Моноклональные антитела к растворимому рецептору лпнп человека, способы их получения и применения и гибридомы, продуцирующие указанные антитела

007494 Данное изобретение относится к моноклональным антителам, которые специфически распознают рецептор липопротеидов низкой плотности (РЛПНП) человека. Указанные антитела применимы, например, для идентификации и очистки растворимого РЛПНП человека (чр-РЛПНП) в процессах получения,а также при идентификации и лечении таких заболеваний, как гепатит С (HCV). Предпосылка изобретения Холестерин, компонент всех эукариотических плазматических мембран, важен для роста и жизнеспособности клеток высших организмов. Однако высокие уровни холестерина в сыворотке являются причиной заболевания и смерти вследствие участия в образовании атеросклеротических бляшек в артериях по всему организму. Основным местом синтеза холестерина у млекопитающих является печень. Существенные количества холестерина также образуются в кишечнике. На скорость образования холестерина этими органами в высокой степени влияет количество холестерина, поглощенного из пищевых источников. Клетки вне печени и кишечника получают холестерин из плазмы, а не путем синтеза denovo. Холестерин и другие липиды транспортируются в жидкостях организма липопротеидами, которые классифицируют в соответствии с возрастанием плотности. Липопротеид представляет собой частицу,состоящую из кора гидрофобных липидов, окруженного оболочкой из полярных липидов и апопротеинов. Указанные липопротеиды играют две роли: они солюбилизируют сильно гидрофобные липиды, и они содержат сигналы, которые регулируют перемещение конкретных липидов в специфичные клеткимишени и ткани и из них. Холестерин транспортируется в жидкостях организма липопротеидами низкой плотности (ЛПНП), которые связываются со специфичным рецептором на плазматической мембране непеченочных клеток. Затем комплекс рецептор-ЛПНП интернализуется в клетки в результате механизма транспорта, известного как опосредованный рецепторами эндоцитоз (Goldstein et al. 1979). Рецептор липопротеида низкой плотности (ЛПНП) является прототипом семейства структурно близких рецепторов клеточной поверхности, которые опосредуют эндоцитоз многочисленных лигандов в клетках млекопитающих. Рецептор ЛПНП состоит из 822 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 164000. Он построен из нескольких доменов, последовательности некоторых из которых гомологичны последовательностям других белков. NH2-конец связывающего лиганд домена рецептора состоит из 292 остатков,организованных в 7 богатых цистеином неполных повторов. Каждый повтор состоит их шести остатков цистеина, которые связаны дисульфидными связями по принципу первый с третьим, второй с пятым и четвертый с шестым (Bieri et al. 1995). За указанным доменом следует четыре дополнительных домена: первый состоит из 400 аминокислотных остатков и гомологичен рецептору EGF, второй состоит из 58 аминокислотных остатков, богатых О-связанными сахарами, третий представляет собой отдельный трансмембранный домен из 22 аминокислотных остатков и четвертый является цитоплазматическим доменом из 50 аминокислотных остатков (Sudhof et al. 1985), (Brown et al. 1986). Физиологическое значение рецептора ЛПНП было показано в исследованиях Brown and Goldstein на семейной гиперхолестеринемии (FH). Было обнаружено, что заболевание является следствием молекулярно-генетического дефекта, результатом которого является отсутствие или недостаточность функциональных рецепторов ЛПНП (Brown et al. 1976). Было охарактеризовано несколько классов FHмутаций (Goldstein et al. 1975). Растворимая форма рРЛПНП, проявляющая антивирусную активность, была идентифицирована и выделена из надосадка культуры индуцированных интерфероном клеток (Fischer et al. 1993) и в жидкостях организма (Fischer et al. 1994). Было идентифицировано несколько индуцируемых интерфероном белков, которые эффективны в индукции антивирусного состояния посредством IFN. Один из таких белков, проявляющих антивирусную активность, продуцировали и накапливали в надосадке культуры клеток WISH амниона человека. Указанный белок очищали до гомогенности и идентифицировали как рРЛПНП (см. ЕР 0553667 и Fischer et al. 1993). Обнаружено, что рРЛПНП секретируется в среду клетками млекопитающих, которые переходят в антивирусное состояние в ответ на интерферон. В отличие от интерферона рРЛПНП не индуцирует антивирусное состояние в клетках, но является противовирусным сам по себе. Обнаружено, что рРЛПНП, по-видимому, должен присутствовать в ходе процесса вирусной репликации, созревания и отделения от клетки верха, что свидетельствует о том, что он может быть вовлечен в сложный процесс, который приводит к ингибированию сборки вируса или его отделения от клетки (неопубликованные данные). Недавно на культивируемых клетках было показано, что эндоцитоз вируса гепатита С опосредован рецепторами ЛПНП (Agnello et al. 1999). Указанные и другие данные свидетельствуют о том, что семейство рецепторов ЛПНП может служить в качестве рецепторов вирусов. Поэтому антитела, выработанные против рецептора рРЛПНП, могут блокировать вход и отделением от клетки вирусных частиц посредством связывания с клеточным рецептором ЛПНП. Единственным известным имеющимся в настоящее время моноклональным антителом к РЛПНП является С 7, антитело к РЛПНП быка (Beisiegel et al. 1981, коммерчески доступное из Amersham, UK),которое получали иммунизацией мышей РЛПНП коры надпочечников быка, очищенным до гомогенности. Растворяли мембраны коры надпочечника быка, и рецептор частично очищали элюированием с колонки с DEAE-целлюлозой (Beisiegel et al. 1981). Антитело к РЛПНП быка только слабо перекрестно реагирует с РЛПНП человека.-1 007494 В действительности было обнаружено, что мАт С 7 к РЛПНП быка имеет существенные недостатки в случае применения для выявления и количественной оценки рекомбинантного РЛПНП человека:a) антитело обладает очень низким сродством к РЛПНП человека,b) оно в значительной степени перекрестно реагирует с примесями, полученными из культуры клеток. Специфичные антитела к РЛПНП человека ранее не были доступны. Это кажется неожиданным,поскольку общепринято вырабатывать антитела против новых белков, использовать их для очистки,идентификации или в целях разработки анализов. Возможно, что такие антитела не были созданы до настоящего времени, поскольку условием для получения моноклональных антител является наличие достаточно больших количеств высоко очищенного антигена, которые позволяют проводить эффективную иммунизацию мышей. Высоко очищенным антигеном является антиген, который виден в виде отдельного основного пика при ОФ-ВЭЖХ. Кроме того, трудно было разработать способы идентификации и количественной оценки антигена в ходе процесса очистки. Согласно изобретению описанный здесь анализ антивирусной активности применяли для идентификации РЛПНП в ходе процесса очистки. Существует необходимость в создании специфичных мАт к растворимому РЛПНП человека, чтобы получить средства для разработки эффективного иммуноанализа (ELISA) и для идентификации белка на Вестерн-блоте. Указанные антитела необходимы для мониторинга и количественного анализа рекомбинантного растворимого РЛПНП человека в ходе разработки способов получения и очистки рекомбинантного белка и для выявления природного белка. Сущность изобретения Данное изобретение позволяет создавать линии клеток гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, способные специфически распознавать и связывать рецептор ЛПНП человека, или их фрагменты. Более конкретно данное изобретение позволяет создавать линии клеток гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, способные специфично распознавать, узнавать и связывать растворимый рецептор ЛПНП человека. Таким образом, данное изобретение относится к моноклональному антителу, химерному антителу,полностью гуманизированному антителу, антителу, к антиидиотипическому антителу или его фрагменту,которое специфически распознает и связывает рецептор ЛПНП человека, включающего аминокислотную последовательность от Asp +4 до Glu +291 последовательности ЛПНП человека и которое способно ингибировать репликацию вируса гепатита С. Данное изобретение относится к таким моноклональным антителам, которые узнают и связывают растворимый РЛПНП человека и удовлетворяют следующим требованиям: 1. мАт, которые можно использовать в качестве пары в ELISA, например ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) методом "сэндвича" для выявления растворимого РЛПНП человека. 