Полинуклеотид, кодирующий фосфолипазу aspergillus niger, фосфолипаза aspergillus niger и способы получения и применения полинуклеотида и фосфолипазы

008607 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к новым идентифицированным полинуклеотидным последовательностям, включающим гены, которые кодируют новую фосфолипазу, выделенную из Aspergillus niger. В изобретении описаны нуклеотидная последовательность новых генов полной длины, последовательность кДНК, включающая полную длину кодирующей последовательности для новой фосфолипазы, а также аминокислотная последовательность функционального белка полной длины и его функциональных эквивалентов. Изобретение также относится к способам применения указанных ферментов в промышленных процессах и к способам диагностики грибковых инфекций. В изобретение также включены клетки, трансформированные полинуклеотидом по настоящему изобретению, и клетки, в которых фосфолипаза по настоящему изобретению генетически модифицирована для усиления или снижения ее активности и/или уровня экспрессии. Предпосылки создания изобретения Фосфолипиды состоят из глицеринового скелета с двумя этерифицированными жирными кислотами во внешнем (sn-1) и внутреннем (sn-2) положениях, тогда как третья гидроксильная группа глицерина этерифицирована фосфорной кислотой. Фосфорная кислота может быть, в свою очередь, этерифицирована, например, аминоспиртом типа этаноламина (фосфатидилэтаноламина), холина (фосфатидилхолина). Третья гидроксильная группа может быть также, вместо этерификации фосфорной кислотой, связана с сахарными остатками, такими как галактоза или ее димер, такой как дигалактозилдиглицерид. Фосфолипазы определяются в настоящем изобретении как ферменты, которые участвуют в гидролизе одной или более связей в фосфолипидах, включая указанный выше дигалактозилдиглицерид. Может быть выделено несколько типов фосфолипазной активности, которые приводят к гидролизу эфирной(ых) связи(ей), которая(ые) соединяет(ют) фрагменты жирного ацила с глицероловым скелетом. Фосфолипаза А 1 (ЕС 3.1.1.32) и А 2 (ЕС 3.1.1.4) катализируют деацилирование одной жирной ацильной группы в положениях sn-1 и sn-2, соответственно, в диацилглицерофосфолипиде с образованием лизофосфолипида. Лизофосфолипаза (ЕС 3.1.1.5, также называемая фосфолипазой В в соответствии с номенклатурой Комитета Международного Союза по биохимии и молекулярной биологии (Union of Biochemistry andMolecular Biology; Enzyme Nomenclature, Academic Press, New York, 1992 катализирует гидролиз оставшейся жирно-ацильной группы в лизофосфолипиде. Фосфолипаза В была открыта в Penicillium notatum(Saito et al., 1991, Methods in Enzymology 197: 446-456), которая катализирует деацилирование обеих жирных кислот в диацилглицерофосфолипиде и по своей природе обладает лизофосфолипазной активностью. Галактолипаза (ЕС 3.1.4.3) катализирует гидролиз одной или обеих жирно-ацильных групп в положениях sn-1 и sn-2, соответственно, в дигалактозилдиглицериде. Фосфолипаза С (ЕС 3.1.4.3) гидролизует сложноэфирную фосфатную связь между глицериновым скелетом и фосфатной группой, например: фосфатадилхолин + Н 2O = 1,2-диацилглицерин + холинфосфат. Фосфолипаза D (ЕС 3.1.4.4) гидролизует сложноэфирную фосфатную связь между фосфатной группой и аминоспиртом, например: фосфатидилхолин + Н 2O = холин + фосфатидная кислота. Фосфолипазы могут быть получены с использованием микроорганизмов. Микробные фосфолипазы доступны из множества источников; виды Bacillus представляют собой основной источник бактериальных ферментов, тогда как грибные ферменты обычно получают из клеток видов Aspergillus. Грибные ферменты с фосфолипазной активностью были описаны в различных источниках, включаяFusarium solani (Tsung-Che et al., 1968, Phytopathological Notes 58: 1437-38). Фосфолипазные гены грибов были клонированы из нескольких источников, включая Penicillumnotatum (Masuda et al., 1991, supra), Torulaspora delbrueckii (Watanabe et al., 1994, FEMS Microbiology Letters 124: 29-34), Saccharomyces cerevisiae (Lee et al., 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 19725-19730),Aspergillus (JP 10155493), Neurosposa crassa (EMBL 042791) и Schizosaccharomyces pombe (EMBL 013857). Фосфолипазы могут использоваться во множестве промышленных процессов, включая модификацию фосфолипидных эмульгаторов. Примером фосфолипидного эмульгатора является лецитин, который представляет смесь полярных и нейтральных липидов, где содержание полярных липидов составляет по-1 008607 меньшей мере 60%. Фосфолипидные эмульгаторы применяются во многих отраслях пищевой и непищевой промышленности, в частности яичный лецитин используется как эмульгатор, например, в молочных продуктах, в особенности в майонезе, заправках, мучных кондитерских изделиях и т.п., соевый лецитин используется, например, в качестве эмульгатора в (низкокалорийных) соусах, хлебе, маргарине, косметических продуктах и т.п., тогда как другие лецитины используются, например, в шоколаде, в корме для выпаивания телят. Модификация фосфолипидных эмульгаторов фосфолипазами может привести к повышению степени эмульгирования смеси масло/вода. Модификация фосфолипидных эмульгаторов фосфолипазами может повысить стабильность эмульсий, образуемых при добавлении модифицированных фосфолипидных эмульгаторов, включая стабильность в более широком диапазоне рН или при других значениях рН и/или в более широком диапазоне температур. Модификация фосфолипидных эмульгаторов фосфолипазами может повысить стабильность эмульсий, образуемых при добавлении модифицированных фосфолипидных эмульгаторов, в присутствии ионов Са 2+ или Mg2+. Другой пример промышленного применения фосфолипаз связан с тем, что они могут использоваться для дегумирования растительных масел при обработке таких масел. В типичном процессе дегумирования лецитины удаляют из растительных масел, например соевых масел, рапсовых масел (масла канолы), льняных масел, подсолнечных масел, с целью повышения, в числе других показателей, стабильности растительного масла, путем промывки масляной фазы водой, где смешивание воды и масла в условиях высокого сдвигающего усилия выталкивает лецитины в водную фазу, которую впоследствии удаляют с помощью сепаратора. В образованной так называемой фазе водного дегумирования удаляются только быстро гидратируемые фосфолипиды, например фосфатидилхолин, фосфатидилинозит и фосфатидилэтаноламин. Негидратируемые фосфолипиды/фосфатиды, прежде всего фосфолипиды, которые содержат до 50% магниевых и/или кальциевых солей, не поддаются легкому удалению на стадии водного дегумирования. Воздействие на негидратируемые фосфолипиды/фосфатиды фосфолипазой А 2 делает указанные фосфолипиды более растворимыми в воде и, в этой связи, легче экстрагируемыми на стадии водного дегумирования. Другой пример промышленного применения фосфолипаз относится к тому, что их используют для удаления осадка, который образуется при осахаривании (с использованием -амилазы и глюкоамилазы) пшеничной клейковины или пшеничного крахмала для получения глюкозных сиропов. Удаление осадка существенно ускоряет последующее фильтрование полученных глюкозных сиропов. Указанные выше направления промышленного применения фермента фосфолипазы охватывают лишь несколько примеров, и указанный перечень не является ограничивающим. Еще один пример промышленного применения фосфолипаз в производстве пищевых продуктов заключается в том, что фосфолипазы используют, в частности, в хлебопечении для повышения качества теста или хлебобулочных продуктов. Пшеничная мука содержит примерно 2,2-2,9% липидов. Липиды муки можно классифицировать на липиды крахмала (0,8-0,9%) и некрахмальные липиды (1,4-2,0%). В то время как крахмальные липиды состоят, в основном, из полярных лизофосфолипидов, некрахмальные липиды состоят примерно на 40% из нейтральных триглицеридов и на 40% из полярных фосфо- и гликолипидов. Для оптимизации состава липидной фракции муки возможно использовать гидролиз фосфолипидов в тесте in situ путем добавления фосфолипазы А. Например, в документах ЕР-А-109244 и WO 98/26057 описывается использование фосфолипазы А в хлебопечении. В патенте Чехословакии АО 190264 используют фосфатидную кислоту (продукт гидролиза фосфолипазы D) в качестве средства, улучшающего тесто и качество хлеба. В соответствии с ЕР-А 075463 вносят сочетание фосфолипазы А и фосфолипазы D с получением лизофосфатидной кислоты как средства для кондиционирования теста. В WO 00/32758 описывается получение вариантов липолитического фермента путем внесения изменений в аминокислотную последовательность липолитического фермента с целью повышения уровня желательной активности. Было показано, в контексте применения в хлебопечении, что особенно полезным является вариант липолитического фермента, выделенный из представителей семейства Humicula или семейства Zygomycetes, поскольку он, по всей видимости, обладает фосфолипазной и/или дигалактозилдиглицеридной активностью. В WO 98/45453 описывается полипептид, обладающий липазной активностью, полученный из Aspergillus tubigensis, который также демонстрирует высокую гидролитическую активность в отношении дигалактозилдиглицерида. Однако указанные ферменты имеют недостаток, связанный с их относительно низкой удельной активностью. В указанных выше процессах использование фосфолипаз имеет ряд преимуществ, которые связаны с тем, что они могут быть получены методами рекомбинантной ДНК. Такие полученные рекомбинантными методами ферменты обладают множеством преимуществ в сравнении с их традиционными очищенными вариантами. Рекомбинантные ферменты могут быть получены с низкой стоимостью, высоким выходом, без загрязняющих компонентов, таких как бактерии или вирусы, и, кроме того, они не содержат бактериальных токсинов или не проявляют активностей других загрязняющих ферментов. Настоящее изобретение относится по меньшей мере к одной, если не ко всем указанным выше проблемам. Объект настоящего изобретения Объектом настоящего изобретения также является получение новых полинуклеотидов, кодирую-2 008607 щих новые фосфолипазы с улучшенными свойствами. Еще одним объектом является получение природных и рекомбинантных фосфолипаз, а также продуцирующих их рекомбинантных штаммов. Часть настоящего изобретения относится также к полипептидам слияния, а также к способам получения и использования полинуклеотидов и полипептидов по настоящему изобретению. Более конкретно, объектом настоящего изобретения является получение фосфолипаз, обладающих также галактолипазной активностью. Объектом настоящего изобретения является получение новых фосфолипаз, которые позволяют решить по меньшей мере одну из указанных выше проблем, или получение новых фосфолипаз, которые обладают одним или более улучшенными свойствами в случае их использования при изготовлении теста и/или хлебобулочных изделий, выбранными из группы свойств, таких как повышенная всхожесть теста,повышенная эластичность теста, повышенная стабильность теста, сниженная липкость теста, повышенная растяжимость теста, усиление показателей теста, способствующих его машинной обработке, повышенный объем полученных хлебобулочных изделий, улучшенная консистенция хлебного мякиша, повышенная мягкость хлебобулочного изделия, улучшенный вкус хлебобулочного изделия, повышенная устойчивость против черствения, улучшенная корка хлебобулочного изделия, или фосфолипаз с более широкой субстратной специфичностью. Краткое описание сущности изобретения Настоящее изобретение относится к новым полинуклеотидам, кодирующим новые фосфолипазы. Более конкретно, изобретение относится к полинуклеотидам, имеющим нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется предпочтительно в условиях высокой строгости с последовательностью,которую выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14. Следовательно,настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые более чем на 40%, в частности примерно на 60%, предпочтительно на 65%, более предпочтительно на 70% и еще более предпочтительно на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%, гомологичны одной или более последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14. В более предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к такому выделенному полинуклеотиду, получаемому из нитчатого гриба, в частности предпочтительно из Aspergillus niger. В одном варианте настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, включающему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15 или их функциональных эквивалентов. В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему по меньшей мере один функциональный домен полипептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15 или их функциональных эквивалентов. В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к гену фосфолипазы с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10 и 13. В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, предпочтительно кДНК, кодирующему(ей) фосфолипазу из Aspergillus niger, которая имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15 или вариантов или фрагментов этого полипептида. В предпочтительном варианте кДНК имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11 или 14 или их функциональных эквивалентов. Еще в одном предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к полинуклеотиду,включающему кодирующую последовательность для полипептидов по настоящему изобретению, которая предпочтительно относится к полинуклеотидным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11 и 14. Настоящее изобретение относится к векторам, включающим полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, и к праймерам, зондам и фрагментам, которые могут использоваться для амплификации или обнаружения ДНК по настоящему изобретению. Еще в одном предпочтительном варианте изобретения предлагается вектор, в котором полинуклеотидная последовательность по настоящему изобретению функционально связана с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии кодируемой аминокислотной последовательности в соответствующей хозяйской клетке, такой как Aspergillus niger или A. oryzea. Настоящее изобретение также относится к способам получения полинуклеотидов и векторов по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к полученным рекомбинантными методами хозяйским клеткам, которые содержат гетерологичные или гомологичные полинуклеотиды по настоящему изобретению. В другом варианте настоящее изобретение относится к рекомбинантным хозяйским клеткам, в которых экспрессия фосфолипазы по настоящему изобретению существенно повышена или в которых повышена активность фосфолипазы. В другом варианте настоящее изобретение относится к полученным рекомбинантными методами хозяйским клеткам, которые содержат гетерологичный или гомологичный полинуклеотид по настоящему изобретению, где указанная клетка способна продуцировать функциональную фосфолипазу по на-3 008607 стоящему изобретению, предпочтительно относится к клетке, способной к суперэкспрессии фосфолипазы по настоящему изобретению, например к штамму Aspergillus, содержащему увеличенное количество копий гена или кДНК по настоящему изобретению. Еще в одном аспекте настоящего изобретения предлагается очищенный полипептид. Полипептиды по настоящему изобретению включают полипептиды, кодируемые полинуклеотидами по настоящему изобретению. Особенно предпочтительным является полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15 или их функциональных эквивалентов. Белки слияния, включающие полипептид по настоящему изобретению, также входят в область настоящего изобретения. Изобретение также относится к способам получения полипептидов по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к использованию фосфолипазы по настоящему изобретению в любом промышленном процессе, описанном в настоящей заявке. Подробное описание изобретения Полинуклеотиды Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим фосфолипазы, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15 или их функционально эквивалентных последовательностей. Последовательности пяти генов, кодирующих фосфолипазы ФЛП 03, ФЛП 06, ФЛП 15, ФЛП 26 и ФЛП 34, соответственно, были определены путем секвенирования соответствующих геномных клонов, полученных из Aspergillus niger. Изобретение относится к полинуклеотидным последовательностям, включающим гены, кодирующие фосфолипазы ФЛП 03,ФЛП 06, ФЛП 15, ФЛП 26 и ФЛП 34, соответственно, а также к полной последовательности их кДНК и их кодирующей последовательности. Соответственно, настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей изSEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14 или их функциональных эквивалентов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, гибридизируемому в строгих условиях, предпочтительно в условиях высокой строгости, с полинуклеотидом, включающим нуклеотидную последовательность, выбранную их группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5,7, 8, 10, 11, 13 и 14 или их функциональных эквивалентов. Преимущественно такие полинуклеотиды могут быть получены из нитчатых грибов, в частности изAspergillus niger. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду,имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную их группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4,5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14. Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему по меньшей мере один функциональный домен полипептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15 или их функциональных эквивалентов. В контексте настоящего описания термины "ген" и "рекомбинантный ген" относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, которые могут быть выделены из хромосомной ДНК и которые включают открытую рамку считывания, кодирующую белок, например фосфолипазу из Aspergillus niger. Ген может включать кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и регуляторные последовательности. Термин "ген" также относится к выделенной молекуле. Кроме того, термин"ген" относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, определенной в настоящем описании. Молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, такая как молекула нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5,7, 8, 10, 11, 13 и 14 или ее функциональных эквивалентов, может быть выделена с использованием стандартных методик молекулярной биологии, и в настоящем описании приведена информация о полученных последовательностях. Например, с использованием части последовательности нуклеиновой кислоты,выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, в качестве зонда для гибридизации, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть выделены с использованием стандартных методик гибридизации и клонирования (см., например, в руководстве СамбрукаHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты, включающая всю или часть последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, может быть выделена посредством полимеразной цепьевой реакции (ПЦР) с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров, разработанных на основе информации о последовательности молекул из группы, включающей SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14. Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть амплифицирована с использованием кДНК, мРНК или, альтернативно, геномной ДНК в качестве матрицы и соответствующих олигонуклеотидных праймеров по стандартным методикам проведения ПЦР-амплификации. Нуклеиновая кислота,амплифицированная таким образом, может быть далее клонирована в соответствующем векторе и охарактеризована путем анализа последовательности ДНК.-4 008607 Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие нуклеотидным последовательностям по настоящему изобретению или гибридизуемые с ними, могут быть получены по стандартным методикам синтеза, например с использованием автоматизированного синтезатора ДНК. В одном предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2. Последовательность SEQ ID NO: 2 соответствует кодирующей области гена фосфолипазы ФЛП 03 из Aspergillus niger,показанной в SEQ ID NO: 1. Такая кДНК включает последовательность, кодирующую ФЛП 03 полипептид из Aspergillus niger, показанную в SEQ ID NO: 3. Во втором предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5. Последовательность SEQ ID NO: 5 соответствует кодирующей области гена фосфолипазы ФЛП 06 из Aspergillus niger,показанной в SEQ ID NO: 4. Такая кДНК включает последовательность, кодирующую полипептид ФЛП 06 из Aspergillus niger, показанную в SEQ ID NO: 6. В третьем предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 8. Последовательность SEQ ID NO: 8 соответствует кодирующей области гена фосфолипазы ФЛП 15 из Aspergillus niger,показанной в SEQ ID NO: 7. Такая кДНК включает последовательность, кодирующую полипептид ФЛП 15 из Aspergillus niger, показанную в SEQ ID NO: 9. В четвертом предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 11. Последовательность SEQ ID NO: 11 соответствует кодирующей области гена фосфолипазы ФЛП 26 из Aspergillusniger, показанной в SEQ ID NO: 10. Такая кДНК включает последовательность, кодирующую полипептид ФЛП 26 из Aspergillus niger, показанную в SEQ ID NO: 12. В пятом предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 14. Последовательность SEQ ID NO: 14 соответствует кодирующей области гена фосфолипазы ФЛП 34 из Aspergillusniger, показанной в SEQ ID NO: 13. Такая кДНК включает последовательность, кодирующую полипептид ФЛП 34 из Aspergillus niger, показанную в SEQ ID NO: 15. В другом предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14 или функционального эквивалента указанных нуклеотидных последовательностей. Молекула нуклеиновой кислоты, которая комплементарна к другой нуклеотидной последовательности, представляет собой такую молекулу, которая обладает достаточной комплементарностью к другой нуклеотидной последовательности, так что может гибридизоваться с другой нуклеотидной последовательностью, образуя при этом стабильный дуплекс. Один аспект настоящего изобретения относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты,которые кодируют полипептид по настоящему изобретению или его функциональный эквивалент, такой как биологически активный фрагмент или домен, а также к молекулам нуклеиновой кислоты, подходящим для использования в качестве гибридизирующего зонда для идентификации молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид по настоящему изобретению, и к фрагментам таких молекул нуклеиновой кислоты, которые пригодны для использования в качестве ПЦР-праймеров для амплификации или мутирования молекул нуклеиновой кислоты. Термины "выделенный полинуклеотид" или "выделенная нуклеиновая кислота" обозначают ДНК или РНК, которые непосредственно не соприкасаются с обеими кодирующими последовательностями, с которыми в естественном геноме организма, из которого они были выделены, они непосредственно соприкасаются (одна на 5'-конце и одна на 3'-конце). Таким образом, в одном варианте выделенная нуклеиновая кислота включает несколько или все из 5'-некодирующих (например, промоторных) последовательностей, которые непосредственно примыкают к кодирующей последовательности. В этой связи, указанный термин включает, например, рекомбинантную ДНК, которая входит в состав вектора в автономно реплицирующихся плазмиде или вирусе или в состав геномной ДНК прокариота или эукариота или которая существует в виде отдельной молекулы (например, кДНК или фрагмента геномной ДНК, получаемой путем ПЦР или обработки рестрикционной эндонуклеазой), независимо от других последовательностей. Указанный термин также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительный полипептид, который, по существу, не содержит клеточный материал, вирусный материал или культуральную среду (в случае получения по методикам рекомбинантной ДНК), или химические предшественники или другие химические вещества (в варианте химического синтеза). Кроме того, "выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты" представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты, который в природе не встречается как фрагмент и не может быть обнаружен в естественном состоянии. В контексте настоящего описания термины "полинуклеотид" или "молекула нуклеиновой кислоты" используются для обозначения молекул ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) или молекул РНК(например, мРНК), а также аналогов ДНК и РНК, получаемых с использованием нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двуцепочечной, но предпочтительно является двуцепочечной. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована с использованием аналогов или производных олигонуклеотидов (например, инозиновых или фосфотиатных нуклеотидов). Такие олигонуклеотиды могут использоваться, например, для получения нуклеиновых кислот, которые обладают измененными свойствами по спариванию оснований или повышенной устойчивостью к нуклеазам. Другой вариант настоящего изобретения относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты,которая является антисмысловой относительно молекулы нуклеиновой кислоты, полученной по настоящему изобретению. В область настоящего изобретения также включаются комплементарные цепи молекул нуклеиновой кислоты, приведенные в настоящем описании. Ошибки последовательности Информация о последовательностях, приведенная в настоящем описании, не должна восприниматься в узком контексте как о последовательностях, в которые включаются ошибочно идентифицированные основания. Конкретные последовательности, раскрытые в настоящем описании, могут без труда использоваться для выделения полного гена из нитчатых грибов, в частности Aspergillus niger, которые, в свою очередь, могут быть далее проанализированы с идентификацией имеющихся в последовательности ошибок. Если особо не оговорено иное, все нуклеотидные последовательности, определенные при секвенировании описанных в настоящей заявке молекул ДНК, анализируют с использованием автоматизированного секвенатора ДНК и все аминокислотные последовательности полипептидов, кодируемые молекулами ДНК, определенными в настоящем изобретении, были прогнозированы как продукты трансляции последовательности ДНК, определенной выше. В этой связи, как известно в данной области, в любой последовательности ДНК, определенной с помощью такого автоматизированного подхода, могут содержаться некоторые ошибки нуклеотидной последовательности. Нуклеотидные последовательности, определенные путем автоматизированного секвенирования, в типичном случае по меньшей мере примерно на 90% идентичны, более типично от по меньшей мере примерно на 95% до по меньшей мере примерно на 99% идентичны фактической нуклеотидной последовательности секвенированной молекулы ДНК. Фактическая последовательность может быть более точно определена с помощью других подходов, включающих способ ручного секвенирования ДНК, также известный в данной области. Как известно в данной области техники, единственная вставка или делеция в определенной нуклеотидной последовательности в сравнении с фактической последовательностью может вызвать сдвиг рамки считывания при трансляции нуклеотидной последовательности, так что предсказанная аминокислотная последовательность, кодируемая определенной нуклеотидной последовательностью, будет совершенно иной относительно аминокислотной последовательности, фактически кодируемой секвенированной молекулой ДНК, начиная с точки такой вставки или делеции. Каждый специалист со средним уровнем знаний в данной области способен определить такие ошибочно идентифицированные основания и знает, как корректировать такие ошибки. Фрагменты нуклеиновой кислоты, зонды и праймеры Молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может включать лишь часть или фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1,2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, например фрагмент, который может использоваться в качестве зонда, или праймера, или фрагмента, кодирующего часть белка по настоящему изобретению. Нуклеотидная последовательность, определенная при клонировании гена фосфолипазы и кДНК, позволяет получать зонды и праймеры, разработанные для целей использования при идентификации и/или клонировании других представителей семейства фосфолипаз, а также гомологов фосфолипазы из других видов. Зонд/праймер в типичном случае включает, по существу, очищенный олигонуклеотид, содержащий обычно область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется, предпочтительно в условиях высокой строгости,по меньшей мере, примерно на участке, включающем 12 или 15, предпочтительно примерно 18 или 20,предпочтительно примерно 22 или 25, более предпочтительно примерно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 75 или более идущих друг за другом нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14 или их функционального эквивалента. Зонды, основанные на нуклеотидной последовательности, приведенной в настоящем описании, могут быть использованы для выявления транскриптов (в основном, мРНК) или геномных последовательностей, кодирующих такие же или гомологичные белки, например, из других организмов. В предпочтительных вариантах зонд также включает метящую группу, присоединенную к нему, например метящую группу, которая может представлять собой радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента. Такие зонды также могут использоваться в качестве составного компонента в диагностических наборах для анализа клеток, которые экспрессируют фосфолипазу. Идентичность и гомология Термины "гомология" или "процент идентичности" используются в настоящем описании взаимозаменяемо. В контексте настоящего изобретения принимается, что для выявления процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновой кислоты проводят сопоставление указанных последовательностей с целью оптимального сравнения (например, могут-6 008607 быть введены гэпы в последовательность первой аминокислоты или в последовательность нуклеиновой кислоты для оптимального сопоставления со второй аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислоты или в соответствующих положениях нуклеотидов. В том случае,когда положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом,что и в соответствующем положении во второй последовательности, то молекулы определяются как идентичные в данном положении. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений в последовательностях (например, % идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений (то есть перекрывающихся положений) х 100). Предпочтительно обе последовательности имеют одинаковую длину. Специалист в данной области понимает, что имеется несколько разных компьютерных программ,доступных для определения гомологии между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть осуществлено с использованием математического алгоритма. В предпочтительном варианте процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют по алгоритму Нидлмана и Вунша (Needleman and Wunsch; J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970, который включен в программуGAP в составе пакета программного обеспечения GCG (доступен на веб-странице http://www.gcg.com), с использованием матрицы Blossom 62 или матрицы РАМ 250, и гэпа с весовым значением 16, 14, 12, 10, 8,6 или 4, и длины с весовым значением 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалист в данной области понимает, что все указанные различные параметры приведут к несколько измененным результатам, но что общий процент идентичности двух последовательностей не будет существенно изменен при использовании такого алгоритма. Еще в одном варианте процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы GAP, входящей в состав пакета программного обеспеченияGCG (доступен на веб-странице http://www.gcg.com), с использованием матрицы NWSgapdna.CMP, и гэпа с весовым значением 40, 50, 60, 70 или 80, и длины с весовым значением 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом варианте процент идентичности между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями определяют по алгоритму Майерса и Миллера (Е. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4: 11-17, 1989, который включен в программу ALIGN (версия 2.0) (доступен на веб-странице http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi),с использованием таблицы весовых значений остатков в рамках РАМ 120, при отклонении гэпа длиной 12 и гэпа с весовым значением 4. Последовательности нуклеиновой кислоты и белковые последовательности по настоящему изобретению могут также использоваться в качестве "запрашиваемой последовательности" для проведения поиска в доступных базах данных для идентификации других представителей семейства или родственных последовательностей. Такие поиски могут проводиться с использованием программ BLASTN и BLASTX(версия 2.0) (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10). Поиски нуклеотидов в режиме BLAST могут проводиться с использованием программы BLASTN, где балльный показатель = 100, длина слова =12, с получением нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекуле нуклеиновой кислоты для ФЛП 03 по настоящему изобретению. Поиски белковых последовательностей в режиме BLAST могут проводиться с использованием программы BLASTX, где балльный показатель = 50, длина слова = 3, с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам ФЛП 03 по настоящему изобретению. В варианте сопоставления с включением гэпов для целей сравнения может использоваться гэпированная версия программы Gapped BLAST, описанная Е. Альтшулем с соавт.(Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402). В случае программ BLAST и Gapped BLAST может использоваться введение по умолчанию параметров соответствующих программ (то есть BLASTX и BLASTN). (См. веб-страницу http://www.ncbi.nim.nih.gob.) Гибридизация В контексте настоящего описания термин "гибридизация" применяется для описания условий гибридизации и промывки, при которых нуклеотидные последовательности по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 85-90%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% гомологичны друг другу и в типичном случае остаются в гибридизованном состоянии друг с другом. Предпочтительные неограничивающие примеры таких условий гибридизации включают гибридизацию в 6 х хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при температуре примерно 45 С с последующей одной или более промывками в 1x SSC, 0,1% ДСН при температуре 50 С, предпочтительно при температуре 55 С, предпочтительно при температуре 60 С, еще более предпочтительно при температуре 65 С. Условия высокой строгости включают, например, гибридизацию при температуре 68 С в 5 х SSC/5x растворе Денхардта/1,0% ДСН и промывку в 0,2 х SSC/0,1% ДСН при комнатной температуре. Альтернативно, промывка может проводиться при 42 С. Для специалиста в данной области известно, какие условия применяются для гибридизации в условиях высокой строгости и очень высокой строгости. В данной области имеется руководство, описываю-7 008607 щее такие условия, доступное, например, в работах Самбрука с соавт. и Аусубеля с соавт. (Sambrook etal., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., and Ausubel et al. (eds.),1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John WileySons, N.Y Разумеется, полинуклеотид, который гибридизуется только с поли-А последовательностью (такой как поли(А) тракт мРНК на 3'-конце) или с комплементарной цепью из Т (или U) остатков, не включается в полинуклеотид по настоящему изобретению, предназначенный для специфической гибридизации с частью нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, поскольку такой полинуклеотид будет гибридизоваться с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей цепь поли(А) или ее комплемент(например, практически с любым клоном двуцепочечной кДНК). Получение ДНК полной длины из других организмов В типичной процедуре описываемого подхода могут быть подвергнуты скринингу библиотеки кДНК, созданные на основе других организмов, например нитчатых грибов, в частности видов Aspergillus. Например, штаммы Aspergillus могут быть подвергнуты скринингу для поиска гомологичных полинуклеотидов методом нозерн-блоттинга. При выявлении транскриптов, гомологичных к полинуклеотидам по настоящему изобретению, с использованием стандартных методик, известных специалистам в данной области, могут быть сконструированы библиотеки кДНК на основе РНК, выделенной из соответствующего штамма. Альтернативно, библиотека общей геномной ДНК может быть подвергнута скринингу с использованием зонда, гибридизуемого с полинуклеотидом по настоящему изобретению. Гомологичные генные последовательности могут быть выделены при проведении ПЦР с использованием двух вырожденных олигонуклеотидных праймерных пулов, разработанных на основе нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению. Матрица для реакции может представлять собой кДНК, полученную путем обратной транскрипции мРНК, полученных из штаммов, в отношении которых известно или предполагается, что они экспрессируют полинуклеотид по настоящему изобретению. Продукт ПЦР может быть подвергнут субклонированию и секвенированию для подтверждения того, что амплифицированные последовательности отражают последовательности новой последовательности нуклеиновой кислоты для ФЛП 03 или ее функционального эквивалента. ПЦР фрагмент может также использоваться для выделения клона кДНК полной длины с использованием множества известных способов. Так, например, амплифицированный фрагмент может быть помечен и использован для скрининга библиотеки кДНК бактериофагов или космид. Альтернативно, меченый фрагмент может использоваться для скрининга геномной библиотеки. Методика ПЦР может также использоваться для выделения последовательности кДНК полной длины из других организмов. Например, РНК может быть выделена по стандартным процедурам из соответствующих клеточных или тканевых источников. Реакция обратной транскрипции может быть проведена на основе РНК с использованием олигонуклеотидного праймера, специфичного, прежде всего, к 5'-концу амплифицированного фрагмента, для осуществления функции затравки в синтезе первой цепи. К полученному РНК/ДНК гидриду может быть далее привешен фрагмент "хвоста" (например, с помощью гуанинов) по стандартной методике концевой трансферазной реакции, после чего гибрид может быть расщеплен РНК-азой Н, с осуществлением далее затравочной функции для синтеза второй цепи(например, с помощью поли-С праймера). Таким образом, могут быть без труда выделены последовательности кДНК амплифицированного фрагмента в направлении против хода транскрипции. Обзор используемых методик клонирования приведен, например, в работах Самбрука с соавт. и Аусубеля с соавт.(Sambrook et al., supra; и Ausubel et al., supra). Векторы Другой аспект настоящего изобретения относится к векторам, предпочтительно векторам экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую белок по настоящему изобретению или его функциональный эквивалент. В контексте настоящего описания термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, к которой она присоединяется. Один тип векторов относится к "плазмиде", которая представляет кольцевую двуцепочечную петлю ДНК, внутри которой могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другой тип векторов представляет собой вирусный вектор, отличающийся тем, что в таком вирусном геноме могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Некоторые векторы способны к автономной репликации в хозяйской клетке, в которую они вводятся (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируются в геном хозяйской клетки при их введении в хозяйскую клетку и таким образом реплицируются вместе с хозяйским геномом. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы обозначаются в настоящем описании как "векторы экспрессии". В целом, векторы экспрессии, используемые в методиках рекомбинантной ДНК, обычно имеют форму плазмид. Термины "плазмида" и "вектор" используются взаимозаменяемо в настоящем описании, поскольку плазмида чаще всего представлена в форме вектора. Однако настоящее изобретение включает и другие формы векторов экспрессии, такие как вирусные векторы (например, векторы ретровирусов с дефектами репликации, аденовирусов и аденоас-8 008607 социированных вирусов), которые выполняют эквивалентные функции. Рекомбинантные векторы экспрессии по настоящему изобретению включают нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в хозяйской клетке, что означает, что рекомбинантный вектор экспрессии включает одну или более регуляторных последовательностей, выбранных с учетом хозяйских клеток, которые будут использоваться для экспрессии, которые оперативно связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, подлежащей экспрессии. В контексте рекомбинантного вектора экспрессии термин "оперативно связанный" означает, что интересующая нуклеиновая последовательность соединена с регуляторной(ыми) последовательностью(ями) таким способом, который позволяет осуществлять экспрессию нуклеотидной последовательности (например, транскрипцию/трансляцию in vitro или в хозяйской клетке, когда вектор вводится в хозяйскую клетку). Термин "регуляторная последовательность" обозначает промоторы, энхансеры и другие контрольные элементы экспрессии (например, сигнал полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны в литературе (см., например, Goeddel; Gene Expression Technology: Methodsin Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990. Регуляторные последовательности включают такие последовательности, которые направляют конститутивную или индуцибельную экспрессию нуклеотидной последовательности в хозяйских клетках многих типов, а также последовательности, которые направляют экспрессию нуклеотидной последовательности только в определенных хозяйских клетках(например, тканеспецифичные регуляторные последовательности). Для специалистов в данной области очевидно, что разработка вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор хозяйской клетки, подлежащей трансформации, желательный уровень экспрессии белка и т.п. Векторы экспрессии по настоящему изобретению могут встраиваться в хозяйские клетки, за счет чего достигается продукция белков или пептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, раскрытыми в настоящем описании (например, фосфолипаз, мутантных фосфолипаз, их фрагментов, вариантов или функциональных эквивалентов, белков слияния и т.п.). Рекомбинантные векторы экспрессии по настоящему изобретению могут быть созданы для экспрессии фосфолипаз в прокариотических или эукариотических клетках. Например, белок по настоящему изобретению может экспрессироваться в бактериальных клетках, таких как Е. coli и виды Bacillus, в клетках насекомых (включая вектор экспрессии бакуловируса), в дрожжевых клетках и в клетках млекопитающих. Подходящие хозяйские клетки описаны также в указанной выше работе (см. Goeddel, GeneExpression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990. Альтернативно, рекомбинантный вектор экспрессии может транскрибироваться и транслироваться in vitro, например,с использованием промоторных регуляторных последовательностей Т 7 и Т 7-полимеразы. Используемые в настоящем изобретении векторы экспрессии включают векторы хромосомного,эписомального и вирусного происхождения, например вирусы, полученные из бактериальных плазмид,бактериофагов, дрожжевых эписом, хромосомных элементов дрожжей, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы осповакцины, аденовирусы, вирусы птичьей оспы, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, а также векторы, полученные из их сочетаний, такие как векторы, полученные на основе плазмид и генетических элементов бактериофагов, такие как космиды и фагемиды. Встраиваемая ДНК должна быть оперативно связана с соответствующим промотором, таким как PL промотор фага ламбда, lac, tpr и tac промоторы Е. coli, ранний и поздний промоторы SV40, а также промоторы длинных концевых повторов ретровирусов (LTR), если ограничиться указанием лишь нескольких наименований. Специалистам в данной области известны другие подходящие промоторы. В конкретном варианте предпочтительными являются промоторы, которые способны направлять высокий уровень экспрессии фосфолипаз в нитчатых грибах. Такие промоторы известны в данной области. Конструкции экспрессии могут содержать сайты инициации и терминации транскрипции, а в транскрибируемой области - сайт связывания рибосом для осуществления трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых такими конструкциями, включает кодон инициации трансляции AUG и кодон терминации транскрипции, расположенные, соответственно, в начале и в конце полипептида, подлежащего трансляции. Векторная ДНК может быть введена в прокариотические или эукариотические клетки по традиционным методикам трансформации или трансфекции. В контексте настоящего описания термины "трансформация" и "трансфекция" используются для обозначения множества известных в данной области методик введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в хозяйскую клетку, включая метод с использованием соосаждения фосфатом кальция или хлоридом кальция, метод трансфекции с использованием ДЭАЭ-декстрана, метод трансдукции, инфекции, липофекции, катионной трансфекции с использованием липидов или электропорации. Подходящие способы трансформации или трансфекции хозяйских клеток описаны, например, в руководстве Самбрука с соавт. и Дэвиса с соавт. (Sambrook et al.Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986 и в других лабораторных руководствах. В попытках достичь стабильной трансфекции клеток млекопитающих было показано, что лишь небольшая фракция клеток, зависимая от используемого вектора экспрессии и методики трансфекции, мо-9 008607 жет интегрировать чужеродную ДНК в свой геном. Для идентификации и отбора таких интегрантов обычно в хозяйские клетки вместе с интересующим геном встраивают ген, который кодирует селектируемый маркер (например, устойчивость к антибиотикам). Предпочтительные селектируемые маркеры включают такие маркеры, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418,гигромицин и метотрексат. Нуклеиновую кислоту, кодирующую селектируемый маркер, предпочтительно вводят в хозяйскую клетку с тем же вектором, что и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок по настоящему изобретению, или, альтернативно, она может вводиться на отдельном векторе. Клетки, стабильно трансфицированные введенной нуклеиновой кислотой, могут быть идентифицированы путем селекции с лекарственным средством (например, клетки, которые включают селектируемый маркерный ген, будут выживать, тогда как другие клетки погибают). Экспрессию белков в прокариотах зачастую проводят в клетках Е. coli с использованием векторов,содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, направляющие экспрессию либо белков слияния, либо неслитых белков. Слитые векторы добавляют множество аминокислот к кодируемому белку, например к аминоконцу рекомбинантного белка. Такие слитые векторы в типичном случае служат для достижения трех целей: 1) для повышения экспрессии рекомбинантного белка; 2) для повышения растворимости рекомбинантного белка; и 3) для помощи в очистке рекомбинантного белка за счет функционирования в качестве лиганда при аффинной очистке. Часто, в случае экспрессии слитых векторов, в месте соединения слитого фрагмента и рекомбинантного белка вводят сайт расщепления протеолитическим ферментом для того, чтобы способствовать отделению рекомбинантного белка от слитого фрагмента после очистки белка слияния. Такие ферменты и распознаваемые ими последовательности включают фактор Ха, тромбин и энтерокиназу. Как отмечалось, вектор экспрессии предпочтительно содержит селектируемые маркеры. Такие маркеры включают дигидрофолатредуктазу или устойчивость к неомицину, в случае культуры эукариотических клеток, и устойчивость к тетрациклину или ампициллину, в случае культивирования Е. coli и других бактерий. Репрезентативные примеры соответствующих хозяйских организмов включают бактериальные клетки, такие как Е. coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium; грибные клетки, такие как дрожжи; клетки насекомых, такие как Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животных, такие как СНО,COS и меланома Bowes, а также растительные клетки. Соответствующие культуральные среды и условия выращивания указанных выше хозяйских клеток известны в данной области. К числу векторов, предпочтительных для использования в бактериях, относятся pQE70, pQE60 иPQE-9, доступные от Qiagen; pBS векторы, Phagescript векторы, Bluescript векторы, pNH8A, pNH16A,pNH18A, pNH46A, доступные от Stratagene; и ptrc99a, pKK223-3, pKK-233-3, pDR540, pRIT5, доступные от Pharmacia. К числу векторов, предпочтительных для эукариотических клеток, относятся PWLNEO,pSV2CAT, pOG44, pZT1 pSG, доступные от Stratagene; и pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, доступные отPharmacia. Специалистам в данной области известны также другие подходящие векторы. Известные бактериальные промоторы, подходящие для использования в настоящем изобретении,включают lacI и lacZ промоторы Е. coli, Т 3 и Т 7 промоторы, gpt промотор, PR, PL промоторы ламбда фага и trp промотор, промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промоторы SV40, промоторы ретровирусных длинных концевых повторов (LTR), такие как длинные концевые повторы вируса саркомы Рауса ("RSV"), и промоторы металлотионеина, такие как мышиный промотор металлотионеина-I. Встраивание энхансерной последовательности в вектор может повышать уровень транскрипции ДНК, кодирующей полипептиды по настоящему изобретению, у высших эукариотов. Энхансеры представляют собой цис-активные элементы ДНК, обычно включающие от 10 до 300 п.н., которые действуют в плане повышения активности транскрипции промотора в хозяйской клетке данного типа. Примеры энхансеров включают энхансер SV40, который расположен на поздней стороне ориджина репликации, на участке от 100 до 270 п.н., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне ориджина репликации и энхансеры аденовируса. Для секреции транслированного белка в просвет эндоплазматического ретикулюма, в периплазматическое пространство или во внеклеточное окружение в экспрессированный полипептид может быть включен соответствующий сигнал секреции. Такие сигналы могут быть эндогенными для полипептида или могут представлять собой гетерологичные сигналы. Полипептиды могут экспрессироваться в модифицированной форме, такой как белок слияния, и они могут включать не только сигналы секреции, но также дополнительные гетерологичные функциональные участки. Так, например, участок, включающий дополнительные аминокислоты, в особенности заряженные аминокислоты, может быть добавлен к N-концу полипептида для повышения стабильности и персистенции в хозяйской клетке, а также стабильности в процессе очистки или впоследствии при работе и хранении. К полипептиду для облегчения очистки могут быть также добавлены пептидные группы. Полипептиды по настоящему изобретению Настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, и 15, или аминокислотную последовательность, получаемую при экспрессии полинуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, в соответствующей хозяйской клетке.- 10008607 В настоящее изобретение входит также пептид или полипептид, включая функциональный эквивалент указанных полипептидов. Указанные выше полипептиды коллективно обозначаются термином "полипептиды по настоящему изобретению". Термины "пептид" и "олигопептид" рассматриваются как синонимы (как это обычно принято), и каждый термин может использоваться взаимозаменяемо, как того требует контекст, определяя цепь, состоящую по меньшей мере из двух аминокислот, соединенных пептидными связями. Слово "полипептид" используется в настоящем описании для обозначения цепей, содержащих более семи аминокислотных остатков. Все олигопептидные и полипептидные формулы или последовательности, приведенные в настоящем описании, написаны слева направо и в направлении от аминоконца к карбоксильному концу. Используемый в описании однобуквенный код аминокислот широко применяется в данной области,расшифровку его можно найти, например, в руководстве Самбрука с соавт. (Sambrook et al., MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY, 1989. Термин "выделенный" в отношении полипептида или белка означает полипептид или белок, отобранный из своего нативного окружения. Например, полученные рекомбинантными методами полипептиды и белки, экспрессируемые в хозяйских клетках, рассматриваются в контексте настоящего изобретения как "выделенные" нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были, по существу, очищены по соответствующей методике, такой как, например, одностадийный метод очистки, описанный Смитом и Джонсоном (Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988. Фосфолипазы по настоящему изобретению могут быть восстановлены и очищены из культур рекомбинантных клеток известными способами, включающими осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на лектине. Наиболее предпочтительно для очистки используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Полипептиды по настоящему изобретению включают природные очищенные продукты, продукты,полученные по процедурам химического синтеза, и продукты, получаемые рекомбинантными методиками, из клеток прокариотических или эукариотических хозяйских организмов, включая, например, клетки бактерий, дрожжей, грибов, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от вида хозяйского организма, используемого в процедуре получения рекомбинантного продукта, полипептиды по настоящему изобретению могут быть гликозилированными или не гликозилированными. Кроме того,полипептиды по настоящему изобретению могут также включать исходный модифицированный остаток метионина, в некоторых случаях как результат процессов, определяемых хозяйским организмом. Белковые фрагменты Настоящее изобретение также относится к биологически активным фрагментам полипептидов по настоящему изобретению. Биологически активные фрагменты полипептидов по настоящему изобретению включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, идентичные в достаточной мере аминокислотной последовательности фосфолипазы или полученные из нее (например, аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15), которые включают меньшее число аминокислот, чем белок полной длины, и проявляют по меньшей мере одну биологическую активность соответствующего белка полной длины. В типичном случае биологически активные фрагменты включают домен или мотив по меньшей мере с одной активностью, свойственной соответствующему белку полной длины. Биологически активный фрагмент белка по настоящему изобретению может представлять собой полипептид, который включает, например, 10, 25, 50, 100 или более аминокислот в длину. Кроме того, рекомбинантными методиками могут быть получены другие биологически активные части, в которых делетированы другие области белка, и оценены на наличие одной или более биологических активностей, свойственных нативной форме полипептида по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к фрагментам нуклеиновой кислоты, которые кодируют указанные выше биологически активные фрагменты фосфолипазы. Белки слияния Белки по настоящему изобретению или их функциональные эквиваленты, например их биологически активные части, могут быть оперативно связаны с нефосфолипазным полипептидом (например, с гетерологичными аминокислотными последовательностями) с образованием белков слияния. В контексте настоящего описания термины "химерный белок" или "белок слияния" относительно фосфолипазы включают фосфолипазный полипептид, оперативно связанный с нефосфолипазным полипептидом. В предпочтительном варианте белок слияния включает по меньшей мере один биологически активный фрагмент фосфолипазы по настоящему изобретению. В другом предпочтительном варианте белок слияния включает по меньшей мере две биологически активных части фосфолипазы по настоящему изобретению. В контексте белка слияния термин "оперативно связанный" обозначает, что фосфолипазный и нефосфолипазный полипептиды слиты в открытой рамке считывания друг с другом на N-конце или Сконце фосфолипазы.