Антитела против рецептора интерферона-альфа/бета

1 Область изобретения Настоящее изобретение относится к антителам против лиганд-связывающего компонента рецептора интерферона-/, которые способны избирательно модулировать активность различных интерферонов I типа. В публикации ЕР 588177 описан растворимый рецептор IFN-, обладающий молекулярной массой приблизительно 40000, который был идентифицирован путем поперечного сшивания с 125I-IFN-2 и иммунопреципитации с анти-IFN- моноклональными антителами. Будучи получено из сыворотки, данное вещество обладало молекулярной массой 50 кДа. В ней также описан указанный выше IFN-связывающий белок массой 40000 Да (здесь далее "IFNAB-BP" или "IFNAB-BPII), полученный из мочи в гомогенном состоянии и обладающий последовательностью, которая отлична от таковой любого другого известного белка. IFNABBP связывается с и блокирует активность множества подтипов IFN-, равно как и IFN-. В публикации ЕР 676413 описаны клонирование и секвенирование двух молекул кДНК, кодирующих предшественники IFNABBP. Обе молекулы, возможно, являются продуктами одного гена, например, в результате альтернативного сплайсинга. Также описана продукция двух рекомбинантных белков, обозначаемых как IFNAB-BPI и IFNAB-BPII, в клетках млекопитающих и других организмов-хозяев. Также описаны поликлональные и моноклональные антитела против IFNAB-BP и применимые для блокирования рецептора IFN для иммунологических анализов и иммунологической очистки IFNAB-BPI и IFNAB-BPII. В настоящем изобретении описаны две группы нейтрализующих антител, индуцированных против IFNAB-BPII, которые связываются с рецептором интерферона I типа на человеческих клетках. Антитела одной группы способны блокировать активность различных подтипов интерферона- в человеческих клетках без влияния на активность интерферона-. Таким образом, указанные антитела одной группы способны ингибировать нежелательные эффекты IFN- при очень небольшом воздействии на активность IFN-. Предпосылки изобретения Интерфероны I типа (IFN) (IFN-, IFN- иIFN-) составляют семейство структурно родственных цитокинов, обычно определяемых по их способности обеспечивать сопротивляемость вирусным инфекциям. Сообщалось о множестве других биологических активностей IFN I типа,включая ингибирование клеточной пролиферации, индукции антигенов МНС I класса и некоторые другие иммунорегуляторные активности(1). IFN- и IFN- являются применимыми для лечения некоторых вирусных заболеваний,включая гепатит С (2, 3) и обыкновенных боро 002543 2 давок (4, 5), равно как и определенных злокачественных опухолей, таких как лейкозный ретикулоэндотелиоз (6), хронический миелолейкозIFN- определяли в образцах сыворотки различных пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями, такими как системная красная волчанка (9), равно как и пациентов,страдающих ВИЧ-инфекцией (10). IFN- вовлечен в процесс развития юношеского диабета(11). Далее, было показано, что в некоторых случаях терапия при помощи IFN- приводит к нежелательным побочным эффектам, включая лихорадку и неврологические расстройства (12). Следовательно, существуют патологические состояния, при которых нейтрализация активности IFN- может являться желательной для пациента. Как и в случае других цитокинов, IFNоказывает свои биологические эффекты посредством связывания с рецептором на поверхности клетки, который является специфичным для всех подтипов IFN-, равно как и IFN- (13). Человеческий рецептор IFN- (IFNAR) идентифицировали и клонировали на клетках Daudi(14). Клонированный рецептор состоит из одного трансмембранного домена, внеклеточного и внутриклеточного доменов. Будучи экспрессирован на мышиных клетках, данный рецептор определяет реактивность по отношению к человеческому IFN-B, но незначительно определяет реактивность по отношению к другим видамIFN- и IFN-, указывая на то, что в формирование ответа на IFN- и на различные виды IFN могут быть вовлечены дополнительные компоненты. Некоторые другие исследования указывают на то, что в процесс связывания IFN- и IFN вовлечены дополнительные компоненты или субъединицы рецептора (15-17). Однако, сообщалось, что в процесс связывания всех видовIFN- и IFN- (18) вовлечен ранее описанный рецептор (14). Действительно, недавно был идентифицирован и клонирован второй рецепторный компонент, так называемый рецепторIFN-/ (публикация ЕР 676413 и ссылка 19). Авторами настоящей заявки было продемонстрировано, что рецептор IFN-/, внеклеточный домен которого обладает той же последовательностью, что и IFNAB-BPI, представляет собой основной лиганд-связывающий компонент рецептора интерферона I типа. Более того, рецептор интерферона-/ и IFNAR проявляют кооперативность связывания лиганда и образуют тройной комплекс с интерферонами I типа на клеточной поверхности (20). Моноклональные антитела, направленные против IFNAR и способные блокировать активность интерферонов I типа неизбирательным образом были описаны ранее (21). Было описано другое моноклональное антитело против не 3 идентифицированного рецеторного компонента. Данное антитело блокировало активность интерферонов I типа неизбирательным образом(22). Суть изобретения Настоящее изобретение обеспечивает моноклональные антитела против рецептора IFN/, который представляет собой обычный рецептор IFN- и IFN-. Данные антитела связываются с некоторыми формами рецептора, которые либо экспрессируются на человеческих клетках, либо существуют в виде растворимых форм IFNAB-BPI и IFNAB-BPII. Были выработаны