Новые аспарагиназы и их применение

(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL) Изобретение касается аспарагиназы, у которой ширина рН-профиля активности составляет по меньшей мере 3,5 единицы рН. Изобретение также касается недавно идентифицированных полипептидов аспарагиназы согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 и их вариантов, а также последовательностей полинуклеотидов, кодирующих эти новые варианты аспарагиназы. Кроме того, изобретение касается применения этих новых вариантов аспарагиназы в промышленных процессах. Лаан Ван Дер Ян Метске, Стор Марк Кристиаан, Ланге Де Илсе, Морман Лисетте (NL) Агуреев А.П. (RU) 017305 Область техники, к которой относится изобретение Изобретение касается недавно идентифицированных вариантов полипептида аспарагиназы и последовательностей полинуклеотидов, содержащих гены, кодирующие эти новые аспарагиназы. В изобретении приведена аминокислотная последовательность полноразмерного функционального белка и функциональные эквиваленты гена или аминокислотной последовательности. Изобретение также касается способов применения этих вариантов белка в промышленных процессах. Также охвачены изобретением клетки, трансформированные полинуклеотидом по изобретению, пригодным для получения этих белков и клеток, причем белок согласно изобретению генетически модифицирован для повышения или снижения активности и/или уровня экспрессии. Изобретение также касается способов применения этих белков в промышленных процессах. Уровень техники Недавно сообщали о появлении акриламида во многих пищевых продуктах при нагревании (Tarekeet al., Chem. Res. Toxicol. 13, 517-522 (2000. Поскольку акриламид считается возможным канцерогеном для животных и человека, эти данные вызвали озабоченность во всем мире. Дальнейшие исследования показали, что значительные количества акриламида обнаруживаются в целом ряде распространенных продуктов при выпекании, жарке и приготовлении в печи, и было показано, что наличие акриламида в продуктах является результатом процесса нагревания. В работе Mottram et al., Nature 419: 448 (2002) было предположено, что акриламид образуется из аминокислот и восстанавливающих сахаров в результате реакции Майяра (Maillard). Согласно этой гипотезе, акриламид может образоваться при реакции Майяра. За цвет, запах и вкус при выпекании и поджаривании главным образом ответственна реакция Майяра. На пути, ведущему к акриламиду, с реакцией Майяра связано и расщепление аминокислот по Штреккеру (Strecker). Образование акриламида становилось заметным при повышении температуры выше 120 С, а максимальная скорость его образования наблюдалась примерно при 170 С. Максимальный уровень акриламида наблюдался в присутствии аспарагина и глюкозы, тогда как глутамин и аспарагиновая кислота давали только следовые количества. Действующий в ЕС предел для переноса акриламида в продукты из контактирующих с ними пластиков составляет 10 ppb (10 мкг на 1 кг). Хотя пока еще не установлен предел для акриламида, образующегося при приготовлении пищи, однако тот факт, что многие продукты превышают эту величину,особенно блюда из круп, хлебопродукты и продукты из картофеля или кукурузы, вызывает озабоченность. Известно, что некоторые растительные материалы содержат значительное количество аспарагина. В картофеле аспарагин является преобладающей свободной аминокислотой (940 мг/кг, что соответствует 40% от общего содержания аминокислот), а в пшеничной муке содержание аспарагина составляет около 167 мг/кг, что соответствует 14% от общего содержания свободных аминокислот (Belitz and Grosch inFood Chemistry -Springer New York, 1999). To, что акриламид в основном образуется из аспарагина (вместе с восстанавливающими сахарами), может объяснить высокий уровень акриламида в жареных, запеченных или поджаренных растительных продуктах. Следовательно, в интересах здоровья населения существует настоятельная потребность в том, чтобы пищевые продукты содержали существенно меньше акриламида, а предпочтительно его совсем не содержали. Предлагались различные способы снижения содержания акриламида как путем изменения параметров обработки, например температуры или продолжительности нагревания, так и путем химического или энзиматического предотвращения образования акриламида, либо путем удаления образовавшегося акриламида. В некоторых патентных заявках изложено применение аспарагиназы для снижения содержания аспарагина и тем самым количества образующегося акриламида. Подходящие для этой цели аспарагиназы были получены из некоторых грибков, например из Aspergillus niger в WO 2004/030468 и Aspergillusoryzae в WO 04/032648. Хотя все L-аспарагиназы катализируют одно и то же химическое превращение, но это не значит,что все они подходят для одинакового применения. При различных применениях будут разные требования к условиям, в которых ферментам придется работать. Физические и химические параметры, которые могут повлиять на скорость энзиматического превращения, - это температура (которая оказывает положительный эффект на скорость химической реакции, но может оказывать отрицательный эффект на стабильность фермента), влагосодержание, рН, концентрация солей, структурная целостность пищевого матрикса, присутствие активаторов или ингибиторов фермента, концентрация субстрата и продуктов реакции и др. Таким образом, все еще существует потребность в улучшении аспарагиназ для некоторых применений с улучшенными свойствами. Цель изобретения Целью изобретения является получение новых вариантов полипептидов аспарагиназы и полинуклеотидов, кодирующих эти варианты. Другой целью является получение рекомбинантных штаммов, продуцирующих такие варианты. Составной частью изобретения являются и слитые полипептиды, а также способы получения и применения полинуклеотидов и полипептидов по изобретению.-1 017305 Сущность изобретения Изобретением предусмотрены новые варианты полипептидов, обладающих аспарагиназной активностью. В частности, изобретением предусматривается вариант аспарагиназы, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, а также другие варианты, по меньшей мере на 85% гомологичные хотя бы одной из них. Как правило, такие дополнительные варианты по изобретению будут функциональными эквивалентами полипептида по SEQ ID NO: 2 или SEQ IDNO: 4. Термин "функциональный эквивалент" в настоящем изобретении предполагает, что полипептиды такого функционального эквивалента, по крайней мере, должны обладать аспарагиназной активностью. Настоящим изобретением также предусмотрена аспарагиназа, у которой ширина рН-профиля активности составляет по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН. В контексте настоящего изобретения ширина рН-профиля активности означает тот диапазон рН (выраженный в единицах рН), в котором фермент проявляет от 50 до 100% максимальной активности. Ширина рН-профиля активности фермента вычисляется, как указано в примерах. Аспарагиназа, у которой ширина рН-профиля активности составляет по меньшей мере 3,5 единицы рН, может быть выделена из природных источников, либо она может быть искусственным ферментом аспарагиназы. В предпочтительном воплощении аспарагиназа, у которой ширина рН-профиля активности составляет по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН, представляет собой вариант аспарагиназы, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, а также другие варианты по меньшей мере на 85% гомологичные хотя бы одной из них. В одном воплощении изобретения предусмотрен выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с аминокислотной последовательностью,приведенной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, либо вариант, к примеру функциональный эквивалент одной из них. В другом воплощении изобретения предусмотрен выделенный полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один функциональный домен полипептида согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, либо вариант, к примеру функциональный эквивалент одной из них. Кроме того, изобретением предусмотрены новые полинуклеотиды, кодирующие новые варианты полипептидов по изобретению. Кроме того, изобретением предусмотрена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей аспарагиназу с шириной рН-профиля активности, составляющей по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН. Изобретение также касается векторов, содержащих последовательность полинуклеотида по изобретению, и праймеров, зондов и фрагментов, которые могут использоваться для амплификации или детектирования такого полинуклеотида по изобретению. В следующем предпочтительном воплощении предусмотрен вектор, у которого последовательность полинуклеотида по изобретению функционально соединяется по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью, пригодной для экспрессии кодируемой аминокислотной последовательности в подходящих клетках хозяина, как то, нитчатого грибка, к примеру Aspergillus. Изобретением также предусмотрен способ получения полинуклеотидов и векторов по изобретению. Изобретение также касается полученных рекомбинантным способом клеток хозяина, содержащих варианты (гетерологических) полинуклеотидов по изобретению. В следующем воплощении изобретения предусмотрены рекомбинантные клетки хозяина, у которых значительно повышена экспрессия варианта аспарагиназы по изобретению либо повышена активность продуцируемой аспарагиназы. В следующем воплощении изобретения предусмотрены полученные рекомбинантным способом клетки хозяина, содержащие полинуклеотид по изобретению, вследствие чего эти клетки способны продуцировать функциональный вариант аспарагиназы по изобретению, предпочтительно они способны суперэкспрессировать функциональный вариант аспарагиназы по изобретению, например клетки штаммаAspergillus niger, содержащие полинуклеотид по изобретению. В следующем аспекте изобретения предусмотрен очищенный вариант полипептида. К полипептидам по изобретению относятся полипептиды, кодируемые полинуклеотидами по изобретению. Особенно предпочтительным является вариант полипептида согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 либо вариант, к примеру функциональный эквивалент одной из них. В рамки изобретения также входят слитые белки, содержащие полипептид по изобретению. Изобретением также предусмотрены способы получения вариантов полипептидов по изобретению. Изобретение также касается применения вариантов аспарагиназы по изобретению в промышленных процессах, как описано в изобретении. Краткое описание чертежа На чертеже представлено сопоставление SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 с последовательностью аспарагиназы дикого типа (wt) A. niger, приведенной в SEQ ID NO: 3 из WO 2004/030468.-2 017305 Осуществление изобретения По всему настоящему описанию и прилагаемой формуле изобретения слова "содержать" и "включать" и их варианты, как то, "содержит", "содержащий", "включает" и "включающий" следует понимать включительно. А именно, эти слова предполагают возможность включения и других элементов или чисел, не указанных специально, если контекст это позволяет. Настоящее изобретение касается вариантов аспарагиназы, имеющих последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, а также других вариантов. Ниже приводятся особенности последовательностей обоих полипептидов. Последовательность SEQ ID NO: 2 включает следующие замены по сравнению с последовательностью аспарагиназы дикого типа, полученной из Aspergillus niger, которая приведена в WO 2004/030468: Т 25 А, Е 28 Т, F30Y, A35S, F53L, D63S, S64A, S65D, S66N, S74A, V77I, V79I, L80Q, S81T, S88E, Е 106 Р,I108V, D111S, I114L, S117A, K119 Т, R122E, E126D, A131S, I161V, S168A, E181Q, Т 189 Р, S190A, M197L,A205V, Y208F, V210A, T211S, M224V, Y228N, Е 231 А, M232I, I233V, T236K, F238Y, F240Y, V250T,А 251 Т, F252V, I254V, T255R, E259S, F267Y, E270Q, H273Q, N279S, S282D, S283N, Q286K, A293S,G297S, T299S, S301G, N303S, E304D, E307D, V309I, I310A, N311S, R312K, L313H, E314S, V317I, Q319L,M321T, V324G, L330T, Y345F, S351A, S360A, Q361E, N364G, I365F, T366K, A369R, D370E, L374K,G375V и D377V. Последовательность аспарагиназы дикого типа, полученной из A. niger, которая приведена в WO 2004/030468, приводится в ней как SEQ ID NO: 3 (аминокислотная последовательность). Аспарагиназа,приведенная в SEQ ID NO: 2 настоящей заявки, условно названа ASN001. Вариант последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, к примеру функциональный эквивалент, может содержать одну или несколько аминокислот из числа Ala в положении 25, Thr в положении 28, Tyr в положении 30, Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126, Ser в положении 131, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205,Phe в положении 208, Ala в положении 210, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Tyr в положении 240, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 252, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270,Gln в положении 273, Ser в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Asp в положении 307, Ile в положении 309, Ala в положении 310, Ser в положении 311, Lys в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317,Leu в положении 319, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Thr в положении 330, Phe в положении 345, Ala в положении 351, Ala в положении 360, Glu в положении 361, Gly в положении 364, Phe в положении 365, Lys в положении 366, Arg в положении 369, Glu в положении 370, Lys в положении 374, Val в положении 375 и Val в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к SEQID NO: 2. Иными словами, при совмещении варианта последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2, с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2, этот вариант может содержать одну или несколько замен из числа:Val в положении (у варианта), соответствующем положению 377 в SEQ ID NO: 2. Вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать 2, 3, 4, 5, к примеру, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, как то, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, либо все из следующих аминокислот: Ala в положении 25, Thr в положении 28, Tyr в положении 30, Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122,Asp в положении 126, Ser в положении 131, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ala в положении 210, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238,Tyr в положении 240, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 252, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Gln в положении 273, Ser в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Gly в положении 301, Ser в положении 303,Asp в положении 304, Asp в положении 307, Ile в положении 309, Ala в положении 310, Ser в положении 311, Lys в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Leu в положении 319, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Thr в положении 330, Phe в положении 345, Ala в положении 351, Ala в положении 360, Glu в положении 361, Gly в положении 364, Phe в положении 365,Lys в положении 366, Arg в положении 369, Glu в положении 370, Lys в положении 374, Val в положении 375 и Val в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 2. Соответственно вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать любую комбинацию из двух или нескольких аминокислот из числа Ala в положении 25, Thr в положении 28, Tyr в положении 30, Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122,Asp в положении 126, Ser в положении 131, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ala в положении 210, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238,Tyr в положении 240, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 252, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Gln в положении 273, Ser в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Gly в положении 301, Ser в положении 303,Asp в положении 304, Asp в положении 307, Ile в положении 309, Ala в положении 310, Ser в положении 311, Lys в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Leu в положении 319, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Thr в положении 330, Phe в положении 345, Ala в положении 351, Ala в положении 360, Glu в положении 361, Gly в положении 364, Phe в положении 365,Lys в положении 366, Arg в положении 369, Glu в положении 370, Lys в положении 374, Val в положении 375 и Val в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 2. Предпочтительно вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать все аминокислоты из числа Ala в положении 25, Thr в положении 28, Tyr в положении 30, Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114,Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126, Ser в положении 131, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ala в положении 210, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232,Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Tyr в положении 240, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 252, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Gln в положении 273, Ser в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297,Ser в положении 299, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Asp в положении 307, Ile в положении 309, Ala в положении 310, Ser в положении 311, Lys в положении 312, His в поло-5 017305 жении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Leu в положении 319, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Thr в положении 330, Phe в положении 345, Ala в положении 351, Ala в положении 360,Glu в положении 361, Gly в положении 364, Phe в положении 365, Lys в положении 366, Arg в положении 369, Glu в положении 370, Lys в положении 374, Val в положении 375 и Val в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 2. Те положения у варианта полипептида аспарагиназы по изобретению, которые соответствуют положениям 25, 28, 30, 35, 53, 63, 64, 65, 66, 74, 77, 79, 80, 81, 88, 106, 108, 111, 114, 117, 119, 122, 126, 131,161, 168, 181, 189, 190, 197, 205, 208, 210, 211, 224, 228, 231, 232, 233, 236, 238, 240, 250, 251, 252, 254,255, 259, 267, 270, 273, 279, 282, 283, 286, 293, 297, 299, 301, 303, 304, 307, 309, 310, 311, 312, 313, 314,317, 319, 321, 324, 330, 345, 351, 360, 361, 364, 365, 366, 369, 370, 374, 375 и 377, могут быть идентифицированы путем совмещения последовательности варианта полипептида с последовательностью SEQ IDNO: 2, например, методом GAP-совмещения с наиболее гомологичной последовательностью, обнаруженной программой GAP (подробно об этой программе см. ниже). При этом можно идентифицировать те положения у варианта, которые соответствуют положениям 25, 28, 30, 35, 53, 63, 64, 65, 66, 74, 77, 79, 80,81, 88, 106, 108, 111, 114, 117, 119, 122, 126, 131, 161, 168, 181, 189, 190, 197, 205, 208, 210, 211, 224, 228,231, 232, 233, 236, 238, 240, 250, 251, 252, 254, 255, 259, 267, 270, 273, 279, 282, 283, 286, 293, 297, 299,301, 303, 304, 307, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 317, 319, 321, 324, 330, 345, 351, 360, 361, 364, 365, 366,369, 370, 374, 375 и 377 в SEQ ID NO: 2 и именуются положениями, определенными по отношению кSEQ ID NO: 2. Последовательность SEQ ID NO: 4 содержит следующие замены по сравнению с последовательностью аспарагиназы дикого типа, полученной из Aspergillus niger, которая приведена в WO 2004/030468:A35S, F53L, D63S, S64A, S65D, S66N, S74A, V77I, V79I, L80Q, S81T, S88E, Е 106 Р, I108V, D111S, I114L,S117A, K119T, R122E, E126D, I161V, S168A, E181Q, Т 189 Р, S190A, M197L, A205V, Y208F, T211S,M224V, Y228N, Е 231 А, M232I, I233V, T236K, F238Y, V250T, А 251 Т, I254V, T255R, E259S, F267Y,E270Q, N279D, S282D, S283N, Q286K, A293S, G297S, T299S, T300S, S301G, N303S, E304D, V309I,N311S, R312T, L313H, E314S, V317I, M321T, V324G, L330P, V333E, H340Q, Y345F, S360A, N364G,T366E, A369R, D370E, L374K, G375V, T376G и D377V. Кроме того, последовательность SEQ ID NO: 4 содержит делецию 4 аминокислот в сравнении с последовательностью аспарагиназы дикого типа, полученной из Aspergillus niger, которая приведена в WO 2004/030468, т.е. приведенная в настоящей заявке SEQ ID NO: 4 не содержит аминокислот, соответствующих D336, Т 337, А 338 и Т 339 в последовательности аспарагиназы дикого типа, полученной из Aspergillus niger, которая приведена в WO 2004/030468 и именуется в ней как SEQ ID NO: 3 (аминокислотная последовательность). Аспарагиназа, приведенная в SEQ ID NO: 4 настоящей заявки, условно названаASN002. Вариант последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 4, к примеру функциональный эквивалент, может содержать одну или несколько аминокислот из числа Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88,Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228,Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Asp в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299,Ser в положении 300, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Ile в положении 309, Ser в положении 311, Thr в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Pro в положении 330, Glu в положении 333, Gln в положении 336, Phe в положении 341, Ala в положении 356, Gly в положении 360, Glu в положении 362,Arg в положении 365, Glu в положении 366, Lys в положении 370, Val в положении 371, Gly в положении 372 и Val в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4. Иными словами, при совмещении варианта последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 4, с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 4, этот вариант может содержать одну или несколько аминокислот из числаVal в положении (у варианта), соответствующем положению 373 в SEQ ID NO: 4. Вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать 2, 3, 4, 5, к примеру, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, как то, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70 либо все из следующих аминокислот: Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208,Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Asp в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286,Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Ser в положении 300, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Ile в положении 309, Ser в положении 311, Thr в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Pro в положении 330, Glu в положении 333, Gln в положении 336, Phe в положении 341,Ala в положении 356, Gly в положении 360, Glu в положении 362, Arg в положении 365, Glu в положении 366, Lys в положении 370, Val в положении 371, Gly в положении 372 и Val в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4. Соответственно вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать любую комбинацию из двух или нескольких аминокислот из числа Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117,Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238,Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Asp в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Ser в положении 300, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Ile в положении 309,Ser в положении 311, Thr в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Pro в положении 330, Glu в положении 333, Gln в положении 336, Phe в положении 341, Ala в положении 356, Gly в положении 360, Glu в положении 362, Arg в положении 365, Glu в положении 366, Lys в положении 370, Val в положении 371, Gly в положении 372 иVal в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4. Предпочтительно вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать все аминокислоты из числа Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122,Asp в положении 126, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Thr в положении 250, Thr в положении 251,Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Asp в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Ser в положении 300, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Ile в положении 309, Ser в положении 311, Thr в положении 312,His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Pro в положении 330, Glu в положении 333, Gln в положении 336, Phe в положении 341, Ala в положении 356, Gly в положении 360, Glu в положении 362, Arg в положении 365, Glu в положении 366, Lys в положении 370, Val в положении 371, Gly в положении 372 и Val в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4.-8 017305 Те положения у варианта полипептида аспарагиназы по изобретению, которые соответствуют положениям 35, 53, 63, 64, 65, 66, 74, 77, 79, 80, 81, 88, 106, 108, 111, 114, 117, 119, 122, 126, 161, 168, 181,189, 190, 197, 205, 208, 211, 224, 228, 231, 232, 233, 236, 238, 250, 251, 254, 255, 259, 267, 270, 279, 282,283, 286, 293, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 309, 311, 312, 313, 314, 317, 321, 324, 330, 333, 336, 341, 356,360, 362, 365, 366, 370, 371, 372 и 373, могут быть идентифицированы путем совмещения последовательности варианта полипептида с последовательностью SEQ ID NO: 4, например, методом GAP-совмещения с наиболее гомологичной последовательностью, обнаруженной программой GAP (подробно об этой программе см. ниже). При этом можно идентифицировать те положения у варианта, которые соответствуют положениям 35, 53, 63, 64, 65, 66, 74, 77, 79, 80, 81, 88, 106, 108, 111, 114, 117, 119, 122, 126, 161, 168, 181,189, 190, 197, 205, 208, 211, 224, 228, 231, 232, 233, 236, 238, 250, 251, 254, 255, 259, 267, 270, 279, 282,283, 286, 293, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 309, 311, 312, 313, 314, 317, 321, 324, 330, 333, 336, 341, 356,360, 362, 365, 366, 370, 371, 372 и 373 в SEQ ID NO: 4 и именуются положениями, определенными по отношению к SEQ ID NO: 4. Кроме того, вариант полипептида аспарагиназы по изобретению, как правило, не должен содержать одну или несколько, к примеру 2, 3, или все аминокислоты, соответствующие Asp 336, Thr 337, Ala 338 иThr 339 в последовательности аспарагиназы дикого типа, полученной из Aspergillus niger, которая приведена в WO 2004/030468. Это значит, что при совмещении варианта полипептида аспарагиназы по изобретению с последовательностью аспарагиназы дикого типа, полученной из Aspergillus niger, которая приведена в WO 2004/030468, она, как правило, не должна содержать одну или несколько аминокислот, соответствующих тем, что находятся в положениях 336, 337, 338 и 339 последовательности дикого типа A.niger. В другом воплощении изобретения также предусмотрена аспарагиназа, у которой ширина рНпрофиля активности составляет по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН. В предпочтительном воплощении аспарагиназа с шириной рН-профиля активности, составляющей по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН, представляет собой вариант аспарагиназы, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, а также другие варианты, по меньшей мере на 85% гомологичные хотя бы одной из них. Полинуклеотиды. Как изложено выше, настоящим изобретением предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие варианты аспарагиназы, имеющие аминокислотные последовательности согласно SEQ ID NO: 2 (условно названной ASN001) или SEQ ID NO: 4 (условно названной ASN002), а также другие варианты, как то,функциональные эквиваленты. Таким образом, изобретением предусмотрены полинуклеотиды согласноSEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 и другие варианты полинуклеотидов. Для ясности отметим, что SEQ ID NO: 1 означает последовательность полинуклеотида, кодирующего полипептид согласно SEQ ID NO: 2; a SEQ ID NO: 3 означает последовательность полинуклеотида,кодирующего полипептид согласно SEQ ID NO: 4. Изобретением предусмотрены последовательности полинуклеотидов, содержащих ген, кодирующий аспарагиназу по изобретению, а также его кодирующую последовательность. Соответственно изобретение касается последовательности нуклеиновой кислоты, включающей:a) последовательность ДНК, кодирующей аспарагиназу согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4;b) последовательность ДНК, кодирующей аспарагиназу, которая по меньшей мере на 85% гомологична полипептиду согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4;c) последовательность ДНК, которая по меньшей мере на 80% гомологична последовательности ДНК по п.а) или b);d) последовательность ДНК, которая гибридизируется с высокой строгостью с комплементарной нитью последовательности ДНК по п.а) или b);e) часть последовательности ДНК по пп.а)-с) или d), содержащую по меньшей мере 100 нуклеотидов; илиf) комплементарную нить последовательности ДНК по пп.