Человеческие моноклональные антитела против cd25 и их применение

013677 Предпосылки создания изобретения Высокоаффинный рецептор интерлейкина-2 (IL-2R) представляет собой гетеротримерный рецептор клеточной поверхности, состоящий из ,и c-полипептидных цепей (KD 10-11 М). -Цепь 55 кДа, также известная как IL-2R, CD25, р 55 и антиген Тас (активации Т клеток, Т-клеточной активации), является уникальной для IL-2R. Цепи(CD122; Р 75) и c (CD132) являются членами суперсемейства рецепторов цитокинов (рецепторы гемопоэтина) и функциональными компонентами других рецепторов цитокинов,таких как IL-15R (Waldmann (1993) Immunol. Today 14(6):264- 70; Ellery et al. (2002) Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 27-40). Рецептор промежуточной аффинности представляет собой димер, состоящий из и c-цепи (KD 10-9 М), тогда как рецептор низкой аффинности состоит из мономерной -субъединицы,которая не способна к сигнальной трансдукции (KD 10-8 М) (Waldmann (1993) Immunol. Today 14(6): 26470). Покоящиеся Т клетки, В клетки и моноциты экспрессируют мало молекул CD25. Однако, при активации рецептор быстро транскрибируется и экспрессируется (Ellery et al. (2002) Cytokine Growth FactorRev. 13(1): 27-40; Morris et al. (2000) Ann. Rheum. Dis. 59 (Suppl. 1) i109-14). Клетки, экспрессирующие высокоаффинный IL-2R, экспрессируют CD25 (CD25-субъединица) в избытке, который приводит к профилям связывания как высоко-, так и низкоаффинного IL-2 (Waldmann et al. (1993) Blood 82(6): 1701-12;de Jong et al. (1996) J. Immunol. 156(4): 1339-48). CD25 экспрессируется Т клетками с высокими уровнями при некоторых аутоиммунных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, склеродермия и увеит, а также кожные заболевания, например псориаз и диффузный нейродермит, и различные лимфоидные опухоли, например Т-клеточный лейкоз и болезнь Ходжкина (Waldmann (1993) Immunol. Today 14(6): 264-70; Kuttler et al. (1999) J. Mol. Med. 77(1):226-9). Помимо этого, экспрессия CD25 ассоциируется с отторжением аллотрансплантата и гомологичной болезнью (реакция трансплантат против хозяина) (Joneset al. (2002) J. Immunol. 168(3):1123-1130; Anasetti et al. (1994) Blood 84(4): 1320-7). Следовательно, CD25 является важной мишенью для опосредованной антителом терапии ("антительная" терапия), например, для уменьшения воспаления при аутоиммунных заболеваниях, лечения опухолей и предупреждения отторжения трансплантата. Однако, несмотря на то, что полученные результаты и современный клинический опыт чтко продемонстрировали, что CD25 является полезной мишенью для иммунотерапии, они также показывают, что современные мышиные и химерные антитела не являются идеальными терапевтическими агентами. Таким образом, существует необходимость в дополнительных терапевтических антителах против CD25, эффективно действующих для предупреждения и/или лечения ряда заболеваний, включающих клетки, экспрессирующие CD25. Сущность изобретения Настоящее изобретение охватывает новую "антительную" терапию для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с клетками, экспрессирующими CD25, включая, среди прочих, отторжение трансплантата органа, тканевого и клеточного трансплантата, в том числе отторжение аллотрансплантата и ксенотрансплантата, гомологичную болезнь, аутоиммунные заболевания, воспалительные и гиперпролиферативные кожные заболевания и лимфоидные опухоли. Антитела, охватываемые изобретением, имеют преимущество в том смысле, что они являются полностью человеческими и, следовательно, потенциально менее иммуногенными для пациентов. Также антитела имеют преимущество,основанное на их улучшенных функциональных (например, терапевтических) качествах. Как показано в данном описании, человеческие антитела по изобретению связываются с CD25, как показано методом ELISA и проточной цитометрией. Как правило, человеческие антитела по изобретению связываются с CD25 с константой равновесной диссоциации (KD) около 10-8 М или ниже, с такой как 10-9 М или ниже, 10-10 М или ниже, или 10-11 М или даже ниже, по определению методом плазмонного поверхностного