Использование семафорина 6а в качестве промотора миелинизации и дифференцировки олигодендроцитов
Формула / Реферат
1. Способ стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов in vitro, включающий осуществление контакта указанных олигодендроцитов с эффективным количеством композиции, включающей выделенный полипептид семафорин 6А ("Sema6A").
2. Способ стимулирования олигодендроцит-опосредованной миелинизации нейронов in vitro, включающий осуществление контакта смеси нейронов и олигодендроцитов с эффективным количеством композиции, включающей выделенный полипептид Sema6A.
3. Способ стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества композиции, включающей выделенный полипептид Sema6A.
4. Способ стимулирования миелинизации нейронов у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества композиции, включающей выделенный полипептид Sema6A.
5. Способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, связанного с дисмиелинизацией или демиелинизацией, у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенный полипептид Sema6A.
6. Способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, связанного с гибелью олигодендроцитов или отсутствием дифференцировки олигодендроцитов у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенный полипептид Sema6A.
7. Способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, при которых наблюдается разрушение миелина у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенный полипептид Sema6А.
8. Способ стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества композиции, включающей выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид Sema6A.
9. Способ стимулирования миелинизации нейронов у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества композиции, включающей выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид Sema6A.
10. Способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, связанного с дисмиелинизацией или демиелинизацией у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид Sema6A.
11. Способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, связанного с гибелью олигодендроцитов или отсутствием дифференцировки олигодендроцитов у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, содержащей выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид Sema6A.
12. Способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, при которых наблюдается разрушение миелина у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид Sema6A.
13. Способ по любому из пп.1-12, в котором указанный полипептид Sema6A связывает полипептид плексин-А2.
14. Способ по любому из пп.1-13, в котором указанный полипептид Sema6A включает последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из последовательностей:
где а представляет собой любое целое число между 24 и 56, b представляет собой любое целое число между 19 и 21, с представляет собой любое целое число между 472 и 512, с' представляет собой любое целое число между 418 и 453, d представляет собой любое целое число между 514 и 569, d' представляет собой любое целое число между 455 и 510, е представляет собой любое целое число между 570 и 650, е' представляет собой любое целое число между 511 и 591, е" представляет собой любое целое число между 570 и 595, и е'" представляет собой любое целое число между 570 и 667; f представляет собой любое целое число между 647 и 671, f' представляет собой любое целое число между 588 и 612, f" представляет собой любое целое число между 592-616 и f" представляет собой любое целое число между 664 и 688.
15. Способ по п.14, в котором указанная последовательность аминокислот по меньшей мере на 90% идентична указанной эталонной последовательности аминокислот.
16. Способ по п.14 или 15, в котором указанная последовательность аминокислот идентична указанной эталонной последовательности аминокислот.
17. Способ по любому из пп.1-16, в котором указанный полипептид Sema6A является циклическим пептидом.
18. Способ по п.17, в котором указанный циклический пептид включает молекулу биотина, присоединенную к N-концу, и остаток цистеина, присоединенный к С-концу указанного циклического пептида.
19. Способ по п.17, в котором указанный циклический пептид включает остаток цистеина, присоединенный к N- и С-концу указанного циклического пептида, причем указанный N-концевой остаток цистеина является ацетилированным.
20. Способ по любому из пп.18 или 19, в котором к указанному С-концевому цистеину присоединена группа NH2.
21. Способ по любому из пп.1-20, в котором указанный полипептид присоединен к части, не являющейся Sema6A.
22. Способ по п.21, в котором указанная часть, не являющаяся Sema6A, представляет собой гетерологичный полипептид, слитый с указанным полипептидом Sema6A.
23. Способ по п.22, в котором указанный гетерологичный полипептид выбран из группы, включающей полипептид иммуноглобулина или фрагмент полипептида иммуноглобулина, полипептид сывороточного альбумина или фрагмент полипептида сывороточного альбумина, направляющий полипептид, репортерный полипептид и полипептид, облегчающий очистку, и комбинацию по меньшей мере двух указанных гетерологичных полипептидов.
24. Способ по п.23, в котором указанный гетерологичный полипептид выбран из группы, включающей c-myc, плацентарную щелочную фосфатазу человека, шарнир иммуноглобулина и Fc-участок и комбинацию двух или более указанных гетерологичных полипептидов.
25. Способ по п.21, в котором указанная часть, не являющаяся Sema6A, представляет собой полимер, конъюгированный с полипептидом Sema6A.
26. Способ по п.25, в котором полимер выбран из группы, включающей полиалкиленгликоль, полимерный сахар и полипептид.
27. Способ по п.26, в котором полимер представляет собой полиалкиленгликоль.
28. Способ по п.27, в котором полиалкиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ).
29. Способ по п.25, в котором указанный полипептид Sema6A связан с 1, 2, 3 или 4 полимерами.
30. Способ по любому из пп.25-29, в котором общий молекулярный вес полимеров составляет от 5000 до 100000 Да.
31. Способ по любому из пп.3-13, в котором у указанного млекопитающего диагностировано заболевание, расстройство или повреждение, при которых наблюдается дисмиелинизация, демиелинизация или нейродегенерация.
32. Способ по п.31, в котором указанное заболевание, расстройство или повреждение выбрано из группы, включающей рассеянный склероз, прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию, энцефаломиелит, миелолиз моста головного мозга, адренолейкодистрофию, болезнь Александера, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, глобоидно-клеточную лейкодистрофию (болезнь Краббе), Уоллеровскую дегенерацию, ретробульбарный неврит, поперечный миелит, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, травмы спинного мозга, травмы головного мозга, лучевое поражение, неврологические осложнения химиотерапии, инсульт, ишемическую нейропатию зрительного нерва, недостаток витамина Е, изолированный синдром недостатка витамина Е, AR, синдром Бессена-Корнцвейга, синдром Марчиафава-Бигнами, метахроматическую лейкодистрофию, невралгию тройничного нерва и паралич Белла.
33. Способ по п.31, в котором указанное заболевание, расстройство или повреждение представляет собой рассеянный склероз.
34. Способ по любому из пп.3-33, в котором введение указанной композиции осуществляют путем болюсной инъекции или хронического вливания.
35. Способ по п.34, в котором указанную композицию вводят непосредственно в центральную нервную систему.
36. Способ по п.35, в котором указанную композицию вводят непосредственно в очаг хронического поражения при рассеянном склерозе.
37. Способ по любому из пп.1 или 2, в котором указанное осуществление контакта включает трансфекцию указанных олигодендроцитов полинуклеотидом, который кодирует указанный полипептид Sema6A и функционально связан с последовательностью контроля экспрессии, и эффективную экспрессию указанного полипептида Sema6A.
38. Способ по любому из пп.8-13, в котором указанный полинуклеотид кодирует указанный полипептид Sema6A и функционально связан с последовательностью контроля экспрессии.
39. Способ по п.38, в котором указанный полинуклеотид вводят в виде вектора экспрессии.
40. Способ по п.39, в котором указанный вектор экспрессии представляет собой вирусный вектор.
41. Способ по любому из пп.8-13, в котором указанное введение включает обеспечение культивируемых клеток-хозяев, включающих указанный полинуклеотид и экспрессирующих указанный полипептид Sema6A, и введение указанных культивируемых клеток-хозяев в указанное млекопитающее, причем указанный полипептид Sema6A экспрессируется в указанном млекопитающем.
42. Способ по п.41, в котором указанные клетки-хозяева вводят указанному животному в участок нервной системы, пораженный заболеванием, расстройством или повреждением, или в зоне такого участка.
43. Способ по любому из пп.41 или 42, в котором указанные культивируемые клетки-хозяева получают трансформацией или трансфекцией реципиентных клеток-хозяев полинуклеотидом согласно п.37 или 38 или вектором согласно п.39 или 40 и последующим культивированием указанных трансформированных или трансфецированных клеток.
44. Способ по любому из пп.41-43, в котором указанные культивируемые клетки-хозяева получены из млекопитающего, в отношении которого осуществляют лечение.
45. Способ по любому из пп.3-44, в котором указанный полипептид Sema6A экспрессируется в количестве, достаточном для того, чтобы уменьшить ингибирование пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов в участке нервной системы, пораженном заболеванием, расстройством или повреждением, или в зоне такого участка.
46. Способ по любому из пп.3-45, в котором указанный полипептид Sema6A экспрессируется в количестве, достаточном для того, чтобы уменьшить ингибирование миелинизации нейронов в участке нервной системы, пораженном заболеванием, расстройством или повреждением, или в зоне такого участка.
47. Способ по п.40, в котором вирусный вектор выбирают из группы, состоящей из аденовирусного вектора, альфавирусного вектора, энтеровирусного вектора, пестивирусного вектора, лентивирусного вектора, бакуловирусного вектора, герпесвирусного вектора, паповавирусного вектора, поксвирусного вектора.
48. Способ по п.47, в котором указанный герпесвирусный вектор выбирают из группы, состоящей из вектора на основе вируса простого герпеса и вектора на основе вируса Эпштейна-Барр.
49. Способ по п.47, в котором указанный поксвирусный вектор представляет собой вектор на основе вируса коровьей оспы.
50. Способ по любому из пп.39, 40 или 47-49, в котором указанный вектор вводят путем, выбранным из группы, состоящей из местного введения, внутриглазного введения, парентерального введения, интратекального применения, субдурального введения и подкожного введения.
Текст
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СЕМАФОРИНА 6 А В КАЧЕСТВЕ ПРОМОТОРА МИЕЛИНИЗАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ОЛИГОДЕНДРОЦИТОВ Настоящее изобретение обеспечивает способы для лечения заболеваний, расстройств или повреждений, при которых наблюдается демиелинизация и дисмиелинизация, в том числе рассеянного склероза, посредством введения полипептида Sema6A.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: БАЙОДЖЕН АЙДЕК эМЭй ИНК.(US); САНТР НАСЬОНАЛЬ ДЕ РЕШЕРШ СЬЯНТИФИК; ЮНИВЕСИТИ ПЬЕР ЭНД МАРИ КЮРИ (FR) 017403 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к нейробиологии, неврологии и фармакологии. Более конкретно, оно относится к способам лечения заболеваний, связанных с миелинизацией центральной нервной системы,путем введения полипептида семафорин 6 А ("Sema6A"). Сведения о предшествующем уровне техники С демиелинизацией и дисмиелинизацией связаны многие заболевания нервной системы, включая рассеянный склероз (MS), прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (PML), энцефаломиелит (EPL), миелолиз моста головного мозга (СРМ), Уоллеровскаую дегенерацию и некоторые наследственные заболевания, такие как адренолейкодистрофия, болезнь Александера и болезнь ПелицеусаМерцбахера (PMZ). Среди этих заболеваний наиболее распространенным является рассеянный склероз,которым страдают приблизительно 2,5 млн человек в мире. Обычно рассеянный склероз начинается с поражения нервной системы возвратно-ремиттирующего характера, переходящего затем в хроническую фазу, при которой повреждение нервной системы увеличивается. Рассеянный склероз связан с разрушением миелина, олигодендроцитов и аксонов в участках хронического повреждения. Наблюдаемая при рассеянном склерозе демиелинизация не всегда постоянна, и на ранних стадиях развития заболевания отмечалась ремиелинизация. Для ремиелинизации нейронов центральной нервной системы (ЦНС) необходимы олигодендроциты. В настоящее время доступны различные способы лечения рассеянного склероза, изменяющие течение заболевания, включая использование кортикостероидов и иммуномодуляторов, таких как интерферон-бета. Кроме того, поскольку олигодендроциты и миелинизация играют ключевую роль в развитии рассеянного склероза, предпринимались попытки разработки терапевтического воздействия для увеличения количества олигодендроцитов или для усиления миелинизации (см., например, Cohen et al., патент США 5574009; Chang et al., N. Engl. J. Med. 346:165-73 (2002. Тем не менее, крайне необходимо разрабатывать дополнительные способы лечения рассеянного склероза. Семафорины представляют собой секретируемые или мембраносвязанные белки, контролирующие аксональное наведение и миграцию клеток (Kerjan et al., Nat. Neursci. 8(11): 1516-1524(2005. Многие трансмембранные семафорины экспрессируются при развитии ЦНС, однако об их функциях in vivo известно мало. Класс 6 семафоринов включает в себя четыре белка: Sema6A-Sema6D-, близкородственные трансмембранным семафоринам беспозвоночных (FiorePuschel. Front. Biosci. 8:2484-2499 (2003. Все семафорины содержат семафориновый домен (Sema) и плексин-семафорин-интегриновый домен (PSI)(встречающийся в плексинах, семафоринах и интегринах) в N-концевой внеклеточной части. Плексины представляют собой семейство молекул (семейство плексинов), распространенных среди различных видов животных (Murakami et al., Dev. Dynam. 220: 246-258 (2001. Плексины подразделяют на четыре подсемейства, плексин-А, -В, -С и -D. У мыши и человека выделены четыре представителя подсемейства плексин-А (плексин-А 1, -А 2, -A3 и -А 4) (см. Kameyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 226: 396 402 (1996); Kameyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 226: 524-529 (1996); Maestriniet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 674-678 (1996); Tamagnone et al., Cell 99: 71-80 (1999); и Suto et al.,Mech. Dev. 120: 385-396 (2003. Эктодомены белков подсемейства плексин-А содержат участок размером приблизительно 500 остатков аминокислот, демонстрирующий значительную гомологию с семадоменом, общим для семафоринов (Murakami et al., Develop. Dyn. 220: 246-258 (2001. Известно, что плексины типа А взаимодействуют с семафоринами класса 6 (Toyofuku et al., Genes Develop. 18: 435-447(2004. Например, Suto и др. показали, что плексин-А 4 является непосредственным рецептором дляSema6A (J. Neurosci. 25(14): 3628-3637 (2005. Сущность изобретения Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что семафорин 6 А (Sema6A) экспрессируется в олигодендроцитах и регулирует их дифференцировку, продолжительность жизни и/или миелинизацию аксонов. Более того, некоторые полипептиды Sema6A стимулируют выживание, пролиферацию и/или дифференцировку олигодендроцитов, а также миелинизацию нейронов. Изобретение, основанное на этих фактах, в целом относится к способам лечения заболеваний, связанных с демиелинизацией и/или дисмиелинизацией (например, рассеянным склерозом), путем введения полипептида Sema6A. В некоторых вариантах реализации изобретение включает способ стимулирования пролиферации,дифференцировки или выживания олигодендроцитов, включающий осуществление контакта олигодендроцитов с эффективным количеством композиции, содержащей выделенный полипептид Sema6A. В других вариантах реализации изобретение включает способ стимулирования миелинизации нейронов, опосредованной олигодендроцитами, включая осуществление контакта смеси нейронов и олигодендроцитов с эффективным количеством композиции, включающей выделенный полипептид Sema6A. Настоящее изобретение относится к способу стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов у млекопитающих, или к способу стимулирования миелинизации нейронов у млекопитающих, включая введение нуждающимся в этом млекопитающим эффективных количеств композиции, включающей полипептид Sema6A. Также изобретение включает способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, связанных с дисмиелинизацией или демиелинизацией, или связанных с гибелью олигодендроцитов или отсут-1 017403 ствием их дифференцировки у млекопитающих, включая введение нуждающимся в этом млекопитающим эффективных количеств композиции, включающей полипептид Sema6A. Другой вариант реализации изобретения включает способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, при которых происходит разрушение миелина у млекопитающих, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, включающей полипептид Sema6A. Другой вариант реализации изобретения включает способ, в котором осуществляют связывание полипептида Sema6A с полипептидом плексин-А 2 или полипептидом плексин-А 4. В других вариантах реализации изобретения полипептид Sema6A является изолированным. Дальнейшие варианты реализации изобретения включают способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, при котором происходит разрушение олигодендроцитов или миелина, путем генной терапии in vivo, которая включает введение млекопитающим (в участке поражения, расстройства или повреждения, или поблизости от него) вектора, содержащего последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид Sema6A, таким образом, чтобы полипептид Sema6A экспрессировался с указанной последовательностью нуклеотидов у млекопитающего в количестве, достаточном для стимулирования удлинения аксонов нейронов, расположенных в месте повреждения или поблизости от него. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение включает способ стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов, или стимулирования миелинизации нейронов у млекопитающих, включая введение млекопитающим, нуждающимся в данном лечении, эффективных количеств композиции, включающей полинуклеотид, кодирующий полипептид Sema6A. Изобретение дополнительно включает способ лечения заболевания, расстройства или повреждения,связанного с дисмиелинизацией или демиелинизацией, или связанного с гибелью олигодендроцитов или отсутствием дифференцировки олигодендроцитов у млекопитающих, включающий введение нуждающимся в этом млекопитающим терапевтически эффективного количества композиции, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид Sema6A. Изобретение далее включает способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, при котором происходит разрушение миелина у млекопитающих,включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид Sema6A. В некоторых вариантах реализации осуществляют связывание полипептида Sema6A согласно настоящему изобретению полипептидом плексин-А 2 или полипептидом плексин-А 4. Полинуклеотид, используемый в способе согласно настоящему изобретению, может быть изолирован. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, выбранный из группы, состоящей из аденовирусного вектора, альфавирусного вектора, энтеровирусного вектора, пестивирусного вектора, лентивирусного вектора, бакуловирусного вектора, герпесвирусного вектора, вектора на основе вируса Эпштейна-Барр, паповавирусного вектора, поксвирусного вектора,вектора на основе вируса коровьей оспы, и вектора на основе вируса простого герпеса. В некоторых вариантах реализации изобретения, болезнь, расстройство, повреждение или заболевание выбирают из группы, включающей рассеянный склероз (MS), прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (PML), энцефаломиелит (EPL), миелолиз моста головного мозга (СРМ), адренолейкодистрофию, болезнь Александера, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (PMZ), глобоидно-клеточную лейкодистрофию (болезнь Краббе), Уоллеровскую дегенерацию, ретробульбарный неврит, поперечный миелит, боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, травмы спинного мозга, травмы головного мозга, лучевое поражение, неврологические осложнения химиотерапии, инсульт, ишемическую нейропатию зрительного нерва, недостаток витамина Е,изолированный синдром недостатка витамина Е, AR, синдром Бессена-Корнцвейга, синдром Марчиафава-Бигнами, метахроматическую лейкодистрофию, невралгию тройничного нерва и паралич Белла. В некоторых вариантах реализации изобретения культивируемую клетку-хозяина получают из млекопитающего, которого лечат. Некоторые полипептиды Sema6A включают фрагменты полипептидов Sema6A, варианты или производные полипептидов Sema6A, лишенные трансмембранного домена и цитоплазматического домена. Полипептиды Sema6A включают полипептиды, содержащие (i) сигнальную последовательность, (ii)sema-домен, (iii) PSI-домен, (iv) внеклеточный домен, (v) трансмембранный домен, (vi) цитоплазматический домен, и (vii) комбинацию двух и более доменов, но не ограничиваются ими. В некоторых вариантах реализации изобретения у полипептида Sema6A отсутствует сигнальная последовательность, semaдомен, PSI-домен, трансмембранный домен, цитоплазматический домен или комбинация двух и более доменов. В некоторых вариантах, полипептид Sema6A содержит Sema-домен, но лишен сигнальной последовательности, PSI-последовательности, трансмембранного домена и цитоплазматического домена. В некоторых вариантах полипептид Sema6A содержит аминокислотные остатки 1-649 последовательностиSEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид Sema6A применяют посредством болюсной инъекции или хронического вливания. В некоторых вариантах полипептид Sema6A вводят непосредственно в центральную нервную систему. В некоторых вариантах полипептид Sema6A вводят непосредственно в участок хронического повреждения при рассеянном склерозе.-2 017403 В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид Sema6A представляет собой полипептид слияния, содержащий компонент, отличный от Sema6A. В некоторых вариантах компонент, отличный от Sema6A, выбирают из группы, состоящей из фрагмента антитела lg, копмонента сывороточного альбумина, целевого фрагменты, репортерного фрагмента и фрагмента, облегчающего очистку. В некоторых вариантах компонент антитела lg представляет собой шарнирный фрагмент и Fc-фрагмент. В некоторых вариантах полипептиды согласно настоящему изоберению конъюгированы с полимером. В некоторых вариантах полимер выбран из группы, состоящей из полиалкенилгликоля, полимерного сахара и полипептида. В некоторых вариантах полиалкенилгликоль представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ). В некоторых вариантах полипептиды согласно настоящему изобретению конъюгированы с 1, 2, 3 или 4 полимерами. В некоторых вариантах общий молекулярный вес полимеров составляет от 5000 до 100000 Да. Перечень фигур, чертежей и иных материалов Фиг. 1 представляет собой сравнение последовательностей изоформ полипептида Sema6A человека,т.е. изоформ A-D. Фиг. 2 - сравнение последовательностей изоформ полипептида Sema6A мыши, т.е. изоформ 1-3. Фиг. 3 - экспрессия Sema6A в нервной системе мыши. Экспрессию Sema6A в нервной системе мышей Р 15 исследовали путем гибридизации in situ. Было обнаружено, что большинство клеток, экспрессирующих Sema6A, находятся в белом веществе. Экспрессирующие Sema6A клетки в белом веществе,представляют собой олигодендроциты. Фиг. 4 (изображения А-С): Иммунологический анализ олигодендроцитов Sema6A+/-(А) илиSema6A -/- (В), экспрессирующих миелиновый протеолипидный протеин (PLP), в передней комиссуре(АС) мышей Р 16. (С) - определение количества клеток, экспрессирующих PLP в АС на различных стадиях, а именно Р 16, Р 30 и Р 45. Фиг. 5 (изображения A-D): (А) - созревание олигодендроцитов Sema6A -/- in vitro. Фрактальная размерность (FD) была измерена после 48 ч. Левые столбики демонстрируют FD олигодендроцитов Sema6A-/-, правые столбики демонстрируют FD олигодендроцитов Sema6A +/-, (В) - олигодендроциты Sema6A /- на стадии 48 ч, визуализованные путем фазово-контрастной микроскопии и иммуноокрашивания антиO4 антителами. (С): Созревание in vitro олигодендроцитов Sema6A -/- на стадии 24 и 48 ч. Левые столбики демонстрируют стадию 24 ч, правые - 48(D): Олигодендроциты Sema6A+/ на стадии 48 ч, визуализированные путем фазово-контрастной микроскопии и иммуноокрашивания анти-O4 антителами. Фиг. 6 (изображения А-С): Миелинизация в совместных культурах клеток ганглиев задних корешков (DRG) и олигодендроцитов с добавлением Sema6A-Fc в различных дозах, (А) отрицательный контроль, (В) 0,1 мкг/мл и (С) 0,3 мкг/мл. Степень миелинизации показана путем иммуноокрашиваня с антителами анти-МВР. Фиг. 7. Мышей подвергали действию купризона и исследовали экспрессию Sema6A при демиелинизации и ремиелинизации. Измеряли количество клеток, экспрессирующих Sema6A, на различных стадиях, т.е. 3-6 недель. Фиг. 8. Изображения А-В иллюстрируют гибридизацию in situ с использованием рибозонда Sema6A в ткани человека, поврежденной вследствие рассеянного склероза, и интактной ткани, при увеличении х 1(А) и х 10 (В), изображение С иллюстрирует иммуноокрашивание ткани человека, поврежденной вследствие рассеянного склероза, с использованием антитела человека к Sema6A при увеличении х 10. Фиг. 9 (изображения A-D): (А) Анализ методом Вестерн-блот экспрессии полипептида плексин-А 2 у мышей плексин-А 2 +/+ (дикий тип), плексин-А 2 нулевой нокаут (plexin-A2-/-) и мутанта по плексинуА 2, несущего одиночную аминокислотную замену (А 396 Е) в семафориновом домене (NMF454); (В) выравнивание последовательностей плексина-А 2, плексина-А 4, плексина-А 1 и плексина-А 3 с целью определения положения аланина (396); (С) анализ связывания Sema6A с белком плексин-А 2 дикого типа, экспрессированным в клетках COS; и (D) анализ связывания Sema6A с мутантным белком плексин-А 2 А 396 Е, экспрессированным в клетках COS. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Определения Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке,имеют то же значение, которое обычно подразумевается специалистами в области, к которой относится данное изобретение. Настоящая заявка содержит определения, которыми следует руководствоваться в случае противоречий. Термины в единственном числе включают одновременно те же понятия во множественном числе, а термины во множественном числе включают те же понятия в единственном числе, если иное не предусмотрено контекстом. Все публикации, патенты и другие источники, упоминаемые в данной заявке, включены посредством ссылки во всей полноте для любых целей, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и индивидуально указана как включаемая посредством ссылки. Хотя для реализации или тестирования изобретения можно применять методы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящей заявке, подходящие способы и материалы описаны ниже. Материалы, способы и примеры приведены исключительно с целью иллюстрации, и их не следует-3 017403 рассматривать как ограничение изобретения. Другие признаки и преимущества данного изобретения станут ясны из подробного описания и формулы изобретения. Для дальнейшей характеристики данного изобретения представлены следующие термины и определения. Следует отметить, что конкретный термин относится к одному или нескольким объектам, например термин "полипептид" следует понимать как представляющий один или несколько полипептидов. Точно также конкретный термин, а также понятия "один или более" и "по меньшей мере один" используются здесь как взаимозаменяемые. В данном описании и формуле изобретения слово "включать", или его варианты, например, "включает" или "включающий" обозначают включение любого из указываемых объектов или группы объектов,но без исключения любых других объектов или групп объектов. В данном описании и формуле изобретения, термин "состоит из" и его варианты, такие как "состоять из" или "состоящий из" обозначают включение любого из указываемых объектов или группы объектов, причем ни один из дополнительных объектов или групп объектов не может быть добавлен к описываемому способу, структуре или композиции. В данном описании и формуле изобретения термин "состоит по существу из" и его варианты, такие как "состоять по существу из" или "состоящий по существу из" обозначают включение любого из указываемых объектов или группы объектов и необязательное включение любых других указываемых объектов или группы объектов, которые принципиально не изменяют существенные или новые признаки описываемого способа, структуры или композиции. В данной заявке термин "антитело" обозначает интактный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитела согласно настоящеиу изобретению могут относиться к любому изотипу или классу (например, D, G, Е и А) или подклассу (например, G1-4, А 1-2) и содержать легкую цепь каппаили лямбда . В данной заявке термин "Fc" обозначает часть тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит один или более доменов СН 1, СН 2 и СН 3 константной области тяжелой цепи. Например, участок константной области тяжелой цепи антитела, который образуется при расщеплении папаином. В данной заявке термин "гуманизированное антитело" обозначает антитело, в котором по меньшей мере часть последовательности, не являющейся человеческой, заменена на последовательность, принадлежащую человеку. Примеры способов создания гуманизированных антител можно найти в патентах США под номерами 6054297, 5886152 и 5877293. В данной заявке термин "химерное антитело" обозначает антитело, которое содержит одну или более областей первого антитела и одну или более областей по меньшей мере одного другого антитела. Первое антитело и дополнительные антитела могут принадлежать одному или разным видам животных. В данной заявке термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному при дозировке, и периоде времени, необходимому для достижения желаемого терапевтического эффекта. Терапевтическим эффектом может являться, например, уменьшение симптомов, более длительное выживание, увеличенная подвижность и т.п. Терапевтический эффект не обязательно является "излечением". В данной заявке термин "профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному при дозировке, и в периоде времени, необходимому для достижения желаемого профилактического эффекта. Обычно, поскольку профилактическую дозировку применяют до развития заболевания или на его ранних стадиях, профилактически эффективное количество меньше терапевтически эффективного количества. В данной заявке термин "полинуклеотид" обозначает последовательность нуклеотидов полноразмерной кДНК, включая нетранслируемые 5' и 3'-участки, кодирующие последовательности, а также фрагменты, эпитопы, домены и варианты последовательностей нуклеиновой кислоты. Полинуклеотид может представлять собой как полирибонуклеотид, так и полидезоксирибонуклеотид, которые могут являться модифицированными или немодифицированными молекулами РНК или ДНК. Например, полинуклеотиды могут состоять из одно- и двухцепочечной ДНК, причем ДНК представляет собой смесь одно- и двухцепочечных участков; из РНК, которая также представляет собой смесь одно- и двухцепочечных участков; из гибридных молекул, состоящих из ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными, или, что более характерно, двухцепочечными, или смесью одно- и двухцепочечных участков. Дополнительно, полинуклеотиды могут состоять из трехцепочечных участков, содержащих РНК или ДНК, или РНК вместе с ДНК. Полинуклеотиды могут также содержать одно или несколько модифицированных оснований или остовов ДНК или РНК, модифицированных для стабильности или по другим причинам. "Модифицированные" основания включают, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. В ДНК и РНК можно вводить разнообразные изменения; таким образом, понятие "полинуклеотид" охватывает формы, модифицированные химическим,ферментативным или метаболическим путем. В настоящем изобретении полипептид может состоять из аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидными изостерами, и мо-4 017403 жет содержать аминокислоты, не относящиеся к 20 генетически кодируемым аминокислотам (например,неприродные аминокислоты). Полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы в ходе природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, или с использованием способов химической модификации, хорошо известных специалистам в данной области. Такие модификации подробно описаны в различных источниках и более подробно в монографиях, а также в обширной научной литературе. Модификации могут быть внесены в любой участок полипептида, включая пептидный остов, боковые цепи аминокислот, и амино- и карбоксиконцевые участки. Очевидно, один и тот же тип модификации может быть представлен в разной степени в различных сайтах данного полипептида. Также один полипептид может содержать несколько типов модификаций. Полипептиды могут быть разветвленными,например, в результате убиквитинирования, а также циклическими, с ветвлениями или без них. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды могут образоваться в результате естественных посттрансляционных процессов или могут быть получены путем синтеза. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, аминирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидных мостиков, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглютамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, формирование GPI-якоря,гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристиолирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, присоединение селена,сульфатирование. тРНК-опосредуемое присоединение аминокислот к белкам, например, аргинилирование и убиквитинирование (см., например, Proteins-Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., Т.Е. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C.Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992).) Термины "фрагмент", "вариант", "производное" и "аналог" в отношении полипептида Sema6A согласно настоящему изобретению включают любые полипептиды, сохраняющие, по меньшей мере, некоторую иммуногенность, т.е. способность вызывать иммунный ответ против sema6A, или сохраняющие природную функцию Sema6A, например способность связываться с любым полипептидом семейства плексин-А, т.е. плексином-А 1, плексином-А 2, плексином-А 3 или плексином-А 4. Примером природной функции Sema6A является его способность связываться с полипептидами плексин-А 2 и плексин-А 4. Полипептиды Sema6A, описанные в данной заявке, могут включать фрагмент, вариант или производные молекулы без ограничений при условии, что полипептид Sema6A сохраняет иммуногенность или одну из естественных функций. Полипептиды Sema6A согласно настоящему изобретению могут включать протеолитические фрагменты Sema6A, делеционные фрагменты и, в частности, фрагменты, которые легче достигают места своего действия в организме животного. Полипептидные фрагменты дополнительно включают любую часть полипептида, содержащую антигенный или иммуногенный эпитоп нативного полипептида, включая линейные, а также трехмерные эпитопы. Полипептиды Sema6A согласно настоящему изобретению могут содержать варианты участков Sema6A, включая фрагменты, описанные выше,а также полипептиды с аминокислотными последовательностями, нарушенными вследствие аминокислотных замен, делеций или вставок. Такие варианты могут существовать в природе, как аллельные варианты. Под "аллельными вариантами" понимаются альтернативные формы гена, занимающего определенный локус в хромосоме организма (Genes II, Lewin, В., ed., John WileySons, New York (1985. Неприродные варианты могут быть получены с использованием известных способов мутагенеза. ПолипептидыSema6A могут нести консервативные или неконсервативные замены аминокислот, делеции или дополнительные аминокислоты. Полипептиды Sema6A согласно настоящему изобретению могут также включать производные молекулы. Например, полипептиды Sema6A согласно настоящему изобретению могут включать участки Sema6A, содержащие модификации, которые придают им дополнительные особенности, отсутствующие у природных вариантов полипептида. Примеры этого включают белки слияния и белковые конъюгаты. В настоящем исследовании понятие "полипептидный фрагмент" или "белковый фрагмент" относится к короткой аминокислотной последовательности полипептида Sema6A. Белковые или полипептидные фрагменты могут быть "отдельно стоящими" или быть частью большего полипептида, в котором фрагменты формируют часть участка. Типичные примеры полипептидных фрагментов согласно настоящему изобретению включают, например, фрагменты, состоящие из приблизительно 5 аминокислот, приблизительно 10 аминокислот, приблизительно 15 аминокислот, приблизительно 20 аминокислот, приблизительно 30 аминокислот, приблизительно 40 аминокислот, приблизительно 50 аминокислот, приблизительно 60 аминокислот, приблизительно 70 аминокислот, приблизительно 80 аминокислот, приблизительно 90 аминокислот, и приблизительно 100 аминокислот. В данной заявке термины "связанный", "слитый" или "слияние" взаимозаменяемы. Эти термины относятся к соединению двух и более элементов или компонентов любым способом, включая химическую конъюгацию и рекомбинантные методы. "Слияние внутри рамки" относится к соединению двух или бо-5 017403 лее открытых рамок считывания (ORF) с образованием протяженной, более длинной рамки считывания,с сохранением правильной рамки считывания исходной ORF. Таким образом, рекомбинантный белок,образованный в результате слияния, представляет собой единый белок, содержащий два или более сегментов, которые относятся к полипептидам, кодируемым исходными ORF (сегменты которых не объединяются в естественных условиях). Хотя рамка считывания, таким образом, является непрерывной в пределах двух слитых фрагментов, сегменты могут быть физически или пространственно разделены посредством, например, линкерной последовательности в рамке считывания. Применительно к полипептидам, термин "линейная последовательность", или "последовательность", обозначает порядок аминокислот в полипептиде в направлении от амино- к карбоксильному концу, в котором соседние остатки образуют непрерывную первичную структуру полипептида. В данной заявке термин "экспрессия" относится к процессу, в ходе которого ген образует биохимическое вещество, например РНК или полипептид. Этот процесс включает любые проявления функционального присутствия гена в клетке, включая, без ограничения, нокдаун генов, а также временную и устойчивую экспрессию. Он также включает, без ограничений, транскрипцию гена в матричную РНК(мРНК), транспортную РНК (тРНК), малую шпилечную РНК(мшРНК), малую интерферирующую РНК(миРНК), или любой другой продукт РНК и трансляцию такой мРНК в полипептид(ы). Если желаемый конечный продукт является биохимическим веществом, экспрессия включает создание этого вещества и любых его предшественников. Под "субъектом", или "индивидуумом", или "животным", или "пациентом", или "млекопитающим" понимают любой субъект, в частности, относящийся к млекопитающим, в отношении которого желательно проведение диагностики, прогнозирования или терапии. Субъекты, относящиеся к млекопитающим, включают, не ограничиваясь ими, людей, одомашненных животных, сельскохозяйственно значимых животных, диких животных, спортивных животных, домашних животных, таких как собаки, кошки,морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы; приматов, таких как человекообразные обезьяны, обезьяны, орангутаны и шимпанзе; животных семейства псовых, таких как собаки и волки, семейства кошачьих, таких как кошки, львы и тигры, семейства непарнокопытных, таких как лошади, ослы и зебры; медведей; мясо-молочный скот, такой как коровы, свиньи и овцы; копытных,таких как олени и жирафы; грызунов, таких как мыши, крысы, хомячки и морские свинки, и т.