Препарат выделенных кератиноцитов, носитель, покрытый этими клетками, способ криоконсервации препарата и способ лечения ран

009073 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к новым культивируемым in vitro кератиноцитам, а также к их предпочтительному применению для получения продукта, который может использоваться для лечения свежих и перешедших в хроническую форму ран. Изобретение относится, таким образом, к области медицины, прежде всего к заживлению ран методами тканевой инженерии. Уровень техники Аллогенные кератиноциты на протяжении многих лет успешно используются для лечения ран,главным образом язв и/или ожогов (Maier, 1993; Schnfeld и др., 1993). Раны, которые в течение длительного периода времени не поддаются лечению традиционными терапевтическими методами, достаточно часто можно успешно лечить с применением аллогенных кератиноцитов (Phillips и Gilchrest, 1993; Beele и др., 1991; Leigh и др., 1991; Lindgren и др., 1998). Первоначально основное внимание при применении аллогенных кератиноцитов уделялось в основном замещению кожного покрова, т.е. регенерации трансплантированного эпидермиса. Однако вскоре было установлено, что эффект терапевтического лечения определяется в первую очередь стимуляцией эндогенного процесса реэпитализации, а не "прирастанием" аллогенного клеточного трансплантата в ране. По результатам многочисленных экспериментов в конечном итоге было установлено, что трансплантированные кератиноциты остаются в ране лишь в течение определенного периода времени, а затем по клинически не выявленным причинам выводятся из организма (Kawai и др., 1993). Таким образом,эндогенное заживление ран стимулируется в первую очередь в результате оптимального в пространстве и времени высвобождения аллогенными кератиноцитами множества различных факторов роста, цитокинов, внеклеточного матрикса (ВКМ), более мелких молекул и протеаз (Lang и др., 1996; Marcusson и др.,1992). Сложностью и большим разнообразием высвобождающихся факторов обусловлено при этом терапевтическое преимущество перед традиционными терапевтическими методами, основанными на применении индивидуальных субстанций по отдельности, например выделенных факторов роста. Наряду с основным эффектом реэпителизации при лечении кератиноцитами в грануляционной ткани происходят и иные обнаруживаемые на макроскопическом и микроскопическом уровне изменения (Lang и др., 1996). Еще один, оказывающий благотворное влияние на пациента и широко описанный в литературе эффект,наблюдаемый при применении кератиноцитов, состоит в проявлении ими ярко выраженного анальгетического действия после их трансплантации (Schnfeld и др., 1993). Для заживления ран предпочтительно использовать недифференцированные, активно делящиеся кератиноциты, поскольку именно активно делящиеся кератиноциты предположительно обладают способствующим заживлению ран комплексным секреторным профилем. За исключением стволовых клеток недифференцированные кератиноциты в ходе естественной дифференцировки утрачивают in vivo свой пролиферативный потенциал уже через несколько циклов клеточного деления, что до настоящего времени всегда наблюдалось при культивировании кератиноцитов in vitro (Barrandon и Green, 1987). Поэтому активно делящиеся кератиноциты, которые до настоящего времени рассматривались как наиболее пригодные для заживления ран, допускали возможность их окончательного культивирования только in vitro,что значительно усложняло и удорожало их применение в медицине. В терапевтических целях аллогенные кератиноциты используют либо непосредственно в виде так называемых "пластов кератиноцитов", представляющих собой многослойное "скопление" клеток, отделенных от чашки для культивирования с помощью ферментов, либо совместно с биосовместимыми носителями в виде так называемой "биологически активной повязки на рану". Преимущество последней состоит в отсутствии необходимости предварительной ферментативной обработки клеток, целью которой является отделение клеток перед их применением от дна чашки для культивирования. Помимо этого применение биосовместимых мембран в качестве носителей для культивирования кератиноцитов(ЕР 0462462, US 5658331, US 5693332, ЕР 0518920) позволяет заблаговременно заготавливать биологически активные повязки на раны, поскольку в этом случае более не требуется образование замкнутого"скопления" клеток. При этом существует возможность использования для лечения ран носители, которые уже покрыты выросшими на них клетками в результате их субслияния. Еще одно преимущество,связанное с применением повязок с субслившимися клетками, состоит помимо возможности их заблаговременного заготовления в том, что культивированные в соответствующих условиях кератиноциты дифференцированы в меньшей степени и поэтому оказываются более эффективными при лечении ран. Кератиноциты допускают возможность их криоконсервации индивидуально либо в сочетании с биосовместимыми носителями путем охлаждения до температуры в пределах от -30 до -196 С, предпочтительно, однако, от -70 до -90 С без снижения их эффективности при заживлении ран (De Luca и др.,1992; Теере и др., 1993). Подобная возможность дополнительно повышает терапевтическую ценность кератиноцитов, поскольку позволяет в определенных объемах изготавливать биологически активные повязки на раны "про запас".