2. мАт, которые можно использовать для идентификации РЛПНП при анализе Вестерн-блотов. 3. мАт, которые можно использовать для нейтрализации антивирусной биологической активности растворимого РЛПНП человека. 4. мАт, которые можно использовать для ингибирования вирусной инфекции, такой как HCV. Данное изобретение, кроме того, относится к способу выявления и/или количественного определения рецептора ЛПНП человека, который включает в себя использование моноклональных антител по настоящему изобретению. Данное изобретение также относится к гибридомным клонам, продуцирующим моноклональное антитело по изобретению. Моноклональное антитело согласно изобретению получают традиционным способом, например выращиванием клонированной гибридомы, полученной из клетки селезенки млекопитающего, иммунизированного высокоочищенной формой +291 растворимого ЛПНП человека, и гомологичную или гетерологичную лимфоидную клетку, в жидкой среде или брюшной полости млекопитающего с получением антитела, которое продуцируется гибридомой и накапливается в указанной среде или брюшной полости млекопитающего. В еще одном аспекте изобретение относится к способу очистки рецептор ЛПНП человека, который включает в себя обеспечение контактирования материала, содержащего неочищенный РЛПНП, с моноклональным антителом по изобретению. В качестве стадии аффинной очистки в способе очистки рекомбинантного белка можно использовать колонку с адсорбированным моноклональным антителом, специфичным по отношению к РЛПНП. Также изобретение относится к способу ингибирования репликации вируса гепатита С, включающему обеспечение контактирования клеток, инфицированных указанным вирусом, с моноклональным антителом по настоящему изобретению. Кроме того, изобретение относится к применению моноклонального антитела по изобретению для ингибирования репликации вируса гепатита С.-2 007494 Краткое описание фигур На фиг. 1 показана схема последовательности операций, изображающая разработку моноклональных антител к р-чрРЛПНП. На фиг. 2 показан Вестерн-блот-анализ формы +291 р-чрРЛПНП на дорожке 1, чрРЛПНП мочи на дорожке 2 и рекомбинантного рецептора TNF р 55 человека в качестве негативного контроля (р-чТВР-1) на дорожке 3 с помощью моноклональных антител, указанных под каждой полоской. Стрелки с левой стороны фигуры указывают положение маркеров молекулярной массы, а стрелками с правой стороны фигуры отмечено положение формы чрРЛПНП, указанной над каждой стрелкой. На фиг. 3 показано влияние мАт 12.6, 28 и 29.8 на продукцию (+)- и (-)-цепей HCV в культуреFT167. Клетки обрабатывали за 30 мин до инфекции мАт против РЛПНП (8 или 2 мкг/мл). Затем клетки в течение ночи инфицировали 25 мкл сыворотки HCV(+) ( 42; lb). Через день после инфекции проводили три промывки и добавляли новую среду, и меняли ее каждые 48 ч. Через пять дней после инфекции собирали гепатоциты, очищали РНК, и 1 мкг клеточной РНК анализировали с помощью rTth-OT-ПЦР+SP; анализ положительной цепи РНК; -SP: анализ отрицательной цепи РНК; X: пустой контроль. Подробное описание изобретения Получили моноклональные антитела (мАт) к растворимому РЛПНП человека (чрРЛПНП). Используя полученные моноклональные антитела разработали способ ELISA и Вестерн-блоттинга для идентификации чрРЛПНП и анализа на основе нейтрализации антивирусной активности чрРЛПНП. мАт вырабатывали у мышей, иммунизированных рекомбинантной формой чрРЛПНП +291, которая состоит из N-концевого связывающего лиганд домена растворимого РЛПНП человека от Asp +4 до Glu+291. Рекомбинантную форму чрРЛПНП +291 продуцировали в клетках СНО и очищали до гомогенности. Иммунизированные мыши продуцировали значительные титры специфичных антител. После скрининга гибридом пять клонов были идентифицированы как самые высокопродуктивные продуценты антител (номера 12, 28, 29, 30 и 50). Указанные клоны были выбраны для дальнейшего субклонирования. После субклонирования выделили 29 субклонов, которые имели высокую продуктивность антител, и ампулы исходных клонов и субклонов замораживали. Выбирали пару моноклональных антител для ELISA р-чрРЛПНП. мАт 28 выбрали в качестве покрывающего антитела, и мАт 29.8, меченое биотином, выбрали в качестве второго антитела. Обнаружено, что мАт 12.6 и 29.8 подходят для идентификации нативного и рекомбинантного чрРЛПНП в Вестернблот-анализе, и обнаружено, что мАт 28 и 30 подходят для идентификации рекомбинантного чрРЛПНП в Вестерн-блот-анализе. Обнаружено, что мАт 12.6 и 50.30 подходят для ингибирования антивирусной активности чрРЛПНП. Согласно изобретению также было обнаружено, что мАт 12.6, 28 и 29.8 ингибируют репликацию генома вируса гепатита С (HCV) в первичных культурах гепатоцитов человека. Таким образом, указанные антитела можно использовать для лечения гепатита С (фиг. 3). Определили подклассы изотипов мАт, продуцируемых клонами. Клоны 12.6, 28, 29.8 и 30 идентифицировали как IgG1, тогда как обнаружено, что клон 50.30 представляет собой IgM. мАт, выработанные против формы чрРЛПНП+291, в ELISA и Вестерн-блот-анализе также узнавали другие формы чрРЛПНП, а именно форму р-чрРЛПНП +292 и форму +331, продуцируемые в рекомбинантных клетках СНО. Форма +292 содержит N-концевую часть рецептора от аминокислотного остаткаAsp +4 до Cys +292, а форма +331 содержит N-концевую часть рецептора от аминокислотного остаткаAsp +4 до Cys +331. Антиген, используемый для иммунизации мышей для того, чтобы получить моноклональные антитела, представлял собой форму р-чрРЛПНП +291, которая была получена в клетках СНО. Продуцирование р-чрРЛПНП выполняли в биореакторах, используя систему матрицы Fibracel, в стационарной фазе. р-чрРЛПНП очищали до гомогенного состояния и использовали для иммунизации мышей. Иммунные клетки селезенки наилучшим образом реагирующей мыши использовали для слияния и создания гибридом. Что касается антител, упоминаемых на протяжении данного описания, имеется в виду, что термин моноклональное антитело включает в себя моноклональные антитела, химерные антитела, полностью гуманизированные антитела, антитела к антиидиотипическим антителам (анти-анти-Id-антитело), которые можно метить в растворимой или связанной форме, а также их фрагменты, получаемые любым известным способом, таким как ферментативное расщепление, пептидный синтез или рекомбинантные технологии, но не ограниченные указанными способами. Моноклональное антитело содержит в основном гомогенную популяцию антител, специфичных по отношению к антигенам, и эти популяции содержат в основном сходные сайты связывания эпитопа. мАт можно получить способами, известными специалистам в данной области. См., например, Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975); патент США 4376110; Ausubel et al., eds., Harlow and Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); и Colligan et al., eds., Current-3 007494 которых полностью включено здесь в виде ссылки. Такими антителами могут быть иммуноглобулины любого класса, включая IgG, IgM, IgE, IgA, GILD и любого их подкласса. Гибридому, продуцирующую мАт согласно данному изобретению, можно культивировать in vitro, in situ или in vivo. Получение высоких титров мАт in vivo или in situ делает этот способ предпочтительным в настоящее время способом получения. Химерные антитела являются молекулами, разные части которых получены от разных видов животных, такими как молекулы, имеющие вариабельную область, полученную из мышиного мАт и константную область иммуноглобулина человека. Химерные антитела главным образом используют для уменьшения иммуногенности при применении и для увеличения выхода продукции, например, в тех случаях, когда мышиные мАт имеют более высокие выходы из гибридом, но более высокую иммуногенность у людей, используют такие химерные человек/мышь мАт. Химерные антитела и способы их получения известны в данной области (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrisonet al., Европейская заявка на патент 125023 (опубликованная 14 ноября 1984); Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., Европейская заявка на патент 171496 (опубликованная 19 февраля 1985);Morrison et al., Европейская заявка на патент 173494 (опубликованная 5 марта 1986); Neuberger et al., заявка РСТ WO 8601533 (опубликованная 13 марта 1986); Kudo et al., Европейская заявка на выдачу патента 184187 (опубликованная 11 июня 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson etal., международная заявка на патентWO 8702671 (опубликованная 7 мая 1987); Liu et al., Proc. Natl.LABORATORY MANUAL, выше. Указанные публикации включены здесь в виде ссылки в полном объеме. Полностью гуманизированные антитела представляют собой молекулы, содержащие как вариабельную, так и константную области иммуноглобулина человека. Полностью гуманизированные антитела потенциально можно использовать для терапевтического применения, при котором требуются повторные обработки в случае хронических и рецидивирующих заболеваний, таких как аутоиммунные болезни. Один способ получения полностью гуманизированных антител состоит в гуманизации мышиной гуморальной иммунной системы, т.