а)-d) или е). Изобретение также касается выделенных полинуклеотидов, кодирующих по меньшей мере один функциональный домен полипептида согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. Далее это описано более подробно в отношении полипептидов по изобретению. Как правило, в отношении SEQ ID NO: 2 такой домен должен содержать аминокислоту или аминокислоты, соответствующие одной или нескольким из числа Ala в положении 25, Thr в положении 28, Tyr в положении 30, Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122,Asp в положении 126, Ser в положении 131, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ala в положении 210, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в-9 017305 положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238,Tyr в положении 240, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 252, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Gln в положении 273, Ser в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Gly в положении 301, Ser в положении 303,Asp в положении 304, Asp в положении 307, Ile в положении 309, Ala в положении 310, Ser в положении 311, Lys в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Leu в положении 319, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Thr в положении 330, Phe в положении 345, Ala в положении 351, Ala в положении 360, Glu в положении 361, Gly в положении 364, Phe в положении 365,Lys в положении 366, Arg в положении 369, Glu в положении 370, Lys в положении 374, Val в положении 375 и Val в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 2. В одном воплощении изобретения последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению кодирует полипептид, причем этот полипептид представляет собой вариант, который имеет аминокислотную последовательность, содержащую одно или несколько усечений и/или по меньшей мере одну замену,делецию и/или вставку аминокислоты по сравнению с последовательностью из аминокислот 1-378 SEQID NO: 2. Такой полипептид, как правило, содержит одну или несколько аминокислот из числа Ala в положении 25, Thr в положении 28, Tyr в положении 30, Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117,Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126, Ser в положении 131, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ala в положении 210, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233,Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Tyr в положении 240, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 252, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Gln в положении 273, Ser в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299,Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Asp в положении 307, Ile в положении 309, Ala в положении 310, Ser в положении 311, Lys в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Leu в положении 319, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Thr в положении 330, Phe в положении 345, Ala в положении 351, Ala в положении 360, Glu в положении 361,Gly в положении 364, Phe в положении 365, Lys в положении 366, Arg в положении 369, Glu в положении 370, Lys в положении 374, Val в положении 375 и Val в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 2. Как правило, в отношении SEQ ID NO: 4 такой домен должен содержать аминокислоту или аминокислоты, соответствующие одной или нескольким из числа Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117,Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238,Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Asp в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Ser в положении 300, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Ile в положении 309,Ser в положении 311, Thr в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Pro в положении 330, Glu в положении 333, Gln в положении 336, Phe в положении 341, Ala в положении 356, Gly в положении 360, Glu в положении 362, Arg в положении 365, Glu в положении 366, Lys в положении 370, Val в положении 371, Gly в положении 372 иVal в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4. В одном воплощении изобретения последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению кодирует полипептид, причем этот полипептид представляет собой вариант, который имеет аминокислотную последовательность, содержащую одно или несколько усечений и/или по меньшей мере одну замену,делецию и/или вставку аминокислоты по сравнению с последовательностью из аминокислот 1-374 SEQID NO: 4. Такой полипептид, как правило, содержит одну или несколько аминокислот из числа Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении- 10017305 126, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233,Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Asp в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Ser в положении 300, Gly в положении 301, Ser в положении 303,Asp в положении 304, Ile в положении 309, Ser в положении 311, Thr в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Pro в положении 330, Glu в положении 333, Gln в положении 336, Phe в положении 341, Ala в положении 356, Gly в положении 360, Glu в положении 362, Arg в положении 365, Glu в положении 366, Lys в положении 370,Val в положении 371, Gly в положении 372 и Val в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4. В другом воплощении изобретения предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей аспарагиназу с шириной рН-профиля активности, составляющей по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН. В предпочтительном воплощении данная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей аспарагиназу с шириной рН-профиля активности, составляющей по меньшей мере 3,5 единиц рН, представляет собой нуклеиновую кислоту, которая включает: а) последовательность ДНК, кодирующей аспарагиназу согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4;b) последовательность ДНК, кодирующей аспарагиназу, которая по меньшей мере на 85% гомологична полипептиду согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4;c) последовательность ДНК, которая по меньшей мере на 80% гомологична последовательности ДНК по п.а) или b);d) последовательность ДНК, которая гибридизируется с высокой строгостью с комплементарной нитью последовательности ДНК по п.а) или b);e) часть последовательности ДНК по пп.а)-с) или d), содержащую по меньшей мере 100 нуклеотидов; илиf) комплементарную нить последовательности ДНК по пп.а)-d) или е). В настоящем изобретении термины "ген" и "рекомбинантный ген" относятся к молекулам нуклеиновых кислот, включающим открытую рамку считывания, кодирующую вариант аспарагиназы, как описано в настоящей заявке, например вариант аспарагиназы дикого типа из Aspergillus niger. Ген может включать кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и регуляторные последовательности. Это значит, что "ген" в настоящем изобретении может означать выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем изобретении. Соответственно термин "ген" в контексте настоящей заявки относится не только к встречающимся в природе последовательностям. Молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения может быть создана стандартными методами молекулярной биологии, хорошо известными специалистам, в сочетании с информацией о последовательности, приведенной в настоящем изобретении. Например, нужная молекула нуклеиновой кислоты может быть синтезирована de novo стандартными методами синтеза. Такой процесс синтеза обычно является автоматизированным. Такие методы хорошо известны специалистам в этой области. С другой стороны, молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может быть создана при помощи направленного мутагенеза существующей молекулы нуклеиновой кислоты, к примеру молекулы нуклеиновой кислоты дикого типа. Направленный мутагенез может осуществляться с применением ряда методов, хорошо известных специалистам в этой области. В одном из таких методов, который здесь приводится просто для примера, на плазмидной матрице проводится реакция ПЦР с использованием олигонуклеотидных "праймеров", содержащих нужную мутацию. Поскольку праймеры представляют собой концевые участки синтезируемых заново нитей, если во время первого цикла будет несоответствие при связывании с матричной нитью ДНК, то после этого первого цикла образующаяся на основе праймера нить (содержащая мутацию) сравняется по концентрации с исходной матрицей. После следующих циклов она будет возрастать экспоненциально и через 25 циклов превзойдет исходную, не несущую мутации нить в соотношении порядка 8 млн к 1, в результате чего образуется почти однородный раствор несущих мутацию амплифицированных фрагментов. Затем матричную ДНК можно удалить посредством энзиматического расщепления, например, с помощью такого рестрикционного фермента, как Dpn1, который расщепляет только метилированную ДНК. Матрица,которая происходит из полученного методом щелочного лизиза препарата плазмид и поэтому метилирована, на этой стадии разрушается, а несущая мутацию плазмида сохраняется, так как она была создана invitro и поэтому не метилирована. В таком методе можно вводить более чем одну мутацию в молекулу нуклеиновой кислоты при одной реакции ПНР, например, используя один или несколько олигонуклеотидов, каждый из которых содержит одно или несколько несоответствий. С другой стороны, можно ввести более чем одну мутацию в- 11017305 молекулу нуклеиновой кислоты путем выполнения более чем одной реакции ПЦР, при каждой из которых вводится одна или несколько мутаций таким образом, что изменения в нуклеиновую кислоту вводятся последовательно, многократно. Нуклеиновая кислота по изобретению может быть создана с использованием в качестве матрицы кДНК, мРНК или же геномной ДНК и соответствующих олигонуклеотидных праймеров с несоответствиями согласно методу направленного мутагенеза, описанному выше. Полученная при этом молекула нуклеиновой кислоты может быть клонирована в соответствующий вектор и охарактеризована методами анализа последовательности ДНК. Последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать одну или несколько делеций, т.е. пробелов, в сравнении с последовательностью аспарагиназы дикого типа, полученной изNO: 2 или SEQ ID NO: 4. Такие делеции/пробелы могут быть созданы и методом направленного мутагенеза с помощью соответствующих олигонуклеотидов. Методы создания таких делеций хорошо известны специалистам в этой области. Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие или гибридизирующиеся с последовательностями нуклеотидов по изобретению, могут быть получены стандартными методами синтеза, например с помощью автоматизированного синтезатора ДНК. Настоящим изобретением также охвачены комплементарные молекулы нуклеиновых кислот. Молекула нуклеиновой кислоты комплементарна другой последовательности нуклеотидов, если она настолько комплементарна этой последовательности нуклеотидов, что может гибридизироваться с ней с образованием устойчивой двойной спирали. Один из аспектов изобретения касается выделенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид по изобретению или его функциональный эквивалент, как то, биологически активный фрагмент или домен, а также молекул нуклеиновых кислот, пригодных для применения в качестве зондов для гибридизации при идентификации молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид по изобретению, и фрагментов таких молекул нуклеиновых кислот, пригодных для применения в качестве праймеров для ПЦР при амплификации или мутагенезе молекул нуклеиновых кислот, к примеру, для получения молекул нуклеиновых кислот по изобретению."Выделенный полинуклеотид" или "выделенная нуклеиновая кислота" означает такую ДНК или РНК, которая не соприкасается непосредственно с теми двумя кодирующими последовательностями (одной на 5'-конце и другой на 3'-конце), с которыми она непосредственно соприкасается в естественном геноме того организма, из которого она получена. Так, в одном воплощении выделенная нуклеиновая кислота включает часть или все 5'-некодирующие последовательности (например, промотор), которые непосредственно соприкасаются с кодирующей последовательностью. Следовательно, этот термин охватывает, к примеру, рекомбинантную ДНК, встроенную в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус либо в геномную ДНК прокариот или эукариот, либо существующую в виде отдельной молекулы (например, кДНК или фрагмента геномной ДНК, полученных методом ПЦР или при обработке рестрикционными эндонуклеазами) независимо от других последовательностей. Он также охватывает рекомбинантную ДНК, составляющую часть гибридного гена, кодирующего другой полипептид, которая практически свободна от клеточного материала, вирусного материала или культуральной среды (при получении методами рекомбинантной ДНК) либо химических предшественников или других химикатов(при химическом синтезе). Кроме того, "выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты" означает такой фрагмент нуклеиновой кислоты, который в природе не встречается в виде фрагмента и не встречается в естественном состоянии. В настоящем изобретении термины "полинуклеотид" или "молекула нуклеиновой кислоты" служат для обозначения молекул ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) и молекул РНК (например, мРНК),а также аналогов ДНК или РНК, полученных с помощью аналогов нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно она представляет собой двухцепочечную ДНК. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована с использованием аналогов нуклеотидов или их производных (например, инозина или фосфоротиоатных нуклеотидов). Такие олигонуклеотиды могут применяться, к примеру, для получения нуклеиновых кислот, обладающих измененной способностью к спариванию оснований или повышенной устойчивостью к нуклеазам. В следующем воплощении изобретения предусмотрены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, которые являются антисмысловыми по отношению к молекулам нуклеиновых кислот по изобретению, например кодирующей нити молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3. Также в рамки изобретения входят комплементарные нити описанных в нем молекул нуклеиновых кислот. Идентичность и гомологичность. Термины "гомологичность" или "степень идентичности" в настоящем изобретении применяются взаимозаменяемым образом. В целях настоящего изобретения установлено, что для определения степени идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеотидных последовательностей проводится совмещение этих последовательностей с целью их оптимального сравнения (например, могут- 12017305 вводиться пробелы в первую аминокислотную или нуклеотидную последовательность для оптимального совмещения со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). Затем проводится сравнение аминокислотных или нуклеотидных остатков по соответствующим аминокислотным или нуклеотидным положениям. Если какое-то положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным или нуклеотидным остатком, что и соответствующее положение во второй последовательности, то эти молекулы идентичны в этом положении. Степень идентичности между двумя последовательностями является функцией от числа идентичных положений между этими последовательностями (т.е. % идентичности=числу идентичных положений/общее число положений (т.