д. В некоторых вариантах реализации изобретения под млекопитающими понимают субъектов-людей.Sema6A Изобретение основано на обнаружении того факта, что полипептиды Sema6A способствуют увеличению числа олигодендроцитов путем стимулирования их выживания, пролиферации и/или дифференцировки. Кроме того, изобретатели обнаружили, что полипептиды Sema6A способствуют миелинизации нейронов. Известно, что природный полипептид Sema6A экспрессируется в развивающихся мозге, почках,легких и печени. Sema6A также обнаружен в тканях взрослых людей, например в коже (дендритные клетки) и в плацентарных тканях с высокой способностью к регенерации. Ген Sema6A человека состоит из 20 экзонов, включая 2 нетранслируемых экзона, занимающих приблизительно 60 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов) последовательности генома на 5 хромосоме. Полноразмерный полипептид человека Sema6A состоит из сигнальной последовательности, внеклеточного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического домена. Внеклеточный домен содержит sema-домен и плексин-семафорин-интегриновый домен (PSI). Размер полноразмерных полипептидов человека Sema6A варьирует от приблизительно 971 аминокислоты до приблизительно 1049 аминокислот,в зависимости от варианта (см. фиг. 1). Подобные варианты существуют для Sema6A мыши (см., например, фиг. 2). Последовательность полипептида из 1030 аминокислот описана как последовательность полипептида человека Sema6A и помещена в базу данных Genbank под номером NP-065847. Последовательность полипептида человека Sema6A обозначена в настоящей заявке как изоформа А и SEQ ID NO:2. SEQ IDNO:1 представляет собой последовательность нуклеотидов, кодирующую SEQ ID NO:2. Последовательность полипептида из 1047 аминокислот описана как вариант последовательности полипептида человекаSema6A и помещена в базу данных Genbank под номером EAW48937. Полипептид из 1047 аминокислот обозначен здесь как изоформа В и SEQ ID NO:4. Последовательность нуклеотидов, кодирующая SEQ IDNO:4, обозначена SEQ ID NO:3. Еще один вариант полипептида человека Sema6A, состоящий из 971 аминокислоты, помещен в базу данных Genbank под номером EAW48935. Полипептид из 971 аминокислоты обозначен в настоящей заявке как изоформа С и SEQ ID NO:6. Последовательность полипептида из 975 аминокислот описана как вариант последовательности полипептида человека Sema6A и помещена в базу данных Genbank под номером EAW48934. Полипептид из 975 аминокислот обозначен в настоящей заявке как изоформа D и SEQ ID NO:8. Варианты Sema6A человека включают, не ограничиваясь ими,полипептид Sema6A изоформы А с делецией после аминокислоты 1001, в результате чего образуется полипептид из 1000 аминокислот (Nakayama et al., Genome Res. 12(11): 1773-1784 (2002); Strausberg et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(26): 16899-16903 (2002. Известны также другие варианты Sema6A (см.,например, Prislei et al. Mol Cancer Ther. 7(1): 233-241 (2007.-6 017403 Также описана последовательность полипептида мыши Sema6A и его варианты. Полипептид мышиSema6A из 1031 аминокислоты помещен в базу данных UniProtKB/Swiss-Prot entry под номером 035464. Этот полипептид обозначен здесь как изоформа 1 и SEQ ID NO:10. Нуклеотидная последовательность,кодирующая SEQ ID NO:10, обозначена SEQ ID NO:9. Еще одна полипептидная последовательность из 1005 аминокислот описана как последовательность полипептида мыши Sema6A и помещена в базу данных Genbank под номером AF288666. Данная полипептидная последовательность обозначена как изоформа 2 и SEQ ID NO:12. Последовательность нуклеотидов, кодирующая SEQ ID NO: 2, обозначена SEQID NO:11. Еще один вариант последовательности полипептида мыши Sema6A помещен в базу данныхUniProtKB/Swiss-Prot под номером 035464. Данная последовательность полипептида обозначена в настоящей заявке как изоформа 3 и SEQ ID NO: 14. Последовательность нуклеотидов, кодирующая SEQ IDNO:14, обозначена SEQ SEQ ID NO:13. Варианты Sema6A мыши включают, не ограничиваясь ими, полипептиды с нижеследующими мутациями: A172V, L201P, N337D, S585N, Q685R, TK703-704SE, P735S,Q766E, I856T, или KSPNHGVNLVENLDSLPPKVPQREAS863888ESSPYVLKQFSEAFNRQGIILSVAVE. Известные полипептиды Sema6A других животных, включают, не ограничиваясь ими, полипептиды шимпанзе, собаки и рыбы Danio rerio. Известны варианты полипептидов Sema6A шимпанзе, например,помещенные в базу данных Genbank под номерами ХР 001150634, ХР 001150901, ХР 001150706,ХР 001151177, ХР 001151109, ХР 001151041, ХР 001150971 и ХР 517889. Не ограничивающими примерами вариантов полипептидов Sema6A собаки являются последовательности, помещенные в базу данных Genbank под номерами ХР 538552, ХР 859002, ХР 858964, ХР 858921, ХР 858886 и ХР 858843. Полипептиды Sema6A и их варианты могут быть найдены у других животных. Обозначения функциональных доменов Sema6A определены ниже. Таблица 1. Примеры доменов Sema6A человека Специалисту в данной области будет понятно, что начальные и конечные остатки доменов, приведенные здесь, могут отличаться в зависимости от компьютерной программы, используемой для моделирования, или от способа, используемого для определения домена. Поэтому различные функциональные домены Sema6A могут отличаться от указанных выше. Например, функциональные домены полипептида человека Sema6A изоформы А, т.е. SEQ ID NO: 2, могут варьироваться таким образом.-7 017403 Таблица 3. Вариации последовательности функциональных доменов SEQ ID NO: 2 На основании вариаций последовательности SEQ ID NO: 2, специалист, обладающий средними навыками в данной области, может выявить варианты последовательностей SEQ ID NOs: 4, 6 и 8. Последовательности функциональных доменов в SEQ ID NO:10, т.е. изоформы 1 полипептидаSema6A мыши, варьируются следующим образом: Таблица 4. Вариации последовательности функциональных доменов SEQ ID NO:10 Кроме того, варианты последовательностей SEQ ID NO:12 или 14, или других вариантов мыши или других животных могут быть легко выявлены на основании табл. 2-4. Плексин-А 2 Известно, что полипептид плексин-А 2 связывается с полипептидом Sema6A (Suto et al. Neuron 53: 535 (2007. Полноразмерный полипептид плексин-А 2 человека (SEQ ID NO: 15) состоит из сигнальной последовательности, внеклеточного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического домена. Внеклеточный домен содержит sema-домен и четыре IPT/TIG-домена, т.е. IPT/TIG 1-4. Sema-домен включает аминокислоты 50-523 в SEQ ID NO: 15. IPT/TIG-домены 1-4 включают аминокислоты 873-967,967-1053, 1056-1155 и 1158-1251 в SEQ ID NO: 15, соответственно. Специалисту в данной области будет понятно, что начальные и конечные остатки доменов, приведенные в настоящей заявке могут различаться в зависимости от компьютерной программы, используемой для моделирования, или от метода, используемого для определения домена. Последовательности полноразмерных полипептидов человека плексин-А 2 варьируют. Один пример варианта полипептида плексин-А 2 имеет последовательность из 1894 аминокислот и помещен в базу данных Genbank под номером NP 079455. Также, в данной области техники хорошо известны последовательности плексина-А 2 других животных. Например, полипептиды мыши плексин-А 2 описаны и помещены в базу данных Genbank под номерами NP032908, AAH68155, EDL12938, EDL12937 и NP786926. Плексин-А 4 Также известно, что плексин-А 4 является рецептором полипептида Sema6A (Suto et al. Neuron 53: 535 (2007. Полноразмерный полипептид человека плексин-А 4 (SEQ ID NO: 16) состоит из сигнальной последовательности, внеклеточного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического домена. Внеклеточный домен содержит sema-домен, три PSI-домена, т.е. PSI 1-3, и 4 IPT/TIG-домена, т.е.IPT/TIG 1-4. Sema-домен включает аминокислоты 24-507 в SEQ ID NO: 16. PSI-домены включают аминокислоты 509-559, 655-702 и 803-856 в SEQ ID NO: 16, соответственно. IPT/TIG-домены 1-4 в полипептиде плексин-А 4 включают аминокислоты 858-952, 954-1037, 1040-1139 и 1142-1230 в SEQ ID NO: 16,соответственно. Специалисту в данной области будет понятно, что начальные и конечные остатки доменов, приведенные в настоящей заявке, могут различаться в зависимости откомпьютерной программы,используемой для моделирования, или от способа, используемого для определения домена. Последовательности полноразмерных полипептидов плексин-А 4 человека варьируют. Например,различные варианты плексина-А 4 помещены в базу данных Genbank под номерами EAW83796,-8 017403NP001099013, EAW83795, ААН 28744 и EAL24077. Более того, описаны также последовательности плексина-А 4 у других животных. Например, последовательности полипептидов плексин-А 4 мыши помещены в базу данных Genbank под номерами NP786926, BAC56599, EDL13705 и EDL13704. Некоторые варианты реализации изобретения предусматривают использование полноразмерного или зрелого полипептида Sema6A, или растворимого полипептида Sema6A. Конкретнее, растворимые полипептиды Sema6A согласно настоящему изобретению включают фрагменты, варианты или производные полноразмерного или зрелого полипептида Sema6A. Приведенные выше табл. 1-4 описывают различные функциональные домены полипептида Sema6A. Растворимые полипептиды Sema6A согласно настоящему изобретению, как правило, включают часть или целый внеклеточный домен полипептида. Растворимые полипептиды Sema6A согласно настоящему изобретению, как правило не имеют трансмембранного и/или цитоплазматического домена. Специалисту в данной области будет понятно, что полноразмерный внеклеточный домен Sema6A может содержать дополнительные аминокислоты, или меньше аминокислот, на С- или N-конце экстраклеточного домена полипептида, и может содержать внутренние делеции. Полипептиды Sema6A человека, которые можно использовать в способах согласно настоящему изобретению включают, не ограничиваясь ими, полипептид Sema6A, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85,90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминоксилот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот от 56 до 417 в SEQ IDf" в SEQ ID NO: 8; от а до f" в SEQ ID NO: 8; от b до f" в SEQ ID NO: 8; от 1 до f" в SEQ ID NO: 8; от 56 до f" в SEQ ID NO: 4; от а до f'" в SEQ ID NO: 4; от b до f" в SEQ ID NO: 4; от 1 до f" в SEQ ID NO: 4; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот; причем а представляет собой любое целое число между 24 и 56, b (любое целое число между 19 и 21), с (любое целое число между 472 и 512), с' (любое целое число между 418 и 453), d (любое целое число между 514 и 569), d' (любое целое число между 455 и 510), е (любое целое число между 570 и 650), е' (любое целое число между 511 и 591),е" (любое целое число между 570 и 595), и е'" (любое целое число между 570 и 667); f (любое целое число между 647 и 671), f' (любое целое число между 588 и 612), f" (любое целое число между 592-616), и f'"(любое целое число между 664 и 688). В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидSema6A, который можно использовать в способах согласно настоящему изобретению, связывается с полипептидом плексин-А 2 или плексин-А 4. Полипептиды Sema6A человека, которые можно использовать в способах согласно настоящему изобретению включают полипептид Sema6A, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминоксилот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот от 1 до 975 в SEQ ID NO: 8; от 19 до 417 вID NO: 6; от 1 до 593 в SEQ ID NO: 8; от 1 до 665 в SEQ ID NO: 4; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминоксилот. В других вариантах реализации изобретения полипептидSema6A связывается с полипептидами плексин-А 2 или плексин-А 4. В другом варианте реализации изобретения полипептиды человека Sema6A, которые можно использовать в способах согласно настоящему изобретению включают полипептид Sema6A, включающий,состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминоксилот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот от 56-417 в SEQ ID NO: 2; 55-417 в SEQ ID NO: 2; 54-417 в SEQ ID NO: 2; 53-417 в SEQ ID NO: 2; 52-9 017403 417 в SEQ ID NO: 2; 51-417 в SEQ ID NO: 2; 50-417 в SEQ ID NO: 2; 49-417 в SEQ ID NO: 2; 48-417 вID NO: 2; 8-417 в SEQ ID NO: 2; 7-417 в SEQ ID NO: 2; 6-417 в SEQ ID NO: 2; 5-417 в SEQ ID NO: 2; 4417 в SEQ ID NO: 2; 3-417 в SEQ ID NO: 2; 2-417 в SEQ ID NO: 2; 1-417 в SEQ ID NO: 2; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминоксилот, причем указанный полипептид Sema6A связывается с полипептидами плексин-А 2. В дальнейших вариантах реализации изобретения полипептиды человека Sema6A, которые можно использовать в способах согласно настоящему изобретению, включают полипептид Sema6A, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот,причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 40-472 в SEQ ID NO: 2; 41-472 в SEQ ID NO: 2; 42-472 в SEQ ID NO: 2; 43-472 в SEQ ID NO: 2; 44-472 в SEQ ID NO: 2; 45-472 в SEQ ID NO: 2; 46-472 в SEQ ID NO: 2; 47-472 в SEQ ID NO: 2; 48-472 вSEQ ID NO: 2; 56-479 в SEQ ID NO: 2; 56-480 в SEQ ID NO: 2; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминоксилот. В дальнейших вариантах реализации изобретения, полипептиды человека Sema6A, которые можно использовать в способах согласно настоящему изобретению, включают полипептид Sema6A, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот,причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 1-551 в SEQ ID NO: 2; 1-552 в SEQ ID NO: 2; 1-553 в SEQ ID NO: 2; 1-554 в SEQ ID NO: 2; 1-555 вNO: 2; 1-597 в SEQ ID NO: 2; 1-598 в SEQ ID NO: 2; 1-599 в SEQ ID NO: 2; 1-600 в SEQ ID NO: 2; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот. В других вариантах реализации изобретения полипептиды человека Sema6A, которые можно использовать в способах согласно настоящему изобретению, включают полипептид Sema6A, включающий,состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 1-649 в SEQ ID NO: 2; 2-649 в SEQ ID NO: 2; 3-649 в -649 в SEQ ID NO: 2; 4-649 в SEQ ID NO: 2; 5649 в SEQ ID NO: 2; 6-649 в SEQ ID NO: 2; 7-649 в SEQ ID NO: 2; 8-649 в SEQ ID NO: 2; 9-649 в SEQ IDNO: 2; 23-649 в SEQ ID NO: 2; 24-649 в SEQ ID NO: 2; 25-649 в SEQ ID NO: 2; 26-649 в SEQ ID NO: 2; и комбинации двух или более указанных х последовательностей аминокислот. Способы согласно настоящему изобретения дополнительно включают полипептид Sema6A, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей изSEQ ID NO: 2; 1-663 в SEQ ID NO: 2; 1-664 в SEQ ID NO: 2; 1-665 в SEQ ID NO: 2; 1-666 в SEQ ID NO: 2; 1-667 в SEQ ID NO: 2; 1-668 в SEQ ID NO: 2; 1-669 в SEQ ID NO: 2; 1-670 в SEQ ID NO: 2; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот. Способы согласно настоящему изобретению дополнительно включают полипептид Sema6A, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 1-570 в SEQ ID NO: 4; 1-571 в SEQ ID NO: 4; 1-572 в SEQ ID NO: 4; 1-573 в SEQ ID NO: 4; 1-574 в SEQ ID NO: 4; 1-575 в SEQ ID NO: 4; 1-576 в SEQ ID NO: 4; 1-577 в SEQ ID NO: 4; 1-578 в SEQNO: 4; 1-588 в SEQ ID NO: 4; 1-589 в SEQ ID NO: 4; 1-590 в SEQ ID NO: 4; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот. Способы согласно настоящему изобретению дополнительно включают полипептид Sema6A, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 1-630 в SEQ ID NO: 4; 1-631 в SEQ ID NO: 4; 1-632 в SEQ ID NO: 4; 1-633 в SEQ ID NO: 4; 1-634 в SEQ ID NO: 4; 1-635 в SEQ ID NO: 4; 1-636 в SEQ ID NO: 4; 1-637 в SEQ ID NO: 4; 1-638 в SEQID NO: 4; 1-662 в SEQ ID NO: 4; 1-663 в SEQ ID NO: 4; 1-664 в SEQ ID NO: 4; 1-665 в SEQ ID NO: 4; 1666 в SEQ ID NO: 4; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот. Способы согласно настоящемй изобретению дополнительно включают полипептид Sema6A, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 45-492 в SEQ ID NO: 6; 46-492 в SEQ ID NO: 6; 47-492 в SEQ ID NO: 6; 48-492 в SEQ IDNO: 6; 56-498 в SEQ ID NO: 6; 56-599 в SEQ ID NO: 6; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот. Способы согласно настоящемй изобретению дополнительно включают полипептид Sema6A, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 1-580 в SEQ ID NO: 6; 1-581 в SEQ ID NO: 6; 1-583 в SEQ ID NO: 6; 1-584 в SEQ ID NO: 6; 1-585 в SEQ ID NO: 6; 1-586 в SEQ ID NO: 6; 1-587 в SEQ ID NO: 6; 1-588 в SEQ ID NO: 6; 1-589 в SEQNO: 6; 18-590 в SEQ ID NO: 6; 19-590 в SEQ ID NO: 6; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот. Способы согласно настоящемй изобретению дополнительно включают полипептид Sema6A, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей изNO: 8; 50-595 в SEQ ID NO: 8; 51-595 в SEQ ID NO: 8; 52-595 в SEQ ID NO: 8; 53-595 в SEQ ID NO: 8; 54595 в SEQ ID NO: 8; 55-595 в SEQ ID NO: 8; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот. Способы согласно настоящему изобретению дополнительно включают полипептид Sema6A, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 1-580 в SEQ ID NO: 8; 1-581 в SEQ ID NO: 8; 1-583 в SEQ ID NO: 8; 1-584 в SEQ ID NO: 8; 1-585 в SEQ ID NO: 8; 1-586 в SEQ ID NO: 8; 1-587 в SEQ ID NO: 8; 1-588 в SEQ ID NO: 8; 1-589 в SEQSEQ ID NO: 8; 18-595 в SEQ ID NO: 8; 19-595 в SEQ ID NO: 8; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения, полипептид Sema6A согласно настощему изобретнию связывается с полипептидами подсемейства плексин-А. Например, полипептид Sema6A связывается с полипептидом плексин-А 1, с полипептидом плексин-А 2, с полипептидом плексин-А 3, или с полипептидом плексин-А 4. В других вариантах, Sema6A может быть изолированным. Под "эталонной последовательностью аминокислот" подразумевается указанная последовательность без внесения каких-либо замен аминокислот. Специалист с базовыми знаниями в данной области способен понять, что если замены аминокислот отсутствуют, то "изолированый полипептид" согласно настоящему изобретению состоит из последовательности аминокислот, которая идентична эталонной последовательности аминокислот. Полипептиды Sema6A, описанные в настоящей заявке, могут включать различные изменения, такие как замены, вставки или делеции. Типичные аминокислоты, которые могут быть заменены в полипептиде, включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин),неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин,метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Также предусмотрены соответствующие фрагменты полипептидов Sema6A, по меньшей мере на 70,75, 80, 85, 90 или 95% идентичные полипептидам и эталонным полипептидам, описываемым здесь. Как известно, "идентичность последовательностей" между двумя полипептидами определяется путем сравнения последовательности аминокислот одного полипептида с последовательностью другого полипептида. Рассматривая в данной заявке вопрос о том, является ли любой отдельно взятый полипептид по меньшей мере приблизительно на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99%, или 100% идентичным другому полипептиду, можно использовать методы и компьютерные программы, известные в данной области, такие как (без ограничения) программа BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT использует алгоритм локального выравнивания Смита и Уотермана (Smith and Waterman, Advances in AppliedMathematics 2:482-489 (1981 для определения сегмента наибольшей гомологии между двумя последовательностями. При использовании программы BESTFIT, или любой другой программы для выравнивания последовательностей с целью определения того, является ли конкретная последовательность, например,на 95% идентичной последовательности, используемой для сравнения, в соответствии с настоящим изобретением, параметры, конечно, должны быть заданы таким образом, чтобы процент идентичности рассчитывался по всей длине эталонной последовательности полипептида и допускались пропуски в гомологии до 5% от общего числа аминокислот в последовательности, используемой для сравнения. В соответствии со способами настоящего изобретения полипептид Sema6A или фрагмент полипептида может быть введен непосредственно в качестве готового полипептида. Как описано в другом месте настоящей заявки, полипептид Sema6A можно вводить в форме полинуклеотида, который поглощается- 12017403 клетками и экспрессируется в них. Например, полинуклеотид, кодирующий Sema6A, может быть введен в виде вирусного вектора. Способы лечения с использованием полипептидов Sema6A В одном из вариантов реализации изобретения обеспечивается способ лечения болезни, заболевания или поражения, связанного с дисмиелинизацией и демиелинизацией, например рассеянного склероза, у животного, страдающего данным заболеванием, причем данный способ включает, состоит по существу из, или состоит из введения животному эффективного количества полипептида Sema6A или его фрагмента, растворимого полипептида Sema6A, или его вариантов, производных или аналогов. Дополнительно изобретение ориентировано на способ стимулирования миелинизации нейронов у млекопитающих, причем данный способ включает, состоит по существу из, или состоит из введения млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида Sema6A или его фрагмента,растворимого полипептида Sema6A, или его вариантов, производных или аналогов. В дополнительном варианте реализации изобретения обеспечиваются способы лечения болезни, заболевания или поражения, ассоциированных с гибелью олигодендроцитов или снижением их дифференцировки, например рассеянного склероза, болезни Пелицеуса-Мерцбахера или глобоидно-клеточной лейкодистрофии (болезни Краббе), у животных, страдающих от этого заболевания, причем данный способ включает, состоит по существу из, или состоит из введения животному эффективного количества полипептида Sema6A или его фрагмента, растворимого полипептида Sema6A, или его вариантов, производных или аналогов. Другой вариант реализации изобретения включает способ стимулирования пролиферации, дифференцировки и выживания олигодендроцитов у млекопитающих, причем данный способ включает, состоит по существу из, или состоит из введения терапевтически эффективного количества полипептидаSema6A или его фрагмента, растворимого полипептида Sema6A, или его вариантов, производных или аналогов. Настоящее изобретение ориентировано на способ стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов, включая осуществление контакта олигодендроцитов с эффективным количеством композиции, содержащей полипептид Sema6A. Далее настоящее изобретение ориентировано на способ стимулирования миелинизации нейронов, опосредованной олигодендроцитами, включая осуществление взаимодействия смеси нейронов и олигодендроцитов с эффективным количеством композиции, содержащей изолированный полипептид Sema6A. Полипептид Sema6A, подлежащий использованию в способах лечения, указываемых здесь, может быть приготовлен и использован в качестве терапевтического агента, который индуцирует, способствует,активирует или стимулирует способность Sema6A к регуляции миелинизации нейронов олигодендроцитами. Дополнительно, полипептид Sema6A, подлежащий использованию в способах лечения, указываемых здесь, может быть приготовлен и использован в качестве терапевтического агента, который индуцирует, способствует, активирует или стимулирует способность Sema6A к регуляции дифференцировки,пролиферации и выживания олигодендроцитов. Дальнейшие варианты реализации изобретения включают способ индукции пролиферации или выживания олигодендроцитов, с целью лечения заболевания, расстройства или поражения, при которых наблюдается разрушение олигодендроцитов или миелина, причем данный способ включает введение млекопитающему в месте повреждения, расстройства или поражения, или рядом с ним, в количестве,достаточном для снижения ингибирования аксонального удлинения и стимулирования миелинизации. В другом варианте реализации изобретение ориентировано на способ стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов у млекопитающих, причем способ включает введение млекопитающему, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции, содержащей изолированный полинуклеотид, который кодирует полипептид Sema6A, указанный здесь, или способ стимулирования миелинизации нейронов у млекопитающих, причем способ включает введение млекопитающему эффективного количества композиции, содержащей изолированный полинуклеотид, который кодирует полипептид Sema6A, указанный здесь. Изобретение также включает способ лечения болезни, расстройства или поражения, связанных с миелином, или дисмиелинизацией, или демиелинизацией, или болезни, расстройства или поражения,связанных с гибелью олигодендроцитов или отсутствием их дифференцировки у млекопитающих, причем способ включает введение млекопитающему, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей изолированный полинуклеотид, который кодирует полипептид Sema6A. В соответствии со способами настоящего изобретения полипептид Sema6A можно применять путем непосредственного назначения пациенту полипептида Sema6A. Альтернативно, полипептид Sema6A можно применять, используя экспрессионный вектор, который продуцирует специфический полипептидSema6A. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид Sema6A применяется в способе лечения, который включает: (1) трансформацию или трансфекцию имплантируемой клетки-хозяина нуклеиновой кислотой, например, вектором, который экспрессирует полипептид Sema6A; и (2) имплантирование трансформированной клетки-хозяина млекопитающему в место повреждения, расстройства или- 13017403 поражения. Например, трансформированная клетка-хозяин может быть имплантирована в очаг хронического поражения при рассеянном склерозе. В некоторых вариантах реализации изобретения имплантируемую клетку-хозяин берут у млекопитающего, некоторое время культивируют, трансформируют или осуществляют трансфекцию изолированной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид Sema6A, и имплантируют обратно тому же млекопитающему, у которого была взята клетка. Клетка может быть (хотя и необязательно) взята из того же места, куда затем будет имплантирована. Такие способы реализации изобретения, известные как генная терапия ех vivo, могут обеспечивать продолжительное снабжение полипептидом Sema6A, локализованное в месте действия, в течение ограниченного периода времени. Заболевания и расстройства, которые можно лечить, или облегчать их течение, посредством способов, описываемых в настоящем изобретении, включают заболевания, расстройства или поражения, которые относятся к дисмиелинизаци и демиелинизации нейронов млекопитающих; более конкретно, заболевания и расстройства, при которых миелин, окружающий нейрон, отсутствует, или не полностью присутствует, или не формируется должным образом, или портится. Такие заболевания включают, без ограничения, рассеянный склероз, включая рассеянный склероз возвратно-ремиттирующего характера, вторично прогрессирующие и первично прогрессирующие формы рассеянного склероза; прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (PML), энцефаломиелит (EPL), миелолиз моста головного мозга(СРМ), адренолейкодистрофию, болезнь Александера, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (PMZ), глобоидно-клеточную лейкодистрофию (болезнь Краббе), Уоллеровскую дегенерацию, ретробульбарный неврит и поперечный миелит. Заболевания и расстройства, которые можно лечить или облегчать их течение, посредством способов, описываемых в настоящем изобретении, включают нейродегенеративные заболевания или расстройства. Такие заболевания включают, не ограничиваясь ими, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Примеры дополнительных болезней, расстройств и поражений, которые можно лечить, или облегчать их течение, посредством способов, описываемых в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь ими, травмы спинного мозга, хроническую миелопатию или радикулопатию, травмы головного мозга, заболевания моторных нейронов, повреждения аксонов, контузии, паралич, лучевое поражение или другие неврологические осложнения химиотерапии, инсульт, большие лакуны, средние и большие непроходимости сосудов, лейкоареоз, ишемическую нейропатию зрительного нерва, недостаток витамина Е (синдром недостатка изолированного витамина Е, AR, синдром Бессена-Корнцвейга), недостаток витаминов В 12, В 6 (пиридоксин - пеллагра), тиамина, фолата, никотиновой кислоты, синдром Марчиафава-Бигнами, метахроматическую лейкодистрофию, невралгию тройничного нерва, паралич Белла или любые поражения нервной системы, при которых необходима регенерация аксонов, ремиелинизация или выживание, а также дивверенцировка/пролиферация олигодендроцитов. Белки слияния и конъюгированные полипептиды Некоторые варианты реализации изобретения включают использование полипептида Sema6A, слитого с частью гетерологичного белка с образованием белка слияния. Такие белки слияния могут быть использованы для достижения различных целей, например, для увеличения периода полужизни сыворотки крови, улучшения биодоступности, нацеливания in vivo на специфический орган или тип ткани,улучшения рекомбинантным путем эффективности экспрессии, улучшение секреции клетки-хозяина,облегчения очистки и усиления связей в молекуле. В зависимости от желаемой цели гетерологичная часть может быть инертной или биологически активной. Также она может быть стабильно сшита с участком полипептида Sema6A, описываемого в изобретении, или расщеплена in vitro или in vivo. Гетерологичные части, способные удовлетворять указанным условиям, известны в данной области знаний. В качестве альтернативы экспрессии белка слияния выбранная гетерологичная часть может быть создана и химически связана с участком полипептида Sema6A, описываемого в изобретении. В большинстве случаев выбранная гетерологичная часть должна функционировать подобным образом при слиянии или связывании с участком полипептида Sema6A. Поэтому в нижеследующем описании гетерологичных аминокислотных последовательностей, если не указано иного, подразумевается, что гетерологичная последовательность может быть соединена с участком полипептида Sema6A в форме белка слияния или продукта химического связывания (включая ковалентные и нековалентные связи) с полипептидами или другими соединениями. Например, полипептиды Sema6A могут быть рекомбинантно слиты или химически связаны с молекулами, которые можно использовать как метки при детекционном анализе, и с эффекторными молекулами, например, гетерологичными полипептидами, лекарствами, радионуклидами,или токсинами (см., например, РСТ publications WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. PatentNo. 5,314,995; и ЕР 396,387). Полипептиды Sema6A, которые могут быть использованы в способах лечения, описываемых здесь,включают производные, модифицированные, например, посредством ковалентного присоединения молекул любого типа, причем ковалентно присоединенная к полипептиду Sema6A молекула не вызывает ингибирования биологической функции Sema6A. Например, но не для введения каких-либо ограничений,полипептиды Sema6A, описываемые в настоящем исследовании, можно модифицировать, например, посредством гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфилирования, фосфорилирования,- 14017403 аминирования, образования производных белка с введением известных защитных/блокирующих групп,протеолитического расщепления, связывания с клеточными лигандами или другими белками, и т.д. Любые из многочисленных химических модификаций могут быть осуществлены с использованием известных способов, включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т.д. Дополнительно, производное может содержать одну или более неприродных аминокислот. Полипептиды Sema6A, которые могут быть использованы в способах лечения, описываемых здесь,могут состоять из аминокислот, соединенных между собой пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидными изостерами, и могут содержать аминокислоты, не относящиеся к 20 аминокислотам, кодируемым генами. Полипептиды Sema6A могут быть модифицированы в ходе природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, или с использованием подходов химических модификаций, хорошо известных специалистам в данной области. Такие модификации подробно описаны в различных текстах и более детально в монографиях, а также в обширно представленной научной литературе. Модификации могут быть внесены в любой участок полипептида Sema6A, включая пептидный остов, боковые цепи аминокислот, и амино- и карбоксиконцевые участки, или в участки небелковой природы, например, углеводородные участки. Предпочтительно один и тот же тип модификации может быть представлен в той же или слегка отличающейся манере в различных сайтах данного полипептида Sema6A. Также заданный полипептид Sema6A может содержать несколько типов модификации. Полипептиды Sema6A могут быть разветвленными, например, в результате убиквитинирования, а также циклическими, с ветвлениями или без них. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды Sema6A могут образоваться в результате естественных посттрансляционных процессов или могут быть созданы синтетическими способами. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, аминирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизация, образование дисульфидных мостиков, деметилирование,образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглютамата,формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, формирование GPI-якоря, гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристиолирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, присоединение селена, сульфатирование, тРНК-опосредованное добавление аминокислот к белкам, например, аргинилирование и убиквитинирование (см., например, Proteins-Structure And Molecular Properties, Т. E. Creighton, W. H. Freemanand Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. С Johnson,Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12(1983); Seifteret al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al.,Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992. Данное изобретение также обеспечивает белки слияния, включающие, состоящие по существу из,или состоящие из слияния полипептида Sema6A. В некоторых вариантах реализации изобретения, слияние полипептида Sema6A связывается с плексином-А 2 или плексином-А 4. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид Sema6A, например, полипептид Sema6A, содержащий Sema-домены иPSI-домен, или полный внеклеточный домен (соответствующий аминокислотам от 1 до 649 в SEQ IDNO: 2), слит с гетерологичным полипептидным участком с формированием полипептида слиянияSema6A. Фармакологически активные полипептиды могут быстро деградировать in vivo, вызывая необходимость использования больших доз для достижения терапевтически эффективных концентраций в организме. Кроме того, полипептиды, не превосходящие 60 кДа, потенциально подвергаются гломерулярной фильтрации, что иногда приводит к нефротоксичности. Слияние или связывание полипептидных фрагментов может быть использовано для снижения или избежания риска такой нефротоксичности. Известны различные гетерологичные аминокислотные последовательности, т.е. полипептидные части или "носители" для увеличения стабильности терапевтических полипептидов in vivo, например, полужизни сыворотки крови. Благодаря длительному периоду полужизни, широкому распространению in vivo и отсутствию ферментативной или иммунологической функции, полноразмерный человеческий сывороточный альбумин (HSA), или его фрагмент, широко используется в качестве гетерологичной части. Применяя способы и материалы, указанные в источниках (Yen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1904-08 (1992) and Syed etal., Blood 89:3243-52 (1997, HSA можно использовать для создания полипептида слияния Sema6A, который проявляет фармакологическое действие за счет части Sema6A и при этом демонстрирует значительно большую стабильность in vivo, например, в 10-100 раз выше. С-конец HSA может быть слит с Nконцом части Sema6A. Поскольку HSA является исходно секретируемым белком, сигнальная последовательность HSA может быть использована, чтобы добиться секреции белка слияния Sema6A в культуральную среду, если белок слияния продуцируют эукариотические экспрессионные системы, например,клетки млекопитающих. Сигнальная последовательность представляет собой полинуклеотид, кодирующий аминокислотную- 15017403 последовательность, которая инициирует транспорт белка через мембрану эндоплазматического ретикулума. Сигнальные последовательности, удобные для создания иммунослияний, включают сигнальные последовательности легкой цепи антитела, например антитело 14.18 (Gillies et al., J. Immunol. Meth. 125:191-202 (1989 и сигнальные последовательности тяжелой цепи антитела, например сигнальную последовательность тяжелой цепи антитела МОРС 141 (Sakano et al., Nature 286:5774 (1980. В качестве альтернативы могут использоваться и другие сигнальные последовательности (см. Watson, Nucl. AcidsRes. 12:5145 (1984. Сигнальный пептид обычно отщепляется в просвете эндоплазматического ретикулума за счет действия сигнальных пептидаз. Это приводит к секреции белка иммунослияния, содержащего Fc-район и часть Sema6A. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность ДНК может кодировать сайт протеолитического расщепления между кассетой секреции и полипептидом Sema6A. Такой сайт расщепления может обеспечивать, например, протеолитическое расщепление кодируемого белка слияния, таким образом, отделяя Fc-домен от целевого белка. Пригодные сайты протеолитического расщепления включают аминокислотные последовательности, распознаваемые протеолитическими ферментами, такими как трипсин, плазмин, тромбин, фактор Ха или энтерокиназа К. Кассета секреции может быть встроена в реплицирующийся экспрессионный вектор. Пригодные векторы включают линейные нуклеиновые кислоты, плазмиды, фагмиды, космиды и т.п. Типичным примером вектора экспрессии является pdC, в котором транскрипция ДНК иммунослияния находится под контролем энхансера и промотора цитомегаловируса человека (см., например, Lo et al., Biochim. Biophys.Acta 1088:712 (1991); and Lo et al., Protein Engineering 11:495-500 (1998. Подходящие клетки-хозяева могут быть трансформированы или подвергнуты трансфекции ДНК, кодирующей полипептид Sema6A, и использованы для экспрессии и секреции полипептида Sema6A. Обычно используемые клетки-хозяева включаютиммортализованные клетки гибридомы, клетки миеломы, клетки 293, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки Hela и клетки COS. В одном из вариантов реализации изобретения полипептид Sema6A слит с шарниром и Fc-районом,т.