Антагонистические антитела против htnfsf13b человека

009074 Известно, что лиганды TNF-семейства относятся к наиболее плейотропным цитокинам, включающим большое число клеточных ответных реакций, включая пролиферацию, цитотоксичность, антивирусную активность, иммунорегулирующую активность и регулирование транскрипции нескольких генов. С наступлением эпохи массового EST-секвенирования в последние несколько лет TNF-семейство цитокинов и рецепторов сильно расширилось. TNFSF13b представляет собой официальное название, принятое TNF-конгрессом для BlysS, TALL-1, BAFF, THANK, нейрокина- и zTNF (см. обзор Lockslev et al.,Cell, 2001, 104:487). TNFSF13b человека (hTNFSF13b) представляет собой 285-аминокислотный типа II мембранно-связанный белок, который обладает N-концевым сайтом расщепления, что дает возможность существования как растворимого, так и мембранно-связанного белков. Функционально, TNFSF13b регулирует В-клеточные и некоторые Т-клеточные иммунные ответные реакции. Исследования синдрома септического шока и других заболеваний, возникающих из-за сверхпродуцирования воспалительных цитокинов, показали, что страдающий заболеванием хозяин должен часто противодействовать высоким уровням цитокинов путем высвобождения растворимых рецепторов цитокинов или с помощью синтеза высокоаффинных антител против цитокинов. Способы лечения, которые имитируют такие природные ответные реакции, рассматриваются как имеющие право на существование терапевтические подходы для облегчения цитокин-опосредованного заболевания. Таким образом, существует признанная необходимость в антителах человека, которые с высоким сродством (аффинностью) связывают цитокины, такие как TNFSF13b, которые включены в регулирование клеточных иммунных процессов, и которые обладают способностью действовать в качестве антагонистов активности цитокинов-мишеней in vitro и in vivo. Хотя заявка на международный патентWO 00/50597 в общих чертах описывает антитела, направленные на TNFSF13b, в этой заявке конкретно не описаны структурные или функциональные характеристики таких антител. Настоящее изобретение относится к антителу против TNFSF13b человека, содержащему по крайней мере три аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей:a. SEQ ID No:4 в CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR);d. SEQ ID No:12 в CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR);f. SEQ ID No:16 в CDR3 HCVR. Также настоящее изобретение относится к указанному антителу, содержащему по крайней мере четыре аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей:a. SEQ ID No:4 в CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR);d. SEQ ID No:12 в CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR);f. SEQ ID No:16 в CDR3 HCVR. Также настоящее изобретение относится к указанному антителу, содержащему по меньшей мере пять аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей:a. SEQ ID No:4 в CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR);d. SEQ ID No:12 в CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR);f. SEQ ID No:16 в CDR3 HCVR. Настоящее изобретение относится к указанному антителу, содержащему аминокислотные последовательности:a. SEQ ID No:4 в CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR);d. SEQ ID No:12 в CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR);f. SEQ ID No:16 в CDR3 HCVR. Настоящее изобретение относится к антителу против hTNFSF13b человека, содержащему аминокислотную последовательность вариабельной области (LCVR) легкой цепи SEQ ID No:2, или аминокислотную последовательность вариабельной области (HCVR) тяжелой цепи SEQ ID No:10. Настоящее изобретение относится к указанному антителу, содержащему аминокислотную последовательность LCVRSEQ ID No:2, и аминокислотную последовательность HCVR SEQ ID No:10. Также настоящее изобретение относится к указанному антителу, дополнительно содержащему константную область IgG4 с заменой серина на пролин в положении 231. Также настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей указанные-1 009074 выше антитела. Настоящее изобретение относится к применению вышеуказанных антител для производства лекарственного средства для введения пациенту, страдающему заболеванием, выбранным из системной красной волчанки, ревматоидного артрита, ювенильного хронического артрита, артрита Лима, болезни Крона, язвенного колита, воспалительного заболевания кишечника, астмы, аллергических заболеваний, псориаза, острого или хронического иммунного заболевания, связанного с трансплантацией органа, отторжения трансплантированного органа, заболевания трансплантат-против-хозяина, саркоидоза, инфекционных заболеваний, паразитарных заболеваний, женского бесплодия, аутоиммунной тромбоцитопении,аутоиммунного заболевания щитовидной железы, болезни Хасимото, синдрома Шегрена и рака. Фиг. 1 - график, иллюстрирующий ингибирование индуцированной hTNFSF13b и IL-1 пролиферации клеток Т 1165.17 антителом человека 4 А 5-3.1.1.-В 4. Фиг. 2 - график, иллюстрирующий нейтрализацию индуцированной hTNFSF13b пролиферации антителом человека 4 А 5-3.1.1.-В 4 первичных В-клеток человека, стимулированных анти-IgM. Для более легкого понимания изобретения первоначально определены некоторые термины. Антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина, состоящую из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей (примерно 50-70 КДа) и двух легких (L) цепей (примерно 25 КДа), связанных между собой дисульфидными мостиками. Легкие цепи классифицируют как каппа и лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон и определяют изотип антитела как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначенную здесь как HCVR) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и СН 3 для IgG, IgD и IgA и четырех доменов CH1, CH2, СН 3, СН 4 для IgM и IgE. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначенной здесь как LCVR) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен, CL. Области HCVR и LCVR могут дополнительно подразделяться на участки гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность участками(CDR), размещенные между участками, которые являются более хорошо сохраняющимися и называются каркасными участками (FR). Каждая HCVR и LCVR состоит из трех участков CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3,CDR3, FR4. Распределение аминокислот для каждого домена находится в соответствии с хорошо известными договоренностями [Kabat et al., Seguencing of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, Department of Health and Human Services, NIH Publication, No. 91-3242 (1991); Chotia et al., J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987); Chotia et al., Nature 342:878-883 (1989)]. Функциональные характеристики антитела для связывания с конкретным антигеном определяются участками CDR. В настоящем описании подразумевается, что термин антитело относится к моноклональному антителу как таковому. Моноклональное антитело может представлять собой антитело человека, химерное антитело, гуманизированное антитело, Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')2 или одноцепочечный FV-фрагмент. Предпочтительно термин антитело относится к антителу человека. Термин антитело человека включает антитела, имеющие вариабельные и константные области,соответствующие иммуноглобулиновым последовательностям зародышевых линий человека. При применении для лечения человека антитела человека имеют ряд преимуществ по сравнению с антителами особей, отличных от человека, и химерными антителами. Например, эффекторная часть антитела человека может лучше взаимодействовать с другими частями иммунной системы человека (например, разрушать клетки-мишени более эффективно за счет комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) или антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC. Другим преимуществом является то, что иммунная система человека не будет распознавать антитела человека в качестве чужеродных, и поэтому гуморальный иммунный ответ против такого инъецированного антитела будет меньшим, чем против чужеродного в целом антитела особи, не являющейся человеком, или частично чужеродного химерного антитела. Кроме того, сообщалось, что антитела особей, отличных от человека, имеют период полураспада в кровотоке человека намного более короткий, чем период полураспада антител человека. Инъецированные антитела человека будут иметь период полураспада, по существу, идентичный таковому для существующих в природе антител человека, что позволяет вводить меньшие и менее частые дозы. Термин hTNFSF13b относится к человеческой форме члена семейства лигандов фактора некроза опухоли, описанного в заявках на международный патент WO 98/18921 и WO 00/50597 (упоминаемый в них как нейтрокин-). Подразумевается, что термин TNFSF13b охватывает hTNFSF13b, а также гомологи hTNFSF13b, полученные от других видов. Подразумевается, что термины hTNFSF13b иTNFSF13b включают такие их формы, которые могут быть получены стандартными методами рекомбинантной экспрессии или закуплены коммерчески (Research Diagnostics Inc. Catalog No. RDI-3113, rhuBAFF, Flanders, N.J.), а также генерированы синтетически. Выражение биологическое свойство, биологическая характеристика и термин активность при упоминании антитела по настоящему изобретению используются взаимозаменяемо в данном описа-2 009074 нии и включают, но не ограничиваются указанным, сродство к антигенной детерминанте и специфичность (например, связывание антитела против hTNFSF13b человека с hTNFSF13b), способность действовать в качестве антагонистов активности полипептида-мишени (например, активности TNFSF13b), стабильность антитела in vivo и иммуногенные свойства антитела. Другие идентифицируемые биологические свойства или характеристики антитела, известные в данной области, включают, например, перекрестную реактивность (т.