Штамм молочно-кислых бактерий streptococcus thermophilus, обеспечивающий улучшенную текстуру ферментированных молочных продуктов, и его применение

ШТАММ МОЛОЧНО-КИСЛЫХ БАКТЕРИЙ STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS,ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЙ УЛУЧШЕННУЮ ТЕКСТУРУ ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Янцен Томас, Енсен Нильс Банг Симсен Штамм молочно-кислых бактерий Streptococcus thermophilus (ST) DSM 17876 или его мутантный штамм, создающий улучшенную текстуру, например, в молочном продукте из ферментированного молока. 013947 Настоящее изобретение относится к новой бактерии Streptococcus thermophilus (ST), которая создает улучшенную текстуру, например, молочного продукта из ферментированного молока. Многие штаммы Streptococcus thermophilus синтезируют внеклеточные полисахариды (EPS). Эти молекулы могут производиться в виде капсул, прочно связанных с клеткой, или они могут высвобождаться в среду в виде несвязанной слизи (т.е. "вязкие" полисахариды). Хотя присутствие экзополисахарида не дает какого-нибудь очевидного преимущества росту или выживанию S.thermophilus в молоке,продукция in situ этих видов или прочих молочно-кислых бактерий обычно придает ферментированным молочным продуктам желательную "вязкость", или вязкую текстуру. Практика также показала, что продуцирующие экзополисахарид S.thermophilus могут улучшать функциональные свойства сыра"Mozzarella". Для более подробных сведений см. обзорную статью авторов Broadbent et al. (J. dairy Sci.,vol. 86, p. 407-423).WO 2004/085607A2 (Rhodia Chimie) описывает штамм Streptococcus thermophilus (ST), включающий некоторые специфические конкретные гены (называемые "eps-гены), включенные в биосинтез внеклеточных полисахаридов (EPS). Авторы Hassan et al. (2003, J. dairy Sci., vol. 86, p. 1632-1638) описывают 2 "вязких" штаммаStreptococcus thermophilus, CHCC3534 и СНСС 3541. Оба этих штамма чувствительны к бактериальным вирусам. Задача, которую решает настоящее изобретение, состоит в представлении нового штаммаStreptococcus thermophilus с улучшенными свойствами, в особенности относительно способности создавать улучшенную текстуру ферментированных молочных продуктов, таких как, например, йогурт, и который полезен в современном высокоразвитом промышленном производстве молочной продукции, где проблему представляет вредное воздействие бактериальных вирусов. Как можно видеть в нижеприведенных рабочих примерах, описываемый здесь новый штаммStreptococcus thermophilus (ST) с регистрационным номером DSM 17876 (здесь также называемый СНСС 8833) дает улучшенную текстуру (измеряемую как напряжение сдвига) по сравнению с соответствующими имеющимися в продаже штаммами ST, которые считаются штаммами с высокой текстурирующей способностью и в настоящее время используются в молочной промышленности. Описываемый здесь новый штамм DSM 17876 ST не включает специфических конкретных eps-генов, описанных в заявке WO 2004/085607A2 (Rhodia Chimie) (определяемых PCR-анализом (ПЦР, полимеразно-цепная реакция) - данные не приведены). Далее, как иллюстрировано в примере 2, штамм Streptococcus thermophilusCHCC8833 имеет преимущество в том, что он устойчив к большому числу бактериальных вирусов, которые присутствуют в молочных продуктах. Соответственно этому первый аспект изобретения относится к молочно-кислой бактерииStreptococcus thermophilus (ST) с регистрационным номером DSM 17876 или ее мутанту, в которой мутантный штамм получается с использованием депонированного штамма в качестве исходного материала и в которой мутант сохраняет или еще более улучшает текстурирующие свойства штамма DSM 17876. Второй аспект изобретения относится к заквасочной композиции, включающей бактерию первого аспекта. Третий аспект изобретения относится к способу получения продовольствия или пищевого продукта, включающему добавление заквасочной композиции согласно второму аспекту к исходному материалу пищевого или кормового продукта и выдерживание, таким образом, заквашенного исходного материала в условиях, при которых бактерия является метаболически активной. Вариант выполнения настоящего изобретения описан ниже только в качестве примера. На фигуре изображен результат, показывающий улучшенную текстуру (напряжение сдвига) молока, ферментированного новым ST-штаммом в сравнении с имеющимися в продаже ST-штаммами, которые рассматриваются как штаммы с высокой текстурирующей способностью. Штаммы описаны в примере 2. Текстура количественно оценивается путем определения сдвигового напряжения, измеренного в паскалях [Па] с использованием реометра, как описано в примере 1. Столбец изображает 1S.E. (стандартное отклонение). Новый штамм Streptococcus thermophilus. Образец нового штамма Streptococcus thermophilus (ST) СНСС 8833 был депонирован в DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH - "ООО Германская Коллекция Микроорганизмов и Клеточных Культур") под инвентарным номером DSM 17876 с датой депонирования 11 января 2006 г. Депонирование было проведено согласно условиям Будапештского договора о Международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры. Первый аспект изобретения относится к описанному здесь новому штамму или его мутанту. Специалисту будет понятно, что путем применения депонированного штамма в качестве исходного материала квалифицированный читатель может обычным порядком с помощью общепринятых методик мутагенеза или технологии повторного выделения получить дальнейшие мутанты или их производные,которые сохраняют описываемые здесь соответственные признаки и преимущества. Соответственно этому термин "его мутант" в первом аспекте относится к мутантным штаммам, полученным с использованием депонированного штамма в качестве исходного материала.-1 013947 Поскольку молоко и условия в молочных хозяйствах в общем являются нестерильными, бактериофаги представляют серьезную угрозу в производстве молочных продуктов. Бактериальные вирусы заражают молочно-кислые бактерии и взрывообразно размножаются, приводя к гибели клеток и, как следствие, к недостаточному скисанию и сбою в производстве. В особенности в современной молочной промышленности, которая применяет очень крупномасштабные емкости, заражение бактериальными вирусами связано с очень существенными денежными потерями. Таким образом, промышленность постоянно пытается разработать новые культуры, устойчивые к бактериальным вирусам. Как иллюстрировано в примере 1 и 2, штамм Streptococcus thermophilus CHCC8833 (DSM 17876) не только обеспечивает неожиданно высокую текстуру, но и неожиданно СНСС 8833, в отличие от других штаммов с высокой текстурирующей способностью был устойчивым ко всем испытанным бактериальным вирусам. Бактериальная культура для получения кисло-молочных продуктов, содержащая молочно-кислую бактерию (LAB), как описываемую здесь. Молочно-кислая бактерия (LAB), как описываемая здесь, пригодна в качестве бактериальной культуры для получения кисло-молочных продуктов в производстве продовольствия или пищевых продуктов. Типично, такая композиция бактериальной культуры для получения кисло-молочных продуктов включает бактерии в концентрированном виде, в том числе замороженные, высушенные или лиофилизированные концентраты, обычно имеющие концентрацию жизнеспособных клеток, которая варьируется в диапазоне от 104 до 1012 cfu (КОЕ, колониеобразующих единиц) на грамм композиции, включающей по меньшей мере 104 КОЕ/г, такой как по меньшей мере 105 КОЕ/г, например по меньшей мере 106 КОЕ/г,такой как по меньшей мере 107 КОЕ/г, например по меньшей мере 108 КОЕ/г, такой как по меньшей мере 109 КОЕ/г, например по меньшей мере 1010 КОЕ/г, такой как по меньшей мере 1011 КОЕ/г. Композиция может содержать в качестве дальнейших компонентов криопротекторы и/или общеупотребительные добавки, в том числе питательные вещества, такие как дрожжевые экстракты, сахара и витамины. Поскольку в производственном применении ферментативных процессов с помощью молочнокислых бактерий является нормальным употребление смешанных культур молочно-кислых бактерий, в некоторых вариантах осуществления композиция включает множество штаммов либо принадлежащих к одному виду, либо принадлежащих к разным видам. Типичный пример такой применимой комбинации молочно-кислых бактерий в заквасочной композиции представляет собой смесь вида Leuconostoc и одного или более подвидов Lactococcus, таких как Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвидcremoris или Lactococcus lactis подвид lactis biovar. diacetylactis. Способ приготовления продовольствия или пищевого продукта. Как изложено выше, аспект изобретения относится к способу приготовления продовольствия или пищевого продукта, включающему добавление заквасочной композиции, как здесь описанной, к исходному материалу пищевого или кормового продукта и выдерживание, таким образом, заквашенного исходного материала в условиях, в которых молочно-кислая бактерия является метаболически активной. Применимые для пищевых продуктов исходные материалы включают любой материал, который общепринятым образом подвергается воздействию молочно-кислых бактерий в стадии ферментации,такой как молоко, растительные материалы, мясные продукты, фруктовые соки, виноградное сусло, тесто и взбитое жидкое тесто. Ферментированные продукты, которые получаются согласно способу, включают в качестве типичных примеров молочные продукты, такие как ферментированное молоко, йогурт, сыр, в том числе молодые сыры с мягкой сливочной текстурой или моццарелла, и пахта. Для дальнейших примеров и подробностей в отношении описываемых здесь ферментированных пищевых продуктов приводится ссылка на обзорную статью авторов Broadbent et al. (J. Dairy Sci., vol. 86:p. 407-423), где соответственные ферментированные пищевые продукты описаны в разделах с названиями "Применение в йогурте и ферментированных молочных продуктах" и "Применение в сыре моццарелла". В дальнейших вариантах осуществления материал субстрата представляет собой исходный материал для животного корма, такого как силос, например трава, зерновой материал, горох, люцерна или ботва сахарной свеклы, где бактериальными культурами заквашиваются кормовые культуры для силосования,чтобы обеспечить их консервирование, или богатые белками животные отходы, такие как отходы со скотобоен и предприятий переработки рыбы, также в целях консервирования этих отходов, предназначенных для питания животных.-2 013947 Примеры Пример 1. СНСС 8833 - улучшенная текстура ферментированного молока. Штаммы. СНСС 8833: новый штамм DSM 17876 ST, как здесь описанный. Контрольные штаммы: см. пример 2. Все штаммы являются коммерческими штаммами, которые в общем считаются штаммами с высокой текстурирующей способностью. Ферментация молока. Замороженный концентрат ST-штаммов использовали для заквашивания 200 мл восстановленного молока с содержанием сухого вещества 9,5%, которое было подвергнуто тепловой обработке при температуре 99 С в течение 15 мин в периодическом процессе. Замороженные концентраты СНСС 8833 типично проявляют количество клеток между 1109 и 11010 КОЕ/г. Степень заквашивания составляла 1 г концентрата на 10 л молока, тем самым между 1105 и 1106 КОЕ/мл молока. Инкубацию проводили при температуре 37 С до тех пор, пока величина рН не достигла 4,55, за это время произошла коагуляция молока. Затем ферментированное молоко охладили до температуры 5 С. Анализ текстуры ферментированного молока. Через 1 день после инкубации ферментированное молоко довели до температуры 13 С и осторожно перемешали с помощью палочки, оснащенной просверленным диском, до достижения однородности образца. Реологические свойства образца оценивали реометром (StressTech, фирма Reologica Instruments,Швеция), оснащенным С 25-коаксиальной измерительной системой. Вискозиметрическое испытание проводили при скоростях сдвига, варьирующихся от 0,27 до 300 с-1 в 21 стадии. Скорости сдвига повышали и затем понижали и записывали восходящие и нисходящие кривые напряжения сдвига (паскалей, Па) и кажущейся вязкости (Пас). Времена задержки и интеграции составляли 5 и 10 с соответственно. Для дальнейшего анализа было выбрано значение напряжения сдвига 300 с-1. Результаты и выводы. Ферментированные молочные продукты, инкубированные с концентратами штаммов Streptococcusthermophilus, которые в настоящее время применяются в молочной промышленности (контрольные штаммы), показали меньшую вязкость (меньшие значения напряжения сдвига) по сравнению с образцами, полученными с СНСС 8833 (см. фигуру). Пример 2. СНСС 8833 - профиль устойчивости к бактериальным вирусам. Бактериальные штаммы. СНСС 2389: штамм Streptococcus thermophilus ST143, имеющийся в продаже от фирмы Chr. HansenA/S как продукт F-DVS ST143, материал 200144. СНСС 2389 и СНСС 3534 (авторы Hassan et al., 2003) представляют собой различные изоляты одного и того же штамма. СНСС 3021: штамм Streptococcus thermophilus ST10255, имеющийся в продаже от фирмы Chr.Hansen A/S как продукт F-DVS ST-BODY-2, материал 623155. СНСС 3541: штамм Streptococcus thermophilus ST20, имеющийся в продаже от фирмы Chr. HansenA/S как продукт F-DVS ST20X, материал 501696. СНСС 4239: штамм Streptococcus thermophilus ST4239, имеющийся в продаже от фирмы Chr. HansenA/S в смешанной культуре F-DVS ABY-4, материал 675175. СНСС 5086: штамм Streptococcus thermophilus 5086, имеющийся в продаже от фирмы Chr. HansenA/S в смешанной культуре F-DVS YF-LX701, материал 660656. СНСС 5389: штамм Streptococcus thermophilus 5389, имеющийся в продаже от фирмы Chr. HansenA/S в смешанной культуре F-DVS ABY-4, материал 675175. СНСС 5581: штамм Streptococcus thermophilus TA40, имеющийся в продаже от фирмы Danisco A/S. СНСС 8833: штамм Streptococcus thermophilus DSM 17876. Испытание устойчивости к бактериальным вирусам. Чувствительность к бактериальным вирусам вышеупомянутых коммерческих штаммов с высокой текстурирующей способностью сравнивали путем капельного испытания на тест-панели с бактериальными вирусами, включающими 43 отдельных фаговых изолята. Капельное испытание представляет собой способ агаровой аппликации для подсчета количества бактериофагов в образце. Способ включает посев испытуемого штамма на чашках Петри с помощью мягкого верхнего слоя агара на поверхности агаровой пластинки (нижний агар). Различные разбавления свободных от клеток фаговых изолятов затем наносят в виде капель на верхний слой агара. Отдельные фаги будут атаковать бактериальную клетку и воспроизводиться, выделяя фаговые частицы, которые атакуют и лизируют ближайшие к ним бактерии, приводя к чистым зонам (бляшкам, негативным колониям), окруженным непрозрачной областью растущей культуры, см. Adams, M.H. (1959). Bacteriophages. Издательство Interscience Publishers, Inc., New York.-3 013947 Метод. Вкратце, 10 мкл фагового лизата (бляшкообразующие единицы (PFU) приблизительно 109/мл) наносили неразбавленными и в 1:100-разбавлении на испытуемый бактериальный штамм (штамм-хозяин) и инкубировали при температуре 37 С в течение ночи. Использованный агар представлял собой агар М 17 (Oxoid СМ 785) плюс 2% лактозы, по существу,приготовленный согласно рекомендациям поставщика (фирма Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, Великобритания). Чистую зону при 1:100-разбавлении или отдельные бляшки рассматривали как обусловленные фаговой атакой и как показательные. Результаты и выводы. Результаты капельного испытания состояли в том, что штаммы СНСС 2389, СНСС 3021, СНСС 3534,СНСС 3541, СНСС 4239 и СНСС 5086 проявили себя как чувствительные в отношении бактериальных вирусов. Ранее было показано, что штамм СНСС 5381 чувствителен к фагам. Интересно, что не было обнаружено бактериальных вирусов, которые атаковали штамм СНСС 8833. Депонированные микроорганизмы [экспертное решение]. В отношении Правила 13bis.6 (PCT, Договор о патентном сотрудничестве) заявитель запрашивает"экспертное решение" для образцов микроорганизма, упомянутого в настоящем патенте, на всех территориях, где такое решение может быть применимым. В частности, данное заявление касается: Европа. В отношении тех указаний, в которых Европейский патент требует, чтобы образец депонированного микроорганизма был предоставлен до публикации упоминания о предоставлении Европейского патента или до даты, при которой заявка была отклонена или отозвана или предполагается быть отозванной,только передачей такого образца эксперту, указанному лицом, запрашивающим образец и одобренным или i) заявителем и/или ii) Европейским патентным ведомством, кто бы ни запросил. (Правило 28(4) и 28(5) ЕРС (Европейское соглашение о патентах. Канада. Заявитель просит, чтобы либо до того, как будет выдан Канадский патент на основе заявки, или заявка будет отклонена, или она оставляется без движения и уже более не является предметом восстановления, или она отзывается, только руководитель Патентного ведомства уполномочивает представление образца депонированного биологического материала, обозначенного в заявке, независимому эксперту,назначенному руководителем, заявитель должен письменным заявлением информировать Международное бюро соответственным образом до завершения технических приготовлений для публикации международной заявки. Норвегия. Заявитель настоящим просит, что до того, как заявка будет опубликована для всеобщего ознакомления (Норвежским Патентным ведомством), или Норвежским Патентным ведомством будет принято окончательное решение без опубликования для всеобщего ознакомления, представление образца должно быть сделано только эксперту, квалифицированному в этой области технологии. Просьба об этом действии должна быть направлена заявителем в Норвежское Патентное ведомство не позже чем к моменту,когда заявка будет представлена для всеобщего ознакомления согласно разделам 22 и 33(3) Норвежского Патентного закона. Если такая просьба была направлена заявителем, любой запрос, сделанный третьей стороной для представления образца, должен показывать привлечение эксперта. Этот эксперт может быть любым лицом, внесенным в список признанных экспертов, составленный Норвежским Патентным ведомством, или любым лицом, одобренным заявителем в индивидуальном порядке. Австралия. Заявитель настоящим уведомляет, что представление образца микроорганизма должно быть сделано только перед выдачей патента или до истечения срока действия, отклонения или отозвания заявки лицу, каковое является квалифицированным получателем, не заинтересованным в изобретении (Положение 3.25(3) Австралийского Регламента порядка выдачи патентов). Финляндия. Заявитель настоящим просит, что до того, как заявка будет опубликована для всеобщего ознакомления (Национальным Советом по патентам и регламентам), или Национальным Советом по патентам и регламентам будет принято окончательное решение без опубликования для всеобщего ознакомления,представление образца должно быть сделано только эксперту, квалифицированному в этой области технологии. Великобритания. Заявитель настоящим просит, чтобы представление образца микроорганизма было сделано только эксперту. Просьба сделать это должна быть направлена заявителем в Международное бюро перед завершением технических приготовлений для международной публикации заявки.-4 013947 Дания. Заявитель настоящим просит, что до того, как заявка будет опубликована для всеобщего ознакомления (Датским Патентным Ведомством), или Датским Патентным Ведомством будет принято окончательное решение без опубликования для всеобщего ознакомления, представление образца должно быть сделано только эксперту, квалифицированному в этой области технологии. Просьба об этом действии должна быть направлена заявителем в Датское Патентное ведомство не позднее чем к моменту, когда заявка будет представлена для всеобщего ознакомления согласно разделам 22 и 33(3) Датского Патентного закона. Если такая просьба была направлена заявителем, любой запрос, сделанный третьей стороной для представления образца, должен показывать привлечение эксперта. Этот эксперт может быть любым лицом, внесенным в список признанных экспертов, составленный Датским Патентным ведомством,или любым лицом от заявителя в индивидуальном порядке. Швеция. Заявитель настоящим просит, что до того, как заявка будет опубликована для всеобщего ознакомления (Шведским Патентным ведомством), или Шведским Патентным ведомством будет принято окончательное решение без опубликования для всеобщего ознакомления, представление образца должно быть сделано только эксперту, квалифицированному в этой области технологии. Просьба об этом действии должна быть направлена заявителем в Международное бюро до истечения 16 месяцев от даты приоритета (предпочтительно, на форме PCT/RO/134, приведенной в приложении Z тома I Руководства для заявителя РСТ). Если такая просьба была направлена заявителем, любой запрос, сделанный третьей стороной для представления образца, должен показывать привлечение эксперта. Этот эксперт может быть любым лицом, внесенным в список признанных экспертов, составленный Шведским Патентным ведомством,или любым лицом, одобренным заявителем в индивидуальном порядке. Нидерланды. Заявитель настоящим просит, что до даты выдачи патента Нидерландов или до даты, при которой заявка отклоняется или отзывается или утрачивает силу, микроорганизм должен быть предоставлен в распоряжение, как указано в пункте 3 IF(1) Патентных правил, только представлением образца эксперту. Просьба об этом действии должна быть направлена заявителем в Ведомство по охране промышленной собственности Нидерландов до даты, при которой заявка будет опубликована для всеобщего ознакомления согласно Разделу 22 С или Разделу 25 Патентного Закона Королевства Нидерланды, какая бы из двух дат ни наступила первой. Исландия. Заявитель настоящим просит, что до выдачи патента или окончательного решения, вынесенного Патентным ведомством Исландии в отношении заявки, которое не имеет результатом просьбу об этом действии, просьба должна быть направлена заявителем в Патентное ведомство Исландии не позднее момента, когда заявка будет опубликована для всеобщего ознакомления согласно разделам 22 и 33(3) Патентного закона Исландии. Если такая просьба была направлена заявителем, любой запрос, сделанный третьей стороной для представления образца, должен показывать привлечение эксперта. Этот эксперт может быть любым лицом, внесенным в список признанных экспертов, составленный Патентным ведомством Исландии, или любым лицом от заявителя в индивидуальном порядке. Сингапур. Заявитель настоящим просит, что представление образца микроорганизма должно быть сделано только эксперту. Словения. Заявитель настоящим просит, что представление образцов третьей стороне имеет место на условиях, что эта сторона (а) имеет право требовать, чтобы образец микроорганизма был сделан доступным; (b) обязана убедиться, что заявитель не санкционирует доступа к образцу депонированного микроорганизма любой третьей стороне до истечения предписанного периода действительности патента. Швейцария. Заявитель настоящим просит, что представление образцов третьей стороне имеет место на условиях, что эта сторона указывает депонирующему учреждению свое название и адрес для цели информирования депозитора и гарантирует (а) не предоставлять депонированную культуру или ее производную третьей стороне; (b) не использовать культуру вне сферы применения закона; (с) в случае спора, представление доказательства, что обязательства согласно пунктам (а) и (b) не были нарушены. Бывшая Югославская республика Македония. Заявитель настоящим просит, что представление образцов третьей стороне имеет место на условиях, что эта сторона (а) имеет право требовать, чтобы образец микроорганизма был сделан доступным; (b) обязана убедиться, что заявитель не санкционирует доступ к образцу депонированного микроорганизма любой третьей стороне до истечения предписанного периода действительности патента. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Штамм молочно-кислых бактерий Streptococcus thermophilus (ST) DSM 17876 или полученный на его основе мутантный штамм, сохранивший или имеющий улучшенные текстурирующие свойства штамма DSM 17876. 2. Заквасочная композиция, содержащая штамм по п.1 предпочтительно в количестве жизнеспособных клеток от 104 до 1012 КОЕ на грамм композиции. 3. Способ производства пищевого или кормового продукта, предусматривающий добавление заквасочной композиции по п.2 к исходному материалу пищевого или кормового продукта и выдерживание заквашенного исходного материала в условиях, при которых молочно-кислые бактерии являются метаболически активными. 4. Способ по п.3, в котором ферментированный пищевой продукт представляет собой ферментированный молочный продукт. 5. Способ по п.4, в котором ферментированный молочный продукт выбран из группы, состоящей из ферментированного молока, йогурта, сыра, включающего свежие сырные продукты или моццареллу, и пахты.