Комбинация молочно-кислых бактерий и ее применение для профилактики и/или лечения инфекций и воспалительных состояний

006037 Настоящее изобретение относится к комбинации молочно-кислых бактерий и ее применению для получения пищевой добавки, гигиенического продукта или фармацевтического препарата для профилактики и/или лечения инфекций и воспалительных состояний, вызываемых бактериями, вирусами или грибами, особенно в ротовой полости, влагалище, уретре, носу, глазах и ушах. Молочно-кислые бактерии являются грамположительными бактериями, которые продуцируют молочную кислоту путем ферментации глюкозы. Streptococcus thermophilus также включены в данное определение. Хорошо известно, что штаммы молочно-кислых бактерий, которые продуцируют H2O2, могут действовать в качестве регуляторов бактериальной флоры в открытых полостях организма и на слизистых оболочках. Было показано, что продуцирующие Н 2 О 2 молочно-кислые бактерии могут быть антагонистами Е. coli, N. gonorrhoea, G. vaginalis, С. trachomatis, U. urealyticum и В. bivius. Однако данные бактерии имеют ограниченную полезность при применении в медицинской практике. Это очевидно из того факта, что препараты на основе молочно-кислых бактерий (например, вагинальные суппозитории), предназначенные для лечения инфекций, вызываемых вышеуказанными микроорганизмами (например, вагинита), не применяются врачами, которые предпочитают лечить своих пациентов антибиотиками или химиотерапевтическими препаратами. Насколько известно заявителям, антибактериальное или регулирующее флору действие в открытых полостях организма и на слизистых оболочках не является определяющим признаком утилизирующих аргинин молочно-кислых бактерий. В настоящее время с удивлением было установлено, что активность продуцирующих H2O2 молочно-кислых бактерий в значительной степени усиливается при добавлении одного и более штаммов молочно-кислых бактерий, которые способны утилизировать аргинин. Аргинин образует часть различных небольших пептидов, обнаруженных в биологических жидкостях, и также присутствует в виде свободного аргинина. Многие виды бактерий используют его для собственного питания и роста. Следовательно, утилизирующие аргинин молочно-кислые бактерии могут лишать другие патогенные или потенциально патогенные бактерии определенного количества аргинина, которое, хотя и недостаточно для остановки их роста,делает их более чувствительными к воздействию H2O2, продуцируемой молочно-кислыми бактериями. Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает комбинацию молочно-кислых бактерий,включающую(a) первый компонент, состоящий из по меньшей мере одного штамма продуцирующих H2O2 молочно-кислых бактерий, и(b) второй компонент, состоящий из по меньшей мере одного штамма утилизирующих аргинин молочно-кислых бактерий. Штамм молочно-кислых бактерий в компоненте (а) предпочтительно выбран из группы, включающей штаммы видов Lactobacillus crispatus, Lactobacillus salivarius и Lactobacillus casei, в то время как штамм молочно-кислых бактерий в компоненте (b) выбран из группы, включающей штаммы видов Lactobacillusbrevis, Lactobacillus gasseri и Lactobacillus fermentum. Конкретнее, штамм молочно-кислых бактерий в компоненте (b) представляет штамм Lactobacillus brevis CD2, хранящийся в DSM - Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур, GmbH, Braunschweig, Германия, с 6 февраля 1998 года под инвентарным номером DSM 11988 согласно Будапештскому Договору, - или его мутанты или производные. Соотношение числа бактерий в компоненте (а) к числу бактерий в компоненте (b) предпочтительно равно от 1:100 до 100:1 и более предпочтительно от 1:5 до 5:1, наиболее предпочтительное соотношение равно 1:1. Комбинацию можно вводить в разовой лекарственной форме, включающей от 1 х 102 до 5 х 1011 бактерий компонента (а) и от 1 х 102 до 5 х 1011 бактерий компонента (b), предпочтительно 1 х 109 бактерий компонента (а) и 3 х 109 бактерий компонента (b). Комбинацию также можно вводить в виде таблеток, сосательных таблеток, конфет, жевательной резинки, желатиновых капсул, вагинальных суппозиториев, суппозиториев и микроклизм, а также в виде пилюль, зубных паст и гелей, зубных порошков, жидкостей для полоскания рта, средств для чистки зубов, спреев, суспензий и мазей. Согласно другому