е. реакционную способность по отношению к гомологам полипептида-мишени особей, отличных от людей, или к другим белкам или тканям, в общем) и способность сохранять высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих. Вышеуказанные свойства или характеристики можно наблюдать или измерять с использованием известных в данной области методов, включая, но не ограничиваясь указанным, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), конкурентный ELISA, анализ поверхностного плазмонного резонанса, анализы нейтрализации in vitro и in vivo (например, см. пример 2) и иммуногистохимически для срезов тканей из различных источников, включая человека, примата или любой другой источник, в котором может возникнуть необходимость. Конкретные активности и биологические свойства антител против hTNFSF13b человека описаны более подробно в приведенных ниже примерах. Выражение положение контакта включает положение аминокислоты в CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, которое занимает аминокислота, которая контактирует с антигеном. Если аминокислота CDR контактирует с антигеном, то такая аминокислота может рассматриваться, как занимающая положение контакта. Выражение консервативное замещение или консервативное замещение аминокислоты относится к замещениям аминокислот, возникающим или за счет природных мутаций, или в результате манипуляций человека, когда антитела, продуцируемые с использованием таких замещений, имеют, по существу, ту же самую (или улучшенную, или пониженную, как может быть желательно) активность(и),что и описанные здесь антитела. Термин антигенная детерминанта (эпитоп), как он использован в данном описании, относится к области молекулы белка, с которой может связываться антитело. Выражение иммуногенная антигенная детерминанта определяется как часть белка, которая вызывает ответ в виде антител, когда целый белок представляет собой иммуноген. Термин связывание, как он использован в данном описании, обычно относится к взаимодействию антитела с антигенной детерминантой антигена. Более конкретно, термин связывание относится к сродству антитела к антигенной детерминанте антигена. Сродство (аффинность) измеряется с использованием KD. Термин ингибировать или ингибирование включает его общепринятое значение, которое включает нейтрализацию, препятствование, предотвращение, сдерживание, замедление, остановку или реверсию развития или тяжести заболевания или болезненного состояния. Термин нейтрализация или действие в качестве антагониста при упоминании антитела противTNFSF13b или выражение антитело, которое действует в качестве антагониста активности TNFSF13b,предназначены для упоминания антитела или фрагмента антитела, чье связывание с TNFSF13b приводит к ингибированию биологической активности, индуцируемой полипептидами TNFSF13b. Ингибирование биологической активности TNFSF13b может быть оценено измерением одного или нескольких in vitro или in vivo индикаторов биологической активности TNFSF13b, включая, но не ограничиваясь указанным,TNFSF13b-индуцируемую пролиферацию, TNFSF13b-индицируемую секрецию иммуноглобулина,TNFSF13b-индуцируемое предотвращение апоптоза В-клеток или ингибирование рецепторного связывания в анализе связывания TNFSF13b с рецептором. Индикаторы биологической активности TNFSF13b могут быть оценены с помощью одного или нескольких in vitro или in vivo анализов, известных в данной области (см., например, Moore P.A. et al., Science, 285:260-263 (1999); Schneider P. et al., J.Exp.Med., 189: 1747-1756 (1999); Shu H. et al., J.Leuko. Biol., 65:680-683 (1999); Mukhopadhyay A. et al., J.Biol.Chem.,274:15978-15981 (1999); Mackay F. et al., J.Exp.Med., 190: 1697-1710 (1999); Gross J.A. et al., Nature, 404: 995-999 (2000); и пример 2). Предпочтительно способность антитела нейтрализовать или действовать в качестве антагониста активности TNFSF13b оценивают по ингибированию пролиферации В-клеток, как показано в примере 2. Термин Koff, как он использован в данном описании, предназначен для упоминания константы скорости обратной реакции (реакции распада комплекса) для диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген. Термин KD, как он использован в данном описании, предназначен для упоминания константы диссоциации или скорости обратной реакции, деленной на скорость прямой реакции (реакции образования комплекса) для конкретного взаимодействия атитело-антиген. В целях настоящего изобретения KD определяли, как показано в примере 4. Выделенное антитело представляет собой такое антитело, которое было идентифицировано и отделено, и/или выделено из компонентов его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой вещества, которые будут мешать диагностическим или терапевтическим применениям антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелко-3 009074 вые растворенные вещества. Обычно выделенное антитело получают с использованием по крайней мере одной стадии очистки. В предпочтительных вариантах осуществления антитело будет очищено (1) до степени, превышающей 95% по весу антитела, как определено методом Лоури, и наиболее предпочтительно, превышающей 99% по весу антитела, и (2) до гомогенности, как определено с использованиемSDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания кумасси синим или, предпочтительно, серебряным красителем. Предпочтительно выделенное антитело представляет собой антитело, которое, по существу, не содержит других антител, обладающих различной антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое специфически связываетhTNFSF13b, по существу, не содержит антител, которые специфически связывают антигены, отличающиеся от полипептида hTNFSF13b). Выражение молекула нуклеиновой кислоты включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную молекулу ДНК. Выражение изолированная молекула нуклеиновой кислоты, как оно использовано в данном описании со ссылкой на нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела или фрагменты антител (например,HCVR, LCVR, CDR3), которые связывают полипептид hTNFSF13b, включает молекулу нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая антитело или часть антитела, не содержит других нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела или фрагменты антител, которые связывают антигены, отличающиеся от полипептида hTNFSF13b; такие другие последовательности могут в природных условиях фланкировать нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению в геномной ДНК человека. Таким образом, например, изолированная нуклеиновая кислота по изобретению,кодирующая HCVR-область антитела против hTNFSF13b человека, не содержит других последовательностей, кодирующих области HCVR, которые связывают антигены, отличающиеся от полипептидаhTNFSF13b. Термин вектор включает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую молекулу нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Один тип вектора представляет собой плазмиду, которая относится к кольцевой двухцепочечной петле ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы,имеющие бактериальное начало репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы(например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клеткихозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы упоминаются в данном описании как рекомбинантные векторы экспрессии (или просто векторы экспрессии). Обычно векторы экспрессии, имеющие применение в технологии рекомбинантных ДНК, часто имеют форму плазмид. В настоящем описании термины плазмида и вектор могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку плазмида является, как правило, наиболее используемой формой вектора. Однако подразумевается, что изобретение включает также другие формы векторов экспрессии, такие как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции. Нуклеиновая кислота является оперативно (функционально) связанной, когда она находится в функциональном отношении с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для препоследовательности или секреторного лидера оперативно связана с ДНК для полипептида, если он экспрессируется в качестве белка-предшественника, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер являются оперативно связанными с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы является оперативно связанным с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, что облегчает трансляцию. Обычно оперативно связанный означает, что связанные ДНК-последовательности являются смежными и, в случае секреторного лидера, являются смежными и в рамке считывания. Однако энхансеры не должны быть смежными. Связывание осуществляют лигированием в подходящих рестрикционных сайтах. Если такие сайты не существуют, в соответствии с обычной практикой используют синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры. Термин рекомбинантный при упоминании антитела включает антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами. Иллюстративные примеры включают антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина; антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител человека; антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным по иммуноглобулиновым генам человека; или антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют любыми способами, которые включают сплайсинг последовательностей иммуноглобулиновых генов человека в другие ДНК-последовательности. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, полученные из иммуноглобулиновых последовательностей зароды-4 009074 шевых линий человека. Выражение рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин) включает клетку, в которую введен рекомбинантный вектор экспрессии. Следует понимать, что такие термины предназначены для упоминания не только конкретной клетки субъекта, но и потомства такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут происходить в последующих поколениях или вследствие мутации, или под влиянием окружающей среды, такое потомство в действительности может быть не идентичным родительской клетке, но все еще включено в объем термина клетка-хозяин, как он использован в настоящем изобретении. Рекомбинантные антитела человека также могут быть подвергнуты мутагенезу in vitro (или когда используется животное, трансгенное по Ig последовательностям человека, соматическому мутагенезу invivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей HCVR и LCVR рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и являются производными последовательностей HCVR- и LCVR- зародышевых линий человека, в природных условиях, могут не существовать в составе антител зародышевой линии человека in vivo. Можно использовать трансгенных животных (например, мышей), которые способны, при иммунизации, продуцировать полный набор антител человека в отсутствие эндогенного иммуноглобулинового продуцирования. Перенос комплекта иммуноглобулиновых генов зародышевой линии человека в такую зародышевую линию мышей-мутантов будет приводить к продуцированию антител человека при антигенном вызове (см., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555 (193); Jakobovits(1994), Nature Biotechnology 14:826 (1996); Gross J.A. et al., Nature, 404: 995-999 (2000); и патенты США 5877397, 5874299, 5814318, 5789650, 5770429, 5661016, 5633425, 5625126, 5569825 и 5545806, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте для всех целей). Антитела человека также можно получать в библиотеках фагового представления (Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol., 227:381 (1992); Marks et al., J.Mol.Biol., 222:581 (1991. Методики Cole et al. и Boerner et al.,также доступны для получения моноклональных антител человека (Cole et al., Monoclonal Antibodies andCancer Therap., Alan R. Liss, p.77 (1985) и Boerner et al., J.Immunol., 147(1): 86-95 (1991. Контейнер означает любые вместилище и средство для закрывания, подходящие для хранения,транспортировки, отпуска и/или обработки фармацевтического продукта. Упаковочный материал означает подходящее для покупателя приспособление, дающее возможность удобного введения и/или вспомогательные приспособления, которые способствуют доставке, просвещению и/или введению. Упаковочный материал может улучшать введение антитела пациенту, сокращать или уменьшать образовательное время инструктажа для пациента, обеспечивать основу для усовершенствованных экономических исследований здоровья и/или ограничивать объем работы по каналам распределения. Также упаковочный материал может включать, но не ограничивается этим, упаковку на основе бумаги, упаковку в усадочную пленку, упаковку с полупрозрачной верхней частью, пробные премиальные купоны, образовательные материалы, вспомогательные принадлежности и/или устройство доставки. Вкладыш к упаковке означает информацию, сопровождающую продукт, которая обеспечивает описание того, каким образом вводить продукт, вместе с данными по его безопасности и эффективности,необходимыми для того, чтобы лечащий врач, фармацевт и пациент приняли на основе информации решение, касающееся применения продукта, и/или содержит образовательную информацию для пациента. Вкладыш к упаковке обычно рассматривается как этикетка для фармацевтического продукта. Субъект означает млекопитающее, предпочтительно человека, нуждающегося в лечении. Касательно настоящего изобретения субъекты, нуждающиеся в лечении, включают млекопитающих, которые страдают от заболевания или предрасположены к заболеванию, при котором нежелательна активностьTNFSF13b, например, иммунные заболевания, включая аутоиммунные заболевания, и воспалительные заболевания. Предпочтительные заболевания включают, но не ограничиваются этим, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, артрит Лима, болезнь Крона,язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, астму, аллергические заболевания, псориаз,заболевание трансплантат-против-хозяина, отторжение трансплантированного органа, острое или хроническое иммунное заболевание, связанное с трансплантацией органа, саркоидоз, инфекционные заболевания, паразитарные заболевания, женское бесплодие, аутоиммунную тромбоцитопению, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, болезнь Хасимото, синдром Шегрена и раки, в частности В- или Тклеточные лимфомы или миеломы. Различные аспекты изобретения описаны более подробно в следующих подразделах. Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам человека, которые являются специфическими и нейтрализуют биоактивные полипептиды hTNFSF13b. Также описаны аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи антитела, которые являются высокоспецифическими и нейтрализуют полипептиды TNFSF13b, которые связываются с ними. Такая высокая специфичность позволяет использовать антитела против hTNFSF13b человека и моноклональные антитела человека с аналогичной специфичностью для иммунотерапии TNFSF13b-связанных заболеваний.-5 009074 В одном аспекте изобретение относится к выделенному антителу человека, которое включает по крайней мере одну из аминокислотных последовательностей, указанных как SEQ ID No:2, 4, 6, 8, 10, 12,14 или 16, и которое связывает антигенную детерминанту полипептида TNFSF13b с высокой аффинностью, диссоциирует от связанного полипептида TNFSF13b с низкой константой скорости Koff, составляющей 110-4 с-1 или менее и обладает способностью действовать в качестве антагониста активности полипептида TNFSF13b. В одном варианте осуществления антитело против hTNFSF13b человека включает полипептид, выбранный из группы, состоящей из CDR1-полипептида LCVR, представленного SEQHCVR, представленного SEQ ID No:14; и CDR3-пoлипeптидa HCVR, представленного SEQ ID No:16. В другом варианте осуществления антитело против hTNFSF13b человека включает по крайней мере два полипептида, выбранных из группы, состоящей из CDR1-полипептида LCVR, представленного SEQ IDHCVR, представленного SEQ ID No:14; и CDR3-пoлипeптидa HCVR, представленного SEQ ID No:16. В другом варианте осуществления антитело против hTNFSF13b человека включает по крайней мере три полипептида, выбранных из группы, состоящей из CDR1-полипептида LCVR, представленного SEQ IDHCVR, представленного SEQ ID No:14; и CDR3-полипептида HCVR, представленного SEQ ID No:16. В другом варианте осуществления антитело против hTNFSF13b человека включает по крайней мере четыре полипептида, выбранных из группы, состоящей из CDR1-полипептида LCVR, представленного SEQ IDHCVR, представленного SEQ ID No:14; и CDR3-полипептида HCVR, представленного SEQ ID No:16. В другом варианте осуществления антитело против hTNFSF13b человека включает по крайней мере пять полипептидов, выбранных из группы, состоящей из CDR1-полипептида LCVR, представленного SEQ IDHCVR, представленного SEQ ID No:14; и CDR3-пoлипeптидa HCVR, представленного SEQ ID No:16. В другом варианте осуществления антитело против hTNFSF13b человека включает следующие полипептиды: CDR1-полипептид LCVR, представленный SEQ ID No:4; CDR2-пoлипeптид LCVR, представленныйSEQ ID No:6; CDR3-полипептид LCVR, представленный SEQ ID No:8; CDR1-полипептид HCVR, представленный SEQ ID No:12; CDR2-пoлипeптид HCVR, представленный SEQ ID No:14; и CDR3 полипептид HCVR, представленный SEQ ID No:16. Более предпочтительно антитело против hTNFSF13b человека включает полипептид вариабельной области легкой цепи (LCVR), представленный SEQ ID No:2, или полипептид вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), представленный SEQ ID No:10. Еще более предпочтительно антитело противhTNFSF13b человека включает полипептид LCVR, представленный SEQ ID No:2, и полипептид HCVR,представленный SEQ ID No:10. В предпочтительных вариантах осуществления выделенное антитело человека диссоциирует от связанного TNFSF13b-полипептида с константой скорости Koff, составляющей 510-5 с-1 или менее, и ингибирует индуцированную TNFSF13b пролиферацию в анализе нейтрализации in vitro с IС 50, составляющей 110-7 М или менее. В более предпочтительных вариантах осуществления выделенное антитело человека диссоциирует от связанной антигенной детерминанты полипептида TNFSF13b с константой скоростиKoff, составляющей 110-5 с-1 или менее, и ингибирует индуцированную TNFSF13b пролиферацию в анализе нейтрализации in vitro с IC50, составляющей 110-8 М или менее. В еще более предпочтительном варианте осуществления выделенное антитело против TNFSF13b человека диссоциирует от связанного полипептида TNFSF13b с константой скорости Koff, составляющей 510-6 с-1 или менее, и ингибирует индуцированную TNFSF13b пролиферацию в анализе in vitro с IC50, составляющей 110-9 М или менее. Примеры антител против hTNFSF13b человека, которые отвечают вышеуказанным критериям кинетики и нейтрализации, включают антитела 4 А 5-3.1.1.-В 4. Наиболее предпочтительное антитело против hTNFSF13b человека по настоящему изобретению упоминается в данном описании как 4 А 5-3.1.1.-В 4. 4 А 5-3.1.1.-В 4 имеет LCVR- и HCVR-полипептидные последовательности, представленные SEQ ID No:2 и SEQ ID No:10 соответственно. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая LCVR и HCVR 4A5-3.1.1.-B4, показана в SEQ ID No:1 и в SEQ ID No:9 соответственно. Свойства антител против hTNFSF13b человека по настоящему изобретению конкретно описаны в примерах. Особенно примечательно высокое сродство к полипептиду TNFSF13b, низкая кинетика диссоциации и высокая способность проявлять антагонизм в отношении активности полипептидаTNFSF13b, продемонстрированная 4 А 5-3.1.1.