е. в получении линий мышей, способных продуцировать Ig человека (ксеномыши), путем введения локусов иммуноглобулинов (Ig) человека мышам, у которых инактивированы эндогенные гены Ig. Локусы Ig являются чрезвычайно сложными по своей физической структуре, и необходимы процессы перестройки генов и экспрессии для того, чтобы в конечном итоге продуцировать широкий иммунный ответ. Разнообразие антител, главным образом, создается в результате основанной на комбинированной перестройке разных генов V, D и J, присутствующих в локусах Ig. Указанные локусы также содержат рассеянные регуляторные элементы, которые контролируют экспрессию антител, аллельное исключение, переключение классов и развитие аффинности. Введение мышам неперестроенных трансгенов Ig человека показало, что аппарат рекомбинации у мышей совместим с генами человека. Кроме того, гибридомы, секретирующие специфичные для антигена hu-мАт разных изотипов,можно получить путем иммунизации ксеномышей антигеном. Полностью гуманизированные антитела и способы их получения известны в данной областиTomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727 (2000), заявка на патент WO 98/24893. Антиидиотипическое (анти-Id) антитело представляет собой антитело, которое узнает уникальные детерминанты, как правило, связанные с антигенсвязывающим сайтом антитела. Id-антитело можно получить иммунизацией животного того же вида и генетического типа (например, линия мышей) что и источник мАт, к которому получают анти-Id-антитело. Иммунизированное животное будет распознавать и отвечать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела продукцией антитела к данным идиотипическим детерминантам (анти-Id-антитела). См., например, патент США 4699880, который включен здесь в виде ссылки в полном объеме. Анти-Id-антитело также можно использовать в качестве иммуногена, чтобы индуцировать иммунный ответ еще и у другого животного, продуцирующего так называемое анти-анти-Id-антитело. Анти-анти-Id-антитело по эпитопам может быть идентично исходному мАт, которое индуцировало анти-Idантитело. Таким образом, используя антитела к идиотипическим детерминантам мАт, можно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности. Таким образом, мАт, созданные против РЛПНП, их изоформы, аналоги, фрагменты или производные согласно изобретению можно использовать для индукции анти-Id-антител у подходящих животных,таких как мыши BALB/c. Клетки селезенки таких иммунизированных мышей используют для получения анти-Id-гибридом, секретирующих анти-Id-MAT. Кроме того, анти-Id-MAT можно связать с носителем,таким как гемоцианин морского блюдечка замочная скважина (KLH), и использовать для иммунизации следующих мышей BALB/c. Сыворотка таких мышей будет содержать анти-анти-Id-антитела, которые обладают связывающими свойствами исходного мАт, специфичного по отношению к эпитопу указанного выше белка РЛПНП, или его аналогов, фрагментов и производных.-4 007494 Таким образом, анти-Id-MAT имеют свои собственные идиотипические эпитопы, или идиотопы,структурно сходные с оцениваемым эпитопом. Также подразумевается, что термин моноклональное антитело включает в себя как интактные молекулы, так и его фрагменты, например, такие как Fab иF(ab')2, которые способны связывать антиген. Фрагменты Fab и F(ab')2 не имеют Fc-фрагмента интактного антитела, быстрее выводятся из циркуляции и могут меньше подвергаться неспецифичному связыванию в тканях, чем интактное антитело (Wahl. et al., J. Nuncl. Med. 24: 316-325 (1983. Будет понятно, что Fab и F(ab')2 и другие фрагменты антител, применимых в данном изобретении,можно использовать для выявления и количественного анализа белка РЛПНП согласно описанным здесь способам для интактных молекул антител. Такие фрагменты обычно получают протеолитическим расщеплением с использованием таких ферментов, как папаин (чтобы получить Fab-фрагменты) или пепсин(чтобы получить F(ab')2-фрагменты). Говорят, что моноклональное антитело "способно к связыванию" молекулы, если оно способно специфически взаимодействовать с молекулой, тем самым связывая молекулу с антителом. Имеется в виду, что термин "эпитоп" относится к той части какой-либо молекулы, которая может связываться антителом, которое также может узнаваться таким антителом. Эпитопы или "антигенные детерминанты" обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и обладают специфичными характеристиками третичной структуры, а также специфичными характеристиками заряда."Антиген" является молекулой или частью молекулы, которая может связываться антителом, и этот антиген, кроме того, способен индуцировать животное к продукции антитела, способного связываться с эпитопом данного антигена. Антиген может иметь один или несколько эпитопов. Подразумевается, что вышеуказанная специфичная реакция означает, что антиген будет реагировать с высокой степенью избирательности с эпитопом на соответствующем ему антителе, но не с множеством других антител, которые могут быть вызваны другими антигенами. Антитела, включая фрагменты антител, применимые в данном изобретении, можно использовать для количественного или качественного выявления в образце белков РЛПНП или для выявления наличия клеток, которые экспрессируют белки РЛПНП согласно данному изобретению. Это можно выполнить иммунофлуоресцентными способами с применением флуоресцентно меченого антитела (см. далее), вместе с флуоресцентной микроскопией, проточной цитометрией или флуориметрическим определением. Антитела (или их фрагменты), применимые в данном изобретении, можно использовать в гистологических исследованиях, как например, при иммунофлуоресцентной или иммуноэлектронной микроскопии, для выявления белков РЛТШП согласно данному изобретению in situ. Выявление in situ можно выполнить посредством извлечения гистологического образца из организма пациента и внесения в такой образец меченого антитела согласно данному изобретению. Антитело (или фрагмент) предпочтительно вносят путем нанесения или покрывания биологического образца меченым антителом (или фрагментом). Благодаря применению такого способа можно определить не только наличие белков РЛПНП, но и их распределение в исследуемой ткани. Используя данное изобретение, специалисты в данной области легко поймут, что можно модифицировать любой из широкого множества гистологических способов (таких как способы окрашивания) для того, чтобы достичь такого выявления in situ. Такие анализы белков РДПНП согласно данному изобретению обычно включают в себя инкубацию биологического образца, такого как биологическая жидкость, тканевой экстракт, свежесобранные клетки,такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые были инкубированы в культуре ткани, в присутствии меченого антитела, позволяющего идентифицировать белки РЛПНП, и выявление антитела любым из множества способов, хорошо известных в данной области. Биологический образец можно связывать с твердофазной подложкой или носителем, таким как нитроцеллюлоза, или другая твердая подложка или носитель, который позволяет иммобилизовать клетки,клеточные частицы или растворимые белки. Затем подложку или носитель можно промыть подходящими буферами с последующей обработкой меченым антителом согласно данному изобретению, как указано выше. Затем твердофазную подложку или носитель можно промыть буфером второй раз, чтобы удалить не связавшееся антитело. Затем количество связанной метки на указанной твердой подложке или носителе можно определить стандартными способами. Под твердофазной подложкой, твердофазным носителем, твердой подложкой, твердым носителем, подложкой или носителем имеют в виду любую подложку или носитель, способный связывать антиген или антитела. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирол,полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон, амилозы, природные и модифицированные целлюлозы,полиакриламиды, габбро и магнетит. В целях данного изобретения носитель по своей природе может быть либо растворимым в некоторой степени, либо нерастворимым. В действительности материал подложки может иметь любую возможную структурную конфигурацию при условии, что связанная молекула обладает способностью связываться с антигеном или антителом. Таким образом, конфигурация подложки или носителя может быть сферической, как в шарике, цилиндрической, как на внутренней поверхности пробирки или внешней поверхности стержня. В альтернативном случае поверхность может быть плоской, такой как лист, тестируемая полоска и т.д. Предпочтительные подложки или носители-5 007494 включают шарики из полистирола. Специалисты в данной области будут знать другие подходящие носители для связывания антитела или антигена, или смогут выяснить это с использованием обычных экспериментов. Связывающая активность данной партии антитела согласно изобретению, как указано выше, можно определить согласно хорошо известным способам. Специалисты в данной области смогут определить рабочие и оптимальные условия анализа для каждого определения, используя стандартные эксперименты. Как обычно или необходимо в конкретной ситуации к анализам могут быть добавлены другие стадии, такие как промывка, перемешивание, встряхивание, фильтрование и тому подобное. Одним из способов, которыми можно метить антитело согласно данному изобретению, является способ его связывания с ферментом и использование в иммуноферментном анализе (ИФА). Указанный фермент, в свою очередь, в том случае, когда последний подвергается воздействию соответствующего субстрата, будет реагировать с субстратом таким образом, при котором образуется химический компонент, который можно зарегистрировать, например, спектрофотометрическими, флуорометрическими или визуальными способами. Ферменты, которые можно использовать для того, чтобы пометить антитело регистрируемой меткой, включают, но не ограничены указанным, малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу,изомеразу дельта-5-стероида,алкогольдегидрогеназу дрожжей,альфа-глицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу,глюкозоксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу,глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Регистрацию можно проводить колориметрическими способами, в которых используют хромогенный субстрат для фермента. Регистрацию также можно выполнять визуальным сравнением степени ферментативной реакции субстрата со стандартами, приготовленными сходным образом. Регистрацию также можно выполнять с использованием любого из множества других способов иммуноанализа. Например, при радиоактивном мечении антител или фрагментов антител можно выявитьR-PTP-азу с применением радиоиммуноанализа (РИА). Хорошее описание РИА можно найти в Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, by Work, T. S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) особенно обращаясь к главе, озаглавленной An Introduction to Radioimmune Assay andRelated Techniques by Chard, Т., включенной здесь в виде ссылки. Радиоактивный изотоп можно регистрировать такими способами, как с применением гамма-счетчика или сцинтилляционного счетчика или авторадиографии. Антитело согласно данному изобретению также можно метить флуоресцентным соединением. Когда флуоресцентно меченое антитело подвергают воздействию света соответствующей длины волны, его присутствие затем можно выявить благодаря флуоресценции. Среди наиболее широко используемых соединений флуоресцентных меток имеются изотиоцианат флуоресцеина, родамин, фикоэритрин, пикоцианин, аллофикоцианин, о-фтальальдегид и флуоресцамин. Антитело также можно метить регистрируемой меткой с использованием металлов, испускающих флюоресценцию, таких как 152 Е или другие представители ряда лантанидов. Указанные металлы можно связывать с антителом с помощью таких хелатирующих металлы групп, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ЕТРА). Антитело также можно метить регистрируемой меткой посредством его связывания с хемилюминесцентным соединением. Присутствие хемилюминесцентно меченого антитела затем определяют, регистрируя наличие люминесценции, которая возникает в ходе химической реакции. Примерами особенно пригодных соединений хемилюминесцентных меток являются люминол, изолюминол,ароматический сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и сложный эфир оксалат. Также можно использовать биолюминесцентное соединение для того, чтобы метить антитело согласно данному изобретению. Биолюминесценция является разновидностью хемилюминесценции, обнаруженной в биологических системах, в которых каталитический белок увеличивает эффективность хемилюминесцентной реакции. Присутствие биолюминесцентного белка определяют посредством регистрации наличия люминесценции. Важными биолюминесцентными соединениями в целях мечения являются люциферин, люцифераза и акворин. Молекулу антитела согласно данному изобретению можно адаптировать для применения в иммунометрическом анализе, также известном как двухсайтовый анализ или анализ по типу сэндвича. В обычном иммунометрическом анализе некоторое количество немеченого антитела (или фрагмента антитела) связывают с твердой подложкой или носителем и добавляют некоторое количество регистрируемого меченого растворимого антитела, чтобы обеспечить возможность выявления и/или количественной оценки тройного комплекса, образованного между антителом на твердой фазе, антигеном и меченым антителом. Обычные и предпочтительные иммунометрические анализы включают прямые анализы, при которых антитело, связанное с твердой фазой, является первым антителом, контактируемым с тестируемым образцом, чтобы экстрагировать антиген из образца благодаря формированию двойного комплекса антитело на твердой фазе-антиген. После соответствующего инкубационного периода твердую подложку или носитель промывают для того, чтобы удалить остаток жидкого образца, включая не прореагировавший-6 007494 антиген, если такой имеется, и затем подвергают контакту с раствором, содержащим неизвестное количество меченого антитела (которое функционирует как репортерная молекула). После второго инкубационного периода, чтобы обеспечить образование комплекса между меченым антителом и антигеном,связанным с твердой подложкой или носителем через немеченое антитело, твердую подложку или носитель промывают второй раз, чтобы удалить не прореагировавшее меченое антитело. В другом типе сэндвич-анализа, который также можно применять по отношению к антигенам согласно данному изобретению, используют так называемые одновременный и обратный анализы. Одновременный анализ включает в себя единственную стадию инкубации, на которой и антитело, связанное с твердой подложкой или носителем, и меченое антитело добавляют к тестируемому образцу в одно и то же время. После завершения инкубации твердую подложку или носитель промывают, чтобы удалить остаток жидкого образца и меченое антитело, не образовавшее комплексы. Затем определяют наличие меченого антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, как это делали бы при обычном прямом анализе типа сэндвича. В обратном анализе используют поэтапное добавление первого раствора меченого антитела к жидкому образцу с последующим добавлением немеченого антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, после соответствующего периода инкубации. После второй инкубации твердую фазу промывают обычным образом, чтобы освободить его от остатка тестируемого образца и раствора не прореагировавшего меченого антитела. Регистрацию меченого антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, затем проводят как в одновременном и прямом анализах. Изобретение далее будет проиллюстрировано следующими не ограничивающими примерами. Примеры Пример 1. Получение р-чрРЛПНП СНО. Стабильные рекомбинантные клетки СНО, экспрессирующие растворимый РЛПНП человека, получали котрансфекцией клеток CHO-DUKX, у которых отсутствует ген дигидрофолатредуктазы (DHFR)(Urlaub. G. et al., 1980), двумя экспрессирующими векторами: psLDLROl, содержащим N-концевой связывающий лиганд домен РЛПНП, начиная с аминокислотного остатка Asp (+4) до Glu 291 (+291), иpDHFR, содержащим мышиный