е. с С-концевым участком константного района тяжелой цепи lg. Потенциальные преимущества слияния Sema6A-Fc включают растворимость, стабильность in vivo и мультивалентность, например димеризацию. Используемый Fc-район может представлять собой Fc-участок молекул IgA, IgD, или IgG (шарнир-Сн 2-Сн 3). Альтернативно, он может также представлять собой Fc-участок молекул IgE или IgM (шарнирСн 2- Сн 3-Сн 4). Обычно используется Fc-участок молекулы IgG, например, Fc-участок молекулы IgG-,или lgG4. В одном из вариантов реализации изобретения для слияния используется последовательность,начинающаяся в шарнирном участке сразу перед сайтом расщепления папаина, который определяет Fcучасток молекулы IgG химически (т.е. остаток 216, что делает первый остаток константного участка тяжелой цепи остатком 116, в соответствии с системой Kabat), или аналогичными сайтами в других иммуноглобулинах. Точный сайт, по которому осуществляется слияние, не является критичным; некоторые конкретные сайты хорошо известны и могут быть выбраны для оптимизации биологической активности,секреции или характеристик связывания молекулы. Материалы и способы конструирования и экспрессии ДНК, кодирующей Fc-слияния, известны в данной области знаний и могут быть применены для того,чтобы получить Sema6A слияния, без дополнительных экспериментов. В некоторых вариантах реализации изобретения используют белок слияния, такой как описан в источнике (Capon et al., US Patent Nos. 5428130 and 5565335). Полностью интактные участки Fc дикого типа проявляют эффекторные функции, которые могут быть нецелесообразны и нежелательны в белках Fc-слияния, используемых согласно способам настоящего изобретения. Поэтому, некоторые сайты связывания обычно делетируют из Fc-участка при конструировании кассеты секреции. Например, поскольку совместная экспрессия с легкой цепью нежелательна, сайт связывания для белка, связывающего тяжелую цепь, Bip (Hendershot et al., Immunol. Today 8:11114 (1987, делетирован из СН 2-домена Fc-участка молекулы IgE, так что данный сайт не мешает эффективной секреции иммуноглобулина. Также обычно делетируют последовательности трансмембранного домена, присутствующие в молекуле IgM. Наиболее часто используют Fc-участок молекулы IgG1. Альтернативно, в секреционной кассете можно использовать Fc-участок молекул других подклассов иммуноглобулина гамма (гамма-2, гамма-3 и гамма-4). Обычно в секреционной кассете используют lgG1 Fc-участок иммуноглобулина гамма-1, который включает по меньшей мере часть шарнирного участка, Сн 2-район и Сн 3-район. В некоторых вариантах Fc-участок иммуноглобулина гамма-1 представляет собой Сн 2-делетированный Fc, включающий часть шарнирного участка и Сн 3-участок, но не Сн 2-участок. Сн 2-делетированный Fc был описан в следующем источнике (Gillies et al., Hum. Antibod. Hybridomas 1:47 (1990. В некоторых вариантах, используется Fc-участок молекул IgA, IgD, IgE, или IgM. Белки слияния Sema6A-Fc могут быть сконструированы во многих различных конфигурациях. В одной конфигурации С-конец части Sema6A слит непосредственно с N-концом части Fc-шарнира. В несколько другой конфигурации короткий полипептид, например, из 2-10 аминокислот, включен в слияние между N-концом части Sema6A и С-концом части Fc. Такой линкер обеспечивает конформационную подвижность, которая может усиливать биологическую активность при некоторых обстоятельствах. Если- 16017403 в участке Fc сохранена значительная часть шарнирного участка, слияние Sema6A-Fc димеризуется, формируя тем самым двухвалентную молекулу. Однородная популяция мономерных Fc-слияний содержит моноспецифические, бивалентные димеры. Смесь двух мономерных Fc-слияний, каждое из которых имеет различную специфичность, содержит биспецифические, бивалентные димеры. Любой из большого числа перекрестных линкеров, которые содержат соответствующую аминореактивную группу и тиол-реактивную группу, можно использовать для соединения полипептидовSema6A с сывороточным альбумином в других гетерологичных пептидах. Примеры подходящих линкеров включают аминореактивные перекрестные линкеры, встраивающие тиол-реактивный малеимид, например, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, и GMBS. Другие подходящие линкеры встраивают тиол-реактивную галоацетатную группу, например, SBAP, SIA, SIAB. Линкеры, предоставляющие защищенный или незащищенный тиол для реакции с сульфогидрильными группами, чтобы получить допускающую ослабление связь, включают SPDP, SMPT, SATA, и SATP. Данные реагенты являются коммерчески доступными (например, Pierce Chemicals). Химическое связывание не обязательно должно затрагивать N-концевую часть полипептидаSema6A или тиольную часть сывороточного альбумина. Например, слияния Бета 6 А-альбумин можно получить, используя методики генной инженерии, при этом часть Sema6A может быть слита с геном сывороточного альбумина на его N-конце, С-конце, или обоих концах молекулы. Для облегчения очистки или идентификации участка Sema6A можно получать слияние полипептидов Sema6A с гетерологичными пептидами. Например, для облегчения очистки Sema6A с использованием коммерчески доступной хроматографической среды можно присоединять к Sema6A гистидиновую метку. В некоторых вариантах реализации изобретения конструкция слияния Sema6A используется для увеличения продукции участка Sema6A в бактериях. В таких конструкциях бактериальный белок, в норме экспрессирующийся и/или секретируемый на высоком уровне, используется в качестве N-концевого партнера для слияния с полипептидом Sema6A (см., например, Smith et al., Gene 67:31 (1988); Hopp et al.,Biotechnology 6:1204 (1988); La Vallie et al., Biotechnology 11:187 (1993. При использовании части Sema6A на амино- и карбоксиконцах, подходящих для слияния молекулпартнеров, могут быть получены бивалентные или тетравалентные формы полипептида Sema6A. Например, часть Sema6A может быть слита с амино- и карбоксиконцом lg части с целью получения бивалентного мономерного полипептида, содержащего две части Sema6A. При димеризации двух таких мономеров за счет lg части образуется тетравалентная форма белка Sema6A. Такие мультивалентные формы можно использовать для достижения повышенной аффинности связывания с мишенью. Мультивалентные формы Sema6A также можно получить путем соединения частей Sema6 А тандемно, с образованием конкатемеров, которые можно использовать как сами по себе, так и формировать слияния со сливающимися молекулами, такими как lg или HSA. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептиды Sema6A, которые можно использовать согласно способам настоящего изобретения, включают направляющую часть. Направляющая часть включает белок или пептид, который направляет молекулу в определенную часть тела, например, в мозг или его отделы. В некоторых вариантах полипептиды Sema6A, которые можно использовать согласно способам настоящего изобретения, присоединены или слиты с частью, направляющей молекулу в мозг. Части, направляющие молекулу в мозг, присоедины ковалентно (например, напрямую, путем трансляционного слияния, или посредством химического связывания либо непосредственно, либо через спейсерную молекулу, которая возможно может быть отщеплена), или нековалентно (например, посредством обратимых взаимодействий, которые осуществляют авидин, биотин, белок А, IgG и т.п.). В других вариантах реализаци изобретения полипептиды Sema6A, которые можно использовать согласно способам настоящего изобретения, присоединены к еще одной части, направляющей молекулу в мозг. В других вариантах, часть, направляющая молекулу в мозг, присоединена к множеству полипептидов Sema6A,которые можно использовать согласно способам настоящего изобретения. Часть, направляющая молекулу в мозг, связанная с полипептидом Sema6A, улучшает доставку в мозг такого полипептида Sema6A. Описано большое число полипептидов, которые, будучи слиты с белком или терапевтическим агентом, осуществляют доставку указанного белка или терапевтического агента через гематоэнцефалический барьер (ВВВ). Примеры, которые не следует рассматривать как ограничивающие, включают однодоменное антитело FC5 (Abulrob et al., J. Neurochem. 95, 1201-1214 (2005;mAB 83-14, моноклональное антитело к человеческому рецептору инсулина (Pardridge et al., Pharmacol.(hTfR) (Xia et al., J. Virol. 74, 11359-11366 (2000; моноклональное антитело 0X26 к рецептору трансферрина (Pardridge et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 259, 66-70 (1991 и SEQ ID NOs: 1-18 of U.S. Patent No. 6306365. Содержимое вышеуказанных источников включено в данный текст во всей полноте посредством ссылки. Улучшенная доставка в мозг композиции, содержащей Sema6A, определена методами, хорошо известными в данной области знаний. Например, введение животному радиоактивно меченого полипептида Sema6A, связанного с частью, направляющей молекулу в мозг; определение локализации в мозге и- 17017403 сравнение локализации с эквивалентным радиоактивно меченым полипептидом Sema6A, не связанным с частью, направляющей молекулу в мозг. Другие методы определения улучшения доставки белков в мозг описаны в вышеуказанных источниках. Конъюгированные полимеры (отличные от полипептидов) Некоторые варианты реализации изобретения включают полипептид Sema6A, причем с полипептидом Sema6A связаны (ковалентно) один или более полимеров. Примеры полимеров, подходящих для такого связывания, включают полипептиды (обсуждаемые выше), сахаридные полимеры и цепочки полиалкиленгликолей. Обычно, хотя и необязательно, полимер связан с полипептидом Sema6A с целью улучшения одного или более пунктов из нижеследующих: растворимость, стабильность или биодоступность. Полимеры, обычно используемые для связывания с полипептидом Sema6A, относятся к классу полиалкиленгликолей. Наиболее часто используется полиэтиленгликоль (ПЭГ). Части ПЭГ, например 1, 2,3, 4 или 5 полимеров ПЭГ могут быть связаны с каждым полипептидом Sema6A для увеличения полужизни сыворотки крови, по сравнению с полипептидом Sema6A без дополнительных компонентов. ПЭГ части молекулы являются не антигенными и биологически практически инертны. ПЭГ части, которые используют на практике, могут быть разветвленными или неразветвленными. Число частей ПЭГ, присоединенных к полипептиду Sema6A, а также молекулярный вес отдельных цепей ПЭГ, могут варьировать. Вообще, чем выше молекулярный вес полимера, тем меньше полимерных цепей присоединено к полипептиду. Обычно, суммарная масса полимеров, присоединенных к полипептиду Sema6A, составляет от 20 до 40 кДа. Таким образом, если присоединена одна цепь полимера, ее вес в большинстве случаев составляет 20-40 кДа. Если присоединены две цепи, их вес в большинстве случаев составляет 10-20 кДа. Если присоединены три цепи, молекулярный вес каждой цепи в большинстве случаев составляет 7-14 кДа. Полимер, например, ПЭГ, может быть связан с полипептидом Sema6A через любую подходящую,доступную химически активную группу полипептида. Доступные химически активные группы могут представлять собой, например, N-терминальную аминогруппу или эпсилон-аминогруппу внутреннего лизинового остатка, или обе эти группы. Активированный полимер может вступать в реакцию и ковалентно связываться с любой из свободных групп полипептида Sema6A. Свободные карбоксильные группы, соответствующим образом активированные карбонильные группы, гидроксил-, гуанидил-, имидазолокисленные углеводородные группы и меркаптогруппы полипептида Sema6A (если являются доступными) также могут быть использованы в качестве химически активных групп для присоединения полимера. В реакции связывания обычно используется от приблизительно 1.0 до приблизительно 10 молей активированного полимера на моль полипептида, в зависимости от концентрации полипептида. Обычно выбираемое соотношение отражает баланс между максимально возможным выходом прямой реакции и уменьшением побочных реакций (часто неспецифических), которые могут влиять на желаемую фрамакологическую активность полипептида Sema6A. Предпочтительно, чтобы в результате сохранялось по меньшей мере 50% биологической активности полипептида Sema6A (что может быть продемонстировано, например, посредством любого анализа, описанного здесь или известного в данной области знаний),и наиболее предпочтительным вариантом является сохранение почти 100% биологической активности полипептида Sema6A. Конъюгировать полимер с полипептидом Sema6A можно, используя обыкновенные химические методы. Например, полиалкиленгликольная часть может быть соединена с лизиновой эпсилонаминогруппой полипептида Sema6A. Связывание с лизиновой боковой цепью может быть осуществлено с активным сложным эфиром, содержащим N-гидроксилсукцинимид (НГС), таким как ПЭГсукцинимидилсукцинат (ПЭГ-СС) и сукцинимидилпропионат (ПЭГ-СП). Подходящие полиалкиленгликольные части включают, например, карбоксиметил-НГС и норлейцин-НГС, SC. Данные реагенты являются коммерчески доступными. Дополнительные линкеры ПЭГ с химически активными аминогруппами могут быть заменены на сукцинимидиловую часть. Они включают, например, изотиоцианаты, нитрофенилкарбонаты (PNP), эпоксиды, бензотриазол-карбонаты, SC-PEG, трезилат, альдегид, эпоксид,карбонилимидазол и PNP-карбонат. Условия реакции обычно оптимизируют для достижения максимальной избирательности и выхода реакции. Такая оптимизация условий реакции известна специалистам со средним уровнем знаний в данной области. ПЭГилирование может быть осуществлено путем любой из реакций ПЭГилирования, известных в данной области знаний (см., например, Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992), и Европейские патентные заявки ЕР 0154316 и ЕР 0401384). ПЭГилирование может быть проведено с использованием реакций ацилирования или алкилирования с химически активными молекулами полиэтиленгликоля (или аналогичного химически активного водорастворимого полимера). ПЭГилирование путем ацетилирования, как правило, включает реакцию с активным производным полиэтиленгликоля в виде сложного эфира. Любая химически активная молекула ПЭГ может быть вовлечена в реакцию ПЭГилирования. Часто в качестве активированного сложного эфира ПЭГ используют ПЭГ, этерифицированный с N-гидроксилсукцинимидом (НГС). Термин "ацилирование", используемый в данной заявке, включает, без каких-либо ограничений, следующие типы связей между терапевтическим- 18017403 белком и водорастворимым полимером, таким как ПЭГ: амидную, карбаматную, уретановую и т.п. (см.,например, Bioconjugate Chem. 5:133-140, 1994). Условия реакции обычно подбираются так, чтобы избежать использования температур, растворителей и значений рН, которые могут повредить или инактивировать полипептид Sema6A. Как правило, связь представляет собой амидную связь, и обычно по меньшей мере 95% продукта,образующегося в результате реакции, моно-, ди- или три-ПЭГилировано. Тем не менее, могут образовываться также некоторые варианты молекул с более высокой степенью ПЭГилирования, и их количество зависит от специфических условий реакции. При желании, очищенные варианты ПЭГилированных молекул можно отделить от смеси, в частности, от молекул, не вступивших в реакцию, посредством обычных способов очистки, включая, например диализ, высаливание, ультрафильтрацию, ионообменную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию, хроматографию с гидрофобным обменом и электрофорез. ПЭГилирование посредством алкилирования обычно включает осуществление реакции терминального альдегидного производного ПЭГ с полипептидом Sema6 А присутствии восстановителя. Дополнительно можно изменять условия реакции, чтобы они способствовали ПЭГилированию главным образом только по N-терминальной аминогруппе полипептида Sema6A, с образованием моно-ПЭГилированного белка. В любом случае, включая моно-ПЭГилирование или поли-ПЭГилирование, ПЭГ группы обычно присоединяются к белку через Cн 2-NH-группу. Co ссылкой на Сн 2-группу данный тип связи называют"алкильная" связь. Формирование производных путем восстановительного алкилирования с образованием Nтерминально меченных моно-ПЭГилированных продуктов использует различную способность к реагированию различных типов первичных аминогрупп (лизин по сравнению с N-терминальной группой),способных к образованию производных. Реакцию проводят при значении рН, которое позволяет использовать различия рКа между эпсилон-аминогруппами лизиновых остатков и N-терминальных аминогрупп белка. При таком селективном образовании производных можно контролировать присоединение водорастворимого полимера, содержащего химически активную группу, такую как альдегидная группа, к белку: связывание с полимером имеет место преимущественно на N-конце белка, и не наблюдается никаких значительных модификаций других химически активных групп, таких как лизиновые боковые цепи аминогрупп. Полимерные молекулы, которые используются в методиках ацилирования и алкилирования, выбираются из водорастворимых полимеров. Обычно выбранный полимер модифицирован так, чтобы иметь лишь одну химически активную группу, например, активную эфирную группу для ацилирования или альдегидную для алкилирования, так что уровень полимеризации можно контролировать, в соответствии с тем, как это обеспечивается в описываемой методике. Типичным примером химически активного ПЭГ альдегида является полиэтиленгликоль-пропионовый альдегид, стабильный в водном растворе, или его моно-С 1-С 10-алкокси или арилоксипроизводные (см., например, Harris et al., U.S. Pat. No. 5252714). Полимер может быть разветвленным или неразветвленным. Полимеры, выбранные для реакций ацилирования, несут единственную химически активную эфирную группу. Полимеры, выбранные для реакций алкилирования, несут единственную химически активную альдегидную группу. Обычно водорастворимый полимер не выбирается из природных гликозильных остатков, поскольку их удобнее получать в рекомбинантных экспрессионных системах млекопитающих. Способы приготовления ПЭГилированного полипептида Sema6A обычно включают этапы: (а) осуществления реакции полипептида Sema6A с полиэтиленгликолем (таким, как производное ПЭГ с химически активной эфирной или альдегидной группой) при условиях, в которых молекула оказывается пришитой к одной или более ПЭГ групп, и (б) получения продуктов реакции. В целом, оптимальные условия реакции для реакций ацилирования определяются для каждого конкретного случая на основании известных параметров и желаемого результата. Например, увеличение соотношения ПЭГ к белку обычно приводит к увеличению количества поли-ПЭГилированного продукта. Восстановительное алкилирование, приводящее к образованию практически однородной популяции монополимер/полипептид Sema6A, обычно включает этапы: (а) осуществления реакции белка Sema6A или полипептида Sema6A с химически активной молекулой ПЭГ в условиях, необходимых для восстановительного алкилирования, при значениях рН, подходящих для осуществления избирательной модификации N-терминальной аминогруппы полипептида, и (б) получения продуктов реакции. Для практически однородной популяции монополимер/полипептид Sema6A условиями реакции восстановительного алкилирования являются те условия, при которых происходит селективное присоединение водорастворимой полимерной части к N-концу полипептида. Такие условия реакции обычно определяются для различий рКа между аминогруппой лизиновой боковой цепи и N-терминальной аминогруппы. Для целей настоящего изобретения, значения рН устанавливали обычно в интервале 3-9,обычно 3-6. Полипептиды Sema6A могут включать метку, т.