-В 4. Константа Koff антитела против hTNFSF13b человека может быть определена с использованием по-6 009074 верхностного плазмонного резонанса, как описано в общем виде в примере 4. Обычно, анализ методом поверхностного плазмонного резонанса измеряет в реальном времени взаимодействие связывания между лигандом (рекомбинантным полипептидом TNFSF13b, иммобилизованным на биосенсорном матриксе) и аналитом (антитела в растворе) с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием системы BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). SPR-анализ также может быть осуществлен путем иммобилизации аналита (антител на биосенсорном матриксе) и присутствующего лиганда (рекомбинантный TNFSF13b в растворе). В одном аспекте настоящее изобретение также относится к клеточным линиям, которые продуцируют антитела против hTNFSF13b человека по настоящему изобретению. Выделение клеточных линий,продуцирующих моноклональные антитела по изобретению, может быть осуществлено с использованием рутинных методов скрининга, известных в данной области. Гибридома, которая продуцирует антитела против hTNFSF13b человека по настоящему изобретению, была размещена в АТСС (Американская коллекция типовых культур) (АТСС РТА-3674), как указано в данном описании. Для экспрессирования антител по настоящему изобретению можно использовать широкое множество экспрессионных систем-хозяев, включая бактериальные, дрожжевые, бакуловирусные, растительные системы экспрессии и систему экспрессии млекопитающих (а также экспрессионные системы фагового представления). Примером подходящего бактериального вектора экспрессии является pUC119 (Sfi). Другие системы экспрессии антител также известны в данной области и рассматриваются в данном описании. Антитело по изобретению может быть получено с помощью рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина в клетке-хозяине. Для рекомбинантного экспрессирования антитела клетку-хозяина трансфицируют одним или несколькими рекомбинантными векторами экспрессии,несущими фрагменты ДНК, кодирующие легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов антител таким образом, что легкие и тяжелые цепи экспрессируются клеткой-хозяином. Предпочтительно рекомбинантные антитела секретируются в среду, в которой культивируют клетки-хозяева, антитела могут быть выделены из данной среды. Стандартные методологии рекомбинантной ДНК используют для получения генов тяжелых и легких цепей антитела, включения данных генов в рекомбинантные векторы экспрессии и введения векторов в клетки-хозяева. Изолированные ДНК, кодирующие область HCVR, могут быть превращены в полный ген тяжелой цепи с помощью функционального связывания HCVR-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CH1, CH2 и СН 3). ДНК-последовательности константной области генов тяжелой цепи человека известны в данной области, и ДНК-фрагменты, охватывающие данные области, могут быть получены стандартным ПЦР-амплифицированием. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM илиIgD и любой ее аллотипический вариант, как описано Rabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242(1991, но наиболее предпочтительно представляет собой константную область IgGl или IgG4. Альтернативно, часть антитела может представлять собой Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')2 или одноцепочечный FV-фрагмент. Для гена тяжелой цепи Fab-фрагмента HCVR-кодирующая ДНК может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область СН 1 тяжелой цепи. Изолированная ДНК, кодирующая LCVR-область, может быть преобразована в полный ген легкой цепи (а также ген легкой цепи Fab) путем функционального связывания LCVR-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, CL. ДНК-последовательности константной области генов легкой цепи человека известны в данной области, и ДНК-фрагменты, охватывающие данные области, могут быть получены стандартным ПЦР-амплифицированием. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа или лямбда. Для создания гена scFV, HCVR- и LCVR-кодирующие фрагменты ДНК функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(Gly4-Ser)3, так что HCVR- иLCVR-последовательности могут экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка сLCVR- и HCVR- областями, связанными гибким линкером (см., например, Bird et al., Science 242:423-426(1990. Для экспрессирования антител по изобретению ДНК, кодирующие частичные или полные легкие и тяжелые цепи, полученные как описано выше, вставляют в векторы экспрессии, так что гены являются функционально связанными с транскрипционными и трансляционными контрольными последовательностями. Ген антитела лигируют в вектор так, что транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности внутри вектора служат для предназначенной им функции регулирования транскрипции и трансляции гена антитела. Вектор экспрессии и контрольные последовательности экспрессии выбирают таким образом, чтобы они были совместимы с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельные векторы или,-7 009074 более типично, оба гена вставляют в один и тот же вектор экспрессии. Гены антител вставляют в вектор экспрессии стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и векторе, или лигированием по тупым концам, если сайты рестрикции не присутствуют). Дополнительно или альтернативно рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела против hTNFSF13b человека из клеткихозяина. Ген цепи антитела против hTNFSF13b антитела человека может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид будет связан внутри рамки считывания с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой иммуноглобулиновый сигнальный пептид или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид из неиммуноглобулинового белка). В дополнение к генам цепей антитела рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению несут регулирующие последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антитела в клеткехозяине. Регулирующие последовательности включают промоторы, энхансеры и другие контрольные элементы экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Специалистам в данной области будет понятно, что дизайн вектора экспрессии, включая селекцию регулирующих последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемых клеток-хозяев, уровень экспрессии желаемого белка и т.д. Предпочтительные последовательности, регулирующие экспрессию в клетках-хозяевах млекопитающих, включают вирусные элементы, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV) (такие какCMV промотор/энхансер), обезьяньего вируса 40 (SV4 0) (такие как SV40 промотор/энхансер), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP и полиомы. В дополнение к генам цепей антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, начало репликации) и гены селектируемых маркеров. Гены селектируемых маркеров облегчают селекцию клетокхозяев, в которые был введен вектор. Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую был введен вектор. Предпочтительные гены селектируемых маркеров включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в dhfr-клетках-хозяевах с метотрексатной селекцией/амплификацией) и neo ген (для G418-селекции). Для экспрессии легких и тяжелых цепей вектор(ы) экспрессии, кодирующий тяжелые и легкие цепи, трансфицируют в клетку-хозяина с помощью стандартных способов. Различные формы термина трансфекция предназначены для того, чтобы охватить широкое разнообразие способов, обычно используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина,например электропорация, кальций-фосфатная преципитация, DEAE-декстрановая трансфекция и тому подобное. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела по изобретению или в прокариотических, или в эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках, и наиболее предпочтительно в клетках-хозяевах млекопитающих, является наиболее предпочтительной, поскольку такие эукариотические клетки, и в частности клетки млекопитающих, с большей вероятностью по сравнению с прокариотическими клетками будут собирать и секретировать правильно сложенное и иммунологически активное антитело. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессирования рекомбинантных антител по изобретению включают клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО) (включая клетки dhfr-CHO, описанные в Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:42164220 (1980), используемые с селектируемым маркером DHFR, например, как описано в R.J.Kaufman andP.A.Sharp, Mol. Biol., 159:601-621 (1982, клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. Когда рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антител, вводят в клетки-хозяева млекопитающих,антитела получают культивированием клеток-хозяев в течение промежутка времени, достаточного для экспрессии антитела в клетках-хозяевах или, более предпочтительно, для секреции антитела в культуральную среду, в которой растут клетки-хозяева. Антитела могут быть выделены из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белка. Клетки-хозяева также могут использоваться для продуцирования частей целых антител, таких какFab-фрагменты одноцепочечных FV-молекул. Следует понимать, что варианты вышеуказанного способа включены в объем настоящего изобретения. Например, может оказаться желательным трансфицировать клетку-хозяина с использованием ДНК, кодирующей или легкую цепь, или тяжелую цепь (но не обе) антитела по изобретению. Технология рекомбинантных ДНК также может быть использована для удаления некоторых или всех ДНК, кодирующих любую или обе из легких и тяжелых цепей, которые не являются необходимыми для связывания с hTNFSF13b. Антитела по изобретению также охватывают молекулы, экспрессируемые из таких усеченных молекул ДНК. В одной системе для рекомбинантной экспрессии антитела по настоящему изобретению, рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий как тяжелую цепь антитела, так и легкую цепь антитела, вводят в клетки dhfr-CHO с помощью опосредованной кальций-фосфатом трансфекции. В рекомбинантном векторе экспрессии каждый из генов тяжелой и легкой цепи антитела функционально связан с регулирующими элементами энхансер/промотор (напри-8 009074 мер, полученными из SV40, CMV, аденовируса и тому подобных, как например, регулирующий элемент энхансер CMV/промотор AdMLP или регулирующий элемент энхансер SV40/промотор AdMLP) для обеспечения высоких уровней транскрипции генов. Рекомбинантный вектор экспрессии также содержитDHFR-ген, который дает возможность осуществлять селекцию клеток СНО, которые были трансфицированы вектором, с использованием метотрексатной селекции/амплификации. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивируют, чтобы дать им возможность экспрессировать тяжелые и легкие цепи антитела, и целое антитело выделяют из культуральной среды. Стандартные методы молекулярной биологии используются для получения рекомбинантного вектора экспрессии, трансфекции клетокхозяев, отбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и выделения антитела из культуральной среды. Антитела или их антиген-связывающие части по изобретению могут экспрессироваться в животном (например, мыши), которое является трансгенным в отношении генов иммуноглобулина человека(см., например, Taylor L.D., et al., Nucl.Acids Res., 20:6287-6295 (1992. Клетки растений также могут быть модифицированы для создания трансгенных растений, которые экспрессируют антитела или их антиген-связывающие части по изобретению. Исходя из вышеизложенного, другой аспект настоящего изобретения относится к нуклеиновым кислотам, векторам и композициям клеток-хозяев, которые можно использовать для рекомбинантной экспрессии антител или частей антител по изобретению. Предпочтительно отличительной особенностью изобретения являются изолированные нуклеиновые кислоты, которые кодируют CDR 4A5.