резонанса (SPR) на прибореBIAcore 3000 с применением рекомбинантного человеческого IL-2R в качестве лиганда и антитела в качестве аналита. Как правило, такие антитела не реагируют перекрстно с родственными антигенами клеточной поверхности и не ингибируют их функцию. Помимо этого, человеческие антитела по настоящему изобретению ингибируют (например, блокируют) взаимодействие CD25 с его лигандом, IL-2. Например, связывание можно ингибировать по меньшей мере примерно, на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100%. Примеры клеток, которые экспрессируют CD25 и, следовательно, клеточную функцию которых можно ингибировать с помощью человеческих антител по данному изобретению, включают, среди прочих, Т клетки, В клетки и моноциты. Например, как показано в данном описании, человеческие антитела по изобретению могут ингибировать связывание IL-2 с CD25. Такое ингибирование связывания IL-2 с CD25 попутно ингибирует различные клеточные механизмы, индуцированные связыванием IL-2. Как также показано в данном описании, человеческие антитела по изобретению могут ингибировать индуцированную антителом против CD3 Тклеточную пролиферацию в зависимости от дозы. Как также показано в данном описании, человеческие антитела по изобретению могут ингибировать смешанную реакцию лимфоцитов (MLR) в зависимости от дозы. Ингибирование пролиферации в таких экспериментах можно контролировать по уменьшению аккумуляции клеточной массы, измеряемую методом ELISA, или по уменьшению встраивания BrdU в ДНК-1 013677 клетки. Человеческие антитела по изобретению включают IgG1 (например, IgG1, и IgG1,) и IgG4 (например, IgG4, и IgG4,) антитела. Однако, другие изотипы антител также охватываются изобретением,включая IgG2, IgG3, IgM, IgA1, IgA2, секреторный IgA, IgD и IgE. Антитела могут являться полными антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, включая, например, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2,Fv, одноцепочечные Fv фрагменты или биспецифические антитела. Кроме того, антигенсвязывающие фрагменты включают химерные (слитые) белки связывающего домена иммуноглобулинов, содержащие(i) полипептид связывающего домена (такой как вариабельная область тяжлой цепи или вариабельная область лгкой цепи), слитую с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, (ii) CH2 константную область тяжлой цепи иммуноглобулина, слитую с полипептидом шарнирной области, и (iii) CH3 константную область тяжлой цепи иммуноглобулина, слитую с СН 2 константной областью. Такие химерные белки связывающего домена иммуноглобулина дополнительно описаны в Патентных заявках США 2003/0118592 и 2003/0133939. Конкретные человеческие антитела по настоящему изобретению включают антитела, названные АВ 1, АВ 7, АВ 11 и АВ 12, кодируемые нуклеиновыми кислотами тяжлой цепи человеческого происхождения и лгкой цепи каппа человеческого происхождения, содержащими нуклеотидные последовательности в их вариабельных областях, представленных в SEQ ID NO:1, 5, 9 или 13 и SEQ ID NO:3, 7, 11 или 15, соответственно, и их модификации консервативной последовательности. В другом варианте изобретения человеческие антитела характеризуются тем, что они имеют вариабельные области тяжлой цепи человеческого происхождения и лгкой цепи каппа человеческого происхождения, содержащие аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO:2, 6, 10 или 14 иSEQ ID NO:4, 8, 12 или 16, соответственно, и модификации их консервативных последовательностей. Другие конкретные человеческие антитела по изобретению включают антитела, которые содержатCDR (области, определяющие комплементарность), имеющий CDR1 область тяжлой и лгкой цепи человеческого происхождения, CDR2 область тяжлой и лгкой цепи человеческого происхождения иCDR3 область тяжлой и лгкой цепи человеческого происхождения, где:(a) CDR1, CDR2 и CDR3 области тяжлой цепи человеческого происхождения содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностейCDR1, CDR2 и CDR3, показанных на фиг. 1-10 (SEQ ID NO:17-19, 23-25, 29-31 или 35-37), и модификаций их консервативных