е. совпадающих положений)100. Предпочтительно две последовательности имеют одинаковую длину. Сравнение последовательностей может проводиться по всей длине двух сравниваемых последовательностей или по фрагменту этих двух последовательностей. Как правило, сравнение проводится по всей длине двух сравниваемых последовательностей. Однако идентичность последовательностей может устанавливаться по какому-то участку, например, из 20, 50, 100 или больше смежных аминокислотных остатков. Специалистам должно быть известно, что имеется несколько различных компьютерных программ для определения гомологичности между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение степени идентичности между двумя последовательностями может осуществляться с помощью математического алгоритма. В предпочтительном воплощении степень идентичности между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями определяется с помощью алгоритма Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970, встроенного в программу GAP в комплекте программного обеспечения Accelrys GCG (доступно на http://www.accelrys.com/products/gcg/),используя матрицу Blosum 62 либо матрицу РАМ 250 и весовой коэффициент для пробела 16, 14, 12, 10,8, 6 или 4 и весовой коэффициент для длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалистам должно быть известно, что все эти различные параметры дают слегка отличные результаты, но в целом степень идентичности двух последовательностей существенно не меняется при использовании разных алгоритмов. Последовательности нуклеотидов или белков настоящего изобретения также можно использовать в качестве "запрашиваемой последовательности" для проведения поиска в публичных базах данных, например, для идентификации других представителей семейства или родственных последовательностей. Такой поиск может проводиться с помощью программ BLASTN и BLASTP (версия 2.0) по Altschul et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Поиск BLAST по белкам может проводиться с помощью программыBLASTP при значениях score=50, wordlength=3, получая аминокислотные последовательности, гомологичные белковым молекулам по изобретению. Для получения совмещений с пробелами в целях сравнения можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, BLASTP и BLASTN), см. домашнюю страницу Национального центра информации по биотехнологии на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Гибридизация. Полинуклеотид по изобретению и последовательность, комплементарная приведенной в SEQ IDNO: 1 или SEQ ID NO: 3, как правило, могут гибридизироваться на уровне, существенно превышающем фон. Фоновая гибридизация может происходить, к примеру, из-за присутствия других кДНК в библиотеке кДНК. Уровень сигнала, издаваемого при взаимодействии между полинуклеотидом по изобретению и кодирующей последовательностью, комплементарной приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3,как правило, по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз больше интенсивности при взаимодействии между другими полинуклеотидами и последовательностью по SEQ ID NO: 1 илиSEQ ID NO: 3. Интенсивность взаимодействия может быть измерена, к примеру, методом радиометки. В настоящем изобретении термины "гибридизироваться" и "гибридизация" служат для описания условий гибридизации и отмывки, при которых нуклеотидные последовательности, гомологичные друг другу, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%,более предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%,как то, по меньшей мере на 95%, например, гомологичные друг другу по меньшей мере на 98%, как то,по меньшей мере на 99% при определении на участке по меньшей мере из 20, к примеру по меньшей мере 50, как то, по меньшей мере 100, например, по меньшей мере 200, более предпочтительно по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов, а еще более предпочтительно по всей длине сравниваемых последовательностей, обычно остаются гибридизированными друг с другом. Предпочтительным неограничивающим примером таких условий гибридизации является гибридизация в 6-кратном NaCl/Na-цитрате (SSC) при 45 С с последующей одной или несколькими отмывками в 1SSC, 0,1% SDS при 50 С, предпочтительно при 55 С, более предпочтительно при 60 С и еще более предпочтительно при 65 С. Очень строгие условия включают, к примеру, проведение гибридизации при 68 С в 5SSC/5 растворе Денхардта/1,0% SDS и отмывка в 0,2SSC/0,1% SDS при комнатной температуре. С другой стороны, отмывка может проводиться при 42 С.- 13017305 Специалистам должно быть известно, какие условия соответствуют строгим и очень строгим условиям гибридизации. Дополнительные рекомендации в отношении таких условий легко доступны, например, в Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. иAusubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology (John WileySons, N.Y.). Конечно, полинуклеотиды, гибридизирующиеся только с последовательностью поли-А (как то, 3'концевым участком поли-А в мРНК) или с комплементарным отрезком остатков Т (или U), не относятся к тем полинуклеотидам по изобретению, которые используются для специфической гибридизации с участком нуклеиновой кислоты по изобретению, так как такие полинуклеотиды будут гибридизироваться с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей участок поли-А или комплементарный ему (например, практически с любым клоном двухцепочечной кДНК). Для определения полинуклеотидов по изобретению могут использоваться любые комбинации вышеприведенных степеней идентичности последовательностей и минимальной протяженности, причем предпочтительны более строгие комбинации (т.е. большая идентичность последовательностей на большем протяжении). Векторы. Следующий аспект изобретения касается векторов, предпочтительно экспрессионных (экспрессирующих) векторов, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант аспарагиназы по изобретению, к примеру белок аспарагиназы согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 либо его функциональный эквивалент. В настоящем изобретении термин "вектор" обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой он соединен. Одним из типов вектора является "плазмида", что означает кольцевую петлю двухцепочечной ДНК, в которую можно лигировать (вставить) дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, при этом в вирусный геном можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Некоторые вектора обладают способностью к автономной репликации в клетках хозяина, в которые они введены (например, бактериальные вектора, содержащие бактериальное начало репликации, и эписомные вектора млекопитающих). Другие вектора (например, неэписомные вектора млекопитающих) встраиваются в геном клеток хозяина после введения в клетки и при этом реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые вектора способны управлять экспрессией тех генов, с которыми они функционально связаны. Такие вектора именуются "экспрессионными векторами". Обычно экспрессионные вектора, имеющие применение в методах рекомбинантной ДНК, имеют вид плазмид. Термины "плазмида" и "вектор" в настоящем изобретении используются взаимозаменяющим образом, так как плазмида является наиболее распространенным типом вектора. Однако изобретение охватывает и другие разновидности экспрессионных векторов, как то, вирусные вектора (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции. Рекомбинантные экспрессионные вектора по изобретению содержат нуклеиновую кислоту по изобретению в виде, подходящем для экспрессии е в клетках хозяина, а это значит, что рекомбинантный экспрессионный вектор включает одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных исходя из клеток хозяина, используемых для экспрессирования, которые функционально связаны с экспрессируемой последовательностью нуклеиновой кислоты. В рекомбинантном экспрессионном векторе"функционально связаны" означает то, что данная последовательность нуклеотидов связана с регуляторными последовательностями таким образом, который позволяет экспрессию этой последовательности нуклеотидов (например, в системе транскрипции/трансляции in vitro или в клетках хозяина при введении вектора в эти клетки). Термин "регуляторные последовательности" охватывает промоторы, энхансеры и другие контролирующие экспрессию элементы (например, сигнал полиденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, к примеру, в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Регуляторные последовательности включают те,которые управляют конститутивной экспрессией последовательности нуклеотидов во многих типах клеток хозяина, и те, которые управляют экспрессией последовательности нуклеотидов только в определенных клетках хозяина (например, тканеспецифичные регуляторные последовательности). Специалистам должно быть известно, что конструкция экспрессионного вектора может зависеть от таких факторов, как выбор подлежащих трансформации клеток хозяина, уровень экспрессии нужного белка и т.д. Экспрессионные вектора по изобретению могут вводиться в клетки хозяина и при этом продуцировать белки или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, как описано в настоящем изобретении (например, вариант аспарагиназы согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 или его вариант, например функциональный эквивалент или фрагмент, либо слитый белок, включающий один или несколько таких вариантов). Рекомбинантные экспрессионные вектора по изобретению могут предназначаться для экспрессии вариантов белков по изобретению в прокариотических или эукариотических клетках. Например, можно экспрессировать вариант белка по изобретению в таких бактериальных клетках, как Е. coli, в клетках насекомых (с помощью бакуловирусных экспрессионных векторов), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки хозяина обсуждаются более подробно в Goeddel, Gene ExpressionTechnology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). С другой стороны, реком- 14017305 бинантный экспрессионный вектор можно подвергнуть транскрипции и трансляции in vitro, например,используя регуляторные последовательности промотора Т 7 и полимеразу Т 7. Экспрессионные вектора, применимые в настоящем изобретении, включают вектора хромосомного,эписомного и вирусного происхождения, например вектора, происходящие из бактериальных плазмид,бактериофагов, дрожжевых эписом, хромосомных элементов дрожжей, таких вирусов, как бакуловирусы, паповавирусы, вирус коровьей оспы, аденовирусы, птичьи поксвирумы, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, а также вирусы, происходящие из их комбинаций, как то, вирусы, происходящие из генетических элементов плазмид и бактериофагов, как то, космиды и фагомиды. Вставленная ДНК должна быть функционально связана с соответствующим промотором, таким как промотор PL фага лямбда, промоторы lac, trp и tac E. coli, ранние и поздние промоторы SV40 и промоторы вирусных LTRs - назовем лишь несколько. Другие подходящие промоторы должны быть известны специалистам. В одном конкретном воплощении предпочтительны такие промоторы, которые способны обеспечить высокий уровень экспрессии аспарагиназы в нитчатых грибах. Такие промоторы известны в этой области. Экспрессионные конструкции могут содержать сайты для инициации транскрипции, терминации и, в транскрибируемой области, сайт связывания с рибосомой для трансляции. Кодирующая часть готовых транскриптов, экспрессируемых этими конструкциями, должна включать инициирующий трансляцию AUG в начале и терминирующий кодон в соответствующем месте на конце транслируемого полипептида. ДНК вектора может быть введена в прокариотические или эукариотические клетки стандартными методами трансформации или трансфекции. В настоящем изобретении термины "трансформация" и"трансфекция" служат для обозначения ряда признанных методов введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетки хозяина, включая методы осаждения фосфатом кальция или хлоридом кальция, трансфекции с помощью DEAE-декстрана, трансдукции, инфицирования, липофекции,трансфекции с помощью катионных липидов или электропорации. Подходящие методы трансформирования или трансфецирования клеток хозяина приведены в Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) и других лабораторных пособиях. Известно, что при устойчивой трансфекции клеток млекопитающих, в зависимости от экспрессионного вектора и метода трансфекции, лишь небольшая часть клеток может встраивать чужеродную ДНК в свой геном. Обычно для идентификации и отбора этих интегрантов в клетки хозяина вместе с заданным геном вводится ген, кодирующий селекционный маркер (например, устойчивость к антибиотикам). Предпочтительными селекционными маркерами являются маркеры, придающие устойчивость к лекарственным препаратам, таким как G418, гигромицин и метатрексат. Нуклеиновая кислота, кодирующая селекционный маркер, может вводиться в клетки хозяина в том же самом векторе, который кодирует вариант белка по изобретению, либо в отдельном векторе. Клетки, устойчиво трансфецированные введенной нуклеиновой кислотой, можно идентифицировать путем отбора в присутствии препарата (например, выживут клетки со встроенным геном селекционного маркера, тогда как остальные клетки погибнут). Экспрессирование белков в прокариотах зачастую проводится в Е. coli с помощью векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, управляющие экспрессией слитых либо не слитых белков. Вектор для слияния добавляет ряд аминокислот к кодируемому им белку, например на Nконец рекомбинантного белка. Как правило, такие вектора для слияния выполняют три задачи: 1) повышения экспрессии рекомбинантного белка; 2) повышения растворимости рекомбинантного белка и 3) облегчения очистки рекомбинантного белка, действуя в качестве лиганда при аффинной очистке. Часто в экспрессионные вектора для слияния вводится сайт протеолитического расщепления на стыке между сливаемой молекулой и рекомбинантным белком, который позволяет отделить рекомбинантный белок от сливаемой молекулы после очистки слитого белка. Как уже сказано, экспрессионные вектора предпочтительно должны содержать селекционные маркеры. Такие маркеры включают дигидрофолатредуктазу или устойчивость к неомицину при культивировании в эукариотических клетках и устойчивость к тетрациклину или ампициллину при культивировании в Е. coli и других бактериях. Репрезентативные примеры подходящих клеток хозяина включают клетки бактерий, как то, Е. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium и некоторые виды Bacillus; клетки грибков типа Aspergillus, например A. niger, A. oryzae и A. nidulans; дрожжевые клетки типа Kluyveromyces, например K. lactis и/или Puchia, например P. pastoris; клетки насекомых, как то, Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животных, как то, СНО, COS и меланомы Bowes; и клетки растений. Известны подходящие среды и условия культивирования вышеописанных клеток хозяина. Предпочтительные вектора для бактерий приведены, к примеру, в WO-A1-2004/074468, включенной в настоящее изобретение путем ссылки. Другие подходящие вектора должны быть известны специалистам. Известные бактериальные промоторы, подходящие для настоящего изобретения, включают промоторы, приведенные в WO-A1-2004/074468, включенной в настоящее изобретение путем ссылки. Транскрипция ДНК, кодирующей вариант по настоящему изобретению у высших эукариот, может быть повышена при введении в вектор последовательности энхансера. Энхансеры представляют собойcis-элементы ДНК, обычно от 10 до 300 п.о., которые действуют, повышая транскрипционную активность промотора у данного типа клеток хозяина. Примеры энхансеров включают энхансер SV40, который располагается на поздней стороне начала репликации в районе п.о. 100-270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне начала репликации и энхансеры аденовирусов. Для секреции транслируемого белка в просвет эндоплазматического ретикулума в периплазматическое пространство или во внешнюю среду можно вставить подходящий сигнал секреции в экспрессируемый полипептид. Сигналы могут быть эндогенными для полипептида либо гетерологичными. Вариант по изобретению может экспрессироваться в таком виде, что он будет включать дополнительные гетерологичные функциональные участки, например сигналы секреции. Вариант по изобретению также может содержать, к примеру, участок из добавочных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, вставленный на N-конец полипептида, например, для улучшения стабильности и стойкости в клетках хозяина, во время очистки или при последующей обработке и хранении. К тому же к варианту по изобретению могут быть добавлены молекулы пептидов, способствующие очистке, например, при добавлении остатков гистидина или Т 7-метки. Полипептиды по изобретению. Изобретением предусмотрена аспарагиназа, которая представляет собой:b) полипептид, который по меньшей мере на 85% гомологичен полипептиду по п.а);c) полипептид, который может быть получен из полипептида, приведенного в п.