-3.1.1.-B4 или полную вариабельную область тяжелой и/или легкой цепи 4 А 5-3.1.1.-В 4. Соответственно, в одном варианте осуществления изобретение относится к изолированной нуклеиновой кислоте, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи антитела, которая кодирует CDR3 тяжелой цепи 4 А 5-3.1.1.-В 4, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID No:16. Предпочтительно, нуклеиновая кислота,кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела, дополнительно кодирует CDR2 тяжелой цепи 4 А 5-3.1.1.-В 4, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID No:14. Более предпочтительно нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела, дополнительно кодирует CDR1 тяжелой цепи 4 А 5-3.1.1.-В 4, включающий аминокислотную последовательность SEQ IDNo:12. Еще более предпочтительно, изолированная нуклеиновая кислота кодирует вариабельную область тяжелой цепи антитела, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID No:10 (полнаяHCVR-область 4 А 5-3.1.1.-В 4). В других вариантах осуществления изобретение относится к изолированной нуклеиновой кислоте,кодирующей вариабельную область легкой цепи антитела, которая кодирует CDR3 легкой цепи 4 А 53.1.1.-В 4, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID No:8. Предпочтительно нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела, дополнительно кодирует CDR1 легкой цепи 4 А 5-3.1.1.-В 4, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID No:4. Еще более предпочтительно, изолированная нуклеиновая кислота кодирует вариабельную область легкой цепи антитела, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID No:2 (полная LCVR-область 4 А 53.1.1.-В 4). В другом варианте осуществления изобретение относится к изолированной нуклеиновой кислоте,кодирующей CDR3-домен тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ IDNo:16 (т.е. CDR3 HCVR 4A5-3.1.1.-В 4). Данная нуклеиновая кислота может кодировать только CDR3yчасток или более предпочтительно кодирует полную вариабельную область тяжелой цепи антитела(HCVR). Например, нуклеиновая кислота может кодировать HCVR, имеющую CDR2-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID No:14, (т.е. CDR2 HCVR 4A5-3.1.1.-В 4) и CDR1 домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID No:12, (т.е. CDR1 HCVR 4A5-3.1.1.B4). Еще в одном варианте осуществления изобретение относится к изолированной нуклеиновой кислоте, кодирующей вариабельную область легкой цепи антитела, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID No:2 (т.е. LCVR 4A5-3.1.1.-В 4). Предпочтительно данная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность SEQ ID No:1, хотя квалифицированному специалисту будет понятно, что вследствие вырожденности генетического кода другие нуклеотидные последовательности могут кодировать аминокислотную последовательность SEQ ID No:2. Нуклеиновая кислота может кодировать только LCVR или может также кодировать константную область легкой цепи антитела, оперативно связанную с LCVR. В одном варианте осуществления данная нуклеиновая кислота находится в рекомбинантном векторе экспрессии. В другом варианте осуществления изобретение относится к изолированной нуклеиновой кислоте,кодирующей вариабельную область тяжелой цепи антитела, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID No:10 (т.е. HCVR 4A5-3.1.1.-В 4). Предпочтительно данная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность SEQ ID No:9, хотя квалифицированному специалисту будет понятно, что вследствие вырожденности генетического кода другие нуклеотидные последовательности могут кодировать аминокислотную последовательность SEQ ID No:10. Нуклеиновая кислота может кодировать только HCVR или может также кодировать константную область легкой цепи антитела, оперативно связанную с HCVR. Например, нуклеиновая кислота может включать константную область IgG1 илиIgG4. В одном варианте осуществления данная нуклеиновая кислота находится в рекомбинантном векторе экспрессии. Специалисты в данной области понимают, что модификации аминокислотной последовательности антитела могут приводить к антителу, которое проявляет эквивалентные или превосходящие функциональные характеристики по сравнению с первоначальным антителом. Изменения в антителах по настоящему изобретению могут включать одну или несколько аминокислотных вставок, делеций, замещений,усечений, слияний и тому подобного, либо за счет природных мутаций, либо в результате человеческих манипуляций. Настоящее изобретение охватывает раскрытые в данном описании антитела, дополнительно включающие одно или несколько замещений аминокислот при условии, что такие замещенные антитела имеют, по существу, такую же (или улучшенную, или пониженную, как может быть желательно) активность(и), что и описанные здесь антитела. Предпочтительно CDR по настоящему изобретению имеет 3 или менее консервативных замещения. Предпочтительно CDR по настоящему изобретению имеет 2 или менее консервативных замещения. Предпочтительно CDR по настоящему изобретению имеет 1 консервативное замещение. Квалифицированному специалисту будет очевидно, что антитела, имеющие консервативные замещения аминокислот, могут быть получены множеством способов, известных в данной области. Например, можно использовать ряд методов мутагенеза, включая ПЦР-сборку, Kungel (dutung-) и тиофосфатный (Amersham Sculptor набор) сайт-направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов. Представляющие интерес консервативные замещения показаны в табл. 1 наряду с предпочтительными замещениями. Таблица 1 Консервативные замещения Изобретение также относится к рекомбинантным векторам экспрессии, кодирующим антитело,включающее полипептид, выбранный из группы, состоящей из полипептида, представленного SEQ IDNo:2, полипептида, представленного SEQ ID No:4, полипептида, представленного SEQ ID No:6, полипептида, представленного SEQ ID No:8, полипептида, представленного SEQ ID No:10, полипептида, представленного SEQ ID No:12, полипептида, представленного SEQ ID No:14, и полипептида, представленного SEQ ID No:16. Изобретение также относится к рекомбинантным векторам экспрессии, кодирующим как тяжелую цепь антитела, так и легкую цепь антитела. Например, в одном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному вектору экспрессии, кодирующему:b) тяжелую цепь антитела, имеющую вариабельную область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID No:10; иc) легкую цепь антитела, имеющую вариабельную область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID No:2. Будучи экспрессированными, цельные антитела, их димеры, индивидуальные легкие и тяжелые цепи или другие иммуноглобулиновые формы по настоящему изобретению могут быть очищены в соответствии со стандартными процедурами данной области, включая осаждение сульфатом аммония, ионообменную, аффинную, с обращенной фазой, с гидрофобным взаимодействием колоночную хроматогра- 10009074 фию, гель-электрофорез и тому подобное. Предпочтительными для фармацевтических применений являются, по существу, чистые иммуноглобулины, имеющие по крайней мере от 90 до 95% гомогенности,и наиболее предпочтительны имеющие гомогенность от 98 до 99% или более. Будучи очищенными, частично или до гомогенности при желании, полипептиды затем можно использовать в терапевтических или профилактических целях, как указано в данном изобретении. Антитела по настоящему изобретению могут быть включены в фармацевтические композиции,подходящие для введения субъекту. Обычно, фармацевтическая композиция включает антитело или часть антитела по изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель и/или эксципиент. Фармацевтические композиции для введения разрабатывают таким образом, чтобы они были подходящими для выбранного способа введения, и используют фармацевтически приемлемые разбавители,носители и/или эксципиенты, такие как диспергирующие агенты, буферы, поверхностно-активные вещества, консерванты, солюбилизирующие агенты, изотонические агенты, стабилизирующие агенты и тому подобное, которые являются подходящими. Фармацевтическую композицию, включающую антитело против hTNFSF13b человека по настоящему изобретению, можно вводить млекопитающему при риске возникновения или проявлении родственных аутоиммунности симптомов или патологии, такой как системная красная волчанка, с использованием стандартных способов введения посредством внутривенного, внутриперитонеального, подкожного, легочного, чрескожного, внутримышечного, внутриназального, буккального, сублингвального введения или с помощью суппозитория. Антитела по изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения. Предпочтительной является система периферической доставки посредством внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции. Подходящими носителями для таких инъекций являются те, которые можно вводить непосредственно. Однако, кроме того, введение можно проводить через слизистые мембраны с помощью назальных аэрозолей или суппозиториев. Подходящие препараты для таких способов введения хорошо известны и обычно включают поверхностно-активные вещества, которые облегчают перенос через мембрану. Фармацевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Следовательно, фармацевтические композиции могут быть стерилизованы фильтрованием после получения препарата, или в противном случае они становятся микробиологически доступными. Типичная композиция для внутривенного вливания может иметь объем, составляющий 250 мл жидкости, такой как стерильный раствор Рингера, и концентрацию антитела 1-100 мг/мл или более. Терапевтические агенты по настоящему изобретению могут быть заморожены или лиофилизированы для хранения с последующим восстановлением влагосодержания в подходящем стерильном носителе перед применением. Лиофилизация и восстановление влагосодержания могут приводить к потере активности антитела в различной степени (например, для обычных иммуноглобулинов антитела-IgM имеют тенденцию терять