последовательностей, и(b) CDR1, CDR2 и CDR3 области лгкой цепи человеческого происхождения содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностейCDR1, CDR2 и CDR3, показанных на фиг. 1-10 (SEQ ID NO:20-22, 26-28, 32-34 или 38-40), и модификаций их консервативных последовательностей. В другом варианте изобретения человеческие антитела против CD25 по настоящему изобретению можно охарактеризовать одним или более следующих свойств:b) аффинность связывания с CD25 (KD) около 10-8 М или ниже, с такой как 10-9 М или ниже, 10-10 М или ниже, или 10-11 M или даже ниже, по определению методом плазмонного поверхностного резонанса(SPR) на приборе BIAcore 3000 с применением рекомбинантного человеческого IL-2R в качестве лиганда и антитела в качестве аналита;c) способность вызывать толерантность Т клеток;d) способность блокировать взаимодействие CD25 с его лигандом, IL-2;f) способность ингибировать пролиферацию Т клеток, экспрессирующих CD25;g) способность ингибировать вызванную антителом против CD25 Т-клеточную пролиферацию мононуклеаров периферической крови (РВМС);h) способность блокировать смешанную лимфоцитарную реакцию (MLR) и/илиi) интернализация CD25, экспрессированных на Т-клетках. Выражение "вызывает толерантность" по данному описанию означает, что Т клетки не способны реагировать с антигеном после повторной антигенной стимуляции этим антигеном. Человеческие антитела против CD25 по настоящему изобретению могут быть дериватизированными, связанными с или коэкспрессирующимися с другими специфичностями связывания. В особом варианте изобретения антитела связаны с одной или более специфичностей связывания в отношении другого антигена-мишени, такого как антиген на эффекторной клетке. Следовательно, настоящее изобретение включает также биспецифические или полиспецифические молекулы, которые связываются как с человеческим CD25, так с одним или более других антигеновмишеней, таких как CD3, CD4, IL-15R, мембраносвязанный или связанный с рецептором TNF- или мембраносвязанный или связанный с рецептором IL-15. В другом варианте изобретения человеческие антитела против CD25 по изобретению являются дериватизированными, связанными с или коэкспрессирующимися с другой функциональной молекулой,например с другим пептидом или белком (например, фрагментом Fab). Например, антитело может быть-2 013677 функционально связано (например, химической связью, генетическим слиянием, нековалентной ассоциацией или другим способом) с одним или более других молекулярных объектов, таких как другое антитело (например, с образованием биспецифического или полиспецифического антитела), цитотоксин,клеточный лиганд или антиген (например, с образованием иммуноконъюгата, такого как иммунотоксин). Антитело также может быть связано с другими терапевтическими частицами, например радиоизотопом,низкомолекулярным противораковым лекарственным веществом, противовоспалительным агентом или иммуносупрессором. Следовательно, настоящее изобретение охватывает большой ряд конъюгатов антител, биспецифических или полиспецифических молекул и химерных (слитых, гибридных) белков, причм все они связываются с клетками, экспрессирующими CD25, и всех их можно использовать для нацеливания других молекул на такие клетки. Человеческие антитела, иммуноконъюгаты, биспецифические и полиспецифические молекулы и композиции по данному изобретению можно использовать в различных методах ингибирования, киллинга и/или модулирования активности и/или роста (например, пролиферации) клеток, экспрессирующихCD25. В одном варианте изобретения метод включает ингибирование пролиферации Т клеток, экспрессирующих CD25. В другом варианте изобретения метод включает ингибирование реакций трансплантата(на) против хозяина (гомологичной болезни), например MRL. Ещ в одном варианте изобретения метод включает киллинг клеток, экспрессирующих CD25 (например, с помощью опосредованного комплементом лизиса или путм связывания антитела с цитотоксином). Клетки предпочтительно гибнут или ингибируются, но без киллинга или ингибирования активности клеток, которые не экспрессируют CD25, но могут, например, экспрессировать структурно родственный антиген клеточной поверхности (т.