е. часть, которая впоследствии может быть отщеплена в ходе протеолиза. Так, лизин может быть селективно модифицирован, если вначале провести его реакцию с His-меткой, модифицированной линкером с низким молекулярным весом, таким как реагент- 19017403 Траута (Pierce), который взаимодействует как с лизином, так и с N-концом, а затем отщепить His-метку. Полипептид, образующийся в результате, будет содержать свободную SH-группу, которую можно селективно модифицировать ПЭГ, содержащим тиол-реактивную головную группу, например, такую как малеимидная группа, винилсульфоновая группа, галоацетатная группа, или свободная или защищенная SHгруппа. Реагент Траута можно заменить на любой линкер, который устанавливает специфический сайт для присоединения ПЭГ. Например, его можно заменить на SPDP, SMPT, SATA, или SATP (Pierce). Также,можно провести реакцию взаимодействия белка с аминореактивным линкером, который встраивает малеимид (например, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, или GMBS), галоацетатную группу (SBAP, SIA, SIAB) или винилсульфоновую группу, а затем провести реакцию взаимодействия образовавшегося продукта с ПЭГ, содержащим свободные SH-группы. В некоторых вариантах реализации изобретения полиалкиленгликольная часть соединена с цистеиновой группой полипептида Sema6A. Такое связывание можно осуществить, используя, например, малеимидную группу, винилсульфоновую группу, галоацетатную группу или тиольную группу. При желании, можно связать полипептид Sema6A с полиэтиленгликольной частью через лабильную связь. Лабильную связь можно расщепить при, например, биохимическом гидролизе, протеолизе, или сульфидрильном расщеплении. Например, эту связь можно расщепить в in vivo (физиологических) условиях. Реакции можно осуществлять посредством любого доступного способа, используемого для осуществления взаимодействия биологически активных материалов с инертными полимерами, обычно при значениях рН, равных 5-8, например, рН 5, 6, 7 или 8, если химически активные группы находятся на альфа-аминогруппе на N-конце. Обычно данный процесс состоит из приготовления активированного полимера и последующего осуществления реакции взаимодействия белка с активированным полимером,с образованием белка, подходящего для использования. Векторы Векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды Sema6A, можно также использовать в соответствии со способами настоящего изобретения. Выбор вектора и последовательностей,контролирующих экспрессию, с которыми соединены указанные нуклеиновые кислоты, зависит от желаемых функциональных характеристик, например, экспрессии белка и типа клеток-хозяев, которые будут подвергнуты трансформации. Элементы контроля экспрессии, полезные для регуляции экспрессии кодирующей последовательности, хорошо известны специалистам в данной области знания. Их примеры включают, не являясь ограничениями, индуцибельные промоторы, конститутивные промоторы, сигналы секреции и другие регуляторные элементы. Если используется индуцибельный промотор, можно осуществлять его контроль,например, путем изменения статуса питания, или путем изменения температуры среды, в которой растут клетки-хозяева. Вектор может включать прокариотический репликон, т.е. последовательность ДНК, способную к непосредственной автономной репликации и поддержанию рекомбинантной молекулы ДНК внехромосомно в бактериальной клетке-хозяине. Такие репликоны известны специалистам в данной области знания. Дополнительно, векторы, включающие прокариотический репликон, могут также включать ген,экспрессия которого представляет собой детектируемый маркер, например, устойчивость к некоторым препаратам. Примерами бактериальных генов устойчивости к препаратам являются гены, обеспечивающие устойчивость кампициллину или тетрациклину. Векторы, включающие прокариотический репликон, могут также включать прокариотический промотор или промотор бактериофага, для управления экспрессией кодирующей последовательности гена в бактериальной клетке-хозяине. Промоторные последовательности, совместимые с бактериальными хозяевами, обычно предоставляются в плазмидных векторах, содержащих подходящие сайты рестрикции для вставки сегмента ДНК, который будет экспрессироваться. Примерами таких плазмидных векторов являются pUC8, pUC9, pBR322 и pBR329 (BioRad), pPL и рКК 223 (Pharmacia). Любые подходящие прокариотические клетки-хозяева могут быть использованы для того, чтобы экспрессировать рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую белок, используемый согласно способу настоящего изобретения. Для целей настоящего изобретения можно использовать многочисленные системы экспрессионных векторов. Например, в одном классе векторов используются элементы ДНК, производные от вирусов животных, например вируса бычьей папилломы, вируса полиомы, аденовируса, вируса коровьей оспы,бакуловируса, ретровирусов (RSV, MMTV или MOMLV) или вируса SV40. В других векторах используются полицистронные системы с внутренними сайтами связывания рибосом. Дополнительно можно вести отбор клеток, включивших ДНК в хромосомы, если внести в них один или несколько маркеров, позволяющих вести отбор трансформированных клеток. Маркер может обеспечивать прототрофность ауксотрофному хозяину, устойчивость к биоцидным веществам (например, антибиотикам), или устойчивость к тяжелым металлам, например, к меди. Маркерный ген, используемый для отбора, может быть либо непосредственно связан с последовательностями ДНК, которые будут экспрессироваться, либо может быть внесен в ту же клетку при ко-трансформации. Ген неомицин-фототрансферазы (neo) является- 20017403 примером маркерного гена, используемого для отбора (Southern et al., J. Mol. Anal. Genet. 1:327-341(1982. Для оптимального синтеза мРНК могут также требоваться дополнительные элементы. Эти элементы могут включать сигнальные последовательности, сигналы сплайсинга, а также транскрипционные промоторы, энхансеры и сигналы терминации. В одном из вариантов реализации изобретения, можно использовать запатентованный вектор экспрессии Biogen IDEC, Inc., называемый NEOSPLA (U.S. patent 6,159,730). Данный вектор содержит промотор/энхансер цитомегаловируса, основной промотор бета-глобина мыши, точку начала репликацииSV40, последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста, экзон 1 и экзон 2 гена неомицинфототрансферазы, ген дигидрофолатредуктазы и лидерную последовательность. Было показано, что данный вектор способен к очень высокому уровню экспрессии при внесении его в клетки СНО, после отбора на G418-содержащей среде и росте на метотрексате. Разумеется, в настоящем изобретении можно использовать любой экспрессионный вектор, способный вызывать экспрессию в эукариотических клетках. Примеры подходящих векторов включают, не ограничиваясь ими, плазмиды pcDNA3, pHCMV/Zeo,pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1 иpZeoSV2 (доступные в Invitrogen, San Diego, CA), и плазмиду pCI (доступную в Promega, Madison, WI). Другие экспрессионные векторы для эукариотических клеток известны специалистам в данной области и коммерчески доступны. Как правило, такие векторы содержат рестрикционные сайты, подходящие для вставки желаемого сегмента ДНК. Типичные векторы включают pSVL и pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1,pml2d (International Biotechnologies), pTDT1 (АТСС 31255), ретровирусный вектор экспрессии pMIG иpLL3.7, аденовирусный шаттл-вектор pDC315 и векторы AAV. Другие типичные векторные системы описаны, например, в US Patent 6,413,777. Вообще, скрининг большого количества трансформированных клеток с целью обнаружения тех клеток, которые экспрессируют достаточно высокий уровень полипептида, является обычным экспериментом, который можно осуществлять, например, при помощи роботизированных систем. Часто используемые регуляторные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих включают вирусные элементы, которые определяют высокий уровень экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и энхансеры, происходящие из ретровирусных LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, промотор/энхансер CMV), обезьяньего вируса 40 (SV40) (например,промотор/энхансер SV40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (AdmIP,полиомы, и сильные промоторы млекопитающих, например, природные промоторы иммуноглобулина и актина. Для дальнейшего описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей см. источники (Stinski, US Pat. No. 5168062; Bell, US Pat. No. 4510245; and Schaffner, US Pat. No. 4968615). Рекомбинантные экспрессионные векторы могут содержать последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и маркерные гены,используемые для отбора. Маркерные гены, используемые для отбора, ускоряют отбор клеток-хозяев, в которые встроился вектор (см., например, Axel, US Pat. Nos. 4399216; 4634665 and 5179017). Например,обычно маркерный ген, используемый для отбора, обеспечивает устойчивость к препарату, например,G418, гигромицину или метотрексату, клетки-хозяина, в которую встраивается вектор. Часто используемые маркерные гены, используемые для отбора, включают гендигидрофолат-редуктазы (DHFR) (для использования в dhfr- клетках-хозяевах с отбором/ростом на метотрексате) и ген neo (для отбора G418). Векторы, кодирующие полипептиды Sema6A, можно использовать для трансформации подходящих клеток-хозяев. Трансформацию можно осуществлять любым подходящим способом. Способы внесения экзогенной ДНК в клетки млекопитающих, хорошо известны в данной области знаний и включают декстран-опосредованную транфекцию, осаждение фосфатом кальция, полибрен-опосредованную транфекцию, слияние протопластов, электропорацию, энкапсулирование полинуклеотидов влипосомах и прямую микроинъкецию ДНК в ядра. Дополнительно, молекулы нуклеиновой кислоты можно вносить в клетки млекопитающих при помощи вирусных векторов. Трансформацию клеток-хозяев можно осуществлять с использованием традиционных способов,подходящих для используемого типа вектора и клеток-хозяев. Для трансформации прокариотических клеток-хозяев можно использовать электропорацию и способ солевого воздействия (Cohen et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 69:2110-14 (1972. Для трансформации клеток позвоночных можно использовать электропорацию, способы катионно-липидного или солевого воздействия (см., например, Graham et al.,Virology 52:456-467 (1973); Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-76 (1979. Линия клеток-хозяев, используемая для экспрессии белка, может происходить из млекопитающих; специалист в данной области знания способен предпочтительно определить конкретные линии клетокхозяев, которые наилучшим образом подходят для экспрессии в них желаемого генного продукта. Типичные примеры линий клеток-хозяев включают, не ограничиваясь ими, клетки NSO, SP2, клетки почки детенышей хомячка (ВНК), клетки почки обезьяны (COS), клетки человеческой гепатоклеточной карциномы (например, Hep G2), клетки А 549 DG44 и DUXB11 (линии яичника китайского хомячка, DHFRминус), HELA (человеческая цервикальная карцинома), CVI (линия почки обезьяны), COS (производноеCVI с Т-антигеном SV40), R1610 (фибробласты китайского хомячка), BALBC/3T3 (мышиные фибробласты), НАК (линия почки хомячка), SP2/O (миелома мыши), P3x63-Ag3.653 (миелома мыши), BFA- 21017403 1c1BPT (клетки эндотелия быка), RAJI (лимфоциты человека) и 293 (почка человека). Линии клетокхозяев обычно доступны в коммерческих службах, Американской Коллекции Клеточных Культур или в опубликованной литературе. Экспрессию полипептидов в линиях продуцирующих клеток можно усиливать, используя известные методики. Например, для усиления экспрессии в различных условиях обычно используют глутаминсинтазную (GS) систему (см., например, Европейские патенты 0216846, 0256055 и 0323997 и Европейскую патентную заявку 89303964.4. Клетки-хозяева Клетки-хозяева для экспрессии полипептида Sema6A для использования в соответствии со способами настоящего изобретения могут быть прокариотическими и эукариотическими. Типичные примеры эукариотических клеток-хозяев включают, не ограничиваясь ими, клетки дрожжей и млекопитающих,например клетки яичника китайского хомячка (СНО) (номер CCL61 в АККК), NIH клетки эмбриона швейцарской мыши NIH-3T3 (номер CRL1658 в АККК) и клетки почки детенышей хомячка (ВНК). Другие подходящие эукариотические клетки-хозяева включают клетки насекомых и растений. Типичными прокариотическими клетками-хозяевами являются Е. coli и Streptomyces. Генная терапия Полипептид Sema6A можно продуцировать in vivo в организме млекопитающих, например у пациентов человека, с использованием методики генной терапии для лечения болезней нервной системы, заболеваний или повреждений, при которых стимулирование выживания, пролиферации и/или дифференцировки олигодендроцитов или стимулирование миелинизации нейронов может быть терапевтически выгодным. Данный подход включает применение подходящей нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид Sema6A, соединенной сучетом нормальной работы с подходящими последовательностями, контролирующими экспрессию. Как правило, данные последовательности встроены в вирусный вектор. Векторы, подходящие для такой генной терапии, включают аденовирусный вектор, альфавирусный вектор,энтеровирусный вектор, пестивирусный вектор, лентивирусный вектор, бакуловирусный вектор, герпесвирусный вектор, вектор на основе вируса Эпштейна-Барр, паповавирусный вектор, поксвирусный вектор, вектор на основе вируса коровьей оспы, вектор на основе аденосателлитного вируса и вектор на основе вируса простого герпеса. Вирусный вектор может представлять собой вектор, не способный к нормальной репликации. Обычно используются аденвирусные векторы с делецией генов Е 1 или Е 3. Когда используется вирусный вектор, вектор не содержит маркерного гена, используемого для отбора. Фармацевтические композиции Полипептиды Sema6A, используемые в соответствии со способами настоящего изобретения, могут входить в состав фармацевтических композиций для введения млекопитающим, включая человека. Фармацевтические композиции, используемые в соответствии со способами настоящего изобретения, включают фармацевтически пригодные носители, включая, например, ионообменные соединения, окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, например человеческий сывороточный альбумин, буферные вещества, например фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смесь фрагментов глицеридов насыщенных жирных кислот растений, воду, соли или электролиты, например, сульфат протамина, гидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный оксид кремния, трисиликат магния, поливинил-пирролидон, вещества целлюлозной природы, полиэтиленгликоль, натриевая карбоксиметилцеллюлоза, полиакрилаты, воска, полимеры из блоков полиэтиленполиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин. Композиции, используемые в соответствии со способами настоящего изобретения, можно применять посредством любого подходящего способа, например, парентерально, интравентрикулярно, орально, путем ингаляции спреем, локально, ректально, назально, буккально, вагинально или с использованием имплантированного резервуара. Термин "парентерально", используемый в данной заявке, включает подкожное, внутривенное, внутримышечное, интраартикулярное, внутрисуставное, подложечное, интратекальное, внутрипеченочное, внутриочаговое и внутричерепное введение или вливание. Как было описано выше, полипептиды Sema6A, применяемые в соответствии со способами настоящего изобретения,работают в нервной системе, стимулируя выживание, пролиферацию и дифференцировку олигодендроцитов и миелинизацию нейронов. Сответственно, в способах настоящего изобретения, полипептидыSema6A применяются таким образом, чтобы они могли проникнуть через гематоэнцефалический барьер. Такое проникновение осуществляться благодаря физико-химическим свойствам, присущим самой молекуле полипептида Sema6A, благодаря другим компонентам фармацевтической композиции, или за счет использования механического приспособления, например иглы, канюли или хирургического инструмента, позволяющих физически нарушить гематоэнцефалический барьер. Если полипептид Sema6A является молекулой, которой не свойственно проникновение через гематоэнцефалический барьер, например, при слиянии с частью молекулы, усиливающей проникновение, подходящими способами введения являются,например, интратекальный и внутричерепной, т.е. непосредственно в очаг хронического повреждения при рассеянном склерозе. Если полипептид Sema6A является молекулой, которой свойственно проникновение через гематоэнцефалический барьер, подходящим способом его введения может быть один или более из различных способов, описываемых ниже.- 22017403 Стерильные инъекционные формы композиций, используемые согласно способам настоящего изобретения, могут представлять собой водную или масляную суспензию. Данные суспензии могут быть приготовлены в соответствии с методиками, известными в данной области знания, с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих веществ и суспендирующих веществ. Стерильный инъекционный препарат может также представлять собой стерильный инъекционный раствор или суспензию в нетоксичном парентерально применяемом растворителе, например суспензию в 1,3-бутандиоле. К подходящим растворителям, которые можно использовать подобным образом, относятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Стерильные нелетучие масла также традиционно используются в качестве растворителей или суспендирующих веществ. Для этих целей можно использовать любое обычное нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, например, олеиновую кислоту и ее глицериновые производные, можно использовать для приготовления инъекционных растворов, так же, как и природные масла, применяемые в фармации, например оливковое масло или касторовое масло, в особенности их полиоксиэтилированные варианты. Данные масляные растворы или суспензии могут также содержать длинноцепочечный спирт в качестве растворителя или диспергирующего средства, например, карбоксиметилцеллюлозу или подобное диспергирующее вещество, которое обычно используется при приготовлении фармацевтически допустимых дозированных форм,включая эмульсии и суспензии. Также для приготовления лекарственных форм можно применять другие широко используемые поверхностно-активные вещества, например Tweens, Spans и другие эмульгаторы или усилители биодоступности, которые обычно используются в производстве фармацевтически допустимых твердых, жидких или других дозированных форм. Парентеральное применение может осуществляться в виде одиночной болюсной дозы, вливания,или загрузочной болюсной дозы с последующим введением поддерживающей дозы. Эти композиции могут применяться в специфически указанном или варьирующем временном интервале, например один раз в день, или "как требуется". Некоторые фармацевтические композиции, используемые согласно способам настоящего изобретения, можно применять орально в допустимых дозированных формах, включая, например, капсулы, таблетки, водные суспензии и растворы. Некоторые фармацевтические композиции также можно применять в виде назальных аэрозолей или ингаляций. Такие композиции могут быть приготовлены в виде солевых растворов, включая бензиловый спирт или другие подходящие консерванты, вещества, способствующие абсорбции, для увеличения биодоступности, и/или другие традиционные растворители или диспергирующие вещества. Количество полипептида Sema6A, который может быть связан с материалом носителей для создания единичной дозированной формы, варьируется в зависимости от организма, подвергаемого лечению,типа используемого полипептида и конкретного способа введения. Композицию можно вводить в виде единичной дозы, множественных доз или в течении установленного периода времени в виде вливаний. Дозовый режим также может быть подобран так, чтобы вызвать оптимальный желаемый ответ (например терапевтический или профилактический ответ). В способах настоящего изобретения используется "терапевтически эффективное количество" или"профилактически эффективное количество" полипептида Sema6A. Такое терапевтически или профилактически эффективное количество может варьировать в соответствии со следующими факторами: стадия заболевания, возраст, пол и вес индивида. Терапевтически