а) или b), путем замены, делеции и/или вставки одной или нескольких аминокислот;d) полипептид, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты по SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, кодирующей зрелый полипептид, или частью этой последовательности, содержащей по меньшей мере 100 нуклеотидов. Как правило, в отношении SEQ ID NO: 2 полипептид по пп.b), с) или d) содержит одну или несколько аминокислот из числа Ala в положении 25, Thr в положении 28, Tyr в положении 30, Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126,Ser в положении 131, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ala в положении 210, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Tyr в положении 240,Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 252, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Gln в положении 273, Ser в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304,Asp в положении 307, Ile в положении 309, Ala в положении 310, Ser в положении 311, Lys в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Leu в положении 319, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Thr в положении 330, Phe в положении 345, Ala в положении 351, Ala в положении 360, Glu в положении 361, Gly в положении 364, Phe в положении 365, Lys в положении 366,Arg в положении 369, Glu в положении 370, Lys в положении 374, Val в положении 375 и Val в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 2. Полипептид по изобретению может содержать две или несколько аминокислот из числа Ala в положении 25, Thr в положении 28, Tyr в положении 30, Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117,Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126, Ser в положении 131, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ala в положении 210, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233,Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Tyr в положении 240, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 252, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Gln в положении 273, Ser в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299,Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Asp в положении 307, Ile в положении 309, Ala в положении 310, Ser в положении 311, Lys в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Leu в положении 319, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Thr в положении 330, Phe в положении 345, Ala в положении 351, Ala в положении 360, Glu в положении 361,- 16017305Gly в положении 364, Phe в положении 365, Lys в положении 366, Arg в положении 369, Glu в положении 370, Lys в положении 374, Val в положении 375 и Val в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 2. Более предпочтительно полипептид по изобретению может содержать все аминокислоты, приведенные в указанных положениях, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 2. В отношении SEQ ID NO: 4 полипептид по изобретению может содержать одну или несколько аминокислот из числа Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122,Asp в положении 126, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Thr в положении 250, Thr в положении 251,Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Asp в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Ser в положении 300, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Ile в положении 309, Ser в положении 311, Thr в положении 312,His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Pro в положении 330, Glu в положении 333, Gln в положении 336, Phe в положении 341, Ala в положении 356, Gly в положении 360, Glu в положении 362, Arg в положении 365, Glu в положении 366, Lys в положении 370, Val в положении 371, Gly в положении 372 и Val в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4. Полипептид по изобретению может содержать две или несколько аминокислот из числа Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126,Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 254,Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Asp в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Ser в положении 300, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Ile в положении 309, Ser в положении 311, Thr в положении 312, His в положении 313,Ser в положении 314, Ile в положении 317, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Pro в положении 330, Glu в положении 333, Gln в положении 336, Phe в положении 341, Ala в положении 356, Gly в положении 360, Glu в положении 362, Arg в положении 365, Glu в положении 366, Lys в положении 370, Val в положении 371, Gly в положении 372 и Val в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4. Более предпочтительно полипептид по изобретению может содержать все аминокислоты, приведенные в указанных положениях, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4. В следующем воплощении изобретения предусмотрена аспарагиназа, у которой ширина рНпрофиля активности составляет по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН. В предпочтительном воплощении аспарагиназа с шириной рН-профиля активности, составляющей по меньшей мере 3,5 единиц рН, представляет собой:b) полипептид, который по меньшей мере на 85% гомологичен полипептиду по п.а);c) полипептид, который может быть получен из полипептида, приведенного в п.а) или b), путем замены, делеции и/или вставки одной или нескольких аминокислот;d) полипептид, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты по SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, кодирующей зрелый полипептид, или частью этой последовательности, содержащей по меньшей мере 100 нуклеотидов. Настоящее изобретение также охватывает пептиды или полипептиды, составляющие функциональный эквивалент вышеприведенных полипептидов. Вышеприведенные полипептиды собирательно охватываются терминами "полипептид по изобретению" или "вариант по изобретению". Термины "пептид" и "олигопептид" считаются синонимами (что общепринято), причем каждый термин может использоваться взаимозаменяемым образом в зависимости от контекста и означает цепочку по меньшей мере из двух аминокислот, соединенных пептидными связями. Слово "полипептид" в на- 17017305 стоящем изобретении применяется в отношении цепочек, содержащих более 7 аминокислотных остатков. Все формулы или последовательности олигопептидов и полипептидов пишутся слева направо и в направлении от N-конца к С-концу. Однобуквенная кодировка аминокислот, используемая в настоящем изобретении, широко известна в данной области и приведена в Sambrook et al. (Molecular Cloning: AHarbor, NY, 1989). Под "выделенным" полипептидом или белком подразумевается полипептид или белок, изъятый из его естественного окружения. Например, полученные рекомбинантным способом полипептиды и белки,экспрессируемые в клетках хозяина, для целей изобретения считаются выделенными, равно как и природные или рекомбинантные полипептиды, подвергавшиеся существенной очистке любым подходящим методом, таким, к примеру, как одноступенчатый метод очистки, приведенный в Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988). Вариант полипептида по изобретению может быть выделен и очищен из культуры рекомбинантных клеток известными в этой области методами. Наиболее предпочтительно для очистки применяется метод ионообменной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии ("HPLC"). Полипептиды настоящего изобретения включают продукты методов химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными методами из прокариотических или эукариотических клеток хозяина, в том числе бактериальных, дрожжевых клеток, клеток высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от клеток хозяина, используемых в рекомбинантном методе получения, полипептиды настоящего изобретения могут быть гликозилированными или не гликозилированными. Кроме того, полипептиды по изобретению могут содержать и модифицированный остаток начального метионина, в некоторых случаях как результат опосредованных хозяином процессов. Фрагменты белков. Изобретением также предусмотрены биологически активные фрагменты полипептидов по изобретению. Такие фрагменты считаются охваченными термином "вариант по изобретению". Биологически активные фрагменты полипептидов по изобретению включают полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, достаточно идентичные или происходящие от аминокислотной последовательности варианта белка по изобретению (например, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4), которые содержат меньше аминокислот, чем полноразмерный белок,но проявляют по меньшей мере одну биологическую активность соответствующего полноразмерного белка. Как правило, биологически активные фрагменты содержат домен или мотив, обладающий по меньшей мере одной активностью варианта белка по изобретению. Предпочтительно биологически активные фрагменты, по крайней мере, обладают аспарагиназной активностью. Биологически активный фрагмент белка по изобретению может представлять собой полипептид длиной, к примеру, в 10, 25, 50,100 или больше аминокислот. Более того, рекомбинантными методами могут быть получены и другие биологически активные части, из которых удалены остальные участки белка, и исследованы на наличие одной или нескольких биологических активностей нативной формы полипептида по изобретению. Как правило, в отношении SEQ ID NO: 2 фрагмент белка по изобретению содержит одну или несколько аминокислот из числа Ala в положении 25, Thr в положении 28, Tyr в положении 30, Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126,Ser в положении 131, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ala в положении 210, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Tyr в положении 240,Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 252, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Gln в положении 273, Ser в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304,Asp в положении 307, Ile в положении 309, Ala в положении 310, Ser в положении 311, Lys в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Leu в положении 319, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Thr в положении 330, Phe в положении 345, Ala в положении 351, Ala в положении 360, Glu в положении 361, Gly в положении 364, Phe в положении 365, Lys в положении 366,Arg в положении 369, Glu в положении 370, Lys в положении 374, Val в положении 375 и Val в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 2. Фрагмент белка по изобретению может содержать две или несколько аминокислот из числа Ala в положении 25, Thr в положении 28, Tyr в положении 30, Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117,- 18017305Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126, Ser в положении 131, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ala в положении 210, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233,Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Tyr в положении 240, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 252, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Gln в положении 273, Ser в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299,Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Asp в положении 307, Ile в положении 309, Ala в положении 310, Ser в положении 311, Lys в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Leu в положении 319, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Thr в положении 330, Phe в положении 345, Ala в положении 351, Ala в положении 360, Glu в положении 361,Gly в положении 364, Phe в положении 365, Lys в положении 366, Arg в положении 369, Glu в положении 370, Lys в положении 374, Val в положении 375 и Val в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 2. Более предпочтительно фрагмент белка по изобретению может содержать все аминокислоты, приведенные в указанных положениях, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 2. Как правило, в отношении SEQ ID NO: 4 фрагмент белка по изобретению содержит одну или несколько аминокислот из числа Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Thr в положении 250,Thr в положении 251, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Asp в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Ser в положении 300, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Ile в положении 309, Ser в положении 311,Thr в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Pro в положении 330, Glu в положении 333, Gln в положении 336, Phe в положении 341, Ala в положении 356, Gly в положении 360, Glu в положении 362, Arg в положении 365, Glu в положении 366, Lys в положении 370, Val в положении 371, Gly в положении 372 и Val в положении 373,причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4. Фрагмент белка по изобретению может содержать две или несколько аминокислот из числа Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233,Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Asp в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Ser в положении 300, Gly в положении 301, Ser в положении 303,Asp в положении 304, Ile в положении 309, Ser в положении 311, Thr в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Pro в положении 330, Glu в положении 333, Gln в положении 336, Phe в положении 341, Ala в положении 356, Gly в положении 360, Glu в положении 362, Arg в положении 365, Glu в положении 366, Lys в положении 370,Val в положении 371, Gly в положении 372 и Val в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4. Более предпочтительно фрагмент белка по изобретению может содержать все аминокислоты, приведенные в указанных положениях, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4. Изобретением также предусмотрены фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие вышеприведенные биологически активные фрагменты (которые сами представляют собой варианты по изобретению). Слитые белки. Варианты по изобретению, как то, белки настоящего изобретения или их функциональные эквиваленты, например их биологически активные части и фрагменты, могут быть функционально соединены с полипептидом не по изобретению (например, гетерологичной аминокислотной последовательностью) с образованием слитых белков. В данном контексте полипептид не по изобретению означает полипептид,- 19017305 имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую белку, который не является существенно гомологичным варианту аспарагиназы по изобретению. В слитом белке вариант по изобретению может соответствовать полноразмерной последовательности либо биологически активному фрагменту полипептида по изобретению. В предпочтительном воплощении слитый белок по изобретению включает по меньшей мере две биологически активные части. В отношении слитого белка термин "функционально соединен" служит для обозначения того, что вариант белка и полипептид не по изобретению слиты друг с другом в одной рамке считывания. Полипептид не по изобретению может быть пришит к N-концу или С-концу варианта белка. Например, в одном воплощении слитый белок представляет собой белок, у которого последовательность варианта пришита к С-концу последовательностей GST. Такие слитые белки могу способствовать очистке рекомбинантного варианта по изобретению. В другом воплощении слитый белок является вариантом по изобретению, содержащим гетерологичную