е. без кросс-реактивности к родственным, но отличающимся по структуре антигенам клеточной поверхности). Клетки, экспрессирующие CD25, которые можно ингибировать или убить при использовании человеческих антител по изобретению, включают, например, активированные Т лимфоциты, В лимфоциты, моноциты, макрофаги, печночные клетки Купфера, кожные клетки Лангерганса, экспрессирующие CD25. Следовательно, человеческие антитела по данному изобретению можно использовать для лечения и/или предупреждения ряда заболеваний и состояний, при которых активированные клетки, экспрессирующие CD25, играют активную роль в патогенезе, вводя антитела больным, страдающим такими заболеваниями и состояниями. Примеры заболеваний, которые можно лечить (например, уменьшать интенсивность симптомов) или предупреждать, включают, но без ограничения, отторжение трансплантата, в том числе отторжение аллотрансплантата и ксенотрансплантата у пациентов, которым делают или которые перенесли трансплантацию органа или ткани, например, сердца, лгкого, комбинированную трансплантацию сердца-лгкого, трансплантацию трахеи, почки, печени, поджелудочной железы, пищевода,кишечника, кожи, конечности, пуповины, стволовых клеток, инсулоцитов и т.д. Антитела по данному изобретению можно, следовательно, применять в качестве профилактики отторжения аллотрансплантата и ксенотрансплантата или для обращения (полного изменения направления), лечения или иного ослабления острых эпизодов отторжения аллотрансплантата или ксенотрансплантата. Другие заболевания, которые можно лечить, включают гомологичную болезнь ("трансплантат против хозяина"), например, болезнь "трансплантат против хозяина" в результате переливания крови или в результате пересадки мозга; воспалительные, иммунные и аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилоартрит, псориатический артрит, дерматит, диабет типа 1,инсулинзависимый диабет типа 2, рассеянный склероз, системную эритематозную волчанку, тяжлую псевдопаралитическую миастению, воспалительное заболевание кишечника (IBD), болезнь Крона, язвенный колит, дерматополимиозит, синдром Сгрена (Шегрена), артерииты, включая гигантоклеточный артериит, гипопластическую анемию, астму, склеродермию и увеит; воспалительные и гиперпролиферативные кожные заболевания, например псориаз, включая бляшечный псориаз, пустулзный акродерматит (РРР), эрозивный плоский лишай, буллзный пемфигоид, врожднный буллзный эпидермолиз, контактный дерматит и диффузный нейродермит; и ряд лимфоидных опухолей, например Т-клеточный лейкоз, болезнь Ходжкина, волосатоклеточная лимфома, или кожная Т-клеточная лимфома, включая грибовидный микоз и синдром Сезари. Другими заболеваниями, которые можно лечить, являются злокачественные опухоли, на которые благотворно действуют ингибирование инфильтрации CD25+ регуляторных Т клеток, такие как рак желудка, рак пищевода, злокачественная меланома, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, мелкоклеточный рак лгкого, немелкоклеточный рак лгкого, рак шеи и почечноклеточный рак; гематологические заболевания, такие как Т-клеточный лейкоз/Т-клеточная лимфома взрослых, анапластическая гигантоклеточная лимфома, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL)/малая лимфоцитарная лимфома (SIX), периферическая Т-клеточная лимфома и вторичный амилоидоз; кожные заболевания, такие как гангренозная пиодермия, гранулма кольцевидная, аллергический контактный дерматит, рубцовый пемфигоид и герпес беременных; заболевания печени и желудочно-кишечного тракта, такие как коллагеновый колит, склерозирующий холангит, хронический активный гепатит, волчаночный гепатит, аутоиммунный гепатит, алкогольный гепатит, хронический панкреатит и острый панкреатит;-3 013677 болезни сердца, такие как миокардит и перикардит; заболевания сосудов, такие как артериосклероз, гигантоклеточный артериит/ревматическая полимиалгия, артериит Такаясу, узелковый артериит, синдром Кавасаки, гранулматоз Вегенера, микроскопический полиангиит, синдром Черга-Штрауса, лейкоцитокластический ангиит и вторичный лейкоцитокластический васкулит; заболевания почек, такие как острый гломерулонефрит, хронический гломерулонефрит, нефрит с минимальными изменениями и синдром Гудпасчера; лгочные заболевания, такие как альвеолит, облитерирующий бронхиолит, силикоз и бериллиоз; неврологические нарушения, такие как рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, тяжлая псевдопаралитическая миастения, хроническая демиелинизирующая полиневропатия и полирадикулит, включая синдром Гийена-Барре; заболевания соединительных тканей, такие как рецидивирующий полихондрит, саркоидоз, системная красная волчанка, волчанка CNS (ЦНС), дискоидная волчанка, волчаночный нефрит, синдром хронической усталости и фибромиалгия; заболевания эндокринной системы, такие как болезнь Грейвза, тиреоидит Хашимото и подострит тиреоидит; и вирусные инфекции, такие как тропический спастический парапарез. В особом варианте изобретения субъекта, которому вводят антитело, дополнительно лечат одним или более других терапевтических агентов, таких как иммуносупрессоры (иммунодепрессанты), противовоспалительные агенты, химиотерапевтические агенты или другие агенты, которые повышают терапевтический эффект антитела. Ещ в одном аспекте настоящее изобретение включает метод обнаружения in vitro или in vivo присутствия CD25 в образце или индивидуально, например, для диагностирования связанного с CD25 заболевания предпочтительно на ранней стадии. Это также может быть полезно для мониторинга заболевания и эффекта лечения антителом против CD25 и для определения и корректировки дозы вводимого антитела. В одном варианте изобретения обнаружение присутствия CD25 в образце проводят при контактировании тестируемого образца, необязательно наряду с контрольным образцом, с человеческим моноклональным антителом по изобретению в условиях, которые допускают образование комплекса между антителом и CD25. Затем детектируют образование комплекса (например, с помощью ELISA, проточной цитометрии или Вестерн-блоттинга). Если наряду с тестируемым образцом используют контрольный образец, комплекс обнаруживают в обоих образцах, и любая статистически значимая разница между образцами в образовании комплексов является показателем присутствия в тестируемом образце CD25. Invivo метод можно осуществлять, используя методику визуализации, такую как PET (позитронно эмиссионную томографию) или SPECT (единичную фотонно-эмиссионную компьютерную томографию). В другом аспекте данное изобретение относится к антиидиотипическим антителам, которые связываются с человеческими моноклональными антителами по изобретению. Эти антиидиотипические антитела можно использовать в качестве средства для иммунодиагностики для обнаружения и количественного определения уровней человеческих моноклональных антител против CD25 в лаборатории или в образцах пациента. Это может применяться для изучения фармакокинетики антитела против CD25 или для обнаружения и корректировки дозы антитела против CD25 и для мониторинга заболевания и действия лечения на пациента. Мышиные антиидиотипические антитела можно получать иммунизацией мышей Balb/C человеческими моноклональными антителами по изобретению и получением гибридом из селезнок этих мышей путм слияния с клетками миеломы, такими как NS1 клетки, стандартными методами. Ещ в одном аспекте изобретение охватывает трансгенное, отличное от человека, животное, такое как трансгенная мышь, которое экспрессирует человеческие моноклональные антитела, связывающиеся сCD25. В особом варианте изобретения трансгенное, не являющееся человеком животное представляет собой трансгенную мышь, имеющую геном, содержащий трансген или трансхромосому тяжлой цепи человеческого происхождения и трансген или трансхромосому лгкой цепи человеческого происхождения, кодирующие вс (полное) антитело по изобретению или его фрагмент. Трансгенное отличное от человека животное можно иммунизировать очищенным или обогащнным препаратом CD25 антигена и/или клеток, экспрессирующих CD25. Предпочтительно, трансгенное отличное от человека