-1 009073 Задача изобретения Известные из уровня техники кератиноциты, а также изготовленные на их основе биологически активные повязки на раны обладают в настоящее время определенными недостатками, преодоление которых и является положенной в основу настоящего изобретения задачей. Очевидный недостаток известных в настоящее время кератиноцитов первичного происхождения состоит в том, что удвоение количества таких клеток при их выращивании методом культивирования invitro возможно без потери их высокой активности, проявляющейся в готовности к делению, и тем самым без ухудшения их предпочтительных свойств, которыми определяется их пригодность для изготовления биологически активных повязок на раны, лишь на протяжении небольшого числа их поколений. В соответствии с уровнем техники количество клеток можно увеличить путем их культивирования in vitro лишь примерно в 103-104 раз (Tanczos и др., 1999). Еще один, связанный с описанным выше недостаток состоит в необходимости частого и трудоемкого повторного выделения новых клеток из-за ограниченной способности указанных кератиноцитов к размножению при культивировании in vitro, и поэтому выделенный и размноженный клеточный материал не обладает единообразием, а изготовленные на его основе повязки на раны тем самым с высокой степенью вероятности отличаются или, по крайней мере, могут отличаться друг от друга по своим качественным показателям. Еще один недостаток заключается в том, что с повторным выделением новых кератиноцитов у различных доноров связан повышенный риск инфицирования реципиента, которому на рану накладывают содержащую эти кератиноциты повязку. В качестве возможного примера при этом можно назвать повышенный риск заражения ВИЧ или гепатитом. Описание изобретения В настоящем изобретении предлагаются обладающие высоким пролиферативным потенциалом кератиноциты, которые являются не иммортализованными и допускают возможность удвоения их количества по меньшей мере 150 раз при их выращивании методом культивирования клеток in vitro. Отсюда следует, что количество клеток возрастает примерно в 1044 раз. При этом соответствующие кератиноциты сохраняют свои положительные свойства, позволяющие использовать их для заживления ран. Предлагаемый в изобретении препарат выделенных кератиноцитов, которые представляют собой первоначально выделенные у донора и культивируемые in vitro кератиноциты, для выделения и начального культивирования которых может использоваться, например, метод, описанный Rheinwald и Green,1975. Кератиноциты согласно изобретению выделяют из эпидермальных участков крайней плоти человека. Причем в качестве препарата согласно изобретению используют кератиноциты из культуры KC-BI-1,которые в соответствии с Будапештским договором были депонированы для целей патентования 27 июня 2001 г. в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ, DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Брауншвейг, Германия) под регистрационным номером DSM ACC2514. В объем изобретения включены также те кератиноциты, которые являются производными клеток из культуры KC-BI-1 (DSM ACC2514). Объектом изобретения являются, таким образом, также все те клетки и культуры, которые получают и/или которые можно получить путем субпассирования и/или субклонирования исходной культуры KC-BI-1. Культивирование предлагаемых в изобретении кератиноцитов KC-BI-1 рассмотрено в примере 1. Для культивирования клеток предпочтительно использовать комплексную среду указанного в примере 1 состава, а также подкармливающие клетки (называемые также "клетками-фидерами"), в качестве которых предпочтительно применять облученные летальной дозой мышиные фибробласты 3 Т 3. Содержание фетальной телячьей сыворотки (ФТС) в культуральной среде должно составлять от 2 до 10%. Методы получения подкармливающих клеток хорошо известны специалистам в данной области, например их можно получать описанным в примере 2 методом. Предлагаемые в изобретении кератиноциты наиболее предпочтительно при этом выращивать путем их субкультивирования (пересева) при максимальной степени слияния, равной 80%. Предлагаемые в изобретении кератиноциты можно культивировать при температуре от 35 до 38 С, предпочтительно при 37 С и при относительной влажности воздуха более 90%,предпочтительно 95%, в атмосфере, насыщенной CO2 на 5-9%. При культивировании кератиноцитов, выделенных из эпидермальных участков крайней плоти описанным в примере 1 методом время удвоения их количества составляет от 1 до 2 дней (фиг. 1). При этом скорость удвоения количества культивируемых клеток даже при их многократном пассировании остается примерно на постоянном уровне (фиг. 2). Выражение "не иммортализованные" в контексте настоящего изобретения означает, что первично выделенные кератиноциты, а также внесенные в культуру кератиноциты не являются спонтанно трансформированными и/или не были трансформированы известными из уровня техники молекулярнобиологическими, химическими или физическими методами. В последнем случае предполагается, что клетки не подвергались обработке с применением, например, вирусных факторов или последовательностей, химических мутагенов или, например, облучения либо обработке несколькими такими методами в их сочетании.-2 009073 Под "не иммортализованными" подразумеваются также кератиноциты, которые не обладают вовсе или обладают значительно более низкой теломеразной активностью в сравнении с линиями трансформированных опухолевых клеток (Hrle-Bachor и Boukamp, 1993) или в сравнении с линиями иммортализованных клеток, предпочтительно в сравнении с клетками линии HeLa (см. фиг. 3). Сказанное относится,в частности, и к теломеразной активности не иммортализованных кератиноцитов в сравнении с иммортализованными кератиноцитами клеточной линии HaCat. Выражение "не иммортализованные" означает далее, что удвоение количества указанных кератиноцитов в отличие, например, от иммортализованных кератиноцитов (Schoop и др., 1999) невозможно в отсутствие фетальной телячьей сыворотки, и/или в отсутствие подкармливающих клеток, и/или в отсутствие эпидермального фактора роста (EGF-фактора от англ. "epidermal growth factor"). Выражение "не иммортализованные" означает также, что