- 11008607 Например, в одном варианте настоящего изобретения белок слияния представляет собой белок слияния GST-фосфолипазы, в котором фосфолипазные последовательности слиты с С-концом GST последовательностей. Такие белки слияния могут облегчать очистку рекомбинантной фосфолипазы. В другом варианте настоящего изобретения белок слияния представляет собой фосфолипазный белок, содержащий гетерологичную сигнальную последовательность на своем N-конце. В некоторых хозяйских клетках (например, в хозяйских клетках млекопитающих и дрожжей) экспрессия и/или секреция фосфолипазы может быть повышена путем использовании гетерологичной сигнальной последовательности. В другом варианте может использоваться секреторная последовательность gp67 белка оболочки бакуловируса в качестве гетерологичной сигнальной последовательности (Current Protocols in MolecularBiology, Ausubel et al., eds., John WileySons, 1992). Другие примеры гетерологичных сигнальных последовательностей эукариотов включают секреторные последовательности мелитина и щелочной фосфатазы человеческой плаценты (Stratagene; La Jolla, Калифорния). Еще в одном примере используемые гетерологичные сигнальные последовательности включают сигнал секреции phoA (Sambrook et al., supra) и сигнал секреции белка A (Pharmacia Biotech; Piskataway, Нью-Джерси). Сигнальная последовательность может использоваться для облегчения секреции и выделения белка или полипептида по настоящему изобретению. В типичном случае сигнальные последовательности характеризуются наличием ядра из гидрофобных аминокислот, который, в основном, выщепляется из зрелого белка в ходе одного или двух явлений расщепления. Такие сигнальные полипептиды содержат сайты процессинга, которые позволяют расщеплять сигнальную последовательность зрелых белков, когда они вступают в секреторный механизм. Сигнальная последовательность направляет секрецию белка, такого как белок из эукариотического хозяйского организма, который был трансформирован вектором экспрессии, и сигнальная последовательность впоследствии или одновременно подвергается расщеплению. Белок может быть затем легко выделен из внеклеточной среды и очищен известными способами. Альтернативно, сигнальная последовательность может быть связана с интересующим белком с использованием последовательности, которая облегчает очистку, такой как домен GST. Таким образом, например,последовательность, кодирующая полипептид, может быть слита с маркерной последовательностью, такой как последовательность, кодирующая пептид, который облегчает очистку слитого полипептида. В некоторых предпочтительных вариантах данного аспекта изобретения маркерная последовательность представляет собой гексагистидиновый пептид, такой как метка, имеющаяся в векторе pQE (Qiagen, Inc.),в числе других, многие из которых коммерчески доступны. Как описано в литературе (Gentz et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989, например, гексагистидин обеспечивает осуществление удобных методик очистки. НА метка представляет собой другой используемый для очистки пептид, который соответствует эпитопу белка гемагглютинина вируса гриппа, описанного, например, Вильсоном с соавт.(Wilson et al., Cell 37:767 (1984. Предпочтительно химерный белок или белок слияния получают по стандартным процедурам на основе рекомбинатной ДНК. Например, фрагменты ДНК, кодирующие разные полипептидные последовательности, лигируют вместе в открытой рамке считывания по традиционным методикам, например путем использования липких концов или ступенчатых разрывов для лигирования, расщепления рестрикционным ферментом с обеспечением соответствующих концов, фланкирования липких концов, где это приемлемо, обработки щелочной фосфатазой для избежания нежелательного связывания и знзиматического лигирования. В другом варианте ген слияния может быть синтезирован традиционными методиками, включающими использование автоматизированного синтезатора ДНК. Альтернативно, амплификация методом ПЦР фрагментов гена может быть проведена с использованием "якорных" праймеров, которые дают возможность комплементарно объединить выступающие участки между двумя последовательными генными фрагментами, которые впоследствии могут быть подвергнуты отжигу и повторной амплификации для создания химерной генной последовательности (см.,например, Current Protocols in Molecular Biology, eds., Ausubel et al., John WileySons: 1992). Кроме того, коммерчески доступно множество векторов экспрессии, которые кодируют слитый фрагмент (например, полипептид GST). Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть клонирована в таком векторе экспрессии, так что слитый фрагмент связывается в открытой рамке считывания со слитым фрагментом для экспрессии белка слияния, включающего белок по настоящему изобретению. Функциональные эквиваленты Термины "функциональные эквиваленты" и "функциональные варианты" используются в настоящем описании взаимозаменяемо. Функциональные эквиваленты ДНК, кодирующей фосфолипазу, представляют собой выделенные фрагменты ДНК, которые кодируют полипептид, демонстрирующий конкретную функцию фосфолипазы из Aspergillus niger, определенной в настоящем описании. Функциональный эквивалент фосфолипазного полипептида по настоящему изобретению представляет собой полипептид, который демонстрирует по меньшей мере одну из функций фосфолипазы из Aspergillus niger,определенной в настоящем описании. В этой связи, функциональные эквиваленты также охватывают биологически активные фрагменты. Функциональные эквиваленты белка или полипептида могут содержать только консервативные замещения одной или более аминокислот в аминокислотных последовательностях, выбранных из группы,- 12008607 состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15, или замещения, вставки или делеции аминокислот, не относящихся к незаменимым. Соответственно, аминокислота, не относящаяся к группе незаменимых, представляет собой остаток, который может быть изменен в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15, без существенного изменения биологической функции. Так, например, можно полагать, что аминокислотные остатки, которые являются консервативными для фосфолипазных белков по настоящему изобретению, в особенности не подлежат изменениям. Более того, аминокислоты, сохраняющиеся в фосфолипазных белках по настоящему изобретению и других фосфолипазах, также не подлежат изменениям. Термин "консервативное замещение" указывает на замещение, при котором один аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, имеющим похожую боковую цепь. Такие семейства известны в данной области и включают аминокислоты с боковой цепью основной природы (например,лизин, аргинин и гистидин), боковой цепью кислотной природы (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), аминокислоты с незаряженной полярной боковой цепью (например, глицин, аспарагин, глютамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярной боковой цепью (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленной боковой цепью (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматической боковой цепью (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). В типичном случае функциональные эквиваленты нуклеиновой кислоты могут содержать молчащие мутации, которые не изменяют биологической функции кодируемого полипептида. Соответственно, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим фосфолипазные белки,которые содержат изменения аминокислотных остатков, но которые не являются существенными для конкретной биологической активности. Такие белки отличаются по аминокислотной последовательности от последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15, но при этом они сохраняют по меньшей мере одну биологическую активность. В одном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, где указанный белок включает, по существу, гомологичную аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15. Рекомендации по получению фенотипически молчащих аминокислотных замен приведены, например, в работе Боуи (Bowie, J.U. et al., Science 247: 1306-1310 (1990, где авторы показывают, что имеется два основных подхода для определения толерантности аминокислотной последовательности к изменениям в ее составе. Первый метод основан на эволюционном принципе, когда мутации либо воспринимаются, либо отвергаются естественным отбором. Во втором подходе используется генно-инженерный метод для введения аминокислотных изменений в конкретное положение клонированного гена с проведением впоследствии отбора или скрининга с целью идентификации последовательностей, которые способствуют сохранению функциональной активности. Исследования вышеуказанных авторов показали, что исследованные белки отличаются удивительной толерантностью к аминокислотным заменам. Далее авторы определили, какие изменения являются, скорее всего, допустимыми в конкретном положении белка. Так,например, большая часть заменяемых аминокислотных остатков требует наличия неполярных боковых цепей, тогда как некоторые особенности поверхности боковых цепей, в целом, сохраняются. Другие такие фенотипические молчащие замены описаны, например, в работе Боуи с соавт. (Bowie et al., supra) и в приведенных в ней ссылках. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, гомологичный белку, выбранному из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15, может быть получена при введении одной или более нуклеотидных замен, вставок или делеций в кодирующие нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 2, 4 и 5, 7 и 8, 10 и 11, 13 и 14, соответственно, так что одна или более аминокислотных замен, делеций или вставок вводится в кодируемый белок. Эти мутации могут быть введены с помощью стандартных методик, таких как сайт-направленный мутагенез и мутаганез посредством ПЦР. Термин "функциональные эквиваленты" также относится к ортологам фосфолипаз из Aspergillus niger,приведенных в настоящем описании. Ортологи фосфолипаз из Aspergillus niger представляют собой белки, которые могут быть выделены из других штаммов или видов и которые обладают близкой или идентичной биологической активностью. Такие ортологи могут быть без проблем идентифицированы как молекулы, включающие аминокислотную последовательность, которая, по существу, гомологична к аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15. В соответствии с определением по настоящему описанию термин "по существу, гомологичные" относится к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное число аминокислот или нуклеотидов, идентичных или эквивалентных (например,имеющих похожую боковую цепь) второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, так что первая и вторая аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют общий домен. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, которые содержат общий домен, характеризуются примерно 60%, предпочтительно 65%, более предпочтительно 70%, еще более предпоч- 13008607 тительно 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% или более идентичностью и определяются в рамках настоящего описания как достаточно идентичные. Кроме того, нуклеиновые кислоты, кодирующие другие представители семейства фосфолипаз, которые имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от нуклеотидной последовательности,выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, также входят в область настоящего изобретения. Кроме того, нуклеиновые кислоты, кодирующие фосфолипазные белки из других видов, которые имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, также входят в область настоящего изобретения. Молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующие вариантам (например, природным аллельным вариантам) и гомологам ДНК по настоящему изобретению, могут быть выделены на основе их гомологии к нуклеиновым кислотам по настоящему изобретению с использованием раскрываемых в настоящем описании кДНК или их соответствующего фрагмента в качестве зонда для гибридизации по стандартным методикам гибридизации, предпочтительно в условиях высокой строгости гибридизации. Специалисту в данной области понятно, что кроме природных аллельных вариантов последовательностей из Aspergillus niger, приведенных в настоящем описании, можно получить изменения за счет введения мутации в нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ IDNO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, с достижением изменений в аминокислотной последовательности фосфолипазного белка без существенного изменения функции белка. В другом аспекте настоящего изобретения предлагаются улучшенные варианты фосфолипазы. Улучшенные фосфолипазы представляют собой белки, в которых достигнуто улучшение по меньшей мере одной биологической активности. Такие белки могут быть получены при введении случайных мутаций по всей кодирующей последовательности или по ее части, таких как мутации, вводимые путем мутагенеза по механизму насыщения, при этом получаемые мутанты могут быть экспрессированы рекомбинантно и подвергнуты скринингу на биологическую активность. Например, в настоящей области имеются стандартные тесты для определения ферментативной активности фосфолипаз и таким образом быть отобраны улучшенные белковые варианты. В предпочтительном варианте фосфолипаза имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15. В другом варианте фосфолипаза, по существу,гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6,9, 12 и 15, и сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность фосфолипазы, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15, соответственно, но отличается по аминокислотной последовательности из-за наличия природных вариаций или за счет мутагенеза, описанного выше. В другом предпочтительном варианте фосфолипаза имеет аминокислотную последовательность,кодируемую фрагментом выделенной нуклеиновой кислоты, способным гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, предпочтительно в условиях высокой строгости гибридизации. Соответственно, фосфолипаза представляет собой белок, который включает аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичностью к аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15. В частности, фосфолипаза представляет собой белок, который включает аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере примерно на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96,97, 98, 99% или более гомологичностью к аминокислотной последовательности, показанной в SEQ IDNO: 3, или фосфолипаза представляет собой белок, который включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологична аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 6, или фосфолипаза представляет собой белок, который включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологична аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 9, или фосфолипаза представляет собой белок, который включает аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65,70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичностью аминокислотной последовательности,показанной в SEQ ID NO: 12, или фосфолипаза представляет собой белок, который включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97,98, 99% или более гомологична аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 15. Функциональные эквиваленты белка по настоящему изобретению могут быть также идентифицированы, например, путем скрининга библиотек комбинаторных мутантов, например "укороченных" мутантов белка по настоящему изобретению на фосфолипазную активность. В одном варианте библиотеку мозаичных вариантов создают путем комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновой кислоты. Библиотека мозаичных вариантов может быть получена, например, путем энзиматического лигирования смеси синтетических олигонуклеотидов в генных последовательностях, так что множество потенциальных белковых последовательностей, определяемое вырожденностью кода, экспрессируется в виде отдельных полипептидов или, альтернативно, в виде набора более крупных белков слияния (например, для- 14008607 индикации фага). Имеется множество разнообразных способов, которые могут использоваться для создания библиотек возможных вариантов полипептидов по настоящему изобретению на основе вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Методы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в данной области (см., например, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477). Кроме того, библиотеки фрагментов кодирующей последовательности для полипептида по настоящему изобретению могут использоваться для создания мозаичной популяции полипептидов с целью скрининга путем отбора вариантов. Например, может быть создана библиотека фрагментов кодирующих последовательностей путем обработки нуклеазой двуцепочечного фрагмента интересующей кодирующей последовательности после ПЦР в условиях, когда одноцепочечные разрывы происходят только один раз на молекулу, с проведением впоследствии денатурации двуцепочечной ДНК, ренатурации ДНК с образованием двуцепочечной ДНК, которая может включать смысловые/антисмысловые пары из разных продуктов с ник-разрывами, удалением одноцепочечных частей из реформированных дуплексов путем обработки нуклеазой S1 и лигированием полученной библиотеки фрагментов в векторе экспрессии. С помощью этого способа может быть получена библиотека экспрессии, относящаяся к кодированию Nконцевых и внутренних фрагментов разного размера интересующего белка. В данной области известно несколько методик скрининга генных продуктов в комбинаторных библиотеках, полученных путем точечных мутаций или процессирования, и скрининга библиотек кДНК для поиска генных продуктов, обладающих выбранным свойством. Наиболее часто используемые методики,которые позволяют осуществлять масштабный анализ при скрининге больших генных библиотек, включают в типичном случае клонирование генной библиотеки в реплицируемых векторах экспрессии,трансформацию подходящих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, при которых обнаружение желаемой активности облегчает выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого был выявлен. Рекурсивный согласованный мутагенез (PCM (REM представляет собой методику, которая повышает частоту образования функциональных мутантов в библиотеке и которая может использоваться в сочетании с методами скрининга для идентификации белка по настоящему изобретению (Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave etal. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331). Для специалистов в данной области очевидно, что полиморфизм последовательности ДНК, ведущий к изменениям в аминокислотной последовательности фосфолипазы, может существовать только внутри данной конкретной популяции. Такой генетический полиморфизм может существовать в клетках из разных популяций или внутри отдельной популяции за счет наличия природных аллельных вариаций. Аллельные варианты могут также включать функциональные эквиваленты. Фрагменты полинуклеотида по настоящему изобретению могут также включать полинуклеотиды,не кодирующие функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут функционировать в качестве зондов или праймеров для ПЦР. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, независимо от того, кодируют они функциональные или нефункциональные полипептиды, могут использоваться в качестве зондов для гибридизации и в качестве праймеров для полимеразной цепьевой реакции (ПЦР). Использование молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, которые не кодируют полипептид с фосфолипазной активностью, включает, в том числе, (1) выделение гена, кодирующего фосфолипазу по настоящему изобретению, или его аллельных вариантов из библиотеки кДНК, например из организмов, отличных от Aspergillusniger, (2) гибридизацию in situ (например, по методике FISH) с метафазными хромосомными пластинками для обеспечения точной хромосомной локализации ФЛП 03 гена, как описано в работе Верма с соавт.(Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); (3) нозерн-блоттинговый анализ для выявления экспрессии мРНК фосфолипазы в специфических тканях и/или клетках и (4) использование зондов и праймеров в качестве диагностического инструмента для анализа наличия нуклеиновой кислоты, гибридизуемой с фосфолипазным зондом в данном биологическом образце (например, в ткани). Настоящее изобретение также относится к способу получения функционального эквивалента гена или кДНК, кодирующих фосфолипазу. Такой способ связан с получением меченого зонда, который включает выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полную последовательность или часть последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15 или ее варианта; с последующим скринингом библиотеки фрагментов нуклеиновой кислоты с меченым зондом в условиях,которые позволяют осуществлять гибридизацию зонда с фрагментами нуклеиновой кислоты из библиотеки с образованием дуплекса нуклеиновой кислоты и с образованием генной последовательности полной длины на основе фрагментов нуклеиновой кислоты от любого меченого дуплекса, что позволяет получить ген, родственный гену фосфолипазы. В одном варианте нуклеиновая кислота по настоящему изобретению по меньшей мере на 40, 45, 50,55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14 или комплементарных последовательностей.- 15008607 В другом предпочтительном варианте полипептид по настоящему изобретению по меньшей мере на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичен аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15. Хозяйские клетки В другом варианте настоящее изобретение относится к клеткам, например трансформированным хозяйским клеткам или рекомбинантным хозяйским клеткам, которые содержат нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Термины "трансформированная клетка" или "рекомбинантная клетка" относятся к клетке, в которую (или в ее предшественник) была введена нуклеиновая кислота по настоящему изобретению, например, по методике рекомбинантной ДНК. В область настоящего изобретения включаются и прокариотические, и эукариотические клетки, например бактерии, грибы, дрожжи и т.п., особенно предпочтительными клетками являются клетки нитчатых грибов, в частности Aspergillus niger. Может быть выбрана хозяйская клетка, которая модулирует экспрессию введенных последовательностей или модифицирует и процессирует генный продукт определенным, желательными образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессирование (например, расщепление) белковых продуктов могут способствовать оптимальному функционированию белка. Различные клетки обладают характерными и специфическими механизмами для осуществления посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Могут быть выбраны соответствующие клеточные линии или системы хозяйских клеток, известные специалистам в области молекулярной биологии и/или микробиологии, которые обеспечивают желательную и корректную модификацию и процессинг экспрессированного чужеродного белка. Для указанных целей могут быть выбраны эукариотические хозяйские клетки, которые обладают клеточным механизмом для осуществления соответствующего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие хозяйские клетки известны в данной области. Хозяйские клетки также включают, без ограничения, клеточные линии млекопитающих, такие как СНО, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3 Т 3, WI38 и клеточные линии сосудистого сплетения (choroidplexus). При необходимости, полипептиды по настоящему изобретению могут быть получены с помощью стабильно трансфицированной клеточной линии. Доступно множество векторов, пригодных для стабильной трансфекции клеток млекопитающих, и широко известны способы конструирования таких клеточных линий (см., например, Ausubel et al., supra). Антитела Настоящее изобретение также относится к антителам, таким как моноклональные или поликлональные антитела, которые специфически связаны с фосфолипазами по настоящему изобретению. В контексте настоящего описания термины "антитело" (Ат) или "моноклональное антитело" (Мат) обозначают интактные молекулы, а также фрагменты антител (такие, как, например, Fab и F(ab')2 фрагменты), которые способны к специфическому связыванию с белком ФЛП 03. Fab и F(ab')2 фрагменты утратили Fc-фрагмент интактного антитела, и, в этой связи, они быстрее удаляются из кровотока и характеризуются меньшей степенью неспецифического связывания с тканями, чем интактные антитела (Wahl etal., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983. Таким образом, указанные фрагменты являются предпочтительными. Антитела по настоящему изобретению могут быть получены с использованием множества способов. Например, клетки, экспрессирующие фосфолипазу и ее антигенный фрагмент, могут быть введены животному для индукции образования сыворотки, содержащей поликлональные антитела. В предпочтительном способе получают препарат фосфолипазы и очищают его с целью, по существу, полного освобождения от природных контаминантов. Такой препарат затем вводят в организм животного для образования поликлональной антисыворотки с большей удельной активностью. В наиболее предпочтительном способе антитела по настоящему изобретению представляют собой моноклональные антитела (или их фрагменты, связывающиеся с фосфолипазой). Такие моноклональные антитела могут быть получены с использованием методики получения гибридом (Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies andT-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981. В целом, такие процедуры включают иммунизацию животного (предпочтительно мыши) белком по настоящему изобретению или клеткой, экспрессирующей белок по настоящему изобретению. Экстрагируют спленоциты из таких мышей и сливают их с соответствующей миеломной клеточной линией. В целях настоящего изобретения может использоваться любая подходящая миеломная клеточная линия, однако, предпочтительно использовать родительскую миеломную клеточную линию (SP2O), доступную из Американской Коллекции типовых культур (American TypeCulture Collection, Rockville, Maryland). После слияния полученные гибридомные клетки селективно поддерживают в среде HAT и затем клонируют методом серийных разведений, как описано, например, в работе Вэндса с соавт. (Wands et al. Gastro-enterology 80: 225-232 (1981. Гибридомные клетки, полученные при таком отборе, затем анализируют для идентификации клонов, которые секретируют антитела,способные связывать белковый антиген ФЛП 03. В основном, полипептиды могут быть связаны с белкомносителем, таким как KLH, как описано в работе Аусубеля с соавт. (Ausubel et al., supra), в смеси с адъювантом и затем инъецированы в организм хозяина млекопитающего.- 16008607 В частности, различные животные-хозяева могут быть иммунизированы путем инъекции полипептида по настоящему изобретению. Примеры подходящих хозяйских организмов включают кроликов,мышей, морских свинок и крыс. Могут использоваться различные адъюванты для повышения иммунологического ответа, в зависимости от вида хозяйского организма, которые включают, без ограничения,адъювант Фрейнда (полный и неполный), адъюванты на основе минеральных гелей, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плуроновые полиоли, полианионы,пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол, вакцина БЦЖ (бацилла Кальмете-Герена) и Corynebacterium parvum. Поликлональные антитела представляют собой гетерогенную популяцию антительных молекул, получаемых из сыворотки иммунизированных животных. Такие антитела могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgE, IgA,IgD и любой их подкласс. Гибридомы, продуцирующие Мат по настоящему изобретению, могут культивироваться in vitro или in vivo. Поликлональные или моноклональные антитела после их получения тестируют на способность к специфическому распознаванию белка по настоящему изобретению или его функционального эквивалента в иммунологическом тесте, таком как вестерн-блоттинг или анализ на основе иммунопреципитации с использованием стандартных методик, описанных, например, в работе Аусубеля с соавт. (Ausubelet al., supra). В настоящем изобретении используют антитела, которые специфически связываются с белком по настоящему изобретению или его функциональными эквивалентами. Например, такие антитела могут использоваться в иммунологическом анализе для выявления белка по настоящему изобретению в патогенных или непатогенных штаммах Aspergillus (например, в экстрактах Aspergillus). Предпочтительно антитела по настоящему изобретению получают с использованием фрагментов белка по настоящему изобретению, которые могут обладать антигенностью, по таким критериям, как высокая частота встречаемости заряженных остатков. Например, такие фрагменты могут быть получены по стандартным методикам осуществления ПЦР и затем клонированы в векторе экспрессии pGEX(Ausubel et al., supra). Белки слияния могут быть затем экспрессированы в E.coli и очищены с помощью аффинной матрицы на основе глютатионагарозы, как описано в работе Аусубеля с соавт. (Ausubel et al.,supra). При необходимости, для каждого белка может быть получено несколько слияний (например, два или три), и каждый такой белок слияния может быть инъецирован по меньшей мере двум кроликам. Образование антисыворотки может быть индуцировано серией инъекций, включающих в типичном случае три бустер-инъекции. В типичном случае антисыворотки тестируют на их способность к иммунопреципитации рекомбинантного полипептида ФЛП 03 или его функциональных эквивалентов, тогда как неродственные белки могут служить контролем для оценки специфичности иммунной реакции. Альтернативно, методики, описанные для получения одноцепочечных антител (патенты США 4946778 и 4704692), могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител к белку по настоящему изобретению или его функциональных вариантов. Наборы для создания и скрининга библиотек фаговой активности выпускаются, например, компанией Farmacia. Дополнительные примеры способов и реагентов, особенно пригодных для использования с целью создания и скрининга библиотеки антител, могут быть найдены в патентной литературе (патент США 5223409; публикация РСТ No. WO 92/18619; публикация РСТ No. WO 91/17271; публикация РСТHybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246; 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734). Поликлональные и моноклональные антитела, которые специфически связываются с белком по настоящему изобретению или его функциональными эквивалентами, могут использоваться, например, для выявления экспрессии гена, кодирующего белок по настоящему изобретению или его функциональный эквивалент, например, в штамме, отличном от Aspergillus. Например, белок по настоящему изобретению может быть без труда обнаружен методами традиционного иммунологического анализа клеток Aspergillus или их экстрактов. Примеры соответствующих методик включают, без ограничения, вестерн-блоттинг,ИФТФА, радиоиммуноанализ (РИА) и т.п. Термин "специфически связывается" в контексте настоящего описания означает, что антитело распознает и связывается с конкретным антигеном, например белком по настоящему изобретению, но, по существу, не распознает и не связывается с другими неродственными молекулами в образце. Антитела могут очищены, например, методами аффинной хроматографии, в которых полипептидный антиген иммобилизован на смоле. Антитела (например, моноклональные антитела) к белку по настоящему изобретению могут использоваться для выделения белка стандартными методиками, такими как аффинная хроматография или иммунопреципитация. Кроме того, такие антитела могут использоваться для обнаружения белка (например, в клеточном лизате или супернатанте клеток) для оценки наличия и картины экспрессии белка. Антитела могут также использоваться в методах диагностики для оценки уровня белка в клетках или тканях как часть процедуры клинического тестирования, например для определения эффективности данного режима лечения или при диагностике аспергиллеза.- 17008607 Связывание антитела с выявляемым веществом может облегчать его обнаружение. Примеры выявляемых веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы,люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, -галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; примером люминесцентного материала является люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и акворин; примеры подходящих радиоактивных материалов включают 125I, 131I, 35S или 3 Н. Предпочтительные эпитопы антигенного пептида представляют собой участки, которые расположены на поверхности белка, например гидрофильные участки. Для идентификации гидрофильных участков могут быть использованы карты гидрофобности белков. Антигенный пептид или белок по настоящему изобретению включает по меньшей мере 7, предпочтительно 10, 15, 20 или 30 последовательных аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15, и охватывают эпитоп белка,так что индуцированное против пептида антитело образует специфический иммунный комплекс с данным белком. Предпочтительные эпитопы, имеющиеся на антигенном пептиде, представляют собой участки белка по настоящему изобретению, которые расположены на поверхности белка, например гидрофильные участки, гидрофобные участки, участки, содержащие альфа-спирали, участки, содержащие бета-цепи или бета-складчатую конформацию, спиральные участки, участки с завитой структурой и гибкие участки. Иммунологические анализы Качественное или количественное определение белка по настоящему изобретению в биологическом образце может быть осуществлено с использованием любого известного в данной области метода. Методики, основанные на действии антител, имеют определенное преимущество при анализе уровня конкретного полипептида в биологическом образце. В таких процедурах специфическое распознавание обеспечивается первичным антителом (поликлональным или моноклональным), тогда как вторичная система обнаружения может использовать флуоресцентное антитело, энзимсвязанное антитело или другие конъюгированные вторичные антитела. В результате образуется иммунный комплекс. Соответственно, настоящее изобретение относится к способу диагностики инфекции определенного организма Aspergillus, включающего стадии: выделения биологического образца из указанного организма, в отношении которого имеется подозрение на инфицирование Aspergillus,проведения реакции указанного образца с антителом по настоящему изобретению,выявления наличия образованных иммунных комплексов. Ткани могут быть также экстрагированы, например, с использованием мочевины и нейтрального детергента для высвобождения белка с целью использования в вестерн-блоттинге или дот/слот-анализе. Такие методики могут также применяться для анализа жидкостей организма. Другие способы, основанные на использовании антител для выявления белка по настоящему изобретению, включают методы иммуноанализа, такие как иммуноферментный твердофазный анализ(ИФТФА) и радиоиммуноанализ (РИА). Например, моноклональные антитела к белку по настоящему изобретению могут использоваться как в качестве иммуносорбента, так и в качестве меченного ферментом зонда для обнаружения и количественного определения белка по настоящему изобретению. Количество конкретного белка, присутствующего в образце, может быть вычислено относительно его количества, присутствующего в стандартном препарате, с использованием компьютерного алгоритма линейной регрессии. В другом методе ИФТФА могут использоваться два разных специфических моноклональных антитела для выявления белка по настоящему изобретению в биологической жидкости. В рамках такого анализа одно из антител используют в качестве иммуносорбента, а второе - в качестве меченного ферментом зонда. Указанные выше методики могут осуществляться, по существу, в режиме одностадийного или двустадийного анализа. Одностадийный анализ включает приведение в контакт белка по настоящему изобретению с иммобилизованным антителом с последующим приведением смеси, без промывки, в контакт с меченым антителом. Двустадийный анализ включает промывку перед осуществлением контакта смеси с меченым антителом. Другие традиционные способы также могут использоваться согласно потребности. Обычно бывает желательно иммобилизовать один компонент анализируемой системы на подложке, что позволяет привести другие компоненты системы в контакт с данным компонентом и затем легко удалить из образца. Подходящие для мечения ферменты включают, например, ферменты оксидазной группы, которые катализируют образование перекиси водорода при взаимодействии с субстратом. Активность оксидазной метки может быть проанализирована путем измерения концентрации перекиси водорода, образуемого в реакции меченного ферментом антитела/субстрата. Другие приемлемые метки, кроме ферментов, включают радиоактивные изотопы, такие как йод- 18008607 метки, такие как флуоресцеин и родамин, а также биотин. Специфическое связывание исследуемого соединения с белком по настоящему изобретению может быть выявлено, например, in vitro путем обратимой или необратимой иммобилизации белка по настоящему изобретению на субстрате, например на поверхности ячейки в 96-ячеечном полистироловом микротитрационном планшете. Способы иммобилизации полипептидов и других малых молекул известны в данной области техники. Например, микротитрационные планшеты могут быть покрыты белком по настоящему изобретению путем добавления к каждой ячейке белка в растворе (в типичном случае в концентрации 0,05-1 мг/мл в объеме 1-100 мкл) с последующей инкубацией планшетов при температуре от комнатной до 37 С в течение периода времени от 0,1 до 36 ч. Белки, которые не связываются с планшетом, могут быть удалены с избытком раствора из планшета путем встряхивания с последующей промывкой планшета (однократной или повторной) водой или буфером. В типичном случае полипептид содержится в воде или буфере. Затем планшет промывают буфером, который удаляет связанный полипептид. Для блокирования свободных сайтов связывания белка на планшетах на указанные планшеты вносят для блокирования белок, не родственный связанному полипептиду. Например, можно использовать 300 мкл бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрации 2 мг/мл в Трис-НСl. Приемлемые субстраты включают такие субстраты, которые обладают определенной сшитой структурой (например, пластиковые субстраты, такие как полистироловые, стироловые или полипропиленовые субстраты, например, от компании Корнинг Костар (Corning Costar Corp. (Cambridge, MA. При желании, в качестве субстрата могут использоваться гранулярные частицы, например гранулярная агароза или гранулярная сефароза. Связывание исследуемого соединения с белками по настоящему изобретению может быть обнаружено с помощью множества известных в технике способов. Так, например, в иммуноанализе может использоваться специфическое антитело. При необходимости, антитело может быть помечено (например,флуоресцентной или радиоизотопной меткой) и выявлено непосредственно (см., например, West andMcMahon, J. Cell. Biol. 74:264, 1977). Альтернативно, для выявления может использоваться второе антитело (например, меченое антитело, которое связывает Fc-часть антитела к AN97). В альтернативном способе обнаружения белок по настоящему изобретению метят (например, путем мечения белка по настоящему изобретению радиоактивным изотопом, флуорофором, хромофором и т.п.) и затем выявляют введенную метку. Еще в одном способе белок по настоящему изобретению получают в виде белка слияния с белком, который может быть выявлен оптическим методом, например с зеленым флуоресцентным белком (который может быть обнаружен в УФ-свете). В альтернативном методе белок по настоящему изобретению может быть ковалентно присоединен или слит с ферментом, обладающим выявляемой ферментативной активностью, таким как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, -галактозидаза и глюкозооксидаза. Гены, кодирующие все такие ферменты, были клонированы и доступны специалистам в данной области для работы. При необходимости, белок слияния может включать антиген, и такой антиген может быть выявлен и количественно определен с помощью поликлонального или моноклонального антитела по традиционным методикам. Подходящие антигены включают ферменты (например, пероксидазу хрена,щелочную фосфатазу, -галактозидазу) и неферментативные полипептиды (например, сывороточные белки, такие как БСА и глобулины, а также белки молока, такие как казеины). Эпитопы, антигены и иммуногены В другом аспекте настоящее изобретение относится к пептиду или полипептиду, включающему эпитопсодержащую часть полипептида по настоящему изобретению. Эпитоп указанной части полипептида представляет собой иммуногенный или антигенный эпитоп полипептида по настоящему изобретению. Термин "иммуногенный эпитоп" определяется как часть белка, которая проявляет антительную реакцию, когда целый белок является иммуногеном. Считается, что указанные иммуногенные эпитопы ограничены несколькими локусами молекулы. С другой стороны, участок белковой молекулы, к которому может присоединяться антитело, определяется как "антигенный эпитоп". Количество иммуногенных эпитопов в белке, в основном, меньше, чем количество антигенных эпитопов (см., например, Geysen,H.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984. Что касается выбора пептидов или полипептидов, несущих антигенный эпитоп (то есть участок белковой молекулы, с которым может связаться антитело), то в данной области хорошо известно, что относительно короткие синтетические пептиды, которые имитируют часть белковой последовательности, обычно способны проявлять свойства антисыворотки, которая реагирует с частично имитированным белком (см., например, Sutcliffe, J.G. et al., Science 219:660-666 (1984. Пептиды, способные проявлять свойства сывороток, реактивных в отношении белка, которые зачастую отражаются в первичной последовательности белка, могут быть охарактеризованы набором простых химических правил, которые не ограничиваются ни иммунодоминантными участками интактных белков (например, иммуногенными эпитопами), ни амино- или карбоксильными концами. Пептиды, которые характеризуются чрезвычайной гидрофобностью, и пептиды, содержащие шесть или менее остатков, в основном, не эффективны с точки зрения индукции антител, которые связываются с имитированными белками; тогда как более длинные растворимые пептиды, особенно пептиды, содержащие пролиновые остатки, обычно эффективны (Sutcliffe- 19008607 руководств, которые содержат 8-39 остатков, охватывающих 75% последовательности полипептидной цепи гемагглютинина вируса гриппа HAI, индуцируют антитела, которые взаимодействуют с НА 1 белком или интактным вирусом, и 12/12 пептидов на основе полимеразы MuLV и 18/18 на основе гликопротеина вируса бешенства индуцируют антитела, которые осаждают соответствующие белки. В этой связи пептиды и полипептиды по настоящему изобретению, несущие антигенные эпитопы,могут использоваться для индукции антител, включая моноклональные антитела, которые специфически связываются с полипептидом по настоящему изобретению. Таким образом, высокая доля гибридом, получаемых при слиянии селезеночных клеток от доноров, иммунизированных пептидом с антигенным эпитопом, в основном, секретирует антитело, реактивное с нативным белком (Sutcliffe, et al., supra, at 663). Антитела, индуцированные пептидами или полипептидами, несущими антигенные эпитопы, используются для обнаружения имитированного белка, а антитела к различным пептидам могут использоваться для отслеживания метаболизма различных участков белкового предшественника, который подвергается посттрансляционному процессингу. Пептиды и непептидные антитела могут использоваться в различных качественных и количественных методах анализа имитированного белка, например в конкурентном анализе, поскольку было показано, что даже короткие пептиды (например, включающие около 9 аминокислот) могут связываться и замещать более крупные пептиды в тестах с иммунопреципитацией(см., например, Wilson, I.A., et al., Cell 37:767-778 at 777 (1984. Антитела к пептидам по настоящему изобретению также используются для очистки имитированного белка, например, с помощью абсорбционной хроматографии с использованием известных в данной области методов. Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению, несущие антигенные эпитопы, разработанные в соответствии с указанными выше руководствами, предпочтительно содержат последовательность,включающую по меньшей мере 7, более предпочтительно по меньшей мере 9 и наиболее предпочтительно по меньшей мере от примерно 15 до примерно 30 аминокислот в составе аминокислотной последовательности полипептида по настоящему изобретению. Однако пептиды или полипептиды, включающие более крупный участок аминокислотной последовательности полипептида по настоящему изобретению,содержащие от примерно 30 до примерно 50 аминокислот, или участок любой другой длины, вплоть до полной аминокислотной последовательности полипептида по настоящему изобретению, также рассматриваются как пептиды или полипептиды по настоящему изобретению, несущие эпитопы, и также используются для индукции антител, которые взаимодействуют с имитированным белком. Предпочтительно аминокислотную последовательность пептида, несущего эпитопы, выбирают таким образом, чтобы обеспечить существенную растворимость в водных растворителях (например, последовательность включает относительно гидрофильные остатки, тогда как высоко гидрофобные последовательности предпочтительно не используются); и особенно предпочтительны последовательности, содержащие пролиновые остатки. Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению, несущие эпитопы, могут быть получены традиционными способами получения пептидов или полипептидов, включая рекомбинантные способы с использованием молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Например, короткая аминокислотная последовательность, несущая эпитоп, может быть слита с более крупным полипептидом,который действует как носитель в процессе рекомбинантного получения и очистки, а также в процессе иммунизации для индукции антител к пептиду. Пептиды, несущие эпитоп, могут быть также синтезированы с использованием известных методов химического синтеза. Например, Houghten описал простую методику синтеза большого числа пептидов,таких как по 10-20 мг 248 разных пептидов из 13 остатков, представляющих варианты сегмента HAI полипептида по одной аминокислоте, который был получен и охарактеризован (в исследованиях по связыванию с использованием ИФТФА) менее чем за 4 недели (Houghten, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1985. Указанный процесс "одновременного множественного пептидного синтеза" (ОМПС)(1986. В этой процедуре отдельные смолы для твердофазного синтеза различных пептидов содержатся в отдельных пакетах, проницаемых для растворителя, что позволяет оптимально использовать многие идентичные повторяющиеся стадии, входящие в методики твердофазного синтеза. Полностью ручная процедура позволяет осуществлять одновременно 500-1000 или более синтезов (Houghten, et al., supra, at 5134). Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению, несущие эпитоп, могут использоваться для индукции антител по настоящему изобретению в соответствии с методиками, известными в данной области (см., например, Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914; and Bittle, F.J. et al., J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985. В целом, в соответствии с указанными методиками животные могут быть иммунизированы свободным пептидом; однако, титр антител к пептиду может быть получен бустинг-инъекцией при связывании пептида с макромолекулярным носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (ГЛУ) или столбнячный токсин. Например, пептиды, содержащие цистеин, могут быть связаны с носителем с использованием линкера, такого как малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир (МБС), тогда как другие пептиды могут быть связаны с носителем с использованием более универсального связывающего средства, такого как глутаральдегид. Животных,таких как кролики, крысы и мыши, иммунизируют либо свободным пептидом, либо связанным с носителем, например, путем внутрибрюшинной и/или внутрикожной инъекции эмульсий, содержащих пример- 20008607 но 100 мкг пептидного или белкового носителя и адъюванта Фрейнда. Может потребоваться несколько бустинг-инъекций, например, с интервалами примерно 2 недели для достижения полезного титра антител к белку, который может быть обнаружен, например, методом ИФТФА с использованием свободного пептида, сорбированного на твердой поверхности. Титр антител к пептиду в сыворотке иммунизированного животного может быть повышен при отборе противопептидных антител путем сорбции пептида на твердой подложке и элюции выбранных антител по известным в технике методикам. Пептиды по настоящему изобретению, несущие иммуногенный эпитоп, то есть те части белка, которые проявляют антительную реакцию, когда целый белок является иммуногеном, идентифицируют по известным в технике методикам. Например, Гейсен с соавт. (Geysen et al., supra 1984) описывает процедуру быстрого одновременного синтеза на твердых подложках сотен пептидов с достаточной степенью чистоты, способных демонстрировать реакцию в иммуноферментном твердофазном анализе. При этом взаимодействие синтезированных пептидов с антителами легче выявляется без удаления их с подложки. В таком варианте пептид, несущий иммуногенный эпитоп желаемого белка, может быть идентифицирован обычными способами специалистом со средним уровнем знаний в данной области. Например, Гейсен с соавт. (Geysen et al.) локализовал иммунологически важный эпитоп в белке оболочки вируса ящура с разрешением 7 аминокислот путем синтеза перекрывающегося набора из всех 208 возможных гексапептидов, охватывающих полностью последовательность белка из 213 аминокислот. Затем был синтезирован полный набор замещающих пептидов, в котором все 20 аминокислот были, в свою очередь, замещены по каждому положению внутри эпитопа, и были определены конкретные аминокислоты, придающие специфичность реакции с антителом. Таким образом, этим способом были получены пептидные аналоги пептидов по настоящему изобретению, несущих эпитоп. В патенте США 4708781 (Geysen (1987 описан также способ идентификации пептида, несущего иммуногенный эпитоп желаемого белка. Кроме того, в патенте США 5194392 (Geysen (1990 описывается общий способ выявления или определения последовательности мономеров (аминокислот или других соединений), которые топологически эквивалентны эпитопу (например, "мимотопу"), который комплементарен конкретному паратопу(антигенсвязывающему сайту) целевого антитела. В более общей форме в патенте США 4433092(Geysen (1989 описывается способ выявления или определения последовательности мономеров, которая является топографическим эквивалентом лиганда, комплементарного к сайту связывания лиганда конкретного целевого рецептора. Аналогично в патенте США 5480971 (Houghten, R.A. et al. (1996) OnPeralkylated Oligopeptide Mixtures) раскрываются линейные С 1-С 7-алкильные пералкилированные олигопептиды, а также наборы и библиотеки таких пептидов и способы использования таких наборов и библиотек для определения последовательности пералкилированного пептида, который предпочтительно связывается с акцепторной целевой молекулой. Таким образом, с помощью указанных способов могут быть получены непептидные аналоги пептидов по настоящему изобретению, несущих эпитоп. Применение фосфолипаз в промышленных процессах Настоящее изобретение также относится к применению фосфолипазы по настоящему изобретению в ряде промышленных и фармацевтических способов. Хотя накоплен длительный опыт осуществления этих способов, фосфолипаза по настоящему изобретению, тем не менее, имеет множество существенных преимуществ в сравнении с ферментами, используемыми в настоящее время. В зависимости от конкретного варианта применения, такие преимущества могут включать аспекты, связанные с меньшими затратами на производство продукции, большей специфичностью к субстрату, меньшими антигенными свойствами, менее выраженными нежелательными явлениями, большим выходом при получении в соответствующем микроорганизме, более удобным диапазоном приемлемых рН и температуры, лучшим вкусом готового продукта, а также аспекты, связанные с качеством пищи и ее кошерными свойствами. Важный аспект фосфолипаз по настоящему изобретению заключается в том, что они охватывают широкий диапазон оптимальных значений рН и температуры, которые идеально подходят для множества направлений их применения. Например, во многих крупномасштабных процессах выгодно использовать относительно высокие температуры: 50 С или выше, например, для снижения риска микробного заражения. Некоторые фосфолипазы по настоящему изобретению удовлетворяют такому требованию, но в то же время они не обладают достаточным уровнем термостабильности, чтобы противостоять последующей инактивации путем дополнительной тепловой обработки. Последняя особенность позволяет осуществлять режим производства, который приводит к получению готовых продуктов, таких как хлебобулочные изделия, не содержащих следов ферментативной активности. Кроме того, многие пищевые и кормовые продукты имеют слегка кислые значения рН, так что для их обработки предпочтительны фосфолипазы с кислым или почти нейтральным оптимумом рН. Фосфолипазы по настоящему изобретению соответствуют также и такой потребности. Фосфолипазы по настоящему изобретению могут найти применение в любом практическом варианте, где желательно гидролизовать фосфолипид или получить специфические продукты его расщепления. Так, например, полипептиды по настоящему изобретению позволяют получать лизофосфолипиды, диацилглицерины, холин- или этаноламинфосфаты, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин и различные фосфатидаты. Фосфолипазы по настоящему изобретению предпочтительно используют при значении рН, оптимальном для их активности.- 21008607 Фосфолипазы по настоящему изобретению могут использоваться для дегумирования водного раствора или взвеси углеводов для улучшения свойств фильтруемости, в частности гидролизата крахмала и особенно гидролизата пшеничного крахмала, который трудно фильтруется и дает мутные фильтраты. Обработка может проводиться с использованием известных в технике методов. См., например, ЕР-А 219269 и ЕР-А-808903. Фосфолипазы по настоящему изобретению могут использоваться в способе снижения содержания фосфолипидов в пищевом масле путем обработки масла полипептидом для гидролиза основной части фосфолипида и отделения водной фазы, содержащей гидролизованный фосфолипид, от масла. Такой способ применим для очистки любого пищевого масла, которое содержит фосфолипид, например растительного масла, такого как соевое масло, рапсовое масло и подсолнечное масло. Перед обработкой фосфолипазой масло предпочтительно подвергают предварительной обработке для удаления слизи (растительного клея), например, путем влажного рафинирования. В типичном случае масло содержит 50-250 м.д. фосфора в виде фосфолипида в начале обработки фосфолипазой, тогда как обработка может снизить уровень фосфора до значений менее 5-10 м.д. Обработку фосфолипазой проводят при диспергировании водного раствора фосфолипазы, предпочтительно в виде капелек со средним диаметром менее 10 мкм. Количество воды составляет предпочтительно 0,5-5 мас.% относительно масла. Может быть необязательно добавлен эмульгатор. Может быть также применено механическое перемешивание для поддержания эмульсии. Фосфолипазную обработку проводят в диапазоне рН от примерно 3,5 до примерно 5 с целью максимизации действия фермента, или может использоваться рН в диапазоне от примерно 1,5 до примерно 3(например, 2-3) для подавления щелочного гидролиза триглицеридов (сапонификации). Соответствующее значение рН может быть доведено при добавлении лимонной кислоты, цитратного буфера или хлористо-водородной кислоты. Приемлемая температура составляет, в основном, 30-70 С (в частности, 3045 С, например 35-40 С). Время реакции составляет в типичном случае 1-12 ч (например, 2-6 ч). Подходящая дозировка фермента составляет 0,1-10 мг на литр (например, 0,5-5 мг на литр). Фосфолипазная обработка может проводиться периодически в партиях, например, в чане при перемешивании или может осуществляться в непрерывном режиме, например, в серии реакторов при перемешивании. После фосфолипазной обработки проводят разделение водной фазы и масляной фазы. Разделение может осуществляться традиционными способами, например путем центрифугирования. Водная фаза будет содержать фосфолипазу, при этом фермент может повторно использоваться для повышения экономичности процесса. Обработка может проводится с использованием любой известной в технике методики. См., например,патент США 5264367, ЕР-А-654527, JP-А-153997. Хлебобулочные изделия получают из теста, которое обычно делают из базовых ингредиентов,включающих муку, воду и необязательно соль. В зависимости от вида хлебобулочных изделий, другими необязательными ингредиентами могут быть сахара, вкусовые вещества и т.п. Для получения продуктов из разрыхленного теста используют преимущественно пекарские дрожжи, а также химические разрыхляющие системы, такие как сочетание кислоты (выделяющее ее соединение) и бикарбонат. Для улучшения свойств теста, способствующих обработке и/или улучшающих качество готовых хлебобулочных изделий, предпринимаются непрерывные попытки по разработке процессов, способствующих улучшению таких свойств. Свойства теста, подлежащие улучшению, включают его податливость к машинной обработке, способность удерживать газ и т.п. Свойства хлебобулочных изделий, которые могут быть улучшены, включают объем батона, хрустящие свойства корочки, крошливую структуру и мягкость, вкус,запах и срок годности. Существующие в настоящее время вспомогательные средства для обработки могут быть разделены на две группы: химические добавки и ферменты. Химические добавки, направленные на улучшение таких свойств, включают окислители, такие как аскорбиновая кислота, бромат и азодикарбонат, восстановители, такие как L-цистеин и глютатион,эмульгаторы, действующие в качестве кондиционеров теста, такие как диацетилвинные эфиры моно/диглицеридов (ДАВЭМ), стеароиллактилат натрия (СЛН) или стеароиллактилат кальция (СЛК), или действующие в качестве смягчителей мякиша, такие как моностеарат глицерина (МСГ), жирные материалы,такие как триглицериды (жир) или лецитин, и другие. В настоящее время наблюдается тенденция к замене химических добавок ферментами. Последние рассматриваются как более натуральные соединения и, в этой связи, более приемлемые для потребителей. Подходящие ферменты могут быть выбраны из группы, состоящей из ферментов, разлагающих крахмал, ферментов, разлагающих арабиноксилан- и другие гемицеллюлозы, ферментов, разлагающих целлюлозу, окислительных ферментов, ферментов, расщепляющих жирный материал, и ферментов деградации белка. Настоящее изобретение также относится к способам приготовления теста или хлебобулочного изделия, включающим введение в тесто эффективного количества фосфолипазы по настоящему изобретению, которое улучшает одно или более свойств теста или хлебобулочного изделия, получаемого из этого теста, в сравнении с тестом или хлебобулочным изделием без включения указанного полипептида. Фраза "введение в тесто" в контексте настоящего описания означает добавление фосфолипазы по настоящему изобретению к тесту, любому ингредиенту, из которого может быть получено тесто, и/или- 22008607 любой смеси ингредиентов, из которой изготавливается тесто. Иными словами, фосфолипаза по настоящему изобретению может быть добавлена на любой стадии приготовления теста, причем она может быть добавлена на одной, двух или более стадиях. Фосфолипазу по настоящему изобретению добавляют к ингредиентам теста, которые замешиваются и используются для выпечки хлебобулочных изделий по известным в технике способам. См., например, патент США 4567046, ЕР-А-426211, JP-A-60-78529, JPA-62-111629 и JP-A-63-258528. Термин "эффективное количество" в контексте настоящего описания обозначает количество фосфолипазы по настоящему изобретению, которого достаточно для появления измеряемого эффекта по меньшей мере одного требуемого свойства теста или хлебобулочного изделия. Термин "улучшенное свойство" в контексте настоящего описания обозначает любое свойство теста и/или продукта, получаемого из теста, в частности хлебобулочного изделия, которое улучшается под действием фосфолипазы по настоящему изобретению в сравнении с тестом или продуктом, не содержащим фосфолипазу по настоящему изобретению. Улучшенное свойство может включать, без ограничения, повышенную силу теста, повышенную эластичность теста, повышенную стабильность теста, сниженную липкость теста, улучшенную растяжимость теста, улучшенный запах хлебобулочного продукта,повышенную устойчивость хлебобулочного изделия против черствения. Улучшенное свойство может быть выявлено при сравнении теста и/или хлебобулочного изделия,приготовленного при добавлении или без добавления полипептида по настоящему изобретению в соответствии со способами согласно изобретению, которые описаны ниже в примерах. Органолептические показатели могут быть оценены с использованием процедур, известных в хлебобулочной промышленности, и могут включать, например, использование набора тестеров вкуса. Термин "повышенная сила теста" в контексте настоящего описания обозначает свойство теста, которое имеет отношение к большей эластичности и/или определяет потребность в более сильном воздействии для формования теста. Термин "повышенная эластичность теста" в контексте настоящего описания обозначает свойство теста, которое определяет повышенную тенденцию теста восстанавливать исходную форму после действия на него некоторого физического усилия. Термин "повышенная стабильность теста" в контексте настоящего описания обозначает свойство теста, которое определяет меньшую чувствительность к механической деформации, что позволяет лучше поддерживать его форму и объем. Термин "сниженная липкость теста" в контексте настоящего описания означает свойство теста, которое определяет меньшую тенденцию прилипать к поверхностям, например, при машинном замешивании теста, и эту способность либо оценивается эмпирически опытным пекарем, либо ее измеряют с помощью анализатора консистенции (например, ТАХТ 2), известного в данной области техники. Термин "улучшенная растяжимость теста" в контексте настоящего описания обозначает свойство теста, которое определяет его способность поддаваться усилию или растяжению без разрыва. Термин "улучшенная машинабельность теста" в контексте настоящего описания обозначает свойство теста, которое определяет его меньшую липкость, и/или большую плотность, и/или большую эластичность. Термин "повышенный объем хлебобулочного изделия" измеряется как удельный объем данной буханки хлеба (объем/вес), определяемый в типичном случае по традиционному способу смещения с использованием рапса. Термин "улучшенная консистенция мякиша хлебобулочного изделия" в контексте настоящего описания обозначает свойство хлебобулочного изделия, определяющее наличие мелких и/или тонких ячеек в мякише и/или более однородное/гомогенное распределение таких ячеек в мякише, и обычно оценивается эмпирически опытным пекарем. Термин "улучшенная мягкость хлебобулочного изделия" означает свойство, противоположное твердости, и определяется в контексте настоящего описания как способность хлебобулочного изделия поддаваться более легкому прессованию, которая оценивается либо эмпирически опытным пекарем, либо определяется при использовании анализатора консистенции (например, ТАХТ 2), известного в данной области техники. Термин "улучшенный вкус хлебобулочного изделия" определяется дегустационной комиссией. Термин "повышенная устойчивость хлебобулочного изделия против черствения" определяется в контексте настоящего описания как свойство хлебобулочного изделия, которое определяет сниженную скорость ухудшения параметров его качества, таких как мягкость и/или эластичность, при хранении. Термин "тесто" в контексте настоящего описания определяется как смесь муки и других ингредиентов, достаточно твердая для замешивания и раскатывания. Тесто может быть свежим, замороженным,подвергнутым предварительному осаждению и предварительной выпечке. Получение замороженного теста описано Кульпом и Лоренцом (Kulp and Lorenz in Frozen and Refrigerated Doughs and Batters). Термин "хлебобулочное изделие" в контексте настоящего описания определяется как любой продукт, полученный из теста, либо мягкого, либо хрустящего характера. Примеры хлебобулочных изделий белого, светлого или темного типа, которые могут с успехом быть получены по настоящему изобретению, включают хлеб (в частности, белый, на основе муки из цельного зерна или рисовый хлеб), обычно в- 23008607 форме буханок или булочек, батонов типа французского багета, изделий из макаронного теста, лаваша,плоских маисовых лепешек, маисовых лепешек с начинкой, кексов, блинов, бисквитов, печенья, пирогов,заварного хлеба, хрустящих хлебцев и т.п. Фосфолипазы по настоящему изобретению и/или дополнительный фермент, используемые в способах настоящего изобретения, могут иметь любую форму, пригодную для данного направления использования, например могут иметь вид сухого порошка, агломерированного порошка или гранулята, в частности обеспыленного гранулята, жидкости, в частности стабилизированной жидкости, или защищенного фермента, такого как описан в WO 01/11974 и WO 02/26044. Грануляты и агломерированные порошки могут быть получены традиционными способами, например путем разбрызгивания фосфолипазы по настоящему изобретению на носитель в грануляторе с псевдоожиженным слоем. Носитель может состоять из ядра, включающего частицы соответствующего размера. Указанный носитель может быть растворимым или нерастворимым, представляя собой, например, соль (такую, как NaCl или сульфат натрия), сахар (такой, как сахароза или лактоза), сахарный спирт (такой, как сорбит), крахмал, рис, кукурузную крупу или сою. Фосфолипаза по настоящему изобретению и/или дополнительные ферменты могут входить в состав композиции с медленным высвобождением. Способы получения композиции с медленным высвобождением известны в данной области техники. Добавление приемлемых для пищевых продуктов стабилизаторов, таких как сахар, сахарный спирт или другой полиол и/или молочная кислота или другая органическая кислота, в соответствии с известными способами могут, в частности, способствовать стабилизации препаратов жидкого фермента. Фосфолипазы по настоящему изобретению могут быть также включены в дрожжевые композиции,как описано, например, в ЕР-А 0619947, ЕР-А-0659344 и WO 02/49441. Для введения муки в предварительно приготовленную смесь предпочтительно, чтобы полипептид по настоящему изобретению имел вид сухого продукта, например обеспыленного гранулята, тогда как для введения ее вместе с жидкостью предпочтительно, чтобы он был в жидкой форме. В тесто могут быть включены один или более дополнительных ферментов. Дополнительные ферменты могут быть любой природы, включая в качестве источника организм млекопитающего и растения,и предпочтительно микробного происхождения (из бактерий, дрожжей или грибов), которые могут быть получены по известным в данной области методикам. В предпочтительном варианте осуществления изобретения дополнительный фермент может представлять собой амилазу, такую как альфа-амилазу (используемую для получения cахаров, ферментируемых дрожжами, и замедления черствения) или бета-амилазу, циклодекстринглюканотрансферазу, пептидазу, в частности экзопептидазу (используемую для усиления вкуса), трансглутаминазу, липазу (используемую для модификации липидов, имеющихся в тесте или его компонентах, для смягчения теста), фосфолипазу, целлюлазу, гемицеллюлазу, в частности пентозаназу, такую как ксиланаза (используемую для частичного гидролиза пентозанов, что повышает растяжимость теста), протеазу (используемую для ослабления клейковины, в частности, в случае твердых сортов пшеницы), дисульфидизомеразу белка, например дисульфидизомеразу белка, описанную в WO 95/00636, гликозилтрансферазу, пероксидазу (используемую для улучшения консистенции теста), лакказу или оксидазу, например глюкозооксидазу, гексозооксидазу, альдозооксидазу, пиранозооксидазу, липоксигеназу или оксидазу L-аминокислоты (используемую для улучшения консистенции теста). В том случае, когда в соответствии со способами согласно изобретению добавляется одна или более дополнительных ферментативных активностей, указанные активности могут вводиться отдельно или вместе с полипептидом по настоящему изобретению, необязательно в качестве компонента(ов) композиции, улучшающего(их) качество хлебобулочных изделий и/или теста. Другие ферментативные активности могут представлять собой любую ферментативную активность из приведенного выше перечня и могут вводиться в дозе, установленной в хлебопекарной практике. Настоящее изобретение также относится к способам получения хлебобулочного изделия, включающим выпечку теста, получаемого по способу согласно изобретению с получением хлебобулочного продукта. Выпечка теста с получением хлебобулочного изделия может проводиться с использованием известных в технике методов. Настоящее изобретение также относится к тесту и хлебобулочным изделиям, соответственно, получаемым по способу согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к предварительно приготовленной смеси, например к мучной смеси для приготовления теста и/или выпечки из теста хлебобулочных изделий, где указанная предварительно приготовленная смесь включает полипептид по настоящему изобретению. Термин "предварительно приготовленная смесь" в контексте настоящего описания понимается в традиционном значении, то есть как смесь хлебопекарных средств, включающих, в основном, муку, которая может использоваться не только на заводах/устройствах для крупномасштабной выпечки хлеба, но также в небольших пекарнях. Предварительно приготовленная смесь может быть получена при смешивании полипептида или композиции, улучшающей качество хлебобулочных изделий и/или теста по настоящему изобретению, которая включает полипептид в сочетании с соответствующим носителем, таким как мука, крахмал,сахар или соль. Предварительно приготовленная смесь может содержать другие добавки для улучшения- 24008607 качества теста и/или хлебобулочных изделий, например любые добавки из указанного выше перечня,включая ферменты. Настоящее изобретение также относится к добавкам для выпечки хлебобулочных изделий в виде гранулята или агломерированного порошка, которые включают полипептид по настоящему изобретению. Добавки для выпечки хлебобулочных изделий предпочтительно характеризуются узким диапазоном распределения размера частиц, где более 95 мас.% частиц имеет размер в диапазоне от 25 до 500 мкм. Способ согласно изобретению в аспекте изготовления теста и хлебобулочных изделий может использоваться в сочетании с указанными выше средствами, улучшающими обработку, такими как химические вспомогательные средства типа окислителей (например, аскорбиновая кислота), восстановители(например, L-цистеин), оксидоредуктазы (например, глюкозооксидаза) и/или другие ферменты, такие как ферменты модификации полисахаридов (например, -амилаза, гемицеллюлаза, разветвляющие ферменты и т.п.) и/или ферменты модификации белка (эндопротеаза, экзопротеаза, разветвляющие ферменты и т.п.). Пример 1. Ферментация Aspergillus niger. Фосфолипазы, кодируемые нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению, получают путем конструирования плазмид экспрессии, содержащих последовательности ДНК, трансформации штамма A. niger указанной плазмидой и выращивания штаммов Aspergillus niger указанным ниже способом. Свежие споры (106-107) штаммов A. niger инокулируют в 20 мл CSL-среды (колба на 100 мл с отражательной перегородкой), выращивают в течение 20-24 ч при 34 С и скорости качания 170 об./мин. После инокуляции 5-10 мл CSL предкультуры в 100 мл среды CSM (колба на 500 мл с отражательной перегородкой) штаммы ферментируют при 34 С и скорости качания 170 об./мин в течение 3-5 дней. Бесклеточные супернатанты получают при центрифугировании в пробирках Грейнера на 50 мл (30 мин,5000 об./мин). Супернатанты подвергают предварительному фильтрованию через стеклянный микроволоконный фильтр GF/A Whatman (150 мм ) для удаления крупных частиц, доводят (при необходимости) значение рН до 5 с помощью 4 н. КОН и подвергают стерильному фильтрованию через фильтр с размером пор 0,2 мкм (насаженный на верх бутыли) с отсосом для удаления грибного материала. Супернатант хранят при 4 С (или при -20 С).CSL среда состоит из (в количестве на литр): 100 г твердой кукурузной замочной жидкости(Basildon). Ингредиенты растворяют в деминерализованной воде и доводят значение рН до 5,8 с использованием NaOH или H2SO4; колбы на 100 мл с отражательной перегородкой и пенными шариками заполняют 20 мл ферментированного бульона и стерилизуют в течение 20 мин при 120 С, после чего к каждой колбе, охлажденной до комнатной температуры, добавляют 200 мкл раствора, содержащего 5000 МЕ/мл пенициллина и 5 мг/мл стрептомицина. Среда CSM состоит из (в количестве на литр): 150 г мальтозы х Н 2O, 60 г пептона Сойтон (Soytone),1 г NaH2PO4 x Н 2O, 15 г MgSO4 х 7 Н 2O, 0,08 г Твина 80, 0,02 г пеногасителя Базилдон (Basildon), 20 гMES, 1 г L-аргинина. Ингредиенты растворят в деминерализованной воде и доводят значение рН до 6,2 с использованием NaOH или H2SO4; колбы на 500 мл с отражательной перегородкой и пенными шариками заполняют 100 мл ферментированного бульона и стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120 С,после чего к каждой колбе, охлажденной до комнатной температуры, добавляют 1 мл раствора, содержащего 5000 МЕ/мл пенициллина и 5 мг/мл стрептомицина. Пример 2. Очистка фосфолипаз по настоящему изобретению. Стадия 1. Получение ультрафильтратов. Супернатанты культур, полученных в примере 1, подвергают ультрафильтрации для удаления низкомолекулярных загрязняющих примесей, которые могут мешать проведению тестов для определения ферментативной активности и качества выпечной продукции. Ультрафильтрацию 30 мл супернатанта проводят в системе Millipore Labscale TFF, снабженной фильтром для отсечения молекулярной массы от 10 кДа. Образцы, в зависимости от их цвета, промывают 3-5 раз с использованием 40 мл охлажденного 100 мМ фосфатного буфера при рН 6,0, включающего 0,5 мМ СаСl2. Конечный объем ферментного раствора,который далее фигурирует в описании как "ультрафильтрат", составляет 30 мл. Стадия 2. Определение концентрации фосфолипазы с использованием системы ВЭГФ по поглощению при длине волны А 280. Концентрацию фосфолипазы в ультрафильтрате вычисляют на основе величины экстинкции при 280 нм (А 280), определяемой поглощением фосфолипазы, и далее вычисляют коэффициент молекулярной экстинкции фосфолипазы. Вычисление А 280 проводят на спектрофотометре Uvikon XL Secomam(Beun de Ronde, Abcoude, Нидерланды). Коэффициент молекулярной экстинкции может быть вычислен, исходя из количества остатков тирозина, триптофана и цистеина на молекулу фермента (S.C. Gill and P.H. von Hippel, Anal. Biochem. 182,319-326 (1989. Коэффициент молекулярной экстинкции указанных аминокислот составляет 1280, 5690 и 120 1/М х см, соответственно. Данные о количестве остатков тирозина, триптофана и цистеина в фосфолипазе по настоящему изобретению могут быть получены на основании белковых последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 и 15. Ниже в табл. 1 приведены вычисленные коэффициенты молекулярной экстинкции фосфолипаз по настоящему изобретению. Экстинкция ультрафильтрата при длине волны 280 нм (А 280), определяемая фосфолипазой, зависит от чистоты ферментного образца. Указанная чистота определяется с помощью ВЭГФ (HPSEC) (высокоэффективной гельпроникающей хроматографии) на колонке TSK SW-XL (300 х 7,8 мм; диапазон исключаемого размера 10-300 кДа). Элюирующий буфер состоит из 25 мМ натрийфосфатного буфера, рН 6,0,который пропускают через колонку со скоростью 1 мл/мин. Инъецируют образцы по 5-100 мкл. Далее измеряют поглощение при длине волны 280 нм. Величину поглощения А 280 в ультрафильтрате, определяемую фосфолипазой по настоящему изобретению, вычисляют на основе отношения площади пика, соответствующего пику фосфолипазы на хроматограмме, к общей площади пиков, поглощающих при 280 нм. Далее вычисляют концентрацию фосфолипазы, умножая величину А 280 ультрафильтрата на коэффициент указанного выше отношения и деля на вычисленный коэффициент экстинции (1 мг/мл раствора значение в самой правой колонке табл. 1) для каждой фосфолипазы. Пример 3. Измерение активности. В ультрафильтратах, полученных по процедуре примера 2, измеряют активности следующих ферментов: фосфолипазы A1 или А 2; лизофосфолипазы; фосфолипазы С; галактолипазы; грибной альфа-амилазы. Активность фосфолипазы А определяют спектрофотометрически с использованием в качестве субстрата 1,2-дитиодиоктаноилфосфатидилхолина. Фосфолипаза А гидролизует сульфидную связь в положении 1 (ФЛА 1) или в положении 2 (ФЛА 2), высвобождая тем самым 4-тиооктановую кислоту, которая в следующей реакции вступает во взаимодействие с 4,4'-дитиопиридином с образованием 4-тиопиридона. Последнее соединение находится в таутомерном равновесии с 4-меркаптопиридином, который поглощает при длине волны 334 нм. Данную реакцию проводят в 0,1 М ацетатном буфере при рН 4,0 с добавкой 0,2% Тритона-Х 100 при температуре 37 С. 1 единицу активности фосфолипазы А (ФЛА) определяют как количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль 4-тиооктановой кислоты в минуту в указанных выше условиях реакции. Активность лизофосфолипазы определяют методом 31 Р-ЯМР спектроскопии с использованием в качестве субстрата лизофосфатидилхолина. Лизофосфолипаза гидролизует сложноэфирную связь, высвобождая тем самым жирную кислоту из глицеринового фрагмента. Полученный таким образом глицеринфосфохолин количественно определяют по методу ЯМР. Реакцию проводят в 50 мМ ацетатном буфере при рН 4,5, который содержит также 1 мг/мл лизофосфатидилхолина и 5 мМ СаСl2, в течение 30 мин при 55 С. 1 единицу активности лизофосфолипазы (LPC) определяют как количество фермента, которое в указанных условиях реакции образует 1 мкмоль 4-глицеролфосфохолина в минуту. Активность фосфолипазы С определяют спектрофотометрически с использованием в качестве субстрата паранитрофенилфосфорилхолина. Фосфолипаза С гидролизует сложноэфирную связь, высвобождая паранитрофенол, который поглощает при длине волны 405 нм. Указанную реакцию проводят в 100 мМ ацетатном буфере при рН 5,0, который содержит также 20 мМ СаСl2, 0,25% Тритона-Х 100 и 20 мМ паранитрофенилфосфорилхолина, при 37 С в течение 7 мин. Указанную реакцию останавливают и повышают рН добавлением к 1 объему реакционной смеси 0,75 объема 1 М раствора Трис, после чего измеряют экстинкцию при длине волны 405 нм (405 нм=18500 М-1 х см-1). 1 единицу активности фосфолипазы С определяют как количество фермента, которое в указанных условиях реакции образует 1 мкмоль паранитрофенола в минуту. Активность галактолипазы определяют методом Н-ЯМР спектроскопии с использованием в качестве субстрата дигалактозилдиглицерида по методу, описанному Хираяма и Мацуда (Hirayama and Matsuda(1972) Agric. Biol. Chem. 36, 1831). Галактолипаза гидролизует сложноэфирную связь между жирно-кислотными остатками и глицериновым скелетом, высвобождая одну или более жирных кислот. Указанную реакцию проводят в 50 мМ ацетатном буфере при рН 4,5, который содержит также 4 мМ СаСl2,- 26008607 0,2% Тритона Х-100 и 1 мг/мл дигалактозилдиглицерида (липидный продукт), при 37 С в течение 30 мин. 1 единицу активности галактолипазы определяют в указанных условиях реакции как количество фермента, который образует 1 мкмоль жирной кислоты в минуту. Активность грибной альфа-амилазы определяют с использованием тест-таблеток Фадебас-амилазы(Phadebas-Amylase) (Pharmacia). Таблетки Фадебас содержат водонерастворимый крахмальный субстрат и синий краситель, связанный с субстратом. Субстрат гидролизуется грибной амилазой, высвобождая при этом в раствор окрашенные растворимые мальтодекстрины. Строят калибровочную кривую на основе раствора, содержащего грибную альфа-амилазу с эталонной активностью. Из стандарта и исследуемых образцов делают соответствующие разведения 50 мМ буфером с яблочной кислотой, рН 5,5. Образцы по 5 мл инкубируют при 30 С в течение 5 мин, добавляют таблетки Фадебас и через 15 мин останавливают реакцию добавлением 1,0 мл 0,5 н. гидроксида натрия. Смеси оставляют на 5 мин для охлаждения до комнатной температуры, после чего добавляют 4,0 мл воды, встряхивают вручную и через 15 мин центрифугируют образцы при 4700 об./мин в течение 10 мин. Измеряют экстинкцию верхних слоев при длине волны 620 нм. Поглощение (ОП) при 620 нм используют как меру активности грибной альфа-амилазы. 1 единицу активности грибной амилазы (FAU) в контексте настоящего описания определяют как количество фермента, которое превращает 1 г крахмала (100% по сухому остатку) в течение часа в указанных условиях реакции в продукт, характеризующийся прозрачностью при длине волны 620 нм после реакции с раствором йода известной активности. Таблица 2 а Активность фосфолипазы в ультрафильтратах, полученных по процедуре примера 2 Таблица 2b Активность фосфолипазы в единицах на мг белка, определяемая при измерении показателя поглощения А 280 нм в ультрафильтратах, полученных по процедуре примера 2 В образцах, кроме указанной активности, присутствуют также минорные активности глюкоамилазы и ксиланазы, однако, в таких малых количествах, что указанные ферменты не влияют на эксперименты по выпечке, описанные в примере 4. Пример 4. Эсперимент по выпечке 1 - булочки для хот-догов. Булочки для хот-догов выпекают из кусочков теста по 150 г, получаемого при смешивании 200 г муки(Kolibri/Ibis, в соотношении 80/20), 1,4 г сухих пекарских дрожжей (Fermipan), 4 г соли, 3 г сахара,10 мг аскорбиновой кислоты, 116 г воды и 3 г жира. После перемешивания в течение 6 мин и 15 с в тестомесильной машине шпилечного типа тесто разделяют на кусочки по 150 г и производят расстойку в течение 45 мин при 30 С, далее обминают, производят расстойку еще в течение 25 мин, формуют и кладут на противень. Расстойку производят при относительной влажности 90-100%. После завершения окончательной расстойки в течение 70 мин при температуре 30 С тесто выпекают в течение 20 мин при температуре 225 С. Различные эффекты (табл. 3) разных фосфолипаз в экспериментах по выпечке сравнивают с контролем, содержащим такое же количество грибной амилазы, добавляемой в той же дозировке к ультрафильтрату (см. табл. 2 с данными по активности грибной амилазы в ультрафильтратах). Указанная обра- 27008607 ботка необходима, поскольку количества добавленной вместе с фосфолипазой грибной амилазы воздействуют преимущественно на объем булочек, а не на другие параметры. Объем изделий, получаемый с контрольным количеством грибной амилазы, берут за 100%. Таблица 3 Объем булочек определяют с помощью измерителя объема хлеба (Bread Volume Measurer BVM-3)(RI Cards Instruments AB, Viken, Швеция). Принцип указанного метода основан на отражении ультразвука, который измеряется сенсором вокруг вращающегося хлеба. Время измерения составляет 45 с. Липкость и растяжимость теста оцениваются квалифицированным пекарем с использованием шкалы, показанной в табл. 3. В среднем измеряют 2 булочки на каждый оцениваемый параметр. После анализа указанные кусочки теста округляют и проводят первую расстойку в течение 45 мин при 30 С, после чего тесто обминают, формуют, кладут на противень и производят расстойку в течение 75 мин при 30 С. Относительную влажность в процессе расстойки поддерживают на уровне 85%. Далее подтверждают стабильность теста после расстойки по наличию пузырей, разорванных участков на корке и неравномерно изогнутых поверхностей на корке. Сформованные кусочки теста выпекают в течение 25 мин при 225 С. Объем булочек определяют по методу BVM-3: в таблице представлено среднее значение показателя, измеряемого для двух хлебных изделий, которые выпекаются из одного и того же объекта. Структуру мякиша оценивает квалифицированный пекарь с использованием шкалы, показанной в табл. 3. После хранения булочек в течение 3 дней в полиэтиленовых пакетах при комнатной температуре измеряют твердость корки с использованием анализатора структуры Stevens Texture Analyser. С помощью анализатора оценивают структуры двух срезов по 2 см толщиной, взятых из центра каждой булочки, с использованием пробоотборника с диаметром 1,5 дюйма, глубиной вдавливания 5 мм (25%) и скоростью прессования 0,5 мм/с. В таблице приведены средние значения показателей, полученные в двух измерениях. Цвет корки оценивает квалифицированный пекарь по шкале, показанной в табл. 3. В качестве стандарта используют хлеб, выпеченный по стандартному рецепту голландского формового хлеба. Цвет мякиша оценивает квалифицированный пекарь по шкале, показанной в табл. 3. Цвет мякиша контрольного хлеба оценивается как нормальный (3). В качестве позитивного контроля используют два объекта хлеба с тем же самым составом, что и контроль, плюс 0,5% соевой муки. Процедуру расстойки и выпечки производят, как и в контрольном варианте, без соевой муки. Последний показатель оценивают как "превосходный". Выступающую верхушку хлеба оценивают по уровню выступа верхней части в сравнении с формовым стандартом, чем ниже края верха, тем ниже балл при тестировании. Чем меньше выступ, тем лучший присваивается балл. Таблица 4 Характеристика фосфолипаз по настоящему изобретению с точки зрения воздействия на качество выпечки- 28008607 Пример 5. Второй эксперимент по выпечке - батар. Характеристики фосфолипаз по настоящему изобретению, определяемые их воздействием на вид выпечки, исследуют на примере хлеба типа французского батона, называемого "батар". Батары изготавливают путем стандартного процесса выпечки при смешивании при температуре примерно 20 С 3000 г пшеничной муки, 70 г прессованных дрожжей, 60 г соли, 68 м.д. аскорбиновой кислоты, 17 м.д. препарата Фермизим Р 200 (Fermizyme P200) (грибная -амилаза), 30 м.д. препарата Фермизим HS2000 (FermizymeHS2000) (грибная хемицеллюлаза), 7 м.д. препарата Бэйкзим Р 500 (Bakezyme P500) и 1680 мл воды (810 С) в спиральном смесителе (Diosna: 2 мин со скоростью 1; 100 Вт/ч, ввод со скоростью 2). Температура теста составляет 27 С. Способность теста к машинной обработке анализирует вручную пекарь. Тесто отставляют для расстойки до нужного объема на 15 мин в расстойном шкафу при 32 С и 90% ОВ. Далее тесто разделяют на 6 кусочков по 350 г, округляют их и вновь производят расстойку в течение 15 мин при 32 С и 90% ОВ. В конце указанного периода времени формуют кусочки теста и производят окончательную расстойку в течение 90 мин при 32 С и 90% ОВ. Полностью расстойное тесто раскатывают в длину кусочка и выпекают в печи при 240 С в течение 30 мин при обработке вначале паром. После охлаждения до комнатной температуры определяют объем полученных булочек по методу с ипользованием анализатора BVM-3 (см. пример 4). Полученный хлеб сразу после охлаждения до комнатной температуры анализирует пекарь на наличие трещин, разрывов корки и форму, ранжируя результаты по табл. 5. После выдерживания в течение 16 ч(в течение ночи) в закрытой коробке при комнатной температуре квалифицированный пекарь оценивает качество мякиша хлеба. Результат для каждого показателя получают из одного хлебного изделия в качестве объекта. Таблица 5 Таблица 6 Характеристики фосфолипаз по настоящему изобретению с точки зрения их эффекта на выпечку В м.д. на основании веса муки и веса фермента, определяемых по методу измерения А 280.