животное,например, трансгенная мышь, способно продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител к CD25 (например, IgG, IgA и/или IgM), если осуществлять V-D-J рекомбинацию и переключение изотипа. Переключение изотипа может осуществляться, например, путм классического или неклассического переключения изотипа. Соответственно, ещ в одном аспекте изобретение охватывает выделенные В клетки трансгенного отличного от человека животного, описанного выше, например трансгенной мыши, которая экспрессирует человеческие антитела против CD25. Выделенные В клетки могут затем быть иммортализованы путм слияния с иммортализованной клеткой для создания источника (например, гибридомы) человеческих антител против CD25. Такие гибридомы (т.е. те, которые продуцируют человеческие антитела против CD25) также входят в объм настоящего изобретения. Как показано в примерах по данному описанию, человеческие антитела по изобретению можно по-4 013677 лучать непосредственно при использовании гибридом, которые экспрессируют антитело, или можно клонировать (например, при использовании гибридом или фага, которые визуализуют антигенсвязывающие участки антител) и рекомбинантно экспрессировать в клетке-хозяине (например, в СНО клетке(клетке яичника китайского хомячка) или в NS/0 клетке). Другими примерами клеток- хозяев являются микроорганизмы, такие как Е. coli, и грибы, такие как дрожжи. Или же их можно получать методами рекомбинантной ДНК в трансгенном отличном от человека животном или растении. Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение охватывает методы получения моноклональных антител, которые связываются с человеческим CD25. В одном варианте изобретения метод включает иммунизацию трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, описанной ранее (например,имеющей геном, содержащий трансген тяжлой цепи человеческого происхождения и трансген лгкой цепи человеческого происхождения, кодирующие полное антитело против CD25 или его фрагмент),очищенным или обогащенным препаратом человеческого CD25 антигена и/или клеток, экспрессирующих человеческий CD25. Затем получают В клетки (например, В клетки селезнки) животного и сливают с клетками миеломы для образования бессмертных гибридомных клеток, которые секретируют человеческие моноклональные антитела против CD25. Ещ в одном аспекте изобретение включает нуклеотидные молекулы, кодирующие человеческие антитела против CD25 (например, их вариабельные области), а также рекомбинантные векторы экспрессии, которые включают нуклеиновые кислоты по изобретению, и клетки-хозяева, трансфецированные при использовании таких векторов. Методы получения антител с помощью культивирования этих клеток-хозяев также охватываются данным изобретением. Конкретные нуклеиновые кислоты по изобретению, содержат нуклеотидные последовательности, показанные SEQ ID NO:1, 5, 9 или 13 и SEQ ID NO:3,7, 11 или 15, кодирующие тяжлую и лгкую цепи, соответственно, человеческих антител против CD25: АВ 1, АВ 7, АВ 11 и АВ 12. Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеприведнного подробного описания и формулы изобретения. Краткое описание фигур На фиг. 1 показаны аминокислотные последовательности областей VJ лгкой (каппа) цепи человеческих моноклональных антител АВ 1, АВ 7, АВ 11 и АВ 12 (SEQ ID NO:4, 8, 12 и 16, соответственно) с обозначенными CDR. На фиг. 2 - аминокислотные последовательности областей VDJ тяжлой цепи человеческих моноклональных антител АВ 1, АВ 7, АВ 11 и АВ 12 (SEQ ID NO:2, 6, 10 и 14, соответственно) с обозначенными CDR. На фиг. 3 - аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) и соответствующая нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1) области VDJ тяжлой цепи человеческого моноклонального антитела АВ 1 с обозначенными CDR. На фиг. 4 - аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:4) и соответствующая нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:3) области VJ лгкой (каппа) цепи человеческого моноклонального антитела АВ 1 с обозначенными CDR. На фиг. 5 - аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:6) и соответствующая нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:5) области VDJ тяжлой цепи человеческого моноклонального антитела АВ 7 с обозначенными CDR. На фиг. 6 - аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:8) и соответствующая нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:7) области VJ лгкой (каппа) цепи человеческого моноклонального антитела АВ 7 с обозначенными CDR. На фиг. 7 - аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:10) и соответствующая нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:9) области VDJ тяжлой цепи человеческого моноклонального антитела АВ 11 с обозначенными CDR. На фиг. 8 - аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:12) и соответствующая нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:11) области VJ лгкой (каппа) цепи человеческого моноклонального антитела АВ 11 с обозначенными CDR. На фиг. 9 - аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:14) и соответствующая нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:13) области VDJ тяжлой цепи человеческого моноклонального антитела АВ 12 с обозначенными CDR. На фиг. 10 - аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:16) и соответствующая нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:15) области VJ лгкой (каппа) цепи человеческого моноклонального антитела АВ 12 с обозначенными CDR. На фиг. 11 - график ингибирования связывания IL-2 с его рецептором, CD25, супернатантами человеческих моноклональных антител АВ 1, АВ 7, АВ 11 и АВ 12 в сравнении с ингибированием связыванияIL-2 препаратом Zenapax (даклизумаб, рекомбинантное гуманизированное антитело против CD25,Roche). На фиг. 12 показан график ингибирования связывания Zenapax с CD25 человеческими монокло-5 013677 нальными антителами АВ 1, АВ 7, АВ 11 и АВ 12. На фиг. 13 показан график ингибирования индуцированной антителом против CD3 Т-клеточной пролиферации (с применением РВМС, мононуклеаров периферической крови) человеческими моноклональными антителами АВ 1, АВ 7, АВ 11 и АВ 12 в сравнении с ингибированием контрольным антителом(hIgG1/) и Zenapax. На фиг. 14 - график ингибирования MLR человеческими моноклональными антителами АВ 1, АВ 7,АВ 11 и АВ 12 в сравнении с ингибированием контрольным антителом (hIgG1/) и Zenapax. На фиг. 15 - фотографии с применением FITC фильтра, визуализующие интернализацию CD25 меченным FITC AB12. На фиг. 15 А показан результат для Т-бластов, преинкубированных с меченным FITC AB12, после инкубации при 37 С в течение 18 ч, а на фиг. 15 В - результат для Т-бластов, культивированных при 37 С в течение 18 ч в присутствии меченного FITC AB12. Для сравнения на фиг. 15 С показан результат для Тбластов, культивированных при 37 С в течение 18 ч в присутствии меченного FITC изотипического контрольного антитела (против KHL). На фиг. 16 - интернализация CD25 меченным FITC AB12, измеренная проточной цитометрией, где отношение средней интенсивности флуоресценции (MFI) выше 1 указывает, что имеет место интернализация. На фиг. 16 А показан результат для Т-бластов, преинкубированных с меченным FITC AB12 при 4 и при 37 С, соответственно, а на фиг. 16 В - результат для Т-бластов, культивированных в присутствии меченного FITC АВ 12 при 4 и при 37 С, соответственно. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение охватывает "антительную" терапию для лечения и диагностирования различных заболеваний (нарушений), включающих клетки, экспрессирующие CD25. Терапия по изобретению применяет выделенные человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с эпитопом антигена CD25. Такие антитела включают все известные изотипы, например антитела IgA,IgG-4, IgE, IgM и IgD. В одном варианте изобретения антитело является IgG1 антителом, более конкретно IgG1, илиIgG1, изотипа. В другом варианте изобретения антитело является IgG3 антителом, более конкретно,IgG3, или IgG3, изотипа. Ещ в одном варианте изобретения антитело является IgG4 антителом, более конкретно IgG4, или IgG4, изотипа. Ещ в одном варианте изобретения антитело является IgA1 илиIgA2 