указанные кератиноциты не изменяют характерный для них фенотип с увеличением числа циклов удвоения их количества (см. фиг. 4). Выражение "не иммортализованные" означает, кроме того, что указанные кератиноциты после их трансплантации бесшерстным мышам (бестимусным мышам с мутацией nude), предпочтительно мышам линии BALB/c, проявляют нормальный профиль дифференцировки. Под "нормальным профилем дифференцировки" при этом подразумевается наличие у кератиноцитов способности развиваться до окончательно дифференцированных кератиноцитов и способности к образованию надбазальных эпидермальных слоев, а также рогового слоя (Stratum corneum) аналогично аутологическим кератиноцитам. Итак, объектом изобретения является препарат выделенных кератиноцитов, которые являются не иммортализованными и допускают возможность удвоения их количества по меньшей мере 150 раз при их выращивании методом культивирования клеток in vitro. Изобретение относится далее к кератиноцитам, которые являются не иммортализованными и допускают возможность удвоения их количества по меньшей мере 200 раз или 250 раз при их выращивании методом культивирования клеток in vitro. Помимо этого в изобретении также описаны такие кератиноциты, которые являются не иммортализованными и допускают возможность удвоения их количества по меньшей мере 300 раз при их выращивании методом культивирования клеток in vitro. Одно из основных преимуществ настоящего изобретения состоит в возможности размножения указанных выше кератиноцитов, взятых только у одного или небольшого числа доноров. Так, например,потомство от одной взятой у донора клетки после 150-кратного удвоения количества клеток достигает 1044 клеток, после 250-кратного удвоения количества клеток достигает 1077 клеток, а после 300-кратного удвоения количества клеток достигает 1090 клеток. В соответствии с этим согласно настоящему изобретению впервые становится возможным получать в больших объемах стандартизированный клеточный материал для изготовления биологически активных повязок на раны постоянного и контролируемого качества. Необходимое количество стандартизированного клеточного материала можно получать, например, размножением криоконсервированных клеток из банка клеток, которые в свою очередь получены из кератиноцитов, обладающих соответствующими настоящему изобретению свойствами. Использование стандартизированного клеточного материала в качестве исходного материала для получения биологически активных повязок на раны позволяет также снизить риск инфицирования возможного реципиента, поскольку число доноров, у которых выделяют кератиноциты, ограничено небольшим количеством людей, предпочтительно одним человеком. Тем самым настоящее изобретение позволяет преодолеть существенный недостаток, который в настоящее время состоит в возможности пассирования известных на сегодня кератиноцитов лишь ограниченное число раз. Объектом изобретения является также носитель, покрытый предлагаемыми в изобретении кератиноцитами. Выражение "покрытый" в контексте настоящего изобретения означает, что носитель частично или полностью покрыт на его поверхности выросшими на нем предлагаемыми в изобретении кератиноцитами. Наиболее предпочтителен частично покрытый выросшими на нем кератиноцитами носитель,поскольку в этом случае сокращается промежуток времени, которое требуется затрачивать на культивирование клеток и соответственно на получение пригодного для заживления ран носителя. Один из пригодных для применения в предусмотренных изобретением целях носителей отличается тем, что он представляет собой биосовместимый материал, допускающий возможность его применения для получения соответствующего лекарственного средства. В качестве такого носителя можно использовать, например, гидрофобные биосовместимые материалы, описанные, в частности, в WO 91/13638. Вместе с тем в качестве носителя можно использовать и материалы, обладающие преимущественно гидрофильными свойствами. В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве носителя предлагается использовать полимерные материалы из этерифицированной гиалуроновой кислоты. Согласно особо предпочтительному варианту в качестве носителя используется полимер из этерифицированной гиалуроновой кислоты в виде перфорированной полимерной пленки определенной геометрии. Такая полимерная пленка имеет, например, толщину от 10 до 500 мкм и перфорирована отверстиями размером от 10 до 1000 мкм. При этом перфорированные отверстия имеют определенный и постоянный размер и расположены в виде упорядоченного ряда с постоянным шагом между ними, составляющим от-3 009073 50 до 1000 мкм. Полимерная пленка подобного типа описана в ЕР 0462426. Применение перфорированных носителей наиболее целесообразно по той причине, что они не требуют точно выверенного наложения на рану биологически активной повязки. Получение имеющей определенную геометрию и покрытой выросшими на ней предлагаемыми в изобретении кератиноцитами перфорированной матрицы-носителя из верифицированной гиалуроновой кислоты описано ниже в примере 3. В качестве подобной матрицыносителя используется продаваемый в Германии под названием "Laserskin" продукт фирмы Fidia Advanced Biopolymers Ltd., Абано-Терме, Италия. Особо высокая пригодность такого носителя для получения биологически активных повязок на раны с использованием кератиноцитов уже была подтверждена в экспериментах на животных (Lam и др.,1999), а также в исследованиях на людях (Harris и др., 1999). Наряду с обеспечением улучшенной миграции и дифференцировки эпителиальных клеток матрица из эфира гиалуроновой кислоты оказывает положительное влияние на развитие кровеносных сосудов (ангиогенез) и продуцирование коллагена. Однако применяемые в настоящее время повязки на раны с матрицей из эфира гиалуроновой кислоты покрыты аутологическими кератиноцитами и/или имеющими сложную структуру эквивалентными заменителями кожи на основе кератиноцитов и фибробластов. Тем самым таким повязкам на раны присущи рассмотренные выше при описании уровня техники недостатки. Устранить эти недостатки удается, прежде всего,за счет применения предлагаемых в изобретении препаратов выделенных аллогенных кератиноцитов. Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения предлагаемый в нем носитель содержит предлагаемые в изобретении кератиноциты в сочетании с резорбируемыми (рассасывающимися) полимерами, в качестве которых используются сложные полиэфиры, поликарбонаты,полиангидриды, сложные полиортоэфиры, полидепсипептиды, сложные эфиры простых полиэфиров,полиаминокислоты или полифосфазены, прежде всего поли-L-лактид, поли-D,L-лактид, сополимер Lлактида и D,L-лактида, полигликолид, сополимер L-лактида и гликолида, сополимер L-лактида и триметиленкарбоната или полидиоксанон. При этом указанные полимеры могут быть как перфорированными,так и неперфорированными. Настоящее изобретение относится также к способу криоконсервации предлагаемых в нем кератиноцитов путем их охлаждения до температуры от -20 до -196 С, предпочтительно до температуры-180 С. Для консервации указанных кератиноцитов путем их замораживания могут использоваться стандартные и известные специалистам методы. В качестве криозащитной среды можно использовать, в частности, ДМСО (диметилсульфоксид). Вместе с тем возможно также применение и других криозащитных сред, таких, например, как глицерин, гидроксиэтилкрахмал или обе эти криозащитные среды в сочетании между собой, а также в сочетании с ДМСО. Соответствующие методы описаны, например, вWO 96/24018, US 5891617 или же в US 5298417. Объектом настоящего изобретения является также способ криоконсервации покрытых предлагаемыми в изобретении кератиноцитами носителей, отличающийся тем, что кератиноциты с соответствующими носителями криоконсервируют путем их охлаждения до температуры от -20 до -196 С, предпочтительно от -60 до -80 С. Одно из основных преимуществ криоконсервации состоит в возможности сравнительно длительного хранения выпускаемой в больших объемах продукции и тем самым в возможности проверки на однородность ее качества перед ее медицинским применением по типу выборочного контроля. Создание же определенного запаса направляемой на хранение продукции в конечном итоге позволяет в короткий срок предоставить в распоряжение указанные повязки на раны для медицинских целей. В качестве криозащитной среды при криоконсервации предлагаемого в изобретении продукта можно использовать, например, гидроксиэтилкрахмал в концентрации от 7 до 13% мас./мас. Помимо этого в качестве криозащитной среды можно также использовать ДМСО или глицерин, а также комбинацию различных криозащитных сред, прежде всего гидроксиэтилкрахмала, ДМСО и/или глицерина. В качестве криозащитной среды возможно также применение трегалозы. При криоконсервации предлагаемый в изобретении продукт, состоящий из носителя и кератиноцитов, сначала охлаждают, быстро снижая температуру в течение 2-5 мин с 37 С до температуры от -5 до 10 С, предпочтительно от -6 до -8 С, а затем выдерживают при этой температуре в течение 15-30 мин,предпочтительно 23-26 мин, давая ему прийти в равновесное состояние. После этого продукт охлаждают до температуры, например, от -60 до -80 С, понижая температуру со скоростью менее 1 С/мин, предпочтительно со скоростью от 0,2 до 0,6 С/мин, наиболее предпочтительно со скоростью 0,4 С/мин. Один из возможных процессов криоконсервации покрытой клетками KC-BI-1 матрицы-носителя из эфира гиалуроновой кислоты описан ниже в примере 4. Однако для криоконсервации можно использовать и иные методы, например описанные в WO 95/07611, WO 96/24018, ЕР 0296475, при этом перечень возможных методов криоконсервации продуктов, состоящих из биосовместимых носителей и кератиноцитов, не исчерпывается описанными в этих публикациях, а лишь указывает на известность подобных методов из существующего уровня техники.-4 009073 Представленные в настоящем изобретении препарат выделенных кератиноцитов и/или носитель можно применять для лечения ран. В одном из вариантов осуществления изобретения предлагаемые в нем препарат выделенных кератиноцитов и/или носитель, покрытый кератиноцитами, применяют для лечения ожогов и/или язв. В случае ожогов, для лечения которых могут использоваться предлагаемые в изобретении препарат выделенных кератиноцитов и/или носитель, покрытый кератиноцитами, речь предпочтительно идет об ожогах второй степени, а в случае язв - предпочтительно о перешедших в хроническую форму, плохо заживающих язвах голени типа Ulcus cruris, предпочтительно Ulcus cruris venosum, или же об обусловленных диабетом язвах, а также о пролежнях. Применение в медицине указанных выше продуктов выделенных кератиноцитов и/или носителей,покрытых кератиноцитов, предполагает их комбинированное и/или дополняющее применение классическими, известными специалистам терапевтическими методами лечения, оказывающими положительное действие на процесс заживления ран. При этом имеется в виду применение предлагаемых в изобретении продукта выделенных кератиноцитов и/или носителя в дополнение к применению или в сочетании с применением одного или нескольких других материалов, оказывающих положительное действие на процесс заживления ран. В качестве примера при этом можно назвать применение предлагаемых в изобретении продукта выделенных кератиноцитов и/или носителя для лечения Ulcus cruris venosum в дополнение и/или в сочетании с гидроколлоидными перевязочными материалами и/или в дополнение к применению противомикробных веществ, например в дополнение к приему антибиотиков. Предлагаемые в настоящем изобретении продукт выделенных кератиноцитов и/или биосовместимый носитель с указанными кератиноцитами можно использовать для получения медицинского изделия,предназначенного для лечения ран, прежде всего для лечения ожогов и/или язв, например для лечения ожогов второй степени, Ulcus cruris (venosum), обусловленных диабетом язв или пролежней. Итак, объектом данного изобретения является также способ лечения указанных выше ран, отличающийся тем, что предлагаемые в изобретении препарат кератиноцитов и/или носитель, покрытый кератиноцитами, накладывают на залечиваемые раны. Указанные продукт и носитель можно при этом использовать либо сразу после их получения, либо после их криоконсервации. Соответствующий способ лечения ран описан в примере 5. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана зависимость удвоения количества кератиноцитов KC-BI-1 от длительности их культивирования. При этом на графике показано число удвоений кератиноцитов KC-BI-1 (КУП, кумулятивное удвоение популяции) в зависимости от длительности культивирования, равной 94 дням. Во время наблюдений в течение 94 дней количество клеток удваивалось примерно 75 раз. Эта величина соответствует средней продолжительности удвоения количества клеток, равной 1,25 дня из расчета на однократное удвоение количества клеток, или 12,5 дня из расчета на 10-кратное удвоение количества клеток. На фиг. 2 показана диаграмма, отражающая удвоение количества кератиноцитов KC-BI-1 за 10 месяцев. При этом удвоение количества кератиноцитов KC-BI-1 за 10 месяцев представлено в виде числа удвоений популяции (УП) при пассировании культуры клеток с 1- по 67-й раз. На фиг. 3 в табличном виде представлены результаты определения относительной теломеразной активности. При этом приведены данные об относительной теломеразной активности для кератиноцитовKC-BI-1 после 1-, 12-, 18-, 40- и 57-го пассирования в сравнении с активностью клеток линии HeLa. Из приведенных в этой таблице данных следует, что у кератиноцитов KC-BI-1 почти не наблюдается,соответственно наблюдается лишь незначительная теломеразная активность по сравнению с иммортализованными клетками линии HeLa. На фиг. 4 показана морфология кератиноцитов KC-BI-1 после 5- и 60-го пассирования. На полученных с помощью оптического микроскопа изображениях видно, что у кератиноцитов KC-BI-1 отсутствуют какие-либо морфологические различия между клетками, полученными при 5-м пассировании (длительность культивирования составляет 25 дней), и клетками, полученными при 60-м пассировании (длительность культивирования составляет 300 дней). Примеры осуществления изобретения Пример 1. Способ культивирования предлагаемых в изобретении кератиноцитов на примере клеток из культуры KC-BI-1 (DSM ACC2514). 1. Материал. Кератиноциты KC-BI-1, облученные мышиные фибробласты 3T3 (подкармливающие клетки, получаемые в соответствии с описанным в примере 2 методом), культуральная среда K/1 (состав указан ниже), ЭДТК (0,02%), трипсин/ЭДТК (0,05%/0,01%), чашки для культивирования клеток (чашки для культивирования тканевых культур, сокращенно называемые Т-чашками) площадью 25, 80 и 175 см 2.-5 009073 2. Размораживание клеток. 2.1. Размораживание подкармливающих клеток. Клетки медленно размораживают и переносят в 5-10 мл подогретой среды K/1. Соответствующее количество подкармливающих клеток переносят в чашки для культивирования и добавляют среду K/1: Т-чашка площадью 25 см 2 0,5106 клеток конечный объем среды 5-6 мл Т-чашка площадью 80 см 2 1,5106 клеток конечный объем среды 20 мл Т-чашка площадью 175 см 2 3,5106 клеток конечный объем среды 50 мл Подкармливающие клетки можно использовать сразу же либо в течение 24 ч после размораживания. 2.2. Размораживание кератиноцитов. Клетки медленно размораживают и переносят в 5-10 мл подогретой среды K/1. Соответствующее количество клеток переносят в чашки для культивирования с предварительно помещенными в них подкармливающими клетками и заполняют свежей средой: конечный объем среды 6-10 мл Т-чашка площадью 25 см 2 0,15106 клеток 2 конечный объем среды 20 мл Т-чашка площадью 80 см 0,4106 клеток конечный объем среды 50 мл Т-чашка площадью 175 см 2 1,0106 клеток 3. Культивирование. Клетки инкубируют при 35-39 С, предпочтительно при 37 С. Клетки инкубируют в атмосфере с влажностью воздуха, составляющей более 90, предпочтительно 95%, и с концентрацией CO2, равной 5-9%. Кератиноциты субкультивируют при максимальной степени слияния, равной 80%. С этой целью надосадочную жидкость клеточной культуры отбрасывают. Подкармливающие клетки после двукратной промывки 0,02% ЭДТК (2-10 мл) и инкубации в течение 5-10 мин при 37 С отделяют путем последующего постукивания (или путем встряхивания) от чашек для культивирования. Затем после обработки кератиноцитов трипсином/ЭДТК (0,05%/0,01%, 1-6 мл) в течение 5-10 мин при 37 С их осторожно отделяют путем постукивания. При необходимости оставшиеся клетки осторожно отделяют с помощью соответствующего скребка. Раствор трипсина/ЭДТК нейтрализуют добавлением среды K/1 и клетки осторожно разделяют с помощью пипетки. Клетки высевают в количествах, указанных выше в п.2.2. Культуральную среду K/1 заменяют на свежую на 3-й день, а затем каждые два дня. 4. Приготовление среды K/1. Все компоненты, а также исходные растворы последовательно добавляют в порядке, указанном в табл. 1. Объем смеси доводят до 1 л добавлением воды для инъекций (ВДИ). После этого значение рН устанавливают на 7,0-7,2 с помощью NaOH или НСl. Осмотическое давление должно составлять от 320 до 400 мосмолей/кг. В завершение среду K/1 стерилизуют фильтрацией. 4.1. Приготовление исходных растворов. Трииодотиронин. 