сигнальную последовательность на N-конце. В некоторых клетках хозяина (например, клетках млекопитающих и дрожжевых клетках) при помощи гетерологичной сигнальной последовательности может быть повышена экспрессия и/или секреция варианта по изобретению. В другом примере в качестве гетерологичной сигнальной последовательности может применяться секреторная последовательность белка gp67 оболочки бакуловируса (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John WileySons, 1992). Другие примеры эукариотических гетерологичных сигнальных последовательностей включают секреторные последовательности мелиттина и плацентарной щелочной фосфатазы человека (Stratagene; La Jolla, California). В еще одном примере полезные прокариотические гетерологичные сигнальные последовательности включают секреторный сигнал phoA (Sambrook et al., supra) и секреторный сигнал белка А (Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey). Сигнальная последовательность может использоваться для облегчения секреции и выделения варианта по изобретению. Как правило, сигнальные последовательности характеризуются основой из гидрофобных аминокислот, которые обычно отщепляются от зрелого белка при секреции за один или несколько этапов отщепления. Такие сигнальные пептиды содержат сайты для процессинга, которые позволяют отщепление сигнальной последовательности от зрелого белка при прохождении через секреторный путь. Сигнальная последовательность может направлять секрецию варианта, скажем, их клеток эукариотического хозяина, трансформированных экспрессионным вектором, а затем сигнальная последовательность может быть отщеплена, потом или одновременно. После этого вариант по изобретению легко может быть выделен из внеклеточной среды известными методами. С другой стороны, сигнальная последовательность может быть присоединена к данному варианту с помощью последовательности, способствующей очистке, к примеру, с доменом GST. Так, например, последовательность, кодирующая вариант по изобретению, может быть слита с последовательностью маркера, как то, последовательности, кодирующей пептид, способствующий очистке слитого варианта по изобретению. В некоторых предпочтительных воплощениях этого аспекта изобретения маркерная последовательность представляет собой гексагистидиновый пептид типа метки, встроенной в вектор pQE (Qiagen, Inc.), среди прочих, многие из которых коммерчески доступны. Как описано в Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989), к примеру, гексагистидин обеспечивает удобную очистку слитого белка. Другим пептидом, полезным для очистки, является метка НА, которая соответствует эпитопу из белка гемагглютинина вируса гриппа,который описан в Wilson et al., Cell 37: 767 (1984), к примеру. Слитый белок по изобретению может быть получен стандартными методами рекомбинантной ДНК. Например, фрагменты ДНК, кодирующие последовательности различных полипептидов, лигируют друг с другом в одной рамке считывания в соответствии со стандартными методами, к примеру, используя тупые концы или выступающие концы для лигирования, расщепление рестрикционными ферментами для получения соответствующих концов, заполнение липких концов надлежащим образом, обработку щелочной фосфатазой для предотвращения нежелательного соединения и энзиматическое лигирование. В другом воплощении можно синтезировать слитый ген стандартными методами, включая автоматизированные синтезаторы ДНК. С другой стороны, можно провести амплификацию фрагментов генов методом ПЦР с помощью якорных праймеров, создающих комплементарные выступы между двумя соседними фрагментами генов, которые затем можно подвергнуть отжигу и повторно амплифицировать, получая последовательность химерного гена (например, см. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al.,eds., John WileySons: 1992). Более того, коммерчески доступны многие экспрессионные вектора, кодирующие готовые молекулы для слияния (например, полипептид GST). В такой экспрессионный вектор можно клонировать кодирующую вариант нуклеиновую кислоту таким образом, чтобы молекула для слияния соединялась с данным вариантом в одной рамке считывания. Функциональные эквиваленты. Термины "функциональные эквиваленты" и "функциональные варианты" в настоящем изобретении используются взаимозаменяемым образом. Функциональные эквиваленты по изобретению представляют собой выделенные фрагменты ДНК, которые кодируют полипептид, проявляющий определенную функцию вариантов аспарагиназы Aspergillus niger, как определено в настоящем изобретении. Функциональный эквивалент полипептида по изобретению представляют собой полипептид, проявляющий по мень- 20017305 шей мере одну функцию варианта аспарагиназы Aspergillus niger, как определено в настоящем изобретении. Следовательно, функциональные эквиваленты также охватывают биологически активные фрагменты и сами охватываются термином "вариант" по изобретению. Предпочтительно полипептид функционального эквивалента в отношении SEQ ID NO: 2 по изобретению содержит одну или несколько аминокислот из числа Ala в положении 25, Thr в положении 28, Tyr в положении 30, Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122,Asp в положении 126, Ser в положении 131, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ala в положении 210, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238,Tyr в положении 240, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 252, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Gln в положении 273, Ser в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Gly в положении 301, Ser в положении 303,Asp в положении 304, Asp в положении 307, Ile в положении 309, Ala в положении 310, Ser в положении 311, Lys в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Leu в положении 319, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Thr в положении 330, Phe в положении 345, Ala в положении 351, Ala в положении 360, Glu в положении 361, Gly в положении 364, Phe в положении 365,Lys в положении 366, Arg в положении 369, Glu в положении 370, Lys в положении 374, Val в положении 375 и Val в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 2. Соответственно вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать 2, 3, 4, 5, к примеру, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, как то, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70,по меньшей мере 80 либо все из следующих аминокислот: Ala в положении 25, Thr в положении 28, Tyr в положении 30, Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122,Asp в положении 126, Ser в положении 131, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ala в положении 210, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238,Tyr в положении 240, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 252, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Gln в положении 273, Ser в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Gly в положении 301, Ser в положении 303,Asp в положении 304, Asp в положении 307, Ile в положении 309, Ala в положении 310, Ser в положении 311, Lys в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Leu в положении 319, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Thr в положении 330, Phe в положении 345, Ala в положении 351, Ala в положении 360, Glu в положении 361, Gly в положении 364, Phe в положении 365,Lys в положении 366, Arg в положении 369, Glu в положении 370, Lys в положении 374, Val в положении 375 и Val в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 2. Предпочтительно полипептид функционального эквивалента в отношении SEQ ID NO: 4 по изобретению содержит одну или несколько аминокислот из числа Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117,Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238,Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Asp в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Ser в положении 300, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Ile в положении 309,Ser в положении 311, Thr в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Pro в положении 330, Glu в положении 333, Gln в положении 336, Phe в положении 341, Ala в положении 356, Gly в положении 360, Glu в положении 362, Arg в положении 365, Glu в положении 366, Lys в положении 370, Val в положении 371, Gly в положении 372 иVal в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4. Соответственно вариант полипептида аспарагиназы по изобретению может содержать 2, 3, 4, 5, к примеру, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, как то, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70 либо все из следующих аминокислот: Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119,Glu в положении 122, Asp в положении 126, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Thr в положении 250,Thr в положении 251, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Asp в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Ser в положении 300, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Ile в положении 309, Ser в положении 311,Thr в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Pro в положении 330, Glu в положении 333, Gln в положении 336, Phe в положении 341, Ala в положении 356, Gly в положении 360, Glu в положении 362, Arg в положении 365, Glu в положении 366, Lys в положении 370, Val в положении 371, Gly в положении 372 и Val в положении 373,причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4. Функциональные эквиваленты белка или полипептида могут содержать замены одной или нескольких аминокислот в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 либо замены, вставки или делеции несущественных аминокислот. Соответственно несущественная аминокислота представляет собой такой остаток, который может быть изменен в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 без существенного изменения биологической функции. Более того, изменению и вовсе не подлежат аминокислоты, являющиеся консервативными среди белков по настоящему изобретению и других аспарагиназ. Для получения функционального варианта по изобретению могут производиться замены аминокислот в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, например от 1, 2 или 3 до 10, 20, 30 или больше замен. Функциональные эквиваленты нуклеиновой кислоты, как правило, могут содержать молчащие мутации или мутации, не изменяющие биологическую функцию кодируемого полипептида. Соответственно изобретением предусмотрены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты белка аспарагиназы, которые содержат замены аминокислотных остатков, не существенных для определенной биологической активности. Такие варианты белка отличаются по аминокислотной последовательности от SEQ IDNO: 2 или SEQ ID NO: 4, но сохраняют по меньшей мере одну биологическую активность его. В одном воплощении выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов,кодирующую белок, причем этот белок имеет практически гомологичную аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или больше гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант по изобретению, который гомологичен, как правило существенно гомологичен, белку согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, может быть создана путем введения одной или нескольких замен, добавлений или делеций нуклеотидов в кодирующую последовательность нуклеотидов по изобретению таким образом, чтобы в кодируемый белок была введена одна или несколько замен, делеций или вставок аминокислот. Такие мутации могут вводиться стандартными методами, как то, методами направленного мутагенеза и с помощью ПЦР. В настоящем изобретении термин "существенно гомологичная" относится к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, содержащей достаточное или минимальное количество идентичных или эквивалентных (например, с аналогичной боковой цепью) аминокислот или нуклеотидов ко второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности с тем, что и первая, и вторая аминокислотная или нуклеотидная последовательности содержат общий домен. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, содержащие общий домен и идентичные на 60%, предпочтительно на 65%, более предпочтительно на 70%, еще более предпочтительно на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97,98, 99% или больше, в настоящем изобретении определяются как достаточно идентичные. Молекулы нуклеиновых кислот, соответствующих, т.е. колирующих варианты аспарагиназы по изобретению, могут быть выделены на основе их гомологичности нуклеиновым кислотам изобретения с помощью кДНК, приведенных в настоящем изобретении. Специалисты должны понимать, что в нуклеотидные последовательности по изобретению могут вводиться изменения при помощи мутагенеза, которые приводят к изменению аминокислотной последовательности получаемого белка без существенного изменения функции такого белка. В следующем аспекте изобретения предусмотрены улучшенные варианты белка аспарагиназы. Улучшенными вариантами белка аспарагиназы являются белки, у которых улучшается по меньшей мере одна биологическая активность, например, по сравнению с аспарагиназой дикого типа, как то, аспараги- 22017305 назой A. niger. В частности, варианты белка по изобретению могут обладать большей удельной активностью при данном рН по сравнению с аспарагиназой дикого типа, как то, аспарагиназой A. niger, приведенной вSEQ ID NO: 3 из WO 2004/030468, или могут лучше реагировать на рН, к примеру быть более алкалофильными или ацидофильными, чем аспарагиназа дикого типа, как то, аспарагиназа A. niger, приведенная в SEQ ID NO: 3 из WO 2004/030468. Например, варианты белка по изобретению могут обладать большей удельной активностью по меньшей мере при рН 5 по сравнению с удельной активностью аспарагиназы дикого типа из A. niger, приведенной в SEQ ID NO: 3 из WO 2004/030468, при измерении в одинаковых условиях. Например, аспарагиназа дикого типа из A. niger, приведенная в SEQ ID NO: 3 изWO 2004/030468, имеет рН-оптимум при рН от 4 до 5. Вариант белка по изобретению может быть более алкалофильным, чем тот же фермент дикого типа, т.