два типа нейтрализующих моноклональных антител. Высокий титр антител одного типа наблюдается при применении для блокирования противовирусной активности как IFN-, так иIFN-. Высокий блокирующий титр антител второго типа неожиданно наблюдается только в связи с противовирусной активностью IFNпри очень низком титре, связанном с активностью IFN-. Таким образом, неожиданный второй тип моноклональных антител может быть применен в определенном интервале концентраций для избирательного блокирования активности IFN-, тогда как активность IFNизменяться не будет. Настоящее изобретение также обеспечивает гуманизированные моноклональные антитела против рецептора IFN-/, экспрессированного на человеческих клетках, IFNAB-BPI и IFNABBPII. Гуманизированные моноклональные антитела представляют собой гибридные молекулы мышиных и человеческих антител, в которых вариабельные домены происходят из мышиных антител, тогда как постоянные домены происходят из человеческих антител. Настоящее изобретение также обеспечивает молекулы ДНК, кодирующие моноклональные антитела и гуманизированные моноклональные антитела против рецептора IFN-/,IFNAB-BPI и IFNFB-BPII. Данное изобретение далее обеспечивает реплицируемые экспрессирующие векторы, содержащие указанные молекулы ДНК, трансформированные ими организмы-хозяева и белки, продуцируемые такими трансформированными организмами-хозяевами. Термин "молекулы ДНК" включает в себя геномную ДНК,кДНК, синтетическую ДНК и их комбинации. Данное изобретение также относится к молекулам ДНК, которые гибридизуются в строго определенных условиях с указанными выше молекулами ДНК и кодируют последовательность белков, обладающих такой же биологической активностью, что и моноклональные антитела и гуманизированные моноклональные антитела против рецептора IFN-/, IFNAB-BPI иIFNAB-BPII. Настоящее изобретение также обеспечивает способы получения клеток-хозяев, способных 4 продуцировать функциональные моноклональные антитела и гуманизированные моноклональные антитела против рецептора IFN-/,IFNAB-BPI и IFNAB-BPII. Моноклональные антитела по настоящему изобретению ингибируют биологическую активность человеческого интерферона- в человеческих клетках без воздействия на биологическую активность человеческого интерферона-. Биологическую активность определяли путем количественной оценки ингибирующего эффекта антитела при тестировании методом анализа ингибирования цитопатического эффекта с применением человеческих клеток WISH и вируса везикулярного стоматита. Подробное описание изобретения В соответствии с заявкой на патент Израиля 106591, IFN-/-связывающий белок, обладающий молекулярной массой 40000 кДа,(IFNAB-BP) выделяли из обычной мочи в две хроматографические стадии. Неочищенные белки мочи наносили на колонку, состоящую изIFN-2, пришитого к агарозе. Колонку промывали в целях удаления неинтересующих белков,а связанные белки затем смывали при низких значениях рН. Смытые белки затем разрешали с помощью ЖХВР с разделением по размеру(размероспецифичной ЖХВР) с выходом нескольких белковых фракций, одна из которых характеризовалась своей способностью специфично взаимодействовать с 125I-IFN-2 и блокировать противовирусную активность IFN- иIFN-. Данный белок был далее охарактеризован с помощью анализа N-концевой микропоследовательности. Полученную последовательность сравнили и нашли отличной от таковой известного рецептора IFNAR (14). Она также отличалась от таковой любого другого известного белка, и она не кодировалась ни одной из известных последовательностей ДНК, что определяли путем ее сравнения с вводами банков данных Swissprot и Genebank с применением программы FastA (23). Гомогенные препараты IFNAB-BP, выделенного из мочи, применяли в качестве иммуногена для получения антител. Подразумевается, что термин "антитело" включает в себя поликлональные антитела, моноклональные антитела (MAT), химерные антитела, антиидиотипические (анти-Id) антитела к антителам, которые могут быть помечены в растворимой или связанной формах, равно как и их активные участки, полученные в соответствии с любой известной методикой, такой как, но не ограничиваясь, ферментативное расщепление,пептидный синтез или рекомбинантные методики. Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, полученные из сыворотки животных, иммунизированных антигеном. МоноклональноеMAT могут быть получены в соответствии с методиками, известными специалистам в данной области. Смотри, например, Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Патент США 4376110; Ausubel et al., eds., Current Protocols inPublishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y.,(1992-1996), причем содержание данных ссылок приводится здесь целиком в качестве ссылки. Такие антитела могут являться иммуноглобулинами любого класса, включая IgG, IgM, IgE,IgA, GILD и любой их подкласс. Гибридома,продуцирующая MAT по настоящему изобретению, может быть выращена in vitro, in situ или invivo. Продукция более высоких титров MAT invivo или in situ делает данные методики предпочтительным в настоящее время способом продукции. Химерные антитела представляют собой молекулы, различные части которых происходят от животных разных видов, как, например, молекулы, содержащие вариабельный участок,происходящий из мышиного MAT, и постоянный участок человеческого иммуноглобулина. Химерные антитела исходно применяли для снижения иммуногенности в применении и для повышения объема продукции, например, если мышиные MAT продуцируются гибридомами с более высоким выходом, но с более высокой иммуногенностью у людей, такие как человеческие/мышиные, применяют химерные МАТ. Химерные антитела и способы их продукции известны в данной области (Cabilly et al., Proc.