варианту изобретения комбинация дополнительно включает по меньшей мере один штамм молочно-кислых бактерий, выбранных из группы, включающей Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus catenaforme, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillusbifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium eriksonii,Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium plantarum и Streptococcus thermophilus. Комбинация может также включать витамины, четвертичные аммониевые основания, минеральные соли, антиоксиданты и средства против зубного налета. Изобретение также относится к применению комбинации молочно-кислых бактерий, включающей(a) первый компонент, состоящий из по меньшей мере одного штамма продуцирующих H2O2 молочно-кислых бактерий, и(b) второй компонент, состоящий из по меньшей мере одного штамма утилизирующих аргинин молочно-кислых бактерий, для получения пищевой добавки, гигиенического продукта или фармацевтического препарата для профилактики и/или лечения инфекций и воспалительных состояний, вызываемых бактериями, вирусами или грибами, особенно в ротовой полости, влагалище, уретре, носу, глазах и ушах. Данные инфекции и воспалительные состояния включают гингивит, периодонтит, мукозит и стоматит,вызванные лекарственными препаратами и/или физическими агентами, синдром Бехчета, диакератоз ротовой полости, глоссит, заболевание горла, сиаладенит, сиалолитиаз, пузырчатку, плоский лихен, синдром Шегрена, вагиноз, вагинит, уретрит, простатит, проктит, отит, конъюнктивит, ринит, синусит, лейкоплакию, афты, герпес и инфекции, вызываемые Helicobacter pilori в ротовой полости. Комбинацию также можно применять для лечения ротовой полости в виде дезодоранта для ротовой полости и препарата против воспаления, кариеса и/или зубного налета. Следующие примеры служат для более подробной иллюстрации различных аспектов изобретения,но их ни коем образом не следует истолковывать в качестве ограничивающих изобретение. Пример 1. Оценивали ингибирующее действие продуцирующих Н 2O2 молочно-кислых бактерий (компонент А); утилизирующих аргинин молочно-кислых бактерий (компонент В); и комбинации двух штаммов конкретно в соотношении 1:1 (комбинация АВ) на рост потенциально патогенных бактерий. Кратко, рН тестируемой культуры молочно-кислых бактерий вначале доводили до нейтрального значения, поскольку кислое значение рН само по себе ингибирует рост бактерий. Суспензию подвергали стерилизации фильтрованием и фильтрат использовали для пропитывания ряда дисков из впитывающей бумаги (30 мкл фильтрата на диск). Диски помещали на чашки с селективной питательной средой, на которую высевали 0,1 мл Gardnerella vaginalis (штамм, который вызывает вагиноз и который выделяли в лаборатории) вместе с контрольным диском, который пропитывали только 30 мкл дистиллированной воды. После инкубирования в течение 24 ч при 37 С оценивали ингибирование роста патогенов определением диаметра кольца вокруг диска в миллиметрах. Вторую серию опытов проводили с Streptococcus mutans в качестве мишеневого патогена, данный вид является возбудителем зубного налета и кариеса. Характеристика бактерий в качестве продуцентов H2O2 была дана с помощью классической бензидин-пероксидазной реакции, которой выявляются колонии бактерий, продуцирующие Н 2 О 2, по синей окраске. Определяли активность аргининдегидролазы для оценки способности молочно-кислых бактерий утилизировать аргинин (M.C.Manca de Nadra, Milchwissenschaft, 37 (1982), pp. 669-670). Молочно-кислые бактерии получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС), Rockville,США. Штамм бактерий Кольцо ингибирования (активность против G. vaginalis, мм) Продуцент H2O2 (компонент А)Lactobacillus salivarius+Lactobacillus fermentum 104 Штамм бактерий Кольцо ингибирования (активность против S. mutans, мм) Продуцент H2O2 (компонент А)-2 006037 Пример 2. Готовили сосательные таблетки со следующим составом композиции. Комбинация АВ 4000 млн(Lactobacillus salivarius+Lactobacillus brevis, соотношение 1:1) Маннит 400 мг Сахарин 5 мг Полиэтиленоксид 50 мг Мg стеарат 15 мг Тальк 25 мг Кремний диоксид 5 мг Данные таблетки давали четырем добровольцам, которых просили не чистить зубы или использовать жевательную резинку в течение предшествующей недели. Субъекты