активность в большей степени, чем антитела-IgG). Для компенсации этого следует регулировать дозировку. рН препарата будет выбираться таким образом, чтобы сбалансировать стабильность антитела (химическую и физическую) и удобства для пациента при введении. Обычно допустимым является рН между 6 и 8.TNFSF13b играет решающую роль в патологии, связанной со множеством заболеваний, включающих иммунные и воспалительные факторы. Следовательно, фармацевтическая композиция, включающая антитело против TNFSF13b человека по изобретению, может использоваться для лечения заболеваний,при которых активность TNFSF13b нежелательна, например иммунных заболеваний, включая аутоиммунные заболевания и воспалительные заболевания. Предпочтительные заболевания включают, но не ограничиваются этим, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, артрит Лима, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, астму, аллергические заболевания, псориаз, заболевание трансплантат-против-хозяина, отторжение трансплантированного органа, острое или хроническое иммунное заболевание, связанное с трансплантацией органа, саркоидоз, инфекционные заболевания, паразитарные заболевания, женское бесплодие, аутоиммунную тромбоцитопению, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, болезнь Хасимото, синдром Шегрена и раки, в частности В- или Т-клеточные лимфомы или миеломы. Более предпочтительно фармацевтическая композиция, включающая антитела против hTNFSF13b человека и/или фрагмент антитела по изобретению, используется для лечения системной красной волчанки. В данном описании также рассматривается применение антитела против hTNFSF13b человека по настоящему изобретению при получении лекарственного средства для лечения по крайней мере одного из вышеуказанных заболеваний, при которых нежелательна активность TNFSF13b. В некоторых ситуациях антитело по изобретению будет совместно введено в состав препарата и/или совместно введено субъекту вместе с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, которые используются для лечения аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний. При такой комбинированной терапии выигрышным может оказаться использование более низких дозировок- 11009074 терапевтических агентов, таким образом исключая возможное токсичное действие или осложнения, связанные с различными монотерапиями. Квалифицированному лечащему врачу будет понятно, что когда антитела по изобретению используют в качестве части комбинированной терапии, желательными могут оказаться более низкие дозировки антитела, чем в том случае, когда антитело само по себе вводят субъекту (например, синергетическое терапевтическое действие может достигаться при использовании комбинированной терапии, что, в свою очередь, допускает применение более низкой дозы антитела для достижения желаемого терапевтического действия). Фармацевтические композиции по изобретению могут включать терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество антитела по изобретению. Выражение терапевтически эффективное количество относится к количеству, которое эффективно, в дозировках и в течение необходимого промежутка времени, для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может изменяться в соответствии с факторами, такими как стадия заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, и способности антитела или части антитела вызывать желательную ответную реакцию у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой такое количество, для которого какие-либо токсические или нежелательные действия антитела или части антитела перевешиваются терапевтически благоприятным действием. Выражение профилактически эффективное количество относится к количеству, которое эффективно, в дозировках и в течение необходимого промежутка времени, для достижения желаемого профилактического результата. Обычно поскольку профилактическая доза используется для субъектов перед заболеванием или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество. Режим дозировки можно регулировать для обеспечения оптимальной желаемой ответной реакции(например, терапевтической или профилактической ответной реакции). Например, может быть введен один болюс, несколько раздельных доз могут быть введены в течение промежутка времени, или доза может быть пропорционально снижена или увеличена, как требуют крайности терапевтической ситуации. Обладающие способностью связываться с hTNFSF13b антитела по изобретению могут использоваться для обнаружения полипептидов TNFSF13b (например, в биологическом образце, таком как сыворотка крови или плазма крови), с использованием обычного иммуноанализа, такого как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) или иммуногистохимия тканей. Изобретение относится к способу обнаружения TNFSF13b в биологическом образце, включающему контактирование биологического образца с антителом, или частью антитела, по изобретению и обнаружение либо антитела (или части антитела), связанного с hTNFSF13b, или несвязанного антитела (или части антитела), обнаруживая таким образом hTNFSF13b в биологическом образце. Антитело является непосредственно или косвенно меченым с использованием обнаруживаемого вещества для облегчения обнаружения связанного или несвязанного антитела. Подходящие обнаруживаемые вещества включают различные ферменты, искусственные группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, -галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов искусственных групп включают стрептавидин/битион и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают амбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазинил-амин флуоресцеин, данзилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; и примеры подходящего радиоактивного материала включают 125I, 131I, 35S или 3 Н. Альтернативно использованию меченого антитела, TNFSF13b может быть проанализирован в биологических жидкостях с помощью конкурентного иммунологического анализа с использованиемTNFSF13b-стандартов, меченых с использованием обнаруживаемого вещества, и немеченого антитела против hTNFSF13b человека. В таком анализе биологический образец, меченые TNFSF13b-стандарты и антитело против hTNFSF13b человека объединяют и определяют количество меченого TNFSF13bстандарта, связанного с немеченным антителом. Количество TNFSF13b в биологическом образце обратно пропорционально количеству меченого rTNFSF13b-стандарта, связанного с антителом противhTNFSF13b человека. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антитела, которое нейтрализует активность TNFSF13b посредством связывания антигенной детерминанты TNFSF13b. Антигенная детерминанта была идентифицирована, как описано в примере 10. Для ссылки, растворимая часть hTNFSF13b представлена следующим образом: Аминокислоты hTNFSF13b, включенные в связывание новых антител против hTNFSF13b человека,- 12009074 включают по крайней мере одну аминокислоту, выбранную из группы, включающей треонин в положении 69, лизин в положении 71, треонин в положении 72, тирозин в положении 73, глутаминовую кислоту в положении 105, треонин в положении 106, лейцин в положении 107 и аспарагин в положении 109. В другом варианте осуществления аминокислоты, включенные в связывание новых антител противhTNFSF13b человека, включают по крайней мере две аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из треонина в положении 69, лизина в положении 71, треонина в положении 72, тирозина в положении 73, глутаминовой кислоты в положении 105, треонина в положении 106, лейцина в положении 107 и аспарагина в положении 109. В другом варианте осуществления аминокислоты, включенные в связывание новых антител против hTNFSF13b человека, включают по крайней мере три аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из треонина в положении 69, лизина в положении 71, треонина в положении 72,тирозина в положении 73, глутаминовой кислоты в положении 105, треонина в положении 106, лейцина в положении 107 и аспарагина в положении 109. В другом варианте осуществления аминокислоты,включенные в связывание новых антител против hTNFSF13b человека, включают по крайней мере четыре аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из треонина в положении 69, лизина в положении 71, треонина в положении 72, тирозина в положении 73, глутаминовой кислоты в положении 105, треонина в положении 106, лейцина в положении 107 и аспарагина в положении 109. В другом варианте осуществления аминокислоты, включенные в связывание новых антител противhTNFSF13b человека, включают лизин в положении 71, треонин в положении 72, тирозин в положении 73 и глутаминовую кислоту в положении 105. В другом варианте осуществления аминокислоты, включенные в связывание новых антител противhTNFSF13b человека, включают глутаминовую кислоту в положении 105 и по крайней мере одну из аминокислот, выбранных из группы, состоящей из треонина в положении 69, лизина в положении 71,треонина в положении 72 и тирозина в положении 73. В другом варианте осуществления аминокислоты,включенные в связывание новых антител против hTNFSF13b человека, включают треонин в положении 106 и по крайней мере одну из аминокислот, выбранных из группы, состоящей из треонина в положении 69, лизина в положении 71, треонина в положении 72 и тирозина в положении 73. В другом варианте осуществления аминокислоты, включенные в связывание новых антител против hTNFSF13b человека,включают лейцин в положении 107 и по крайней мере одну из аминокислот, выбранную из группы, состоящей из треонина в положении 69, лизина в положении 71, треонина в положении 72 и тирозина в положении 73. В другом варианте осуществления аминокислоты, включенные в связывание новых антител против hTNFSF13b человека, включают аспарагин в положении 109 и по крайней мере одну из аминокислот, выбранную из группы, состоящей из лизина в положении 71, треонина в положении 72 и тирозина в положении 73. В другом варианте осуществления аминокислоты, включенные в связывание новых антител против hTNFSF13b человека, включают лизин в положении 71, треонин в положении 72, тирозин в положении 73 и глутаминовую кислоту в положении 105. Следующие примеры предназначены для иллюстрации, но не для ограничения изобретения. Пример 1. Образование моноклональных антител против hTNFSF13b человека. Моноклональные антитела генерировали с использованием технологии HuMAb-MouseTM на Medarex посредством иммунизации мышей растворимым hTNFSF13b (аминокислоты 133-285, получен отRDI, Flanders, NJ). Использовали мышей НСо 7 и НСо 12. Мышей иммунизировали, используя от 15 до 50 мкг растворимого hTNFSF13b в RIBI, полном адьюванте Фрейнда или неполном адьюванте Фрейнда. Восьми мышам, дающим титр антитела к hTNFSF13b в сыворотке крови, вводили в виде внутривенной инъекции 10 мкг hTNFSF13b в PBS (забуференном фосфатом физиологическом растворе). Через три дня собирали селезенку у каждой мыши и сливали с клетками миеломы в соответствии со способом, описанным Zola (Zola H. Monoclonal antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Boca Raton, FL. (1987. Гибридомы тестировали на связывание hTNFSF13b и для подтверждения того, что они экспрессируют тяжелые и легкие цепи иммуноглобулина человека. Связывание антитела с hTNFSF13b определяли с использованием ELISA следующим образом. Планшеты сенсибилизировали 50 мкл раствора с концентрацией 5 мкг/мл hTNFSF13b в PBS в течение ночи при 4 С. Затем планшеты осушали и блокировали 100 мкл PBS+0,05% Tween 20 (PBST)+5% цыплячьей сыворотки в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратного промывания с использованием PBST, планшеты осушали и добавляли в каждую лунку 100 мкл разбавленных вторичных реагентов (HRP-HuIgGFc, Jackson cat109-036-098 или HRP-HuKappa, Bethyl catA80-115P; 1:5000 в блокирующем буфере). После инкубирования с течение 1 ч при комнатной температуре планшеты промывали три раза, как описано выше. Планшеты проявляли с использованием 10 мл цитрат-фосфатного буфера рН 4,0, 80 мкл ABTS, 8 мкл Н 2O2 на планшет. После инкубирования в течение от 30 мин до 1 ч при комнатной температуре поглощение планшетов считывали А 415-А 490. Гибридомы, которые продемонстрировали связывание с hTNFSF13b и которые представляли собой тяжелую цепь huIgG и каппа-легкую цепь человека, отбирали для субклонирования. Клеточную культуральную среду субклонированных гибридом концентрировали в тангенциальной системе фильтрации Amicon ProFlux M12 с использованием мембран Amicon S3Y30 UF. Концентрированную среду пропускали через колонки с белок-А Сефарозой (5-10 мл колонки) при скорости потока 5- 13009074 мл/мин. Колонки промывали буфером A (PBS, рН 7,4) до тех пор, пока поглощение не возвращалось к базовой линии, и связанные полипептиды элюировали 50 мМ лимонной кислотой, рН 3,2. Фракции сразу же нейтрализовали с использованием 1 М Tris, рН 8,0. Затем фракции анализировали с использованиемSDS-PAGE. Фракции, содержащие антитело, собирали и концентрировали при помощи фильтровального устройства Ultrafree (Millipore, отсечение молекулярного веса 10 КДа) с центрифугированием. Пример 2. Функциональная активность антител против hTNFSF13b человека. Нейтрализующую активность антител против hTNFSF13b человека по изобретению измеряли с использованием мышиной IL-1-зависимой В-клеточной линии, Т 1165.17. Клетки промывали три раза средой для анализа (RPMI-1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 1 мМ пирувата натрия,510-5 М 2-меркаптоэтанола и пенициллин, стрептомицин и фунгизон) для удаления IL-1. Клетки повторно суспендировали из расчета 100000 клеток/мл в среде для анализа, содержащей 2,5 нг/мл растворимого hTNFSF13b, и помещали из расчета 5000 клеток/лунку в 96-луночный планшет и инкубировали при 37 С в 5% CO2. Супернатанты из ELISA-положительных гибридом включали при разведении 1:4. Через 48 ч добавляли 20 мкл водного раствора Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution (Madison, WI),и планшет инкубировали дополнительно в течение 5 ч при 37 С в 5% СO2. Поглощение считывали при А 490 для измерения пролиферации. Пример нейтрализующей активности для одного из гибридомных супернатантов, 4 А 5-3.1.1-В 4, приведен на фиг. 1. В качестве контроля антитела добавляли к IL-1 стимулированным клеткам. Не наблюдалось подтверждения ингибирования IL-1-стимулированной пролиферации, ингибирование происходило только в случае стимулированной hTNFSF13b пролиферации. Нейтрализующие антитела были протестированы на их способность ингибировать усиленнуюhTNFSF13b пролиферацию первичных В-клеток человека в качестве ответа на стимуляцию анти-IgM. Первичные В-клетки человека выделяли из крови человека с использованием СD19-положительного отбора с помощью магнитной системы выделения MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). В-клетки добавляли в лунки 96-луночного планшета из расчета 2105 клеток на лунку в полной среде RPMI, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (полная среда RPMI представляет собой RPMI 1640, содержащий 10 мМL-глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 0,1 мМ заменимых аминокислот и 110-5 M -меркаптоэтанола). Некоторые из этих лунок были сенсибилизированы 10 мкг/мл антител против IgM человека в PBS (BD PharMingen, Clone G20-127) в течение ночи при 4 С и промыты четыре раза PBS перед употреблением. Некоторые клетки были стимулированы растворимымhTNFSF13b (25 нг/мл) в присутствии или в отсутствие нейтрализующего антитело против hTNFSF13b(2,5 мкг/мл). На фиг. 2 проиллюстрирована способность 4 А 5-3.1.1.-В 4 нейтрализовать стимулирующее действие hTNFSF13b. Пример 3. Характеристики моноклональных антител. Все нейтрализующие антитела против hTNFSF13b представляли собой или IgG1 человека, или IgG4 человека. Они также были проанализированы на их способность связывать hTNFSF13b в денатурированном состоянии, т.е. hTNFSF13b подвергали SDS-PAGE и блоттировали на нитроцеллюлозе. Все нейтрализующие антитела не связывали hTNFSF13b в Вестерн-блоттинге, тогда как несколько не нейтрализующих антител были способны это делать. Эксперименты с использованием BIACore-системы проводили для определения того, связываются ли не нейтрализующие антитела и нейтрализующие антитела с одним и тем же сайтом hTNFSF13b. Первоначально, чип покрывали 4 А 5-3.1.1.-В 4 с последующим введением hTNFSF13b, а затем насыщающего количества не нейтрализующего антитела. После достижения насыщения высокая концентрация 4 А 53.1.1.-В 4 выходила за пределы чипа. Одиннадцать не нейтрализующих моноклональных антител были не способны конкурировать с 4 А 5-3.1.1.-В 4 за тот же сайт связывания. Одна из не нейтрализующих гибридом была способна блокировать связывание 4 А 5-3.1.1.-В 4 приблизительно на 45%, указывая на то, что она может иметь антигенную детерминанту, близкую к антигенной детерминанте 4 А 5-3.1.1.-В 4. С использованием такой же экспериментальной разработки также определяли, что нейтрализующееmAb (моноклональное антитело), 4 А 5-3.1.1-В 4, могло конкурировать за тот же сайт связывания, что и один из рецепторов для hTNFSF13b, TACI. Данные эксперименты позволяют предположить, что TACIFc и 4 А 5-3.1.1.-В 4 могут иметь перекрывающиеся антигенные детерминанты на hTNFSF13b. 4 А 5-3.1.1-В 4 иммобилизовали на твердой фазе, пропуская раствор антитела через IMAC-смолу, нагруженную Со+2. После связывания кобальт окисляли до состояния +3, инкубируя смолу с разбавленным раствором пероксида. После промывания смолы природный hTNFSF13b и hTNFSF13b, который был модифицирован (восстановлением/алкилированием или термическим денатурированием), пропускали через колонку. После промывания связанный белок элюировали кислотным раствором, и элюированные белки анализировали масс-спектроскопией MALDI. 4A5-3.1.1-B4 связывал природный рекомбинантныйhTNFSF13b, но не связывал ни химически, ни термически модифицированный hTNFSF13b. Следовательно, 4 А 5-3.1.1-В 4, по-видимому, распознает конформационную антигенную детерминанту на растворимом hTNFSF13b. Рекомбинантный растворимый hTNFSF13b (RDI) инкубировали с 4 А 5-3.1.1-В 4 или кроличьим поликлональным антителом против TNFSF13b (MoBiTec, Marco Island, FL; против аминокислот с 254 по- 14009074 269 hTNFSF13b) на льду в течение 2 ч и смесь белка наносили на колонку для вытеснительной по размеру ВЭЖХ (две, расположенные друг за другом колонки TosoHaas TSK-GEL G3000PW), уравновешенныеPBS при скорости потока 0,25 мл/мин. Белки элюировали PBS. В качестве контроля растворы антител и раствор hTNFSF13b анализировали по отдельности. TNFSF13b человека элюировался из колонки для вытеснительной по размеру хроматографии в положении, совпадающем с тримером молекул TNFSF13b. Элюирование тримерного hTNFSF13b сдвигалось к более ранней временной точке в присутствии 4 А 53.1.1-В 4, но не в присутствии поликлональных антител против TNFSF13b, указывая на связывание тримерного hTNFSF13b с антителом 4 А 5-3.1.1-В 4. Эти данные позволяют предположить, что нейтрализующее mAb 4 А 5-3.1.1-В 4 связывается с конформационной антигенной детерминантой на hTNFSF13b. Пример 4. Измерение аффинности моноклональных антител с помощью BIAcore. Аффинность различных антител против hTNFSF13b человека по отношению к hTNFSF13b измеряли с использованием инструментальной системы BIAcore 2000. В системе используются оптические свойства поверхностного плазмонного резонанса для обнаружения изменения концентрации белка взаимодействующих молекул в декстрановом биосенсорном матриксе. За исключением отмеченного, все реагенты и материалы были закуплены в BIAcore AB (Upsala, Швеция). Все измерения проводили при 25 С. Образцы растворяли в буфере HBS-EP (150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% (вес./об.) поверхностноактивного вещества Р-20 и 10 мМ НЕРЕС, рН 7,4). Козьи антитела против мышиного IgG (Fcспецифические; Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) иммобилизовали на проточной ячейке 1 на сенсорном чипе СМ 5 с использованием аминного набора для сшивания. Козьи антитела против IgG человека (Fc-специфические; Jackson Immunoresearch) иммобилизовали на проточной ячейке 2 также посредством аминного сшивания. Оба антитела иммобилизовали до достижения 700 ответных единиц для каждого. Связывание рекомбинантного hTNFSF13b (Research Diagnostics, Inc., Flanders, NJ) оценивали с использованием множества аналитических циклов. Каждый цикл проводили при скорости потока 30 мкл/мин, и он состоял из следующих стадий: введение 150 мкл 4 А 5-3.1.1-В 4 при 20 мкл/мл, введение 250 мкл hTNFSF13b (начиная с 50 нМ и используя 2-кратные серийные разведения для каждого цикла) с последующим периодом в 15 мин для диссоциации, и восстановление с использованием 90 мкл 10 мМ хлоргидрата глицина (глицин-HCl), рН 1,5. Скорости ассоциации и диссоциации для каждого цикла оценивали с использованием модели связывания 1:1 Лангмюра (Langmuir) и программного обеспечения BIAevaluation. Определено, что KD антитела 4 А 5-3.1.1-В 4 для hTNFSF13b составляет 38 пМ. Пример 5. Клонирование и секвенирование областей антигенного связывания тяжелой и легкой цепей. Вариабельную область тяжелой и легкой цепи для нейтрализующего mAb 4A5-3.1.1-B4 человека клонировали и секвенировали с использованием следующих протоколов. МРНК получали из 2106 гибридомных клеток с использованием протокола Micro-Fast Track (Invitrogen), поставляемого с набором. кДНК получали из 200 мкл мРНК, преципитированной этанолом, с использованием кДНК-цикл (cDNA-Cycle)-набора (Invitrogen) путем центрифугирования аликвоты мРНК в течение 30 мин при 14000 об/мин при 4 С с последующей промывкой осадка 70%-ным этанолом. Высушенный на воздухе осадок повторно суспендировали в 11,5 мкл стерильной воды, и кДНК получали, следуя инструкции, прилагаемой к набору. Необязательный второй цикл синтеза кДНК опускали, но кДНК очищали с помощью стадии экстракции, используя смесь фенол/хлороформ, и осаждения этанолом. Осадок кДНК повторно суспендировали в 30 мкл ТЕ для использования в ПЦР. ПЦР-реакции проводили с дегенеративными праймерами для 5'-конца вариабельной области для тяжелой и легкой цепи, спаренными с 3'-праймером для константной области. Для каждых 50 мкл реакции использовали 1 мкл кДНК. Реакцию регулировали так, как указано для применения с Pful, с последующими 20 циклами. ПЦР-продукты проверяли, нанося 5 мкл каждой реакции на 1% агарозный гель. Положительные реакции клонировали с использованием набора для клонирования Zero Blunt TOPO PCR(Invitrogen). Минипрепараты от положительных клонов секвенировали и анализировали для установления продуцирующего гена. Результаты независимых ПЦР реакций и секвенирования многочисленных клонов выявили описанные ниже последовательности.- 15009074 Последовательности легкой цепи антитела человека 4 А 5-3.1.1-В 4 (CDR указаны жирным шрифтом)- 16009074 Последовательности тяжелой цепи антитела человека 4 А 5-3.1.1-В 4 (CDR указаны жирным шрифтом, сигнальные последовательности указаны курсивом) Пример 6. Видовая перекрестная реактивность антител против hTNFSF13b человека с TNFSF13b особей, отличных от человека. Для определения видовой перекрестной реактивности нейтрализующих mAb проводили анализELISA с использованием 4 А 5-3.1.1-В 4 в качестве как захватывающего, так и обнаруживающего mAb. В качестве стандартной кривой использовали рекомбинантный TNFSF13b человека. TNFSF13b человека может быть обнаружен в культуральном супернатанте от клеток СНО, трансфицированных вектором,экспрессирующим hTNFSF13b, супернатантах от культивируемых моноцитов человека или в сыворотке или плазме человека. Супернатанты от клеток СНО, экспрессирующих мышиный TNFSF13b, тестировали на реактивность в ELISA, и результаты оказались отрицательными. 4 А 5-3.1.1-В 4 также оказался неспособным вызывать иммунопреципитацию мышиного TNFSF13b, но мог вызывать иммунопреципитацию TNFSF13b человека. Мышиный TNFSF13b использовали в анализе пролиферации, как описано в примере 2. При использовании данного анализа пролиферации 4 А 5-3.1.1-В 4 оказался неспособным нейтрализовать пролиферацию, индуцированную мышиным TNFSF13b. Это указывает на тот факт, что 4 А 53.1.1-В 4 не может распознавать мышиный TNFSF13b. Пример 7. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи 4 А 5-3.1.1-В 4. Ниже приведена аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела 4 А 5-3.1.1-В 4, которая включает HCVR и константную область IgG4. Константная область IgG4 человека имеет серин в поло- 17009074 жении 231. Однако данное положение 231 было замещено с серина на пролин, который вводит структурное изменение в шарнирной области для получения оптимальных межцепочечных дисульфидных связей. Это снижает образование половинных антител. Половинные антитела образованы из одной тяжелой цепи и одной легкой цепи. Кроме того, можно провести замещение фенилаланина на аланин в положении 237 и замещение лейцина на аланин или глутаминовую кислоту в положении 238 для уменьшения эффекторной функции антитела. Пример 8. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи 4 А 5-3.1.1-В 4. Ниже приведена аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела 4 А 5-3.1.1-В 4, которая включает HCVR и константную области IgG1. Пример 9. Аминокислотная последовательность легкой цепи 4 А 5-3.1.1-В 4. Ниже приведена аминокислотная последовательность легкой цепи антитела 4 А 5-3.1.1-В 4, которая включает LCVR и константную области каппа. Пример 10. Идентификация антигенной детерминанты для 4 А 5-3.1.1-В 4. Определяли антигенную детерминанту, с которой связывается 4 А 5-3.1.1-В 4 и нейтрализует Для TNFSF13b человека создавали гомологическую модель, основываясь на известных кристаллических структурах нескольких членов семейства TNF. Доступные остатки, которые различны дляTNFSF13b мыши и человека, являются потенциальными сайтами связывания для 4 А 5-3.1.1-В 4, поскольку 4 А 5-3.1.1-В 4 нейтрализует TNFSF13b человека, но не мыши. Идентифицированы три потенциальные антигенные детерминанты: 1) К 71, Т 72, Y73, Е 105; 2) Q26, S29, L139, D140 и 3) L53, К 55, Е 56, К 119. Для получения химерных молекул проводили мутагенез путем изменения аминокислотной последовательности человека на мышиную. Химера А представляла собой L139R, D140N; химера В представляла собой К 71 Р, T72I, Y73F; химера С представляла собой К 71 Р, T72I, Y73F, Е 105K; химера D представляла собой L53V, K55R, E56Q; химера Е представляла собой Е 105K. С использованием анализа пролиферации, как описано в примере 2, все химеры были протестированы на функциональную активность и нейтрализацию 4 А 5-3.1.1-В 4. Первоначальные анализы проводили с использованием супернатантов от 293 временных трансфекций для каждой химеры и исходных молекул как TNFSF13b человека, так и мышиного TNFSF13b. Все химеры индуцировали сходную пролиферацию, что указывает на то, что полученные химеры были функциональными. С использованием 6 мкг/мл 4 А 5-3.1.1-В 4 наблюдали 100% нейтрализации для TNFSF13b человека и химер А, В, D и Е. Нейтрализации не наблюдалось для мышиного TNFSF13b или химеры С. Очищенные мутанты TNFSF13b были получены для химер А, В и С, и анализ повторяли с использованием 11 нг/мл каждого из исходногоTNFSF13b или химер TNFSF13b и 1 мкг/мл 4 А 5-3.1.1-В 4. Результаты продемонстрировали, что 100% нейтрализация наблюдалась для TNFSF13b человека и химеры А, 88% нейтрализация - для химеры В и нейтрализация не наблюдалась для мышиного TNFSF13b или химеры С. Пример 11. Исследования in vivo с использованием 4 А 5-3.1.1-В 4. Производили трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих растворимый TNFSF13b человека, с использованием разработанных способов, описанных Hogan В. et al., (1986) Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, NY, и модифицированных Fox и Solter (Mol.Cell.Biol. 8:5470, 1988). Кратко, фрагмент ДНК, включающий ген hTNFSF13b, микроинъецировали в мужские пронуклеусы вновь оплодотворенных эмбрионов на одноклеточной стадии (зиготы) штамма FVB/N. Эмбрионы культивировали in vitro в течение ночи, чтобы дать возможность развития до двухклеточной стадии. Двухклеточные эмбрионы затем трансплантировали в фаллопиевы трубы псевдобеременных мышей штамма CD-1 и оставляли развиваться до срока. Для тестирования на присутствие трансгена у новорожденной мыши небольшой кусочек пальца ноги удаляли у каждого животного и разлагали протеиназой К для высвобождения нуклеиновых кислот. Образец экстракта пальца ноги впоследствии подвергали ПЦРанализу для идентификации трансгенсодержащих мышей. Трансгенные по hTNFSF13b мыши имели резкое увеличение периферических В-клеток, обычно примерно трехкратное по сравнению с подходящими по возрасту и полу особями приплода. Также имелось небольшое увеличение периферических Т-клеток. Трансгенных по hTNFSF13b мышей обрабатывали 4 А 5-3.1.1-В 4 для определения того, будет ли нейтрализация hTNFSF13b приводить к уменьшению числа В-клеток обратно к нормальному уровню. В возрасте 15 недель самок hTNFSF13b-мышей инъецировали подкожно дважды в неделю в течение трех недель с использованием или 25 мкг 4 А 5-3.1.1-В 4, или изотипного контрольного антитела. Через четыре дня после последней инъекции антитела мышей умерщвляли, и селезенку удаляли для анализа. Число В- и Т-клеток подсчитывали путем определения процента клеток CD19+ для В-клеток и клеток CD3+ для Т-клеток с использованием проточной цитометрии и полного подсчета лейкоцитов для каждой селезенки. Результаты, представленные ниже, демонстрируют, что in vivo введение 4 А 5-3.1.1-В 4 трансгенным по hTNFSF13b мышам способно восстанавливать нормальное число Т- и В-клеток (среднее значениестандартное отклонение).- 19009074 Последовательности по настоящему изобретениюSEQ ID No:1 полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепиSEQ ID No:2 аминокислотная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепиSEQ ID No:9 полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепиSEQ ID No:10 аминокислотная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Антитело против TNFSF13b человека, содержащее по крайней мере три аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей:a. SEQ ID No:4 в CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR);d. SEQ ID No:12 в CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR);f. SEQ ID No:16 в CDR3 HCVR. 2. Антитело по п.1, содержащее по крайней мере четыре аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей:a. SEQ ID No:4 в CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR);d. SEQ ID No:12 в CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR);f. SEQ ID No:16 в CDR3 HCVR. 3. Антитело по п.1, содержащее по меньшей мере пять аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей: