Способ получения диуридинтетрафосфата или его соли

1 Область изобретения Настоящее изобретение относится к способу эффективного получения Р 1,Р 4-ди(уридин 5'-)тетрафосфата или его соли, который можно использовать и для получения стабильных кристаллов Р 1,Р 4-ди(уридин 5'-)тетрафосфата (U2P4) или его соли, которые полезны в качестве активного ингредиента отхаркивающего средства или терапевтического средства при пневмонии. Предшествующий уровень техники Тетранатриевая соль Р 1,Р 4-ди(уридин 5'-) тетрафосфата (U2P44Na), представленная следующей формулой (I): обладает вызывающим отхаркивание действием и является соединением, которое, как ожидают,будет разработано в качестве отхаркивающего средства или терапевтического агента при пневмонии (например, патенты США 5789391, 5763447 и 5635160). До настоящего времени U2P4 не был получен в кристаллическом виде, а был получен лишь в форме лиофилизованного продукта (см. пример 1 WO 99/05155). Обычный U2P4, полученный стандартным способом, имеет чистоту лишь 90% и содержит побочные продукты. Примеры побочных продуктов включают нуклеозид 5'-(поли)фосфаты, такие как уридин 5'тетрафосфат (UP4), уридин 5'-трифосфат (УТФ)(UTP), уридин 5'-дифосфат (УДФ) (UDP) и уридин 5'-монофосфат (УМФ) (UMP); и динуклеозид полифосфаты, такие как Р 1,Р 4-ди(уридин 5'-)трифосфат (U2P3) и Р 1,Р 4-ди(уридин 5'-) дифосфат (U2P2). В частности, от U2P4 сложно отделить нуклеозид 5'-(поли)фосфаты, такие как УТФ, и U2P4 высокой чистоты лишь с большим трудом был получен обычным способом очистки, т.е. ионообменной хроматографией (WO 99/05155, Biochimica et Biophysica Acta, 438(l976) 304-309). Указанный выше очищенный и лиофилизованный продукт имеет такой недостаток, как высокая гигроскопичность. Поэтому получение фармацевтического препарата из U2P4 должно проводиться на специальном оборудовании,обеспечивающем контроль влажности. Даже после получения фармацевтического препарата,продукт должен быть плотно упакован. Кроме того, поскольку фармацевтический препарат имеет очень короткий период доступности вследствие низкой стабильности лиофилизованного препарата, было бы желательно получить стабильные кристаллы U2P4 высокой чистоты.U2P4 синтезируют из уридин 5'-монофосфата (УМФ) путем использования активатора, такого как дифенилфосфорохлоридат (ДФХ)(DPC) (или хлорид диффенилфосфиновой кислоты) и фосфорилирующего агента, такого как пирофосфат (ПФ) (PPi). Однако по обычному способу получается низкий выход синтеза, т.е. только приблизительно 10 мас.% (пример 4 ВWO 99/05155), и он не может служить в качестве практического способа. Соответственно было бы также желательно разработать способ получения U2P4 с высоким выходом и в крупном масштабе. В свете упомянутого выше, целью настоящего изобретения является обеспечение способа эффективного получения U2P4 в крупном масштабе. Описание изобретения Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования способа синтеза U2P4 из УМФ. Было найдено, что использование особых условий реакции приводит к значительному повышению выхода U2P4 при синтезе U2P4 или его соли из УМФ, служащего в качестве исходного вещества, и при использовании ДФХ и ПФ. Настоящее изобретение осуществлено на основе полученных данных. Настоящее изобретение предлагает способ получения Р 1,Р 4-ди(уридин 5'-)тетрафосфата или его соли из уридин 5'-монофосфата (УМФ),служащего в качестве исходного вещества, и путем использования дифенилфосфорохлоридата (ДФХ) и пирофосфата (ПФ), включающий по меньшей мере одну из следующих стадий обработки:(УМФ-ДФФ) отдельными порциями во время стадии взаимодействия УМФ-ДФФ с солью ПФорганической