13,6 мг трииодотиронина растворяют в 1 мл 0,1-молярного NaOH и добавляют 99 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (ЗФР). Готовый к применению раствор разбавляют ЗФР в пропорции 1:100. На 1 л среды необходимо использовать 1 мл этого раствора.EGF-фактор. 1 мг EGF-фактора растворяют в 100 мл ВДИ. На 1 л среды необходимо использовать 1 мл этого раствора.rh-Инсулин (только растворимый при рН менее 4,0). 5 г rh-инсулина добавляют в 0,9 л ВДИ и значение рН устанавливают на 2,5 с помощью 6-молярнойHCl. После растворения rh-инсулина значение рН устанавливают на 8,0 с помощью 1-молярного NaOH. Объем смеси доводят до 1 л добавлением ВДИ. На литр среды необходимо использовать 1 мл этого раствора. В другом варианте культивировать клетки можно также исходя из свежего биоптата, например исходя из материала, взятого из эпидермальных участков крайней плоти. Для первичного выделения недифференцированных пролиферирующих кератиноцитов можно использовать метод, описанный Rheinwald и Green, 1975. В качестве подкармливающих клеток можно использовать описанные в примере 2 клетки. Помимо этого можно использовать также иные, погибшие фибробласты, предпочтительно иные мышиные фибробласты, наиболее предпочтительно клетки, являющиеся производными клеток линии 3T3. Пример 2. Получение облученных питающих клеток 3T3 для культивирования кератиноцитов. 1. Материал. Мышиные фибробласты 3T3 (например АТСС CCL 92, контактно-ингибированные фибробласты 3T3 мышей альбиносов линии Swiss), получаемые из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection (АТСС), 10801 University Boulevar, Manassas, VA, USA), модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM-среда) плюс 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС), ЗФР,0,2% раствор трипсина, 0,04% раствор ЭДТК, чашки для культивирования (Т-чашки) площадью 25, 80 и 175 см 2. 2. Размораживание клеток. Клетки медленно размораживают и переносят в 5-10 мл подогретой среды. Содержащую ДМСО среду удаляют после центрифугирования. Клетки суспендируют в 5-10 мл среды. После определения количества клеток их высевают в соответствующие чашки для культивирования с плотностью 103-104 клеток/см 2. Клетки инкубируют при 35-39 С, предпочтительно при 37 С. Инкубацию проводят в атмосфере с влажностью воздуха, составляющей более 90, предпочтительно 95%, и с концентрациейCO2, равной 5-9%. 3. Культивирование клеток. Клетки ежедневно исследуют на предмет их роста. Плотность клеток не должна превышать максимальную степень их слияния, равную 70-80%. Субкультивирование осуществляют исходя из собственного опыта каждые 2-4 дня. С этой целью среду отбрасывают, а клетки промывают определенным количеством смеси ЭДТК и трипсина (0,5-5 мл) в соотношении 1:2. Затем отделившиеся клетки переносят в 3,5-20 мл среды. Клетки повторно высевают с плотностью 103-104 клеток/см 2. 4. Облучение подкармливающих клеток. Доза облучения подкармливающих клеток составляет примерно 60 Гр (6000 рад в источнике 137Cs). Облученные, равно как и необлученные клетки можно криоконсервировать в жидком азоте в соответствии со стандартными процедурами и хранить в таком виде в течение длительного периода времени. Пример 3. Способ покрытия матрицы-носителя, в данном случае материала Laserskin, кератиноцитами из культуры KC-BI-1 (DSM АСС 2514). Ниже в качестве примера рассмотрен один из возможных вариантов получения предлагаемой в изобретении биологически активной повязки на рану. Описанная в этом примере повязка на рану состоит из предлагаемых в изобретении кератиноцитов KC-BI-1 и материала Laserskin, представляющего собой биорезорбируемую матрицу-носитель из эфира гиалуроновой кислоты. При этом следует отметить, что изобретение не ограничено применением рассмотренной в этом примере комбинации кератиноцитов и носителя. Более того, для покрытия носителя могут использоваться все те кератиноциты, которые обладают указанными в пп.1-8 формулы изобретения свойствами.-7 009073 Помимо этого в качестве носителя могут использоваться и иные приемлемые матрицы-носители, но при условии, что они изготовлены из биосовместимого материала, допускающего возможность его применения для получения соответствующего лекарственного средства. В качестве такого носителя можно использовать, например, гидрофобные биосовместимые материалы, описанные, в частности,в WO 91/13638. Вместе с тем в качестве носителя можно использовать и материалы, обладающие преимущественно гидрофильными свойствами. Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения предусмотрено применение кератиноцитов в сочетании с резорбируемыми полимерами, в качестве которых используются сложные полиэфиры, поликарбонаты, полиангидриды, сложные полиортоэфиры, полидепсипептиды,сложные эфиры простых полиэфиров, полиаминокислоты или полифосфазены, прежде всего поли-L-лактид, поли-D,L-лактид, сополимер L-лактида и D,L-лактида, полигликолид, сополимерL-лактида и гликолида, сополимер L-лактида и триметиленкарбоната или полидиоксанон, а также применение перфорированных пленок из указанных полимеров. 1. Материал. Среда K/1 (см. пример 1), ЗФР, 0,04% ЭДТК (разбавляют с помощью ЗФР до концентрации, равной 0,02%), трипсин/ЭДТК (0,05%/0,01%), стерильные чашки Ру (Т-чашки площадью 25, 80 и 175 см 2), материал Laserskin (фирма Fidia Advanced Biopolymers srl, Абано-Терме, Италия) в 14421 клетках/чашку Петри (площадью 145 см 2), подкармливающие клетки 3T3, предлагаемые в изобретении кератиноциты,например KC-BI-1. 2. Культивирование клеток для получения биологически активной повязки на рану. 2.1. Материал. Облученные подкармливающие клетки, например указанные в примере 2 мышиные фибробласты 3T3, предлагаемые в изобретении кератиноциты из исходного места их хранения, куски материалаLaserskin размером 8,58,5 см в чашке Петри (готовый продукт), среда K/2. 