ген DHFR, оба под контролем промотора и элементов терминации транскрипции раннего района SV40. Трансфекцию проводили катионными липосомами, используя LipofectAmine (Gibco BRL), согласно протоколу, описанному производителем. Через 72 ч после трансфекции клетки переносили в селективную среду, в которой отсутствуют дезокси- и рибонуклеозиды, с добавлением 10% диализованной FCS. Клетки, экспрессирующие активность DHFR, обладали способностью формировать колонии, которые выделяли отслаиванием клеток с помощью смоченных в трипсине бумажных дисков. Клетки выращивали и проводили скрининг в отношении активности р-чрРЛПНП. Затем трансфицированные клетки подвергали амплификации генов с помощью МТХ с последующим субклонированием и отбором стабильных клонов продуцентов. р-чрРЛПНП (форма +291) получали с помощью клеток СНО стабильного клона продуцента, обозначенного 33-10-29-21, в биореакторе CelliGen объемом 5 л в бессывороточной среде (Gibco CHO-ASFM катал.95-0091 DJ). Неочищенный собранный материал очищали фильтрованием через патронный фильтр 0,8-2,0 мкм (Gelman катал.CSS92DSCCK) и концентрировали в 100 раз над мембраной с отсечением 5 кД. Форму +291 р-чрРЛПНП, использованную для первых иммунизаций, очищали с использованием способа очистки в небольшом масштабе. В этом способе использовали катионобменную колонку с DEAE-сефарозой, после чего следовала стадия гидрофобного взаимодействия на колонке бутил-TSK, затем следовала колонка НТР и стадия эксклюзионной хроматографии по размеру (SEC) на колонке с Сефакрилом 100. Выбирали фракцию 27 SEC, так как она содержала материал со специфичной антивирусной активностью 780 единиц/мкг, выявлена в анализе на антивирусную активность,описанном ниже в примере 9. Белок в указанной фракции идентифицировали как р-чрРЛПНП посредством анализа N-конца. Очищали вторую партию р-чрРЛПНП +291 СНО и использовали для бустер-инъекций мышей. РчрРЛПНП очищали, используя усовершенствованный способ, дающий повышенный выход, который включал в себя следующие стадии: а) осветление и концентрирование х 100 неочищенного собранного материала; b) анионообменную колонку HQ POROS и с) две стадии гидрофобного взаимодействия (HIC): улавливание на колонке бутил-TSK и пропускание через колонку фенил-5 РW. Не связавшуюся фракцию с последней стадии HIC диализовали и очищали на катионобменной колонке HS-POROS. Последняя стадия представляла собой колонку с гидроксиапатитом (НТР). Следовательно, полученный р-чрРЛПНП очищали примерно до 90%, элюируя в виде единственного основного пика при ОФ-ВЭЖХ. Пример 2. Иммунизация мышей. 10 мкг очищенного р-чрРЛПНП фракции 27, полученной с колонки SEC в примере 1, указанном выше, при концентрации 100 мкг/мл гомогенизировали с полным адъювантом Френда (CFA, 50% об/об.) и инъецировали в подушечку стопы каждой из пяти самок мышей Balb/C 7-недельного возраста. Через четыре недели после первой иммунизации мышей повторно иммунизировали внутримышечно 10 мкг той же фракции очищенного р-чрРЛПНП в 50% (об./об.) растворе CFA. Через две недели после второй инъекции тестировали сыворотку мышей в отношении антител к р-7 007494 чрРЛПНП, используя прямой способ ELISA, описанный далее в примере 3. Двух мышей М-1 и М-2 с наиболее значительной специфической иммунореактивностью к рчрРЛПНП далее подвергали бустер-иммунизации через 10 недель после второй инъекции 10 мкг очищенного р-чрРЛПНП, полученного усовершенствованным способом очистки, описанным выше в примере 1. Спустя 14 недель у мышей брали кровь и тестировали в отношении антител к р-чрРЛПНП. Затем они получали две дополнительные бустер-иммунизации 50 мкг р-чрРЛПНП в PBS: первую внутрибрюшинно, а вторую два дня спустя как внутрибрюшинно, так и внутривенно. Через две недели после второй инъекции у мышей брали кровь и антисыворотки тестировали в отношении анти-р-чрРЛПНП-активности прямым способом ELISA, как в примере 3 далее. Каждую антисыворотку серийно разводили 1:100-1:32000 и вносили в повторах в 96-луночный планшет, покрытый 10U/лунку р-чрРЛПНП, очищенного с использованием усовершенствованного способа очистки, описанного выше в примере 1. В первой лунке каждого ряда в качестве пустых контролей использовали буфер для анализа и DMEM + PBS, содержащий 10% HS + 1% БСА или желатина + 0,05% Твина 20 + 0,05% тимерозала. Нормальную сыворотку мыши (NMS) вносили в таких же пределах разведений в последние два ряда в качестве негативных контролей. Оптическую плотность ферментативной реакционной смеси измеряли на считывающем устройстве для ELISA при 492 и 405 нм. Результаты данного теста показали, что сыворотка мыши М-1 имела более высокую специфичную иммунореактивность по отношению к р-чрРЛПНП, и поэтому мышь забивали и собирали клетки селезенки для слияния с клетками миеломы (Eshhar Z, 1985). Пример 3. Прямой ELISA для тестирования антисыворотки и скрининга клонов гибридом. Прямой ELISA для скрининга позитивной антисыворотки выполняли следующим образом: 96 луночные планшеты покрывали 100 мкл р-чрРЛПНП (очищенного усовершенствованным способом очистки согласно примеру 1), 100 единиц/мл (10U/лунку) в PBS + 1% желатин (Sigma, катал.G-7765) + 0,9 мМ Са+2 и 0,5 мМ Мg+2, рН 5, 6, в дальнейшем именуемом буфером для анализа, в течение 90 мин. при 37 С при встряхивании. Планшеты шесть раз промывали в PBS + 0,05% Твин 20 (монолаурат полиоксиэтиленсорбитана - Sigma Р-1379), в дальнейшем называемом раствором для промывки. Образцы антисыворотки от иммунизированных мышей, серийно разведенные 1:100-1:32000, или надосадок культур клеток гибридомы добавляли в лунки и инкубировали в течение 90 мин при 37 С при встряхивании, после чего шесть раз промывали в растворе для промывки. В лунки добавляли 100 мкл антитела козы против Fab мышей, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP)-APA (Sigma-катал.4 601-1), разведенного 1:1200, и инкубировали в течение 90 мин при 37 С при встряхивании, и затем шесть раз промывали раствором для промывки. В лунки добавляли 100 мкл раствора субстрата (полученного растворением одной таблетки OPD и одной таблетки Н 2O2 в 20 мл воды) и инкубировали при КТ в течение 30 мин. Ферментативную реакцию останавливали добавлением 100 мкл/лунку 4N НСl. Оптическую плотность в 96-луночных планшетах регистрировали, используя считывающее устройство для ELISA, при 492 и 405 нм, и результаты рассчитывали, используя логистический алгоритм по четырем параметрам с помощью компьютерной программы MultiCalc PC-компьютера, соединенного со считывающим устройством для ELISA. Пример 4. Слияние, получение гибридом, селекция клонов и очистка антител из асцитных жидкостей. Процесс слияния и селекцию клеток гибридом проводили согласно протоколам, описанным в Eshhar Z, 1985. Коротко, клетки селезенки мыши М-1, которую подвергали бустер-иммунизации за 2-4 дня до слияния, сливали с клетками миеломы при короткой инкубации с ПЭГ. ПЭГ сначала медленно разбавляли DMEM, а затем полностью удаляли центрифугированием. Клетки снова суспендировали в средеDMEM-HAT, распределяли в 96-луночные планшеты при концентрации примерно 3,4 х 10-4 клеток/лунку и инкубировали в течение 10-14 дней в инкубаторе с 8% СО 2 при 37 С. Среду во всех лунках с гибридомами заменяли на DMEM с добавлением 10% сыворотки лошади (HS) в 10-дневный период времени. Проводили скрининг образцов надосадка культуры гибридом на наличие мАт к р-чрРЛПНП прямымELISA, описанным выше в примере 3. В качестве пустых контролей использовали буфер для анализа иDMEM + 10% HS, в качестве позитивных контролей использовали мАт С 7 (коммерчески доступное изAmersham) и антисыворотку мыши М-1, в то время как моноклональное антитело к растворимому рецептору TNF р 55 использовали в качестве негативного контроля. Клетки из тех лунок, в которых в надосадках культур выявили наличие антител, переносили в 24-луночные планшеты и затем в Т-флаконы объемом 25 см 2. Увеличенные в объеме культуры проверяли в отношении секреции мАт к р-чрРЛПНП. Ампулы клеток позитивных культур замораживали и хранили в жидком азоте. Всего проверили примерно 1000 культур для выявления антител к р-чрРЛПНП. 