(1984); Cabilly et al., заявка на Европейский патент 125023 (опубликованная 14 ноября 1984 года); Neuberger et al., Nature 314:268-270(1985); Taniguchi et al., заявка на Европейский патент 171496 (опубликованная 19 февраля 1985 года); Morrison et al., заявка на Европейский патент 173494 (опубликованная 5 марта 1986 г.);Neuberger et al., заявка по РСТ WO 8601533(опубликованная 13 марта 1986 г.); Kudo et al.,заявка на Европейский патент 184187 (опубликованная 11 июня 1986 г.); Morrison et al., заявка на Европейский патент 173494 (опубликованная 5 марта 1986 г.); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson et al., публикация Международного патента, WO 9702671Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, supra). Данные ссылки включены сюда целиком в качестве ссылки. Антиидиотипическое (анти-Id) антитело представляет собой антитело, которое распознает специфичные детерминанты, как правило,ассоциированные с антигенсвязывающим сайтом антитела. Анти-Id антитело может быть получено путем иммунизации животного одинакового вида и генотипа как источника MAT (например, линии мышей) MAT, на которое получают анти-Id. В организме иммунизированного животного будут происходить распознавание и ответ на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела в виде выработки антител на данные идиотипические детерминанты(анти-Id антитело). См., например, патент США 4699880, который включен здесь целиком в качестве ссылки. Анти-Id антитело может быть также применено в качестве "иммуногена" для индукции иммунного ответа еще в одном животном с получением так называемого анти-анти-Id антитела. Анти-Id антитело может обладать идентичными эпитопами с исходным MAT, которое индуцировало выработку анти-Id. Таким образом,с помощью применения антител к идиотипическим детерминантам MAT можно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности. Соответственно, MAT, выработанные против IFNAB-BPI, IFNAB-BPII и родственных белков по настоящему изобретению, могут быть применены для индукции анти-Id антител в подходящих животных, таких как мышиBALB/c. Спленоциты таких иммунизированных мышей применяют для создания анти-Id гибридом, секретирующих анти-Id МАТ. Далее, антиId MAT могут быть прикреплены к носителю,такому как гемоцианин keyhole limpet (KLH), и применены для иммунизации дополнительных мышей BALB/c. Сыворотка данных мышей будет содержать анти-Id антитела, которые обладают параметрами связывания исходных MAT,специфичных к IFNAB-BPI или IFNAB-BPII. Таким образом, анти-Id MAT содержат собственные идиотипические эпитопы, или"идиотопы", структурно сходные с эпитопом,подвергающимся оценке, таким как IFNAB-BPI или IFNAB-BPII. Также подразумевается, что термин "антитело" включает как интактные молекулы, так и их активные участки, такие как, например, Fab иF(ab')2, которые способны связывать антиген.Fab- и F(ab')2-фрагменты не содержат Fcфрагмента интактного антитела, быстрее выводятся из циркуляции и могут в меньшем объеме осуществлять неспецифическое связывание с тканями по сравнению с интактным антителом 7 Было бы чрезвычайно полезно, если быFab- и F(ab')2- и другие фрагменты антител,применимые по настоящему изобретению, могли быть применены для избирательного блокирования биологической активности IFN- в соответствии с методиками, описанными здесь для интактных молекул антител. Такие фрагменты обычно получают путем протеолитического расщепления, применяя ферменты, такие как папаин (для получения Fab-фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')2-фрагментов). Об антителе говорят, что оно "способно связывать" молекулу, если оно способно специфично взаимодействовать с молекулой, посредством чего молекула связывается с антителом. Подразумевается, что термин "эпитоп" относится к той части любой молекулы, способной к связыванию с антителом, которая также может быть распознана данным антителом. Эпитопы или "антигенные детерминанты" обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обладают специфичными трехмерными структурными характеристиками, равно как и специфичными зарядовыми характеристиками."Антиген" представляет собой молекулу или часть молекулы, способную к связыванию с антителом, которое к тому же способно индуцировать ответ иммунной системы животного в виде продуцирования антитела, способного связываться с эпитопом данного антигена. Антиген может содержать один или несколько эпитопов. Подразумевается, что специфичная реакция,относящаяся к указанному выше, указывает на то, что антиген будет высоко избирательно взаимодействовать с соответствующим ему антителом и не будет взаимодействовать с множеством других антител, выработка которых может быть индуцирована другими антигенами. Антитела, включая фрагменты антител,применимые по настоящему изобретению, могут быть применены для блокирования биологической активности подтипов IFN- с оказанием незначительного влияния на активность интеферона-. Настоящее изобретение также обеспечивает молекулы ДНК, кодирующие последовательность любого из антител по настоящему изобретению, которые определены выше, реплицируемые экспрессирующие векторы, содержащие любые из таких молекул ДНК, клетки-хозяева,трансформированные любыми из таких экспрессирующих векторов, включая прокариотические и эукариотические клетки-хозяева. Данное изобретение далее относится к активным мутеинам и активным участкам указанных антител и к гибридным белкам, состоящим из антител дикого типа, или их активных мутеинов или их активных участков, конденсированных с другим полипептидом или белком и 8 проявляющих сходную способность блокировать биологическую активность IFN I типа. ДНК, кодирующую последовательности указанных антител, их активных участков, мутеинов или гибридных белков, и оперативно пришитые регуляторные сигналы транскрипции и трансляции, вносят в эукариотические векторы, которые способны интегрировать последовательность желаемого гена в хромосому клетки-хозяина. В целях выбора клеток, которые устойчиво интегрируют внесенную ДНК в свои хромосомы, применяют один или несколько маркеров, которые позволяют выбирать клеткихозяева, которые содержат экспрессирующий вектор. Маркер может обеспечить прототрофность для ауксотрофного хозяина, невосприимчивость к биоцидам, например, к антибиотикам,или невосприимчивость к тяжелым металлам,таким как медь, или тому подобное. Избранный маркерный ген может быть либо непосредственно пришит к последовательностям ДНК генов, подлежащих экспрессии, или введен в ту же клетку по методу котрансфекции. Дополнительные элементы могут также быть необходимыми для оптимального синтеза одноцепочечной мРНК binding protein. Данные элементы могут включать в себя сплайсинг-сигналы, равно как и промоторы, энхансеры транскрипции и сигналы терминации (24). В целях экспрессии указанных антител, их активных участков или производных молекула ДНК, подлежащая введению в выбранные клетки, предпочтительно, будет включена в плазмиду или вирусный вектор, способный к автономной репликации в хозяин-реципиент. Представляющие важность факторы в выборе конкретной плазмиды или вирусного вектора включают в себя простоту, с которой клетки-реципиенты, которые содержат вектор, могут быть распознаны и выделены из тех клетокреципиентов, которые не содержат вектор; число копий вектора, которое желательно внести в определенного хозяина; и является ли желаемым "переносить" вектор между клеткамихозяевами различных видов. Предпочтительные прокариотические векторы включают плазмиды,такие как реплицируемые в Е. coli, например,pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184 и т.д. (25); плазмиды Bacillus, такие как рС 194, рС 221,рТ 127 и т.д. (26); плазмиды Streptomyces, включая pIJ101 (27), бактериофаги Streptomyces, такие как IC31 (28) и плазмиды Pseudomonas (29,30). Предпочтительные эукариотические плазмиды включают BPV, вирус коровьей оспы,SV40, 2-микронное кольцо и т.д. или их производные. Такие плазмиды хорошо известны в данной области (31-35). Как только вектор или последовательность ДНК, содержащую мотив(ы), подготавливают к экспрессии, экспрессирующий вектор может быть введен в подходящую клетку-хозяин по 9 средством любого из множества методов, таких как трансформация, трансфекция, липофекция,конъюгация, слияние протопластов, электропорирование, кальцийфосфатная преципитация,прямая микроинъекция и т.д. Клетки-хозяева, применимые по данному изобретению, могут являться либо прокариотическими, либо эукариотическими. Предпочтительные прокариотические хозяева включают бактерии, такие как Е. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia и т.д. Наиболее предпочтительным прокариотическим хозяином является Е. coli. Особенно интересующие бактериальные хозяева включают штамм 294 Е. coli K12 (АТСС 31446), Е. coli Х 1776 (АТСС 31537), Е. coli W3110 (F-, -, прототрофная (АТСС 27325 и другие энтеробактерии, такие как Salmonella Typhimurium илиSerratia marcescens и различные виды Pseudomonas. В таких условиях белок находится в негликозилированном состоянии. Прокариотический хозяин должен быть совместим с последовательностью репликона и контрольной последовательностью в экспрессирующей плазмиде. Предпочтительными эукариотическими хозяевами являются клетки млекопитающих,например, человеческие, обезьяньи, мышиные клетки и яйцеклетки китайского хомячка (СНО),поскольку они обеспечивают посттрансляционные модификации белковых молекул, включая адекватное упорядочивание, адекватное образование дисульфидных связей, равно как и гликозилирование по адекватным сайтам. Также посттрансляционные модификации пептидов,включая гликозилирование большим количеством остатков маннозы, могут проводить клетки дрожжей и клетки насекомых. Существует ряд стратегий экспрессии рекомбинантной ДНК, где применяются высокопродуктивные промоторные последовательности и большое количество копий плазмид, которые могут быть применены для получения желаемых белков в дрожжевых клетках и в клетках насекомых. В дрожжевых клетках происходит распознавание лидерных последовательностей клонированных продуктов генов млекопитающего и секреция пептидов,несущих лидерные последовательности. После внесения вектора клетки-хозяева культивируют в селективной среде, которая направляет рост векторсодержащих клеток. Экспрессия клонируемой(ых) последовательности(ей) генов приводит к продукции указанных антител, гибридных белков или мутеинов или их активных участков. Экспрессированные антитела затем выделяют и очищают в соответствии с любой традиционной методикой, включая экстракцию,осаждение, хроматографию, электрофорез и тому подобное, или по методу аффинной хроматографии. Как здесь используется, термин "мутеины" относится к аналогам указанных антител, в которых один или несколько аминокислотных ос 002543 10 татков указанных антител или их активных участков замещены различными аминокислотными остатками или удалены, или один или несколько аминокислотных остатков добавлены к исходной последовательности указанных антител, без существенного изменения активности полученных продуктов по сравнению с антителами дикого типа или их активными участками. Данные мутеины получают в соответствии с известными методиками синтеза и/или сайт-специфического мутагенеза или в соответствии с любой другой методикой, подходящей для данных целей. Любой такой мутеин обладает последовательностью аминокислот, существенно дублирующей таковую указанных антител с тем, чтобы обладать активностью, по существу, идентичной таковой указанных антител или их активных участков. Одна группа указанных антител способна блокировать противовирусную активность человеческого IFN-2 и человеческого IFN-. Другая группа указанных антител способна блокировать противовирусную активность человеческого IFN-2, тогда как активность человеческого IFN- остается, по большей части, неизменной. Таким образом, с помощью постановки традиционных экспериментов, заключающихся в подвергании такого мутеина,например, обычному анализу противовирусной активности, может быть определено, обладает ли любой данный мутеин той же активностью,что и указанное антитело, поскольку мутеин,который блокирует эффект любого вида интерферона I типа, в достаточной мере сохраняет активность указанных антител и, таким образом,обладает, по крайней мере, одним из описанных применений указанных антител и, таким образом, обладает активностью, по существу, идентичной таковой указанных антител. В предпочтительном осуществлении любой такой мутеин обладает идентичностью или гомологией с последовательностью одного из указанных антител, составляющей, по крайней мере, 40%. Более предпочтительно, он обладает идентичностью или гомологией с ней, составляющей, по крайней мере, 50%, по крайней мере, 60%, по крайней мере, 70%, по крайней мере, 80%, или, более предпочтительно, по крайней мере, 90%. Мутеины указанных антител или их активных участков, которые могут быть применены по настоящему изобретению, или кодирующая их последовательность нуклеиновая кислота,включают ограниченный набор существенно соответствующих друг другу последовательностей, как, например, замещающие пептиды или полинуклеотиды, которые могут быть традиционно получены специалистом в данной области без постановки каких-либо обширных экспериментов, основываясь на учениях и руководствах, представленных здесь. Подробное описание белковой химии и структуры см. в Schulz, 11G.E. et al., Principles of Protein Structure,Springer-Verlag, New York, 1978; и Creighton Т.Е., Proteins: Structure and Molecular Properties,W.H. FreemanCo., San Francisco, 1983, которые включены здесь в качестве ссылки. Представление замен в нуклеотидных последовательностях, таких как предпочтения кодонов,см. в Ausubel et al., supra, вА.1.1-А.1.24, иSambrook et al., supra, в приложениях С и D. Предпочтительными изменениями мутеинов по настоящему изобретению являются таковые, известные как "консервативные" замены. Консервативные аминокислотные замены в указанных антителах, полипептидах или белках или их активных участках могут включать в себя синонимичные аминокислоты в пределах группы, которая обладает существенно сходными физико-химическими свойствами, так что при замене между членами группы биологическая функция молекулы сохранится, Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1). Понятно, что вставки и делеции аминокислот также могут быть выполнены и в указанных выше последовательностях без какого-либо изменения их функции, особенно, если вставки и делеции затрагивают лишь несколько аминокислот, например, до тридцати, и более предпочтительно,до десяти, и если не удалены или не замещены аминокислоты, которые обладают принципиальным значением для образования функциональной конформации, например, цистеиновые остатки, Anfines, "Principles That Govern TheFolding of Protein Chains", Science, Vol. 181, pp. 223-230 (1973). Белки и мутеины, полученные в результате таких делеций и/или вставок входят в сферу настоящего изобретения. Предпочтительно, синонимичные аминокислотные группы представляют собой таковые,определенные в табл. 1. Более предпочтительно,синонимичные аминокислотные группы представляют собой таковые, определенные в табл. 2; и наиболее предпочтительно, синонимичные аминокислотные группы представляют собой таковые, определенные в табл. 3. Таблица 1. Предпочтительные группы синонимичных аминокислот. Аминокислота Синонимичная группа Таблица 2. Более предпочтительные группы синонимичных аминокислот. Аминокислота Синонимичная группаTrp Таблица 3. Наиболее предпочтительные группы синонимичных аминокислот Аминокислота Синонимичная группа Примеры выполнения замен аминокислот в белках, которые могут быть применены для получения мутеинов указанных антител или их активных участков для применения по настоящему изобретению, включают любые известные стадии методики, такие как представленные в патентах США RE33653, 4959314, 4588585 и 4737462, выданных Mark et al.; 5116943, выданном Koths et al.; 4965195, выданном Namen et(Shaw et al.). В другом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения любой мутеин указанных антител или их активных участков обладает аминокислотной последовательностью, 13 существенно соответствующей таковой указанных антител. Подразумевается, что термин "существенно соответствующий" охватывает