щелочи;(b) проведение стадии взаимодействия УМФ-ДФФ с солью ПФ-органической щелочи в присутствии основания и(c) дальнейшая обработка синтезированного U2P4 щелочью. Наилучший способ воплощения изобретения Эффективный способ синтеза U2P4. Обычно U2P4 или его соль преимущественно синтезировали из уридин 5'-монофосфата(УМФ), служащего в качестве исходного вещества, и с использованием активатора, такого как дифенилфосфорохлоридат (ДФХ) и фосфорилирующего агента, такого как пирофосфат (ПФ). Более конкретно, ДФХ и трибутиламин добавляют к трибутиламиновой соли УМФ с образованием при этом УМФ дифенилфосфата (УМФДФФ), служащего в качестве реакционноспособного промежуточного соединения, которое взаимодействует с пирофосфатом трибутиламина (ПФ-ТБА) с получением при этом U2P4 или его соли с выходом приблизительно 9,6% (пример 4 В WO 99/05155). Способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что проводят по меньшей мере одну из следующих стадий обработки: (а) добавление УМФ-ДФФ отдельными 3 порциями во время обычной стадии взаимодействия УМФ-ДФФ с солью ПФ-органической щелочи; (b) осуществление взаимодействия УМФ-ДФФ и соли ПФ-органической щелочи в присутствии основания; и (с) дальнейшая обработка синтезированного U2P4 щелочью. Можно объединить две или более стадий описанной выше обработки. Стадия (а) добавления УМФ-ДФФ отдельными порциями относится к добавлению УМФ-ДФФ, которое должно быть обеспечено в количестве по молям, составляющем, по меньшей мере, двукратное количество соли ПФорганической щелочи, в виде нескольких порций, а не одной порции. Например, соль ПФорганической щелочи подвергают взаимодействию с эквимолярным количеством УМФ-ДФФ и указанную стадию повторяют. Несмотря на то,что на количество порций УМФ-ДФФ не налагается никаких особых ограничений, предпочтительны 2-3 порции, принимая во внимание повышение выхода. Примеры солей ПФ-органической щелочи включают соль гексиламина, соль дибутиламина, соль триэтиламина и соль трибутиламина. При взаимодействии с УМФ-ДФФ, соль ПФорганической щелочи можно растворить в растворителе. Примеры растворителей включают амиды, такие как ДМФ (диметилформамид),ДМА (диметилацетамид) и формамид; циклические простые эфиры, такие как диоксан и тетрагидрофуран; кетоны, такие как ацетон; и диметилимидазолидинон, гексаметилфосфотриамид,диметилсульфоксид, ацетонитрил, или смесь двух или более из них. После этого к раствору добавляют УМФ-ДФФ и дают смеси прореагировать при комнатной температуре в течение приблизительно от 30 мин до 5 ч. Стадия (b) осуществления вззаимодействия УМФ-ДФФ с солью ПФ-органической щелочи в присутствии основания относится к реакции, проводимой в присутствии основания. Примеры оснований включают пиридиновые основания, такие как пиридин, 2,6-лутидин, 2,4 лутидин, -, -, -пиколин, 2,4-диметиламинопиридин и -, -, -коллидин, причем особенно предпочтительным является пиридин. Основный растворитель для реакции также входит в число оснований, используемых в настоящем изобретении. Концентрация основания особенно не ограничивается. Основание предпочтительно добавляют в количестве 6 эквивалентов или более относительно УМФ, более предпочтительно 18 эквивалентов или более. Кроме того, стадия (с) дальнейшей обработки синтезированного U2P4 щелочью относится к гашению жидкости, содержащей синтезированный U2P4 водой и обработке смеси раствором органической или неорганической щелочи, такой как гидроксид натрия, аммиак, гидроксид калия, пиридин, триэтиламин, или кар 004513 4 бонат натрия. Обычно, погашенную жидкость,как таковую, непосредственно подвергают очистке. Однако обработка щелочью дает возможность улучшить выход выделенного U2P4 по сравнению с обычным способом. При обработке щелочью жидкость, содержащую синтезированный U2P4, гасят водой и добавляют к смеси щелочь таким образом, что рН смеси составляет приблизительно 8-13,предпочтительно 10-12. Смесь оставляют для взаимодействия при комнатной температуре в течение приблизительно от 10 мин до 5 ч. УМФ-ДФФ можно синтезировать из УМФ обычным способом. Например, УМФ триалкиламиновую соль, такую как УМФ трибутиламиновую соль, полученную обычным способом,растворяют в растворителе. Примеры растворителей включают амиды, такие как диметилформамид (ДМФ) и диметилацетамид (ДМА); циклические простые эфиры, такие как диоксан и тетрагидрофуран; кетоны, такие как ацетон; и диметилимидазолидинон,гексаметилфосфотриамид, или их смесь. После этого к раствору добавляют ДФХ и, при необходимости, триалкиламин и смесь оставляют для взаимодействия при комнатной температуре в течение приблизительно от 30 мин до 5 ч, для получения таким образом УМФ-ДФФ, служащего в качестве реакционноспособного промежуточного вещества. Примеры Далее настоящее изобретение будет описано более подробно путем примеров. Пример 1. Синтез U2P4 или его соли.(1) Влияние основания. К дегидрированной соли уридин 5'монофосфата трибутиламина (УМФ-ТБА) (6,2 ммоль) добавили ДМА (8 мл) и к этой смеси при перемешивании добавляли по каплям ДФХ (1,7 мл). Полученную таким образом смесь оставили для взаимодействия при комнатной температуре в течение 1 ч с образованием при этом УМФДФФ, после чего ТБА (7,6 мл) добавили к реакционной смеси, которую перемешивали еще 10 мин. Тем временем дегидрированный ТЭА-ПФ(3,0 ммоль) растворили в пиридине (1,7 мл) и полученный при этом раствор добавили к реакционной смеси УМФ-ДФФ. Затем смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и добавили к этой смеси воду для прекращения, таким образом, реакции. Полученную реакционную смесь анализировали методом ВЭЖХ (при 262 нм), показавшим, что целевойU2P4 был получен с выходом 18,3%. Как очевидно из этого результата, когда УМФ-ДФФ взаимодействует с ТЭА-ПФ в присутствии основания (пиридина), U2P4 можно синтезировать с выходом, примерно в два раза превышающим выход, полученный обычным способом.(2) Влияние использования сочетания основания и обработки щелочью. 5 К дегидрированной соли уридин 5'монофосфата трибутиламина (УМФ-ТБА) (6,2 ммоль) добавили ДМА (8 мл) и к этой смеси добавляли по каплям при перемешивании ДФХ(1,7 мл). Полученная при этом смесь реагировала при комнатной температуре в течение 1 ч с образованием при этом УМФ-ДПФ, после чего к реакционной смеси добавили ТБА (7,6 мл) и перемешивали смесь еще 10 мин. Тем временем,дегидрированный ТЭА-ПФ (3,0 ммоль) растворили в пиридине (1,7 мл) и полученный при этом раствор добавили к УМФ-ДФФ реакционной смеси. После этого смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и к смеси добавили воду для того, чтобы остановить, таким образом, реакцию. К полученной таким образом реакционной смеси добавили 30% раствор гидроксида натрия с тем, чтобы довести рН до 11,0 и оставили смесь на ночь. Полученную реакционную смесь анализировали методом ВЭЖХ (при 262 нм) , который показал,что целевой U2P4 получили с выходом 29,7%. Как очевидно из этого результата, когда УМФ-ДФФ взаимодействует с ТЭА-ПФ в присутствии основания (пиридина) и после этого проводят обработку щелочью, U2P4 можно синтезировать с выходом, примерно в три раза превышающим выход, полученный по обычному способу.(3) Влияние основания и добавления УМФ-ДФФ несколькими порциями. К триэтиламиновой соли дегидрированной пирофосфорной кислоты (ТЭА-ПФ) (6 ммоль) добавили формамид (1,5 мл) и пиридин (1,5 мл) и перемешивали смесь в сосуде. Тем временем в другом сосуде к дегидрированной соли уридин 5'-монофосфата трибутиламина (УМФ-ТБА) (12 ммоль) добавили ДМА (4,3 мл), диоксан (4,8 мл) и трибутиламин (ТБА) (5,8 мл) и смесь перемешивали. После этого к смеси добавили по каплям ДФХ (2,5 мл) и полученную при этом смесь перемешивали еще при комнатной температуре в течение 1 ч для получения в результате УМФДФФ. Половину реакционной смеси УМФ-ДФФ добавили по каплям в сосуд, содержащий ТЭАПФ, и оставили реакционную смесь для взаимодействия при комнатной температуре на 1 ч. Затем к смеси добавили пиридин (1,5 мл) и в сосуд добавили по каплям оставшуюся реакционную смесь УМФ-ДФФ. После этого полученная реакционная смесь реагировала при комнатной температуре в течение часа, и к смеси добавили воду для того, чтобы остановить, таким образом, реакцию. Полученную реакционную смесь анализировали методом ВЭЖХ (при 262 нм), который показал, что целевой U2P4 получили с выходом 29,5%. Из этого результата очевидно, что когда УМФ-ДФФ добавляют в виде двух порций и УМФ-ДФФ взаимодействует с ТЭА-ПФ в присутствии основания (пиридина), U2P4 можно синтезировать с выходом, примерно в три раза 6 превышающим выход, полученный по обычному способу. Из этого результата также очевидно, что добавление УМФ-ДФФ в виде двух порций обеспечивает выход 29,5%, что примерно в 1,6 раза больше выхода, полученного в описанном выше (1) (18,3%).(4) Влияние обработки щелочью. К триэтиламиновой соли дегидрированной пирофосфорной кислоты (ТЭА-ПФ) (6 ммоль) добавили формамид (1,5 мл) и пиридин (1,5 мл) и перемешивали смесь в сосуде. Тем временем в другом сосуде к дегидрированной соли уридин 5'-монофосфата трибутиламина (УМФ-ТБА) (12 ммоль) добавили ДМА (4,3 мл), диоксан (4,8 мл) и трибутиламин (ТБА) (5,8 мл) и смесь перемешивали. Затем к этой смеси добавили по каплям ДФХ (2,5 мл) и полученную при этом смесь перемешивали при комнатной температуре еще в течение 1 ч для получения в результате УМФДФФ. Половину реакционной смеси УМФ-ДФФ добавили по каплям в сосуд, содержащий ТЭАПФ и оставили реакционную смесь для взаимодействия при комнатной температуре на 1 ч. Затем к смеси добавили пиридин (1,5 мл) и в сосуд добавили по каплям оставшуюся реакционную смесь УМФ-ДФФ. Затем полученная реакционная смесь реагировала при комнатной температуре в течение часа и к смеси добавили воду для того, чтобы остановить таким образом реакцию. К полученной таким образом реакционной смеси добавили 30% раствор гидроксида натрия с тем, чтобы довести рН до 11,0 и оставили смесь на ночь. Полученную реакционную смесь анализировали методом ВЭЖХ (при 262 нм), который показал, что целевой U2P4 получили с выходом 32,2%. Из этого результата очевидно, что когда к вышеописанному (3) добавляют обработку щелочью, выход увеличивается примерно на 10%,т.е. от 29,5 до 32,2%. Способ получения U2P4 или его соли в соответствии с настоящим изобретением осуществляется с высоким выходом и делает возможным крупномасштабный синтез. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения Р 1,Р 4-ди(уридин 5'-)тетрафосфата или его соли из уридин 5'монофосфата (УМФ), служащего в качестве исходного вещества, и с использованием дифенилфосфорохлоридата (ДФХ) и пирофосфата(ПФ), включающий по меньшей мере одну из следующих стадий обработки (а)-(с):(УМФ-ДФФ) отдельными порциями во время стадии взаимодействия УМФ-ДФФ с солью ПФорганической щелочи;(b) проведение стадии взаимодействия УМФ-ДФФ с солью ПФ-органической щелочи в присутствии основания и(c) дальнейшую обработку синтезированного U2P4 щелочью.