Дерматологические и косметические композиции местного применения, содержащие сфингомиелиназу для повышения уровня церамидов в коже и слизистых оболочках

1 Настоящее изобретение относится к применению сфингомиелиназы, полученной из грам-положительных бактерий, грам-отрицательных бактерий и лактобактерий или их смесей, для повышения уровней церамидов в коже и слизистых оболочках, а также к содержащим ее дерматологическим и косметическим композициям, которые удобны для местного применения. Церамид (N-ацилсфингозин) является липидным метаболитом, о котором недавно было сделано предположение, что он является важным внутриклеточным посредником, который высвобождается внутри клетки через несколько часов стимуляции различными агентами или в результате сывороточной депривации, и связан с клеточной блокадой в фазе GO/G1 и апоптозом. В настоящее время церамид считают вторичным посредником в контакте пути преобразования сфингомиелинового сигнала. Он высвобождается сфингомиелином в результате действия сфингомиелиназ, которые представляют собой формы фосфолипазы С, специфичные для сфингомиелина. Внутри клеток церамид может влиять на рост и дифференциацию, регулировать секрецию белков, индуцировать фрагментацию ДНК и апоптоз, а также увеличивать синтез и секрецию цитокинов. Молекулярные механизмы, лежащие в основе этих разнообразных эффектов, еще не полностью известны. Больше известно, с другой стороны, о внеклеточных агонистах, которые вызывают высвобождение церамида. Гидролиз сфингомиелина наблюдается вскоре после воздействия на клетки экзогенной сфингомиелиназой или агонистом, которые активируют эндогенные сфингомиелиназы. Такие агонисты включают ФНО-, лиганд Fas,интерлейкин 1-, интерферон-, 1,25-дигидроксивитамин D3 и ФРН. Косметические композиции, содержащие сфингомиелиназу, уже известны. Японская патентная публикация 63-216813 раскрывает такую композицию, в которой имеющаяся сфингомиелиназа предназначена для противодействия физиологическому снижению количества этого фермента в стареющей коже, способствуя,таким образом, превращению сфингомиелина в дерамид, который, в свою очередь, оказывает благоприятное увлажняющее действие на кожу. В японской публикации, однако, не раскрывается или, по меньшей мере, не предполагается, что эти композиции могут использоваться в терапевтических целях для лечения заболеваний кожи. Более того, сфингомиелиназу получают с помощью громоздкой и сложной процедуры экстракции из тканей высших животных, таких как головной мозг и печень. Важная роль церамида в метаболизме кожи будет совершенно ясна из дальнейшего изложения материала. 2 Главными клеточными элементами эпидермиса являются кератиноциты, меланоциты,клетки Лангерганса, фибробласты, эндотелиальные клетки и макрофаги. Моно- и полиморфно-ядерные лейкоциты могут инфильтрировать кожу в процессе воспаления или при наличии опухоли. Внутриклеточное пространство,с другой стороны, состоит, главным образом, из нейтральных липидов, гликопротеинов, продуктов распада белков, десмосом, активных ферментов, продуктов сальных желез и церамидов. До сих пор пока эта структура "кирпичи и строительный раствор" интактна, кожа обеспечена как защитным слоем, так и избирательно проницаемым фильтром. Во время процесса дифференцировки в эпидермисе, который начинается с деления клеток базальных слоев и заканчивается гибелью кератиноцитов и развитием липидного барьера,клетки модифицируют свою способность синтезировать липиды. Результатом является то, что для базального слоя характерно наличие фосфолипидов и холестерина, в то время как для более поверхностных слоев характерно наличие холестерина, свободных жирных кислот и, помимо прочего, церамидов. Липиды рогового слоя,основной компонент которых состоит из сфинголипидов, играют ключевую роль в поддержании проницаемого для воды барьера эпидермиса. Сфингомиелины вытесняются из ламеллярных тел гранулярных клеток эпидермиса. Церамиды (сфинголипиды), которые составляют до 