2.2. Посев подкармливающих клеток 3T3. Подкармливающие клетки, полученные согласно примеру 2, наносят на материал Laserskin, высевая их с плотностью примерно от 15000 до 25000 клеток/см 2 (соответствует примерно 310 клеток/чашку Петри). Затем клетки в чашке Петри инкубируют в термостате при 35-37 С в атмосфере с влажностью воздуха, составляющей более 90%, и с содержанием CO2, равным 5-11%, предпочтительно 7-9%. Кератиноциты высевают на слой подкармливающих клеток либо в этот же день, либо самое позднее на следующий день (через 24 ч). 2.3. Посев и культивирование кератиноцитов. С использованием предлагаемых в изобретении кератиноцитов изготавливают биологически активные повязки на раны. Субкультивирование кератиноцитов можно проводить, например, по описанной ниже методике. Субслившиеся культуры однократно промывают 0,02% ЭДТК (в количестве 8 мл для культур, находящихся в чашке Ру площадью 80 см 2, и 10 мл для культур, находящихся в чашке Ру площадью 175 см 2). После этого подкармливающие клетки в течение 5-10 мин инкубируют при 37 С с 0,02% ЭДТК(используя 8 мл при инкубации клеток в чашке Ру площадью 80 см 2 и 10 мл при инкубации клеток в чашке Ру площадью 175 см 2) и затем отделяют путем осторожного встряхивания. Кератиноциты в соответствии с примером 1 разбавляют смесью трипсин/ЭДТК (0,05%/0,01%) в количестве 2-3 мл для кератиноцитов, находящихся в чашке Ру площадью 80 см 2, и 5-6 мл для кератиноцитов, находящихся в чашке Ру площадью 175 см 2, после чего к ним добавляют культуральную среду (в количестве 7-8 мл для кератиноцитов, находящихся в чашке Ру площадью 80 см 2, и 14-15 мл для кератиноцитов, находящихся в чашке Ру площадью 175 см 2) и осторожно разделяют с помощью пипетки. На подготовленную пленку из материала Laserskin с подкармливающими клетками наносят предлагаемые в изобретении кератиноциты, высевая их с плотностью примерно от 15000 до 25000 клеток/см 2(соответствует примерно 310 клеток/чашку Петри). После этого клетки инкубируют при 35-39 С, предпочтительно при 37 С до степени их слияния, равной 30-100%, предпочтительно 80-100%. Инкубацию проводят в атмосфере с влажностью воздуха, составляющей более 90, предпочтительно 95%, и с концентрацией CO2 5-9%. Пример 4. Способ криоконсервации предлагаемой в изобретении биологически активной повязки на рану. После образования на матрице-носителе покрытия из выросших на ней кератиноцитов со степенью их слияния, составляющей 30-100%, предпочтительно 80-100%, предлагаемый в изобретении продукт можно замораживать в контролируемых условиях в приемлемой упаковке, например в запечатываемых сваркой полипропиленовых пакетах. С этой целью осторожно удаляют культуральную среду и заменяют ее на 20 мл охлажденной до 2-6 С среды для замораживания K/2. После этого продукт упаковывают в стерильных условиях и замораживают по следующей схеме.-8 009073 Сначала продукт охлаждают, быстро снижая температуру в течение 2-5 мин до температуры от -5 до -10 С, предпочтительно от -6 до -8 С, а затем выдерживают при этой температуре в течение 15-30 мин, предпочтительно 23-25 мин, давая ему прийти в равновесное состояние. После этого продукт охлаждают до температуры, например, от -60 до -80 С, понижая температуру со скоростью менее 1 С/мин, предпочтительно со скоростью от 0,2 до 0,6 С/мин, наиболее предпочтительно со скоростью 0,4 С/мин. Замороженный продукт хранят при температуре от -60 до -80 С. Среда для замораживания K/2. В качестве среды для замораживания используют питательную среду K/1 (см. пример 1) с добавлением к ней 7-13 мас.% гидроксиэтилкрахмала. Пример 5. Пример применения покрытой выросшими на ней предлагаемыми в изобретении кератиноцитами матрицы-носителя для закрытия ран на примере Ulcus cruris venosum. 1. Транспортировка повязок на раны сразу же после их получения. После образования на материале Laserskin покрытия из выросших на нем кератиноцитов со степенью их слияния, составляющей 30-100%, предпочтительно 80-100%, культуру одно-, соответственно,многократно промывают определенным количеством, предпочтительно 30 мл, среды для транспортировки K/3. Биологически активную повязку на рану транспортируют в определенном количестве, предпочтительно в 20 мл, среды для транспортировки K/3. Верхнее пространство чашки Петри кратковременно продувают воздухом с 5-10% содержанием СO2, укупоривают клейкой лентой, например парафильмом, и сразу же отправляют в клинику в транспортировочном контейнере. Среда для транспортировки K/3. В качестве среды для транспортировки используют питательную среду K/1 (см. пример 1) без фетальной телячьей сыворотки (ФТС). В принципе в качестве среды для транспортировки можно использовать также простые физиологические растворы, например, на основе фосфата-бората, в частности ЗФР, или же на основе HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота) или MES([2-N-морфолино]этансульфоновая кислота). 2. Транспортировка криоконсервированных повязок на раны. Криоконсервированные повязки на раны обычно можно поставлять в клиники с охлаждением сухим льдом. Вместе с тем для транспортировки повязок на раны могут использоваться и иные средства при условии, что они при транспортировке повязок на раны обеспечивают поддержание их температуры ниже -60 С. При подготовке к применению криоконсервированные повязки на раны медленно размораживают. После этого удаляют среду для замораживания и повязку одно- или многократно промывают средой для транспортировки K/3 (см. выше) или иным пригодным для этой цели физиологическим раствором, например раствором Рингера. 