или профилактически эффективное количество также представляет собой то количество, при котором терапевтически полезное влияние преобладает над любыми токсическими или вредными эффектами. Специфические дозы и режим лечения для любого отдельно взятого пациента зависят от значительного количества факторов, включая конкретный используемый полипептид Sema6A, возраст пациента, вес тела, общее здоровье, пол, диету, время применения, уровень экскреции, комбинацию с другими лекарственными препаратами и серьезность конкретного заболевания, лечение которого проводится. Оценка этих факторов может быть проведена медицинскими работниками со средними знаниями в данной области. Количество также зависит от индивидуального пациента, подвергаемого лечению, способа применения, типа лекарства, характеристик используемого вещества, серьезности заболевания, и желаемого эффекта. Количество, которое следует использовать, может быть определено на основании фармакологических и фармакокинетических принципов, хорошо известных в данной области знания. Согласно способам настоящего изобретения полипептиды Sema6A обычно вводятся непосредственно в нервную систему, интрацеребровентрикулярно или интратекально, например, в очаг хронического поражения при рассеянном склерозе. Композиции для применения в соответствии со способами настоящего изобретения можно готовить таким образом, чтобы вводить дозу полипептида Sema6A 0,00110 мг/кг веса тела в день. В некоторых вариантах реализации изобретения дозировка составляет 0,01-1,0 мг/кг веса тела в день. В некоторых вариантах реализации изобретения дозировка составляет 0,001-0,5 мг/кг веса тела в день. Во многих вариантах реализации изобретения, дозировка составляет 5-100 мг/кг веса тела в день. В других вариантах реализации изобретения дозировка составляет 50-500 мг/кг веса тела в день. Настоящее изобретение также включает дозировку 100-1 г/кг веса тела в день. Примеры дозировок, не являющиеся ограничениями, используемых согласно способам настоящего изобретения, вы- 23017403 бираются из группы, состоящей из 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 19, 20, 25, 30,35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мг/кг веса тела в день. Дозировки, используемые в настоящем изобретении, могут составлять 1-5 г/кг веса тела в день. Дозировки, имеющие промежуточные значения между указанными выше, также рассматриваются в пределах настоящего изобретения. Указанные дозировки могут вводиться субъектам, подвергающимся лечению, ежедневно, или не каждый день, или еженедельно, или в соответствии с любым другим режимом,определенным эмпирически. Типичный пример лечения определяет порядок применения во множественных дозах, в течение продолжительного периода, например, в течение по меньшей мере шести месяцев. Другие типичные примеры режимов лечения определяют порядок применения один раз каждые две недели, или один раз в месяц, или один раз каждые 3-6 месяцев. Типичные дозировки включают, не ограничиваясь ими, 1-10 мг/кг или 15 мг/кг каждый день, 30 мг/кг не каждый день, или 60 мг/кг один раз в неделю. В некоторых вариантах реализации изобретения можно осуществлять лечение субъекта путем введения молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид Sema6A. Дозировки для нуклеиновых кислот варьируют в пределах приблизительно от 10 нг до 1 г, от 100 нг до 100 мг, от 1 мкг до 10 мг или от 30 до 300 мкг ДНК на одного пациента. Дозировки для инфекционных вирусных векторов варьируют от 10 до 100 или более вирионов на дозу. В композиции, используемые в соответствии со способами настоящего исследования, также могут быть включены сопутствующие активные компоненты. Например, полипептид Sema6A или белок слияния может быть совмещен и/или применен совместно с одним или более дополнительными терапевтическими веществами. Изобретение включает в себя любой подходящий способ доставки полипептида Sema6A в выбранную ткань, включая болюсную инъекцию водного раствора, или имплантацию системы с контролируемым высвобождением вещества. Использование имплантатов с контролируемым высвобождением вещества уменьшает число необходимых повторных инъекций. Полипептиды Sema6A, используемые в соответствии со способами настоящего изобретения, могут быть непосредственно влиты в головной мозг. Известны разнообразные имплантаты для прямого вливания в головной мозг, являющиеся эффективными способами для доставки терапевтических соединений в мозг людей, страдающих нейродегенеративными заболеваниями. Данные способы включают хронические вливания в мозг с использованием стереотаксически имплантированных насосов, временных внутритканевых катетеров, постоянных внутричерепных имплантированных катетеров и хирургически имплантированных, биодеградируемых имплантатов (см., например, Gill et al., supra; Scharfen et al., "High(1995). Композиции могут также содержать полипептид Sema6A, распределенный в биосовместимом материале-носителе, который функционирует в качестве системы доставки соединений или их поддержания. Подходящие примеры носителей с непрерывным высвобождением вещества включают полупроницаемые полимерные матрицы в виде формованных предметов, например суппозитории или капсулы. Имплантируемые или микрокапсульные матрицы с непрерывным высвобождением вещества включают полилактиды (U.S. Patent No. 3773319; ЕР 58,481), ко-полимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Lглутамата (Sidman et al., Biopolymers 22:547-56 (1985; поли(2-гидроксиэтил-метакрилат), этиленвинилацетат (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982 или поли-D-(-)-3 гидроксимасляную кислоту (ЕР 133988). В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид Sema6A вводят пациенту посредством прямого вливания в соответствующий район головного мозга (см., например, Gill et al., "Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease," Nature Med. 9: 589-95 (2003. Альтернативные методики также доступны и могут быть использованы, чтобы вводить полипептид Sema6A в соответствии с изобретением. Например, стереотаксическая установка катетера или имплантата может быть осуществлена с использованием аппарата Райхерта-Мундингера и многофункциональной навигационной системы ZD (Zamorano-Dujovny). Компьютеризованный томографический сканер (СТ) с усилением контрастности позволяет осуществлять трехмерное многоплоскостное планирование воздействия,при инъекции 120 мл омнипака, 350 мг йода/мл, с толщиной среза 2 мм (STP, Fischer, Freiburg, Germany). Данное оборудование позволяет планировать лечение на основе изучения магнитно-резонансных изображений, объединяя информацию, полученную СТ и МРТ, для точного подтверждения. С той же целью можно использовать стереотаксическую систему Leksell (Downs Surgical, Inc., Decatur, GA), модифицированную для использования с GE СТ сканером (General Electric Company,Milwaukee, WI), а также стереотаксическую систему Brown-Roberts-Wells (BRW) (Radionics, Burlington,- 24017403MA). Таким образом, на начальных этапах имплантации кольцевая основа стереотаксической рамкиBRW может быть прикреплена к черепу пациента. Серии СТ срезов могут быть получены с интервалами в 3 мм, хотя район (выбранные ткани) с графической рамкой локализатора скреплен с основной платой. Компьютерную программу планирования лечения можно запускать на компьютере VAX 11/780 (DigitalEquipment Corporation, Maynard, Mass.) с использованием СТ координат изображений, полученных с графитового стержня, для сопоставления результатов СТ и BRW. Способы лечения заболеваний, связанных с демиелинизацией и дисмиелинизацией, описанные здесь, перед опробованием на человеке, как правило, тестированы in vitro, а затем in vivo на приемлемой животной модели для оценки желаемого терапевтического или профилактического эффекта. Специалисту с базовыми знаниями в данной области известны приемлемые животные модели, включая трансгенных животных. Например, здесь описаны анализы in vitro, позволяющие продемонстрировать влияние полипептидов Sema6A на дифференцировку и выживание олигодендроцитов. Влияние полипептидовSema6A на миелинизацию аксонов или дифференцировку олигодендроцитов можно тестировать in vitro согласно тому, как это описано в примерах. В заключение, тесты in vivo можно осуществить, получив трансгенных мышей, экспрессирующих полипептид Sema6A, или воздействовав полипептидом Sema6A на мышей или крыс в условиях модели. Диагностика и наблюдение нейродегенеративных заболеваний Некоторые варианты реализации настоящего изобретения ориентированы на способ диагностики или мониторинга неврологического заболевания или состояния субъекта, посредством: (а) получения образца, например, ткани или пробы биологической жидкости, например, крови или спинномозговой жидкости (ЦСЖ) от субъекта, подвергаемого диагностике или наблюдению, (b) измерения уровня полипептида Sema6A в образце и (с) сопоставление уровня полипептида Sema6A с образцом сравнения. Под термином "диагностика" подразумевается идентификация индивида как имеющего конкретное заболевание или состояние. Под термином "наблюдение" подразумевается постоянная и/или периодическая проверка на наличие данного заболевания или феномена. В одном из вариантов реализации изобретения способ наблюдения нейродегенеративного заболевания включает отбор проб биологических жидкостей в нескольких временных точках с интервалом как часть наблюдения состояния пациента при лечении нейродегенеративного заболевания. В другом варианте реализации изобретения способ наблюдения нейродегенеративного заболевания включает отбор проб биологических жидкостей в нескольких временных точках с интервалом, как часть наблюдения состояния пациента при лечении рассеянного склероза. В одном из вариантов реализации изобретения заболеванием или состоянием, в отношении которого необходимо осуществлять диагностику или наблюдение, является рассеянный склероз. В других вариантах заболевание или состояние может быть выбрано из группы, включающей прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (PML), энцефаломиелит (EPL), миелолиз моста головного мозга(СРМ), адренолейкодистрофию, болезнь Александера, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (PMZ), глобоидно-клеточную лейкодистрофию (болезнь Краббе), Уоллеровскую дегенерацию, ретробульбарный неврит,поперечный миелит, боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, травмы спинного мозга, травмы головного мозга, лучевое поражение, неврологические осложнения химиотерапии, инсульт, ишемическую нейропатию зрительного нерва, недостаток витамина Е, синдром недостатка изолированного витамина Е, AR, синдром Бессена-Корнцвейга,синдром Марчиафава-Бигнами, метахроматическую лейкодистрофию, невралгию тройничного нерва и паралич Белла. Пробы биологических жидкостей включают, не ограничиваясь ими, кровь, мочу и спинномозговую жидкость (ЦСЖ). Способы, посредством которых можно получить биологические жидкости, включают,не ограничиваясь ими, биопсию тканей, венопункцию, сбор мочи и спинномозговую пункцию. В одном из вариантов реализации изобретения, проба биологической жидкости представляет собой ЦСЖ или кровь. Ткани включают, не ограничиваясь ими, эпителий, мышечную ткань, соединительную ткань или нервную ткань. В одном из вариантов реализации изобретения ткань представляет собой эпителий, например участок кожной ткани. В другом варианте реализации изобретения дендритные клетки, отобранные из ткани или биологической жидкости, например ЦСЖ или крови, используют для обнаружения экспрессии Sema6A. Проба биологической жидкости берется у субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект относится к позвоночным. Позвоночные включают, не ограничиваясь ими, человека, мышей,крыс, овец, коз, свиней, рогатый скот, лошадей, рептилий, рыб, амфибий и эмбрионы птиц, рептилий и рыб. В одном из вариантов реализации изобретения субъект является человеком. В другом варианте реализации изобретения субъект является человеком, страдающим или предположительно страдающим неврологическим заболеванием, выбранным из списка, включающего рассеянный склероз, прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (PML), энцефаломиелит (EPL), миелолиз моста головного мозга (СРМ), адренолейкодистрофию, болезнь Александера, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (PMZ), глобоидно-клеточную лейкодистрофию (болезнь Краббе), Уоллеровскую дегенерацию, ретробульбарный- 25017403 неврит, поперечный миелит, боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, травмы спинного мозга, травмы головного мозга, лучевое поражение,неврологические осложнения химиотерапии, инсульт, ишемическую нейропатию зрительного нерва, недостаток витамина Е, синдром недостатка изолированного витамина Е, AR, синдром БессенаКорнцвейга, синдром Марчиафава-Бигнами, метахроматическую лейкодистрофию, невралгию тройничного нерва и паралич Белла. В отдельном варианте реализации изобретения, субъект является пациентом с рассеянным склерозом, у которого недавно обнаружили по меньшей мере одно состояние, выбираемое из группы, включающей оцепенение, слабость, нарушение зрения, потеря равновесия, головокружение,гиперактивность мочевого пузыря, утомление и депрессия. В значении, используемом здесь, "недавно" может означать 3, 5, 7, 10, 14 или 21 день. Уровень экспрессии Sema6A в образце может служить индикатором стадии болезни, например,серьезности заболевания или состояния, предрасположенности субъекта к заболеванию, прогноза в отношении субъекта или эффективности применяемой терапии против заболевания. Настоящее изобретение далее обеспечивает способы детекции присутствия полипептида Sema6A в образце, полученном от субъекта. Любой способ, известный в данной области знания, может быть использован для детекции белков или мРНК. Такие методы включают, не ограничиваясь ими, окрашивание Кумасси синим, иммунодиффузию, иммуноэлектрофорез, иммунохимические способы, анализ связывания лигандов, иммуногистохимическе подходы, агглютинацию и анализ комплемента [Basic and ClinicalImmunology, 217-262, Sites and Terr, eds., AppletonLange, Norwalk, CT, (1991), источник, включенный посредством ссылки]. Способ детекции мРНК Sema6A хорошо известен в данной области знания (TuanMolecular Biology) (1st ed. Humana Press, PA 1997. Примерами, не представляющими собой ограничения,являются нозерн-гибридизация (гибридизация ДНК-РНК), гибридизация in situ, или ОТ-ПЦР. Многочисленные иммунологические анализы конкурентного и неконкурентного связывания белков хорошо известны специалисту в данной области знаний. Антитела, используемые в таких анализах, могут быть не мечеными, например, антитела, используемые в реакции агглютинации, или мечеными для использования в различных методах анализа. Метки, которые можно использовать, включают радионуклиды, ферменты, флюорофоры, хемилюминесцентные молекулы, субстраты ферментов или кофакторы,ингибиторы ферментов, частицы, красители и т.п. для использования в радиоиммунологическом анализеRIA), ферментативных иммуноанализах, например твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА,ELISA), флуоресцентном иммуноанализе, вестерн-гибридизации и т.п. При диагностике или мониторинге неврологического заболевания у субъекта уровень полипептидаSema6A в образце можно сопоставлять с уровнем полипептида Sema6A в образце сравнения. Подходящие образцы сравнения могут включать, не ограничиваясь ими, ткани или пробы биологических жидкостей, полученные от индивида, не страдающего расстройствами нервной системы. В одном из вариантов реализации изобретения образец сравнения может быть получен от субъекта, не страдающего нейродегенеративным заболеванием. В другом варианте реализации изобретения образец сравнения может быть получен от субъекта, не страдающего рассеянным склерозом. Дополнительно, в качестве внутреннего стандарта или контроля можно использовать известный белок, продуцируемый субъектом, например альбумин, если измерять его количество в сыворотке крови или общем белке. Наборы для диагностики Наборы для диагностики также рассматриваются в настоящем изобретении. Такие наборы позволяют проводить детекцию, диагностику или наблюдение нейродегенеративных заболеваний. Методика одиночного теста, используемая в данных наборах для диагностики, уменьшает время, необходимое для диагностики дейродегенеративного заболевания индивида и/или снижает время, необходимое для детекции дифференциально экспрессируемых белков в пробе биологической жидкости пациента, если проводится наблюдение прогрессии заболевания и/или эффекта от лечения заболевания пациента. Один из вариантов реализации изобретения ориентирован на создание диагностического набора для детекции, диагностики или наблюдения нейродегенеративных заболеваний у пациентов, с использованием антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с полипептидомSema6A, описываемым здесь, и детектируемой метки. В другом варианте реализации изобретение ориентировано на создание диагностического набора для детекции, диагностики или наблюдения рассеянного склероза у пациентов с использованием антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с полипептидом Sema6A, и детектируемой метки. В некоторых вариантах реализации изобретения, антитело помечено ферментами, необходимыми для детекции, например пероксидазой хрена, -галактозидазой, люциферазой, щелочной фосфатазой,глокозооксидазой и т.п. В вариантах, когда оно помечено ферментом, необходимым для детекции, детекция антитела осуществляется посредством добавления дополнительных реагентов, которые используются ферментом для образования детектируемого продукта реакции. Например, пероксидаза хрена, взаимодействующая с пероксидом водорода и диаминобензидином. Антитело может быть также помечено биотином, и в этом случае его детекцию можно проводить посредством непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина. Антитело может быть также- 26017403 помечено определенными заранее полипептидными эпитопами, распознаваемыми вторичным репортером (например, последовательности пары лейциновой застежки, сайты связывания вторичных антител,металлсвязывающие домены, эпитопные метки). Наборы, которые рассматриваются в настоящем изобретении, предназначены для детекции, диагностики или наблюдения нейродегенеративных заболеваний у позвоночных, включая, но не ограничиваясь ими, человека, мышей, крыс, овец, коз, свиней, рогатый скот, лошадей, рептилий, рыб, амфибий и эмбрионы птиц, рептилий и рыб. Наборы для диагностики, которые рассматриваются в настоящем изобретении, содержат некоторые или все важнейшие компоненты, необходимые для осуществления желаемого иммунологического анализа, в соответствии с настоящим изобретением. Набор для диагностики может представлять собой форму,упакованную для коммерческого использования, как комбинацию одного или несскольких контейнеров,содержащих необходимые реагенты. Обычные компоненты набора очевидны для специалиста в данной области, и описаны в многочисленных публикациях, включающих, например, следующий источник (Harlow and Lane; Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y. 1988), включенный в данный документ во всей полноте посредством ссылки. Обычные компоненты набора могут включать такие предметы, как, например, микропланшеты, буферы для поддержания рН анализируемой смеси (такие как, но не ограничивась ими, Tris, HEPES, фосфат, карбонат и т.