43-46% рогового слоя, являются основными полярными липидами рогового слоя и играют фундаментальную роль в барьерной функции кожи, направленной против потери воды в местах соединения клеток и в дифференцировке эпидермиса. Данные литературы указывают, что церамиды синтезируются в эпидермисе de novo при участии фосфолипидоподобных промежуточных соединений. Они имеются в довольно высоких концентрациях в роговом слое (до 40% от общего количества липидов). Подобно внешнему виду поверхности кожи, ее функциональные свойства с возрастом также претерпевают изменения. Для стареющей кожи характерно снижение содержания воды в роговом слое, связанное с уменьшением проникновения воды через кожу. Было показано,что отношение церамид 2:сфинголипид с возрастом снижается. Падение количества церамида, связанное со старением, может быть ответственно за дегидратацию кожи, которая наблюдается в процессе старения. Помимо этого, патологические уровни церамидов (дефициты) были обнаружены при атопической экземе, дерматозе и дерматите, в частности, при атопическом дерматите, и псориазе. Недавно был обнаружен врожденный дефицит церамида 1 при аутосомном рецессивном сфинголипидозе. Также хорошо известны генерали 3 зованные формы сфинголипидоза, такие как болезнь Фабри, болезнь Гоше и болезнь ТеяСакса. Синдром Шегрена-Ларссона связан с дефицитом церамида 1 и 6 с сопутствующим разрушением нормальной барьерной функции кожи. В свете вышесказанного, совершенно очевидна важность поддержания высоких уровней церамида в коже. Следует также понять, что применение сфингомиелиназы представляется выгодным также и на слизистых оболочках. В настоящее время в продаже имеются многочисленные продукты, содержащие церамиды, полученные методами экстракции или синтеза и применяющиеся в дерматологии и косметологии. Местное наружное применение церамидов предложено для ремоделирования кожного липидного барьера, измененного вследствие старения, под воздействием лекарственных средств, детергентов, физических агентов и т.п. Такое экзогенное введение не учитывает возможности качественных и/или количественных вариаций в содержании церамида в силу возраста и анатомической области, сезонных факторов и заболеваний. Ясно, что экзогенное введение церамида действует только во вспомогательном смысле (эндогенный + экзогенный церамид), но не в модулирующем смысле (изменения в содержании церамида в соответствии с сезоном, анатомической областью, возможными развивающимися болезненными процессами и т.п.). Неожиданно было установлено, что высокие уровни нейтральной, но не кислой сфингомиелиназы, присутствуют в бактериальных клетках. Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к применению сфингомиелиназы грам-положительных бактерий,грам-отрицательных бактерий, лактобактерий или их смесей для изготовления дерматологических или косметических композиций, подходящих для местного применения с целью повышения уровня церамидов в коже и слизистых оболочках. Согласно настоящему изобретению сфингомиелиназу предпочтительно выделяют из бактериальных клеток или используют в составе лиофилизированных или обработанных ультразвуком бактериальных клеток. Лактобактерии предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Lactobacillus acidophilus, Lactobacilluslongum, Bifidobacterium plantarum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, Streptococcus lactis, Streptococcus raffinolactis и Streptococcus thermophilus. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения клетки используются в лиофилизированном или обработанном ультразвуком виде. Согласно настоящему изобретению сфингомиелиназу можно использовать также как усилитель кожной проницаемости или всасывания как отдельно, так и в смеси с другими усилителями, для приготовления фармацевтических или косметических композиций, подходящих для чрескожного введения. Еще одним аспектом настоящего изобретения является обеспечение дерматологических или косметических композиций, отличающихся тем, что они содержат количество сфингомиелиназы, эффективное для обеспечения повышения уровня церамидов в коже или слизистых оболочках. Согласно настоящему изобретению сфингомиелиназу, содержащуюся в указанных композициях, предпочтительно выделяют из грамположительных бактерий, грам-отрицательных бактерий, лактобактерий или их смесей. Лактобактерии предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus leichmanii, Lactobacillus minutus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacteriumlongum, Bifidobacterium plantarum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, Streptococcus lactis, Streptococcus raffinolactis и Streptococcus thermophilus. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения клетки,содержащиеся в указанных композициях, находятся в лиофилизированной или обработанной ультразвуком форме. Дерматологические или косметические композиции по настоящему изобретению будут,предпочтительно, включать на один грамм композиции от 1102 до 11015 КОЕ лактобактерий. Дерматологические или косметические композиции по настоящему изобретению могут также содержать экзогенный церамид или продукты, содержащие экзогенный церамид, сфин 5 гомиелины, жирные кислоты, холестерин, ингибиторы церамидаз, ингибиторы протеаз, иммуномодуляторы, витамины, факторы роста, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы,стабилизаторы, липиды, реологические добавки,увлажнители, антиоксиданты, консерванты,красители, лаки, пигменты, вспомогательные вещества (например, кислоты, основания, пропелленты) и функциональные вещества (вяжущие средства, антисеборейные агенты, агенты против перхоти, дезодоранты, очищающие кожу вещества, кератиногенные агенты, увлажнители,антиксерозные агенты, агенты, способствующие разглаживанию кожи, экраны, солнечные экраны, пигментирующие агенты, антипигментирующие агенты, размягчители, восстановители,эутрофические агенты, агенты против морщин,агенты, нейтрализующие свободные радикалы,уплотнители, агенты, препятствующие растяжению, вазопротекторы, агенты против кожных высыпаний, успокаивающие кожу агенты, антицеллюлитные агенты, тонизирующие агенты,стимуляторы, гиперэлюирующие агенты, эпиляторы, защитные вещества для ногтей). Наконец, дерматологические или косметические композиции по настоящему изобретению могут изготавливаться в форме жидких, полужидких, полутвердых, твердых или порошкообразных продуктов, например, в форме кремов,мазей, лосьонов, капсул, гранул, шариков, туши для ресниц, жидкостей для промывания глаз,зубной пасты, жидкостей для полоскания рта,губной помады, липосом, мыла, мыла для бритья, тоников, средств для душа, растворов для клизм, шампуней, препаратов против перхоти,импрегнированных и/или содержащих лекарственное средство бинтов или марли, пластырей,содержащих лекарственное средство эмульсий,чрескожных гелей или пластырей. Для подтверждения способности этих бактерий индуцировать выработку церамида в коже, были проведены следующие эксперименты,основанные на определении нейтральной сфингомиелиназы, фермента, ответственного за выработку церамида в коже человека. Методы Анализ на нейтральную и кислую сфингомиелиназу в лактобактериях 10 мг лиофилизированного Streptococcus(Sigma Chemical Co.) и 0,2% Тритон Х-100 (для анализа активности нейтральной сфингомиелиназы) или 500 мкл 0,7% Тритона Х-100 (для анализа активности кислой сфингомиелиназы). Приготовленные таким образом образцы затем лизировали с помощью ультразвука (в течение 1 мин и 50 с, чередуя 10 с обработки ультразву 001741 6 ком и 10 с покоя) с помощью ультразвукового прибора Vibracell (Sonic and Materials Inc.,Danbury, CT). Обработанные ультразвуком образцы затем центрифугировали в течение 30 мин на 14000 об./мин, при 4 С, супернатант удаляли и определяли концентрацию белка с помощью набора Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA). 