белки с минимальными изменениями, внесенными в структуру природного белка, которые не влияют на основные характеристики природных белков,особенно когда речь идет об их способности полностью или избирательно блокировать активность IFN- и IFN-. Тип изменений, которые как правило, считают подпадающими под определение "существенно соответствующий",представляет собой изменения, которые являются результатом применения традиционных методик мутагенеза ДНК, кодирующей последовательности данных антител, приводящего к возникновению нескольких минимальных модификаций, и скрининга на предмет желаемой активности обсуждавшимся выше способом. Мутеины по настоящему изобретению включают белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которую гибридизуют с ДНК или РНК, которая кодирует последовательность указанных антител по настоящему изобретению, в строго определенных условиях. Данное изобретение также включает такую нуклеиновую кислоту, которая также применима в качестве зонда для идентификации и очистки желаемой нуклеиновой кислоты. Кроме того, такая нуклеиновая кислота будет представлять собой главную кандидатуру на определение, кодирует ли она последовательность полипептида, который сохраняет функциональную активность указанных антител по настоящему изобретению. Термин "строго определенные условия" относится к условиям гибридизации и последующей промывки, которые специалисты в данной области обычно называют "строгими". Смотри Ausubel et al., CurrentProtocols in Molecular Biology, supra, Interscience,NY,6.3 и 6.4 (1987, 1992) и Sambrook et al.,supra. Без какого-либо ограничения примеры строго определенных условий включают в себя условия промывки при температуре на 12-20 С ниже рассчитанной для исследуемого гибрида Тпл, например, в 2SSC и 0,5% SDS в течение 5 мин, 2SSC и 0,1% SDS в течение 15 мин; 0,1SSC и 0,5% SDS при 37 С в течение 30-60 мин и затем 0,1SSC и 0,5% SDS при 68 С в течение 30-60 мин. Специалистам в данной области понятно, что строго определенные условия также зависят от длины последовательностей ДНК, олигонуклеотидных зондов (таких как длиной в 10-40 оснований) или смешанных олигонуклеотидных зондов. При применении смешанных зондов предпочтительным является использование вместо SSC хлорида тетраметиламмония (ТМАС). Смотри Ausubel, supra. Термин "гибридный белок" относится к полипептиду, содержащему указанные антитела или их активные участки или их мутеины, конденсированному с другим белком, который, например, обладает продолжительным временем 14 циркуляции в жидкостях организма. Указанные антитела или их активные участки могут быть гибридизованы с другим белком, полипептидом и т.п. Термин "соли" здесь относится как к солям карбоксильных групп, так и к солям добавления кислот аминогрупп указанных антител, их активных участков, мутеинов или их гибридных белков. Соли карбоксильной группы могут образовываться известным в данной области образом и включают в себя неорганические соли,например, соли натрия, кальция, аммония, железа (III) или цинка и т.п., и соли органических оснований, как, например, соли, образованные с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и т.п. Соли добавления кислот включают в себя, например,соли минеральных кислот, таких как например,соляная кислота или серная кислота, и соли органических кислот, таких как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. Разумеется,любые такие соли должны обладать существенно сходной активностью с таковой указанных антител или их активных участков. Термин "функциональные производные",как здесь используется, охватывает производные указанных антител или их активных участков и их мутеинов и гибридных белков, которые могут быть получены из функциональных групп, которые присутствуют в качестве боковых цепей остатков или N- или С-концевых групп, известными в данной области способами,и функциональные производные включаются в область данного изобретения, поскольку они остаются фармацевтически применимыми, т.е. они не нарушают активность белка, которая существенно сходна с активностью указанных антител, и не придают токсичных свойств содержащим их композициям. Данные композиции могут, например, содержать полиэтиленгликолевые боковые цепи, которые способны маскировать антигенные сайты и продлевать время циркуляции указанных антител или их активных участков в жидкостях организма. Другие производные включают алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, образованные путем реакции с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Nацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацильными радикалами (например, алканоильные или карбоциклические ароильные группы),или O-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, таковых серильных и треонильных остатков), образованные с ацильными радикалами. Под "активными участками" указанных антител, мутеинов и гибридных белков в настоящем изобретении имеются в виду любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи указанных антител, самих по себе или совместно с ассоциированными молекулами или 15 присоединенными к ним остатками, например,углеводными или фосфатными остатками, или агрегаты любого из указанных выше антител при условии, что указанный участок обладает существенно сходной активностью с таковой указанных антител. Настоящее изобретение далее относится к фармацевтическим композициям, содержащим фармацевтически приемлемый носитель и указанное антитело по данному изобретению или их активные мутеины, гибридные белки и их соли, функциональные производные или их активные участки. Фармацевтические композиции по данному изобретению получают для введения путем смешивания указанных антител или их производных с физиологически приемлемыми носителями, и/или стабилизаторами, и/или наполнителями и готовят в дозированной форме, например, путем лиофилизации в дозировочных сосудах. Способ введения может представлять собой любой из общепринятых способов введения подобных средств и будет зависеть от подвергающегося лечению состояния, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно, с помощью местной инъекции или местного нанесения, или путем непрерывной инфузии и т.д. Количество вводимого активного соединения будет зависеть от способа введения, подвергающегося лечению заболевания и состояния пациента. При местной инъекции, например, требуется меньшее количество белка на массу тела, чем требуется при внутривенной инфузии. Указанные антитела применимы для модулирования или блокирования биологической активности различных подтипов IFN-, например, при сахарном диабете I типа, различных аутоиммунных заболеваниях,отторжении трансплантата, ВИЧ-инфекции и сходных заболеваниях, при которых имеет место нарушенная экспрессия IFN-, т.е. указанные антитела могут быть применены при любом состоянии, при котором избыток IFN- эндогенно продуцируется или вводится извне. Соответственно, указанные антитела, гуманизированные антитела, их активные участки,мутеины, гибридные белки и их соли, функциональные производные и их активные участки предназначены для лечения аутоиммунных заболеваний, других воспалительных состояний в организме млекопитающих, для лечения токсических состояний, вызванных введением интерферона-альфа или интерферона-бета, юношеского диабета, системной красной волчанки и ВИЧ-инфекции. Теперь данное изобретение будет проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами: 16 Пример 1. Иммунизация мышей IFNAB-BP и слияние с миеломными клетками. Сначала самкам мышей Ваlb/С (в возрасте 3 месяцев) вводили 2 мкг очищенного IFNABBP в эмульсии на основе полного адъюванта Фройнда, а через три недели подкожно в неполном адъюванте Фройнда. Пять дополнительных инъекций вводили с 10-суточным интервалом подкожно в ФБР. Сыворотки данных мышей имели титр связывания 1:100000, что определяли по методу IsRIA (смотри ниже). Антисыворотки блокировали противовирусную активность как IFN-, так и IFN-, что определяли в соответствии со следующей процедурой. Предварительно образованные монослои человеческих клеток WISH в 96-луночных планшетах инкубировали в течение 2 ч при 37 С с двукратными разведениями антисыворотки(или моноклональных антител). Затем во все лунки добавляли IFN-2 или IFN- (в конечной концентрации 10 ЕД/мл; калибровано относительно стандартов NIH) и далее планшеты инкубировали в течение 4 ч. Затем клетки заражали вирусом везикулярного стоматита (VSV) и инкубировали в течение ночи до тех пор, пока в контрольных лунках, не содержащих IFN, не отмечался полный цитопатический эффект. За нейтрализующий титр антител в лунках, проявляющих 50% ЦПД, приняли 9 единиц/мл. Следовательно, 1 блокирующая единица/мл представляет собой концентрацию антител, необходимую для блокирования активности 1 ЕД/млIFN в данных условиях анализа. Сыворотка иммунизированных мышей имела нейтрализующий титр 120000 ЕД/мл как по IFN-2, так и поIFN-. Окончательные повторные иммунизации очищенным IFNAB-BP проводили внутрибрюшинно за 4 и за 3 суток до слияния. Слияние проводили, применяя в качестве участников слияния миеломную клеточную линию NSO/1 и лимфоциты, полученные как из селезенки, так и из лимфатических узлов иммунизированной мыши. Слитые клетки распределяли по 96 луночным планшетам и гибридомы отбирали вDMEM, содержащей HAT и 15% лошадиную сыворотку. Пример 2. Скрининг гибридом и характеризация моноклональных антител. Скрининг гибридом, продуцирующих анти-IFNAB-BP моноклональные антитела, проводили следующим образом. Супернатанты гибридом тестировали на предмет наличия антиIFNAB-BP антител по методу инвертированного твердофазного радиоиммунного анализа (IsRIA) следующим образом. Планшеты для микротитрования, изготовленные из ПВХ, (DynatechLaboratories, Alexagdria, VA) покрывали афинными очищенными козьими анти-мышиными сывороточными F(ab)2 антителами (Jackson 17 инкубации при 4 С в течение ночи планшеты промывали дважды ФБР, содержащим БСА(0,5%) и Tween 20 (0,05%) и блокировали в промывающем растворе в течение, по крайней мере, 2 ч при 37 С. Добавляли культуральные супернатанты гибридом (100 мкл/лунка) и планшеты инкубировали в течение 4 ч при 37 С. Планшеты промывали 3 раза промывным раствором, и добавляли для дальнейшей инкубации 125I-IFNAB-BP (100 мкл, 105 cpm) в течение 16 ч при 4 С. Планшеты промывали 3 раза и отдельные лунки выделяли и анализировали с помощью гамма-счетчика. Образцы, в которых подсчет давал результат, по крайней мере, в 5 раз превышающий значение, полученное на отрицательном контроле, расценивали как давшие положительный результат (таблица 4). Все положительные клоны отбирали и субклонировали. Отдельные субклоны вводили мышам Balb/C, у которых с помощью pristane стимулировали выработку асцитической жидкости. Иммуноглобулины выделяли из асцитической жидкости путем осаждения сульфатом аммония (50% насыщения). Изотипы антител определяли с применением коммерчески доступного набора дляELISA (Amersham, UK). Различные моноклональные антитела, равно как и супернатанты гибридом, концентрированные супернатанты гибридом, асцитическая жидкость или иммуноглобулины из асцитической жидкости далее тестировали на предмет их способности блокировать рецептор и препятствовать противовирусной активности IFN-2 иIFN-, как описано выше применительно к сыворотке иммунизированных мышей. Результаты приведены в табл. 4. Таким образом, было обнаружено, что моноклональные антитела 16.3, 53.2 и 392.1 блокируют противовирусную активность как IFN-2, так и IFN- в сравнимых титрах, тогда как было неожиданно обнаружено,что титр моноклональных антител 35.9, 51.44 и 234.14 против IFN-2 значительно выше, чем их титр против IFN-. Таким образом, моноклональные антитела 35.9, 51.44 и 234.14 могут быть применены в определенном интервале концентраций для избирательного блокирования активности IFN-, тогда как активностьIFN- затронута не будет. Таблица 4. Характеризация моноклональных антител против рецептора IFN-/ (IFNAB-BP). Антитело(число зующий зующий импульсов титр IFN- титр IFNв минуту) 2 (ЕД/мл)(ЕД/мл) 16.3 Суперна 391035120 НО Пример 3. Применение моноклональных антител для постановки на IFNAB-BPII тестаELISA. Планшеты для микротитрования (Dynatech или Maxisorb, bNunc) покрывали анти-IFNABBP моноклональными антителами в течение ночи при 4 С. Данное нанесение первого покрытия может быть выполнено с применением любого моноклонального антитела 46.10 (Ig фракция, 120 мкл/лунка, 10 мкг/мл в ФБР). Моноклональное антитело 46.10 описано в публикации ЕР 676413. Альтернативно, для нанесения первого покрытия может быть применено моноклональное антитело 117.7. Планшеты промывали ФБР,содержащим БСА (0,5%), Tween 20 (0,05%) иNaN3 (0,02%) (Блокирующий раствор) и блокировали в том же растворе в течение ночи при 37 С. Тестируемые образцы подвергали серийному двукратному разведению (начиная с 1:4) в Блокирующем растворе, содержащем 0,1%NP40 и 0,65 М NaCl и добавляли в лунки (100 мкл/лунка) на 4 ч при 37 С. Планшеты затем промывали 3 раза ФБР, содержащим 0,05%Tween 20 (ФБР/Tween) с последующим добавлением биотинилированного моноклонального антитела 234.14 (1:1000 в Блокирующем растворе, но без NaN3 100 мкл/лунка) для дальнейшей инкубации в течение ночи при 4 С. Планшеты промывали 3 раза ФБР/Tween (100 мкл/лунка) и в течение 2 ч при комнатной температуре добавляли конъюгат стрептавидинпероксидаза хрена (Jackson Labs, 1:10000 в ФБР/Tween, 100 мкл/лунка). Планшеты промывали 3 раза ФБР/Tween, и после добавления в каждую лунку 100 мкл свежеприготовленного раствора АБТС(2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты), Sigma, 10 мг; 6,4 мл Н 2O; 2,2 мл 0,2 М Na2HPO4, 1,4 мл 0,2 М лимонной кислоты; 1 мкл Н 2 О 2) в качестве субстрата развивалась окраска. Окраска развивается в течение 30 мин, и реакция может быть остановлена путем добавления 100 мкл/лунка 0,2 М лимонной кислоты. Данные с планшетов были считаны автоматическим ELISA-ридером при 405 нм, делая поправку на неспецифическое 19 считывание при 630 нм. Нижний предел определения в данном анализе составлял 30 пг/мл. Предшествующее описание конкретных осуществлений выявляет общую природу данного изобретения, так что другие могут, применяя данные знания, с легкостью модифицировать и/или приспосабливать такие конкретные осуществления для различных приложений без отдаления от основополагающей концепции, и,таким образом, такие приспособления и модификации должны и предназначены для того,чтобы быть охвачены значением и кругом эквивалентов описанных осуществлений. Следует понимать, что фразеология и терминология,применяемая здесь, служит цели описания, а не ограничения. Гидридомы 46.10, 117.7 и 234.14 были положены на хранение в Pasteur Institut (CNCM) под номерами хранения 1-1697, 1-1698 и 1-1699,соответственно, 23 апреля 1996 года. Ссылки 1. Taylor, J.L., et al., "Recent progress in interferon research:molecular mechanisms of regulation, action and virus circumvention". Virus Research. 15:1-26, 1990. 2. Bisceglie, A.M., et al., "Recombinant interferon alpha therapy for chronic hepatitis C. A randomized, double-bind, placebo-controlled trial".Sci. USA, 85: 8998-9002,1988. 39. Graham, F.L., et al., Virology, 52: 456467, 1973. 40. Munson, P.J., et al., Anal. Biochem., 107: 220-239, 1980. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Антитело, способное связываться с рецептором IFN-/ и обеспечивающее более вы 22 сокий антивирусный блокирующий титр противIFN-, чем против IFN-, отличающееся тем,что оно не является поликлональным антителом, или его Fаb-фрагменты. 2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно представляет собой моноклональное антитело. 3. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно представляет собой химерное антитело. 4. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно представляет собой гуманизированное антитело. 5. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно представляет собой моноклональное антитело 234.14 (I-1699) или 117.7 (I-1698). 6. Гибридома, которая продуцирует моноклональное антитело 117.7 (I-1698). 7. Гибридома, которая продуцирует моноклональное антитело 234.14 (I-1699). 8. Фармацевтическая композиция, включающая моноклональное антитело 117.7 (I-1698) или 234.14 (I-1699). 9. Способ блокирования биологической активности IFN-, включающий введение пациенту эффективного количества композиции по п.8. 10. Набор для тестирования IFNAB-BPI или IFNAB-BPII методом ELISA, включающий моноклональные антитела 117.7 (I-1698) и 234.14 (I-1699).