3. Терапевтическое применение. После выполнения описанных выше операций повязку накладывают на рану. При применении в качестве носителя неперфорированных материалов повязку необходимо накладывать на рану той ее стороной, на которой находятся клетки. При применении перфорированных носителей, допускающих возможность двустороннего их покрытия выращиваемыми на них кератиноцитами (например, при применении материала Laserskin), предлагаемую в изобретении повязку можно накладывать на залечиваемую рану любой ее стороной. В зависимости от терапевтического эффекта лечение раны с использованием указанной выше повязки можно повторять многократно. Пример 6. Определение генетических характеристик кератиноцитов KC-BI-1 (DSM ACC2514). Клетки KC-BI-1 субкультивировали описанным выше предлагаемым в изобретении способом в несколько стадий пассирования (пассажей). Клетки, полученные при 4-, 13- 121-м пассировании, затем подвергали генетическому анализу, исследуя полиморфизм длины 15 различных локусов (CSF1PO,D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, FGA, Penta D, Penta E, TH01,ТРОХ и vWA). Анализ проводили по известному из уровня техники методу. С этой целью соответствующие аллели амплифицировали с использованием тест-набора для определения отцовства (системаPowerPlex 16) фирмы Promega (Маннгейм, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Аллели можно идентифицировать определением длины фрагментов (стандарт длины ILS 600 является компонентом указанного выше набора). Данные о частотах аллелей в популяции выбираются из соответствующих таблиц. По результатам анализа для клеток из всех проанализированных стадий их пассирования было выявлено совпадение длин у всех аллелей во всех локусах. Тем самым полученные данные позволяют отнести проанализированные клетки на основе их генетических характеристик к клеткам KC-BI-1. Вероятность такого соответствия проанализированных клеток клеткам KC-BI-1, определенная на основе частот аллелей, составила более 99,999%.-9 009073 Определение полиморфизма длины ДНКdressings in healing chronic venous ulcers, Journal of the American Academy of Dermatology, 29/6, 1993,pp. 982-988. 18. Wagner G., Horch R., Debus M., Tanczos E., Jiao X.J., Saied S., Stark G.B. Human keratinocytes cultured subconfluent on esterified hyaluronic acid membranes for resurface full thickness nude mice wounds,European Journal of Cell Biology, 74, 47, 1997, p 61. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Препарат выделенных кератиноцитов человека, которые представляют собой клетки культурыKC-BI-1 (DSM АСС 2514) или производные данных клеток, являются не иммортализованными и могут реплицироваться по меньшей мере 150 раз при выращивании in vitro. 2. Препарат по п.1, где репликация кератиноцитов не возможна: а) в отсутствие фетальной телячьей сыворотки, и/или б) в отсутствие подкармливающих клеток, и/или в) в отсутствие эпидермального фактора роста (EGF-фактора). 3. Препарат выделенных кератиноцитов по п.1, которые обладают незначительной теломеразной активностью или вообще не обладают ею. 4. Препарат выделенных кератиноцитов по п.1, которые могут реплицироваться по меньшей мере 200 раз при выращивании методом культивирования клеток in vitro. 5. Препарат выделенных кератиноцитов по п.1, которые могут реплицироваться по меньшей мере 250 раз при выращивании методом культивирования клеток in vitro. 6. Препарат выделенных кератиноцитов по п.1, которые могут реплицироваться по меньшей мере 300 раз при выращивании методом культивирования клеток in vitro. 7. Носитель, по меньшей мере частично покрытый выросшими на нем кератиноцитами, охарактеризованными в п.1. 8. Носитель по п.7, представляющий собой биосовместимый материал, который может применяться для получения фармацевтической композиции. 9. Носитель по п.8, представляющий собой гидрофобную или гидрофильную биологически разлагаемую мембрану. 10. Носитель по п.8, представляющий собой полимер из этерифицированной гиалуроновой кислоты, где полимерная пленка имеет толщину от 10 до 500 мкм и перфорирована отверстиями размером от 10 до 1000 мкм, при этом перфорированные отверстия имеют определенный и постоянный размер и расположены в виде упорядоченного ряда с постоянным шагом между ними, составляющим от 50 до 1000 мкм. 11. Носитель по п.8, представляющий собой сложный полиэфир, поликарбонат, полиангидрид,сложный полиортоэфир, полидепсидил пептид, простой и сложный полиэфир, полиаминокислоту или полифосфазен, причем указанный полимер является перфорированным или неперфорированным. 12. Способ криоконсервации препарата по п.1, заключающийся в том, что препарат криоконсервируют путем его охлаждения до температуры от -20 до -196 С. 13. Способ криоконсервации носителя по п.7, заключающийся в том, что его криоконсервируют путем охлаждения до температуры от - 20 до -196 С. 14. Препарат по п.1, отличающийся тем, что он получен путем криоконсервирования при охлаждении до температуры от - 20 до -196 С. 15. Носитель по п.8, отличающийся тем, что он получен путем криоконсервирования при охлаждении до температуры от - 20 до -196 С. 16. Способ лечения ран, включающий нанесение на раны носителя по п.8. 17. Способ по п.16, при котором ранами являются ожоги или язвы. 18. Способ по п.17, при котором ранами являются ожоги, которые представляют собой ожоги второй степени. 19. Способ по п.17, при котором ранами являются язвы и эти язвы являются перешедшими в хроническую форму, плохо заживающими язвами голени типа Ulcus cruris. 20. Способ по п.17, при котором ранами являются язвы, которые обусловлены диабетом. 21. Способ по п.17, при котором ранами предпочтительно являются язвы и этими язвами являются пролежни. Удвоение количества кератиноцитов KC-BI-1 в зависимости от длительности их культивирования Фиг. 1 Удвоение количества кератиноцитов KC-BI-1 за 67 стадий пассирования Фиг. 2 Определение относительной теломеразной активности