54 культуры с самой высокой иммунной активностью перепроверяли несколько раз. Пять культур (12, 28, 29, 30 и 50) с самой высокой активностью клонировали методом лимитирующего разведения в 96-луночных планшетах. Надосадки растущих клонов проверяли несколько раз на наличие антител к р-чрРЛПНП прямым-8 007494 Клетки позитивных клонов гибридом выращивали во флаконах для культуры ткани в DMEM, содержащей 15% сыворотки лошади, и ампулы с частью культур замораживали. В параллели клетки разных клонов гибридом инъецировали каждой из 2-4 мышей, чтобы получить асцитные жидкости. Антитела очищали из асцитной жидкости либо осаждением сульфатом аммония, либо на колонке с белком G. Коротко, 7,5 мл асцитной жидкости разбавляли 1:3 в 20 мМ фосфатном буфере, рН 7, и наносили на колонку с белком G объемом 5 мл (СЮ/10) . Колонку промывали 20 мМ фосфатным буфером, рН 7, и мАт элюировали 100 мМ глициновым буфером, рН 2,7. Значение рН элюированной фракции доводили до 77,5 1 М трис-буфером, рН 9,3. Пример 5: Скрининг пар мАт, которую следует использовать в ELISA, и оптимизация параметровELISA. мАт, очищенные из асцитных жидкостей, как описано выше в примере 4, использовали для выполнения серии экспериментов в матричной форме, чтобы выбрать наилучшую подходящую пару мАт, которые следует использовать в качестве первого и второго антитела в ELISA по типу сэндвича для рчрРЛПНП, описанном далее в примере б. Коротко, 96-луночные планшеты покрывали асцитными жидкостями, полученными из пяти гибридом ( 12, 28.28, 29.08, 30 и 50.05), очищенными либо осаждением сульфатом аммония, либо на колонке с белком G. Проводили скрининг антител с использованием в качестве антигенов формы +291, а также форм +292 (от аминокислотного остатка Asp +4 до Cy +292) и +331(от аминокислотного остатка Asp +4 до Cys +331) р-чрРЛПНП, полученных в клетках СНО. Один мл каждого из указанных выше частично очищенных мАт метили биотином для быстрого скрининга их применимости в качестве вторых антител в ELISA по типу сэндвича. Коротко, 1,5 мг очищенных осаждением сульфатом аммония мАт доводили до рН 8,5 с помощью 30 мкл 0,5 М NaHCO3. 0,75 мг биотинаOSu N-гидроксисукцинимидобиотин (Biotin-OSu, Sigma, катал.Н 1759, из раствора 5 мг в 200 мкл ДМСО) добавляли к раствору антитела и инкубировали в течение двух часов при комнатной температуре при осторожном встряхивании, после чего инкубировали в течение ночи при 2-8 С. Реакционный раствор наносили на колонку PD10 с Сефадексом G-25M (Pharmacia катал.17-0851-01), чтобы разделить биотинилированные мАт и избыток не прореагировавшего биотина-OSu. Первые предварительные эксперименты показали, что мАт 29.08 и 30 давали самый высокий сигнал над фоном при использовании в качестве вторых антител в ELISA. Реакцию указанных двух клонов в качестве вторых антител снова проверяли с антителами 12, 28,29.08 и 50, используемыми для покрытия планшетов. Результаты этого эксперимента четко показали, что мАт 28 было наиболее подходящим антителом для покрытия. Наилучшие результаты в отношении интенсивности сигнала и специфичности были получены с мАт 28, использованным для покрытия планшета для микротитрования, и мАт 29.08, меченым биотином,в качестве второго антитела. Используя указанные мАт, получили хорошие результаты со всеми тремя формами (+291, +292 и +331) р-чрРЛПНП. Со всеми формами оптическая плотность при 492/405 нм составляла примерно 1,3 OD. Три формы антигена р-чрРЛПНП анализировали в серийных разведениях в пределах концентраций 0,9-1000 нг/мл. Кривую доза-ответ получали с использованием мАт 28 для покрытия и биотинилированного мАт 29.08 в качестве второго антитела. Указанная комбинация давала линейный ответ в пределах концентраций р-чрРЛПНП 1-10 нг/мл. Оптимизировали различные параметры, которые могут влиять на тест ELISA, такие как концентрация реагентов, периоды инкубации, выбор буферов и планшетов, посредством тестирования следующих параметров: Покрывание лунок планшета для микротитрования 5-10 мкг/мл мАт 28 в PBS. Состав буфера:e) I Block, Ну Pep и Ну Yeast Второе мАт 29.08, меченое биотином, при концентрациях 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000,1:10000, эквивалентных пределу концентраций 10,74-0,537 мкг/мл. Концентрации экстравидина: 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:10000, эквивалентные пределу концентраций 4-0,2 мкг/мл. На основе указанных экспериментов была разработана окончательная процедура для теста ELISA по типу сэндвича, описанная далее в примере 6. Пример 6. Разработка ELISA по типу сэндвича для р-чрРЛПНП. Разработали ELISA по типу сэндвича для р-чрРЛПНП с использованием мАт 28 и 29.08. Коротко,96-луночный планшет покрывали 100 мкл очищенного с помощью белка G мАт 28 (5 мкг/мл) в течение-9 007494 ночи при 2-8 С или в течение 3 ч при 37 С. Затем планшеты пять раз промывали PBS + 0,05% Твин 20. Планшеты инкубировали с 200 мкл блокирующего раствора PBS +1% БСА или желатин + 0,05% Твин 20 +тимерозал 0,05% в течение 1 ч при 37 С или в течение ночи при 4 С и пять раз промывали PBS + 0,05% Твин 20. В лунки добавляли 100 мкл образцов или антигена для калибровочной кривой (рчрРЛПНП +291 СНО, 0,5-32 нг/мл, разведенный в блокирующем растворе) и инкубировали в течение 90 мин при 37 С со встряхиванием. Затем планшеты пять раз промывали PBS+0,05% Твин 20. Добавляли 100 мкл/лунку биотинилированного мАт 29.08 (0,67 мкг/мл) в блокирующем растворе и инкубировали при встряхивании в течение 1 ч при 37 С. Планшеты пять раз промывали PBS+0,05% Твин 20. В лунки добавляли 100 мкл коммерческого конъюгата экстравидина-пероксидазы (ExtrAvidin TMPeroxidase BioMakor, катал.0645-1), разведенного 1:10000, и инкубировали при встряхивании в течение 1 ч при 37 С. Затем планшеты пять раз промывали PBS + 0,05% Твин 20. В каждую лунку добавляли 125 мкл вышеуказанного раствора субстрата и инкубировали примерно в течение 10 мин до развития окраски до требуемой интенсивности. Реакцию останавливали добавлением 125 мкл 4N НСl. Оптическую плотность в 96-луночных планшетах регистрировали с использованием считывающего устройства для ELISA при длинах волн 492 и 405 нм, и результаты рассчитывали с помощью компьютерной программы MultiCalc на РС-компыотере, соединенном со считывающим устройством для ELISA. Пример 7. Изотип моноклональных антител.Ig-изотип моноклональных антител определяли, используя коммерческий набор для изотипирования (PharMingen International) в соответствии со способом анализа производителя. Клоны 12.6, 28, 29.8 и 30 идентифицировали как IgG1 в то время как обнаружено, что клон 50.30 является Ig класса IgM. Пример 8. Вестерн-блот-анализ SDS-ПААГ. Форму +291 очищенного р-чрРЛПНП и нативный РЛПНП, очищенный из мочи человека, анализировали Вестерн-блот-анализом с использованием моноклональных антител, выработанных к рчрРЛПНП. Коротко, на 12% SDS-полиакриламидный гель наносили 100 нг/дорожку формы +291 рчрРЛПНП СНО или нативного чрРЛПНП мочи или неочищенного собранного материала ТВР-1 (в качестве негативного контроля) при восстанавливающих условиях (40 мМ ДТТ) . На одну дорожку наносили маркеры низкой молекулярной массы (НММ). Указанный набор образцов разгоняли пять раз. Белки, разделенные в геле, переносили электроэлюированием на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны инкубировали в течение 16 ч в PBS, содержащем 10% обезжиренного молока, 0,1% Твина 20. Мембраны разрезали на полоски, и каждую полоску инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с одним из пяти отобранных мАт: 12.6, 30, 50.30, 28 или 29.08 (асцитная жидкость, разведенная 1:4000). Полоски мембран промывали PBS, содержащим 0,1% Твин 20 (3 х 15 мин) и инкубировали в течение 1 ч со вторым антителом - антимышиным антителом козы, конъюгированным с пероксидазой хрена щелочной фосфатазой (разбавленным 1:10000, BioMakor) в течение 2 ч при комнатной температуре. Полоски промывали PBS, содержащим 0,1% Твин 20 (3 х 15 мин). Позитивные полосы регистрировали с помощью усиленной хемилюминесценции (ECL, Amersham). Моноклональные антитела 12.6 и 29.8 узнавали как белок мочи, так и форму +291 очищенного р-чрРЛПНП при Вестерн-блот-анализе (фиг. 2). мАт 28 и 30 узнавали форму +291 очищенного рчрРЛПНП. Пример 9. Ингибирование антивирусной активности р-чрРЛПНП моноклональными антителами. Поводили тестирование мАт, которые специфически взаимодействуют с р-чрРЛПНП, по их способности блокировать антивирусную активность р-чрРЛПНП (формы +291) in vitro, используя анализ ингибирования цитопатического действия (ЦПД) в системе VSV/WISH. Клетки WISH (происходящие из амниона человека) культивировали в MEM с добавлением 10%FBS и 4 мМ глутамина при 37 С в инкубаторе с 5% СО 2. Экспоненциально растущие клетки высевали в 96-луночные планшеты