использовали 3 таблетки в день в течение одной недели после еды, давая таблеткам раствориться во рту. Клинические обследования проводили по индексу зубного налета и гингивальному индексу. Для зубного налета использовали следующую балльную систему для шести зубов (первый верхний моляр справа; верхний центральный резец слева; первый верхний премоляр слева; первый нижний моляр слева; нижний центральный резец справа; первый нижний премоляр справа): 0 - на всех отсутствует зубной налет 1 - нет видимого зубного налета 2 - видимый зубной налет 3 - очень выраженный зубной налет Следующую балльную систему использовали для оценки гингивальных бляшек с использованием края десны, прилегающего к шести зубам, указанным выше: 0 - без воспаления 1 - небольшое воспаление 2 - умеренное воспаление с кровотечением при надавливании 3 - заметное воспаление с тенденцией к спонтанному кровотечению. Объединенные данные, полученные для шести зубов четырех добровольцев, были следующими. Пример 3. Четырех субъектов с клиническим и гистологическим диагнозом рецидивирующих афтозных язв лечили в течение 10 дней 6 сосательными таблетками в день, состав которых представлен в примере 2. У всех подвергшихся лечению пациентов наблюдали полное заживление язв в конце десятидневного курса, и ни у одного из них не появлялось новых язв в течение следующего месяца. Для улучшения вкуса и внешнего вида бактериальной комбинации АВ можно добавлять пригодные красители и подсластители, такие как сахарин, мятное масло и ксилит, как это принято и хорошо известно специалистам в данной области. Комбинацию АВ можно вводить в виде пилюль, конфет, жевательной резинки, желатиновых капсул, зубных паст и гелей, зубных порошков, жидкостей для полоскания рта, зубных чистящих средств,таблеток, вагинальных суппозиториев, суппозиториев, спреев, суспензий и микроклизм. Пример 4. Приготовление зубной пасты. Основа зубной пасты. Процентный состав: Кальций фосфат дигидрат 37,5% Глицерин (85% в воде) 30,0% Отдушка (масло мяты перечной) 1,0% Натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы 1,0% Вода очищенная 20,8% Натриевая соль сахарина (1% водный раствор) 2,5% Натрий лаурилсульфат 2,0% Вода очищенная 5,2% 100,0%-3 006037 Композиция по массе: Кальций фосфат дигидрат Глицерин (85% в воде) Отдушка (масло мяты перечной) Натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы Вода очищенная Натриевая соль сахарина (1% водный раствор) Натрий лаурилсульфат Вода очищенная Глицерин добавляли к дигидрату кальцийфосфата, который измельчали и пропускали через сито с отверстиями 50 меш. Смеси давали гидратироваться, получив густую гомогенную пасту. В этой точке добавляли отдушку (1% масло мяты перечной). Натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы гидратировали в воде в течение ночи (концентрация 4,6% в очищенной воде). К полученному густому гелю добавляли раствор натриевой соли сахарина. Полимерный гель выливали в ступку, где уже находился кальций фосфат, который был гидратирован глицерином, и компоненты энергично перемешивали. Отдельно готовили 28% раствор натрия лаурилсульфата в очищенной воде. Затем раствор натрия лаурилсульфата добавляли к густой пасте дикальций фосфата. Полученную густую гомогенную пасту, которая имела хорошие реологические свойства, перемешивали в течение нескольких минут и рафинировали пропусканием через вальцовочный рафинер. Получали белоснежную гомогенную пасту с приятным мятным запахом. 38,5 г лиофилизованных молочно-кислых бактерий (L. salivarius+L. brevis, 1:1; 1010 КОЕ/г) пропускали через сито с отверстиями 50 меш и добавляли небольшими порциями к оставшейся части (770 г) вышеуказанной основы зубной пасты. Полученная гомогенная паста имела светлый бледно-коричневый цвет и мятный запах. Пример 5. Приготовление вагинальных таблеток с быстрым высвобождением. Вагинальные таблетки, покрытые шипучим слоем, готовили влажной грануляцией. Таблетки весили 2100 мг каждая и содержали 100 мг комбинации молочно-кислых бактерий в качестве активного вещества. Каждая вагинальная таблетка имела следующий состав: Лиофилизованные и пропущенные через сито молочно-кислые бактерии (30 х 109 L. brevis, 30 х 109 L. salivarius и 90 х 109 L. plantarum на грамм) 100,0 мг Лактоза 1368,0 мг Кукурузный крахмал 246,0 мг