п.), связанные вторичные антитела, например, связанный с пероксидазой антимышиный IgG (или любой анти-IgG для животного, из которого происходит первое антитело), стабилизаторы, биоциды, инертные белки,например, бычий сывороточный альбумин, или подобные, и другие стандартные реагенты. Наборы для диагностики, которые рассматриваются в настоящем изобретении, также могут включать наборы, подходящие для использования в домашних условиях, а также в клиниках, врачебных кабинетах или лабораториях. Примеры наборов для домашнего тестирования можно найти в примере в US 5602040, который включен в настоящий документ посредством ссылки. Термин "детекция", используемый в данной заявке, в контексте детекции наличия белка у пациента,включает определение количества белка или способности пациента экспрессировать некоторое количество белка, оценку прогноза в отношении вероятных последствий болезни и перспективы выздоровления, мониторинг уровня белка в течение периода времени как меры состояния больного, и наблюдение уровня белка для определения предпочтительного терапевтического режима для пациента, например,страдающего нейродегенеративным заболеванием. Примеры Пример 1. Sema6A, включенный в природу олигодендроцитов Олигодендроциты созревают, проходя через серию стадий развития от клеток-предшественников олигодендроцитов (которые экспрессируют NG2), дифференцирующихся в премиелинизирующие олигодендроциты (которые экспрессируют 01 и 04), и затем, наконец, в зрелые миелинизирующие олигодендроциты (которые экспрессируют 01 и 04, основной белок миелина (МВР) и антипротеолипидный белок (PLP. Такм образом, посредством слежения за присутствием и отсутствием маркеров NG2, 01, 04,МВР и PLP можно определить стадию развития конкретной клетки и оценить роль полипептидовSema6A в природе олигодендроцитов. Также известно, что транскрипционный фактор-2 олигодендроцитов (Olig-2) экспрессируется в линии олигодендроцитов, поэтому его можно использовать как маркер для детекции олигодендроцитов (см. Yokoo et al. Amer. J. of Path.164: 1717-1725 (2004) (Для общего обзора биологии олигодендроцитов см., например, Baumann and Pham-Dinh, Physiol. Rev. 81: 871-927 (2001);Bras et al., Int. J. Dev. Biol. 49: 209-220 (2005). Моноклональные антитела против 04 и МВР были получены из компании Chemicon. Моноклональное антитело против PLP (клон АА 3, 1:10) любезно предоставлено проф. С. Luberzki (Yamamura et al., J.Neurochem. 57(5): 1671-80 (1991. Моноклональное антитело против клеток-предшественников астроцитов (АРС) было получено из VWR international (Fontenay Sous Bois, France). Антитело против CNPase было получено из компании Sigma. Антитело против NG2 (АВ 5320) было получено из компании Chemicon. Антитело против Sema6A человека было получено из RD Systems (Minneapolis, MN). Антитела против Na2+ и параноидина были получены из компании Sigma. Анти-myc антитело (9 Е 10, 1:100) было получено из Santa Cruz Biotechnology (SC-40). мРНК Sema6A экспрессируется в олигодендроцитах Экспрессию мРНК Sema6A анализировали путем гибридизации in situ в свежем замороженном головном мозге (сагиттальные срезы) и спинном мозге (коронарные срезы) мышей Р 1 и Р 15. Анестезию швейцарских мышей (Janvier, Le Genest Saint Isle, France) осуществляли посредством ингаляции изофлюорана (Abbott), затем мышей декапитировали. Мозг и зрительные нервы немедленно замораживали в изопентане (-50 С) и хранили при -80 С до гибридизации. Срезы тканей затем фиксировали в течение 10 мин в 4% PFA, промывали в PBS, рН 7,4, подвергали действию протеиназы К (10 мкг/мл; Invitrogen,Carlsbad, CA) в течение 3-5 мин, затем фиксировали в течение 5 мин в 4% PFA, промывали в PBS, ацетилировали и промывали в PBS 1% Triton Х-100. Препараты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре в буфере для гибридизации (50% формамид, 5 х SSC, 1 х Denhardt's, 250 мкг/мл дрожжевой тРНК, и 500 мкг/мл спермы сельди, рН 7.4), и затем проводили гибридизацию срезов тканей при 72 С в течение ночи в присутствии рибопроб Sema6A (0,5 нг/мкл), меченных дигоксигенином. После гибриди- 27017403 зации срезы промывали в течение 2 ч в 2 х SSC при 72 С и блокировали в 0.1 М Tris, рН 7.5, 0.15 М NaCl(B1) содержащего 10% нормальной козьей сыворотки (NGS) в течение 1 ч при комнатной температуре. После блокирования препараты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре в присутствии антидигоксигениновых антител, связанных с щелочной фосфатазой (1:5000; Roche Diagnostics) в растворе В 1, содержащем 1% NGS. После дополнительных промывок активность щелочной фосфатазы определяли с помощью нитро-голубого хлорида тетразолия (NBT) (337.5 мкг/мл) и 5-бромо-4-хлоро-3 индолилфосфата (BCIP) (175 мкг/мл) (Roche Diagnostics). Срезы заключали в Mowiol (Calbiochem/Merck,Carlstadt, Germany). Как показано на фиг. 3, мРНК Sema6A обширно экспрессируется в белом веществе ЦНС мышей Р 15, в олигодендроцитах на стадии постнатального развития. Белок Sema6A экспрессируется в олигодендроцитах. Экспрессия белка Sema6A в олигодендроцитах мышей на срезах мозга Р 15 (из мозга, фиксированного в 4% PFA) была подтверждена двойным иммуноокрашиванием Sema6A и PLP, Sema6A и АРС (маркер олигодендроцитов), и Sema6A и CNPase (маркер олигодендроцитов и Шванновских клеток). Срезы блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) в PBS, содержащем 0,2% желатин (Prolabo,Fontenay-sous-Bois, France) и 0,25% Triton X-100 (PBS-G-T), и затем инкубировали в течение ночи при RT в присутствии первичных антител, например антимышиных Sema6A антител, анти-PLP антител, антиАРС антител, и анти-CNPase антител. Культуры затем смешивали с 4% PFA при комнатной температуре в течение 10 мин., промывали, а затем насыщали и пермеабилизировали в буфере PBS, содержащем 10%Sema6A и FITC-связанные антитела для PLP, АРС, и CNPase растворяли в PBS, содержащем 10% NGS и 0,1 % Triton Х-100 в течение 1 ч и после промывки инкубировали в течение 1 ч при RT в присутствии вторичных антител. После промывки культуры заключали в Mowiol (Calbiochem/Merck, Carlstadt, Germany). Двойное иммуноокрашивание показало, что все клетки, экспрессирующие Sema6A, также экспрессируют АРС, CNPase или PLP в белом веществе (данные не представлены). Тем не менее, некоторые клетки, экспрессирующие PLP, АРС и CNPase, не экспрессируют Sema6A. Таким образом, вероятно, белок Sema6A экспрессируется в клетках линии олигодендроцитов или в олигодендроцитах на специфической конкретной стадии созревания. Следовательно, совместное иммуноокрашивание Sema6A и маркеров олигодендроцитов, PLP, АРС или CNPase подтверждает, что олигодендроциты экспрессируютSema6A in vivo. На тех же самых срезах мозга Р 15 (мозжечок, кора) иммуноокрашивание с белками, специфичными для олигодендроглии, например, PLP, было совмещено с Sema6A при гибридизации in situ. Стандартная гибридизация in situ была осуществлена, как показано выше, за исключением уменьшения времени обработки протеиназой К (10 мкг/мл) до 2 мин. После гибридизации in situ с рибопробой Sema6A срезы промывали в PBS-T, блокировали в течение 1 ч при RT в PBS-G-T и инкубировали в течение ночи при RT в присутствии анти-PLP антител (клон АА 3) и затем инкубировали в присутствии биотинилированных кроличьих антикрысиных антител (1:200; Dako, Glostrup, Denmark) и HRP-связанного стрептавидина(1:400; Amersham). Срезы подвергали диаминобензидиновой реакции (коричневый осадок). Все клетки,экспрессирующие транскрипт Sema6A, окрашивались фиолетовым и были также окружены коричневым осадком, указывающим на экспрессию PLP (данные не представлены). Экспрессия белка Sema6A регулируется при развитии. Экспрессию Sema6A и АРС на коронарных срезах переднего мозга мышей Р 15, Р 30 и Р 45 также анализировали путем двойного иммуноокрашивания, с использованием антимышиных Sema6A и антиАРС антител, как описано выше. Сильная экспрессия АРС наблюдалась на всех различных возрастах, но максимум совместно меченных APC/Sema6A клеток наблюдался у мышей Р 15, где 65% олигодендроцитов (АРС+ клеток) экспрессировали Sema6A (данные не представлены). Доля АРС-положительных клеток, также экспрессирующих Sema6A в белом веществе, снижалась до 14% у Р 30 и падала до 8% у Р 45(данные не представлены). Это демонстрирует, что экспрессия Sema6A регулируется в ходе развития и достигает максимального значения на стадии Р 15, во время пика миелинизации. Пример 2. Экспрессия Sema6A на различных стадиях дифференцировки олигодендроцитов Экспрессия Sema6A была также продемонстрирована in vitro в очищенных культурах олигодендроцитов. Кору больших полушарий мышей от РО до Р 5 разрезали и переносили в культуральную среду,состоящую из DMEM с 10% сывороткой крови теленка. Диссоциацию ткани осуществляли путем просеивания ткани через нейлоновое сито с размером ячеек 70 мкм (BD Biosciences) в культуральной среде. Суспензию клеток распределяли на пластиковых чашках для клеточных культур, 100 мм диаметром, покрытых полиорнитином. Клетки-предшественники олигодендроцитов селективно смывали путем осторожного спринцевания культуральной средой клеточного слоя. Смытые клетки затем дважды пересевали на 12-часовой срок на непокрытые пластиковые чашки для культур, чтобы дать возможность закрепиться оставшимся астроцитам и клеткам микроглии. Незакрепившиеся и слабо закрепившиеся клетки (олигодендроциты) культивировали на 60 мм пластиковых чашках для культур. Культуры окрашивали с помощью антимышиных Sema6A антител и анти-NG2 (маркер клеток-предшественников олигодендроцитов),либо анти-O4 (маркер клетоклинии олигодендроцитов на стадии пре-олигодендроцита) и анти-МВР ан- 28017403 тител (маркер зрелых олигодендроцитов). CY3-связанные антитела использовали в качестве вторичных антител, чтобы визуализировать экспрессию Sema6A, а для NG2, O4 и МВР использовали FITCсвязанные антитела. После 24 ч in vitro различные типы клеток экспрессировали NG2: некоторые очень слабо дифференцированные морфологически клетки были мечены только FITC (NG2+) и, следовательно,были Sema6 А-негативными; другие, более дифференцированные (с большим количеством отростков),экспрессировали NG2 и, на низком уровне, Sema6A, в теле клетки, но не в отростках (данные не представлены). После 48 ч in vitro O4-позитивные клетки сильно экспрессировали Sema6A (данные не представлены). После 72 ч in vitro МВР-положительные клетки сильно экспрессировали Sema6A (данные не представлены). Это показывает, что Sema6A более активно экспрессируется в дифференцированных (O4 и МВР+) олигодендроцитах (что наблюдается также in vivo). Пример 3.Sema6 А-нокаутированные мыши демонстрируют уменьшение миелинизованных аксонов. Для создания Sema6 А-нокаутированных мышей кассета, кодирующая CD4-трансмембранный домен галактозидаза-неомицин-фототрансферазы (ТМдео) и плацентарную щелочную фосфатазу человека(PLAP), разделенные участками внутренней посадки рибосомы (IRES), была встроена в 17-ый интронSema6A, как описано в источнике (Leighton et al., Nature, 410: 174-179). Оставшаяся N-терминальная часть белка Sema6A до аминокислоты 623 (и поэтому лишенная трансмембранного и цитоплазматического доменов) была слита с -галактозидазой и заключена в эндоплазматический ретикулум. Для того,чтобы изучить нарушения миелинизации, исследовали перехваты Ранвье у мышей, дефектных поSema6A. В перехватах Ранвье экспрессируются некоторые хорошо изученные белки, имеющие характерную экспрессию и функцию в этом месте. Антитела, полученные против белков, вовлеченных в образование перехвата Ранвье, например параноидина, были использованы для обнаружения экспрессии белков. Перехваты Ранвье являются хорошо организованными структурами, где осуществляется тесное взаимодействие между аксоном, подвергающимся миелинизации, и олигодендроцитами. В соответствии с характерной экспрессией белков в перехватах Ранвье можно визуализовать различные участки: Na2+ потенциал-управляемые каналы для визуализации центрального участка и параноидин для визуализации двух доменов, окружающих центральный участок перехвата Ранвье, который называется кластером параноидин/Na2+ каналов. Экспрессию Na2+ каналов и параноидина визуализовали иммуногистохимически в зрительных нервах у мышей Р 16 с использованием антител против Na2+ каналов и параноидина (данные не представлены). Иммуногистохимические исследования показали, что у мышей, дефектных поSema6A, достоверно снижается число кластеров параноидин/Na2+ каналов (-40,54%; n=3) (данные не представлены). Этот результат свидетельствует о том, что у мышей Р 16, дефектных по Sema6A, аксоны менее миелинизированы, чем у дикого типа.Sema6 А-нокаутированные мыши демонстрируют сниженную экспрессию PLP в олигодендроцитах. Чтобы выяснить, нормально ли происходит дифференцировка и пролиферация олигодендроцитов у мышей, дефектных по Sema6A, три главных аксональных тракта, передняя комиссура (ПК), мозолистое тело (МТ) и зрительный нерв (3 Н), пометили посредством нерадиоактивной гибридизации in situ и определили количество клеток, экспрессирующих PLP. Анализировали три возраста в случае ПК и МТ, Р 16,Р 30 и Р 45 (3 животных для каждого срока) и Р 16 в случае 3 Н. Никаких достоверных изменений экспрессии PLP не наблюдалось в МТ на всех возрастах (данные не представлены). Однако количество клеток,экспрессирующих PLP, было снижено в случае возраста Р 16 в ПК у мышей Sema-/- (-43%) по сравнению с детенышами дикого типа (фиг. 4). Такое снижение у Р 16 объясняется значительным снижением числа клеток, экспрессирующих PLP (-60%), и также оно сопряжено с 30% снижением поверхности ПК. Снижение менее выражено в ПК у Р 30 (-20%) и становится нормальным у взрослых особей, как показано на фиг. 4. Подобным образом, экспрессия PLP в зрительном нерве Р 16 также демонстрирует подобное снижение (-26%) (данные не представлены). Тем не менее, никаких достоверных изменений не было обнаружено в клетках, экспрессирующих транскрипционный фактор-2 олигодендроцитов (Olig-2), относящихся к линии олигодендроцитов, в ПК (данные не представлены). Эти результаты свидетельствуют о возможной роли Sema6A либо в дифференцировке олигодендроцитов in vivo, либо в их способности к миграции и колонизации аксональных трактов. Олигодендроциты, дефектные по Sema6A, демонстрируют задержку дифференцировки. Олигодендроциты выделяли из Sema6A-/- новорожденных мышей и анализировали их способность к дифференцировке согласно способу, описанному в источнике (Bernard et al., J. Neurosc. Res. 65: 439-445 2001). В общем, целые полушария головного мозга мышей Р 0-Р 10 или крыс разрезали в растворе фосфатного буфера и переносили в культуральную среду, состоящую из DMEM (Invitrogen 31966047) с добавлением пенициллина (50 ед./мл), стрептомицина (50 мкг/мл) (Invitrogen 15140), сыворотки крови теленка (10%) (Gibco 16030074), 5 нг/мл PDGFBB (Sigma P3201) и 5 нг/мл bFGF (Sigma F0291). Диссоциацию ткани осуществляли путем просеивания ткани через нейлоновое сито с размером ячеек 70 мкм (BDBiosciences) в культуральной среде. Суспензию клеток распределяли на пластиковых чашках для клеточных культур, 100 мм диаметром, покрытых полиорнитином (Sigma Р 3655). Культуры инкубировали при 37 С во влажном инкубаторе, в атмосфере 95% воздуха-5% CO2. Культуральную среду меняли через 4
МПК / Метки
МПК: A61P 25/00, A61K 48/00, A61K 38/17
Метки: использование, качестве, промотора, олигодендроцитов, миелинизации, дифференцировки, семафорина
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-17403-ispolzovanie-semaforina-6a-v-kachestve-promotora-mielinizacii-i-differencirovki-oligodendrocitov.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Использование семафорина 6а в качестве промотора миелинизации и дифференцировки олигодендроцитов</a>
Производные спиропиперидина и их использование в качестве терапевтических агентов
Номер патента: 1574
Опубликовано: 25.06.2001
Авторы: Свейн Кристофер Джон, Кертис Нил Рой, Кулаговский Януш Йозеф, Холлингворт Грегори Джон, Вилльямс Брайан Джон, Сьюард Эйлин Мэри, Джексон Филип Стефен, Бейкер Рэймонд, Эллиотт Джейсон Мэттью, Харрисон Тимоти
МПК: C07D 491/10, A61P 1/08, A61K 31/4355...
Метки: производные, качестве, спиропиперидина, терапевтических, использование, агентов
Формула / Реферат:
1. Соединение формулы (I) где R1 означает водород, гидрокси, C1-6-алкил, С2-6-алкенил, С3-7-циклоалкил, С3-7-циклоалкил-С1-4-алкил, C1-6-алкокси, фтор-С1-6-алкокси, C1-6-алкокси-С1-4-алкил, С1-б-алкокси-С1-4-алкокси, фтор-С1-6-алкокси-С1-4-алкил, С2-6-алкенилокси, С3-7-циклоалкокси, С3-7-циклоалкил-С1-4-алкокси, фенокси, бензилокси, циано, галоген, NRaRb, SRa, SORa, SO2Ra, OSO2Ra, NRaCOR14, CORa, CO2Ra или CONRaRb, где Ra и Rb независимо друг...
Производные хинолина и их использование в качестве противоопухолевых средств
Номер патента: 7205
Опубликовано: 25.08.2006
Авторы: Хорвитц Джером П., Корбетт Томас Х., Хейзелдайн Стюарт Т., Полин Лиза
МПК: C07D 215/22, A61P 35/00, A61K 31/47...
Метки: использование, качестве, противоопухолевых, хинолина, средств, производные
Формула / Реферат:
1. Соединение формулы I где Y представляет собой F, Cl, Br, метил или метокси; или его фармацевтически приемлемая соль. 2. Соединение по п.1, где Y представляет собой F. 3. Соединение по п.1, где Y представляет собой Cl. 4. Соединение по п.1, где Y представляет собой Br. 5. Соединение по п.1, где Y представляет собой -OMe. 6. Соединение по п.1, где Y представляет собой метил. 7. Соединение по любому из пп.1-6, в котором углерод, несущий...
Атропизомеры 3-арил-4(3н)-хиназолинонов и их использование в качестве антагонистов амра-рецепторов
Номер патента: 1963
Опубликовано: 22.10.2001
Авторы: Велч Виллард Маккован Мл., Девриз Кейт М.
МПК: A61K 31/517, C07D 239/91, A61P 21/02...
Метки: антагонистов, использование, амра-рецепторов, 3-арил-4(3н)-хиназолинонов, качестве, атропизомеры
Формула / Реферат:
1. Атропизомер формулы где R2 представляет фенильную группу формулы Ph2 или пяти- или шестичленный гетероцикл; где указанный 6-членный гетероцикл имеет формулу где N представляет азот; где атомы указанных положений кольца K, L и М могут быть независимо выбраны из углерода и азота, при условии, что i) только один из K, L и М может быть азотом и ii) когда K, L или М представляет азот, то соответствующий ему заместитель R15, R16 или R17...
4-замещенные аналоги пиперидина и их использование в качестве подтип-селективных антагонистов рецепторов nmda.
Номер патента: 1323
Опубликовано: 26.02.2001
Авторы: Вебер Экард, Йеун По-Вай, Кина Джон Ф.В., Гузиковский Энтони П., Лан Нэнси К., Зоу Занг-Лин, Бидж Кристофер Ф., Вудвард Ричард, Кай Суи Ксионг
МПК: C07D 211/14, A61K 31/445, A61P 13/00...
Метки: использование, пиперидина, качестве, антагонистов, подтип-селективных, рецепторов, nmda, аналоги, 4-замещенные
Формула / Реферат:
1. Соединение, представленное формулой (I) или его фармацевтически приемлемая соль, где Аr1 и Ar2 независимо обозначают фенильную, нафтильную, пиперидинильную, хинолинильную, хиноксалинильную, бензимидазолильную, бензоксазолильную, индолильную, тиофенильную группу, каждая из которых может быть независимо замещена одной или двумя группами, выбранными из С1-С6 алкила, гидрокси, галогена, нитро, циано, карбоксальдегида, С1-С6...
Производные сульфонамида, способ их получения и их использование в качестве лекарственных средств.
Номер патента: 2351
Опубликовано: 25.04.2002
Авторы: Кинг Фрэнсис Дэвид, Бромидж Стивен Марк, Ваймэн Пол Эдриан
МПК: C07D 333/34
Метки: производные, использование, способ, сульфонамида, качестве, лекарственных, средств, получения
Формула / Реферат:
1. Соединение формулы (I) или его соль где Р означает фенил, нафтил, тиофенил, бензотиазолил, бензотиадиазолил, бензотиофенил, хинолинил, изоксазолил, бензофуранил или индолил; А является простой связью, C1-6 алкиленом или C1-6 алкениленом; R1 означает галоген, C1-6 алкил, необязательно замещенный одним или более атомами галогена, С3-6 циклоалкил, COC1-6 алкил, C1-6 алкокси, ОСF3, гидрокси, гидрокси C1-6 алкил, гидрокси C1-6 алкокси, C1-6...
Следующий патент: Способ цементирования скважины
Случайный патент: Производные 3-аминопирролидина в качестве модуляторов рецепторов хемокинов