для культуры ткани при плотности 40000 клеток/лунку за 24 ч до начала анализа. Образцы, которые подвергали тестированию, и стандарт разбавляли и разносили в лунки, содержащие клетки. В лунки сразу же добавляли VSV при множественности инфекции (MOI), равной 0,5 БОЕ/клетку. Планшеты инкубировали 16-18 ч при 37 С и затем промывали этанолом. Монослой выживших клеток оценивали при окраске кристаллическим фиолетовым по Граму. Количественный анализ цитопатического действия относительно стандарта проводили посредством нанесения плотности окраски против стандартной концентрации. Для анализа нейтрализующего действия антител р-чрРЛПНП предварительно инкубировали в течение 30 мин при 37 С с возрастающими концентрациями асцитной жидкости с тестируемым мАт. Затем указанные растворы добавляли к культурам клеток WISH в 96-луночные планшеты для микротитрования, после чего добавляли вирус везикулярного стоматита (VSV). Через 18 ч инкубации определяли опосредованный VSV лизис клеток путем окрашивания оставшихся клеток кристаллическим фиолетовым. Полуколичественный анализ цитопатического действия относительно стандарта выполняли, откладывая интенсивность окраски (определенную считывающим устройством для ELISA) против концентрации стандарта. Оценивали действие мАт при возрастающих концентрациях р-чрРЛПНП. Как показано в табл. 1,было обнаружено, что два мАт (12.6 и 50.30) проявляют нейтрализующую активность.- 10007494 В эксперименте, показанном в табл. 1, ингибирующее действие двух мАт тестировали при разведении асцитных жидкостей 1:40. При данном разведении мАт 12.6 проявляло немного более высокую активность, чем мАт 50.30. Это может быть следствием свойств мАт, а также различий в их концентрации в асцитной жидкости. Ингибирующее действие мАт можно ослабить увеличением концентрации р-чрРЛПНП по сравнению с концентрацией мАт. В действительности при концентрациях р-чрРЛПНП 62,5 U/мл ни одно из мАт не оказывало действия на активность р-чрРЛПНП при анализируемой концентрации антитела. Таблица 1. Ингибирование антивирусной активности р-чрРЛПНП клонами 12.6 и 50.30 Ингибирование антивирусной активности р-чрРЛПНП в отношении опосредованного VSV лизиса клеток WISH. Ингибирующее действие мАт определяли при разведении асцитной жидкости 1:40. Количество жизнеспособных клеток представлено в таблице значениями OD. Числа в скобках представляют результаты повторного исследования, выполненного при концентрациях РЛПНП 0 и 12,5 U/мл. Ингибирование антивирусной активности р-чрРЛГШП определяли с использованием возрастающих концентраций мАт 12,6 и 50,30. мАт 12,6 ингибировало антивирусную активность р-чрРЛПНП на 60% при разведении 1:40 (асцитной жидкости) и на 35% при разведении 1:20500. Клон 50.30 ингибировал активность р-чрРЛПНП на 45% при разведении 1:40 и на 15% при разведении 1:20500. Кривая доза-ответ, полученная с обоими мАт, и наблюдение того, что ингибирующее действие снижалось при избытке р-чрРЛПНП, свидетельствуют о том, что мАт оказывают свое действие посредством связывания с р-чрРЛПНП. Пример 10. Ингибирование репликации HCV моноклональными антителами. Тестировали мАт, специфичные для р-чрРЛПНП, в отношении их способности ингибировать репликацию HCV в первичной культуре гепатоцитов человека. Культуру клеток FT167 получали от пациента мужского пола 57-летнего возраста, нуждающегося в резекции - лобэктомии по медицинским показаниям (метастаз опухоли толстого кишечника, правая доля). Первичные культуры гепатоцитов человека получали способом двухстадийной перфузии с коллагеназой (Maurel P. Adv. Drug Del. Rev. 22: 105-132 (1996), Pichard L. et al. Mol. Pharmacol. 41: 1047-1055(1992), Ferrini JB. Et al. Chem-Biol Interactions 107: 31-45 (1997. Жизнеспособность клеток перед посевом определяли, используя тест исключения с трипановым синим. Четыре миллиона клеток в 3 мл культуральной среды высевали в пластиковые чашки диаметром 60 мм, предварительно покрытые коллагеном. Культуральная среда без сыворотки для долгосрочного культивирования состояла из среды Е Вильямса с добавками, которые опубликованы (Lanford R. et al. In Vitro Cell Dev. Bio. 25: 174-182 (1989. Эту среду впоследствии обновляли каждые 48 ч. Культуры поддерживали при 37 С во влажной атмосфере воздуха и 5% диоксида углерода. При указанных условиях культивирования гепатоциты человека сохраняют свой дифференцированный фенотип в течение по меньшей мере 35 дней (Ferrini JB. Et al. ChemBiol Interactions 107: 31-45 (1997 и чувствительны к инфекции HCV и позволяют реплицироваться вирусному геному (Fournier С. et al. J. Gen Virol. 79: 2367-2374 (1998. Образец HCV-позитивной сыворотки: основан банк сыворотки человека от пациентов, которые были оценены в тесте с EIA HCV 3.0 и Chiron RIBA HCV 3.0 SIA как позитивные по анти-HCV-антителам. Ни один из указанных пациентов не был одновременно инфицирован HBV или HIV. В каждом образце сыворотке количественно оценивали РНК HCV с помощью набора Roche monitor и генотипировали поточным анализом проб (Inno-Lipa HCV II, Innogenetics). Образцы сыворотки хранили при -80 С небольшими аликвотами для того, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания. В указанных экспериментах использовали образец S42 (генотип lb; вирусная нагрузка: 410000 копий/мл). Для инфецирования и последующих обработок культуры гепатоцитов в стерильных условиях переносили в лабораторию РЗ (с высокой степенью изоляции для инфекционных для человека микроорганизмов). Через три дня после посева, когда клетки восстанавливались после повреждения при изоляции,проводили инфецирование гепатоцитов in vitro посредством инкубации в течение ночи с 25 мкл образцаHCV-позитивной сыворотки (S42) в 3 мл среды. После инфекции клетки три раза промывали 3 мл свежей среды, и продолжали культивирование при нормальных условиях в среде для долговременного культивирования. Клетки обрабатывали 3 разными мАт против р-чрРЛПНП, мАт 12.6, мАт 28 и мАт 29.8. За 30 мин до- 11007494 инфекции клетки экспонировали 2 или 8 мкг/мл разных мАт. Затем клетки инфицировали, как описано выше. Контрольные культуры инфицировали в сходных условиях, но в отсутствии антивирусной обработки. В параллельных экспериментах такие же культуры обрабатывали 5000 U/мл IFN в сходных условиях для сравнения (IFNa сильно ингибирует репликацию HCV в эталонных клетках). Все обработки проводили в повторах. На 5 день после инфекции среду удаляли и культуры 3 раза промывали холодным фосфатносолевым буфером. РНК очищали из 4 х 106 гепатоцитов, используя способ кислой фенольной экстракции с изотиоцианатом гуанидиния (Chomczynski PN. and Sacchi N. Analyt. Biochem. 162: 156-159 (1987. Преципитированную РНК растворяли в 50 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC), и оценивали количество. Один мкг клеточной РНК анализировали в специфичном для нити rTth-OT-ПЦРанализе. Чтобы избежать возможного загрязнения нитеспецифичный ОТ-ПЦР-анализ проводили последовательно, используя три разных помещения: помещение для пре-ПЦР, помещение для ПЦР и помещение для пост-ПЦР. РНК, растворенную в 10 мкл воды, обработанной DEPC, покрывали минеральным маслом и нагревали до 95 С в течение 1 мин. Температуру снижали до 70 С и добавляли 10 мкл предварительно нагретой реакционной смеси для кДНК. Затем температуру снижали до 60 С в течение 2 мин для отжига,и реакцию образования кДНК выполняли в течение 20 мин при 70oC, используя ДНК-полимеразу rTth(Perkin-Elmer). Во время добавления 40 мкл предварительно нагретого буфера, содержащего EGTA в качестве хелатирующего агента для Мn2+, для того, чтобы супрессировать активность rTth-OT, температуру поддерживали на уровне 70 С. Реакционные пробирки держали при 70 С пока добавляли 40 мкл предварительной нагретой смеси ПЦР. Условия ПЦР, проводимой в системе для ПЦР Gene Amp 9600(Perkin-Elmer), состояли из начального цикла при 94 С в течение 1 мин, 50 циклов при 94 С в течение 15 с, 58 С в течение 30 с, 72 С в течение 30 с и конечной стадии элонгации при 72 С в течение 7 мин. Для анализа положительной цепи РНК HCV нуклеотидная последовательность обратного праймера Р 3 представляет собой: 5'-TGG/ATGCACGGTCTACGAGACCTC-3', (нуклеотиды 342-320), а последовательность прямого праймера Р 4: 5'-CACTCCCCTGTGAGGAACT-3', (нуклеотиды: 38-56), (Laskus Т. et al. J. Gen.Virol. 