е. он может, к примеру, иметь рН-оптимум при рН от 6 до 7. Хотя вариант может быть и более ацидофильным, чем аспарагиназа дикого типа. В следующем воплощении у вариантов белков по изобретению ширина рН-профиля активности может составлять по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН. Такие белки могу быть получены путем введения случайных мутаций по всей или по части кодирующей последовательности по изобретению, как то, методом насыщающего мутагенеза. Полученных мутантов можно затем подвергнуть рекомбинантной экспрессии и скринингу на наличие биологической активности. Например, в этой области существуют стандартные методы измерения энзиматической активности аспарагиназы, так что можно легко проводить отбор улучшенных белков. В предпочтительном воплощении вариант аспарагиназы по изобретению имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. В другом воплощении вариант по изобретению существенно гомологичен аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 2 или SEQID NO: 4, а также обычно сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность полипептида согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, но может отличаться по аминокислотной последовательности вследствие мутагенеза, как описано выше. В другом предпочтительном воплощении вариант аспарагиназы по изобретению имеет аминокислотную последовательность, кодирующуюся выделенным фрагментом нуклеиновой кислоты, который способен гибридизироваться с нуклеиновой кислотой по изобретению, предпочтительно в условиях гибридизации высокой строгости. Соответственно вариант аспарагиназы по изобретению предпочтительно представляет собой белок,имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или больше гомологична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2 или SEQ IDNO: 4, и сохраняет по меньшей мере одну функциональную активность полипептида согласно SEQ IDNO: 2 или SEQ ID NO: 4. Варианты по изобретению, например функциональные эквиваленты белка по изобретению, также можно идентифицировать, например, путем скрининга комбинаторной библиотеки мутантов, например,укороченных мутантов белка по изобретению на наличие аспарагиназной активности. В одном воплощении создается разнородная библиотека вариантов путем комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновой кислоты. Разнородная библиотека вариантов может быть получена, к примеру, путем энзиматического лигирования смеси синтетических олигонуклеотидов с последовательностями гена таким образом,чтобы вырожденный набор потенциальных последовательностей белков можно было экспрессировать в виде индивидуальных полипептидов или же в виде набора более крупных слитых белков (например, при фаговом дисплее). Существует целый ряд методов, которые можно использовать для получения библиотек потенциальных вариантов полипептидов по изобретению из последовательности вырожденных олигонуклеотидов. Методы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в этой области (например,см. Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984)Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477. Кроме того, библиотеки фрагментов последовательности, кодирующей полипептид по изобретению, можно использовать для получения разнородной популяции полипептидов для скрининга при последующем отборе вариантов. Например, можно создать библиотеку фрагментов кодирующей последовательности путем обработки нуклеазой двухцепочечного ПЦР-фрагмента заданной кодирующей последовательности в таких условиях, когда точечный разрыв происходит только примерно один раз на молекулу, денатурирования двухцепочечной ДНК, ренатурирования этой ДНК с образованием двухцепочечной ДНК, которая может включать пары смысловых/антисмысловых нитей из продуктов с разными точечными разрывами, удаления одноцепочечных участков из новообразованных дуплексов при обработке нуклеазой S1, и лигирования полученной библиотеки фрагментов в экспрессионный вектор. Таким способом можно получить экспрессионную библиотеку, кодирующую N-концевые и внутренние фрагменты заданного белка различного размера. Известно несколько методов скрининга генных продуктов из комбинаторных библиотек, полученных путем точечных мутаций или усечения, и скрининга библиотек кДНК на наличие генных продуктов,обладающих заданным свойством. Наиболее распространенные методы, которые поддаются высокопро- 23017305 изводительному анализу для скрининга больших генных библиотек, обычно включают клонирование генной библиотеки в реплицирующиеся экспрессионные вектора, трансформирование подходящих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессирование комбинаторных генов в условиях, при которых детектирование требуемой активности способствует выделению вектора, кодирующего тот ген, продукт которого был детектирован. Для идентификации вариантов белка по изобретению в сочетании с методами скрининга может применяться метод рекурсивного группового мутагенеза (REM), который повышает частоту функциональных мутантов в библиотеках (Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331). Фрагменты полинуклеотидов по изобретению также могут включать полинуклеотиды, не кодирующие функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут функционировать как зонды или праймеры для реакции ПЦР. Нуклеиновые кислоты по изобретению, независимо от того, кодируют они функциональные или нефункциональные полипептиды, могут использоваться в качестве зондов для гибридизации или праймеров для полимеразной цепной реакции (PCR). Применение молекул нуклеиновых кислот настоящего изобретения, не кодирующих полипептид, обладающий аспарагиназной активностью, включает, среди прочего, (1) гибридизацию in situ (например, FISH) расправленных метафазных хромосом для уточнения хромосомной локализации кодирующего аспарагиназу гена, как описано в Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); (2) Northern-гибридизацию для детектирования экспрессии мРНК аспарагиназы в определенных тканях и/или клетках и (3) зонды и праймеры, которые могут применяться для анализа на присутствие нуклеиновой кислоты, гибридизирующейся с таким зондом или праймером в данном биологическом образце (например, образце ткани). Изобретение также охватывает способ получения функционального эквивалента полинуклеотида по изобретению. Такой способ включает получение меченого зонда, включающего выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую всю или часть последовательности белка согласно SEQ ID NO: 2 или SEQ IDNO: 4 либо его варианта; скрининг библиотеки фрагментов нуклеиновой кислоты с помощью меченого зонда в условиях, способствующих гибридизации зонда с фрагментами нуклеиновой кислоты в библиотеке, при которой образуются дуплексы нуклеиновой кислоты; и получение полноразмерной последовательности гена из фрагментов нуклеиновой кислоты в меченых дуплексах, получая последовательность,родственную полинуклеотиду по изобретению. Клетки хозяина. В следующем воплощении изобретения представлены клетки, например трансформированные клетки хозяина или рекомбинантные клетки хозяина, содержащие нуклеиновую кислоту согласно изобретению. "Трансформированные клетки" или "рекомбинантные клетки" представляют собой клетки, в которые (или в предка которых) методами рекомбинантной ДНК была введена нуклеиновая кислота по изобретению. Они охватывают как прокариотические, так и эукариотические клетки, например бактерии,грибки, дрожжи и др., но особенно предпочтительны клетки нитчатых грибов, в особенности Aspergillusniger. Можно выбрать такие клетки хозяина, которые модулируют экспрессию вставленных последовательностей либо модифицируют и подвергают процессингу продукт, кодируемый вставленной последовательностью нуклеиновой кислоты определенным, заданным образом. Такие модификации (например,гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут способствовать оптимальному функционированию кодируемого белка. Различные клетки хозяина обладают характерными и специфическими механизмами посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Можно выбрать подходящие линии клеток или системы хозяина, известные специалистам в области молекулярной биологии и микробиологии, чтобы обеспечить требуемую и правильную модификацию и процессинг экспрессируемого чужого белка. Для этой цели можно использовать эукариотические клетки хозяина, обладающие клеточными механизмами для правильного процессинга первичного транскрипта, гликолизирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки хозяина хорошо известны в этой области. Клетки хозяина охватывают и клеточные линии млекопитающих, как то, линии клеток СНО, VERO,BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3 Т 3, WI38 и хориоидного сплетения. При желании устойчиво трансфецированная линия клеток может продуцировать вариант по изобретению. Имеется целый ряд общедоступных векторов, подходящих для трансфекции клеток млекопитающих, а способы конструирования таких клеточных линий также общеизвестны, например, в Ausubel et al.(supra). Применение варианта аспарагиназы по изобретению в промышленных процессах. В настоящем изобретении также представлены композиции, включающие аспарагиназы по изобретению. Композиции могут необязательно включать и другие ингредиенты, например другие ферменты. Варианты аспарагиназы по изобретению или композиции, содержащие данные аспарагиназы, могут применяться для получения пищевых продуктов. В одном воплощении изобретения варианты аспарагиназы по изобретению или композиции, содержащие данные аспарагиназы, могут применяться для снижения количества акриламида, образующегося при термической обработке пищевых продуктов на основе со- 24017305 держащего аспарагин исходного материала. Например, они могут применяться в способе получения пищевых продуктов, включающем по меньшей мере одну стадию нагревания, который включает добавление одного или нескольких ферментов аспарагиназы в промежуточную форму данного пищевого продукта в данном способе получения, при этом фермент добавляется перед стадией нагревания в количестве, эффективно снижающем уровень аспарагина в данной промежуточной форме пищевого продукта. Такой способ раскрыт в WO 04/030468, причем сам способ и все его преимущества включены в настоящее изобретение путем ссылки. Также и в WO 04/026043 описаны подходящие способы, в которых может применяться аспарагиназа по изобретению. Раскрытые в WO 04/026043 способы и все их преимущества включены в настоящее изобретение путем ссылки. Промежуточная форма пищевого продукта определяется в настоящем изобретении как любая форма, возникающая в процессе получения до получения конечной формы пищевого продукта. Промежуточная форма может включать индивидуальные исходные материалы, и/или их смеси, и/или смеси с добавками и/или технологическими добавками либо их подвергнутые последующей обработке формы. Например, промежуточные формы пищевого продукта - хлеба включают, к примеру, пшеницу, пшеничную муку, исходную смесь е с другими ингредиентами хлеба, такими, к примеру, как вода, соль, дрожжи и композиции для улучшения хлеба, замешанное тесто, вымешенное тесто, поднявшееся тесто и частично испеченное тесто. Например, для некоторых продуктов из картофеля промежуточными продуктами являются обезвоженные картофельные хлопья или гранулы, а промежуточным продуктом для кукурузных чипсов является кукурузная масса. Пищевой продукт может быть изготовлен по меньшей мере из одного исходного материала, имеющего растительное происхождение, например картофеля, табака, кофе, какао, риса, зерновых, к примеру пшеницы, ржи, кукурузы, ячменя, крупы, гречихи и овса. Здесь и далее пшеница означает все известные виды из рода Triticum, например Т. aestivum, durum и/или spelta. Также в рамки изобретения входят пищевые продукты, изготовленные из более чем одного исходного или промежуточного материала, например пищевые продукты, содержащие и пшеницу (муку и/или крахмал), и картофель. Примеры пищевых продуктов, для которых может подойти способ по изобретению, - это мучные продукты, как то, хлеб, выпечка, пирожные, крендели, бублики, медовые торты, печенье, пряники, имбирное печенье и хлебцы, и картофельные продукты, как то, картофель фри, жареный картофель, картофельные чипсы, крокеты. Вышеприведенные исходные материалы, как известно, содержат значительное количество аспарагина, который в процессе производства участвует в образовании акриламида на стадии нагревания. С другой стороны, аспарагин может происходить из других источников, чем исходные материалы, например из гидролизатов белков, как то, дрожжевых экстрактов, гидролизата сои, гидролизата казеина и др.,которые применяются как добавки в процессе производства пищевых продуктов. Предпочтительным производственным процессом является выпекание хлеба и других хлебобулочных изделий из пшеничной муки и/или муки из других злаков. Другим предпочтительным производственным процессом является обжаривание во фритюре картофельных чипсов из ломтиков картофеля. Предпочтительными стадиями нагревания являются те, при которых по меньшей мере часть промежуточного пищевого продукта, например поверхность пищевого продукта, подвергается воздействию температур, при которых происходит образование акриламида, например 110 С или выше, 120 С или выше. Стадия нагревания в способе по изобретению может проводиться в печи, например, при температуре 180-220 С, как при выпекании хлеба и других хлебобулочных изделий, либо в масле, как при обжаривании картофельных чипсов, например, при 160-190 С. В следующем аспекте изобретенияпредусмотрены пищевые продукты, получаемые способом изобретения, как описано выше, или с применением новых аспарагиназ, как описано выше, для получения пищевых продуктов. Эти пищевые продукты отличаются значительным снижением уровня акриламида по сравнению с продуктами, получаемыми такими способами, которые не включают добавления одного или нескольких ферментов в количестве, эффективно снижающем уровень аминокислот, участвующих в образовании акриламида на данной стадии нагревания. Способ по изобретению может применяться для снижения содержания акриламида в приготовленном пищевом продукте предпочтительно до 50%, более предпочтительно до 20%, еще более предпочтительно до 10% и наиболее предпочтительно до 5% по сравнению с пищевым продуктом, полученным традиционным способом. Другим применением для вариантов аспарагиназы по изобретению является их применение при лечении опухолей у животных и человека. Метаболизм раковых клеток требует L-аспарагина, который может быть быстро разрушен аспарагиназами. Аспарагиназа по изобретению также может применяться как вспомогательное средство при лечении некоторых разновидностей лейкемии у человека. Применение аспарагиназы на экспериментальных животных и людях приводит к регрессии некоторых лимфом и лейкемии. Поэтому в одном воплощении изобретения оно касается аспарагиназ или композиций по изобретению для применения в качестве медикамента, например, при лечении опухолей, например при лечении лимфомы или лейкемии у животных или человека. Варианты аспарагиназы по изобретению можно удобно продуцировать в микроорганизмах. В вышеописанных способах предпочтительно применяются аспарагиназы, полученные методами рекомби- 25017305 нантной ДНК. Такие рекомбинантные ферменты обладают рядом преимуществ, как то, продукция при низкой себестоимости, с высоким выходом, отсутствие таких загрязнений, как бактерии или вирусы, а также отсутствие бактериальных токсинов или примесей активности других ферментов. Далее изобретение раскрывается на следующих неограничивающих примерах. Примеры Материалы и методы. Определение аспарагиназы для измерения рН-зависимости в диапазоне рН 4-9. Аспарагиназную активность определяли, используя в качестве субстрата L-аспарагин. Количество выделяющегося под действием фермента аммиака измеряли согласно реакции Berthelot. Готовые к употреблению реагенты фенолнитропруссид и щелочной гипохлорит получали из фирмы Sigma. Образец фермента в 100 мкл смешивали с 2000 мкл 100 мМ L-аспарагина в буфере из смеси 50 мМ лимонной кислоты и 50 мМ пирофосфата натрия с требуемым значением рН. После инкубации при 37 С в течение 30 мин реакцию останавливали добавлением 400 мкл 25% трихлоруксусной кислоты, после чего добавляли 2500 мкл воды. Во время инкубации температуру поддерживали при 37 С, если не указано иначе. Специалистам должно быть понятно, что дозировку фермента выбирали таким образом, чтобы после инкубации при вышеуказанных условиях полученный сигнал был значительно выше уровня фона, но попадал в такой диапазоне, в котором полученные сигналы пропорциональны количеству добавленного фермента. Предпочтительно реакция была нулевого порядка. После остановки реакции 4 мкл инкубационной смеси вносили в 156 мкл воды. После этого добавляли 34 мкл раствора фенолнитропруссида (Sigma P6994) и 34 мкл раствора щелочного гипохлорита(Sigma A1727). После инкубации в течение 676 с при 37 С измеряли экстинкцию при 600 нм. Показания подвергали коррекции на фоновый сигнал по соответствующим холостым пробам. В качестве холостой пробы использовали образец с инактивированным ферментом (ТХУ). Определения проводили на автоматическом анализаторе Konelab Arena 30 (Thermo Scientific). Активность определяли по калибровочной прямой, которую составляли, нанося на график значения поглощения при 600 нм в зависимости от известных концентраций сульфата аммония из стандартного ряда. Активность выражали в единицах, причем 1 единица определялась как количество фермента, необходимое для выделения 1 мкмоль аммиака изL-аспарагина за 1 мин при заданных условиях определения. Определение аспарагиназы для измерения рН-зависимости в диапазоне рН 4-8. Выполнялась такая же методика, как описанная выше методика для измерения рН-зависимости активности в диапазоне рН 4-9 с тем отличием, что образец фермента в 100 мкл смешивали с 2000 мкл 100 мМ L-аспарагина в 50 мМ фосфатно-цитратном буфере с требуемым значением рН. При всех определениях активность аспарагиназы в образцах выражали в единицах на 1 мл. Пример 1. Ферментация, выделение и очистка аспарагиназ по изобретению. Аспарагиназы по изобретению получали путем конструирования экспрессионных плазмид, содержащих последовательность ДНК, кодирующей аспарагиназу по изобретению, трансформирования этой плазмидой штамма Aspergillus niger и культивирования штаммов Aspergillus niger, как описано в WO 2004/030468. После культивирования клеток Aspergillus niger, содержащих соответствующие экспрессионные плазмиды, получали бесклеточные супернатанты путем центрифугирования ферментационной жидкости при 5000g в течение 30 мин при 4 С. При необходимости супернатанты дополнительно фильтровали через фильтр Miracloth (Calbiochem, кат.475855) и микроволоконный фильтр GF/A Glass фирмыWhatmann (150 мм ) соответственно для удаления любых частиц. Чтобы избавиться от грибков, супернатанты доводили до рН 5 с помощью 4 N KOH и стерилизировали фильтрованием через фильтр на 2 мкм (бутылочный) с отсасыванием. Супернатанты хранили до использования при 4 С или замораживали при -20 С, если нужно. В том случае, когда примеси составляли более 60 мас.%, аспарагиназы очищали методом анионообменной хроматографии, исходя из бесклеточных супернатантов или ccUF, обессоленных пропусканием через колонку PD-10 (Amersham Biosciences). Обессоленный материал наносили на колонку с сефарозой Mono-Q или Q-сефарозой, уравновешенной в 20 мМ гистидиновом буфере рН 5,96. После исчерпывающей промывки аспарагиназы элюировали из колонки с помощью градиента от 0 до 1 М NaCl. Чистоту фракций супернатанта, содержащих аспарагиназную активность, или очищенных фракций аспарагиназы (определяли в мг белка/мл) проверяли методом аналитической эксклюзионной хроматографии (HP-SEC: высокоэффективная эксклюзионная хроматография, TSKgel 3000SW-XL, колонка 300 7,8 мм; диапазон мол. весов 10-300 кДа, 100 мМ фосфатный буфер рН 7 и 5,96). Скорость протока составляла 1 мл/мин (за исключением инжекции проб на колонке с Q-сефарозой, которое проводилось при 5 мл/мин). Детектирование элюированного белка проводили при 280 нм. Концентрацию элюированных аспарагиназ Aspergillus niger рассчитывали по экстинкции при 280 нм (А 280), используя молярный коэффициент экстинкции 10240 М-1 см-1 (А 2801 см,1 мг/мл=0,28, где А 2801 см,1 мг/мл означает экстинкцию при 280 нм, измеренную при длине пути в 1 см и при концентрации очищенного белка в 1 мг/мл). Измерение А 280 проводили на спектрофотометре Uvikon XL Secomam (Beun de Ronde, Abcoude, Нидерланды). Для- 26017305 аспарагиназы, соответствующей SEQ ID NO: 4 (ASN002), и аспарагиназы, соответствующей SEQ ID NO: 2 (ASN001), использовали 8960 M-1 см-1 (А 2801 см,1 мг/мл=0,25) и 11520 М-1 см-1 (А 2801 см,1 мг/мл=0,31) соответственно. При наличии примесей, поглощающих при 280 нм, концентрацию аспарагиназ подвергали коррекции по хроматограмме HP-SEC, умножая значение А 280 в образце аспарагиназы на отношение площади под пиком аспарагиназы к общей площади пиков, поглощающих при 280 нм. Если пики аспарагиназ не были четко отделены от других пиков, то вместо площади пика использовали его высоту. Пример 2. Функционирование аспарагиназ по изобретению. Удельная активность в зависимости от рН. Определяли удельную активность вариантов аспарагиназы при рН 4, 5, 6, 7, 8 при 37 С в 50 мМ фосфатно-цитратном буфере, используя бесклеточные супернатанты. Удельная активность фермента настоящим определяется как активность, измеренная в образце фермента в единицах на 1 мг очищенного полипептида фермента. Следовательно, удельная активность аспарагиназы есть активность, измеренная в образце аспарагиназы в единицах на 1 мг очищенного полипептида аспарагиназы. Для определения удельной активности аспарагиназы е концентрацию в супернатанте выводили по измерению А 280 с применением коррекции на загрязнения по хроматограмме HP-SEC, как указано в"Материалах и методах". Таблица 1 Удельная активность вариантов относительно аспарагиназы дикого типа (wt)A. niger (WO 2004/030468) при использовании в качестве субстрата аспарагина при указанных значениях рН При каждом значении рН за 100% принималась удельная активность дикого типа. Активность определяли при 37 С. В сравнении с диким типом у вариантов ASN002 и ASN001 рН-оптимум сместился от pH 4 к рН 6. Кроме того, рН-оптимум сильно расширился, в особенности в щелочном диапазоне. Варианты ASN002 иASN001 при всех измеренных значениях рН выше 4 проявляют существенно более высокую удельную активность, чем у дикого типа. рН-Зависимость активности и рН-оптимум. Определяли рН-зависимость аспарагиназной активности в 50 мМ фосфатно-цитратном буфере в диапазоне рН от 4 до 8, используя бесклеточные супернатанты. Значение рН, при котором у варианта наблюдалась самая высокая активность, именуется рН-оптимумом для данного варианта. В табл. 2 за 100% принимали максимальную активность, наблюдавшуюся у данного варианта, а активности при других значениях рН приведены в процентах от максимальной активности, наблюдавшейся у данного варианта. Таблица 2 Зависимость аспарагиназной активности от рН у вариантов в сравнении с аспарагиназой дикого типа (wt) A. niger (WO 2004/030468) За 100% принимали самую высокую активность, наблюдавшуюся у каждого варианта. Активность определяли при 37 С. Из табл. 2 видно, что рН-оптимум сместился к более высоким значениям рН. Кроме того, у вариантов значительно улучшилась активность при щелочных значениях рН, что делает эти варианты очень полезными для применений, требующих аспарагиназной активности при более щелочных условиях. Ширина рН-профиля активности у вариантов. Наиболее примечательной особенностью ASN002 и ASN001 является то, что эти две аспарагиназы проявляют чрезвычайно широкий рН-профиль активности в наиболее полезном диапазоне рН от 4 до 9,чего не наблюдалось раньше ни у каких аспарагиназ. Для того чтобы установить ширину рН-профиля активности, определяли активность в пределах рН от 4 до 9, используя цитратно-пирофосфатный буфер. Ширина рН-профиля активности означает ширину того интервала рН, выраженного в единицах рН, в котором фермент проявляет от 50 до 100% своей максимальной активности. Ширина рН-профиля активности определяется на графике зависимости активности от рН. Ширина интервала рН, выраженного в единицах рН, в котором фермент проявляет не менее 50% от своей максимальной активности, задает ширину рН-профиля активности данного фермента. Если провести прямую параллельно оси рН на уровне половины от максимальной активности, то рН-профиль активности будет пересекаться с этой прямой- 27017305 при двух значениях рН. Эти два значения рН на пересечении, одно для кислотной части и другое для щелочной части рН-профиля активности, и задают ширину рН-профиля активности. При промежуточных значениях рН активность составляет не менее 50% от максимальной активности. Максимальная активность определяется как самая высокая активность, которая наблюдается на графике зависимости активности от рН. Значение рН, соответствующее самой высокой активности, составляет рН-оптимум данного фермента. Таблица 3 Ширина рН-профиля активности у ASN002 и ASN001 в сравнении с аспарагиназой дикого типа A. niger (WO 2004/030468) и дикого типа A. oryzae (WO 2004/032648) Активность определяли при 37 С. Активность в диапазоне рН от 4 до 9 измеряли, используя смесьL-аспарагина с буфером из 50 мМ лимонной кислоты и 50 мМ пирофосфата натрия при заданном рН, как описано в разделе "Материалы и методы". Использовали образцы фермента в интервале 1,5-12 единиц/мл. В табл. 4 представлена полная рН-зависимость активности при определении в диапазоне рН от 4 до 9. Таблица 4 Зависимость активности от рН у ASN002 и ASN001 в сравнении с аспарагиназой дикого типа A. niger (WO 2004/030468) и A. oryzae (WO 2004/032648) За 100% принимали самую высокую активность у каждой аспарагиназы. Активность определяли при 37 С. Активность в диапазоне рН от 4 до 9 измеряли, используя смесь L-аспарагина с буфером из 50 мМ лимонной кислоты и 50 мМ пирофосфата натрия при заданном рН, как описано в разделе "Материалы и методы". Использовали образцы фермента в интервале 1,5-12 единиц/мл. Устойчивость вариантов Помимо активности при данном рН, функционирование фермента также критически зависит от его термостабильности при преобразовании. Для проверки термостабильности наиболее активных вариантов проводили определение активности при 60 С. В одном опыте реакцию фермента останавливали через 10 мин, а в другом опыте реакцию останавливали через 30 мин. Дозировка фермента в 30-минутном опыте составляла одну треть от дозировки в 10-минутном опыте. Если фермент устойчив в применявшихся условиях, то должна наблюдаться одинаковая активность. Если же происходит инактивация, то активность должна уменьшаться при более продолжительном определении. Результаты представлены в табл. 5. Таблица 5 Устойчивость вариантов Опыты проводились при 60 С, а дозировка фермента в 30-минутном опыте составляла одну треть от дозировки в 10-минутном опыте, что соответствует продолжительности инкубации в 10 и 30 мин со- 28017305 ответственно. Из табл. 5 видно, что устойчивость вариантов очень близка аспарагиназе дикого типа Aspergillus niger. При рН 6, 7, 8 варианты ASN002 и ASN001 полностью активны при 60 С и проявляют лишь небольшое снижение активности после 30-минутной инкубации. Вследствие этого повышенная активность может полностью использоваться при превращении аспарагина в аспарагиновую кислоту. В частности, при заданных значениях рН в нейтральном и щелочном диапазоне функционирование вариантов значительно улучшается. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Аспарагиназа, которая представляет собой:b) полипептид, который по меньшей мере на 85% гомологичен полипептиду по п.а); илиc) полипептид, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты по SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, кодирующей зрелый полипептид. 2. Аспарагиназа по п.1, у которой в отношении SEQ ID NO: 2 полипептид по пп.b), с) или d) содержит одну или несколько аминокислот из числа Ala в положении 25, Thr в положении 28, Tyr в положении 30, Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126, Ser в положении 131, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181,Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205, Phe в положении 208, Ala в положении 210, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Tyr в положении 240, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 252, Val в положении 254,Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Gln в положении 273, Ser в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283, Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Asp в положении 307, Ile в положении 309, Ala в положении 310, Ser в положении 311,Lys в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Leu в положении 319, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Thr в положении 330, Phe в положении 345, Ala в положении 351, Ala в положении 360, Glu в положении 361, Gly в положении 364, Phe в положении 365, Lys в положении 366, Arg в положении 369, Glu в положении 370, Lys в положении 374, Val в положении 375 иVal в положении 377, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 2. 3. Аспарагиназа по п.1, у которой в отношении SEQ ID NO: 4 полипептид по пп.b), с) или d) содержит одну или несколько аминокислот из числа Ser в положении 35, Leu в положении 53, Ser в положении 63, Ala в положении 64, Asp в положении 65, Asn в положении 66, Ala в положении 74, Ile в положении 77, Ile в положении 79, Gln в положении 80, Thr в положении 81, Glu в положении 88, Pro в положении 106, Val в положении 108, Ser в положении 111, Leu в положении 114, Ala в положении 117, Thr в положении 119, Glu в положении 122, Asp в положении 126, Val в положении 161, Ala в положении 168, Gln в положении 181, Pro в положении 189, Ala в положении 190, Leu в положении 197, Val в положении 205,Phe в положении 208, Ser в положении 211, Val в положении 224, Asn в положении 228, Ala в положении 231, Ile в положении 232, Val в положении 233, Lys в положении 236, Tyr в положении 238, Thr в положении 250, Thr в положении 251, Val в положении 254, Arg в положении 255, Ser в положении 259, Tyr в положении 267, Gln в положении 270, Asp в положении 279, Asp в положении 282, Asn в положении 283,Lys в положении 286, Ser в положении 293, Ser в положении 297, Ser в положении 299, Ser в положении 300, Gly в положении 301, Ser в положении 303, Asp в положении 304, Ile в положении 309, Ser в положении 311, Thr в положении 312, His в положении 313, Ser в положении 314, Ile в положении 317, Thr в положении 321, Gly в положении 324, Pro в положении 330, Glu в положении 333, Gln в положении 336,Phe в положении 341, Ala в положении 356, Gly в положении 360, Glu в положении 362, Arg в положении 365, Glu в положении 366, Lys в положении 370, Val в положении 371, Gly в положении 372 и Val в положении 373, причем данные положения определяются по отношению к SEQ ID NO: 4. 4. Аспарагиназа по любому из пп.1-3, у которой рН-оптимум находится между рН 6 и 7 и/или у которой удельная активность при рН не менее 5 будет выше по сравнению с удельной активностью аспарагиназы дикого типа из A. niger при измерении в одинаковых условиях. 5. Аспарагиназа по любому из пп.1-4, у которой ширина рН-профиля активности составляет по меньшей мере 3,5, предпочтительно по меньшей мере 4, более предпочтительно по меньшей мере 5 единиц рН. 6. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аспарагиназу по п.5. 7. Последовательность нуклеиновой кислоты, включающая: