Антитела против миостатина и их применение

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента АНТИТЕЛА ПРОТИВ МИОСТАТИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу против миостатина,к фармацевтической композиции, содержащей указанное моноклональное антитело и фармацевтически приемлемый носитель, а также к применению эффективного количества антитела для получения лекарственного средства для повышения мышечной массы или повышения плотности костной массы у индивидуума.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US) 015589 Область изобретения Изобретение относится к области медицины, в частности к области моноклональных антител против миостатина. Более конкретно, изобретение относится к высокоаффинным химерным, гуманизированным антителам или антителам против миостатина человека, которые предпочтительно связываются с миостатином, а не с GDF-11, и к применению антител для лечения, профилактики или диагностики различных заболеваний или состояний у млекопитающих или птиц. Предпосылки создания изобретения Члены суперсемейства белков трансформирующего фактора роста бета (TGF-) вовлечены в эмбриональное развитие и гомеостаз зрелых тканей. Члены суперсемейства TGF- имеют общую структуру, включая пептидную сигнальную последовательность, необходимую для секреции белкового и аминоконцевого фрагмента, который протеолитически отщепляет приблизительно 105-140 аминокислот от карбоксиконца большого белка-предшественника с получением зрелого белка. Зрелый белок характеризуется наличием высококонсервативных цистеиновых остатков, в то время как активная форма зрелого белка представляет собой связанный дисульфидными мостиками гомодимер протеолитически расщепленного пробелка (Gray, A., and Maston, A., Science, 247: 1328, 1990). Миостатин, также известный как фактор дифференцировки роста-8 (GDF-8), является членом суперсемейства белков TGF-. Структура миостатина подобна структуре других членов семейства TGF-. Она содержит гидрофобный аминоконец, который действует как секреторный сигнал, и консервативный домен RSRR, важный для протеолитического процессинга. Расщепление белка приводит к образованию пептида, с которым связана аминоконцевая латентность, и карбоксиконцевого зрелого сигнального пептида, который формирует биологически активный гомодимер. Миостатин в значительной степени экспрессируется в развивающейся и зрелой скелетной мышце и функционирует как отрицательный регулятор скелетной мышцы. Системная сверхэкспрессия миостатина в организме взрослой мыши приводит к мышечному истощению (Zimmers, et al., Science, 296: 1486-1488, 2002), тогда как, наоборот, мыши с нокаутом миостатина характеризуются гипертрофией и гиперплазией скелетной мышцы, что приводит к увеличению мышечной массы в два или в три раза по сравнению с их однопометными мышами дикого типа и к уменьшению накопления жира (McPherron, et al., Nature, 387: 83-90, 1997). Сообщалось, что нокаут мутации миостатина у человека связан мышечной гипертрофией (Scheulke, et al., New Eng. J. Med. 350: 2682, 2004). В настоящее время количество средств для лечения мышечного истощения, а также расстройств или состояний, которые могут быть улучшены посредством увеличения мышечной массы и/или мышечной силы, включая, например, мышечную дистрофию, слабость, атрофию от бездействия и кахексию, а также расстройства, связанные с мышечным истощением, например болезнь почек, сердечную недостаточность или сердечное заболевание и заболевание печени, ограничено. Благодаря своей функции отрицательного регулятора роста скелетных мышц, миостатин является желаемой мишенью для терапевтического или профилактического воздействия при таких расстройствах или состояниях либо для мониторинга прогрессирования таких расстройств или состояний. Кроме своей непосредственной роли в регуляции скелетных мышц, миостатин может быть также вовлечен в другие физиологические процессы,включая преадипоцитозную дифференцировку адипоцитов (Kim et al., BBRC, 281: 902-906, 2001), и, опосредованно, гомеостаз глюкозы (McPherron, A. and Lee S.-J. JCI, 109: 595, 2002) и ингибирование образования кости (Hamrick, M. Mol. Cell Evol. Biol. 272: 388-91, 2003; Hamrick et al., Calcif Tissue Int. 71:63,2002). Поэтому миостатин-специфичные антагонисты, например миостатин-специфичные антитела, могут также быть эффективными для лечения, профилактики или контроля расстройств или состояний, таких как расстройства или состояния, которые можно улучшить путем увеличения костной плотности(например, остеопороз), диабет II типа, метаболический синдром, ожирение и остеоартрит. Миостатин является высококонсервативным у всех видов; аминокислотная последовательность всех зрелых форм миостатина у человека, мыши, крысы, курицы, индюка и коровы имеет 100% идентичность (см. фиг. 2 и 3). Природные мутации миостатина крупного рогатого скота связаны с двойным мышечным фенотипом (McPherron, et al. PNAS, 94: 12457-61, 1997). Поскольку последовательность и функции миостатина являются высококонсервативными у всех видов, то антитело против миостатина является высокоперспективным средством повышения мышечной массы или лечения или профилактики указанных выше расстройств или состояний не только у людей, но и у других млекопитающих, включая,например, домашних животных (например, псовых и кошачьих), спортивных животных (например, лошадей), животных, которые служат источником пищи (например, коров, свиней и овец), и у птиц (например, кур, индюков, уток и другой пернатой дичи и домашней птицы). Фактор дифференцировки роста-11, также называемый GDF-11 или ВМР-11, является членом суперсемейства белков TGF- и является наиболее гомологичным миостатину. Идентичность аминокислотной последовательности зрелых форм миостатина человека и GDF-11 составляет приблизительно 90%; однако GDF-11 экспрессируется в более широком диапазоне тканей, чем GDF-8, включая зубную пульпу, мозг, сердце, почки и легкие, а также мышечную и жировую ткань (Nakashima, et al., Mech. ofDevelopment, 80: 185, 1999). Мыши с нокаутом GDF-11 имеют множественные аномалии и умирают в-1 015589 течение 24 ч после рождения. В частности, у мышей отмечают наличие лишних пар ребер, отсутствие почек и дефекты желудка, селезенки и поджелудочной железы (McPherron et al., Nature Genetics, 22: 260,1999; Esquela and Lee, Dev. Biol. 257: 356, 2003; Harmon et al., Devpt. 131: 6163, 2004). Недавно было обнаружено, что GDF-11 человека управляет темпоральными окнами, на протяжении которых мультипотентные предшественники сохраняют способность продуцировать различные нейральные потомки нервной системы (Kim, J. et al., Science 308: 1927-1930, 2005). Существует терапевтическая необходимость в специфическом ингибировании миостатиновой активности, не ингибируя при этом или минимально ингибируя активность остальных белков суперсемейства TGF-, в частности GDF-11, для того чтобы минимизировать возможность нежелательных побочных эффектов, возникающих при связывании антагониста миостатина с другим белком суперсемействаTGF-. Кроме того, для диагностических целей существует необходимость в антителах против миостатина, которые не имеют перекрестного связывания или оно минимально, с другим белком суперсемейства TGF-, в частности GDF-11, для более правильного мониторинга или определения уровней миостатина в образце. Также существует необходимость в миостатин-специфичных антителах, которые специфически и предпочтительно связываются с миостатином с высокой аффинностью и позволяют, таким образом, минимизировать уровень дозы, что, следовательно, приводит к повышению частоты приема препарата с таким антителом по сравнению с антителом, которое связывается с миостатином с меньшей аффинностью (т.е. большим KD). Антитело с большей аффинностью также является желательным, так как может позволить большую возможность выбора пути введения антитела пациенту, поскольку внутривенный путь введения лекарственного средства является менее желательным, чем, например, подкожный. Также существует потребность в миостатин-специфичных антителах с низкими или другими благоприятными значениями IC50 для анализа биологической активности миостатина для создания терапевтического антитела против миостатина с минимально эффективной терапевтической дозой. Также желательны антитела, специфичные к миостатину, где любой иммунный ответ на антитело, возникающий у пациента, получающего это антитело, сведен до минимума. Настоящее изобретение удовлетворяет эти потребности и обеспечивает связанные с ними преимущества. Краткое описание изобретения Антитела по настоящему изобретению представляют собой химерные, гуманизированные или полностью моноклональные антитела человека против миостатина и их антигенсвязывающие части, которые являются антагонистами или нейтрализуют по крайней мере одну биологическую активность или свойство, связанное с миостатином или его частью, in vitro или in vivo. В одном из вариантов осуществления антитела по изобретению, которые специфически и/или предпочтительно связываются с миостатином, в значительной степени менее реакционноспособны в отношении GDF-11, чем в отношении миостатина, т.е. моноклональное антитело по изобретению связывается с миостатином по крайней мере приблизительно в 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 или 25 раз больше, чем с GDF-11,как измерено с помощью способов, известных в данной области техники, например с помощью конкурентного ELISA, или анализа BIACORE или KINEXA для демонстраций более высокой аффинности (т.е. более низкого KD) антитела к GDF-8, чем GDF-11. Более предпочтительно антитела по изобретению в случае экспрессии в виде Fab не связываются с GDF-11 выше уровней фона в любом анализе связывания,известном в данной области. Предпочтительно антитела по изобретению специфически связываются с миостатином в пределах домена, охватывающего аминокислоты 40-64 [ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA для человека], 43-57 [CSGECEFVFLQKYPH или CSGESEFVFLQKYPH для человека] и/или 45-59[GECEFVFLQKYPHTH для человека] зрелого миостатина, или специфически связываются с полипептидом, состоящим из 40-64, 43-57 и/или 45-59 аминокислот зрелого миостатина. В одном из вариантов осуществления значение IC50 антител по изобретению менее чем или равно приблизительно 25, 20, 16, 14, 10, 9, 6 или 5,2 нМ в in vitro анализе миостатин/репортер SBE (см. пример 6). Предпочтительно такие антитела по изобретению дополнительно отличаются тем, что в значительной степени менее реакционноспособны в отношении GDF-11, чем в отношении GDF-8, т.е. связываются с миостатином по крайней мере приблизительно в 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 или 25 раз больше, чем с GDF-11,как измерено с помощью способов, известных в данной области, например с помощью конкурентногоELISA или анализа BIACORE или KINEXA для демонстрации большей аффинности (т.е. более низкогоKD) антитела к GDF-8, чем GDF-11, и еще более предпочтительно антитела связываются с миостатином в пределах домена, охватывающего аминокислоты 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина, или специфически связываются с полипептидами, состоящими из 40-64, 43-57 и/или 45-59 аминокислот зрелого миостатина. В одном из вариантов осуществления антитела по изобретению отличаются сильным сродством связывания (KD) с миостатином, т.е. менее чем приблизительно 310-8 М, 110-8 M или 110-9 M, предпочтительно менее чем приблизительно 910-10 М, 8,710-10 М или более предпочтительно менее чем приблизительно 810-11 М. Альтернативно, антитела по изобретению характеризуются KD с миостатином, значение которого не превышает приблизительно 310-8 М, 110-8 M или 110-9 M, предпочтительно-2 015589 не превышает приблизительно 8,710-10 М и более предпочтительно не превышает приблизительно 810-11 М. Предпочтительно значения IC50 антител по изобретению, отличающихся сильным сродством связывания, как описано выше, составляют менее чем 25, 20, 16, 14, 10, 9, 6 или 5,2 нМ в in vitro анализе миостатин/репортер SBE и/или являются в значительной степени менее реакционноспособными в отношении GDF-11, чем в отношении GDF-8. Еще более предпочтительно антитела связываются с миостатином в пределах домена, охватывающего аминокислоты 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина,и/или специфически связываются с полипептидом, состоящим из 40-64, 43-57 и/или 45-59 аминокислот зрелого миостатина. В другом варианте осуществления моноклональное антитело против миостатина по изобретению содержит полипептид вариабельного домена легкой цепи ("LCVR") с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-12. В другом варианте осуществления моноклональное антитело против миостатина по изобретению содержит полипептид вариабельного домена тяжелой цепи ("HCVR") с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей изSEQ ID NO: 13-26, 55 и 56. Последовательности, ассоциированные с каждой SEQ ID NO, показаны на фиг. 5-9 описания. В другом варианте осуществления моноклональное антитело по изобретению является антителом,которое может конкурировать за связывание миостатина человека с конкурирующим антителом, как показано в анализе, известном в данной области (например, в конкурентном анализе ELISA), где конкурирующее антитело содержит два полипептида, последовательности которых выбраны из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 5 и 15; (ii) SEQ ID NO: 5 и 16 и (iii) SEQ ID NO: 10 и 26. Предпочтительно антитело по изобретению, которое конкурирует с определенным выше конкурирующим антителом, дополнительно отличается предпочтительным связыванием с GDF-8 по сравнению с GDF-11; еще более предпочтительно антитела связываются с миостатином в пределах домена, охватывающего аминокислоты 40-64,43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина, и/или они специфически связываются с полипептидом, состоящим из 40-64, 43-57 и/или 45-59 аминокислот зрелого миостатина. Предпочтительно антитело по изобретению, которое конкурирует с определенным выше конкурирующим антителом, дополнительно отличается тем, что имеет значение KD с миостатином менее приблизительно 310-8 M, 110-8 M, 110-9 M или 910-10 М, 8,710-10 М или 810-11 М. Предпочтительно антитело по изобретению, которое конкурирует с определенным выше конкурирующим антителом, дополнительно отличается тем, что имеет значениеIC50 менее 25, 20, 16, 14, 10, 9, 6 или 5,2 нМ в in vitro анализе миостатин/репортер SBE. В одном из вариантов осуществления антитело против миостатина по изобретению имеет вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит области CDR со следующими аминокислотными последовательностями: CDRH1(SEQ ID NO: 59), CDRH2 (SEQ ID NO: 60) и CDRH3 (SEQ ID NO: 61) и/или где вариабельный домен легкой цепи содержит области CDR со следующими аминокислотными последовательностями: CDRL1(SEQ ID NO: 57), CDRL2 (SEQ ID NO: 30) и CDRL3 (SEQ ID NO: 58). Моноклональное антитело против миостатина по изобретению может дополнительно содержать константный домен тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE,IgM и IgD, предпочтительно IgG1 или IgG4 человека (или, по существу, человеческого происхождения). Моноклональное антитело против миостатина по изобретению может дополнительно содержать константный домен каппа- или лямбда- легкой цепи человека. Если антитело предназначено для применения в терапии человека, то константный домен имеет, по существу, человеческое происхождение. Если антитело предназначено для терапевтического использования у животного, которое не является человеком,или направлено на яйца животных, которые не являются человеком, то константный домен предпочтительно, по существу, имеет происхождение от животного, у которого антитело предназначено для применения в качестве терапевтического средства. (см., например, Clarkson, С. et al., Mol. Imm. 30: 11951204, 1993; заявка США 2002/01651350 и номера доступа в Genbank X69797, U03778, Х 16701, Х 07174,АВ 016711). В настоящем изобретении рассмотрены различные формы антител. Например, моноклональное антитело против миостатина по изобретению может содержать или состоять из интактного антитела (т.е. полноразмерного, имеющего интактный Fc-участок), по существу интактного антитела, его антигенсвязывающей части (например, Fab, Fab', F(ab')2) или одноцепочечного Fv-фрагмента. Понятно, что все подобные формы антител входят в объем описания и подразумеваются в данном случае под термином "антитело". Дополнительно, антитело по изобретению может быть мечено детектируемой меткой, иммобилизовано на твердой фазе и/или конъюгировано с гетерологичным соединением, например ферментом или молекулой полиэтиленгликоля. Дополнительно, понятно, что антитела по изобретению являются"моноклональными", даже если они могут отличаться характером гликозилирования.-3 015589 В данном описании рассмотрены диагностическое, терапевтическое и профилактическое применения моноклональных антител по изобретению. В одном из диагностических применений изобретение относится к способу определения и/или измерения количества белка миостатина, включающему воздействие антитела против миостатина по изобретению на тестируемый образец, в котором предполагают наличие белка миостатина, и определение специфического связывания антитела с образцом. Антитело против миостатина по изобретению может использоваться для измерения уровней миостатина в тестируемых образцах путем сравнения значений тестируемого образца со стандартной кривой, созданной с помощью связывания указанного антитела с образцами с известным количеством миостатина, используя метод, доступный в данной области, например анализ ELISA. Изобретение также относится к набору,содержащему антитело по изобретению и предпочтительно инструкции по применению антитела для обнаружения белка миостатина, например, в тестируемом образце. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело против миостатина по изобретению. Фармацевтическая композиция по изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. В указанной фармацевтической композиции моноклональное антитело против миостатина по изобретению является активным ингредиентом. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит гомогенную или по существу гомогенную популяцию моноклональных антител против миостатина по изобретению. Композиция для применения в терапии является стерильной и может быть лиофилизированной, предпочтительно укомплектованной соответствующим разбавителем. Изобретение относится к способу ингибирования по крайней мере одной биологической активности миостатина у животного, предпочтительно у видов млекопитающих или птиц, предпочтительно у человека, при необходимости такого ингибирования, включающему введение терапевтически эффективного количества, или профилактически эффективного количества, или миостатин-нейтрализующего или миостатин-ингибирующего количества моноклонального антитела против миостатина по изобретению указанному виду млекопитающих или птиц. Изобретение также относится к способу повышения мышечной массы или лечения или профилактики заболевания или расстройства, улучшение которых может быть вызвано нейтрализацией биоактивности миостатина, который включает введение пациенту (например,человеку), при необходимости такого лечения или профилактики, терапевтически или профилактически эффективного количества моноклонального антитела по изобретению. Одним из вариантов осуществления изобретения является моноклональное антитело против миостатина по изобретению для применения в производстве лекарственного средства для введения млекопитающему, предпочтительно человеку, для лечения, например, слабости, кахексии, связанной с возрастом саркопении, мышечного истощения или слабости мышц, миопатии, мышечной дистрофии, остеопороза,ожирения, ХОЗЛ, почечной недостаточности или заболевания почек, печеночной недостаточности или заболевания печени, сердечной недостаточности или сердечного заболевания, метаболического синдрома и диабета второго типа у млекопитающего, предпочтительно у человека, путем введения указанному млекопитающему терапевтически эффективного или профилактически эффективного количества моноклонального антитела против миостатина по изобретению. Изобретение относится к изделию, содержащему упаковочный материал и антитело по изобретению, которое находится внутри указанного упаковочного материала, где упаковочный материал содержит листок-вкладыш, в котором предпочтительно указано, что антитело специфически нейтрализует или обладает антагонистическим действием в отношении активности миостатина, или снижает уровень миостатина. Необязательно, в листке-вкладыше дополнительно указано, что антитело предпочтительно нейтрализует или обладает антагонистическим действием против активности миостатина по отношению к активности GDF-11 или предпочтительно снижает уровень миостатина относительно снижения уровняGDF-11 путем предпочтительного связывания с миостатином относительно связывания с GDF-11. Изобретение также относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело по изобретению; вектору (или векторам), содержащим нуклеиновую кислоту, необязательно функционально связанную с контрольными последовательностями, которые распознаются клеткой-хозяином, трансформированной вектором; клетке-хозяину, содержащей вектор; способу получения антитела по изобретению, включающему культивирование клетки-хозяина и, таким образом, экспрессию нуклеиновой кислоты, необязательно, выделяя антитело из культуральной среды клетки-хозяина.-4 015589 Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана аминокислотная последовательность промиостатина человека, сигнальная последовательность которого подчеркнута, а часть белка на карбоксиконце, которая образует мономер зрелой формы миостатина, выделена жирным шрифтом. На фиг. 2 показана аминокислотная последовательность мономерного зрелого миостатина человека. Активный миостатин человека является гомодимером такого полипептида, связанным дисульфидными мостиками. Антигенный эпитоп по изобретению подчеркнут. Эта последовательность идентична последовательности зрелого миостатина мыши, крысы, курицы, индюка, собаки, лошади и свиньи. На фиг. 3 показано выравнивание аминокислотной последовательности зрелого миостатина различных видов млекопитающих и птиц. На фиг. 4 показано выравнивание аминокислотной последовательности зрелой формы миостатина человека и GDF-11 человека, где антигенный эпитоп по изобретению подчеркнут, а остатки в антигенном эпитопе, которые различаются у миостатина и GDF-11, выделены жирным шрифтом. На фиг. 5 показано выравнивание аминокислотной последовательности HCVR с каркасным участком VH2-70. Домены CDR выделены жирным шрифтом. На фиг. 6 показано выравнивание аминокислотной последовательности HCVR с каркасным участком VH4-39. Домены CDR выделены жирным шрифтом. На фиг. 7 и 8 показано выравнивание аминокислотной последовательности LCVR с каркасным участком 02. Домены CDR выделены жирным шрифтом. На фиг. 9 показаны аминокислотные последовательности CDR, LCVR и HCVR различных антител по изобретению. На фиг. 10 показана аминокислотная последовательность LCVR различных антител мыши против миостатина, каждое из которых может быть примером родительской молекулы антител по изобретению. См. заявки на патент США 60/559621 и 60/555456, которые приведены в описании в качестве ссылки. На фиг. 11 показана аминокислотная последовательность HCVR различных антител мыши против миостатина, каждое из которых может быть примером родительской молекулы антител по изобретению. См. заявки на патент США 60/559621 и 60/555456. Подробное описание изобретения Изобретение представляет моноклональные антитела против миостатина, способные специфически связываться с миостатином млекопитающих или птиц (белок или зрелый белок или их часть; мономерные или гомодимерные), где антитела дополнительно отличаются тем, что являются химерными, гуманизированными или полностью антителами человека или их антигенсвязывающими частями, способными нейтрализовать, или обладают антагонистическим действием в отношении по крайней мере одной активности миостатина in vitro и/или in vivo; предпочтительно имеют IC50 менее приблизительно 25, 20,16, 14, 10, 9, 6 или 5,2 нМ в анализе миостатин/репортер SBE и/или предпочтительно имеют высокую связывающую аффинность с миостатином. Антитела по изобретению, кроме того, отличаются тем, что связываются с миостатином в пределах домена, охватывающего аминокислоты остатков 40-64 зрелого миостатина (т.е. SEQ ID NO: 53), и значительно менее реакционноспособны в отношении ближайшего гомолога миостатина, GDF-11. Определения Как используется в описании, термин "зрелый миостатин" (см. SEQ ID NO: 2 человека, мыши, крысы, курицы, индюка, собаки, лошади и свиньи) относится к мономерной или гомодимерной форме белка,которая образуется в результате протеолитического расщепления в положении Arg 266 пробелковой формы, состоящей из 375 аминокислот миостатина. Как используется в описании, термин "миостатин" относится к зрелому миостатину. Как используется в описании, термин "промиостатин" или "пробелковая форма миостатина", при использовании относительно белка человека, относится к белку, содержащему последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, в виде мономера или гомодимера. Полноразмерное антитело, в том виде, в котором оно встречается в природе, представляет собой молекулу иммуноглобулина, состоящую из четырех пептидных цепей: двух тяжелых (Н) цепей (приблизительно 50-70 кДа в полноразмерной форме) и двух легких (L) цепей (приблизительно 25 кДа в полноразмерной форме), связанных между собой дисульфидными мостиками. Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельный домен приблизительно из 100-110 или более аминокислот, которые, в первую очередь, отвечают за распознавание антигенов. Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константный домен, в первую очередь отвечающий за функцию эффектора. Легкие цепи разделяют как каппа и лямбда, и они характеризуются конкретным константным доменом, что хорошо известно в данной области. Тяжелые цепи разделяют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, и они определяют изотип антитела, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно, и несколько из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3,IgG4, IgA1 и IgA2. Каждый тип тяжелых цепей отличается конкретным константным доменом, известным в данной области. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов антител хорошо известны в данной области. Каждая тяжелая цепь состоит из N-концевого вариабельного домена тяжелой цепи (в данном случае "HCVR") и константного домена тяжелой цепи. Константный домен тя-5 015589 желой цепи состоит из трех доменов (CH1, CH2 и СН 3) для IgG, IgD и IgA и 4 доменов (CH1, CH2, СН 3 и СН 4) для IgM и IgE. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного домена легкой цепи (в данном случае "LCVR") и константного домена тяжелой цепи, CL. Домены HCVR и LCVR могут быть дополнительно разделены на участки гипервариабельности, названные участками, определяющими комплементарность (CDR), перемежающиеся с более консервативными участками, названными каркасными участками (FR). Каждый HCVR и LCVR состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в следующем порядке от аминоконца к карбоксиконцу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В данном случае 3CDR тяжелой цепи называются "CDRH1, CDRH2 и CDRH3", а 3 CDR легкой цепи называются "CDRL1,CDRL2 и CDRL3". CDR содержат большинство остатков, которые образуют специфические взаимосвязи с антигеном. Распределение аминокислот в каждом домене осуществляют в соответствии с хорошо известными правилами [например, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutesof Health, Bethesda, Md. (1991) или Chothia numbering scheme as described in Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927-948, 1997, см. также интернет-сайт http:www.rubic.rdg.ac.uk/andrew/bioinf.org/abs]. На функциональные возможности антитела связывать конкретный антиген в значительной степени влияют шестьCDR. Термин "антитело" в отношении к моноклональному антителу против миостатина по изобретению(или просто "моноклональное антитело по изобретению"), как используется в данном описании, относится к моноклональному антителу. "Моноклональное антитело", как используется в данном описании, относится к химерному антителу, гуманизированному антителу или полностью человеческому антителу,если не указано иное. Предпочтительно моноклональное антитело по изобретению существует в гомогенной или по существу гомогенной популяции. Моноклональные антитела по изобретению могут быть получены с использованием, например, гибридомных технологий, хорошо известных в данной области, а также рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий или комбинаций этих технологий или других технологий, хорошо известных в данной области. "Моноклональное антитело" относится к антителу, полученному из единой копии или клона, включая, например, любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не к способу его получения. "Моноклональное антитело" может быть интактным антителом (содержащим полный или полноразмерный участокFc), по существу интактным антителом или частью или фрагментом антитела, содержащими антигенсвязующую часть, например фрагмент Fab, фрагмент Fab' или фрагмент F(ab')2 химерного, гуманизированного или антитела человека. Вариабельные домены каждой пары легкой/тяжелой цепи образуют антигенсвязывающие сайты антитела. Таким образом, интактное антитело IgG имеет два сайта связывания. За исключением бифункциональных или биспецифичных антител, два сайта связывания являются одинаковыми. Как используется в данном изобретении, "антигенсвязывающая часть", или "антигенсвязывающий участок", или "антигенсвязывающий фрагмент" используются взаимозаменяемо и относятся к части молекулы антитела в пределах вариабельного домена, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и придающие антителу специфичность и аффинность по отношению к антигену. Антигенсвязывающая часть антитела включает каркасные аминокислотные остатки, необходимые для поддержания соответствующей конформации антигенсвязывающих остатков. Предпочтительно CDR антигенсвязывающего участка или весь антигенсвязывающий участок антител по изобретению имеет мышиное происхождение или по существу мышиное происхождение с определенными аминокислотными остатками, измененными для повышения конкретной активности (см., например, фиг. 9). Предпочтительно каркасные участки антител по изобретению имеют человеческое или по существу человеческое происхождение (по крайней мере на 85, 90, 95, 97 или 99%). В других вариантах осуществления антигенсвязывающий участок или CDR антигенсвязывающего участка могут быть получены из других видов, не являющихся человеком, включая, но ими не ограничиваясь, кроликов, крыс или хомяков. В других вариантах осуществления антигенсвязывающий участок может иметь полностью человеческое или по существу человеческое происхождение с определенными аминокислотными остатками, измененными для повышения конкретной активности, например аффинности или специфичности (см., например, аминокислотные положения на фиг. 9, которые выделены жирным шрифтом и подчеркнуты). Кроме того, "моноклональное антитело", как используется в данном описании, может быть одноцепочечным фрагментом Fv, который может быть получен путем присоединения ДНК, кодирующей LCVR и HCVR, к линкерной последовательности (см., Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p. 269-315, 1994). Понятно, что вне зависимости от того, указаны ли фрагменты или части, термин "антитело", как используется в данном описании, включает такие фрагменты или части, а также одноцепочечные формы. Если белок сохраняет способность к специфичному или предпочтительному связыванию с предназначенной для этого мишенью(например, с эпитопом или антигеном), то он охвачен термином "антитело.""Популяция моноклональных антител" относится к гомогенной или по существу гомогенной популяции антител (т.е. по крайней мере приблизительно 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96%, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 97 или 98% или более предпочтительно по крайней мере 99% антител в популяции будут конкурировать в анализе ELISA за тот же самый антиген или эпитоп). Рамками изобретения охвачены антитела, которые могут быть гликозилированными или негликозилированными. Моноклональные антитела могут быть гомогенными, если они имеют идентичные аминокислотные последовательности, но при этом могут отличаться посттрансляционными модификациями, например характером гликозилирования."Вариант" антитела против миостатина относится в данном описании к молекуле, аминокислотная последовательность которой отличается от аминокислотной последовательности "родительского" антитела против миостатина в силу добавления, делеции и/или замещения одного или нескольких аминокислотных остатков в последовательности родительского антитела. В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит одну или несколько аминокислотных замен в одном или нескольких участкахCDR родительского антитела. Например, вариант может содержать по крайней мере одну (например, от приблизительно одной до приблизительно десяти и предпочтительно от приблизительно двух до приблизительно пяти) замену в одном или нескольких участках CDR родительского антитела. Идентичность или гомологичность относительно вариантной последовательности определена в данном описании как процент аминокислотных остатков в вариантной последовательности, идентичный остаткам родительского антитела после выравнивания последовательностей и введения пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Ни N-концевые, ни С-концевые или внутреннее удлинение, ни делеции или инсерции в последовательности антитела не должны интерпретироваться как влияющие на идентичность или гомологичность последовательности. Вариант сохраняет способность связываться с миостатином и предпочтительно обладает свойствами, превосходящими аналогичные свойства родительского антитела. Например, вариант имеет более сильную аффинность связывания, более низкую IC50 в анализе SBE/репортер или повышенную способность ингибировать биоактивность миостатина. Вариант антитела, представляющий особый интерес, в данном случае представляет собой антитело, проявляющее по крайней мере приблизительно 2-, 5-кратное, предпочтительно по крайней мере приблизительно 10-кратное и более предпочтительно по крайней мере приблизительно 20-,30- или 50-кратное повышение биологической активности по сравнению с родительским антителом."Родительское" антитело в данном случае представляет собой антитело, которое кодируется аминокислотной последовательностью, использующейся для получения варианта. Родительское антитело может иметь каркасный участок мыши, но предпочтительно имеет каркасный участок человека. Родительское антитело может быть мышиным (см., например, фиг. 10 и 11, приведенные в данном описании), химерным, гуманизированным или антителом человека. Термин "специфически связывается", как используется в данном описании, относится к ситуации,когда один участник пары специфического связывания не связывается в значительной степени с другими молекулами, кроме своего партнера(ов) по специфическому связыванию (т.е. перекрестная реактивность составляет менее приблизительно 35, 33, 30, 20 или 10%), как измерено способами, известными в данной области, например конкурентным ELISA или путем нахождения KD с помощью анализа BIACORE илиKINEXA. Термин также используется, если, например, антигенсвязывающий домен антитела по изобретению является специфическим для конкретного эпитопа, который имеется у некоторого числа антигенов, в таком случае специфическое антитело, несущее антигенсвязывающий домен, будет способно к специфическому связыванию с различными антигенами, несущими эпитоп. Таким образом, моноклональное антитело по изобретению специфически связывается с эпитопом, локализованным в пределах аминокислот 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелой формы миостатина. Термин "предпочтительно связывается", как используется в данном описании, относится к ситуации, когда антитело связывается со специфическим антигеном по крайней мере приблизительно в 2, 3, 5,10, 20, 22, 24 или 25 раз больше, чем с другим антигеном, как измерено способами, известными в данной области, например с помощью конкурентного анализа ELISA или путем KD нахождения с помощью анализов BIACORE или KINEXA. Соответственно, моноклональное антитело по изобретению предпочтительно связывается с GDF-8, а не с GDF-11. Аналогично, антитело может предпочтительно связываться с одним эпитопом антигена по сравнению с другим эпитопом того же самого антигена. Термин "эпитоп" относится к части молекулы, которая способна распознаваться и связываться антителом в одном или нескольких антигенсвязывающих участках антитела. Эпитопы, как правило, состоят из химически активных групп молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, а также специфическим зарядом. Под "ингибирующим эпитопом" и/или "нейтрализующим эпитопом" подразумевается эпитоп, который в контексте интактной молекулы (в данном случае миостатина) и при связывании с антителом, специфическим по отношению к эпитопу, приводит к потере или к уменьшению биологической активности молекулы или организма, содержащего молекулу, in vivo или in vitro.-7 015589 Термин "эпитоп", как используется в данном описании, также относится к части полипептида, которая обладает антигенной и/или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно млекопитающего, например у мыши или человека. Термин "антигенный эпитоп", как используется в данном описании, определяется как часть полипептида, с которой может специфически связываться антитело, как определено любым способом, хорошо известным в данной области, например при помощи обычных иммунных анализов. Антигенные эпитопы не обязательно должны быть иммуногенными, но могут быть иммуногенными. "Иммуногенный эпитоп",как используется в настоящем описании, определяется как часть полипептида, которая вызывает антительный ответ у животного, определяемый любым способом, известным в данной области (см., например, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3998-4002 (1983. Выражения "биологическое свойство" или "биоактивность", "активность" или "биологическая активность" в отношении антитела по настоящему изобретению используются в данном описании взаимозаменяемо и включают, но не ограничиваются, эпитоп/антигенную аффинность и специфичность, способность нейтрализовать или усиливать активности миостатина in vivo или in vitro, IC50 в анализе миостатин/репортер SBE или в другом анализе активности in vitro, стабильность антитела и иммуногенные свойства антитела in vivo. Остальные идентифицируемые биологические свойства антитела включают,например, перекрестную реактивность (т.е. с гомологами пептида-мишени, не принадлежащими человеку, или с другими белками или тканями в общем) и способность сохранять высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих. Вышеуказанные свойства или характеристики можно наблюдать, или измерять, или оценивать с использованием методик, известных из уровня техники, включая, но не ограничиваясь, ELISA, конкурентный ELISA, поверхностный плазменный резонанс, анализы нейтрализацииin vitro и in vivo без ограничений, рецепторного связывания, продукции и/или секреции цитокинов или факторов роста, развития анимального полюса Xenopus, передачи сигнала и иммуногистохимию срезов тканей, полученных из различных источников, в том числе от человека, примата или из любого другого источника по необходимости. Термин "активность миостатина", используемый в настоящем описании, относится к одной или более физиологически рост-регулирующим или морфогенетическим активностям, связанным с активным белком миостатина. Например, активный миостатин является отрицательным регулятором скелетной мускулатуры. Активный миостатин также может модулировать продукцию мышечно-специфических ферментов (например, креатинкиназы), стимулировать пролиферацию миобластов и модулировать дифференцировку преадипоцитов в адипоциты. Термин "ингибировать" или "нейтрализовать", используемый в настоящем описании, в отношении активности антитела по настоящему изобретению означает способность, по существу, противодействовать, препятствовать, предотвращать, ограничивать, замедлять, прерывать, элиминировать, прекращать,уменьшать или обращать, например, прогрессирование или тяжесть того, что ингибируют, включая, но не ограничиваясь, биологическую активность или свойство, заболевание или состояние. Ингибирование или нейтрализация предпочтительно составляет по крайней мере примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,90, 95% или больше. Термин "выделенный" при использовании в отношении нуклеиновой кислоты или белка (например,антитела) относится к последовательности нуклеиновой кислоты или белку, которые идентифицированы и отделены по крайней мере от одного контаминирующего вещества, с которым он обычно связан в его природном источнике. Предпочтительно "выделенное антитело" представляет собой антитело, которое,по существу, свободно от других антител, имеющих другие антигенные специфичности (например, фармацевтические композиции по изобретению содержат выделенное антитело, которое специфически связывается с миостатином и, по существу, свободно от антител, которые специфически связываются с антигенами, отличными от миостатина). Термины "нумерация по Кабату" и "обозначение по Кабату" используются в данном описании взаимозаменяемо. Эти термины, известные в данной области, относятся к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е. гипервариабельными), чем другие аминокислотные остатки в вариабельных доменах тяжелой и легкой цепей антитела (Kabat, et al., Ann. NYAcad. Sci. 190: 382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991. Полинуклеотид является "оперативно связанным", если он находится в оперативной связи с другим полинуклеотидом. Например, промотор или энхансер оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности. Пептид является "оперативно связанным" с другим пептидом, когда полинуклеотиды, кодирующие их, являются оперативно связанными, предпочтительно они находятся в одной и той же открытой рамке считывания. Термины "индивидуум", "индивид" и "пациент" в данном описании используются взаимозаменяемо и относятся к животному, предпочтительно млекопитающему (включая непримата или примата), или видам птиц, включая, но не ограничиваясь, мышей, обезьян, людей, млекопитающих - сельскохозяйственных животных (например, коров, свиней, овец), млекопитающих - спортивных животных (например,лошадей) и млекопитающих - домашних питомцев (например, псовых и кошачьих); предпочтительно-8 015589 этот термин относится к людям. Этот термин также относится к видам птиц, включая, но не только, кур и индюков. В конкретном варианте осуществления индивидуум, предпочтительно млекопитающее, предпочтительно человек, дополнительно характеризуется заболеванием, или нарушением, или состоянием,которые могли бы быть улучшены в результате снижения уровня или снижения биоактивности миостатина. В другом варианте осуществления индивидуум, предпочтительно млекопитающее, предпочтительно человек, дополнительно характеризуется наличием у него риска развития нарушения, заболевания или состояния, которые могли бы быть улучшены в результате снижения уровня или снижения биоактивности миостатина. Термин "вектор" включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана, в том числе плазмиды и вирусные векторы, но не ограничиваясь ими. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены, тогда как другие векторы могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина и при введении в клетку-хозияна, таким образом, реплицироваться наряду с геномом хозяина. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы здесь называются "рекомбинантные векторы экспрессии" (или, упрощенно, "векторы экспрессии"), а примеры векторов хорошо известны в данной области. Используемые в данном описании выражения "клетка", "клетка-хозяин", "клеточная линия" и "клеточная культура" используются взаимозаменяемо и включают в себя индивидуальную клетку или клеточную культуру, которая является реципиентом любого выделенного полинуклеотида по настоящему изобретению или любого рекомбинатного вектора(ов), содержащих последовательность, кодирующуюHCVR, LCVR или моноклональное антитело по изобретению. Клетки-хозяева включают в себя потомство одной клетки-хозяина, и потомство не обязательно может быть полностью идентичным (по морфологии или полной комплементарности ДНК) исходной родительской клетке вследствие природных, случайных или преднамеренных мутаций и/или изменений. Клетка-хозяин включает в себя клетки, трансформированные, трансдуцированные или инфицированные in vivo или in vitro одним или более рекомбинантными векторами, или полинуклеотидом, экспрессирующим моноклональное антитело по изобретению, или его легкую или тяжелую цепь. Клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантный вектор по изобретению (либо стабильно встроенный в хромосому хозяина, либо нет), также может называться "рекомбинантной клеткой-хозяином". Предпочтительными клетками-хозяевами для использования в изобретении являются клетки СНО (например, АТСС CRL-9096), NS0 клетки, SP2/0 клетки и COS клетки(АТСС, например, CRL-1650, CRL-1651), HeLa (АТСС CCL-2). Дополнительные клетки-хозяева для использования в изобретении включают растительные клетки, дрожжевые клетки, другие клетки млекопитающих и клетки прокариот. Характеристика антител. Настоящее изобретение относится к выделенным, моноклональным антителам, которые специфически связываются с миостатином с высокой аффинностью. Антитела по изобретению предпочтительно представляют собой химерные, гуманизированные антитела или антитела человека или их антигенсвязывающие части и преимущественно связываются с миостатином в пределах области зрелой формы миостатина, охватывающего аминокислоты 40-64, или более предпочтительно в пределах области зрелой формы миостатина, перекрывающей аминокислоты 43-57 и/или 45-59. Дополнительно, антитела по изобретению нейтрализуют биологическую активность миостатина in vivo или in vitro. Специфическое связывание моноклональных антител против миостатина по изобретению с миостатином позволяет использовать антитела по изобретению в качестве терапевтических и профилактических средств при состояниях, заболеваниях или нарушениях, связанных с миостатином, т.е. состояниях, заболеваниях или нарушениях, при которых является благоприятным снижение уровней миостатина или противодействие или ингибирование биологической активности миостатина. Кроме того, антитела по изобретению могут быть использованы для диагностики или мониторинга состояний, заболеваний или нарушений, при которых может быть полезным изменение уровня или биоактивности миостатина, или для определения уровня миостатина в образце. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к моноклональному антителу против миостатина, которое связывается с миостатином или его часть, с аффинностью связывания (KD) миостатина, приблизительно меньшей или равной 310-8 М, 110-8 М или 110-9 М, предпочтительно менее чем приблизительно 910-10 М, или 8,710-10 М, или 810-11 М. Предпочтительно антитела по изобретению характеризуются значением KD в отношении миостатина не более приблизительно 310-8 М,110-8 М, 110-9 М или 910-10 М и наиболее предпочтительно значением KD в отношении миостатина приблизительно не более 8,710-10 М или 810-11 М. Аффинности антител могут быть определены, как описано в примерах, приведенных ниже, или с использованием любого подходящего способа, имеющегося в уровне техники.-9 015589 В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к моноклональному антителу против миостатина, которое имеет значение IC50, примерно меньшее или равное 25, 20, 16, 14,10, 9, 6, 5,2 нМ или менее в анализе миостатин/репортер SBE in vitro, как описано в приведенных ниже примерах. Такие антитела могут быть дополнительно охарактеризованы KD в отношении миостатина приблизительно не более 310-8 М, 110-8 M, 110-9 М или 910-10 М и наиболее предпочтительно значением KD в отношении миостатина приблизительно не более 8,710-10 М или 810-11 М. Такие антитела могут быть дополнительно охарактеризованы преимущественным связыванием миостатина по сравнению с их способностью связываться с GDF-11, используя любой доступный в данной области способ,например ELISA или конкурентный ELISA, или значения KD измерены, например, с помощью анализаBIACORE или KINEXA. В одном варианте осуществления перекрестная реактивность моноклонального антитела по изобретению составляет примерно менее 35, 33, 30, 28, 25, 23 или 20% (более предпочтительно примерно менее 19-, 18-, 17-, 16-, 15-, 14-, 13-, 12-, 11-, 10-, 9-, 8-, 7- или 6-, еще более предпочтительно примерно менее 5- или 4-процентную перекрестную реактивность) с белком, не являющимся миостатином (таким как,например, GDF-11), или с пептидом, не являющимся миостатином, состоящим по крайней мере из 15, 14,13, 12, 11, 10 или 9 последовательных аминокислот, как измерено с помощью стандартных способов уровня техники, таких как ELISA или конкурентный ELISA анализ, или значения KD измерены, например, с помощью BIACORE или KINEXA. Предпочтительно антитело по изобретению связывается с миостатином по крайней мере в 2, 3, 5,10, 20, 22, 24 или 25 раз больше, чем он связывается с GDF-11, как определено, например, в конкурентном ELISA, BIACORE или KINEXA анализе. Наиболее предпочтительно антитела по изобретению не связываются с GDF-11 на уровнях, превышающих фоновые уровни, при использовании любого анализа связывания, доступного для специалиста в данной области. Моноклональное антитело по изобретению связывается с мономерной или димерной формой миостатина или его частью, содержащей аминокислоты, перекрывающие остатки 40-64, 43-57 и/или 45-59, или зрелый миостатин. Предпочтительно миостатин и GDF-11 полипептид, тестируемые на предпочтительное связывание с антителом по изобретению, оба, являются гомодимерными формами зрелого белка, преимущественно происходящего из млекопитающих или птиц, еще более предпочтительно получены от человека. Однако миостатин и GDF-11 полипептид, тестируемые на предпочтительное связывание с антителом по изобретению, могут представлять собой мономерную форму зрелого белка или форму протеина, или полипептид, содержащий часть зрелого белка, перекрывающую аминокислоты 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелой формы белка. Моноклональные антитела против миостатина по изобретению связываются с антигенным эпитопом, локализация которого была обнаружена в пределах аминокислот 40-64 (SEQ ID NO: 53 для человека) зрелого миостатина, предпочтительно в пределах аминокислот 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина. Кроме того, иммуногенный эпитоп миостатина по изобретению расположен в пределах аминокислот 40-64 зрелого миостатина (SEQ ID NO: 53 для человека), предпочтительно в пределах аминокислот 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина любого вида млекопитающих или птиц. Иммуногенный эпитоп по изобретению также считается антигенным эпитопом. Антигенный эпитоп может иметь дополнительные остатки миостатина вне аминокислот 40-64 зрелого миостатина, но для моноклональных антител по изобретению эти дополнительные остатки не требуются для специфического связывания с миостатином. Кроме того, остатки миостатина вне аминокислот 40-64 могут влиять на конформационную структуру антигенного домена и таким образом изменять связывание антитела по изобретению с антигенным эпитопом. Предпочтительно моноклональные антитела по изобретению, по существу, не реагируют (т.е. не связываются) с GDF-11 по сравнению с уровнем, с которым они связываются с GDF-8. Более предпочтительно моноклональные антитела по изобретению связываются с миостатином по крайней мере в 2, 3, 5,10, 20, 22, 24 или 25 раз больше (т.е. с большей аффинностью или большей специфичностью), чем они связываются с GDF-11, как определено с помощью, например, анализа ELISA или конкурентного анализа ELISA, или значений KD, измеренных в анализах BIACORE или KINEXA. Пептид, состоящий из аминокислот 40-64 (включительно), 43-57 или 45-59 зрелого миостатина, или любой пептид, состоящий из иммуногенного эпитопа, как описано в данном изобретении, может быть использован в качестве иммуногенного пептида, предпочтительно конъюгированного с белкомносителем, например KLH, для получения моноклональных антител по изобретению, используя способы,доступные специалисту в данной области. Предполагается, что остатки цистеина в пределах этих пептидов могут быть заменены остатками серина и сохранить функцию иммуногенного эпитопа. Иммуногенный пептид может быть использован для иммунизации животных, не являющихся человеком, предпочтительно млекопитающих, более предпочтительно мышей. Для полностью антитела человека иммуногенный пептид может быть использован для иммунизации трансгенных линий мышей, у которых генная экспрессия мышиных антител супрессирована и эффективно заменена на генную экспрессию антитела человека. Затем антитела против миостатина выделяют из иммунизированного животного и подвергают скринингу с помощью хорошо известных из уровня техники способов для выделения тех антител, кото- 10015589 рые специфически связываются в пределах области, перекрывающей аминокислоты 40-64 зрелого миостатина, предпочтительно в пределах области, перекрывающей аминокислоты 43-57 и/или 45-59, предпочтительно подвергаемые скринингу, на аффинность связывания примерно менее 310-8 М, 110-8 M или 110-9 M, предпочтительно примерно менее 910-10 М, 8,710-10 М или 810-11 М, и/или подвергают скринингу на IC50, меньшее или равное приблизительно 25, 20, 16, 14, 10, 9, 6, 5,2 нМ или менее в анализе миостатин/SBE in vitro (см. описание анализа в примере 6, приведенном в данном описании). Моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомного способа, хорошо известного в этой области (см., например, Kohler et al., Nature, 256: 495, 1975), или могут быть получены при помощи способов рекомбинантных ДНК (например, как в патенте США 4816567) или других способов, имеющихся в этой области. В общем, гибридому можно получить путем слияния подходящей иммортализованной клеточной линии (например, миеломной клеточной линии, такой как SP2/0) с клетками иммунизированного животного, продуцирующими антитела. Клетки, продуцирующие антитела, предпочтительно представляют собой клетки селезенки или лимфатических узлов, полученные от животных,иммунизированных представляющим интерес антигеном. Слитые клетки (гибридомы) могут быть выделены с использованием селективных условий культивирования и клонированы с помощью предельных разведений. Культуральную среду, в которой выращивают гибридомные клетки, исследуют на продукцию моноклональных антител, направленных против этого антигена. Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, продуцированных гибридомными клетками, определяют с помощью иммунопреципитации или анализом связывания in vitro, такого как радиоиммунный анализ (RIA) или ELISA. Клетки, которые продуцируют антитела с желаемыми характеристиками связывания, могут быть отобраны при помощи подходящего скринингового анализа. Способы такого выделения и скрининга хорошо известны в этой области. Могут быть использованы другие подходящие способы получения или выделения антител, которые связываются в пределах области, перекрывающей аминокислоты 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина, в том числе антитела человека или искусственные антитела, включая, например, способы, в которых отбирают рекомбинантное антитело (например, одноцепочечный Fv или Fab) из библиотеки, или которые основаны на иммунизации трансгенных животных (например, мышей), способных продуцировать набор антител человека (см., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-2555,1993; Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258, 1993; Lonberg et al., патент США 5545806; Surani et al., патент США 5545807). Одноцепочечные антитела и химерные, гуманизированные или приматизированные (CDRпривитые) антитела, а также химерные или CDR-привитые одноцепочечные антитела и подобные им антитела, содержащие части, полученные из различных видов, также охватываются настоящим изобретением и термином "антитело". Различные части этих антител могут быть соединены вместе химически при помощи общепринятых методик, синтетически или могут быть получены в виде смежного белка с использованием методов генной инженерии. Например, нуклеиновые кислоты, которые кодируют химерную или гуманизированную цепь, могут быть экспрессированы для продуцирования смежного белка. См. например, патент США 4816567; европейский патент 0125023 В 1; патент США 4816397; европейский патент 0120694 B1; WO 86/01533; европейский патент 0194276 В 1; патент США 5225539; европейский патент 0239400 В 1 и патенты США 5585089 и 5698762. См. такжеLadner et al., патент США 4946778 и Bird, R.E. et al., Science, 242: 423-426, 1988, в отношении одноцепочечных антител. Кроме того, также могут быть получены функциональные части антител, включая антигенсвязывающие части химерных, гуманизированных антител, или антител человека, или одноцепочечных антител. Функциональные части вышеупомянутых антител сохраняют по крайней мере одну антигенсвязывающую функцию и/или биологическую функцию или биоактивность антитела полной длины, от которого они получены. Предпочтительные функциональные части сохраняют антигенсвязывающую функцию соответствующего антитела полной длины (например, способность связывать зрелую форму миостатина млекопитающего). Особенно предпочтительные функциональные части или фрагменты сохраняют способность ингибировать одну или более функций или биологических активностей, характерных для зрелого миостатина млекопитающих, таких как активность связывания, сигнальная активность и/или стимулирование клеточного ответа. Например, в одном варианте осуществления функциональная часть или фрагмент может ингибировать взаимодействие зрелого миостатина с одним или несколькими его лигандами и/или могут ингибировать одну или более рецептор-опосредованных функций.- 11015589 Части или фрагменты антител, способные связываться со зрелым миостатином или его частью(предпочтительно в пределах аминокислот 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина), включают в себя, но не ограничиваются, фрагменты Fv, Fab, Fab' и F(ab')2 и охватываются изобретением. Такие фрагменты могут быть получены путем ферментного расщепления или с помощью рекомбинатных технологий. Например, расщепление папаином или пепсином может привести к образованию Fab или F(ab')2 фрагментов соответственно. Наименьшим антигенсвязывающим фрагментом является Fv, состоящий изHCVR и LCVR доменов. Фрагмент Fab состоит из HCVR-CH1 и LCVR-CL доменов, ковалентно связанных дисульфидной связью между константными доменами. Для преодоления тенденции нековалентно связанных доменов HCVR и LCVR в Fv диссоциировать при совместной экспрессии в клетке-хозяине может быть сконструирован так называемый одноцепочечный (sc) Fv фрагмент (scFv), в котором гибкий и соразмерно длинный полипептид связывается либо С-концом HCVR с N-концом LCVR или С-концомLCVR с N-концом HCVR. Наиболее часто используемый линкер представлял собой (Gly4Ser)3 пептид из 15 остатков, но из уровня техники также известны другие линкеры. Антитела также могут быть получены в различных усеченных формах с использованием генов антител, в которые один или более стопкодонов были введены выше природным стоп-сайтом. Например, может быть создан химерный ген, кодирующий F(ab')2 часть тяжелой цепи, для включения ДНК последовательностей, кодирующих домен СН 1 и шарнирный участок тяжелой цепи. Было доказано, что отбор фрагментов антител из библиотек при помощи технологий обогащения,таких как фаговый дисплей (Matthews D.J. and Wells J.A. Science. 260: 1113-7, 1993), рибосомный дисплей (Hanes, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95: 14130-5, 1998), бактериальный дисплей (Samuelson P.,et al., Journal of Biotechnology. 96: 129-54, 2002) или дрожжевой дисплей (Kieke M.C., et al., ProteinEngineering, 10: 1303-10, 1997), является удачной альтернативой классической гибридомной технологии(последние обзоры: Little M. et al., Immunology Today, 21: 364-70, 2000). Варианты антител. Мышиное моноклональное антитело или антитело человека (полученное, например, у трансгенных мышей), полученное против иммуногенного эпитопа (аминокислоты 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина) по изобретению или против белка, содержащего иммуногенный эпитоп по изобретению,является родительским антителом. Мышиное родительское антитело может быть дополнительно изменено для создания химерной или гуманизированной формы антитела с использованием способов, хорошо известных в данной области. Такие химерные или гуманизированные антитела могут служить в качестве родительских антител для дальнейших изменений или мутагенеза. Родительские антитела по изобретению могут быть дополнительно подвержены мутагенезу, например, в пределах домена(ов) CDR (см., например, фиг. 9) для создания варианта антитела с оптимизированными свойствами, представляющими интерес, например аффинностью связывания, IC50, специфичностью и т.д. Предпочтительным является вариант антитела с аминокислотной заменой, у которого удален по крайней мере один аминокислотный остаток молекулы родительского антитела и на место которого вставлен другой остаток. Сайты наибольшего интереса для заместительного мутагенеза включают области CDR, но изменения FR также рассматриваются. Предпочтительными являются консервативные аминокислотные замены. Если такие замены приводят к изменению биологической активности антитела, то могут быть внесены более существенные изменения, т.е. неконсервативные аминокислотные замены, и продукты подвергнут скринингу. Пригодным для получения заменяющих вариантов способом является созревание аффинности с использованием фагового дисплея. Кратко, несколько участков CDR области подвергают мутации для получения всех возможных аминокислотных замен в каждом участке. Варианты антител, полученные таким образом, появляются в моновалентном виде из нитевидных фаговых частиц как слияния с продуктом гена III M13, упакованные в каждой частице. Варианты фагового дисплея затем подвергают скринингу на их биологическую активность (например, аффинность связывания, специфичность, IC50), как описано в данном изобретении. Для идентификации участков CDR области, подходящих для модификации, могут быть произведены аланиновые сканирования мутагенов аланином для идентификации остатков CDR области, которые вносят значительный вклад в связывание антигенов. Альтернативно или дополнительно,полезным может быть анализ кристаллической структуры комплекса антиген-антитело для идентификации мест контакта антитела и миостатина. Такие контактирующие остатки и соседние остатки являются кандидатами для замещения в соответствии с методиками, разработанными в данном изобретении или известными в данной области. Альтернативно или дополнительно, может быть проведен неспецифический мутагенез одной или нескольких последовательностей CDR в одном или нескольких положениях остатков либо когда CDR оперативно связан с вариабельным доменом, либо когда CDR не связан с другой последовательностью вариабельного домена, и затем измененный CDR возвращают в вариабельный домен с использованием технологии рекомбинантной ДНК. После того как были получены и экспрессированы такие варианты антител, набор вариантов подвергают скринингу, как описано в данном изобрении, а антитела с лучшими свойствами в одном или нескольких релевантных анализах могут быть отобраны для дальнейшей разработки.- 12015589 Любые цистеиновые остатки, не вовлеченные в поддержание надлежащей конформации антитела против миостатина по изобретению, могут быть замещены в основном серином для улучшения стойкости молекулы к окислению и предотвращения аберрантного перекрестного связывания. Наоборот, к антителу может быть добавлена цистеиновая связь(и) для улучшения его стабильности (в особенности, если антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как фрагмент Fv). Другой тип аминокислотного варианта антитела изменяет исходный профиль гликозилирования антитела. Под изменением подразумевается делеция одной или нескольких углеводных групп, находящихся в антителе, и/или добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в родительском антителе. Гликозилирование антител является либо N-связанным, либо О-связанным. N-связанное гликозилирование относится к присоединению углеводной группы к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидная последовательность аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, являются последовательностями, распознаваемыми при ферментном присоединении углеводной группы к боковой цепи аспарагина. Поэтому присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный участок гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаровN-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего к серину или треонину, хотя также может быть использован 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Добавление сайтов гликозилирования к антителу удобно проводить путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала одну или несколько из вышеописанных трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Изменение может также быть выполнено путем добавления или замены одного или нескольких сериновых или треониновых остатков последовательности исходного антитела (для О-связанных сайтов гликозилирования). Последовательность. Предпочтительное моноклональное антитело по изобретению содержит LCVR, содержащий пептид с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-12, и/или HCVR, содержащий пептид с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13-26, 55 и 56 03-138(см. фиг. 5-9, приведенные в данном описании). Кроме того, моноклональное антитело по изобретению представляет собой антитело, которое конкурентно ингибировано в результате связывания зрелого миостатина человека (или его части) с моноклональным антителом, содержащим два полипептида с последовательностями, показанными в группе, состоящей из (i) SEQ ID NO: 5 и 15; (ii) SEQ ID NO: 5 и 16 и(iii) SEQ ID NO: 10 и 26. Такое конкурентное ингибирование между антителами можно измерить при помощи анализов, хорошо известных специалисту в данной области, например конкурентного анализаELISA. В другом варианте осуществления моноклональное антитело против миостатина по изобретению содержит (i) полипептид LCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-12, и (ii) полипептид HCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13-26, 55 и 56. Предпочтительно антитело, содержащее полипептидSEQ ID NO: 6, дополнительно содержит полипептид HCVR с аминокислотной последовательностьюSEQ ID NO: 14. Предпочтительно антитело, содержащее полипептид LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, дополнительно содержит полипептид HCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21-25 и 56. Предпочтительно антитело, содержащее полипептид LCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, дополнительно содержит полипептид HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 26 или 55. Предпочтительно антитело, содержащее полипептид HCVR с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 55, дополнительно содержит полипептид LCVR с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8-12. Специалисту в данной области техники будет понятно, что антитела по изобретению не ограничиваются конкретными последовательностями HCVR и LCVR, показанными на фиг. 5-9 в данном описании, но также включают в себя варианты этих последовательностей, которые сохраняют антигенсвязывающую способность. Такие варианты могут быть получены из представленных последовательностей,используя методики, известные в данной области и описанные выше. В другом варианте вариантов осуществления антитело против миостатина по изобретению имеет вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит области CDR со следующими аминокислотными последовательностями: CDRH1(SEQ ID NO: 59), CDRH2 (SEQ ID NO: 60) и CDRH3 (SEQ ID NO: 61); и/или где вариабельный домен легкой цепи содержит области CDR со следующими аминокислотными последовательностями: CDRL1(SEQ ID NO: 57), CDRL2 (SEQ ID NO: 30 или 52) и CDRL3 (SEQ ID NO: 58). Предпочтительно CDR тяжелой цепи антитела по изобретению показаны на фиг. 5, 6 или 9, a CDR легкой цепи антитела по изо- 13015589 бретению показаны на фиг. 7, 8 или 9, и CDR находятся в антителе в положении CDR, определенном на фигурах. Например, одно антитело по изобретению имеет CDRL1 с SEQ ID NO: 27, CDRL2 сSEQ ID NO: 47 (как у антитела IC7.1 на фиг. 9). Дополнительно предполагается, что антитело против миостатина по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий область CDRH1 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 36-42, и/или область CDRH2 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных вSEQ ID NO: 43-46, и/или область CDRH3 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 47-51. В другом варианте осуществления антитело против миостатина по изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий областьSEQ ID NO: 27-29, и/или область CDRL2 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 30 или 52, и/или область CDRL3 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 31-35. В предпочтительном варианте осуществления антитело против миостатина по изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий область CDRH1 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 36-42, и/или область CDRH2 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных вSEQ ID NO: 43-46, и/или область CDRH3 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 47-51, и дополнительно содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий область CDRL1 участок с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 27-29, и/или область CDRL2 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 30 или 52, и/или область CDRL3 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 31-35. Структурой, несущей CDR по изобретению, в основном будет последовательность тяжелой или легкой цепи антитела или его значительная часть, в которой расположена CDR в месте, соответствующем CDR природных HCVR и LCVR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Deptof HHS, 1991). Предпочтительно три гипервариабельных домена (CDR) для каждой цепи, легкой и тяжелой, представлены в каркасной области, т.е. в виде смежной последовательности, представленной следующей формулой: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. FR1, FR2, FR3 и FR4 тяжелой цепи или легкой цепи объединяются с образованием полного каркаса при расположении в виде смежной последовательности с CDR в указанном порядке. Помимо последовательностей CDR, LCVR и HCVR дополнительно содержат каркасную последовательность. В гуманизированном антителе, предназначенном для терапевтического использования у людей, каркасная последовательность предпочтительно полностью или по существу происходит от человека (т.е. по крайней мере 85, 87, 90, 92, 95, 96, 97, 98 или 99% происхождение от человека). Предпочтительно каркасная область легкой цепи гуманизированного антитела, антитела человека или химерного антитела по изобретению представляет собой O2, как показано на фиг. 7, состоящий из FR1 сSEQ ID NO: 65, FR2 с SEQ ID NO: 66, FR3 с SEQ ID NO: 67 и FR4 с SEQ ID NO: 68. Предпочтительно каркасная область тяжелой цепи гуманизированного антитела, антитела человека или химерного антитела по изобретению представляет собой VH2-70 или VH4-39, как показано на фиг. 5 и 6 соответственно. Каркас VH2-70 состоит из FR1 с SEQ ID NO: 69, FR2 с SEQ ID NO: 70, FR3 с SEQ ID NO: 71 и FR4 сFR4 с SEQ ID NO: 76. В антителе, предназначенном для использования у животного, не являющегося человеком, последовательность каркасной области может, по существу, происходить из генома человека(предпочтительно используемого у животного, не являющегося человеком, на стадии эмбриона или новорожденного) или из генома животного, у которого он используется терапевтически. В одном варианте осуществления антитело против миостатина по изобретению, в котором весь вариабельный домен или его часть ограничены конкретной последовательностью, показанной здесь посредством SEQ ID NO, дополнительно характеризуется тем, что является химерным, гуманизированным антителом или полностью антителом человека или его антигенсвязывающей частью, которая противодействует или нейтрализует по крайней мере одну активность миостатина in vivo или in vitro. Антитело против миостатина по изобретению, в котором весь вариабельный домен или его часть ограничены конкретной последовательностью, показанной здесь посредством SEQ ID NO, дополнительно характеризуется тем, что оно предпочтительно связывается с GDF-8, а не с GDF-11. Более предпочтительно такие антитела связываются с миостатином по крайней мере приблизительно в 2, 3, 5, 10, 20, 22, 24 или 25 раз больше, чем связываются с GDF-11. Наиболее предпочтительно такие антитела, когда экспрессируются в виде Fab, не связываются с GDF-11 выше фоновых уровней.- 14015589 Антитело против миостатина по изобретению, в котором весь вариабельный домен или его часть ограничены конкретной последовательностью, показанной здесь посредством SEQ ID NO, дополнительно характеризуется (i) связыванием пептида, состоящего из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 53, предпочтительно пептида, состоящего из аминокислотной последовательности,показанной в SEQ ID NO: 62; и/или (ii) наличием IC50, меньшим или равным приблизительно 25, 20, 16,10, 9, 6, 5,7 нМ в анализе миостатин/репортер SBE in vitro; и/или (iii) наличием аффинности связывания(KD) с миостатином приблизительно менее 310-8 М, 110-8 M или 110-9 M, предпочтительно приблизительно менее 910-10 М, или 8,710-10 М, или 810-11 М; альтернативно характеризуется как KD с миостатином не выше, чем приблизительно 310-8 М, 110-8 М, 110-9 М или 910-10 М; более предпочтительноKD не выше приблизительно 8,710-10 М и наиболее предпочтительно KD не выше чем приблизительно 810-11 М. Экспрессия антител. Настоящее изобретение также относится к клеточным линиям, которые экспрессируют антитело против миостатина по изобретению или его часть. Создание и выделение клеточных линий, продуцирующих моноклональное антитело по изобретению, можно осуществить с использованием стандартных методик, известных в данной области. Предпочтительные клеточные линии включают COS, СНО, SP2/0,NS0 и дрожжи (доступное из общественных депозитариев, таких как АТСС, American Type CultureCollection, Manassas, VA). Может быть использован широкий ряд экспрессионных систем хозяев для экспрессии антитела по настоящему изобретению, включая прокариотические (бактериальные) и эукариотические системы экспрессии (такие как дрожжи, бакуловирус, растительные клетки, клетки млекопитающих и клетки других животных, клетки трансгенных животных и гибридомные клетки), а также системы экспрессии фагового дисплея. Примером подходящего бактериального вектора экспрессии является pUC119, а подходящим эукариотическим вектором экспрессии является модифицированный pcDNA3.1 вектор с ослабленной системой селекции DHFR. Остальные системы экспрессии антител также известны в данной области и рассмотрены в данном описании. Антитело по изобретению может быть получено путем рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина в клетке-хозяине. Для рекомбинантной экспрессии антитела клеткухозяин трансформируют, трансдуцируют, инфицируют и т.д. одним или несколькими рекомбинантными векторами экспрессии, несущими ДНК-фрагменты, кодирующие легкие и/или тяжелые цепи иммуноглобулина таким образом, чтобы такие легкие и/или тяжелые цепи экспрессировались в клетке-хозяине. Тяжелая цепь и легкая цепь могут быть экспрессированы независимо от различных промоторов, с которыми они оперативно связаны в одном векторе, или, альтернативно, тяжелая цепь и легкая цепь могут зкспрессироваться независимо от различных промоторов, с которыми они оперативно связаны в двух векторах - один из них экспрессирует тяжелую цепь, а второй - легкую. Необязательно, тяжелая цепь и легкая цепь могут зкспрессироваться в различных клетках-хозяевах. Предпочтительно рекомбинантные антитела секретируются в среду, в которой культивируют клетки-хозяева, из которой эти антитела могут быть выделены или очищены. Стандартные технологии рекомбинатных ДНК используют для получения генов легкой и тяжелой цепей антитела, включения этих генов в рекомбинантные векторы экспрессии и введения векторов в клетки-хозяева. Такие стандартные технологии рекомбинантных ДНК описаны, например, у Sambrook, Fritsch, and Maniatis (Eds.), MolecularProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989. Выделенная ДНК, кодирующая область HCVR, может быть конвертирована в ген тяжелой цепи полной длины путем оперативного связывания HCVR-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные домены тяжелой цепи (CH1, CH2 и СН 3). Последовательности генов константного домена тяжелой цепи человека известны в данной области. См., например, Kabat, et al., Sequences ofPublication No. 91-3242 (1991). Фрагменты ДНК, которые охватывают эти области, могут быть получены,например, с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константный домен тяжелой цепи может быть любого типа (например, IgG, IgA, IgE, IgM или IgD), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) или подкласса и любым его аллотипным вариантом, как описано у Kabat (supra). Альтернативно, антигенсвязывающая часть может быть фрагментом Fab, фрагментом Fab', фрагментом F(ab')2, Fd или одноцепочечным фрагментом Fv (scFv). Для гена фрагмента Fab тяжелой цепи ДНК кодирующая HCVR может быть оперативно связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константный домен тяжелой цепи СН 1.- 15015589 Выделенная ДНК, кодирующая область LCVR, может быть преобразована в ген легкой цепи полной длины (а также в ген Fab легкой цепи) путем оперативного связывания ДНК, кодирующей LCVR, с другой молекулой ДНК, кодирующей константный домен легкой цепи, CL. Последовательности генов константного домена легкой цепи человека известны в данной области. См., например, Kabat, supra. Фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены при помощи стандартной ПЦРамплификации. Константный домен легкой цепи может представлять собой константный домен каппа или лямбда. Для создания гена scFv фрагменты ДНК, кодирующие HCVR и LCVR, оперативно связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующим аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3, таким образом, чтобы последовательности HCVR и LCVR могли экспрессироваться в виде смежного одноцепочечного белка с областями LCVR и HCVR, соединенными гибким линкером. См., например, Bird, et al., Science, 242: 423-6, 1988; Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83,1988; McCafferty, et al., Nature, 348: 552-4, 1990. Для экспрессии антитела по изобретению ДНК кодирующую часть или полную длину легкой и/или тяжелой цепи, полученную, как описано выше, вводят в вектор экспрессии таким образом, чтобы ген был оперативно связан с транскрипционными и трансляционными контрольными последовательностями. Были выбраны вектор экспрессии и контрольные последовательности экспрессии, совместимые с используемой клеткой-хозяином экспрессии. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельные векторы или, чаще, оба гена вставляют в один и тот же вектор экспрессии. Гены антитела вводят в вектор экспрессии стандартными способами. Дополнительно, рекомбинатный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию легкой и/или тяжелой цепи моноклонального антитела против миостатина из клетки-хозяина. Ген легкой и/или тяжелой цепи моноклонального антитела против миостатина может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид является оперативно связанным в рамке с геном аминоконца цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом. Кроме гена(ов) тяжелой и/или легкой цепи антитела, рекомбинантный вектор экспрессии по изобретению несет регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию гена(ов) цепи антитела в клетке-хозяине. Термин "регуляторная последовательность" включает в себя промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), при необходимости, которые контролируют транскрипцию либо трансляцию гена(ов) цепи антитела. Создание вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов,как выбор трансформируемой клетки-хозяина, желаемый уровень экспрессии белка. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих включают в себя вирусные элементы, которые направляют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих,такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV), обезьяньего вируса 40(SV40), аденовируса (например, главного позднего промотора аденовируса (AdMLP и вируса полиомы. Кроме генов тяжелой и/или легкой цепей антитела и регуляторных последовательностей, рекомбинатные векторы экспрессии по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, регулирующие репликацию вектора в клетке-хозяине (например, начало репликации), и один или несколько селектируемых маркерных генов. Селектируемые маркерные гены облегчают отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор. Например, обычно селектируемый маркерный ген придает резистентность к лекарственным средствам, таким как G418, гидромицин или метотрексат, в клетке-хозяине, в которую был введен этот вектор. Предпочтительные селектируемые маркерные гены включают в себя ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для использования в клетках-хозяевах DHFRминус путем селекций метотрексата/амплификацией), ген neo (для отбора G418) и глутаминсинтетазу(GS) в GS-негативной клеточной линии (такой как NS0) для селекции/амплификации. Для экспрессии легкой и/или тяжелой цепей вектор(ы) экспрессии, кодирующий тяжелые и/или легкие цепи, вводят в клетку-хозяин с помощью стандартных технологий, например электропорации,осаждения фосфатом кальция, DEAE-декстран трансфекции, трансдукции, инфицирования и т.п. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела по изобретению либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках-хозяевах, предпочтительными являются эукариотические клетки и наиболее предпочтительными - клетки-хозяева млекопитающих, поскольку такие клетки, наиболее вероятно, собирают и секретируют правильно уложенное и иммунологически активное антитело. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают в себя ооциты китайского хомячка (клетки СНО) (в том числе клетки DHFR-CHO, описанные у Urlaub andChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-20, 1980, используемые с селектируемым маркером DHFR,например, как описано у Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601-21, 1982, NS0 миеломные клетки, COS клетки и SP2/0 клетки. Когда рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, то антитела продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для того, чтобы дать возможность осуществить экспрессии антитела в клетках-хозяевах или более предпочтительно секрецию антитела в культуральную среду, в кото- 16015589 рой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть восстановлены из клетки-хозяина и/или культуральной среды с помощью стандартных способов очистки. Клетки-хозяева также могут быть использованы для получения частей или фрагментов интактных антител, например фрагментов Fab или молекул scFv с применением общепринятых технологий. Квалифицированному специалисту будет понятно, что варианты вышеуказанной методики не выходят за пределы объема настоящего изобретения. Например, может быть желательным трансфектировать клеткухозяина с использованием ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь антитела по изобретению. Также для удаления некоторых или всех ДНК, кодирующих легкую или тяжелую цепь или обе цепи, которые не являются необходимыми для связывания с миостатином, также могут быть использованы технологии рекомбинантных ДНК. Молекулы, которые экспрессируются такими усеченными молекулами ДНК, также включаются в антитела по изобретению. В предпочтительной системе для рекомбинантной экспрессии антитела по изобретению рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий как легкую цепь антитела, так и тяжелую цепь антитела вводят в клетки DHFR-CHO путем, например, трансфекции, опосредованной фосфатом кальция. В рекомбинантном векторе экспрессии каждый ген тяжелой и легкой цепей антитела оперативно связан с регуляторными элементами энхансера/промотора (например, полученными из SV40, CMV, аденовируса и т.п.,таких как регуляторный элемент CMV энхансер/AdMLP промотор или регуляторный элемент SV40 энхансер/AdMLP промотор) для запуска высоких уровней генной транскрипции. Рекомбинантный вектор экспрессии также несет ген DHFR, позволяющий провести отбор СНО клеток, которые были трансфектированы вектором с использованием селекции метотрексата/амплификации. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивируют для возможности осуществить экспрессию легкой и тяжелой цепей антитела и интактное антитело восстанавливают из культуральной среды. Для получения рекомбинатного вектора экспрессии, трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивировирования клеток-хозяев и восстановления антитела из культуральной среды используют стандартные способы молекулярной биологии. Антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению могут быть экспрессированы у животного (например, у мыши), которое является трансгенным для генов иммуноглобулина человека (см., например, Taylor, et al., Nucleic Acids Res. 20: 6287-95, 1992). После экспрессии интактные антитела, их димеры, отдельные легкие и тяжелые цепи или иные формы иммуноглобулина по настоящему изобретению могут быть очищены в соответствии со стандартными способами в этой области, включая осаждение сульфатом аммония, ионообменную аффинную,обратно-фазовую, колоночную хроматографию гидрофобного взаимодействия, гель-электрофорез и т.п. Для фармацевтических целей предпочтительными являются, по существу, чистые иммуноглобулины,имеющие по крайней мере приблизительно 90, 92, 94 или 96% гомогенность, наиболее предпочтительной является гомогенность 98-99% или более. После очистки, частичной или до желаемой степени гомогенности, пептиды могут затем быть использованы в терапевтических либо профилактических целях в соответствии с настоящим изобретением. Химерное антитело. Используемый в данном описании термин "химерное антитело" включает моновалентные, дивалентные или поливалентные иммуноглобулины. Моновалентное химерное антитело представляет собой димер, образованный химерной тяжелой цепью, связанной посредством дисульфидных мостиков с химерной легкой цепью. Дивалентное химерное антитело представляет собой тетрамер, образованный двумя димерами легкая цепь-тяжелая цепь, связанными посредством по крайней мере одного дисульфидного мостика. Химерная тяжелая цепь антитела содержит антигенсвязывающую область, полученную из тяжелой цепи антитела, не принадлежащего человеку, специфичного к миостатину, который оперативно связан по крайней мере счастью константного домена тяжелой цепи человека или по существу человеческого константного домена тяжелой цепи (или видов, которые отличаются от тех, из которых был получен антигенсвязывающий участок). Химерная легкая цепь антитела содержит антигенсвязывающую область, полученную полностью или по существу из легкой цепи антитела, не принадлежащего человеку, оперативно связанного по крайней мере с частью константного домена легкой цепи человека, или по существу человеческого (или видов, которые отличаются от тех, из которых был получен антигенсвязывающий участок) константного домена легкой цепи (CL). Антитела, фрагменты или производные, содержащие химерные тяжелые цепи и химерные легкие цепи с одинаковой или различной специфичностью связывания вариабельного домена, могут также быть получены путем соответствующего связывания отдельных полипептидных цепей в соответствии со стадиями известного способа. Для данного подхода хозяева, которые экспрессируют химерные тяжелые цепи, культивируют отдельно от хозяев, которые экспрессируют химерные легкие цепи, а иммуноглобулиновые цепи восстанавливают отдельно, а затем связывают. Альтернативно, хозяева могут быть культивированы совместно,а цепям дают возможность связываться самопроизвольно в культуральной среде с последующим восстановлением собранного иммуноглобулина или фрагмента. Способы получения химерных антител известны в данной области (см., например, патенты США 6284471; 5807715; 4816567 и 4816397).- 17015589 Гуманизированные антитела. Предпочтительно антитело по изобретению, предназначенное для использования в терапевтических целях, имело бы последовательность каркаса и константного домена (в той мере, в которой она существует в антителе), полученную от млекопитающего, у которого оно было бы использовано в качестве терапевтического средства для того, чтобы снизить вероятность того, что млекопитающее сможет вызвать иммунный ответ на лечебное антитело. Гуманизированные антитела представляют особый интерес, поскольку их считают ценными для применения в терапевтических целях и избежания антительного ответа у человека на мышиное антитело, который часто наблюдается в отношении антител грызунов. Кроме того, в гуманизированных антителах эффекторная часть является человеческой, так что она может лучше взаимодействовать с остальными частями иммунной системы человека (например, разрушать клеткимишени более эффективно посредством комплемент-зависимой цитотоксичности или антителозависимой клеточной цитотоксичности). Также введенные путем инъекции гуманизированные антитела могут иметь период полужизни, больший, чем таковой у природных антител человека, например мышиные антитела, тем самым давая возможность вводить меньшие дозы и с меньшей частотой. Термин "гуманизированное антитело", используемый в данном описании, относится к антителу, содержащему части антител различного происхождения, в котором по крайней мере одна часть имеет человеческое происхождение. Например, гуманизированное антитело может содержать части, полученные из антитела, которое происходит не от человека, с необходимой специфичностью, такого как мышиное антитело, и из антитела человеческого происхождения, соединенных вместе химически при помощи общепринятых способов (например, синтетических) или полученных как смежные полипептиды с использованием методов генной инженерии. Предпочтительно "гуманизированное антитело" имеет CDR, которые происходят из антитела, не принадлежащего человеку (предпочтительно мышиного моноклонального антитела), тогда как каркасная область и константный домен в той мере, в которой они присутствуют (или их значительная, или существенная часть, т.е. по крайней мере приблизительно 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%), кодируются информацией последовательности нуклеиновой кислоты, которая встречается в области иммуноглобулина зародышевой линии человека (см., например, International ImMunoGeneTics Database) или в их рекомбинированных или мутантных формах, вне зависимости от того, продуцируются ли указанные антитела в клетке человека. CDR гуманизированного антитела могут быть оптимизированы из CDR родительского антитела, не являющегося антителом человека, из которого они произошли, для получения желаемых свойств, например специфичности, аффинности и функциональной активности. Оптимизированные CDR могут содержать аминокислотные замены, добавления и/или делеции по сравнению с родительскими CDR. Например, аминокислотные положения в SEQ ID NO: 57, 30, 58, 59, 60 и 61, которые подчеркнуты и выделены жирным шрифтом на фиг. 9, представляют собой положения, которые были оптимизированы из родительских CDR, как показано на фиг. 10 и 11. Однако предполагается, что любое антитело против миостатина, не являющееся антителом человека, (i) индуцированное против пептида,состоящего из последовательности, показанной в SEQ ID NO: 53 или 62, или (ii) индуцированное против пептида, содержащего последовательность, показанную в SEQ ID NO: 53 или 62, и реакционноспособно в отношении пептида, состоящего из последовательности, показанной в SEQ ID NO: 53 или 62, и может служить в качестве родительского антитела, которое может быть преобразовано в гуманизированное или химерное антитело с использованием стандартных способов, доступных в этой области. Гуманизированные формы антител, не являющихся антителами человека (например, мышиных),включают в себя интактное антитело, по существу интактное антитело, часть антитела, содержащую антигенсвязывающий сайт, или часть антитела, содержащую фрагмент Fab, фрагмент Fab', F(ab')2 или одноцепочечный фрагмент Fv. Гуманизированные антитела предпочтительно содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека. Гуманизированные антитела могут также содержать остатки, которые не встречаются ни в реципиентном антителе, ни в импортированном CDR, ни в каркасных последовательностях. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все по крайней мере из одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или, по существу, все аминокислоты в областях CDR соответствуют аминокислотам иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека, а все или по существу все аминокислоты в областях FR являются аминокислотами консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело, оптимально, также содержит по крайней мере часть константного домена иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека [Jones et al., Nature, 321: 522-525(1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)]. Гуманизированные антитела могут быть подвергнуты мутагенезу in vitro с использованием способов, обычно применяемых в этой области (либо при использовании животного, трансгенного для последовательностей Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности каркасной области HCVR и LCVR доменов гуманизированных рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи полученными из последовательностей,относящихся к последовательностям HCVR и LCVR зародышевых линий человека, не могут существовать в природе в наборе антител зародышевых линий человека in vivo. Предполагается, что такие амино- 18015589 кислотные последовательности каркасных областей HCVR и LCVR гуманизированных рекомбинантных антител являются по крайней мере на 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 98% или наиболее предпочтительно по крайней мере на 99% идентичными последовательностям зародышевых линий человека. Предпочтительно такие остатки каркасной области родительского антитела (например, мышиного антитела или, в общем, антитела, из которого получено гуманизированное антитело), которые поддерживают или влияют на структуру сайта связывания, будут оставлены. Такие остатки могут быть идентифицированы, например, при помощи рентгеновской кристаллографии родительского антитела или фрагмента Fab, таким образом идентифицируя трехмерную структуру антигенсвязывающего сайта. Гуманизированное антитело по настоящему изобретению может содержать или может быть получено из каркасной области легкой цепи зародышевой линии человека. В конкретных вариантах осуществления последовательность легкой цепи зародышевой линии человека выбирают из VK последовательностей человека, включая, но не ограничиваясь, А 1, А 10, A11, А 14, А 17, А 18, А 19, А 2, А 20, А 23, А 26,А 27, A3, А 30, А 5, А 7, В 2, В 3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25,L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, O12, O14, O18, O2, O4 и O8. В отдельных вариантах осуществления такую каркасную область легкой цепи зародышевой линии человека выбирают из V1-11, V1-13, V1-16,V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15,V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4 и V5-6. См. РСТ WO 2005/005604, где приведено описание различных последовательностей зародышевых линий. В других вариантах осуществления гуманизированное антитело по настоящему изобретению может содержать или может быть получено из каркасной области тяжелой цепи зародышевой линии человека. В конкретных вариантах осуществления этот каркас тяжелой цепи зародышевой линии человека выбирают из VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5,VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38,VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28,VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1 и VH7-81. См. РСТ WO 2005/005604,где приведено описание различных последовательностей зародышевых линий. В конкретных вариантах осуществления вариабельный домен легкой цепи и/или вариабельный домен тяжелой цепи содержит каркасную область или по крайней мере часть каркасной области (например,содержащую 2 или 3 субобласти, такие как FR2 и FR3). В отдельных вариантах осуществления, по крайней мере, FRL1, FRL2, FRL3 или FRL4 являются полностью человеческими. В других вариантах осуществления, по крайней мере, FRH1, FRH2, FRH3 или FRH4 являются полностью человеческими. В некоторых вариантах осуществления по крайней мере FRL1, FRL2, FRL3 или FRL4 являются последовательностями зародышевой линии (например, зародышевой линии человека) или содержат консенсусные последовательности человека для конкретной каркасной области. В других вариантах осуществления, по крайней мере, FRH1, FRH2, FRH3 или FRH4 являются последовательностями зародышевой линии (например, зародышевой линии человека) или содержат консенсусные последовательности человека для конкретной каркасной области. В предпочтительных вариантах осуществления каркасная область представляет собой каркасную область человека. В общем, гуманизированные антитела могут быть получены путем получения последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих HCVR и LCVR антитела, например мышиного антитела или антитела,полученного из гибридомы, которое связывает эпитоп миостатина по изобретению, идентифицируя CDR в указанных HCVR и LCVR (не принадлежащих человеку) и прививая такие CDR-кодирующие последовательности нуклеиновых кислот в выбранные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие каркасную область человека. Необязательно, область CDR может быть оптимизирована с помощью случайного мутагенеза или мутагенеза в конкретных положениях для замены делеции или добавления одной или более аминокислот в CDR до прививания области CDR в каркасную область. Альтернативно, область CDR может быть оптимизирована после вставки в каркасную область человека, используя способы, доступные специалисту в данной области. Предпочтительно аминокислотные последовательности каркасной области человека выбирают таким образом, чтобы полученное в результате антитело, вероятно, подходило для введения людям in vivo. Это можно определить, например, исходя из предыдущего использования антител, содержащих такую последовательность каркасной области человека. Предпочтительно последовательность каркасной области человека сама по себе не будет в значительной степени иммуногенной. Альтернативно, аминокислотные последовательности каркасных областей антитела, предназначенного для гуманизирования, можно сравнить с последовательностями известных последовательностей каркасной области человека, используемых для прививания CDR и отобранных на основании содержащихся в них последовательностей, в значительной степени подобных последовательностям родительского антитела, например мышиного антитела, которое связывается с миостатином. Были выделены многочисленные последовательности каркасной области человека, а об их последовательностях сообщалось в уровне техники. Это повышает вероятность того, что полученное в результате CDR-привитое гуманизированное антитело, содержащее CDR родительского (например, мышиного) или оптимизированные CDR родительского антитела, привитые в выбранные каркасные области человека (и, возможно также, кон- 19015589 стантный домен человека) в существенной степени сохранят антигенсвязывающую структуру и, таким образом, сохранят аффинность связывания родительского антитела. Для сохранения значительной степени антигенсвязывающей аффинности выбранные каркасные области человека будут предпочтительно такими, которые, как ожидается, подойдут для введения in vivo, т.е. не иммуногенными. В любом из способов получают ДНК последовательности, кодирующие HCVR и LCVR домены предпочтительного мышиного антитела против миостатина. Способы клонирования последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих иммуноглобулины, хорошо известны в данной области. Такие способы могут, например, включать в себя амплификацию иммуноглобулинкодирующих последовательностей, клонируемых с использованием соответствующих праймеров путем полимеразной цепной реакции (ПЦР). О праймерах, подходящих для амплификации последовательностей нуклеиновых кислот иммуноглобулина, в особенности последовательностей мышиных HCVR и LCVR, сообщалось в литературе. После того как такие последовательности, кодирующие иммуноглобулин, были клонированы, они будут секвенированы способами, хорошо известными в данной области. После прививания CDR-кодирующих последовательностей в выбранные последовательности кодирующие каркасные области человека, полученные ДНК последовательности, кодирующие последовательности "гуманизированных" вариабельных тяжелых и вариабельных легких цепей, затем экспрессируют с получением гуманизированного Fv или гуманизированного антитела, которое связывается с миостатином. Гуманизированные HCVR и LCVR могут экспрессироваться как часть целой молекулы антитела против миостатина, т.е. в виде слитого белка с последовательностями константного домена человека, кодирующие ДНК последовательности которого были получены из коммерчески доступной библиотеки или были получены с использованием, например, одного из описанных выше способов получения ДНК последовательностей или способов, известных в данной области. Однако последовательностиHCVR и LCVR также могут экспрессироваться в отсутствие константных последовательностей для получения гуманизированного Fv против миостатина. Тем не менее, слияние последовательностей константных доменов человека в вариабельном домене является потенциально желаемым, так как полученное в результате гуманизированное антитело против миостатина может обладать эффекторными функциями антигена человека. Способы синтеза ДНК, кодирующей белок известной последовательности, хорошо известны в данной области. С использованием таких способов синтезируют ДНК последовательности, кодирующие гуманизированные последовательности HCVR и LCVR пациента (с константными доменами или без них), а затем экспрессируют в векторной системе, подходящей для экспрессии рекомбинантных антител. Это можно осуществить в любой векторной системе, предоставляющей гуманизированные HCVR иLCVR последовательности для пациента, предназначенные для экспрессируемого в виде слитого белка с последовательностями константного домена человека и для объединения с получением функциональных(связывающих антиген) антител или фрагментов антител. Последовательности константного домена человека хорошо известны в данной области, и о них сообщалось в литературе. Предпочтительные последовательности константного домена легкой цепи человека включают каппа- и лямбда-последовательности константного домена легкой цепи. Предпочтительные последовательности константного домена тяжелой цепи человека включают IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека, IgG4 человека и их мутантные варианты, которые обеспечивают измененную эффекторную функцию, например увеличенный период полужизни in vivo, сниженное связывание с рецептором Fc, измененный профиль дезамидирования и т.п. Если таковые имеются, каркасные области человека предпочтительно получают из вариабельного домена антитела человека, имеющего последовательность, подобную последовательности, аналогичной или эквивалентной области антигенсвязывающей области донора (т.е. родительского антитела). Другие источники каркасных областей частей гуманизированного антитела, происходящих от человека, включают вариабельные консенсусные последовательности человека (см., например, Kettleborough, С.A. et al.Protein Engineering, 4: 773-783 (1991); Carter et al., WO 94/04679. Например, последовательность антитела или вариабельного домена, которую используют для получения части, не принадлежащей человеку, может быть сравнима с последовательностями человека, как описано у Kabat et al. Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Fifth Edition, NIH, U.S. Government Printing Office (1991). В особенно предпочтительном варианте осуществления каркасные области цепи гуманизированного антитела получены из вариабельного домена человека, имеющего по крайней мере приблизительно 60% общей идентичности последовательности, предпочтительно по крайней мере приблизительно 70% общей идентичности последовательности и более предпочтительно по крайней мере приблизительно 85% общей идентичности последовательности с вариабельным доменом донора, который не является человеком. Человеческая часть может быть также получена из антитела человека, имеющего по крайней мере приблизительно 65% идентичности последовательности и предпочтительно по крайней мере приблизительно 70% идентичности последовательности с конкретной используемой частью (например, FR), по сравнению с эквивалентной частью (например, FR) донора, который не является человеком.- 20015589 Ссылки, дополнительно описывающие способы, которые могут быть использованы при гуманизации мышиного антитела, представляют собой, например, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 2869,1991; патент США 5693761; патент США 4816397; патент США 5225539; компьютерные программы ABMOD и ENCAD, как описано у Levitt, M., J. Mol. Biol. 168: 595-620, 1983; гуманизация может быть, по существу, проведена в соответствии со способом, описанным Winter и соавторами [Jones et al.,Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)]. Антитела человека. В качестве альтернативы гуманизации могут быть получены антитела человека. Антитела человека могут быть получены с использованием различных способов, известных в данной области, включая библиотеки фагового дисплея. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol.Biol., 222: 581 (1991). Также доступны методики Cole et al. и Boerner et al. для получения моноклональных антител человека. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) иBoerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991). Аналогично, антитела человека могут быть получены путем введения локусов иммуноглобулина человека трансгенным животным, например мышам, у которых эндогенные гены иммуноглобулинов были частично или полностью инактивированы. После иммунизации, например, антигеном, содержащим иммуногенный эпитоп по изобретению, получают полный набор продукции антитела человека, который очень похож на тот, который наблюдается у людей, во всех отношениях, включая перегруппировку генов, сборку и набор антител. Этот подход описан, например, в патентах США 5545807; 5545806; 5569825; 5589369; 5591669; 5625126; 5633425; 5661016 и в следующих научных публикациях: Marks et al., BioTechnology. 10: 779-783, 1992; Lonberg et al., Nature. 368: 856859, 1994; Morrison, Nature. 368: 812-13, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology. 14: 845-51, 1996;and Jobkobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551, 1993. Гены иммуноглобулина человека, введенные мыши, создают, таким образом, трансгенных мышей,способных отвечать на антигены антителами с последовательностями человека, которые также описаны у Bruggemann et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 6709-6713 (1989). Существует несколько стратегий для создания млекопитающих, продуцирующих антитела человека. В частности, существует "минилокусный" подход, в котором локус экзогенного Ig имитирован посредством включения частей (отдельных генов) из локуса Ig (см., например, патенты США 5545807, 5545806, 5625825, 5625126, 5633425,5661016, 5770429, 5789650 и 5814318, 5612205, 5721367, 5789215), YAC введения больших и, по существу, зародышевых фрагментов локусов Ig [см. Mendez et al. Nature Genetics, 15: 146-156 (1997), Green andJakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998)] и введения целых или существенно целых локусов посредством использования микроклеточного слияния (см. европейскую патентную заявку ЕР 0843961 А 1). Для получения антитела против миостатина по изобретению может быть использована любая трансгенная мышь, способная реагировать на иммунизацию антителами, имеющими последовательности человека, с использованием способов, доступных специалисту в данной области, например, когда такую мышь иммунизируют полипептидом, содержащим иммуногенный эпитоп по изобретению. Применение. Антитела по настоящему изобретению применимы в терапевтических, профилактических, диагностических и исследовательских целях, как описано в данном изобретении. Антитело по изобретению может быть использовано для диагностики нарушения или заболевания, связанных с экспрессией миостатина человека. Аналогично, антитело по изобретению может быть использовано в анализе для контроля уровней миостатина у пациента, который получает лечение состояния, связанного с миостатином. Диагностические исследования включают способы, в которых используют антитело по изобретению и метку для детекции миостатина в пробе, например в жидкости организма человека или в клетке, или в тканевом экстракте. Антитела по изобретению могут быть использованы с модификацией или без нее и помечены путем ковалентного или нековалентного присоединения детектируемой группы. Детектируемой группой может быть любая группа, способная продуцировать либо непосредственно, либо опосредованно детектируемый сигнал. Например, детектируемой группой может быть радиоизотоп, такой как, например,3 Н, 14 С, 32 Р, 35S или 125I, флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как флуоресцеин изотиоцианат, родамин или люциферин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или пероксидаза хрена. Может быть использован любой способ, известный в данной области для отдельного конъюгирования антитела с детектируемой группой, включая способы, описанные у Hunter, et al.,Nature. 144: 945, 1962; David, et al., Biochemistry. 13: 1014, 1974; Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40: 219,1981 и Nygren, J. Histochem. And Cytochem. 30: 407, 1982. Ряд общепринятых протоколов для измерения миостатина, включая, например, ELISA, RIA и FACS,известны в данной области и обеспечивают базу для диагностики измененных или аномальных уровней экспрессии миостатина. Нормальные или стандартные значения экспрессии устанавливают при помощи любой методики, известной в данной области, например путем объединения пробы, содержащей полипептид миостатина, например, с антителами в условиях, подходящих для образования комплекса антиген:антитело. Антитело непосредственно или опосредованно метят детектируемым веществом для об- 21015589 легчения выявления связанного или несвязанного антитела. Подходящие детектируемые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, -галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, данзил хлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного вещества включает люминол и примеры радиоактивных веществ включают 125I, 131I, 35S или 3 Н (см., например, Zola,Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987. Количество образованных стандартных комплексов подсчитывают различными способами, такими как, например, фотометрические способы. Количества полипептида миостатина, экспрессируемого у пациента, в контроле и в образцах (т.е. из биопсийных тканей) затем сравнивают со стандартными значениями. Отклонение между стандартными значениями и значениями у пациента устанавливает параметры для корреляции конкретного нарушения, состояния, синдрома или заболевания с определенным уровнем экспрессии (или его отсутствием) для полипептида миостатина. При установлении наличия нарушения, состояния, синдрома или болезни начат протокол лечения,для мониторинга уровня экспрессии миостатина исследования повторяют регулярно. Результаты, полученные в последовательных тестах, используют для того, чтобы показать эффективность лечения на протяжении периода от нескольких дней до нескольких месяцев. Что касается конкретных нарушений (например, слабости или кахексии), то наличие измененного количества миостатина в биопсийной ткани или жидкости (например, сыворотке или моче) от пациента может указывать на предрасположенность к развитию нарушения, состояния, синдрома или заболевания до появления фактических клинических симптомов или может определять популяцию, у которой с большей вероятностью развивается терапевтический ответ на антитело по изобретению. Более точное начальное обнаружение может позволить осуществить более раннее лечение, тем самым предупреждая и/или задерживая дальнейшее прогрессирование болезни или нарушения, связанного с экспрессией миостатина, например мышечного или костного истощения. Для удобства антитело по настоящему изобретению может быть предоставлено в наборе, упакованной комбинации реагентов в заранее определенных количествах с инструкциями по проведению диагностического анализа. Если антитело помечено ферментом, то набор будет включать субстраты и кофакторы, необходимые для этого фермента (например, предшественник субстрата, который обеспечивает детектируемый хромофор или флуорофор). Кроме того, могут быть включены другие вспомогательные вещества, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или лизирующий буфер) и т.п. Относительные количества различных реагентов могут изменяться в широком диапазоне для обеспечения концентраций в растворе реагентов, которые существенно оптимизируют чувствительность анализа. В частности, реактивы могут быть предоставлены в виде сухих порошков, обычно лиофилизированных, включая эксципиенты, которые при растворении обеспечивают раствор реактивов, имеющий соответствующую концентрацию. Терапевтическое применение антител. Миостатин играет роль в развитии мышц и ряде связанных с этим нарушений или заболеваний. У взрослых мРНК миостатина главным образом выявляется в скелетных мышцах, хотя более низкие концентрации также обнаружены в жировой ткани и сердечной ткани (Sharma, М., et al., J. Cell Physiol. 180: 1, 1999). Мыши с нокаутом миостатина имеют в два-три раза большую мышечную массу, чем их однопометные особи дикого типа. Увеличенная мышечная масса является результатом гипертрофии и гиперплазии волокон (McPherron, A., et al. Nature. 387: 83-90, 1997 и Zhu, X. et al., FEBS Letters. 474: 71). Кроме того, мыши с нокаутом миостатина накапливают меньше жира, чем однопометные особи дикого типа, но в остальном выглядят нормальными и здоровыми. Недавно также было показано, что миостатин является важным регулятором адипогенеза (Rebbapragada, A., et al., Mol. and Cell. Bio. 23: 7230-7242, 2003). Кроме того, недавно были исследованы структура и состав костей мышей, имеющих дефицит миостатина(Hamrick M.W., et al., J. Orthopaedic Research. 21: 1025, 2003; Hamrick, M.W., et al., Calcif Tissue Int. 71: 63, 2002. Поэтому фармацевтическая композиция, содержащая антитело против миостатина по изобретению,может быть использована для увеличения мышечной массы, повышения плотности костей, уменьшения мышечного истощения или может быть полезна для лечения или профилактики состояний, при которых наличие миостатина вызывает или вносит вклад в нежелательные патологические эффекты или при которых снижение уровней миостатина оказывает благоприятное терапевтическое действие у млекопитающих, предпочтительно людей, включая, но не ограничиваясь, мышечное истощение, повреждение мышц, хирургическое вмешательство, восстановление пораженных мышц, слабости, возрастную саркопению, атрофию от бездействия, остеопороз, остеоартрит, рост и восстановление связок, ожирение, подавление накопления жира в организме, мышечную дистрофию любого типа, миопатию критического состояния, алкогольную миопатию, кахексию (например, связанную с раком или индуцированную ВИЧ,или возникшую в результате хронического обструктивного заболевания легких, хронического заболева- 22015589 ния легких, восстановления после сепсиса, почечной недостаточности, печеночной недостаточности,сердечной недостаточности или сердечного заболевания), метаболический синдром, послеожоговое мышечное истощение и диабет второго типа. Атрофия от бездействия может быть вызвана множеством причин или случаев, включая любое нарушение, или заболевание, или состояние, которое приводит к длительной неподвижности или бездействию, или постельный режим, включая, но не ограничиваясь,трансплантацию солидных органов, замену суставов, инсульт, повреждения спинного мозга, восстановление после тяжелых ожогов, стационарный хронический гемодиализ, восстановление после сепсиса и воздействия невесомости. Поскольку миостатин имеет высококонсервативную последовательность и функцию у всех видов, антитела по изобретению могут быть использованы для увеличения мышечной массы, повышения плотности костей или лечения или профилактики состояний у млекопитающих, не относящихся к человеку, или птиц [например, домашних животных (например, псовых и кошачьих),спортивных животных (например, лошадей), животных - источников пищи (например, коров, свиней и овец), птиц (например, кур, индюков, остальную пернатую дичь или домашнюю птицу)], у которых наличие миостатина вызывает или вносит вклад в нежелаемые патологические эффекты или снижение уровней миостатина оказывает благоприятный терапевтический эффект. В настоящем описании рассматривается применение моноклонального антитела против миостатина по настоящему изобретению для лечения или профилактики по крайней мере одного из вышеуказанных нарушений, при которых активность миостатина является неблагоприятной или для которых благоприятно снижение уровней биоактивного миостатина. Кроме того, рассматривается применение моноклонального антитела против миостатина по настоящему изобретению для использования в производстве лекарственного средства для лечения по крайней мере одного из вышеуказанных нарушений. Используемый в данном описании термин "лечение", "лечебное воздействие" и т.п. относится к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Этот эффект может быть профилактическим в смысле полной или частичной профилактики заболевания или его симптомов и/или может быть терапевтическим в смысле частичного или полного лечения заболевания и/или неблагоприятных воздействий, сопровождающих это заболевание. "Лечение", как используется в данном описании,включает введение соединения по настоящему изобретению для лечения заболевания или состояния у млекопитающего, в частности у человека, и включает (а) профилактику возникновения заболевания у пациента, который может быть расположен к этому заболеванию, но у которого оно еще не было диагностировано; (b) ингибирование заболевания, т.е. задержку его развития; и (с) облегчение болезни, т.е. вызов регрессии заболевания или нарушения, или облегчение симптомов заболевания или его осложнений. Могут быть установлены режимы дозирования для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, может быть введен один болюс, могут быть введены несколько разделенных доз в течение времени или доза может быть пропорционально снижена или повышена в соответствии с терапевтической ситуацией. Фармацевтическая композиция. Антитело по изобретению может быть включено в фармацевтические композиции, подходящие для введения пациенту. Соединения по изобретению можно вводить отдельно или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или эксципиентами в однократных или многократных дозах. Фармацевтические композиции для введения разработаны таким образом, чтобы соответствовать выбранному способу введения, а фармацевтически приемлемые разбавители, носители и/или эксципиенты, такие как диспергирующие агенты, буферы, поверхностно-активные вещества, консерванты, солюбилизаторы, изотонические агенты, стабилизаторы и т.п. используют соответственно. Указанные композиции разработаны в соответствии с общепринятыми технологиями, приведенными, например, вRemington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, где предоставлен ряд технологий получения лекарственных средств, в общем известных специалистам. Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело против миостатина по настоящему изобретению, может быть введена пациенту, имеющему риск развития или патологические состояния, описанные в данном изобретении, с использованием стандартных способов введения, включая пероральное, внутривенное, интраперитонеальное, подкожное, легочное, трансдермальное, внутримышечное, интраназальное, буккальное, сублингвальное или при помощи суппозиториев. Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно представляет собой "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" антитела по изобретению. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и на протяжении периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может варьировать в зависимости от таких факторов,как состояние болезни, возраст, пол, и массы тела пациента и способности антитела или части антитела вызывать желаемый ответ у пациента. Терапевтически эффективным количеством также является количество, при котором терапевтически благоприятные эффекты антитела преобладают над токсическим или вредным влиянием. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и на протяжении периодов времени, необходимых для достижения желаемого профи- 23015589 лактического результата. Поскольку профилактическую дозу используют у пациентов до заболевания или на ранней стадии, то обычно профилактически эффективное количество может быть меньше терапевтически эффективного количества. Терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество представляет собой,по крайней мере, минимальную дозу, но меньшую, чем токсическая доза активного агента, необходимую для обеспечения терапевтической пользы пациенту. Другими словами, терапевтически эффективным количеством антитела по изобретению является количество, которое у млекопитающих, предпочтительно у людей, увеличивает мышечную массу, повышает плотность костной ткани или оказывает лечебное воздействие на состояния, при которых наличие миостатина приводит к или вносит вклад в нежелательные патологические эффекты или снижение уровней миостатина приводит к благоприятному терапевтическому эффекту у млекопитающих, предпочтительно у людей, включая, но не ограничиваясь, мышечное истощение, повреждение мышц, хирургическое вмешательство, возрастную саркопению, атрофию от бездействия, остеопороз, остеоартрит, рост и восстановление связок, супрессию накопления жира в организме, мышечную дистрофию любого типа, миопатию критического состояния, кахексию (например,связанную с раком или индуцированную ВИЧ или возникшую в результате ХОЗЛ, почечной недостаточности, печеночной недостаточности, сердечной недостаточности или сердечного заболевания), метаболический синдром и диабет второго типа. Атрофия от бездействия может быть вызвана множеством причин или случаев, включая любое нарушение, или заболевание, или состояние, которое приводит к длительной неподвижности или бездействию, или постельный режим, включая, но не ограничиваясь, трансплантацию солидных органов, замену суставов, инсульт, повреждения спинного мозга, восстановление после тяжелых ожогов, стационарный хронический гемодиализ, восстановление после сепсиса и воздействия невесомости. Путь введения антитела по настоящему изобретению может быть пероральным, парентеральным,ингаляционным или местным. Предпочтительно антитела по изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию, пригодную для парентерального введения. Термин "парентеральный", используемый в данном описании, включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или интраперитонеальное введение. Предпочтительной является периферическая системная доставка путем внутривенной, или интраперитонеальной, или подкожной инъекции. Подходящие носители для таких инъекций непосредственно известны в данной области. Фармацевтическая композиция, как правило, должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения в предоставленном контейнере, включая, например, герметично закрытый сосуд или шприц. Следовательно, фармацевтические композиции могут быть стерильно профильтрованы после получения состава либо сделаны микробиологически пригодными иным образом. Характерная композиция для внутривенной инфузии могла бы иметь объем 250-1000 мл жидкости, такой как стерильный раствор Рингера, физиологический раствор, раствор декстрозы и раствор Хенкса и терапевтически эффективную дозу (например, 1-100 мг/мл или более) концентрации антител. Доза может варьировать в зависимости от вида и тяжести заболевания. Как хорошо известно в медицине, дозировки для любого пациента зависят от многих факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст,конкретное соединение, предназначенное для введения, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие лекарства, которые вводят одновременно. Стандартная доза может находиться, например, в диапазоне 0,001-1000 мкг; однако предусмотрены дозы ниже или выше этого примерного диапазона, особенно учитывая вышеуказанные факторы. Ежедневный режим парентерального введения доз может составлять приблизительно от 0,1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг от общей массы тела, предпочтительно приблизительно от 0,3 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг и более предпочтительно приблизительно от 1 мкг/кг до 1 мг/кг, даже более предпочтительно приблизительно от 0,5 до 10 мг/кг массы тела в день. Прогресс можно контролировать путем периодической оценки. Для повторных введений в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение повторяют до достижения желаемого подавления симптомов болезни. Однако полезными могут быть другие режимы дозирования,которые не исключены из данного описания. Желаемую дозировку можно доставлять путем введения единичного болюса, введений многократных болюсов или путем непрерывной инфузии антитела в зависимости от профиля фармакокинетического распада, которого хочет достичь практикующий специалист. Эти предположительные количества антитела во многом зависят от решения терапевта. Ключевым фактором выбора соответствующей дозы и режима введения является получаемый результат. Факторы,рассматриваемые в данном контексте, включают конкретное заболевание, подвергаемое лечению, конкретное млекопитающее, подвергаемое лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, место введения антитела, конкретный тип антитела, способ введения, режим введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Терапевтические агенты по изобретению могут быть заморожены или лиофилизированы для хранения и восстановлены перед применением в подходящем стерильном носителе. Лиофилизация и восстановление могут приводить к потере активности антитела в различной степени. Дозировки могут быть адаптированы для коррекции. В общем, предпочтительным является значение рН от 6 до 8.- 24015589 Готовые изделия. В другом варианте осуществления изобретение относится к готовому изделию, содержащему вещества, используемые для лечения или профилактики нарушений или состояний, описанных выше. Готовое изделие содержит контейнер и метку. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы,шприцы и аналитические пробирки. Контейнеры могут быть сделаны из ряда материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию по изобретению, которая является эффективной для профилактики или лечения нарушения или состояния и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, проницаемую для гиподермальной иглы для инъекций). Активный агент в композиции представляет собой антитело против миостатина по изобретению. Метка на контейнере или присоединенная к нему указывает на то, что композицию применяют для лечения выбранного заболевания. Готовое изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как фосфатно-буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Дополнительно могут быть включены другие вещества, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению. Следующие примеры приведены только в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом. Примеры Пример 1. Анализы ELISA.A. Fab против миостатина преимущественно связывают миостатин, а не GDF-11.Fab против миостатина (или Mab полной длины) по настоящему изобретению анализировали при помощи анализа ELISA, в котором измеряли связывание Fab со зрелым миостатином (димерной формы),нанесенным в различных концентрациях на 96-луночный планшет. Также анализировали связывание Fab с GDF-11. Каждую лунку обеих 96-луночных планшетов покрывают 200 нг/лунку рекомбинантного мышиного миостатина (RD системы, Cat. 788-G8/CF, не содержащие носитель, в карбонатном буфере, рН 9,6) или 200 нг/лунку рекомбинантного GDF-11 человека (Peprotech, Inc., Cat. 120-11, без носителя, в карбонатном буфере, рН 9,6). Планшеты инкубируют при 4C в течение ночи. Лунки аспирируют и дважды промывают промывочным буфером (20 мМ Tris (гидроксиметил)аминометан, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 0,1%Tween-20). Планшеты блокируют 200 мкл блокирующего буфера на каждую лунку (5% растворимого молока фирмы Carnation в вышеуказанном промывочном буфере) в течение 5 ч. Тестируемые Fab или Mab разбавляют в блокирующем буфере при разных концентрациях, например 10, 2, 0,4, 0,08 и 0,016 мкг/мл. 50 мкл каждого раствора Fab добавляют в лунки, покрытые GDF-8 иGDF-11, в двух экземплярах. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки трижды промывают промывочным буфером. АР-конъюгированное вторичное антитело(50 мкл козьего антикаппа АР (Southern Biotech), разбавленного 1:1000 в блокирующем буфере) добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки трижды промывают промывочным буфером. В каждую лунку добавляют по 50 мкл хромогенного субстрата (например, АР субстрата) и оставляют развиваться при комнатной температуре. Поглощение лунок измеряют при оптической плотности 560 нм. Определяют среднее поглощение лунок двух экземпляров. Ожидается, что все антитела по изобретению связываются планшет-связанным зрелым миостатином человека и преимущественно связываются миостатином по сравнению со связыванием с GDF-11. ВGDF-8 простом ELISA Fab C12 имеет значение IC50 0,25 мкг/мл и Fab 510C2 имеет значение IC50 0,27 мкг/мл. В. Гуманизированные оптимизированные антитела против миостатина связываются с пептидом миостатина. В ELISA анализе антитела по изобретению связываются очищенным биотинилированным пептидом с последовательностью, которая перекрывает аминокислоты 40-64 зрелого миостатина человека(SEQ ID NO: 53) за исключением тех, в которых в положении 47 вместо цистеинового остатка находится аминомасляная кислота. Антитела по изобретению также связываются с пептидом, имеющим последовательность, показанную в SEQ ID NO: 62 (с цистеином или серином в положении 47 зрелого миостатина),а также со зрелой формой миостатина в мономерных и димерных формах. В приводимом в качестве примера анализе ELISA 50 мкл раствора козьего антитела против каппацепей человека с концентрацией 1 мкг/мл (UNLB, Southern Biotech. 2060-01) в 50 мМ натрий бикарбонатном буфере, рН 8,0 используют для покрытия каждой лунки титровального микропланшета высокого связывания (Greiner EK 20061). Лунки аспирируют и промывают PBST (PBS, 0,1% Tween), и затем блокируют в течение 1 ч PBST-BSA (PBS, 1% BSA, 0,1% Tween). Затем лунки снова промывают PBST. Все стадии процесса проводят при комнатной температуре. Титрования гуманизированного оптимизированного антитела против миостатина (антитела полной длины, содержащего Fc-область IgG4, транзиторно экспрессированного в 293 клетках), растворенные в PBST-BSA, начиная с 50 нг/лунку, добавляют в лунки, планшет дополнительно инкубируют в течение 1 ч, промывают, как описано выше, и тестируют с- 25015589 50 мкл описанного выше биотинилированного пептида в концентации 50 нМ (разведенного в PBSTBSA). Затем добавляют 50 мкл NeutrAvidin-АР с концентрацией 2 мкг/мл (1:1000 в PBST-BSA, Pierce 31002) и обнаружение осуществляют добавлением АР субстрата в соответствии с инструкцией производителя (Pierce 31002). В качестве контроля используют один буфер. Поглощение определяют при 560 нм.Fab 510C2 и С 12 связываются с пептидом со значениями IC50 6,73 и 5,42 нг на лунку соответственно. Антитела по изобретению способны связываться с пептидом, состоящим из аминокислот 40-64 (SEQ ID NO: 53) зрелого миостатина, и/или с пептидом, содержащим аминокислоты 43-57(SEQ ID NO: 62) зрелого миостатина (аминокислотой с цистеином или серином в положении 47). Однако антитела по изобретению не способны связываться (на уровнях, существенно выше фоновых) с пептидами, состоящими из аминокислот 60-73, 74-86, 87-97, 96-108, 16-29, 1-15 или 30-42 зрелого миостатина. Зрелое антитело, называмое Mab 3 (см. заявки на патент US 60/559621 и 60/555456, включенные в данное описание), содержащее мышиные вариабельные домены (см. фиг. 10 и 11), оперативно присоединенное кFc-области IgG1 мыши, не связывается с пептидами, состоящими из аминокислот 60-73, 74-86, 87-97,96-108, 16-29, 1-15 или 30-42 зрелого миостатина, и является родительским антителом для антител по изобретению. Гуманизированные антитела 510 С 2 и С 12 связываются с пептидами, состоящими из аминокислот 43-57 и 45-59 зрелого миостатина (как показано в табл. 1 ниже) в одинаковой степени. Это демонстрирует то, что эпитоп по изобретению более специфично расположен в пределах пептида, охватывающего аминокислоты 45-57 зрелого миостатина. Связывание незначительно снижается, когда антитела тестируют на связывание с пептидом, состоящим из аминокислот 47-61 зрелого миостатина, демонстрируя важность аминокислот 45-46 зрелого миостатина для связывания или сохранения конформации пептида,которая делает возможным связывание. Связывание дополнительно снижается, когда антитела тестируют на связывание с пептидом, состоящим из аминокислот 49-63 зрелого миостатина, демонстрируя важность аминокислот 47-48 зрелого миостатина для связывания или сохранения конформации пептида, которая делает возможным связывание. Связывание снижается до фоновых уровней, когда антитела тестируют на связывание с пептидом, состоящим из аминокислот 39-53 зрелого миостатина, наводя на мысль о важности участка от остатков 54-57. Таблица 1 Остаток представляет собой С в миостатине. С. ELISA анализ миостатинового гуманизированного оптимизированного Mab. Гуманизированные антитела полной длины против миостатина человека 510 С 2 и С 12 тестировали вELISA анализе, в котором измеряли связывание антитела с антигеном GDF-8, нанесенным на планшет. Также тестировали перекрестную реактивность Mab с GDF-11. Условия отсутствия Mab, контроль изотипов антитела и нерелевантный белок (HGF) использовали в качестве отрицательных контролей. Каждую лунку 96-луночных планшетов покрывают 70 мкл GDF-8 человека (без носителя, 1 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6), рекомбинантного GDF-11 человека (от Peprotech, Inc., Cat. 120-11, без носителя, 1 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6) или рекомбинантного HGF человека (от RDSystems, Cat. 294-HG/CF, без носителя, 1 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6). Планшеты инкубируют при 4 С в течение ночи. Лунки аспирируют и дважды промывают промывочным буфером (20 мМ Tris(гидроксиметил)аминометан, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 0,1% Tween-20). Планшеты блокируют 200 мкл блокирующего буфера на каждую лунку (5% растворимое молоко фирмы Carnation Instant в указанном выше промывочном буфере) в течение 4 ч при комнатной температуре. Планшеты дважды промывали промывочным буфером.Mab разбавляют в блокирующем буфере при концентрациях 1, 0,2, 0,04, 0,008, 0,0016 и 0,00032 мкг/мл. Используют контроль, не содержащий Mab, который состоит только из блокирующего буфера. Контроль изотипов антител также используют в качестве отрицательного контроля в концентрации 1 мкг/мл. Затем по 50 мкл каждого раствора Mab добавляют в лунки, покрытые GDF-8 и GDF-11, в двух повторениях. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки трижды промывают промывочным буфером. Затем по 50 мкл вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой (козье против IgG HRP человека, фрагмент, специфичный к Fc-гамма, Jackson ImmunoResearch, Cat. 109-035-008), разведенный 1:2000 в блокирующем буфере, добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки трижды промывают промывочным буфером. Затем в каждую лунку добавляют- 26015589 по 50 мкл хромогенного субстрата (например, OPD субстрат) и оставляют для развития при комнатной температуре в течение 2,5 мин. Рекцию останавливают добавлением 100 мкл 1N HCl в каждую лунку. Поглощение лунок определяют при 490 нм. Определяют среднее поглощение лунок двух повторений и эти значения представлены в табл. 2. Эти данные демонстрируют, что Mab 510C2 и С 12 связываются с миостатином, связанным на планшете. Что касается специфичности, то эти Mab преимущественно связываются с GDF-8, а не GDF11. Mab 510C2 показывает приблизительно 25-кратное увеличение связывания с миостатином (GDF-8) по сравнению с GDF-11. Mab C12 показывает приблизительно 5-кратное увеличение связывания с миостатином по сравнению с GDF-11. Таблица 2 Кроме того, в ELISA было показано, что Mab C12 полной длины не связывается с другими представителями суперсемейства TGF-: ВМР-2, ВМР-3, BMP-3b/GDF-10, ВМР-4, ВМР-7, ВМР-8 В, Активином А, Активином В, TGF-, TGF-1, TGF-2 и GDF-3; оно продемонстрировало минимальное связывание с ВМР-5. Предполагается, что другие антитела против миостатина по изобретению подобным образом не связываются или минимально связываюся с этими другими представителями суперсемейства TGF-. Пример 3. Анализ нейтрализации миостатина. Эктодермальные эксплантаты удаляют на стадиях 8-9 бластулы эмбрионов Xenopus при помощи стандартных процедур и культивируют в 0,5 MBS (1 MBS: 88 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 0,7 мМ CaCl2, 1 мМMgSO4, 5 мМ HEPES, 2,5 мМ NaHCO3, 1:1000 об./об. гентамицина, 0,1% бычьего сывороточного альбумина) с добавлением фактора роста (GDF-8 или GDF-11) плюс или указанного в течение 18 ч при 18 С,за это время контрольные эмбрионы достигли стадии ранней нейрули (стадия 15-16). Эксплантаты фотографировали, а длину каждого эксплантата измеряли с использованием алгоритма визуального анализа,разработанного для количественного анализа анимального полюса. Эксплантаты не обрабатывали ни фактором роста, ни Fab (контроли), введенного в шары эпидермиса. Миостатин и GDF-11 стимулируют мезодерму в этих эктодермальных эксплантатах, что приводит к элонгации эксплантатов и формированию гантелеобразных структур. Антитела, или Fab, при анализе на нейтрализующую активность добавляют в культуральную среду, содержащую миостатин на протяжении всего периода культивирования, и оценивают их способность ингибировать движения элонгации, индуцированные фактором роста. Миостатин добавляют к эксплантатам в концентрации 25 нг/мл. Тестируемые антитела, или Fab, добавляют в концентрации 20 мкг/мл. Fab, полученный на нерелевантный антиген, используют в качестве контроля. Коммерчески доступные моноклональные антитела против мышей могут быть проанализированы в качестве контроля, это антитело продуцируется у коз, иммунизированных очищенным мышиным GDF-8, и производителем показано, что оно нейтрализует элонгацию анимальных полюсов Xenopus, вызванного 25 нг/мл мышиного GDF-8 при наличии в концентрациях приблизительно 10-20 мкг/мл (RD SystemsCat. МАВ 788). Для обработки изображений используют ImagePro (v4.5.1.22, от Media Cybernetics). Для автоматизации обработки изображений записывали макрос. Макрос обрабатывает изображение и записывает длину в битах. Могут быть использованы альтернативные способы измерения, известные в данной области. Ожидается, что антитела по изобретению нейтрализуют активность GDF-8 в анализе анимальных полюсов и не обладают нейтрализирующей активностью в отношении GDF-11. Пример 4. Измерение аффинности Fab. Аффинность (KD) и величины kon и koff Fab против миостатина по настоящему изобретению измеряют с использованием прибора BIAcore 2000, содержащего сенсорный чип СМ 4. BIAcore использует оптические свойства поверхностного плазмонного резонанса для детекции изменений концентраций белков молекул, которые взаимодействуют в декстрановой биосенсорной матрице. Кроме случаев, когда отмечено иное, все реагенты и материалы приобретены у BIAcore AB (Upsala, Sweden). Все измерения проводят при 25 С. Образцы, содержащие Fab, растворяют в буфере HBS-EP (150 мМ хлорида натрия,- 27015589 3 мМ EDTA, 0,05% (мас./об.) поверхностно-активного вещества Р-20 и 10 нМ HEPES, рН 7,4). Миостатин или GDF-11 (RD Systems) иммобилизируют в проточных ячейках чипа СМ 4 с использованием химии связывания аминов. Проточные ячейки (1-4) активируют 1:1 смесью 0,1 М N-гидроксисукцинимида и 0,1 М 3-(N,N-диметиламино)пропил-N-этилкарбодиимида со скоростью потока 20 мкл/мин. Миостатин или GDF-11 (2,5 мкг/мл в 10 мМ ацетата натрия, рН 4,5) вручную впрыскивали в отдельные проточные ячейки со скоростью потока 10 мкл/мин. Плотность поверхности контролировали, пока каждая проточная ячейка не достигла плотности поверхности 150 единиц реакции (RU). Поверхности блокировали 50 мкл инъекцией 1 М этаноламин-HCl, рН 8,5 (10 мкл/мин). Для обеспечения полного удаления любого нековалентно связанного миостатина или GDF-11 дважды впрыскивали 15 мкл 10 мМ глицина, рН 1,5. Для кинетических экспериментов использовали проточный буфер, содержащий 10 мМ HEPES, рН 7,4,150 мМ NaCl, 0,005% Р 20. Сбор данных о кинетическом связывании проводят при максимальной скорости потока(100 мкл/мин). Каждый аналитический цикл состоит из:(i) инъекции 250 мкл Fab (диапазон концентраций составлял 50-0,4 нМ при двукратных возрастающих разведениях) во все 4 проточные ячейки, а проточную ячейку 1 использовали в качестве эталонной;(iii) регенерации поверхности GDF-8 или GDF-11 при помощи двух 15 мкл инъекций 10 мМ глицина, рН 1,5;(iv) 15 мкл холостой инъекции проточного буфера и(v) 2-минутного периода стабилизации перед началом следующего цикла. Мониторинг сигнала проводили в виде: проточная ячейка 2 минус проточная ячейка 1, проточная ячейка 3 минус проточная ячейка 1 и проточная ячейка 4 минус проточная ячейка 1. Образцы и буферную холостую пробу вводили путем инъекций дважды в произвольном порядке. Данные обрабатывали при помощи программного обеспечения SCRUBBER (Center for Biomolecular Interaction Analysis,Univ. of Utah). Скорости ассоциации и диссоциации для каждого цикла определяют путем аппроксимации биосенсорных данных на модель простой ассоциации, используя ClampXP (Center for BiomolecularInteraction Analysis, Univ. of Utah), для получения констант скорости kon и koff; константу равновесного связывания Kd рассчитывают с использованием уравнения Kd=koff/kon. Данные по аффинности,измеренные в отношении связывания миостатина с 510 С 2 Fab, представляют собой следующее:kon - 5,4105 М-1 с-1, koff - 4,6710-4 с-1 и Kd (выч.) - 0,87 нМ. Связывания GDF-11 с 510 С 2 Fab не наблюдалось. Пример 5. Измерение аффинности Mabs. Измерения аффинности связывания для моноклональных антител полной длины по изобретению проводили с использованием анализа Sapidyne KINEXA. NHS-активированные высокочувствительные сефарозные бусы (GE Healthcare) предварительно покрывают антителом по изобретению (50 мкг антитела против миостатина на 1 мл бус) и блокируют с помощью 10 мг/мл BSA в 1 М Tris-HCl, pH 8,0. Затем 20 и 50 пМ антитела по изобретению инкубируют с различными концентрациями (например, 2,4 пМ-20 нМ, серийных разведений) миостатина в проточном буфере (PBS, 0,005% (об./об.) Tween-20 и 1 мг/мл яичного альбумина) в течение 10 ч при комнатной температуре. Для определения несвязанного антитела,находящегося в равновесном состоянии, каждый образец пропускали через бусы, покрытые миостатином. Количество антитела, связавшегося с бусами, затем количественно определяли путем пропускания раствора козьего антитела против Fc человека, меченного флуоресцеином (Су 5) (Jackson ImmunoResearch), разведенного 1:4000 в проточном буфере, через бусы. Измеренный флуоресцентный сигнал пропорционален концентрации несвязанного антитела при равновесии. Каждую концентрацию миостатина измеряют дважды. Равновесную константу диссоциации (KD) получают по методу нелинейной регрессии конкурентных кривых с использованием составной кривой для модели односайтного гомогенного связывания (программное обеспечение KINEXA) и данные представлены с интервалами надежности (CI) 95%. Константу скорости ассоциации (kon) для связывания GDF-8 также определяют с использованием анализа Sapidyne KINEXA. 20 пМ антитела перемешивают с 1 нМ GDF-8 с использованием тех же условий, что описаны выше. В разные моменты времени образцы зондируют для выявления несвязанного антитела с использованием условий, описанных выше для равновесного связывания, а затем результирующую временную зависимость аппроксимируют с использованием программного обеспеченияKINEXA для определения скорости ассоциации (kon). Константу скорости диссоциации (koff) рассчитывают с использованием выражения koff=Kdkon. 510C2 и С 12 полной длины (оперативно связанные с Fc-областью IgG4) измеряют с использованием описанного анализа, результаты которого приведены в табл. 3. Пример 6. Анализ миостатин/репортер SBE. В этом репортерном анализе плазмида, кодирующая репортерный ген, т.е. ген люциферазы, ниже элемента связывания SMAD ("SBE"), более конкретно (CAGA)12, экспрессирует белок люциферазы, когда молекула, такая как миостатин, GDF-11, или другой представитель суперсемейства TGF- связывается с собственным рецептором, тем самым запуская сигналы SMAD, что приводит к образованию фосфорилированного комплекса SMAD, способного связываться с SBE. Ранее сообщалось, что последовательность CAGA является TGF- реактивной последовательностью в промоторе TGF- индуцированного гена PAI-1 (Denner et al., EMBO J., 17: 3091-3100, 1998). Количество активного миостатина, подверженного воздействию клеток, прямо пропорционально количеству образованного люциферазного фермента,которое прямо пропорционально количеству полученного и измеряемого света. Наличие ингибитора (например, антитела, которое связывается с миостатином) уменьшает количество миостатина, способного активировать SBE, что в конечном счете приводит к уменьшению образования света. Этот анализ также описан в международной публикации WO 2004/037861, которая включена в данное описание в качестве ссылки. Также предполагается, что анализ миостатин/репортер SBE не должен быть ограничен точными условиями, описанными в данном изобретении, могут быть использованы и другие типы клеток, например клетки 293HEK (АТСС) или клетки А 204 рабсомиосаркомы (см., например, Whittemore, et al., BBRC,200: 965-71, 2003); могут быть использованы другие виды репортеров, например CAT, -gal, GFP, и другие условия выращивания клеток и условия анализа, включая использование различных количеств миостатина в реакции. Специалист в данной области легко сможет различить, подпадает ли анализ под объем анализа миостатин/репортер SBE, он сможет для этого воспользоваться вектором, содержащим элемент SBE выше репортерного генома, введенного в клетку-хозяин, где использующий элемент SBE является чувствительным к SMAD, полученному в результате реакции связывания миостатина с рецептором миостатина. R.S. Thies, et al., Growth Factors, 18: 251-259, 2001 описывает аналогичный анализ, в то время как Wittemore, L. et al., BBRC, 300: 965-971, 2003 описывает ответ элемента SBE на SMAD, полученный в результате реакции связывания миостатина с его рецептором. В этом анализе клетки 293 Е (Edge Biosystems) в среде DMEM/F12 (3:1) (Gibco 93-0152DK), 10%FBS, 20 мМ HEPES, 4 мМ L-глутамина засевают в количестве приблизительно 25000 клеток на лунку в покрытые внутри полилизином лунки 96-луночного планшета (BD Biocoat 35-4461) и инкубируют в течение ночи при 37 С. На следующий день клетки промывают PBS и в каждую лунку добавляют по 50 мкл OptiMEM I (Gibco 31985-070). Клетки трансфектируют 50 мкл следующей SBE-люциферазной ДНК смесью: (i) 80 мкл липофектамина (Gibco 11668-019) объединяют с 1,5 мл OptiMEM и оставляют стоять в течение 5 мин, затем добавляют в (ii) пробирку, в которой 20 мкг SBE-люциферазной ДНК объединяют с 1,5 мл OptiMEM и 200 мкл реактива Plus, перемешивают и оставляют на 5 мин. После добавления двух смесей вместе раствор энергично перемешивают и оставляют стоять в течение 30 мин перед добавлением по 50 мкл в каждую лунку. Затем клетки инкубируют в течение ночи при 37 С в 5% CO2. Для каждого планшета с клетками, 5 мл миостатина (RD Systems 788-G8) разбавляют до концентрации 20 нг/мл в полной среде. Каждое тестируемое антитело по изобретению титровали в полной среде, т.е. приблизительно от 40 мкг/мл приблизительно до 50 нг/мл. Трансфекционную среду удаляют из лунок и добавляют в каждую лунку по 50 мкл разведенного антитела и по 50 мкл GDF-8 (миостатин) или GDF-11(RD Systems). Планшет с клетками затем инкубируют в течение ночи при 37 С в 5% CO2. На следующий день среду аспирируют, клетки промывают PBS и добавляют 75 мкл лизирующего буфера (PromegaE266A). Люциферазную активность измеряют в клеточном лизате, используя Luciferase Reagent в соответствии с инструкцией производителя (Promega E2620). Строили график зависимости люминесценцииIC50 (из среднего двух испытаний) 5,15 нМ (5,74 и 4,57 нМ) и 16,07 нМ (23,04 и 9,12 нМ) соответственно. Ни Mab 510C2, ни С 12 не демонстрируют нейтрализующую активность в этом анализе при тестировании с GDF-11 вместо GDF-8.