78: 2747-2750 (1997. Такие же праймеры использовали в обратном порядке, чтобы выявить отрицательную цепь. Одну десятую часть амплифицированного продукта анализировали гельэлектрофорезом в агарозе (2%) с последующим окрашиванием BET и фотографированием в УФ-свете. Во всех сериях экспериментов делали разведения (+)- и (-)-цепей синтетической РНК HCV и добавляли 1 мкг суммарной РНК печени, чтобы имитировать условия для анализа культивируемых гепатоцитов. Указанные смеси использовали в качестве позитивных контролей для исследования ОТ-ПЦР и анализа. На фиг. 3 показано, что продукция отрицательной цепи HCV в присутствии мАт против РЛПНП полностью ингибировалась в культуре FT167. Следовательно, репликация вирусного генома была строго ингибирована. Результаты соответствовали точке зрения о том, что РЛПНП может быть рецепторомHCV. Пример 11. Получение химерных антител к РЛПНП. мРНК очищают из линии гибридом, продуцирующих мАт, специфичное по отношению к РЛПНП. Синтезируют специфичную кДНК с использованием олигонуклеотидов, комплементарных 5'-концу экзона СН 1 вариабельного домена тяжелой цепи (олигонуклеотид 1) и 5'-концу экзона Сk вариабельного домена легкой цепи (олигонуклеотид 2), используя очищенную мРНК в качестве матрицы. Получают две кДНК, одна из которых кодирует вариабельную область (специфичную для РЛПНП) тяжелой цепи, а другая вариабельную область (специфичную для РЛПНП) легкой цепи. кДНК клонируют и секвенируют. Для конструирования химерной тяжелой цепи вариабельную область клонированного гена тяжелой цепи Ig человека заменяют (используя генетические манипуляции) клонированной ДНК, кодирующей вариабельный домен (специфичный для РЛПНП) тяжелой цепи мыши. Генетические манипуляции включают в себя вырезание вариабельной области Ig человека с использованием ферментов рестрикции и лигирование вариабельной области мыши. Такую же процедуру выполняют для того, чтобы получить химерную легкую цепь. Конструируют две экспрессирующих плазмиды млекопитающих, при этом одна содержит ген химерной тяжелой цепи, а другая содержит ген химерной легкой цепи. Оба вектора используют для котрансфекции линии клеток гибридомы (SP6). Продукцию Ig, специфичного для РЛПНП, тестируют в ELISA или на Вестерн-блотах, используя культуральный бульон трансфицированных клеток в качестве второго антитела. Аффинность химерного антитела к его лиганду контролируют с помощью Biacore. Пример 12. Получение трансгенных мышей, которых конструируют так, чтобы они содержали локусы генов иммуноглобулинов человека (ксеномыши), и получение человеческих мАт против чРЛПНП. Получение ксеномышей описано в WO 98/24893 и Mendez M, J. et al., Nature genetics 15: 146-56(1997). Проводят скрининг библиотек искусственных хромосом человек-дрожжи (YAC) в отношении YAC,- 12007494 содержащих вариабельную область тяжелой цепи человека (примерно 1000 т.п.н.) (способ клонированияYAC представляет собой способ отбора, когда требуются размеры вставок больше 100 т.п.н.).YAC характеризуют Саузерн-блот-анализом и электрофорезом в импульсном поле (PFGE) . YAC должны содержать районы С, С, Dh и Vh в конфигурации гаметического типа. Благодаря использованию перекрывающихся последовательностей, находящихся в YAC, YAC рекомбинируют в ДНК дрожжей посредством стратегии поэтапной рекомбинации. Перед рекомбинацией 3'-конец YAC (с районом V) лигируют с селектируемым маркером HPRT. Структуру рекомбинантнойYAC подтверждают посредством PFGE и Саузерн-блот-анализа (наличие локуса тяжелой цепи человека от С-района до Vh-района в конфигурации гаметического типа). Ацентричное плечо YAC является мишенью вектора, несущего полный константный район 2, мышиный энхансер, ген устойчивости к неомицину, чтобы получить конечную тяжелую цепь, содержащую полную вариабельную область, т.е. 82 гена Vh, 6 генов Jh и 3 разных константных района С, С, С с соответствующими им регуляторными последовательностями. Указанную YAC обозначают уН 2. Данную конструкцию используют для получения ксеномыши. Стратегию, подобную стратегии, используемой выше, применяют для реконструкции локусов каппа, за исключением того, что маркер селекции неомицином лигируют с реконструированной YAC, содержащей полный локус каппа. Данную YAC обозначают уK2.YAC, содержащие уН 2, вводят в клетку ES посредством слияния сферопласта дрожжей, содержащего YAC, с клетками ES мышей E14.TG3B, дефицитными по HPRT. Отбирают HPRT-позитивные клетки. Позитивные клоны размножают и анализируют с помощью Саузерн-блотов и CHEF-блот-анализом. Отбирают клоны, содержащие интактную yH2-YAC. Введение и селекцию yK2-YAC в клетках ES выполняют сходным образом, как описано для yH2YAC. Клетки ES, содержащие уН 2, микроинъецируют в бластоциты мыши C57BL/6J. Полученных химерных самцов оценивают в отношении передачи через гаметы потомкам. уН 2- и/или уК 2-трансгенных мышей скрещивают с мышами DI (гомозиготными по целенаправленно инактивированным локусам тяжелой цепи каппа-цепи мыши). Каждую из трансгенных линий yH2; DI скрещивают с трансгенной линией yK2;DI, чтобы получить линии ксеномышей. Воспроизведение развития В-клеток и продукции антител у ксеномыши оценивают проточной цитометрией и ELISA. Иммунизацию ксеномыши проводят, как описано в примере 2. Способы получения гибридомы и скрининга позитивных клонов подобны способам, описанным в примерах 3 и 4. Клоны гибридом 12.6, 28, 29.8, 30 и 50.30 депонированы в Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Paris, по условиям Будапештского договора и соответствуют депозитамI-2390, I-2391, I-2392, I-2393 и I-2394, соответственно. СсылкиReductase Activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Моноклональное антитело, химерное антитело, полностью гуманизированное антитело, антитело к антиидиотипическому антителу или его фрагмент, которое специфически распознает и связывает растворимый рецептор ЛПНП человека и его фрагменты, которое получают путем иммунизации животных формой +291 растворимого рецептора ЛПНП человека, включающей аминокислотную последовательность от Asp +4 до Glu +291 последовательности ЛПНП человека, и которое способно ингибировать репликацию вируса гепатита С. 2. Моноклональное антитело по п.1, экспрессируемое гибридомным клоном 12.6, депонированным в CNCM под 1-2390. 3. Моноклональное антитело по п.1, экспрессируемое гибридомным клоном 28, депонированным вCNCM под 1-2391. 4. Моноклональное антитело по п.1, экспрессируемое гибридомным клоном 29.8, депонированным в CNCM под 1-2392. 5. Моноклональное антитело по п.1, экспрессируемое гибридомным клоном 30, депонированным вCNCM под 1-2393. 6. Моноклональное антитело по п.1, экспрессируемое гибридомным клоном 50.30, депонированным в CNCM под 1-2394. 7. Моноклональное антитело по любому из пп.3-6, которое относится к иммуноглобулину изотипаIgG1 или IgM. 8. Гибридомный клон 12.6, депонированный в CNCM под 1-390, продуцирующий моноклональное антитело по п.2. 9. Гибридомный клон 28, депонированный в CNCM под 1-2391, продуцирующий моноклональное антитело по п.3. 10. Гибридомный клон 29.8, депонированный в CNCM под 1-2392, продуцирующий моноклональное антитело по п.4. 11. Гибридомный клон 30, депонированный в CNCM под 1-2393, продуцирующий моноклональное антитело по п.5. 12. Гибридомный клон 50.30, депонированный в CNCM под 1-2394, продуцирующий моноклональное антитело по п.6. 13. Способ выявления и/или количественного определения рецептора ЛПНП человека, включающий использование моноклонального антитела по любому из пп.1-7. 14. Способ получения моноклонального антитела по п.1, включающий выращивание клонированной гибридомы, полученной из клетки селезенки млекопитающего, иммунизированного высокоочищен- 14007494 ной формой +291 растворимого ЛПНП человека, включающей аминокислотную последовательность отAsp +4 до Glu +291 последовательности ЛПНП человека, и гомогенной или гетерогенной лимфоидной клетки, в жидкой среде или брюшной полости млекопитающего с получением антитела, которое продуцируется гибридомой и накапливается в указанной среде или брюшной полости млекопитающего. 15. Способ очистки рецептора ЛПНП человека, включающий обеспечение контактирования материала, содержащего неочищенный рецептор ЛПНП человека, с моноклональным антителом по любому из пп.1-7. 16. Способ ингибирования репликации вируса гепатита С, включающий обеспечение контактирования клеток, инфицированных указанным вирусом, с моноклональным антителом по любому из пп.1-4. 17. Применение моноклонального антитела по любому из пп.1-4 для ингибирования репликации вируса гепатита С.