Кислота адипиновая 192,0 мг Натрий бикарбонат 150,0 мг Магний стеарат 30,0 мг Кислота стеариновая 9,0 мг Коллоидный кремний диоксид 5, 0 мг 2100,0 мг ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Комбинация молочно-кислых бактерий для профилактики и/или лечения инфекций и воспалительных состояний, вызываемых бактериями, вирусами или грибами, включающая(a) первый компонент, состоящий из по меньшей мере одного штамма продуцирующих Н 2O2 молочно-кислых бактерий, и(b) второй компонент, состоящий из по меньшей мере одного штамма утилизирующих аргинин молочно-кислых бактерий,в которой компонент (а) выбран из группы, состоящей из штаммов видов Lactobacillus crispatus,Lactobacillus salivarius и Lactobacillus casei, и компонент (b) выбран из группы, состоящей из штаммов видов Lactobacillus brevis, Lactobacillus gasseri и Lactobacillus fermentum, при условии, что когда компонент (а) является Lactobacillus casei, то компонент (b) не является Lactobacillus gasseri или Lactobacillusfermentum. 2. Комбинация по п.1, в которой штамм молочно-кислых бактерий в компоненте (b) представляет собой штамм Lactobacillus brevis CD2 DSM 11988. 3. Комбинация по одному из пп.1-2, в которой соотношение числа бактерий в компоненте (а) к числу бактерий в компоненте (b) составляет от 1:100 до 100:1.-4 006037 4. Комбинация по п.3, в которой указанное соотношение составляет от 1:5 до 5:1. 5. Комбинация по п.4, в которой указанное соотношение составляет 1:1. 6. Комбинация по любому одному из пп.1-5 в виде пилюль, зубных паст и гелей, зубных порошков,средств для полоскания рта, средств для чистки зубов, спреев, суспензий и мазей. 7. Комбинация по любому одному из предшествующих пунктов, дополнительно включающая по меньшей мере один штамм молочно-кислых бактерий, выбранных из группы, включающей Lactobacillusbreve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium eriksonii, Bifidobacterium infantis,Bifidobacterium longum, Bifidobacterium plantarum и Streptococcus thermophilus. 8. Комбинация по одному из предшествующих пунктов, дополнительно включающая витамины,четвертичные аммониевые основания, минеральные соли, антиоксиданты и средства против зубного налета. 9. Комбинация по п.1 или 2, в которой компонент (а) является Lactobacillus crispatus и компонент (b) является Lactobacillus brevis. 10. Комбинация по п.1 или 2, в которой компонент (а) является Lactobacillus salivarius и компонент(b) является Lactobacillus brevis. 11. Комбинация по п.1, в которой компонент (а) является Lactobacillus salivarius и компонент (b) является Lactobacillus fermentum. 12. Комбинация по пп.9-11, в которой соотношение числа бактерий в компоненте (а) к числу бактерий в компоненте (b) составляет 1:1. 13. Лекарственная форма на основе комбинации по любому из предшествующих пунктов, включающая от 1 х 102 до 5 х 1011 бактерий компонента (а) и от 1 х 102 до 5 х 1011 бактерий компонента (b). 14. Лекарственная форма по п.13, включающая 1 х 109 бактерий компонента (а) и 3 х 109 бактерий компонента (b). 15. Лекарственная форма по п.13 или 14 в виде таблеток, сосательных таблеток, конфет, жевательной резинки, желатиновых капсул, вагинальных суппозиториев, суппозиториев и микроклизм. 16. Применение комбинации молочно-кислых бактерий, и/или лекарственной формы, определенной в любом из пп.1-15, для получения пищевой добавки, гигиенического продукта или фармацевтического препарата для предотвращения и/или лечения инфекций и воспалительных состояний, вызываемых бактериями, вирусами или грибами, особенно во рту, влагалище, уретре, носу, глазах и ушах. 17. Применение по п.16, в котором инфекции и воспалительные состояния включают гингивит, периодонтит, мукозит и стоматит, вызванные лекарственными препаратами и/или физическими агентами,синдром Бехчета, диакератоз ротовой полости, глоссит, заболевание горла, сиаладенит, сиалолитиаз, пузырчатку, плоский лихен, синдром Шегрена, вагиноз, вагинит, уретрит, простатит, проктит, отит, конъюнктивит, ринит, синусит, лейкоплакию, афты, герпес и инфекции, вызываемые Helicobacter pilori в ротовой полости. 18. Применение по п.16 или 17, в котором гигиенический продукт или фармацевтический препарат для лечения ротовой полости представлен в виде дезодоранта, средства против кариеса и/или зубного налета.