Способ лечения сердечно-сосудистого заболевания с помощью полинуклеотида, кодирующего vegf145, экспрессирующий вектор, набор для введения вектора, способ усиления проникновения лекарства вопухоль,терапевтическая композиция, препарат вектора для инъекций, изолированный полинуклеотид
Номер патента: 4646
Опубликовано: 24.06.2004
Авторы: Кешет Эли, Влодавский Израиль, Ньюфелд Гера, Полторак Зоя
Формула / Реферат
1. Способ лечения сердечно-сосудистого заболевания у млекопитающего, предусматривающий стадию трансфекции клеток указанного млекопитающего полинуклеотидом, который кодирует VEGF145.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид клонирован в вектор.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой аденовирусные частицы.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанные частицы аденовирусного вектора доставляют указанному млекопитающему посредством инъекции.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что количество указанных аденовирусных частиц колеблется приблизительно между 1010 и 1014.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что количество указанных аденовирусных частиц колеблется приблизительно между 1011 и 1013.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные трансфицированные клетки представляют собой клетки сердца.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанные трансфицированные клетки представляют собой клетки коронарной артерии и что указанная инъекция является внутрикоронарной инъекцией.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанные аденовирусные частицы вводят приблизительно на 1 см в просвет левой и правой коронарных артерий.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные клетки трансфицируют in vivo.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные клетки трансфицируют ex vivo.
12. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид вводят в указанные клетки коронарной артерии посредством катетера, вставленного в указанную артерию.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный катетер содержит надувной баллон, имеющий наружную поверхность, приспособленную для взаимодействия с внутренней стенкой указанной артерии, и что указанный полинуклеотид располагается на наружной поверхности указанного баллона.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид состоит из последовательности нуклеотидов, определенной в списке последовательностей как SEQ ID NO: 1.
15. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное млекопитающее является человеком.
16. Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую VEGF145, или ее варианты, полученные в силу вырожденности генетического кода, причем указанные варианты кодируют полипептид, выбранный из группы, состоящей из
(a) биологически активного фрагмента VEGF145; и
(b) биологически активного производного VEGF145, представляющего собой аминокислотную последовательность VEGF145 или ее фрагмент, в котором один или несколько аминокислотных остатков добавлены, заменены или делетированы.
17. Экспрессирующий вектор по п.16, отличающийся тем, что указанный вариант представляет собой VEGF145.
18. Экспрессирующий вектор по п.16, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид содержит последовательность нуклеотидов, определенную в списке последовательностей как SEQ ID NO: 1.
19. Экспрессирующий вектор по п.16, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид фланкирован аденовирусными последовательностями.
20. Экспрессирующий вектор по п.19, отличающийся тем, что указанная полинуклеотидная последовательность оперативно связана по 5'-концу с последовательностью промотора, функционального в эндотелиальных клетках сосудов.
21. Экспрессирующий вектор по п.19, отличающийся тем, что указанный экспрессирующий вектор представляет собой аденовирусный вектор.
22. Экспрессирующий вектор по п.21, отличающийся тем, что указанный вектор дополнительно содержит частичную аденовирусную последовательность, из которой делетированы гены E1A/E1B.
23. Набор для осуществления внутрикоронарного введения рекомбинантного вектора, экспрессирующего VEGF145, содержащий
(a) вектор по п.16, подходящий для экспрессии in vivo;
(b) подходящий контейнер для указанного вектора и
(c) инструкции по осуществлению введения указанного вектора пациенту.
24. Набор по п.23, отличающейся тем, что указанный полинуклеотид клонирован в аденовирусный экспрессирующий вектор.
25. Способ лечения сосудистого заболевания у млекопитающего, предусматривающий стадию введения указанному млекопитающему VEGF145 в количестве, терапевтически эффективном для стимуляции пролиферации клеток сосудов.
26. Способ усиления эндотелизации пораженных заболеванием сосудов, предусматривающий стадию введения млекопитающему VEGF145 в терапевтически эффективном количестве.
27. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанная эндотелизация представляет собой реэндотелизацию после ангиопластики.
28. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанная реэндотелизация ослабляет или предотвращает рестеноз.
29. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанного пациента лечат с помощью стента.
30. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанного пациента лечат без использования стента.
31. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанное млекопитающее является человеком.
32. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанное введение заключается в генной терапии.
33. Способ по п.32, отличающийся тем, что для проведения указанной генной терапии применяют надувной баллонный катетер, покрытый полинуклеотидом, кодирующим VEGF145.
34. Способ усиления проникновения лекарственного средства в опухоль, предусматривающий введение пациенту молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VEGF145.
35. Способ по п.34, отличающийся тем, что указанный VEGF145 доставляют непосредственно в опухолевую клетку.
36. Терапевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и VEGF145 в количестве, терапевтически эффективном для стимуляции пролиферации клеток сосудов.
37. Отфильтрованный препарат аденовирусного вектора для инъекций, содержащий рекомбинантный аденовирусный вектор, причем указанный вектор не содержит вируса дикого типа и содержит
частичную последовательность аденовируса, из которой делетированы гены E1A/E1B, и
трансген, кодирующий VEGF145 под контролем промотора, фланкированного частичной аденовирусной последовательностью; и
фармацевтически приемлемый носитель.
Текст
1 Предпосылки к созданию изобретения Данное изобретение относится к терапии заболевания сердечно-сосудистой системы посредством воздействия на анатомические структуры, проводящую функцию и проницаемость,и более подробно, к способу лечения сердечнососудистого заболевания посредством стимуляции пролиферации клеток сосудов, используя их ростовой фактор, стимулирующий рост эндотелиальных клеток и сосудистую проницаемость. Сердечно-сосудистые заболевания обычно характеризуются нарушением кровоснабжения сердца и других органов мишеней. Инфаркт миокарда (MI), обычно упоминаемый как сердечный приступ, представляет собой основную причину смертности, так как в 30% случаев приводит к смерти в первые месяцы после сердечного приступа. Сердечные приступы происходят в результате сужения или закупоривания коронарных артерий сердца, что приводит к истощению необходимых питательных веществ и кислорода в сердце. Когда кровоснабжение сердца нарушается, клетки отвечают образованием соединений, которые индуцируют рост новых кровеносных сосудов с тем, чтобы увеличить снабжение кровью сердца. Эти новые кровеносные сосуды называют коллатеральными кровеносными сосудами. Процесс, посредством которого индуцируется прорастание новых кровеносных сосудов из существующей сосудистой сети, называют ангиогенезом, а вещества,которые вырабатывают клетки, чтобы индуцировать ангиогенез, являются ангиогенными факторами. К сожалению, естественный ангиогенный ответ организма ограничен и часто неадекватен. По этой причине обнаружение ангиогенных факторов роста ведет к появлению альтернативной терапевтической стратегии, которая пытается дополнить естественный ангиогенный ответ снабжением экзогенными ангиогенными веществами. Делают попытки стимулировать ангиогенез введением различных ростовых факторов.U.S. патент Cid и сотр.5,318,957 описывает способ стимулирования ангиогенеза введением гаптоглобинов (гликопротеина с двумя полипептидными цепями, связанными дисульфидными связями). Внутрикоронарное введение рекомбинантного вектора, экспрессирующего ростовой фактор-5 фибробластов человека(FGF-5) (то есть перенос гена in vivo), на модели животного приводит к успешному снижению интенсивности симптомов нарушения кровотока в миокарде и функции (Giordano, F.J. et. al.Nature Med. 2, 534-539, 1996). Также используют рекомбинантные аденовирусы для экспрессии ангиогенных ростовых факторов in vivo. Последние включают кислый ростовой фактор фибробластов (Muhlhauser, J., et. al. Hum. GeneTher. 6, 1457-1465, 1995), и одну из форм VEGF, 004646VEGF165 (Muhlhauser, J., et. al. Circ. Res. 77,1077-1086, 1995). Один из ответов клеток мышцы сердца на сниженное кровоснабжение включает активацию гена, кодирующего ростовой фактор эндотелия сосудов ("VEGF") (Banai, S., et. al. Cardiovasc. Res. 28:1176-1179, 1994). VEGF представляют собой семейство ангиогенных факторов,которые индуцируют рост новых коллатеральных кровеносных сосудов. Семейство VEGF ростовых факторов представляет собой специфические ангиогенные ростовые факторы, которые направленно действуют почти исключительно на эндотелиальные (выстилающие кровеносные сосуды) клетки. (Рассматривают Ferrara et al., Endocr. Rev. 13:18-32 (1992); Dvorak etVEGF-гена связывает в пространстве и времени явления физиологического ангиогенеза, а делеция VEGF-гена посредством направленного действия на нарушения гена у мыши приводит к гибели эмбриона, так как не развиваются кровеносные сосуды. Поэтому оказалось, что только известный ангиогенный ростовый фактор функционирует как специфический физиологический регулятор ангиогенеза.(Leung et al., Science 246:1306-09, 1989) и увеличивают проницаемость сосудов (Senger et al.,Science 219:983-85, 1983). Сейчас известно, чтоVEGF являются важными физиологическими регуляторами образования капиллярных кровеносных сосудов. Они вовлечены в нормальное образование новых капилляров в период роста органа, включая рост эмбриона (Peters et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8915-19, 1993),заживления ткани (Brown et al., J. Exp. Med. 176:1375-79, 1992), менструального цикла и беременности (Jackson et al., Placenta 15:341-53,1994; CullinanKoos, Endocrinology 133:82937, 1993; Kamat et al., Am. J. Pathol. 146:157-65,1995). Оказалось, что во время эмбрионального развития VEGF играют существенную роль в образовании кровеносных сосудов de novo из кровяных островков (RisauFlamme, Ann. Rev.Cell. Dev. Biol. 11:73-92, 1995), о чем свидетельствует аномальное развитие кровеносных сосудов и летальности у эмбрионов, у которых отсутствует единственный аллель VEGF (Саrmeliet et al., Nature 380:435-38, 1996). Кроме того,VEGF участвуют в патологическом росте кровеносных сосудов, характеризующего многие заболевания, включающие солидные опухоли 3 Используя модель хронической ишемии конечности кролика, показывают, что повторные внутримышечные инъекции или однократное внутриартериальное введение болюса VEGF усиливает образование коллатеральных кровеносных сосудов, о чем свидетельствует измерение кровотока в ишемической задней конечности (Pu, et al., Circulation 88:208-15, 1993; Bauters et al., Am. J. Physiol. 267:H1263-71, 1994;Takeshita et al., J. Clin. Invest. 93:662-70, 1994). На этой модели также показывают, что VEGF действует синергически с основным FGF уменьшая интенсивность ишемии (Asahara et al.,Circulation 92: [suppl. 2], II-365-71, 1995). Также сообщают, что VEGF ускоряет заживление поврежденного баллонным катетером эндотелия сонной артерии крысы, в то же самое время ингибирует патологическое утолщение располагающихся снизу слоев гладких мышц, таким образом, сохраняя диаметр просвета и кровоток(эндотелиальный фактор релаксации (оксид азота - зависимую релаксацию коронарных артерий собаки, таким образом, потенциально способствуя увеличению кровотока в ишемических областях через второстепенный механизм, не связанный с ангиогенезом (Ku et al., Am. J.Physiol. 265:Н 586-Н 592, 1993). Активация гена, кодирующего VEGF, приводит к образованию нескольких различных вариантов VEGF, или изоформ, продуцируемых посредством альтернативного сплайсинга, причем одинаковые хромосомные ДНК производят различные транскрипты мРНК, содержащие различные экзоны, таким образом, продуцируя различные белки. Такие варианты описывают,например, в U.S. патенте Tiesher и сотр.5,194,596, в котором идентифицируют ростовые факторы эндотелиальных клеток сосудов человека, имеющих протяженность пептидной последовательности 121 и 165 аминокислот (то есть VEGF121 и VEGF165). Кроме того, охарактеризованы и описаны VEGF189 и VEGF206 (Neufeld, G., et. al., Cuncer Metastasis Rev. 15:153-158,1996). Как изображают на фиг. 1, домен, кодируемый экзонами 1-5, содержит информацию,необходимую для узнавания известных VEGFрецепторов KDR/flk-1 и flt-1 (Keyt, В.A., et. al.,J. Biol. Chem. 271:5638-5646, 1996), и присутствует во всех известных изоформах VEGF. Аминокислоты, кодируемые экзоном 8, также присутствуют во всех известных изоформах. Изоформы, однако, различаются присутствием или отсутствием пептидов, кодируемых экзонами 6 и 7 гена VEGF, а присутствие или отсутствие пептидов, кодируемых этими экзонами, является результатом структурных различий, которые 4 транслируются в функциональные различия между формами VEGF (рассматривают Neufeld,G., et. al., Cancer Metastasis Rev. 15, 153-158,1996). Экзон 6 терминирует после 72 пар оснований в донорном сайте сплайсинга, где он представляет 24 аминокислоты в VEGF формах, которые включают такие формы, как VEGF189. Эту форму экзона 6 называют экзон 6 а. ОднакоVEGF-РНК сращивание может происходить на 3' конце экзона 6, используя 51 основание, локализованные в альтернативном сайте сплайсинга в направлении 5'-3', обеспечивая в результате продукт экзона 6 большего размера, содержащий 41 аминокислоту. Дополнительные 17 аминокислот, добавленные к продукту экзона 6,как результат этого альтернативного сплайсинга, называют в этом изобретении экзон 6b.VEGF206 содержит удлиненный экзон 6, составленный из экзона 6 а и 6b, но эта форма VEGF является более редкой, чем VEGF189. (Tischer,E., et al., J. Biol. Chem. 266, 11947-11954; Houck,K.А., et al., Mol. Endocrinol., 12, 1806-1814,1991). Предполагаемую пятую форму VEGF,VEGF145 обнаруживают в эндометрии человека с помощью метода PCR (полимеразно-цепьевой реакции). Авторы сообщают, что последовательность варианта сплайсинга VEGF145 указывает, что он содержит экзоны 1-5, 6 и 8. Однако точно не известно, обнаружили ли авторы, что вариант сплайсинга содержит экзоны 6 а и 6b как в VEGF206, экзон 6 а как в VEGF189 или экзон 6b. Авторы сообщают, что, так как вариант сплайсинга сохраняет экзон 6, возможно, что он удерживается клеткой как и другие представители семейства, которые содержат этот экзон.(Charnock-Jones et аl., Biology of Reproduction 48, 1120-1128 (1993). См. также Bacic M., et al.,Growth Factors 12, 11-15, 1995). Биологическая активность этой формы до сих пор не установлена. (Cheung, C.Y., et al., Am J. Obstet Gynecol.,173, 753-759, 1995; Anthony, F.W. et al., Placenta,15, 557-561, 1994). Различные изоформы и экзоны, которые кодируют изоформы, представляют на фиг. 1. Четыре известные формы VEGF являются результатом альтернативного сплайсинга вплоть до 8 экзонов гена VEGF (VEGF121, экзоны 1-5, 8;VEGF165, экзоны 1-5, 7, 8; VEGF189, экзоны 1-5,6 а, 7, 8; VEGF206, экзоны 1-5, 6a, 6b, 7, 8 (экзоны 6 а и 6b относят к двум альтернативным формам сплайсинга того же самого экзона (Houck etVEGF кодируют сигнальные пептиды, которые направляют белок в секреторный путь. Например, VЕGF165-кДНК кодирует последовательность из 191 аминокислотного остатка, содержащая последовательность секреторного сигнального пептида из 26 остатков, который отщепляется при секреции белка из клетки, а субъединица зрелого белка содержит 165 остат 5 ков. Однако только VEGF121 и VEGF165 быстро секретируются культивируемыми клетками,тогда как VEGF189 и VEGF206 остаются ассоциированными с продуцирующими клетками. Эти формы VEGF содержат дополнительную высокоосновную последовательность, кодируемую экзоном 6, соответствующую остаткам 115-139 в VEGF189 и остаткам 115-156 в VEGF206. Эти дополнения характеризуются высоким сродством к гепарину и способностью связывать внеклеточный матрикс (матрикс-конъюгирующая последовательность) (Houck, K.A. et al., J. Biol.Chem. 271:603-06 (1996. Митогенные активности VEGF121 и VEGF165 являются одинаковыми по данным нескольких групп (Neufeld, G., et al.,Cancer Metastasis Rev. 15:153-158 (1996, хотя одна группа исследователей представила доказательства, указывающие, что VEGF121 значительно менее активен (Keyt, В.A., et al., J. Biol.Chem. 271:7788-7795 (1996. Неясно, являются ли две более длинные формы, VEGF189 иVEGF206, такими же активными или менее активными, чем две более короткие формы, так как невозможно получить их в чистом виде,пригодном для количественного анализа. Эта неудача отчасти обусловлена сильной ассоциацией их с продуцирующими клетками и внеклеточным матриксом, которая нарушается присутствием последовательностей, производных экзона 6, явно действующих синергично с группой последовательностей, кодированных экзоном 7 (Neufeld, G., et al., Cancer Metastasis Rev. 15:153-158 (1996. Как описывают более подробно в этом изобретении, каждый из сплайсинговых вариантов VEGF, которые ранее были охарактеризованы, имеет один или несколько недостатков в отношении стимуляции ангиогенеза эндотелиальных клеток при лечении сердечнососудистых заболеваний: (i) невозможность связывания с внеклеточным матриксом (ЕСМ), что является результатом более быстрого клиренса и более короткого периода активности; (ii) неспособности секретироваться в среду (то есть остаются ассоциированными с клеткой), что препятствует достижению эндотелиальных клеток и действию на эти клетки; и (iii) чувствительности к окислительному повреждению, что приводит к более короткому периоду полужизни. Соответственно, существует потребность в новой форме VEGF, которая избежит вышеупомянутых недостатков и которую можно с пользой применять для стимуляции ангиогенеза у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями,что крайне желательно. Сущность изобретения Данное изобретение относится к новому белковому продукту VEGF и нуклеиновой кислоте, кодирующей новый белковый продукт,включающей экзоны 1-6 а и 8 гена VEGF (в 6 дальнейшем "VEGF145"), и использование его в лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы посредством воздействия на анатомические структуры, функцию проводимости и проницаемость. Обнаружено, что VEGF145 представляет собой активный митоген эндотелиальных клеток сосудов и функционирует in vivo как ангиогенный фактор. VEGF145 выгодно проявил себя при сравнении с ранее охарактеризованными видами VEGF относительно клеточного распределения, чувствительности к окислительному повреждению и способности связываться с внеклеточным матриксом (ЕСМ). Предварительные исследования, касающиеся аффинности связывания различных изоформ VEGF показывают, что VEGF165, у которого отсутствует экзон 6, относительно слабо связывается с гепарином,а также очень слабо связывается с внеклеточным матриксом (Park, J.E., et al., Mol. Biol. Cell 4:1317-1326 (1993. VEGF145, который также слабо связывает гепарин, как и VEGF165, значительно лучше, чем VEGF165, связывается с внеклеточным матриксом. Однако, в отличие отVEGF189, VEGF145 секретируется из клетокпродуцентов и эффективно связывает ЕСМ. Это сочетание свойств делает VEGF145, единственным вариантом VEGF, который секретируется из клеток-продуцентов, сохраняющим в то же время способность связывать внеклеточный матрикс. Следовательно, он, вероятно, будет диффундировать по направлению к мишенямкровеносным сосудам, в то время как часть продуцированного VEGF145 будет удерживаться компонентами внеклеточного матрикса по ходу диффузии. Этот связанный с ЕСМ пул будет медленно диссоциировать, обеспечивая более длительный период активности. Кроме того,биологическая активность VEGF145 защищена от окислительного повреждения в отличие от таких форм VEGF, как VEGF121, обеспечивая, тем самым, более длительный период полужизни. В итоге, VEGF145 определенно обладает уникальным сочетанием биологических свойств, которые отличают его от других формVEGF. Это уникальное сочетание биологических свойств VEGF145 делает его предпочтительным терапевтическим агентом для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы,также как и других заболеваний, характеризующихся пролиферацией клеток сосудов. В частности, кДНК применяют в генной терапии для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы. Пролиферация эндотелиальных клеток, которая, имеет место, например, при ангиогенезе,также полезна для предотвращения рестеноза после ангиопластики с введением баллонного катетера. При использовании способа ангиопластики с введением баллонного катетера часто повреждаются эндотелиальные клетки, выстилающие внутренние стенки кровеносных сосудов. Гладкомышечные клетки часто инфильтри 7 руют обнаженные кровеносные сосуды, вызывая вторичную обструкцию в процессе, известном как рестеноз. Пролиферация эндотелиальных клеток, локализованных по периферии поврежденной в результате введения баллонного катетера области, покрывает поверхность просвета сосуда новым монослоем эндотелиальных клеток, восстанавливая первичную структуру кровеносного сосуда. Таким образом, данное изобретение относится к способу лечения сердечно-сосудистого заболевания у млекопитающего, предусматривающему стадию трансфекции клеток указанного млекопитающего полинуклеотидом, который кодирует VEGF145. В предпочтительном аспекте полинуклеотид клонирован в вектор. В другом аспекте вектор представляет собой аденовирусный вектор. Аденовирусный вектор предпочтительно доставляют млекопитающему посредством инъекции; предпочтительно в инъекции доставляют приблизительно от 1010 до 1014 частиц аденовирусного вектора. Более предпочтительно в инъекции вводят приблизительно 1011 до 1013 аденовирусных векторных частиц. Наиболее предпочтительно в инъекции доставляют приблизительно 1012 частиц аденовирусного вектора. Еще одним предпочтительным осуществлением является доставка в сердце млекопитающего полинуклеотида, который кодируетVEGF145. Доставка полинуклеотида предпочтительно представляет собой внутрикоронарную инъекцию в одну или обе артерии, предпочтительно согласно способам, изложенным вPCT/US96/02631, опубликованной 6 сентября 1996 года как WO 96/26742, включенной в настоящую заявку в виде цитируемого источника. Предпочтительно внутрикоронарную инъекцию проводят приблизительно на 1 см в просветы левой и правой коронарных артерий. Другим предпочтительным осуществлением изобретения является трансфекция клеток млекопитающего in vivo. В следующем осуществлении клетки трансфицируют ех vivo. Еще один предпочтительный аспект изобретения представляет собой введение полинуклеотида млекопитающему посредством катетера. Следующий аспект изобретения относится к полинуклеотиду, содержащему экзоны 1-5, 6 а и 8 гена VEGF. В предпочтительном осуществлении полинуклеотидная последовательность,кодирующая VEGF145, представляет собой экспрессирующий вектор. Таким образом, в своем предпочтительном аспекте изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему полинуклеотидную последовательностьSEQ ID NO: 1, кодирующую VEGF145, или ее варианты, полученные в силу вырожденности генетического кода, причем указанные варианты кодируют полипептид, выбранный из группы, состоящей изVEGF145, представляющего собой аминокислотную последовательность VEGF145 или ее фрагмент, в котором один или несколько аминокислотных остатков добавлены, заменены или делетированы. В предпочтительном аспекте изобретения полинуклеотид, кодирующий VEGF145, представляет собой аденовирусный экспрессирующий вектор, таким образом, в предпочтительных аспектах полинуклеотид фланкирован аденовирусными последовательностями. Еще одним предпочтительным аспектом является функциональная связь полинуклеотидной последовательности по ее 5'-концу с промоторной последовательностью, функциональной в эндотелиальных клетках сосудов. Предпочтительно,экспрессирующий вектор дополнительно содержит частичную аденовирусную последовательность, из которой делетированы гены Е 1 А/Е 1 В. Также данное изобретение относится к наборам для осуществления внутрикоронарного введения рекомбинантного вектора, экспрессирующего VEGF145, содержащим(a) рекомбинантный экспрессирующий вектор, подходящий для экспрессии in vivo;(b) подходящий контейнер для указанного вектора; и(c) инструкции по осуществлению введения указанного вектора пациенту. В более предпочтительных аспектах, полинуклеотид клонирован в аденовирусный экспрессирующий вектор. Другим предпочтительным осуществлением изобретения является использование способов, композиций и векторов по данному изобретению для лечения сосудистого заболевания у млекопитающего, предусматривающее стадию введения указанному млекопитающему VEGF145 в количестве, терапевтически эффективном для стимуляции пролиферации клеток сосудов. Другим предпочтительным осуществлением данного изобретения является использование способов, композиций и векторов по изобретению для усиления эндотелизации пораженных заболеванием сосудов, предусматривающее стадию введения млекопитающему VEGF145 в терапевтически эффективном количестве. Предпочтительно, эндотелизация заключается в реэндотелизации после ангиопластики для ослабления или предупреждения рестеноза. Из настоящей заявки специалистам в данной области понятно, что лечение может проводиться как с использованием стента (устройства для реконструкции просвета сосуда), так и без оного. Еще одним предпочтительным осуществлением данного изобретения является использование способов, композиций и векторов по изобретению для усиления проникновения лекарст 9 венного средства в опухоль, предусматривающее введение пациенту молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VEGF145. VEGF145 доставляют непосредственно в опухолевую клетку или его доставляют в сосудистую систему,предпочтительно в участок вблизи опухоли. Таким образом, доставка VEGF145 в сочетании с химиотерапией для уменьшения размера или устранения опухоли способствует эффективности химиотерапии посредством увеличения поглощения лекарства опухолью. В этом способеVEGF145 доставляют либо посредством прямой доставки полипептида или белка, либо методами генной терапии. Другим осуществлением изобретения является терапевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель иVEGF145 в количестве, терапевтически эффективном для стимуляции пролиферации клеток сосудов. Еще одним предпочтительным осуществлением изобретения является Отфильтрованный препарат аденовирусного вектора для инъекций,содержащий рекомбинантный аденовирусный вектор, причем указанный вектор не содержит вируса дикого типа и содержит частичную последовательность аденовируса, из которой делетированы гены Е 1 А/Е 1 В, и трансген, кодирующий VEGF145 под контролем промотора, фланкированного частичной аденовирусной последовательностью; и фармацевтически приемлемый носитель. Вышеупомянутые объекты, преимущества и особенности изобретения станут очевидными в дальнейшем, а сущность изобретения будет более понятной из следующего подробного описания изобретения, фигур и прилагаемой формулы изобретения. Краткое описание фигур Фиг. 1 является графическим изображением экзонов, которые кодируют различные изоформы VEGF. На фиг. 2 представлена нуклеотидная последовательность области кДНК, кодирующейVEGF145 (последовательность SEQ ID NO: 1). Подчеркнутая часть представляет собой последовательность, кодирующую сигнальную последовательность для секреции, которая отщепляется от зрелого белка. На фиг. 3 представлена аминокислотная последовательность зрелого белкового мономера VEGF145 (последовательность SEQ ID NO: 2). Фиг. 4 является фотографией, демонстрирующей экспрессию восстановленного и невосстановленного рекомбинантного VEGF145 и сравнение его с VEGF165. Показывают VEGF145 и VEGF165, которые продуцируются Sf9 клетками насекомых, инфицированных рекомбинантными бакуловирусами, кодирующими VEGF145 и VEGF165. Собирают кондиционированную среду, содержащую рекомбинантный VEGF, и аликвоты по 10 мкл или восстанавливают, ис 004646 10 пользуя 0,1 М дитиотрейтол (панель А), или не восстанавливают (панель В). Белки разделяют посредством электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия(SDS/PAGE) (12% гель) и переносят посредством электроблоттинга на нитроцеллюлозу. Фильтры блокируют в течение 1 ч при комнатной температуре буфером, содержащим 10 мМ трис-HCl, рН 7,0, 15 М NaCl и 0,1% Твин 20(TBST) с 10% обезжиренным сухим молоком. Фильтры инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре с анти-VEGF поликлональными антителами кролика в TBST (23), промывают 3 раза TBST и инкубируют с антителами против IgG кролика, конъюгированных с пероксидазой, в течение 1 ч при комнатной температуре. Связанные антитела выявляют, используяECL систему детекции. Фиг. 5 является фотографией, демонстрирующей связывание VEGF145-мPHK, которое выявляют методом обратной PCR в эксперименте, анализирующем мРНК, изолированную из двух линий злокачественных клеток, происходящих из репродуктивной системы самок (HeLa и А 431 клеток). Тотальную РНК из HeLa и А 431 клеток транслируют в кДНК и амплифицируют методом PCR, используя радиоактивно меченные нуклеотиды, как описывают в разделе "Материалы и методы". Плазмиды, содержащиеVЕGF121-кДНК, VEGF165-кДНК и рекомбинантную VEGF145-кДНК, включают в PCR-реакции,используя праймеры, описанные в разделе "Материалы и методы". Представляют авторадиограмму геля. Фиг. 6 является графическим изображением эксперимента, который показывает, что рекомбинантный VEGF145 является митогенным для эндотелиальных клеток сосудов. VEGF145 стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток: HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) клетки высевают на 24 луночные планшеты (20000 клеток/лунку) и добавляют увеличивающиеся концентрацииVЕGF165-специфических рецептора VEGF, которые обнаружены на эндотелиальных клетках сосудов. Для выяснения влияния VEGF145 на связывание 125I-VEGF165 с эндотелиальными клетками 125I-VEGF165 (10 нг/мл) связывают с монослоем клеток HUVEC, растущим на 5 см чашках в течение 2 ч при 4 С в присутствии 1 мкг/мл гепарина и следующих концентрацийVEGF145 (мкг/мл): Трек 1, 0; Трек 2, 0,05; Трек 3, 0,1; Трек 4, 0,25; Трек 5, 0,5; Трек 6, 1; Трек 7,2; Трек 8, 3. На Трек 9 наносят 2 мг/мл VEGF121. Связанный 125I-VEGF165 впоследствии перекре 11 стно связывают с клетками, используя DSS, и перекрестно связанные комплексы визуализируют авторадиографией. Фиг. 8 представляет два эксперимента, которые показывают, что VEGF145 связывает ЕСМ,продуцируемый эндотелиальными клетками роговицы быка, a VEGF165 нет. а. Покрытые ЕСМ 96-луночные планшеты инкубируют с увеличивающимися концентрациями VEGF145 или VEGF165 ("). Количество ЕСМ-связанного VEGF количественно оценивают, используя М-35 моноклональные антитела против VEGF, как описывают в разделе "Материалы и методы".I-VEGF165 (Трек 3, 50 нг/мл) связывают с ЕСМ-покрытыми лунками. В Трек 2 добавляют гепарин (10 мкг/мл) с VEGF145. Связывание и последующую экстракцию связанных ростовых факторов проводят, как описывают в разделе"Материалы и методы". Экстрагированные ростовые факторы подвергают SDS/PAGE (12% гель) с последующей авторадиографией. с. 125I-VEGF145, использованный в эксперименте, представленном на панели В (0,2 нг),хроматографируют при восстанавливающих условиях в 12% SDS/PAGE-геле. Представляют авторадиографию геля. Фиг. 9 является графическим изображением эксперимента, в котором исследуют влияние гидролиза гепариназой ЕСМ, продуцируемого эндотелиальными клетками роговицы быка, на связывание VEGF145 и bFGF c ЕСМ. а. Влияние гепарина и гепариназы на связывание ростового фактора. Покрытые ЕСМ лунки инкубируют с или без 0,1 ед./мл гепариназы-II в связывающем буфере в течение 2 ч при 37C. Затем 125I-VEGF145(40 нг/мл) или 125I-bFGF (114 нг/мл) добавляют в лунки в присутствии или в отсутствие 10 мкг/мл гепарина. После инкубации в течение 3 ч при 25 С лунки промывают, и ассоциированные с ЕСМ йодированные ростовые факторы диссоциируют гидролизом трипсином в течение 15 мин при 37C. Количество связанного ростового фактора определяют, используя гамма-счетчик(100% связывания составляют 15000 и 25000 СРМ (число импульсов в мин) на лунку для 125IVEGF145 и 125I-FGF, соответственно).b. Влияние гепарина и гепариназы-II на освобождение связанных ростовых факторов от ЕСМ. 125I-VEGF145 и 125I-bFGF связывают с ЕСМпокрытыми лунками, как описывают выше. Лунки промывают и повторно инкубируют в связывающем буфере одном, с 10 мкг/мл гепарина или с 0,1 ед./мл гепариназы-II в конечном объеме 50 мкл. После 12-часовой инкубации при 25 С целостность ЕСМ проверяют посредством микроскопии, и аликвоты по 45 мкл отбирают для счета в гамма-счетчике. Затем добавляют NaOH в лунки и определяют количест 004646 12 во ассоциированных с ЕСМ ростовых факторов. Эксперимент проводят параллельно с экспериментом, вышеописанным в панели А. Эксперименты, представленные на панелях А и В, проводят в дупликатах, и отклонение (значимость разброса) не превышает 10%. Представляют средние значения. Эксперименты повторяют 4 раза с одинаковыми результатами. Фиг. 10 графически показывает, чтоVEGF145, связанный с ЕСМ, является биологически активным. Лунки в 24-луночных планшетах покрывают ЕСМ, продуцируемым клетками ВСЕ (эндотелиальные клетки роговицы быка),культивированными в присутствии 30 нМ хлората. Покрытые ЕСМ лунки инкубируют с увеличивающимися концентрациями VEGF145 или VEGF165, как указано, и интенсивно промывают, как описано. HUVEC клетки (15000 клеток/лунку) высевают на покрытые ЕСМ лунки в среде для роста, в которой отсутствуют ростовые факторы. Клетки трипсинизируют и считают через 3 дня. Количество представляет среднее количество клеток в дуплицированных лунках. Фиг. 11 является фотографией, демонстрирующей кластеры альгинатных гранул, содержащие клетки, экспрессирующие или неэкспрессирующие VEGF145. Кластеры, содержащиеMIRB/VEGF145, трипсинизируют и суспендируют в ДМЕМ (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла) до концентрации 2,7 х 107 клеток/мл. Альгинат натрия (1,2%, 0,66 мл) смешивают с 1,33 мл клеточной суспензии. Гранулы диаметром 1 мкл образуют посредством контакта с 80 мМ СаСl2 раствором. Гранулы 3 раза промывают физиологическим раствором. Каждой Balb/c мыши в группе из 4 х вводят подкожно 400 мкл упакованных гранул, содержащих данный тип клеток. Кластеры гранул вырезают через 4 дня и фотографируют. Области,насыщенные кровью, оказываются на фотографии в виде темных зон. Подробное описание изобретения В изобретении используют следующие сокращения:BCE - эндотелиальные клетки роговицы быкаbFGF - основной ростовой фактор фибробластов ЕСМ - внеклеточный матриксHUVEC - эндотелиальные клетки пупочной вены человекаVEGF - ростовой фактор эндотелия сосудовVEGFxxx - форма ростового фактора эндотелия сосудов, содержащая обозначенное количество (ххх) аминокислот. 13 Данное изобретение относится к новому белковому продукту VEGF и нуклеиновым кислотам, кодирующим новый белковый продукт(фиг. 2), представляющий собой экзоны 1-6, и 8 гена VEGF, и его использование в лечении сердечно-сосудистого заболевания. Используемый в изобретении термин "сердечно-сосудистое заболевание" подразумевает заболевание, которое происходит в результате сердечнососудистой недостаточности, включая, но не ограничиваясь, заболевание коронарных артерий, застойную сердечную недостаточность и периферическое сосудистое заболевание (заболевание периферических сосудов). Способы данного изобретения относятся к лечению пациентов млекопитающих, предпочтительно людей.(фиг. 3). VEGF145 является активным митогеном эндотелиальных клеток сосудов и функционирует, как ангиогенный фактор in vivo. VEGF145 сравнивают с ранее охарактеризованными видами VEGF относительно клеточного распределения, чувствительности к окислительному повреждению и способности связывать внеклеточный матрикс (ЕСМ). Клетки-продуценты секретируют VEGF145, и последний эффективно распространяется по ЕСМ, указывая, что только один VEGF-вариант характеризуется обоими из этих свойств. Используемые в изобретении названия"ростовой фактор эндотелиальных клеток сосудов" или "VEGF" относят к семейству ангиогенных ростовых факторов, кодируемых геном"VEGF145" термин относят к форме VEGF,содержащей приблизительно 145 аминокислот,появившейся в результате альтернативного сплайсинга VEGF-мРНК и содержащей пептиды, кодируемые экзонами 1-5, 6 а и 8 гена VEGF. Термин "VEGF145" также относят к производным и функциональным эквивалентам нативнойVEGF145 последовательности нуклеиновых кислот или аминокислот. Зрелые VEGF145 мономеры содержат аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 3. Однако термин "VEGF145" относят как к зрелой форме,так и к проформе VEGF145, включающей сигнальную последовательность, или к производным или функциональным эквивалентам их.VEGF145 экспрессируют в нескольких клеточных линиях (фиг. 4) и как показано, экспрессируют в ОС 238 клетках карциномы яичников,используя секвенирование области, окружающей экзоны 5-8 VEGF-кДНК, полученной из ОС 238 клеток."Производные" VEGF145 полипептида или субъединицы представляют собой функциональные эквиваленты, имеющие одинаковую аминокислотную последовательность и сохраняющие, до некоторой степени, активностиVEGF145. Под термином "функциональный эквивалент" подразумевают, что производное имеет активность, заменяет активность VEGF145. Предпочтительные функциональные эквиваленты сохраняют полный уровень активностиVEGF145, которую определяют с помощью способов, известных специалистам в данной области, и/или способов, описанных в изобретении. Предпочтительные функциональные эквиваленты имеют активности, которые располагаются в пределах 1% до 10000% активности VEGF145,более предпочтительно между 10% до 1000% и более предпочтительно в пределах от 50% до 200%. Производные имеют, по крайней мере,50% сходство последовательностей, предпочтительно 70%, более предпочтительно 90% и даже более предпочтительно 95% сходства последовательности с VEGF145. "Сходство последовательности" означает "гомологию", наблюдаемую между последовательностями в двух различных полипептидах, независимо от природы полипептида. Способность производного сохранять некоторую активность оценивают, используя способы, описанные в изобретении, и/или способы для измерения активности других изоформVEGF, известные специалистам в данной области. Производные включают модификации, происходящие во время или после трансляции, например, посредством фосфорилирования, гликозилирования, перекрестного связывания, протеолитического расщепления, соединения с молекулой антитела, мембранной молекулой или другим лигандом (см. Ferguson et al., 1988,Annu. Rev. Biochem. 57:285-320). Специфические типы производных также включают аминокислотные перестройки такие,как делеции, замещения, вставки и модификации аминокислот. Термин "делеция" относят к отсутствию одного или более аминокислотного остатка(ов) в родственном полипептиде. Термин"вставка" относят к наличию одного или более аминокислотного остатка(ов) в родственном полипептиде. Вставки и делеции могут происходить на амино-конце, карбоксильном конце и/или во внутренней части. Под термином аминокислотная "модификация" подразумевают перестройку естественной аминокислоты с образованием неприродной аминокислоты. Под термином "замещение" подразумевают замену одного или более аминокислотного остатка(ов) другим аминокислотным остатком(ами) в полипептиде. Производные характеризуются различными комбинациями изменений, включающих более чем одно изменение и различные типы изменений. Хотя влияние аминокислотных превращений варьирует в зависимости от факторов таких,как фосфорилирование, гликозилирование,внутрицепочечное связывание,третичной структуры и роли аминокислоты в активном центре или в возможном аллостерическом сай 15 те, обычно предпочитают, чтобы замещающая аминокислота была из той же группы, что и замененная аминокислота. До некоторой степени следующие группы содержат аминокислоты,которые являются взаимозаменяемыми: основные аминокислоты - лизин, аргинин и гистидин; кислые аминокислоты - аспарагиновая и глутаминовая кислоты; нейтральные полярные аминокислоты - серин, треонин, цистеин, глутамин,аспарагин и, в меньшей степени, метионин; неполярные алифатические аминокислоты - глицин, аланин, валин, изолейцин и лейцин (однако, из-за размера глицин и аргинин являются более родственными, а валин, изолейцин и лейцин более близкими аминокислотами); и ароматические аминокислоты - фенилаланин, триптофан и тирозин. Кроме того, классифицированные в различные категории аланин, глицин и серин являются взаимозаменяемыми до некоторой степени, а цистеин дополнительно подходит в эту группу, или может классифицироваться как полярная нейтральная аминокислота. Хотя пролин является неполярной нейтральной аминокислотой, его замещение представляет трудности из-за его влияния на конформацию. Таким образом, замещения посредством или для пролина не желательны, за исключением случаев, когда получают те же или подобные конформационные результаты. Примеры модифицированных аминокислот включают следующие: измененные нейтральные неполярные аминокислоты такие, как формула H2N(CH2)nСООН, где n составляет - 26, саркозин (Sar), t-бутилаланин (t-BuAla), tбутилглицин (t-BuGly), N-метилизолейцин (NMeIle), и норлейцин (Nleu); измененные нейтральные ароматические аминокислоты такие,как фенилглицин; измененные полярные, но нейтральные аминокислоты такие, как цитруллин (Cit) и метионин сульфоксид (MSO); измененные нейтральные и неполярные аминокислоты такие, как циклогексилаланин (Cha); измененные кислые аминокислоты такие, как цистеиновая кислота (Суа); и измененные основные аминокислоты такие, как орнитин (Orn). Предпочтительные производные имеют одно или более аминокислотное изменение(я),которое значительно не воздействует на связывающую рецептор активность VEGF145. В областях полипептидной последовательностиVEGF145, в которых нет необходимой дляVEGF145 активности, аминокислоты удаляют,добавляют или замещают с меньшим риском для действующей активности. В областях, существенных для активности VEGF145, аминокислотные перестройки менее предпочтительны, так как существует больший риск для действующей активности VEGF145. Такие изменения должны быть консервативными изменениями. Например, один или более аминокислотных остатков в последовательности замещают дру 004646 16 гой аминокислотой подобной полярности, которая действует как функциональный эквивалент. Консервативные области имеют тенденцию быть более важными для белковой активности, чем неконсервативные области. Стандартные способы используют для определения консервативных и неконсервативных областей,важных для рецепторной активности, применяяin vitro методы мутагенеза или делеционный анализ (анализ делеционных мутантов) и измерение рецепторной активности как описывают в данном изобретении. Производные получают, используя стандартные химические способы и способы получения рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот. Модификации специфического полипептида осуществляют как посредством сайтнаправленного мутагенеза и аминокислотного замещения во время твердофазного синтеза, или могут быть случайными посредством мутаций у хозяев, которые вызывает полипептид. Полипептиды, включая производные, получают, используя стандартные способы такие, как описывают Sambrook et al., Molecular Cloning, ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989). Например,Глава 15 Sambrook описывает способы сайтнаправленного мутагенеза клонированной ДНК. Один аспект изобретения показывает молекулу нуклеиновой кислоты или полинуклеотид, кодирующий VEGF145. В некоторых ситуациях желательно повысить содержание такой молекулы или очистить ее. При использовании термина "обогащенный" в отношении молекулы нуклеиновой кислота подразумевают, что последовательность специфической ДНК или РНК составляет значительно большую фракцию (2-5 раз) от общего количества ДНК или РНК, присутствующего в клетках или растворе, и представляющего интерес, чем в нормальных или поврежденных клетках, или в клетках, из которых берут последовательность. Это осуществляют индивидуумы посредством преимущественного снижения количества другой присутствующей ДНК или РНК, или посредством предпочтительного увеличения количества последовательности специфической ДНК или РНК, или посредством сочетания этих двух способов. Однако следует отметить, что термин "обогащенный" не подразумевает, что не присутствуют последовательности других ДНК или РНК, а только, что относительное количество интересующей последовательности существенно увеличено. Термин "существенный" используют для указания, что уровень увеличения является приемлемым для индивидуума, осуществляющего такое увеличение, и обычно означает увеличение относительно других нуклеиновых кислот приблизительно, по крайней мере, в 2 раза,более предпочтительно, по крайней мере, в 5 до 10 раз или больше. Термин также не означает,что не присутствуют ДНК или РНК из других источников. ДНК из других источников, напри 17 мер, включает ДНК из генома дрожжей или бактерий, или клонирующий вектор такой, какpUC19. Это понятие отличается от естественно происходящих событий таких, как вирусная инфекция, или типы опухолевого роста, при которых уровень одного вида мРНК естественно увеличивается относительно других видов мРНК. Так термин рассматривает только те ситуации, при которых индивидуум вмешивается в повышение пропорции требуемой нуклеиновой кислоты. Молекулу нуклеиновой кислоты конструируют из существующей нуклеотидной последовательности VEGF посредством модификаций, используя, например, сайтнаправленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов или посредством вырезания последовательностей, используя ферменты рестрикции, или как описывают в изобретении. Стандартные рекомбинантные способы для мутагенеза такие, как inal., Chapter 15, supra), применение ТAВлинкеров (Pharmacia), и PCR-направленный мутагенез используют для создания таких мутаций. Молекулу нуклеиновой кислоты также синтезируют посредством триэфирного метода синтеза или используют автоматический ДНКсинтезатор. Изобретение также представляет рекомбинантные ДНК векторы, предпочтительно в клетке или организме. Рекомбинантные ДНКвекторы содержат последовательность, кодирующую VEGF145-белок или его функциональное производное в вектор, содержащий промотор, эффективный в инициации транскрипции в клетке хозяина. Рекомбинантный ДНК-вектор содержит функциональную область инициации транскрипции в клетке и функциональную область терминации транскрипции в клетке. Если ДНК-вектор содержит соответствующие контрольные последовательности такие, как области инициации и/или терминации, так что инсерционная молекула нуклеиновой кислоты экспрессируется в клетке хозяина, то вектор также называют "вектор экспрессии" (экспрессирующий вектор). Данное изобретение также относится к клетке или организму, который содержит вышеописанную молекулу нуклеиновой кислоты или рекомбинантный ДНК-вектор и, тем самым,является способным экспрессировать VEGF145 пептид. Пептид очищают из клеток, которые изменяют для экспрессии полипептида. Вышеназванная клетка является "измененной для экспрессии требуемого полипептида", если клетка посредством генетических манипуляций становится способной продуцировать белок, который она обычно не продуцирует или который клетка обычно продуцирует в более низких количествах. Специалисты в данной области быстро адаптируют способы введения и экспрессии или 18 геномной кДНК, или синтетической последовательности в или эукариотических, или прокариотических клетках. Вышеупомянутая молекула нуклеиновой кислоты такая, как ДНК, является "способной экспрессировать" полипептид, если она содержит нуклеотидные последовательности, которые содержат транскрипционную и трансляционную регуляторную информацию и такие последовательности являются "оперативно связанными" с нуклеотидными последовательностями, которые кодируют полипептид. Определенная природа регуляторных областей, необходимых для экспрессии генной последовательности, отличается от организма к организму, но обычно содержит промоторную область, которая у прокариотов содержит как промотор (который направляет инициацию транскрипции РНК), также как и ДНК-последовательности,которые, когда транскрибированы в РНК, являются сигналом инициации синтеза. Такие области обычно включают области 5'некодирующих последовательностей, вовлеченных в инициацию транскрипции и трансляции такие,как ТАТА блок,кэппингпоследовательность, СААТ последовательность и подобные. Например, полную кодирующую последовательность VEGF145 соединяют с одним или более из следующих соответствующих экспрессирующих векторов для проведения такой экспрессии: (1) экзогенная промоторная последовательность, (2) сайт связывания рибосомы, (3) сигнал полиаденилирования, (4) сигнал секреции. Модификации производят в 5'нетранслируемой и 3'-нетранслируемой последовательностях, чтобы улучшить экспрессию в прокариотической или эукариотической клетке; или кодоны модифицируют так, что они кодируют идентичную аминокислоту, что кодон представляет собой предпочтительный кодон для избранной системы экспрессии. Применение таких предпочтительных кодонов описывают, например, Grantham et al., Nuc. Acids Res.,9:43-74 (1981), и Lathe, J. Mol. Biol., 183:1-12(1985), в работе, цитируемой в изобретении во всей полноте. Если необходимо, некодирующую 3'область к геномной VEGF145 белковой последовательности оперативно связывают с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей VEGF145. Эту область используют в рекомбинантном ДНК векторе для его регуляторных последовательностей терминации транскрипции такие,как терминация и полиаденилирование. Таким образом, посредством сохранения 3'-области,естественно прилегающей к последовательности ДНК, кодирующей VEGF, обеспечивают сигналы терминации транскрипции. Альтернативно,замещают функциональную 3'-область в клетке хозяина. 19 Оперативное связывание представляет собой связывание, в котором регуляторные ДНКпоследовательности и ДНК-последовательность, которую пытаются экспрессировать, связывают таким образом, чтобы благоприятствовать экспрессии генной последовательности. Вышеупомянутые две последовательности ДНК(такие как последовательность промоторной области и VЕGF145-белковая последовательность) оперативно связывают, если характер связывания между двумя последовательностями ДНК не представляет собой (1) результат введения мутации со сдвигом рамки в кодирующую последовательность, (2) препятствие способности последовательности промоторной области направлять транскрипцию VEGF145 белковой генной последовательности, или (3) препятствие способности VEGF145 белковой генной последовательности к транскрипции посредством последовательности промоторной области. Таким образом, промоторную область оперативно связывают с последовательностью ДНК, если промотор способен к эффективной транскрипции такой последовательности ДНК. Таким образом,для экспрессии VEGF145 необходимы сигналы транскрипции и трансляции, распознаваемые соответствующим хозяином. Специалисты в данной области узнают,что VEGF145-белок данного изобретения также экспрессируют в различных клеточных системах, как прокариотической, так и эукариотической, все из которых находятся в пределах компетенции данного изобретения. Хотя VEGF145-белок данного изобретения экспрессируют в прокариотических клетках,которые обычно являются очень удобными для продукции рекомбинантных белков, VEGF145,продуцируемый такими клетками не гликозилирован и поэтому имеет более короткое время полужизни in vivo. Прокариотов наиболее часто представляют различными штаммами Е. coli. Однако используют другие штаммы микробов также, включая другие бактериальные штаммы. Признанные прокариотические хозяева включают такие бактерии как Е. coli. Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia и подобные. Прокариотический хозяин должен быть совместим с репликоном и контрольными последовательностями в экспрессирующей плазмиде. В прокариотической системе плазмидные векторы, которые содержат сайты репликации и регуляторные последовательности, получают из видов комплементарных с используемым хозяином. Примеры приемлемых плазмидных векторов включают pBR322, pUC118, pUC119 и подобные; приемлемые векторы фагов или бактериофагов включают gt10, gt11 и подобные; и приемлемые вирусные векторы включаютpMAM-neo, pKRC и подобные. Предпочтительно выбранный вектор данного изобретения ха 004646 20 рактеризуют по способности к репликации в выбранной клетке хозяина. Для экспрессии полипептидов или субъединиц VEGF145 (его функционального производного) в прокариотической клетке, обязательно оперативно связывают белковую последовательность VEGF145 с функциональным прокариотическим промотором. Такие промоторы являются или конститутивными, или более предпочтительно регулируемыми (то есть индуцибельными или репрессибельными). Примеры конститутивных промоторов включают intпромотор бактериофага , blа-промотор генной последовательности -лактамазы pBR322 и CAT промотор генной последовательности хлорамфениколацетилтрансферазы pPR325 и подобные. Примеры индуцибельных прокариотических промоторов включают главные правый и левый промоторы бактериофага(PL и РR), trp,recA, acZ, acI и gal промоторы Е. coli, амилазу (Ulmanen et al., J. Bacteriol. 162:176-182Streptomyces (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203:468-478 (1986) ). Прокариотические промоторы рассматривают Glick (J. Ind. Microbiot. 1:277-282 (1987, Cenatiempo (Biochimie 68:505516 (1986 и Gottesman (Ann. Rev. Genet. 18:415-442 (1984. Надлежащая экспрессия в прокариотической клетке также требует сайтов связывания рибосом в 3'-5' направлении генной кодирующей последовательности. Такие сайты связывания рибосом описывают, например. Gold et al.(Ann. Rev. Microbiol. 35:365-404 (1981. Рибосом-связывающий сайт и другие последовательности, требуемые для инициации трансляции,оперативно связывают с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей VEGF145, посредством, например, сшивания рамок синтетических олигонуклеотидов, которые содержат такие регуляторные последовательности. Экспрессия в прокариотических клетках не требует никакой сигнальной пептидной последовательности. Выбор регуляторных последовательностей, экспрессирующих векторов, способов трансформации и подобное зависит от типа клетки хозяина,используемой для экспрессии гена. Приводимые в изобретении термины"клетка", "клеточная линия" и "клеточная культура" используют как взаимозаменяемые, и все такие обозначения включают потомство. Таким образом, слова "трансформант" или "трансформированные клетки" означают первичную клетку субъекта и культуры, полученные из нее, не учитывая число переносов. Полагают, чтоVEGF145, экспрессированный в прокариотических клетках, содержит смесь правильно ини 21 циированных VEGF145 белковых пептидов с Nконцевой последовательностью, предсказанной из последовательности экспрессирующего вектора, и VEGF145 белковые пептиды, которые имеют N-концевой метионин, являющегося следствием неэффективного отщепления метионина инициации во время бактериальной экспрессии. Считают, что оба типа VEGF145 пептидов соответствуют компетенции данного изобретения, так как не является неожиданным,что наличие N-концевого метионина влияет на биологическую активность. Также не предполагают, что всe потомство нельзя точно идентифицировать по содержанию ДНК из-за намеренных или небрежных мутаций. Однако установлено, что мутантное потомство имеет такую же функциональность, как и первоначально трансформированные клетки. Предпочтительные прокариотические векторы включают плазмиды, способные реплицироваться в Е. coli (такие как, например, pBR322,Co1E1, pSC101, pACYC 184, VX. Такие плазмиды, например, описывают Sambrook (cf.Infect. Dis. 8:693-704 (1986 и Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742 (1978. Эукариотические клетки хозяина, которые используют в экспрессирующих системах данного изобретения, не являются строго ограниченными, при условии, что они соответствуют использованию в экспрессии VEGF145. Предпочтительные эукариотические хозяева включают,например, дрожжи, грибы, клетки насекомых,клетки млекопитающих или in vivo, или в культуре ткани. Клетки млекопитающих, которые полезны в качестве хозяина, включают клеткиHeLa," клетки фибробластной природы такие,как VERO или СНО-K1, или клетки лимфоидного происхождения и их производные.VЕGF145-белки данного изобретения также экспрессируют в клетках человека таких, как 293EBNA клетки эмбриональных почек человека, которые экспрессируют ядерный антиген 1 вируса Эпштейн-Барр, как описывают, например, Olofsson, В. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2576-2581 (1996). Клетки трансфицируют экспрессирующими векторами, используя кальций-фосфатную преципитацию, а затем клетки 22 инкубируют, по крайней мере, 48 ч. VЕFG145 пептиды затем очищают из супернатанта, как описывают в примере 3. Кроме того, клетки растений также приемлемы в качестве хозяев, и контрольные последовательности, комплементарные растительным клеткам, доступны такие, как мозаичный вирус цветной капусты 35S и 19S, и промотор нопалин синтазы и сигнальные последовательности полиаденилирования. Другим предпочтительным хозяином является клетка насекомого, например, Дрозофила личинок. Используя клетки насекомых в качестве хозяина, применяют промотор алкогольдегидрогеназы Drosophila. Rubin,Science 240:1453-1459 (1988). Любые из серий используемых систем экспрессии генной последовательности дрожжей, которые включают промотор и элементы терминации из активно экспрессируемых генных последовательностей, кодирующих гликолитические ферменты, продуцируются в больших количествах, когда дрожжи растут в средах, богатых глюкозой. Известные гликолитические последовательности генов также обеспечивают очень эффективные транскрипционные контрольные сигналы. Дрожжи обладают существенными преимуществами, которые заключаются в том, что они выполняют посттрансляционные модификации пептидов. Существует ряд стратегий рекомбинантных ДНК, которые используют устойчивые промоторные последовательности и большое число копий плазмид, которые применяют для продукции требуемых белков в дрожжах. Дрожжи распознают лидерные последовательности на клонированных продуктах генной последовательности млекопитающих и секретируют пептиды, несущие лидерные последовательности (то есть препептиды). Для млекопитающего-хозяина имеются некоторые возможные векторные системы для экспрессии VEGF145 пептидов. Большое разнообразие транскрипционных и трансляционных регуляторных последовательностей используют в зависимости от природы хозяина. Регуляторные факторы транскрипции и трансляции получают из вирусных источников таких, как аденовирус, вирус папилломы быка, цитомегаловирус, обезьяний вирус и подобные, у которых регуляторные сигналы ассоциированы с особой генной последовательностью, которая характеризуется высоким уровнем экспрессии. Альтернативно, применяют промоторы из продуктов экспрессии млекопитающего, таких как актин, коллаген,миозин и подобные. Выбирают регуляторные сигналы инициации транскрипции, которые предусматривают подавление или активацию так, что модулируют экспрессию генной последовательности. Интересными являются регуляторные сигналы, которые оказываются термочувствительными настолько, что при изменении температуры подавляют или инициируют экс 23 прессию, или подвергаются химической (такой как метаболит) регуляции. Экспрессия VEGF145 у эукариотических хозяев требует использования эукариотических регуляторных областей. Такие области обычно включают промоторную область, достаточную,чтобы направлять инициацию синтеза РНК. Предпочтительные эукариотические промоторы включают, например, промотор генной последовательности металлотионина 1 мыши (Hameret al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288 (1982; TK промотор вируса герпеса (McKnight, Cell 31:355-365 (1982; ранний промотор SV40 (Benoist et al., Nature (London) 290:304-310 (1981; промотор генной последовательности ga14 дрожжей (Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci.Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5951-5955, (1984. Трансляцию эукариотической мРНК инициируют на кодоне, который кодирует сначала метионин. По этой причине предпочтительно обеспечивают связывание между эукариотическим промотором и последовательностью ДНК,которая кодирует VEGF145 (или его функциональное производное) и не содержит никаких мешающих кодонов, которые могут кодировать метионин (то есть AUG). Присутствие таких кодонов приводит или к образованию слитого белка (если AUG кодон находится в той же рамке считывания, что VEGF145-белок, кодирующая последовательность) или к мутации со сдвигом рамки (если AUG кодон не находится в той же рамке считывания, что VEGF145-белок кодирующая последовательность).VЕGF145-молекулу нуклеиновой кислоты и оперативно связанный промотор вводят в клетку прокариотического или эукариотического реципиента или нереплицируемую молекулу ДНК (или РНК), которая является или линейной, молекулой, или более предпочтительно кольцевой молекулой ковалентно замкнутой. Так как такие молекулы не способны к автономной репликации, экспрессия гена происходит посредством кратковременной экспрессии введенной последовательности. Альтернативно,постоянная экспрессия происходит посредством интеграции введенной последовательности ДНК в хромосому хозяина. Применяют вектор, который способен к интегрированию требуемых генных последовательностей в хромосому клетки хозяина. Клетки, которые стабильно интегрируют вводимую ДНК в свои хромoсомы, выбирают также посредством введения одного или больше маркеров, что допускает отбор клеток хозяина, которые содержат экспрессирующий вектор. Маркеры предназначают для прототрофного до ауксотрофного хозяина, биоцид-резистентности, например, к антибиотикам, или тяжелым металлам таким, как медь или подобные. Выбранную маркерную генную последовательность или непосредственно связывают с ДНК генных после 004646 24 довательностей, чтобы экспрессировать, или вводят в ту же клетку посредством котрансфекции. Дополнительные элементы также необходимы для оптимального синтеза мРНК одноцепочечного связывающего белка. Эти элементы включают сигналы сплайсинга, также как и промоторы транскрипции, энхансеры и сигналы терминации. кДНК экспрессирующие векторы,включающие такие элементы, включают векторы, которые описывают Okayama, Molec. Cell.Biol. 3:280 (1983). Введенную молекулу нуклеиновой кислоты вводят в плазмиду или вирусный вектор,способный к автономной репликации у реципиентного хозяина. Для этих целей применяют любой из большого разнообразия векторов. Факторы, имеющие значение в отборе отдельной плазмиды или вирусного вектора, включают легкость, с которой клетки реципиента, которые содержат вектор, узнаются и отбираются от тех клеток реципиента, которые не содержат вектор; количество копий вектора, которое требуется для отдельного хозяина; и желательно,чтобы вектор смог быть "челноком" между клетками хозяина различных видов. Предпочтительные эукариотические плазмиды включают, например, BPV, коровью оспу,SV40, 2-микронное кольцо и подобные или их производные. Такие плазмиды хорошо известны в данной области (Botstein et al., Miami Wntr.Press, NY, pp. 563-608 (1980. Если вектор или молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую конструкцию(ии), полученные для экспрессии, ДНК-конструкцию(ии) вводят в соответствующую клетку хозяина с помощью любого из множества приемлемых способов, то есть трансформации, трансфекции,конъюгации, слияния протопластов, электропорации метода бомбардировки частицами, липофекции, кальций фосфатной преципитации, направленной микроинъекции, транфекции посредством ДЕАЕ-декстрана и подобных. Наиболее эффективный способ трансфекции эукариотических клеточных линий плазмидной ДНК меняется с типом клеток. После введения вектора, клетки реципиента растут в выбранной среде, которую отбирают для роста векторсодержащих клеток. Экспрессия молекулы(ул) клонированного гена приводит к продукцииVEGF145. Это имеет место в трансформированных клетках как таковых, или после индукции этих клеток к дифференцировке (например, посредством введения бромодеокпиурацила в клетки нейробластомы или подобные). Разнооб 25 разные условия инкубации используют для образования пептида данного изобретения. Наиболее предпочтительными условиями являются условия, имитирующие физиологические. Продукцию стабильных трансфектантов достигают, например, посредством трансфекции соответствующей линии клеток эукариотическим экспрессирующим вектором таким, как рСЕР 4, в котором кодирующую последовательность VEGF145 клонируют в многочисленные сайты клонирования. Эти экспрессирующие векторы содержат промоторную область такую,как цитомегаловирусный промотор человека(CMV), который направляет высокий уровень транскрипции требуемых молекул ДНК в различных клетках млекопитающих. Кроме того,эти векторы содержат гены для селекции клеток, которые стабильно экспрессируют интересующую молекулу ДНК. Выбранный маркер в рСЕР 4 векторе кодирует фермент, который приводит к появлению резистентности к гидромицину, ингибитору метаболизма, который добавляют в культуру, чтобы убить нетрансфицированные клетки. Клетки, которые стабильно инкорпорируют трансфицированную ДНК, идентифицируют по их резистентности к среде селекции, как описано выше, и клональные клеточные линии вызывают экспансию резистентных колоний. Экспрессию VEGF145 этими клетками оценивают с помощью методов, известных в данной области,например, гибридизации в растворе и Нозернблоттинга-анализа. Фармацевтические композиции и способы их терапевтического применения Еще одним направлением этого изобретения является обеспечение VEGF145 в фармацевтической композиции, допустимой для терапевтического применения. Таким образом, в этом аспекте изобретение предлагает способ для стимулирования пролиферации клеток сосудов у пациента посредством введения терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей VEGF145. Под термином "терапевтически эффективное количество" подразумевают количество соединения, которое вызывает желаемый терапевтический эффект у пациента. Например, относительно заболевания или нарушения, оно представляет собой количество, которое снижает до некоторой степени один или более симптомов заболевания или нарушения и возвращает к норме или частично, или полностью физиологические или биохимические параметры, ассоциированные или являющиеся причиной заболевания или нарушения. Если используют для терапевтического лечения пациента, полагают, что количество составляет между 0,1 мг/кг до 100 мг/кг, предпочтительно меньше, чем 50 мг/кг,более предпочтительно меньше, чем 10 мг/кг,более предпочтительно меньше, чем 1 мг/кг. 26 Количество соединения зависит от возраста,веса и заболевания пациента. Оптимальная композиция и способ введения соединений данной заявки пациенту зависит от факторов, известных в данной области таких,как частное заболевание или нарушение, желаемый эффект и тип пациента. Хотя соединения обычно используют для лечения людей, их также применяют для лечения подобных или идентичных заболеваний у других млекопитающих таких, как другие приматы, животных ферм таких, как свинья, крупный рогатый скот и домашняя птица, и спортивных животных и комнатных животных таких, как лошади, собаки и кошки. Предпочтительно, терапевтически эффективное количество обеспечивают в виде фармацевтической композиции. Под термином фармакологический агент или композиция подразумевают агент или композицию в форме приемлемой для введения в многоклеточный организм такой, как человек. Приемлемые формы отчасти зависят от использования и способа введения, например, орального, трансдермального или посредством инъекции. Такие формы позволяют агенту или композиции взаимодействовать с клеткой-мишенью, если клеткамишень присутствует в многоклеточном хозяине или в культуре. Например, фармакологические агенты или композиции, вводимые в кровоток, являются растворимыми. Другие факторы, известные в данной области, включают такие обстоятельства, как токсичность и формы,которые предотвращают действие агента или композиции. Заявленные композиции также готовят в виде фармацевтически приемлемых солей (например, соли присоединения кислот) и/или их комплексов. Фармацевтически приемлемые соли являются нетоксичными солями в концентрациях, при которых их вводят. Препараты таких солей способствуют фармакологической пользе посредством изменения физикохимических характеристик композиции, не препятствуя проявлению физиологического действия композиции. Примеры благоприятных изменений в физических свойствах включают снижение точки плавления, что способствует введению через слизистые и увеличению растворимости, для облегчения введения более высоких концентраций лекарственного соединения. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислот, включают такие, как соль серной кислоты, гидрохлорид,фосфат, сульфонат, соль сульфаминовой кислоты, соль серной кислоты, ацетат, цитрат, лактат,соль винной кислоты, метансульфонат, этансульфонат, соль бензоилсульфокислоты, п-соль толуолсульфокислоты, циклогексилсульфонат,циклогексилсульфамат и соль хинной кислоты. Фармацевтически приемлемые соли получают 27 из кислот таких, как хлористо-водородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота,сульфокислота, сульфаминовая кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, молочная кислота, винная кислота, малоновая кислота, метансульфокислота, этансульфокислота, бензоилсульфокислота, толуолсульфокислота, циклогексилсульфокислота, циклогексилсульфаминовая кислота и хинная кислота. Такие соли готовят посредством реакции свободной или кислой форм продукта в растворителе или среде, в которой соль нерастворима, или в таком растворителе, как вода, которую затем удаляют под вакуумом или посредством сушки при температуре ниже 0 С, или посредством обмена ионов существующей соли на другой ион на соответствующей ионообменной смоле. Носители или наполнители также используют для улучшения введения соединения. Примеры носителей и наполнителей включают углекислый кальций, фосфорнокислый кальций,различные сахара такие, как лактоза, глюкоза или сахароза, или виды крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла, полиэтиленгликоли и физиологически совместимые растворители. Композиции или фармацевтическую композицию вводят различными способами, включающими, внутримышечное, внутрибрюшинное, подкожное и внутривенное введение, оральное, местное введение или введение через слизистые. Необходимую изотоничность достигают,используя хлористый натрий или другие фармацевтически приемлемые агенты такие, как декстроза, борная кислота, виннокислый натрий,припиленгликоль, полиолы (такие как маннит и сорбит) или другие неорганические или органические растворенные вещества. Хлористый натрий особенно предпочитают для буферных растворов, содержащих ионы натрия. Соединения изобретения готовят для различных способов введения, включая системное и местное или локализованное введение. Способы и технологии обычно обнаруживают в(1988). Практический врач лучше всего определяет приемлемое введение препарата для каждого пациента индивидуально. Для системного введения предпочитают инъекцию, например, внутримышечную, внутривенную, внутрибрюшинную, подкожную,подоболочечную или интрацеребровентрикулярную (в желудочек мозга). Для инъекции соединения изобретения готовят в жидких растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферных растворах таких, как сбалансированный солевой раствор Хэнкса и рас 004646 28 твор Рингера. Альтернативно, композиции изобретения готовят с одним или более наполнителей (например, пропиленгликолем), которые являются общепринятыми допустимыми наполнителями, что определено в Фармакопеe стандартов США. Например, композиции суспендируют в инертном масле, в приемлемом растительном масле таком, как кунжутовое масло,арахисовое масло, оливковое масло, или другие допустимые носители. Предпочтительно, их суспендируют в водном носителе, например, в изотоническом буферном растворе при рН приблизительно 5,6 до 7,4. Эти композиции стерилизуют с помощью общепринятого способа стерилизации или фильтруют в стерильных условиях. Композиции содержат фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые необходимы для приближения к физиологическим условиям, такие как рН забуферивающие агенты. Полезные буферные растворы включают, например, ацетат натрия - уксусная кислота - буферы. Форму депонированного, или"депо", медленно высвобождаемого соединения используют так, что терапевтически эффективное количество соединения доставляют в кровоток в пределах многих часов или дней после чрескожной инъекции или доставки. Кроме того, композиции готовят в твердой форме и повторно растворяют или суспендируют непосредственно перед применением. Также используют лиофилизированные формы. Надувной баллонный катетер с VEGF145 белком, покрывающим баллон, также применяют для доставки вещества в артерию-мишень. Альтернативно, соединения вводят орально. Для орального введения соединения готовят в общепринятых оральных дозированных формах таких, как капсулы, таблетки и тонизирующие средства. Системное введение осуществляют с помощью способов введения через слизистые и чрескожное введение или молекулы вводят орально. Для введения через слизистые и кожу в композициях используют соответствующие смачивающие реагенты для проникновения через барьеры. Такие смачивающие реагенты известны в данной области и включают, например, для введения через слизистые соли желчной кислоты и производные фусидовой кислоты. Кроме того, используют детергенты для улучшения проникновения. Введение через слизистые, например, осуществляют, используя назальные спреи или суппозитории. Для орального введения композиции готовят в общепринятых оральных дозированных формах введения таких, как капсулы, таблетки, и жидкие препараты. Для местного введения соединения изобретения готовят в виде мазей, целебных бальзамов, гелей или кремов, которые известны в данной области. 29 Если необходимо, растворы вышеупомянутых композиций сгущают с помощью загустителя такого, как метилцеллюлоза. Эти композиции готовят в эмульгированной форме или вода в масле или масло в воде. Применяют любой из большого разнообразия фармацевтически приемлемых эмульгаторов, включающих, например, порошок акации, неионное поверхностно-активное вещество (такое как твин) или ионное поверхностно-активное вещество (такое как щелочные сульфаты полиэфирных спиртов, например, тритон). Полезные композиции изобретения готовят смешиванием ингредиентов общепринятыми способами. Например, выбранные соединения просто смешивают в смесителе (на мешалке) или в другом стандартном приспособлении,чтобы получить концентрированную смесь, которую затем приводят к конечной концентрации и вязкости добавлением воды или загустителя и,возможно, буфера до контрольного рН или дополнительного растворенного вещества до контрольной концентрации. Вводимые количества различных соединений этого изобретения определяют стандартными способами. Обычно терапевтически эффективное количество составляет между приблизительно 1 нмоль и 3 мкмолями молекулы, предпочтительно между приблизительно 10 нмолей и 1 мкмолем в зависимости от возраста, веса пациента. Обычно это количество составляет между приблизительно 0,1 и 50 мг/кг, предпочтительно 1 и 20 мг/кг животного, которое лечат. Для применения врачами предлагают композиции в форме с дозированной единицей, содержащей количество VEGF145. Генная терапия(1992. Miller констатирует, что имеются успехи в результате практического применения генной терапии человека, которая демонстрирует начальные положительные результаты. Основные направления генной терапии описываютMulligan, Science 260:926-931 (1993). Один пример генной терапии представляют в примереVII, который описывает применение генной терапии, опосредованной аденовирусом. В качестве другого примера приводят экспрессирующий вектор, содержащий VEGF145 кодирующую последовательность, вводят в клетки, клетки выращивают in vitro и затем вводят в больших количествах пациентам. В еще одном примере сегмент ДНК, содержащий промотор из отобранных (например, сильный промотор), переносят в клетки, содержащие эндогенный VEGF145 таким способом, что промоторный сегмент усиливает экспрессию эндогенного гена VEGF145 (например, промоторный сегмент переносят в клетку так, что он непосредственно связывается с эндогенным VEGF145 30 Генная терапия предусматривает использование аденовирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую VEGF145, или "голую" молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую VEGF145. Альтернативно, вводят инженерные клетки, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующуюVEGF145. Пример VII иллюстрирует способ генной терапии, использующий аденовирусный вектор для обеспечения ангиогенной терапии. Экспрессирующие векторы, производные вирусов таких, как ретровирусы, вирус коровьей оспы, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирусы герпеса, РНК-вирусы или вирус папилломы крупного рогатого скота, используют для доставки нуклеотидных последовательностей (например, к кДНК), кодирующих рекомбинантный VEGF145 в таргетированной клеточной популяции. Способы, которые известны специалистам в данной области, используют для конструирования рекомбинантных вирусных векторов, содержащих кодирующие последовательности. См., например, Nabel, E.G., Circulation, 91, 541-548 (1995), способы, описанныеWiley Interscience, N.Y. (1989). Альтернативно,рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие белковые последовательности, используют в качестве "голой" ДНК или в реконструированной системе, например, липосомах или других липидных системах для доставки в клетки-мишени (cм., например, Felgneret al., Nature 337:387-8, 1989). Некоторые другие способы прямого переноса плазмидной ДНК в клетки имеются для применения в генной терапии человека и включают таргетирование ДНК к рецепторам на клетках посредством связывания плазмидной ДНК с белком (cм. Miller, Nature 357:455-60, 1992). В простейшем виде перенос гена проводят посредством простого инъецирования мельчайших количеств ДНК в ядро клетки, с помощью микроинъекции. Capecchi, M.R., Cell 22:479-88(1980). Как только рекомбинантные гены вводят в клетку, они узнаются посредством нормальных клеточных механизмов транскрипции и трансляции, и экспрессируется генный продукт. Также пытаются использовать другие способы для введения ДНК в больших количествах в клетки. Эти способы включают трансфекцию,при которой ДНК осаждают СаРО 4, и затем клетка захватывает ДНК посредством пинозитоза (Chen, С. and Okayama, H., Mol. Cell Biol. 7:2745-52 (1987; электропорации, когда клетки экспонируют при высоком напряжении тока для создания отверстий в мембране (Chu, G. et al.,Nucleic Acids Res., 15:1311-26 (1987; липофекции-липосомного слияния, когда ДНК упаковывают в липофильные везикулы, которые слива 31 ются с клеткой-мишенью (Felgner, P.L., et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7413-7 (1987; и бомбардировку частицами, используя ДНК, связанную с небольшими "снарядами" (Yang, N.S.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:9568-72 (1990. В другом способе введения ДНК в клетки ДНК связывают с химически модифицированными белками. Также показано, что аденовирусные белки могут дестабилизировать эндосомы и увеличивать поглощение ДНК в клетках. Смешивание аденовируса с растворами, содержащими комплексы ДНК, или связывание ДНК с полилизином, ковалентно присоединенным к аденовирусу, используя белковые поперечно-сшивающие агенты, существенно улучшают поглощение и экспрессию рекомбинантного гена. Curiel, D.T.,et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 6:247-52(1992). Применяют баллонные катетеры, которые используют при ангиопластике, при этом баллон покрывают VEGF145-ДHК или векторами,как описывает Riessen, R., Human Gene Therapy,4, 749-758 (1993), в работе, цитируемой в изобретении. Используемый в изобретении термин "перенос гена" означает процесс введения чужеродной молекулы нуклеиновой кислоты в клетку. Перенос гена обычно проводят, чтобы обеспечить экспрессию данного продукта, кодируемого геном. Продукт включает белок, полипептид, антисмысловую последовательность ДНК или РНК, или энзиматически активную РНК. Перенос гена проводят в культивируемые клетки или посредством прямого введения животным. Обычно перенос гена включает процесс контакта молекулы нуклеиновой кислоты с клеткой-мишенью с помощью неспецифического или рецептор-опосредованного взаимодействия, поглощение молекулы нуклеиновой кислоты клеткой через мембрану или посредством эндоцитоза, и секрецию молекулы нуклеиновой кислоты в цитоплазму из плазматической мембраны или эндосом. Кроме того, экспрессия требует передвижения молекулы нуклеиновой кислоты в ядро клетки и связывание с соответствующими ядерными факторами для транскрипции. Используемое в изобретении понятие"генная терапия" означает форму переноса гена и входит в понятие "перенос гена", которое используют в изобретении, и специфически относится к переносу гена для экспрессии терапевтического продукта из клетки in vivo или invitro. Перенос гена осуществляют на клетках ехvivo, затем клетки трансплантируют пациенту,или проводят прямое введение пациенту молекулы нуклеиновой кислоты или комплекса нуклеиновая кислота - белок. В другом предпочтительном направлении вектор, содержащий последовательности молекул нуклеиновых кислот, кодирующие VEGF145, 004646 32 обеспечивает то, что молекула нуклеиновой кислоты экспрессируется только в специфической ткани. Способы ткань-специфической экспрессии гена излагают в International PublicationWO 93/09236, направленной 3 ноября 1992 и опубликованной 13 мая 1993. Для всех вышеописанных векторов следующим аспектом изобретения является то, что последовательность нуклеиновых кислот, заключенная в вектор, включает вставки, делеции или модификации в некоторой части или во всей последовательности нуклеиновых кислот,как описано выше. Еще в одном предпочтительном направлении излагают способ генного замещения. "Генное замещение", как применяют в изобретении,подразумевает поставку последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, которая способна экспрессироваться in vivo, животному и,тем самым, обеспечивая усиление функции эндогенного гена, который имеется в недостаточном количестве, или дефектен. Клиническое применение Стимулирование ангиогенеза у млекопитающих трансфекцией эндотелиальных клеток полинуклеотидом, кодирующим VEGF145, выполняют согласно способу, описанному Giordano et al. in "Intracoronary Gene Transfer of Fibroblast Growth Factor-5 Increases Blood Flow anVEGF145 секретируется из клеток, инфицированных аденовирусным вектором, направляющим экспрессию VEGF145, в клетках сердца. Такую секретируемость обнаруживают дляVEGF121 и VEGF165, но не для VEGF189 илиVEGF206. Однако VEGF145, в отличие от VEGF121 или VEGF165, частично сохраняется молекулами ЕСМ, так как VEGF145 диффундирует в направлении эндотелиальных клеток-мишеней смежных кровеносных сосудов. Связанный VEGF145 медленно освобождается позже, таким образом,пролонгируя ангиогенное действие по сравнению с VEGF121 или VEGF165. Кроме того,VEGF145, связанный с ЕСМ, активен и поддерживает вновь синтезированные кровеносные сосуды во время критического периода созревания кровеносных сосудов до тех пор, пока не перестанут зависеть от присутствия ангиогенных ростовых факторов. Таким образом,VEGF145 является более эффективным, чем любая другая форма VEGF, как терапевтический агент, который используют для индукции коллатеральных кровеносных сосудов. Эти преимущества являются решающими при рассмотрении применения экспрессирующих векторов на основе аденовирусов для доставки ангиогенных факторов при генной терапии. Преимущество использования аденовирусных векторов заключается в том, что они безопасны. Вирус быстро утрачивается после первоначальной 33 инъекции, и это сопровождается уменьшением в продукции рекомбинантного белка (Kass-Eisler,A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1149811502, 1993). Так как характеристики связывания VEGF145 допускают его выведение при более низкой скорости по сравнению с другими секретируемыми формами VEGF, мы ожидаем,что VEGF145 является более эффективным терапевтическим агентом по сравнению с другими формами VEGF. Баллонная ангиопластика является главным способом лечения ишемической болезни сердца, который включает надувание баллона в закупоренном кровеносном сосуде для того,чтобы открыть блокированный кровеносный сосуд. К сожалению, этот способ лечения часто приводит к повреждению эндотелиальных клеток, выстилающих внутренние стенки кровеносных сосудов, вызывая вторичную обструкцию в процессе, называемом рестеноз. VEGF145 применяют для индукции пролиферации эндотелиальных клеток, локализованных по периферии индуцированного баллоном повреждения области для того, чтобы покрыть поверхность просвета сосуда новым монослоем эндотелиальных клеток, предполагая восстановить первичную структуру кровеносного сосуда. Опосредованную аденовирусом генную терапию также применяют в случае, когда способ направляют на доставку стимуляторов пролиферации эндотелиальных клеток к поврежденному участку при процедуре баллонной ангиопластики. Способность связывать ЕСМ придает дополнительные преимущества этой заявке. Рассматривают два типа подходов для предупреждения рестеноза после баллонной ангиопластики. Имеется возможность доставлять белок или доставлять экспрессирующий вектор, который направляет экспрессию такого белка в участке закупорки, используя баллон,который применяют для открытия закупоренного сосуда. Такой белок также ингибирует пролиферацию неэндотелиальных клеток, которые вторгаются в повторно открытый сосуд до тех пор, пока эндотелиальные клетки с обеих сторон поврежденных эндотелиальных клеток в виде монослоя успешно вновь не станут расти. Это сочетают с доставкой белка или вектора такого, как рекомбинантный аденовирус, который содействует повторному восстановленному росту слоя эндотелиальных клеток. Однако ростовые факторы такие, как FGF-5, bFGF или HGF также являются митогенами для гладкомышечных клеток и индуцируют их пролиферацию,что является нежелательным эффектом. С другой стороны, VEGFы являются специфичными для эндотелиальных клеток. VEGF145 особенно полезен в этом случае из-за его связывающих ЕСМ свойств. После применения, например,посредством инфицирования смежных клеток аденовирусом, кодирующим белок, направленной трансфекцией плазмидной ДНК, или непо 004646 34 средственной доставки белка, VEGF145 помещают в обнаженный внеклеточный матрикс в обработанном баллоном сосуде и стимулируют пролиферацию и повторный рост эндотелиальных клеток специфически в участке повреждения. Таким образом, VEGF145 локализуют и концентрируют в той самой области, где необходима его активность, что делает его особенно привлекательным кандидатом для использования при лечении рестеноза. Коронарную ангиопластику часто сопровождают развертыванием внутрисосудистого стента, чтобы поддержать функцию сосуда и избежать рестеноза. Стенты покрывают гепарином для предотвращения тромбоза до тех пор,пока новый канал, сформированный с помощью стента, не эндотелизируется. VEGF145 применяют непосредственно в стент, или нуклеиновые кислоты, кодирующие VEGF145, такие как плазмиды; кДНК или аденовирусные векторы применяют в стенте для прямой трансфекции соседних клеток, используя методы, известные специалистам в данной области. Применяемый местно или продуцируемый трансфекциейVEGF145 увеличивает эндотелизацию стента и,таким образом, снижает тромбоз и рестеноз. Рассматривают другие предложения для использования ростового фактора данного изобретения. Один пример представляет собой способ лечения язвы. Язва, в действительности,является раной, расположенной в желудке. Показано, что ангиогенные ростовые факторы эффективны при лечении язв двенадцатиперстной кишки и что стабилизация ангиогенными ростовыми факторами представляет собой механизм,посредством которого некоторые такие терапевтические агенты, как сукралфат, оказывают благотворное воздействие (Szabo, S., et al., Gastroenterology 106, 1106-1111, 1994). Так как VEGF является ангиогенным ростовым фактором, который очень стабилен при кислых условиях,рассматривают его применение для лечения язв желудка и двенадцатиперстной кишки. Способность VEGF145 связывать гепарин, который способствует сохранению его активного состояния,и предполагаемая способность VEGF145 связывать открытый ЕСМ в раненом участке, указывает, что VEGF145 является более приемлемым,чем другие формы VEGF, для лечения язв желудка и дуоденума. Для оценки возможностей данного изобретения следующие примеры включают описание результатов серии экспериментов. Эксперименты, относящиеся к данному изобретению, конечно, не рассматривают как ограничивающие изобретение; и такие варианты изобретения,известные сейчас или разработанные позже,которые рассматриваются специалистами в данной области, обсуждают и описывают в пределах изобретения и в дальнейшем в формуле изобретения.VEGF145. Анализ мРНК из эпителиальных клеток карциномы яичников человека ОС-238, клетокHeLa и клеток А 431 методом PCR с обратной транскриптазой (фиг. 5) определяет форму мРНК-VEGF, соответствующую по размеру предсказанной длине формы мРНК-VEGF, кодирующей предполагаемый зрелый белок из 145 аминокислот. Продукт PCR с обратной транскриптазой из клеток ОС-238 секвенируют и обнаруживают, что он содержит структуру экзонов 1-5, 6 а, 8; которая является предполагаемой структурой мРНК, кодирующей VEGF145. кДНК,которую секвенируют, получают, используя праймеры GGAGAGATGAGCTTCCTACAG иTCACCGCCTTGGCTTGTCACA,соответствующие последовательностям, кодирующим аминокислоты 92-98 из VEGF (общие для всех форм VEGF) и 6 аминокислот из карбоксильного конца VEGF, кодируемые экзоном 8 генаVEGF. Оказывается, что во всех этих линиях клеток предполагаемая кДНК, кодирующая 145 аминокислот, экспрессируется в уровнях, сравнимых с уровнями VEGF165 и более высоких,чем уровни VEGF189. мРНК, кодирующую эту форму VEGF, не определяют в некоторых других линиях трансформированных клеток таких,как С 6-клетки глиомы и U937 клетки. Анализ последовательности предполагаемого продуктаPCR из ОС-238 клеток, показывает, что мРНК содержит экзоны 1-5, 6 и 8 гена VEGF в последовательности (VEGF145). Для того чтобы получить рекомбинантныйVEGF145, мы получаем конструкцию кДHKVEGF145 посредством вырезания олигонуклеотидов, кодируемых экзоном 7 из кДНК-VEGF189. Праймеры, используемые для амплификации экзонов 1-6 кДНК-VEGF, являются внешним праймером, GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGG, соответствующим рuс 118 последовательности, и внутренним праймером,ACGCTCCAGGACTTATACCGGGA, соответствующим последовательности на 3' конце экзона 6. Праймеры, использованные для амплификации 3' конца кДНК-VEGF, комплиментарны последовательности рuс 118GGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTC и 3' концу экзон 6-последовательности (подчеркнутая) и началу экзона 8 (CGGTATAAGTCCTGGAGCGTATGTGACAAGCCGAGGCGGTGA). После амплификации продукты PCR осаждают, и продукты реамплифицируют, используя только рuс 118 производные внешних праймеров. Продукты очищают электрофорезом, субклонируют в PCR-II вектор,секвенируют, используя набор Секвеназа-II, полученный от U.S. Biochemical Corp. (Cleveland, Ohio). Эту кДНК в дальнейшем используют для исследования экспрессии белка. Эту рекомбинантную кДНК-VEGF145 используют для конструирования рекомбинантного бакуловируса, содержащего кДНК-VЕGF145. Вирус используют для инфицирования Sf9 кле 004646 36 ток как для VEGF165 Cohen, Т., et al., GrowthFactors. 7:131-138, 1992, в работе, цитируемой в изобретении. Большую часть VEGF145, продуцируемого инфицированными Sf9 клетками,обнаруживают в кондиционированной среде в виде гомодимера приблизительно 41 кДа, с небольшим количеством мономерного VEGF145(фиг. 4). Димеры VEGF145 диссоциируют на мономеры при восстановлении дитиотрейтолом.VEGF145 частично очищают с использованием гепарин-сефарозы. Белок элюируют с колонки ступенчатым градиентом соли. Большая частьVEGF145 элюируется при 0,6-0,7 М NaCl, указывая на то, что аффинность связывания VEGF145 с гепарином подобна аффинности VEGF165. Рекомбинантный VEGF145 является биологически активным и индуцирует пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человекаVEGF165 оказывается в 6 раз ниже (фиг. 6). Пример II. Пролиферация эндотелиальных клеток и ангиогенез. Для подтверждения того, что VEGF145 индуцирует ангиогенез in vivo, кДНК-VEGF145 субклонируют в Bam-HI сайте экспрессирующего вектора млекопитающего MIRB, используя способ, описанный Macarthur, С.A., et al.,Cell Growth Differ. 6, 817-825, 1995, в работе,которая цитируется в изобретении.MIRB/VEGF145 плазмиду трансфецируют в клетки почек хомяка ВНK-21 и выделяют стабильные линии клеток, продуцирующиеVEGF145. VEGF145, продуцируемый клетками млекопитающих, является биологически активным и секретируется в ростовую среду. Стабильный клон, продуцирующий 0,1 мг VEGF145 на 106 клеток, выделяют клетки VEGF145 экспрессирующие, включают в альгинатные гранулы и гранулы имплантируют под кожуPlunkett, M.L., et al., Lab. Invest. 62, 510-517,1990, который цитируют в изобретении. Альгинатные гранулы с включенными клетками удаляют через 4 дня и фотографируют (фиг. 11). Кластеры альгинатных гранул, содержащих клетки, экспрессирующие VEGF145, оказываются темно-красного цвета с кровью, тогда как гранулы, содержащие клетки, трансфицированные одним вектором, характеризуются значительно меньшим содержанием крови. При более сильном увеличении оказывается, что гранулы,содержащие клетки, продуцирующие VEGF145,значительно больше васкуляризированы, чем гранулы, содержащие контрольные клетки. Эти результаты согласуются с предполагаемым характером пролиферации клеток сосудов или фактора, стимулирующего ангиогенез. Пример III. Характеристики связывания рецептора.VEGF165 связывается с тремя VEGFрецепторами на HUVEC клетках в то время, 37 как VEGF121 связывается только с более крупным рецептором. Обычным рецептором, которым связывают VEGF121 и VEGF165, является KDR/flk-1 VEGF-рецептор (Gitay-Goren, H.,et al., J. Biol. Chem. 271, 5519-5523, 1996). Для определения характера узнавания рецептораGitay-Goren, H., et al., J. Biol. Chem. 271, 55195523, 1996, и цитируют в изобретении) связывают с HUVEC клетками в присутствии 1 мкг/мл гепарина и увеличивающихся концентраций VEGF145. Связанный 125I-VEGF165 впоследствии ковалентно сшивают с VEGFрецепторами. VEGF145 ингибирует связывание 125I-VEGF165 с KDR/flk-1 рецептором HUVEC клеток, но не два меньшего размера VЕGF165 специфических рецепторов клеток (фиг. 7). Эти результаты проверяют в эксперименте свободного связывания клеток, в которомVEGF145 конкурирует с 125I-VEGF165 за связывание с растворимым слитым белком, содержащим внеклеточный домен flk-1 рецептора.VEGF145 конкурирует скорее неэффективно с 125I-VEGF165 за связывание с двумя меньшего размера VEGF-рецепторами, указывая, что сродство VEGF145 к этим двум рецепторам существенно ниже, чем сродство VEGF165. Из этого следует, что поведение VEGF145 отличается от поведения VEGF165. Присутствие экзона 6 не достаточно, чтобы обеспечить эффективное связывание VEGF145 с этими двумя рецепторами,несмотря на гепаринсвязывающие свойства, которые экзон 6 придает VEGF145. Пример IV. Характеристики связывания ЕСМ.VEGF121 не связывает его совсем. Факт, чтоVEGF189 связывает гепарин с высоким сродством, приводит к предположению, что взаимодействие VEGF189 с ЕСМ опосредуется гепаринсульфат протеогликанами (Houck, K.A., et al., J.Biol. Chem. 267, 26031-26037 (1992); Park, J.E.,et al., Mol. Biol. Cell 4, 1317-1326 (1993. Аффинность связывания гепарина у VEGF145 иVEGF165 одинаковая и существенно ниже, чем аффинность связывания гепарина VEGF189 иVEGF145, и, поэтому, полагают, что VEGF145 плохо связывается с ЕСМ. Неожиданно эксперименты, в которых VEGF145 связывают с ЕСМ,продуцируемым эндотелиальными клетками роговицы быка, показывают, что VEGF145 связывает ЕСМ эффективно, тогда как связываниеVEGF165 является незначительным. В этих экспериментах, результаты которых представляют на фиг. 8, оказалось, что VEGF145 эффективно связывается с ЕСМ, тогда как VEGF165 связывается значительно менее эффективно, если вообще связывается. Связывание 125I-VEGF145 существенно, но не полностью ингибирует гепарин 004646 38 10 г/мл. 125I-VEGF145, используемый в этих экспериментах, содержит некоторое количество примесей, но основной йодированный белок,который выделяют из ЕСМ, имеет массу, соответствующую массе 125I-VEGF145 (см. фиг. 8 В). Чтобы удостовериться, что 125I-VEGF145 связывается с ЕСМ и не связывается с открытой пластиковой поверхностью, ЕСМ соскабливают,промывают посредством центрифугирования и определяют количество адсорбированного 125IVEGF145 в осадке. ЕСМ содержит приблизительно 70% адсорбированного 125I-VEGF145. На основании вышеизложенного мы полагаем, что присутствие пептида, производного экзона 6, вVEGF145 дает возможность эффективно связывать ЕСМ в то время, как пептид, производное экзона 7, присутствующий в VEGF165, не обеспечивает эти свойства. Таким образом, VEGF145 существенно отличается в этом отношении отVEGF121 или VEGF165. Пример V. Характеристики связывания ЕСМ. Вышеописанные эксперименты указывают, что VЕGF145 связывается с ЕСМ в то время,как VEGF165 связывается с матриксом менее эффективно. VEGF145 и VEGF165 связывают с одинаковым сродством гепарин, позволяя предположить, что связывание с ЕСМ не опосредуется гепарин-подобными молекулами. Взаимодействие bFGF с ЕСМ опосредуется гепаринсульфат протеогликанами. Для выяснения,взаимодействует ли VEGF145 с ЕСМ, используя в bFGF-подобный механизм связывания, 125IVEGF145 связывают с ЕСМ, покрывающим чашки, в присутствии 10 мкг/мл гепарина. Связывание VEGF145 ингибируется на приблизительно 60%, тогда как связывание 125I-bFGF с ЕСМ ингибируется на 80%. Связывание 125I-VEGF145 с ЕСМ также ингибируется на 80% в присутствии 0,8 М соли, указывая, что взаимодействие не является гидрофобным. Эти результаты сопоставляют с предполагаемым поведением белков,которые связываются с ЕСМ посредством гепарин-подобных молекул. Однако мы неожиданно наблюдали, что 125I-VEGF145 также способен эффективно связываться с ЕСМ, который подвергают перевариванию гепариназой-II. В отличие от этого, не происходит почти никакого связывания 125I-bFGF с ЕСМ, обработанным гепариназой-II (фиг. 9 А). Это наблюдение указывает, что VEGF145 не связывается с ЕСМ, который ассоциирован с гепарин-подобными молекулами. Для дальнейшего исследования способа взаимодействия VEGF145 с ЕСМ мы исследуем влияние обработки гепарином и гепариназой на освобождение предварительно связанногоVEGF145 из ЕСМ. Подобные различия наблюдают, когда ЕСМ, содержащий связанный 125IVEGF145 или 125I-bFGF, инкубируют с гепарином или обрабатывают гепариназой-II. Когда покрытые ЕСМ лунки инкубируют в течениеI-VEGF145 диссоциируют от ЕСМ. Это освобождение отчасти приписывают протеолитической активности, находящейся в ЕСМ. Когда 10 мкг/мл гепарина вносят в буфер,только 33% 125I-VEGF145 освобождается из матрикса по сравнению с 78%-освобождением предварительно связанного 125I-bFGF. Более резкие различия наблюдают, если гепариназуII добавляют в связывающий буфер. Фермент освобождает 72% связанного 125I-bFGF, но только 17% связанного 125I-VEGF145 (фиг. 9 В). Подобные результаты наблюдают, когда эксперимент проводят с немеченным VEGF145,используя коммерческие моноклональные антитела против VEGF для определенияVEGF, связанного с ЕСМ. Для оценки эффективности переваривания гепариназой-II ЕСМ метаболически метят 35Sсульфатом, и меченый ЕСМ переваривают гепариназой-II. Переваривание освобождает 80-85% меченых остатков сульфата. Чтобы определить,связывает ли VEGF145 ЕСМ, истощенный относительно сульфатированных гликозамингликанов, ВСЕ-клетки выращивают в присутствии 30 мМ хлората, ингибитора сульфатирования гликозамингликана по способу, описанному Miao,H.Q., et al., J. Biol. Chem. 271, 4879-4886, 1996. ЕСМ, продуцируемый в присутствии или в отсутствие хлората, затем гидролизуют смесью гепариназ I, II и III. Ни одна из этих обработок не ингибирует значительно связывание VEGF145 с ЕСМ, несмотря на 95% снижение в содержании сульфатной половины ЕСМ. ЕСМ, продуцируемый ВСЕ-клетками,содержит bFGF, который является митогеном эндотелиальных клеток. Однако эндотелиальные клетки не пролиферируют, когда их высевают на ЕСМ, продуцируемый в присутствии хлората, так как bFGF не связывается с ЕСМ, истощенным относительно сульфатированных гепарин-подобных молекул. VEGF145 связывает ЕСМ, продуцируемый в присутствии хлората, и поэтому, исследуют, сохраняет ли VEGF145, связанный с таким ЕСМ, свою биологическую активность. Лунки, покрытые ЕСМ, продуцируемым в присутствии хлората,инкубируют с возрастающими концентрациями или VEGF145, или VEGF165. Лунки впоследствии интенсивно промывают и HUVEC клетки высевают в лунки. ЕСМ, инкубированный с VEGF145, и индуцирует пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов в то время, как ЕСМ, инкубированный с VEGF165 не индуцирует пролиферацию, указывая, чтоVEGF145, ассоциированный с ЕСМ, является биологически активным (фиг. 10). 40 Пример VI. Сравнение VEGF145 с другими формами VEGF. Обзор различий между VEGF145 и другими формами VEGFFlk-1 и Flt-1 рецепторами Связывание с двумя небольшими VEGF-рецеп+ не опр. не опр. торами эндотелиальных клеток Связывание с+ ЕСМ Защита против окислительного повреждения+ не опр. не опр. гепаринподобными клетками Секреция изVEGF, и у него отсутствует энзон 6. Он связывает гепарин с аффинностью связывания подобной аффиности VEGF145. VEGF145 связывает единственный VEGF-рецептор на эндотелиальных клетках пупочной вены человека, который идентифицирован как KDR/flk-1 VEGF-рецептор. В отличие от этого VEGF165 связывает два дополнительных с высокой аффинностью рецептора, которые присутствуют на эндотелиальных клетках сосудов и некоторых других типах клеток (Neufeld, G., et. al.Cancer Metastasis Rev. 15:153-158, 1996). Еще не ясно, происходит ли связывание VEGF165, но если оно происходит, то эндотелиальные клетки проявляют более ограниченный биологический ответ наVEGF145, чем на VEGF165. VEGF165 более чувствительны к окислительным агентам. Их особенно много в воспаленной ткани и при таких ситуациях,как ранение. Однако когда поврежденный окислением VEGF165 связывает гепарин-подобные молекулы, обнаруженные на эндотелиальных клетках,активность поврежденных VEGF165 восстанавливается (Gitay-Goren, H., et. al. J. Biol. Chem. 271,5519-5523, 1996). VEGF145 также проявляет это свойство. Кроме того, VEGF165 очень слабо связывается с ЕСМ или совсем не связывается. Остаточное связывание VEGF165 с ЕСМ ингибирует последующее переваривание ЕСМ гепариназой. В отличие от этого, связывание VEGF145 с ЕСМ не изменяет предшествующее переваривание ЕСМ гепариназой. Таким образом, несмотря на одинаковую аффинность связывания гепарина VEGF165 и VEGF145, неожиданно, VEGF145 секретируется иVEGF121 не содержит экзоны 6 и 7 генаVEGF. В отличие от VEGF, VEGF121 не связывает гепарин. Подобно VEGF145 VEGF121 не связывает два небольших VEGF-рецептора, обнаруженных на эндотелиальных клетках и в различных типах раковых клеток. Как VEGF121, так и VEGF145 секретируются из клеток, но VEGF121 не связывается с ЕСМ. Окисление инактивируетVEGF121 подобно VEGF145 и VEGF165, но активность VEGF121 не восстанавливается при связывании с гепарин-подобными молекулами. с. Сравнение с VEGF189 и VEGF206.VEGF189 содержит пептиды, кодируемые экзоном 6 и экзоном 7 гена VEGF. Он связывает гепарин с более высоким сродством, чемVEGF145. Он также очень хорошо связывается с ЕСМ. Однако, в отличие от VEGF145, VEGF169 не секретируется в среду клетками, продуцирующими VEGF189, и сохраняется ассоциированным с клеткой. Свойства VEGF206 подобны свойствам VEGF189. Хотя гепарин способствует освобождениюVEGF145 из ЕСМ, также как и VEGF189, вероятно, что VEGF145 не использует ЕСМ резидентные гепарин сульфаты для связывания с матриксом. Мы не смогли продемонстрировать ангиогенный ответ с интактным VEGF189. Это обусловлено прочной ассоциацией VEGF189 с клетками, продуцирующими VEGF189 и с ЕСМ,обнаруживаемым в непосредственной близости от клеток, продуцирующих VEGF189. В отличие от этого, мы показали, что VEGF145 освобождается из продуцирующих клеток и стимулирует ангиогенез in vivo. Эти наблюдения указывают,что аффинность VEGF145 в ЕСМ, вероятно, более низкая, чем аффинность VEGF189. Таким образом, VEGF145 обладает уникальным сочетанием свойств, которые превращают его в более приемлемый терапевтический агент в определенных ситуациях по сравнению с другими формами VEGF. Пример VII. Терапия с использованиемVEGF145,приводящая к ангиогенезу, опосредованному переносом гена. ДНК, кодирующую VEGF145, используют для терапии, вызывающей ангиогенез, опосредованный переносом гена, как описывают, например, в международной заявке на патентPCT/US 96/02631, опубликованный 6 сентября 1996, как WО 96/26742, который цитируется в изобретении по всей полноте. Аденовирусные конструкции Систему хелпер независимой репликации, с недостаточностью аденовируса-5 человека используют для переноса гена. Молекулу нуклеиновой кислоты VEGF145, клонируют в полилинкер плазмиды ACCMVPLPA, который содержит промотор CMV и сигнал полиаденилирования SV40,фланкированный частью аденовирусных последо 004646 42 вательностей, из которой удалены гены Е 1 А и Е 1 В. Эту плазмиду ко-трансфецируют (липофекция) в клетки 293 с JM17 плазмидой, которая содержит полный геном аденовируса-5 человека с дополнительной 4.3 kb вставкой, делающей pJM17 слишком большой для инкапсидации. Гомологичная рекомбинация ("спасение") приводит к аденовирусным векторам, содержащим трансген в отсутствие последовательностей Е 1 А/Е 1 В. Хотя эти рекомбинанты являются нереплицируемыми в клетках млекопитающих, они могут упаковываться в клетках 293, которые трансформированы Е 1 А/Е 1 В и обеспечивают эти существенные генные продукты in trans (в положение транс). За трансфицированными клетками наблюдают для обнаружения цитопатического действия, которое обычно происходит на 10-14 день после трансфекции. Для идентификации удачных рекомбинантов клеточный супернатант из плашек, проявляющих цитопатический эффект, обрабатывают протеиназой K (50 мг/мл в 0,5% додецилсульфате натрия и 20 мМ ЭДТА) при 56 С в течение 60 мин, экстрагируют фенол-хлороформом и осаждают этанолом. Затем удачные рекомбинанты идентифицируют методом PCR, используя праймеры (Biotechniques, 15:868-72, 1993), комплементарные к промотору CMV и последовательности полиаденилирования SV40 для амплификацииVEGF145 вставки нуклеиновой кислоты и праймеров (Biotechniques, 15:868-72, 1993), предназначенных для сопутствующей амплификации аденовирусных последовательностей. В таком случае рекомбинанты являются бляшками, дважды очищенными. Вирусные штаммы размножаются в клетках 293 с титром, колеблющимся между 1010 и 1012 вирусных частиц, и их очищают посредством двукратного центрифугирования в градиенте плотности CsCl для дальнейшего использования. Система, используемая для образования рекомбинантных аденовирусов, вынуждает ограничивать упаковку до 5 kb для трансгенных вставок.VEGF145, направляемые промоторами CMV, последовательностью полиаденилирования SV40,находятся в пределах ограничений упаковки. Рекомбинантные векторы представляют собой бляшки, очищенные с помощью стандартных способов. Полученные в результате вирусные векторы размножаются в клетках 293 с титром, колеблющимся в области 1010-1012 вирусных частиц. Клетки инфицируют при 80% монослоя и собирают через 36-48 ч. После циклов замораживания и оттаивания клеточный дебрис осаждают стандартным центрифугированием, и вирус далее очищают посредством двукратного ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCl (прерывистый 1,33/1,45 CsCl градиент; хлорид цезия готовят в 5 мМ трис, 1 мМ ЭДТА (рН 7,8); 90000 хg (2 ч), 105000 х g (18 ч. Перед инъекцией in vivo вирусные штаммы обессоливают гельфильтрацией на колонке с сефарозой такой, как Сефадекс G25. Полученный в результате вирусный штамм имеет конечный титр вируса прибли 43 зительно в области 1010-1012 вирусных частиц. Таким образом, аденовирусная конструкция является высокоочищенной, без присутствия вируса дикого типа (потенциально реплицируемого). Модель ишемии на свинье для индукции ангиогенеза Проводят левостороннюю торакотомию на домашней свинье (30-40 кг) в стерильных условиях для инструментов. (Hammond, et al., J. Clin.Invest. 92:2644-52, и Roth, et al., J. Clin. Invest. 91:939-49, 1993). Катетеры помещают в левое предсердие и аорту, обеспечивая доступ для измерения регионального кровотока и наблюдения за давлением. Дуги зашивают на левом предсердии для проведения регистрации ЭКГ и стимуляции предсердия. Наконец, амароид помещают около проксимальной огибающей артерии. После развития стабильной ишемии опытная группа получает аденовирусную конструкцию, которая содержит ген VEGF145 под контролем промотора CMV. Контрольным животным проводят перенос гена в аденовирусной конструкции, которая включает репортерный ген lacZ под контролем промотора CMV. Исследование начинают на 35 день 3 дня после размещения амароида, в это время развитие коллатеральных сосудов и индуцированная стимуляцией дисфункция оказываются стабильными(Roth, et al., Am. J. Physiol. 253:1-11279-1288, 1987,и Roth, et al., Circulation 82:1778-89). Находящихся в сознании животных подвешивают на поддерживающей повязке и сдавливают LV (левую вену), LA(левую артерию) и аорту, и регистрируют электрокардиограмму в цифровом порядке на линии (на отдыхе и во время стимуляции предсердия при 200bpm). Двумерное и М-образное изображение получают, используя Hewlett Packard ультразвуковую изобразительную систему. Изображения получают от правого окологрудинного подхода на уровне среднесосочковой мышцы и регистрируют VHSудары. Изображения регистрируют у животных в базовом состоянии и снова во время стимуляции правого предсердия (HR=200 bpm). Эти исследования проводят за 1 день до переноса гена и повторяют через 14 дней 1 день. Интенсивность давления и сдавливания левого предсердия одинаковые у обеих групп до и после переноса гена, указывая одинаковую потребность в кислороде миокарда и условия нагрузки. Эхокардиографические измерения производят, используя стандартные критерии(Sahn, et al., Circulation 58:1072, 1978). Измеряют толщину стенки в конце диастолы (EDWTh) и толщину стенки в конце систолы (ESWTh) из 5 непрерывных сокращений и усредняют. Рассчитывают процент утолщения стенки (%WTh) [(EDWThESWTh)/EDWTh] X 100. Данные анализируют, не зная, какой ген получает животное. Для выявления воспроизводимости эхографических измерений животных регистрируют 2 дня, демонстрируя высокую корреляцию (r2=0,90; р=0,005). Через 353 дней после размещения амароида отверстие амароида закрывают, но до 44 переноса гена проводят контрольное эхокардиографическое определение, используя контрастный материал (Levovist), который вводят в левое предсердие во время стимуляции предсердия (200 bpm). Исследование повторяют на 141 день после переноса гена. Измеряют пик контрастной интенсивности на видеоизображении, используя компьютерную программу видеоанализа (Color Vue II, Nova Microsonics,Indianapolis, Indiana), которая обеспечивает объективное измерение видеоинтенсивности. Контрастное исследование анализируют, не зная,какой ген получают животные. По завершении исследования животных анестезируют и проводят торакотомию по средней линии. Изолируют брахицефалическую артерию, вставляют канюлю и перевязывают другие большие сосуды. Животные получают гепарин (10000 IU) и папаверин (60 мг). Хлористый калий дают для индукции остановки сердца в диастоле и пережимают аорту. Физиологический раствор доставляют через канюлю в брахиоцефалической артерии (120 мм Нg давление), тем самым, осуществляя перфузию коронарной артерии. Раствор глутаральдегида(6,25%, 0,1 М какодилатный буфер) перфузируют (120 мм Нg давление) до тех пор, пока не остановится сердце (10-15 мин). Сердце затем удаляют, поддерживающие ткани идентифицируют, используя цветные маркирующие краски,которые вводят антероградно через левую переднюю нисходящую (LAD), левую огибающую(LCx) и правую коронарную артерии. Амароид определяют для подтверждения закрытия. Образцы, взятые из нормально перфузируемой области и ишемической области, разделяют на три части и эндокардиальную и эпикардиальную трети заливают в пластик, проводят микроскопический анализ для количественного определения числа капилляров, как описано ранее(Mathieu-Costello, et al., Am. J. Physiol. 359:H204, 1990). По 4 поперечных среза толщиной 1 мкм берут от каждого субобразца (эндокард и эпикард из каждой области) и точечный счет используют для определения соотношения числа капилляров на число волокон при 400 Х увеличении. 20 до 25 полей считают на субобразец. В каждой области соотношения числа капилляров на число волокон должно быть одинаковым в эндокарде и эпикарде, так 40-50 полей на область усредняют, чтобы представить соотношение транс-муральных капилляров на число волокон. Чтобы установить, что улучшенные региональная функция и кровоток являются следствием экспрессии трансгена, используют PCIR иRT-PCR для определения трансгенных ДНК и мРНК VEGF145 в миокарде животных, которым проводят перенос гена VEGF145. Используют смысловой праймер к промотору CMV [GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC] и антисмысловой праймер внутренней последовательности генаVEGF145. PCIR используют для амплификации предполагаемого 500 bp фрагмента. Используя смысловой праймер к началу VEGF145 последовательности и антисмысловой праймер к внутренней последовательности гена VEGF145, применяют RT-PCR, используют для амплификации ожидаемого 400 bp фрагмента (RT-PCR метод PCR с обратной транскриптазой). Наконец, используют антитела противVEGF145. Экспрессию VEGF145 белка демонстрируют через 48 ч, также как и 141 дней после переноса гена в клетках и миокарде животных,проводили перенос гена геном VEGF145. Используя систему хелперной независимой репликации с недостаточностью аденовируса-5 человека для получения векторов, содержащих трансген. Материал, инъецированный in vivo, является высокоочищенным и не содержит аденовируса дикого типа (компетентного по репликации), таким образом, введение аденовируса и воспалительная инфильтрация в сердце минимизированы. Введение материала непосредственно в просвет коронарной артерии посредством коронарных катетеров возможно для эффективного направленного действия на ген. При таком методе доставки не происходит никакой трансгенной экспрессии в гепатоцитах,и вирусную РНК не обнаруживают в моче в любое время после внутрикоронарного введения. Введение конструкции (4,0 мл, содержащие приблизительно 1011 вирусных частиц аденовируса) осуществляют посредством введения 2,0 мл как в левую, так и в правую коронарные артерии (коллатеральный кровоток в окружающих LCx тканях, оказывается, происходит из обоих сосудов). Животных анестезируют и артериальный доступ устанавливают через правую сонную артерию посредством веносекции; затем 5F Cordis оболочку (оболочку сердца) помещают 5F многоцелевой (А 2) коронарный катетер используют для введения в коронарные артерии. Закрытие LCx амароида подтверждается введением контрастного вещества в левую главную коронарную артерию. Наконечник катетера затем помещают на 1 см в просвет артерии так, что минимальное количество материала теряется в проксимальной части аорты во время введения. Эту процедуру проводят для каждой из свиней. При проведении переноса гена используют 3 стратегии для установления успешного введения и экспрессии гена: (1) некоторые конструкции включают репортерный ген (lacZ); (2) образцы миокарда из прилегающих поддерживающих тканей собирают и проводят иммуноблоттинг для количественного определения присутствия белка VEGF145; и (3) используют PCR для определения мРНК и ДНК VEGF145. Данные, полученные относительно региональной контрактильной функции, показывают,что контрольные свиньи проявляют одинаковую степень индуцированной стимуляцией дис 004646 46 функции в ишемической области до и после переноса гена через 141 дней. В отличие от этого, свиньи, которым осуществили перенос гена VEGF145, показывают увеличение толщины стенки и ишемической области во время стимуляции, демонстрируя, что перенос гена VEGF145 в соответствии с изобретением ассоциирован с улучшенным сокращением сердечной мышцы в ишемизированной области во время стимуляции. Толщина стенки в нормально перфузируемой области (межжелудочковая перегородка) остается нормальной во время стимуляции и не подвергается влиянию посредством переноса гена. Процент снижения в функции, измеренный посредством транс-торакальной эхокардиографии, очень похож на процент снижения, определенный посредством ультразвуковой микрометрии во время стимуляции предсердия в той же самой модели (Hammond, et al., J. Clin.Invest. 92:2644, 1993), документируя достоверность эхокардиографии для оценки ишемической дисфункции. Хотя предпочтительные направления специфически описывают в изобретении, следует отдать должное тому, что многие модификации и варианты данного изобретения возможны в свете вышеприведенных объяснений и в пределах компетенции прилагаемой формулы изобретения, без отклонения от духа и направлений данного изобретения. Список последовательностей ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения сердечно-сосудистого заболевания у млекопитающего, предусматривающий стадию трансфекции клеток указанного млекопитающего полинуклеотидом, который кодирует VEGF145. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид клонирован в вектор. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой аденовирусные частицы. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанные частицы аденовирусного вектора доставляют указанному млекопитающему посредством инъекции. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что количество указанных аденовирусных частиц колеблется приблизительно между 1010 и 1014. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что количество указанных аденовирусных частиц колеблется приблизительно между 1011 и 1013. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные трансфицированные клетки представляют собой клетки сердца. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанные трансфицированные клетки представляют собой клетки коронарной артерии и что указанная инъекция является внутрикоронарной инъекцией. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанные аденовирусные частицы вводят приблизительно на 1 см в просвет левой и правой коронарных артерий. 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные клетки трансфицируют in vivo. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные клетки трансфицируют ex vivo. 12. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид вводят в указанные клетки коронарной артерии посредством катетера, вставленного в указанную артерию. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный катетер содержит надувной баллон,имеющий наружную поверхность, приспособленную для взаимодействия с внутренней стенкой указанной артерии, и что указанный полинуклеотид располагается на наружной поверхности указанного баллона. 49 14. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид состоит из последовательности нуклеотидов, определенной в списке последовательностей как SEQ ID NO: 1. 15. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное млекопитающее является человеком. 16. Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ IDNO: 1, кодирующую VEGF145, или ее варианты,полученные в силу вырожденности генетического кода, причем указанные варианты кодируют полипептид, выбранный из группы, состоящей изVEGF145, представляющего собой аминокислотную последовательность VEGF145 или ее фрагмент, в котором один или несколько аминокислотных остатков добавлены, заменены или делетированы. 17. Экспрессирующий вектор по п.16, отличающийся тем, что указанный вариант представляет собой VEGF145. 18. Экспрессирующий вектор по п.16, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид содержит последовательность нуклеотидов, определенную в cписке последовательностей какSEQ ID NO: 1. 19. Экспрессирующий вектор по п.16, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид фланкирован аденовирусными последовательностями. 20. Экспрессирующий вектор по п.19, отличающийся тем, что указанная полинуклеотидная последовательность оперативно связана по 5'-концу с последовательностью промотора,функционального в эндотелиальных клетках сосудов. 21. Экспрессирующий вектор по п.19, отличающийся тем, что указанный экспрессирующий вектор представляет собой аденовирусный вектор. 22. Экспрессирующий вектор по п.21, отличающийся тем, что указанный вектор дополнительно содержит частичную аденовирусную последовательность, из которой делетированы гены Е 1 А/Е 1 В. 23. Набор для осуществления внутрикоронарного введения рекомбинантного вектора,экспрессирующего VEGF145, содержащий(a) вектор по п.16, подходящий для экспрессии in vivo;(b) подходящий контейнер для указанного вектора и(c) инструкции по осуществлению введения указанного вектора пациенту. 24. Набор по п.23, отличающейся тем, что указанный полинуклеотид клонирован в аденовирусный экспрессирующий вектор. 25. Способ лечения сосудистого заболевания у млекопитающего, предусматривающий 50 стадию введения указанному млекопитающемуVEGF145 в количестве, терапевтически эффективном для стимуляции пролиферации клеток сосудов. 26. Способ усиления эндотелизации пораженных заболеванием сосудов, предусматривающий стадию введения млекопитающемуVEGF145 в терапевтически эффективном количестве. 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанная эндотелизация представляет собой реэндотелизацию после ангиопластики. 28. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанная реэндотелизация ослабляет или предотвращает рестеноз. 29. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанного пациента лечат с помощью стента. 30. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанного пациента лечат без использования стента. 31. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанное млекопитающее является человеком. 32. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанное введение заключается в генной терапии. 33. Способ по п.32, отличающийся тем, что для проведения указанной генной терапии применяют надувной баллонный катетер, покрытый полинуклеотидом, кодирующим VEGF145. 34. Способ усиления проникновения лекарственного средства в опухоль, предусматривающий введение пациенту молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VEGF145. 35. Способ по п.34, отличающийся тем, что указанный VEGF145 доставляют непосредственно в опухолевую клетку. 36. Терапевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и VEGF145 в количестве, терапевтически эффективном для стимуляции пролиферации клеток сосудов. 37. Отфильтрованный препарат аденовирусного вектора для инъекций, содержащий рекомбинантный аденовирусный вектор, причем указанный вектор не содержит вируса дикого типа и содержит частичную последовательность аденовируса, из которой делетированы гены Е 1 А/Е 1 В, и трансген, кодирующий VEGF145 под контролем промотора, фланкированного частичной аденовирусной последовательностью; и фармацевтически приемлемый носитель.
МПК / Метки
МПК: C07K 14/52, A61K 38/19, A61P 9/00, C12N 15/19
Метки: лечения, vegf145, инъекций, способ, полинуклеотида, композиция, вектора, введения, проникновения, помощью, изолированный, заболевания, вектор, полинуклеотид, лекарства, сердечно-сосудистого, вопухоль,терапевтическая, кодирующего, экспрессирующий, усиления, набор, препарат
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/28-4646-sposob-lecheniya-serdechno-sosudistogo-zabolevaniya-s-pomoshhyu-polinukleotida-kodiruyushhego-vegf145-ekspressiruyushhijj-vektor-nabor-dlya-vvedeniya-vektora-sposob-usileniya-proni.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ лечения сердечно-сосудистого заболевания с помощью полинуклеотида, кодирующего vegf145, экспрессирующий вектор, набор для введения вектора, способ усиления проникновения лекарства вопухоль,терапевтическая композиция, препарат вектора для инъекций, изолированный полинуклеотид</a>
Терапевтическая композиция для введения толтеродина с контролируемым высвобождением и способ лечения мочевого пузыря с её использованием
Номер патента: 2720
Опубликовано: 29.08.2002
Авторы: Хокк Улла, Грен Торкель, Стрембом Ян, Рингберг Андерс, Халлен Бенгт, Оруп Якобсен Лене, Крейльгор Бо, Ольссон Биргитта, Викберг Мартин, Нильвебрант Лисбет, Кристенсен Хелле
МПК: A61P 13/10, A61K 9/22
Метки: контролируемым, пузыря, использованием, композиция, терапевтическая, лечения, введения, толтеродина, мочевого, высвобождением, способ
Формула / Реферат:
1. Способ лечения нестабильного или гиперактивного мочевого пузыря, включающий в себя введение больному, нуждающемуся в подобном лечении, толтеродина или родственного толтеродину соединения или его фармацевтически приемлемой соли в фармацевтически эффективном количестве в составе композиции с контролируемым высвобождением, способной поддерживать в сыворотке существенно постоянную концентрацию активного фрагмента или фрагментов в течение, по...
Способ лечения заболевания желудочно-кишечного тракта и/или инфекции желудочно-кишечного тракта, и/или диареи, антимикробная композиция для перорального введения и способ ее получения, пища для человека или корм для животных или птиц
Номер патента: 2771
Опубликовано: 29.08.2002
Автор: Мелрос Грэм Джон Гамильтон
МПК: A61K 31/765, C08L 29/14
Метки: птиц, антимикробная, животных, способ, диареи, корм, инфекции, получения, пища, человека, желудочно-кишечного, композиция, лечения, перорального, тракта, заболевания, введения
Формула / Реферат:
1. Способ лечения или профилактики человека, животного или птицы, пораженного заболеванием желудочно-кишечного тракта, желудочно-кишечной инфекцией или диареей, вызванной инфекцией желудочно-кишечного тракта, отличающийся тем, что перорально вводят названным человеку, животному или птице антимикробно эффективное количество антимикробного вещества, содержащего полимер или сополимер с молекулярной массой, по меньшей мере, 1000, имеющий...
Способ контроля количества сиаловой кислоты, присутствующей в олигосахаридной боковой цепи гликопротеина, способ получения химерного гликопротеина, препарат, содержащий химерный гликопротеин, и терапевтическая композиция.
Номер патента: 1215
Опубликовано: 25.12.2000
Авторы: Этчэверри Тина, Рихтер Вольфганг, Штрайтмюллер Томас, Лесслауер Вернер, Рилл Томас
МПК: C07K 19/00, A61P 29/00, C12N 5/00...
Метки: боковой, содержащий, получения, терапевтическая, химерный, композиция, присутствующей, сиаловой, гликопротеин, олигосахаридной, препарат, способ, контроля, химерного, гликопротеина, количества, цепи, кислоты
Формула / Реферат:
1. Способ контроля количества сиаловой кислоты, присутствующей в олигосахаридной боковой цепи гликопротеина, продуцируемого культурой клеток млекопитающего, путем изменения удельной продуктивности указанной культуры, который осуществляют следующим образом: во время переходной фазы добавляют к культуре клеток алкановую кислоту с 3-6 атомами углерода или ее соль в интервале концентраций, составляющем примерно от 0,1 мМ до 20 мМ, устанавливают...
Системы и устройства для лечения переломов костей или больных костей с помощью расширяемых тел (варианты), стерильный набор инструментов для введения в кость (варианты)
Номер патента: 1570
Опубликовано: 23.04.2001
Авторы: Шолтен Ари, Толмадж Карен Д., Рио Майкл Л., Рейли Марк А., Скрибнер Роберт М.
МПК: A61B 17/56
Метки: стерильный, устройства, расширяемых, системы, помощью, тел, варианты, инструментов, введения, набор, костей, переломов, кость, больных, лечения
Формула / Реферат:
1. Инструмент для введения в кость, имеющую кортикальный слой, окружающий внутренний объем, занятый, по меньшей мере частично, губчатым веществом кости, причем инструмент включает направляющую трубку, для подачи расширяемого тела, в норме имеющего сжатую форму, для введения во внутренний объем, насадку на направляющей трубке около расширяемого тела, для введения во внутренний объем вместе с расширяемым телом, первую полость в направляющей...
Антивирусный препарат для инъекций
Номер патента: 1785
Опубликовано: 27.08.2001
Авторы: Рыбин Владимир Васильевич, Ласкавый Владислав Николаевич
МПК: A61P 31/12, A61K 31/115
Метки: препарат, антивирусный, инъекций
Формула / Реферат:
Антивирусный препарат для инъекций, содержащий смесь водного раствора продукта органического происхождения с солевым раствором, отличающийся тем, что в качестве продукта органического происхождения используют формальдегид, а в качестве солевого раствора водный раствор хлорида натрия при следующем соотношении компонентов, мас.%: Водный раствор формальдегида 0,03 -0,3 Водный раствор хлорида натрияв ...
Предыдущий патент: Аминоалкилзамещенные производные бензопирана
Следующий патент: Способы потенциации внутривенного эстрамустинфосфата
Случайный патент: Водопотребляющий бытовой прибор с фильтрующим устройством в выпускном канале и накопителем