100 мкг образца инкубировали в течение 2 ч при 37 С в буфере (50 мкл конечного объема), содержащем ГЭПЭС 20 мМ, MgCl2 1 мМ,рН 7,4 и 2,25 мкл [N-метил-14 С]сфингомиелина(СМ) (0,2 мкКи/мл, a.s. 56,6 мКи/ммоль, Amersham). Для измерения активности кислой сфингомиелиназы 100 мкг бактериального лизата инкубировали в течение 2 ч при 37 С в буфере(50 мкл конечного объема), содержащем ацетат натрия 250 мМ, ЭДТК 1 мМ, рН 5,0 и 2,25 мкл[N-метил-14 С] СМ. Реакцию блокировали добавлением 250 мкл смеси хлороформ:метанол:уксусная кислота (4:2:1). Фосфолипиды экстрагировали, анализировали на пластинках путем тонкослойной хроматографии и гидролиз СМ определяли количественно посредством ауторадиографии и жидкостной сцинтилляции. Сфингомиелиназу, присутствовавшую в бактериях, обработанных ультразвуком, выражали как единицы/мг белка. Одна единица нейтральной сфингомиелиназы гидролизует 1 мкмоль сфингомиелина в минуту при рН 7,4 и температуре 37 С. Одна единица кислой сфингомиелиназы гидролизует 1 нмоль СМ до Nацетилсфингозина и холинфосфата в час при рН 5,0 и температуре 37 С. Изготовление крема и лечение(продолжительность и способ воздействия) Был изготовлен крем (с использованием дегидратирующего основания крема), содержащий обработанные ультразвуком лактобактерии[2 по 20 г пробирки основного крема плюс 1 флакон обработанных ультразвуком лактобактерий (110 КОЕ) в 20 мл воды], и изучалось влияние ежедневного нанесения этого крема на уровни церамидов в роговом слое эпидермиса предплечья на 8 добровольцах, как указано в табл. 1, ниже. Пол мужской женский женский женский женский женский мужской женский Участников обучили применению контрольного крема и экспериментального крема,содержащего лактобактерии, дважды в день Контрольный крем наносили ежедневно на правое предплечье, в то время как экспериментальный крем наносили на левое предплечье. Оба крема втирали в кожу до полного впитывания. Липиды рогового слоя эпидермиса собирали с предплечья путем смывания 250 мл 99,5% этанола перед началом нанесения крема (Т 0) и через одну неделю после начала обработки (Т 1). Этаноловые экстракты концентрировали с помощью ротационного испарителя, а затем выпаривали досуха. Высушенные образцы растворяли в 2 мл хлороформа, высушивали азотом и подвергали анализу DAG-киназой для количественного определения содержания церамидов(Amersham, Buckinghamshire, Great Britain). После проведения трех экстракций липиды вновь высушивали азотом, растворяли в 100 мкл хлороформа и подвергали тонкослойной хроматографии (ТСХ) с использованием хлороформа:метанола:уксусной кислоты (65:15:5 по объему) в качестве подвижной фазы. Фосфорилированные церамиды определяли посредством ауторадиографии. Пятна, соответствовавшие церамид-1-фосфату, отрезали и подсчитывали их радиоактивность с использованием сцинтилляционной жидкости в -счетчике. Количество присутствующего церамида определяли на основе стандартной кривой, полученной с аутентичным церамидом (тип III; мозг крупного рогатого скота; Sigma Chemical Co., St.Louis, МО). Результаты Активность сфингомиелиназы лактобактерий Уровни активности нейтральной сфингомиелиназы в образцах лактобактерий, обработанных ультразвуком, составляли приблизительно 210-7 единиц/мг бактерий. Активности кислой сфингомиелиназы не отмечалось. Влияние Lactobacillus, обработанной ультразвуком, на уровни церамидов в коже Уровни церамидов в этаноловых экстрактах, полученных как описано в разделе "Методы", представлены в табл. 2 ниже, а соответствующие ауторадиограммы показаны на чертеже. Можно заметить, независимо от значительной вариабельности исходного состояния субъектов эксперимента, что применение обоих кремов вызвало повышение уровней церамидов в коже предплечья у всех субъектов эксперимента. Однако это повышение было значительно сильнее выражено и достоверно после применения крема, содержавшего лактобактерии. Более того,влияние экспериментального крема на уровни церамидов можно было уловить раньше по сравнению с влиянием основного крема, что указывает на более быстрое действие первого. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение сфингомиелиназы для приготовления дерматологических и/или косметических композиций, подходящих для местного применения, для повышения уровней церамидов в коже и слизистых оболочках, отличающееся тем, что используют сфингомиелиназу грамположительных бактерий, грам-отрицательных бактерий, лактобактерий или их смесей. 2. Применение по п.1 для приготовления дерматологических композиций, подходящих для местного применения, с целью профилактики или лечения атопической экземы, дерматоза и дерматита, в частности атопического дерматита, псориаза, ихтиоза, болезни Фабри, болезни Гоше, болезни Тея-Сакса и синдрома ШегренаЛарсона. 3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что лактобактерии выбирают из группы,включающей Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacilluslongum, Bifidobacterium plantarum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, Streptococcus lactis, Streptococcus raffinolactus и Streptococcus thermophilus. 4. Применение по любому из пп.1-3 для приготовления фармацевтических или косметических композиций, подходящих для чрескожного введения. 5. Применение по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что сфингомиелиназу перед использованием выделяют из бактериальных клеток или используют в составе лиофилизированных или обработанных ультразвуком бактериальных клеток. 6. Дерматологическая или косметическая композиция, включающая количество сфингомиелиназы, эффективное для повышения уровня церамидов в коже и слизистых оболочках, отличающаяся тем, что используют сфингомиелиназу грам-положительных бактерий, грамотрицательных бактерий, лактобактерий или их смесей. 7. Композиция по п.6, отличающаяся тем,что лактобактерии выбирают из группы, включающей Lactobacillus acidophilus, Lactobacilluslongum, Bifidobacterium plantarum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, Streptococcus lactis, Streptococcus raffinolactus и Streptococcus thermophilus. 8. Композиция по п.6 или 7, отличающаяся тем, что сфингомиелиназу перед использованием выделяют из бактериальных клеток или используют в составе лиофилизированных или обработанных ультразвуком бактериальных клеток. 9. Композиция по любому из пп.6-8, отличающаяся тем, что она включает от 1102 до 11015 КОЕ лактобактерий на грамм композиции. 10. Композиция по любому из пп.6-9, отличающаяся тем, что она дополнительно включает экзогенный церамид или продукты, содержащие экзогенный церамид, сфингомиелины,жирные кислоты, холестерин, ингибиторы церамидаз, ингибиторы протеаз, иммуномодуляторы, витамины, факторы роста, поверхностноактивные вещества, эмульгаторы, стабилизаторы, липиды, реологические добавки, увлажнители, антиоксиданты, консерванты, красители,лаки, пигменты, вспомогательные вещества (например кислоты, основания, пропелленты) и функциональные вещества (вяжущие средства,антисеборейные агенты, агенты против перхоти,дезодоранты, очищающие кожу вещества, кератогенные агенты, увлажнители, антиксерозные агенты, агенты, способствующие разглаживанию кожи, экраны, солнечные экраны, пигмен 10 тирующие агенты, антидепигментирующие агенты, размягчители, восстановители, эутрофические агенты, агенты против морщин, агенты, нейтрализующие свободные радикалы, уплотнители, агенты, препятствующие растяжению, вазопротекторы, агенты против кожных высыпаний, успокаивающие кожу агенты, антицеллюлитные агенты, тонизирующие агенты,стимуляторы, гиперэлюирующие агенты, эпиляторы, защитные вещества для ногтей). 11. Композиция по любому из пп.6-10 в форме кремов, мазей, лосьонов, капсул, гранул,шариков, туши для ресниц, жидкостей для промывания глаз, зубной пасты, жидкостей для полоскания рта, губной помады, липосом, мыла,мыла для бритья, тоников, средств для душа,растворов для клизм, шампуней, препаратов против перхоти, импрегнированных и/или содержащих лекарственное средство бинтов или марли, пластырей, содержащих лекарственное средство эмульсий, чрескожных гелей или пластырей.