антителом. Ещ в одном варианте изобретения антитело является IgM антителом. В одном варианте изобретения человеческие антитела продуцируются в отличном от человека трансгенном животном, например в трансгенной мыши, способной продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к CD25 при использовании V-D-J рекомбинации и переключения изотипа. Такое трансгенное животное может также быть трансгенным кроликом для продуцирования поликлональных антител, таких как поликлональные антитела, описанные в Патентной заявке США 2003/0017534. Следовательно изобретение также охватывает человеческие поликлональные антитела,которые специфически связываются с CD25. Поэтому аспекты по изобретению включают не только антитела, фрагменты антител и их фармацевтические композиции, но также отличных от человека трансгенных животных, В клетки, трансфектомы клеток-хозяев и гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела. Также включены методы применения антител по изобретению для блокирования или ингибирования клеток, экспрессирующих CD25, эти методы применимы для лечения нарушений, ассоциированных с CD25. Изобретение охватывает методы применения антител по изобретению для обнаружения клеток, экспрессирующих CD25. Для того чтобы лучше понять настоящее изобретение, сначала датся определение некоторых терминов. Дополнительные определения вводятся в ходе подробного описания. Термины "CD25" и "антиген CD25" применяются поочердно в данном описании и включают любые варианты, изоформы и гомологи вида человеческого CD25, которые естественно (в природе) экспрессируются клетками или экспрессируются на клетках, трансфецированных геном CD25. СинонимыCD25, известные в технике, включают CD25, р 55 и Тас (Т-клеточной активации) антиген. Связывание антитела по изобретению с антигеном CD25 ингибирует и/или блокирует связывание CD25 с его лигандом, IL-2 и, попутно, его результирующую клеточную функцию. Например, в одном варианте изобретения человеческие антитела по изобретению ингибируют вызванную антителом против CD3 Т-клеточную пролиферацию. В другом варианте изобретения человеческие моноклональные антитела ингибируютMLR. Предполагается, что применяемое в данном описании выражение "ингибирует рост" (например, по отношению к клетке) включает любое измеряемое уменьшение роста клеток при контакте с антителом против CD25 по сравнению с ростом тех же самых клеток, не контактирующих с антителом противCD25, например ингибирование роста клеточной культуры по меньшей мере примерно на 10, 20, 30, 40,50, 60, 70, 80, 90, 99 или 100%. Применяемые в данном описании термины "ингибирует связывание" или "блокирует связывание"(например, по отношению к ингибированию/блокированию связывания IL-2 с CD25) используются по-6 013677 очердно и охватывают как частичное, так и полное ингибирование/блокирование. Ингибирование/блокирование связывания IL-2 с CD25 предпочтительно снижает или изменяет нормальный уровень или тип передачи сигнала в клетке, которая происходит, когда IL-2 связывается с CD25 в отсутствие ингибирования или блокирования. Предполагается, что ингибирование или блокирование также включают любое уменьшение аффинности связывания IL-2 с CD25 при контакте с антителом против CD25 по сравнению с лигандом, не контактирующим с антителом против CD25, например блокирование связыванияIL-2 с CD25 по меньшей мере примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 99 или 100%. Термин "антитело" по данному описанию включает целые антитела и любой их антигенсвязывающий фрагмент (т.е. "антигенсвязывающий участок") или их одиночную цепь. "Антитело" относится к гликопротеину, содержащему, по меньшей мере, две тяжлых (Н) цепи и две лгких (L) цепи, связанных между собой дисульфидными связями, или его антигенсвязывающему фрагменту. Каждая тяжлая цепь состоит из вариабельной области тяжлой цепи (сокращнно обозначенной в данном описании VH) и константной области тяжлой цепи. Каждая лгкая цепь состоит из вариабельной области лгкой цепи(сокращнно обозначенной в данном описании VL) и константной области лгкой цепи. Области VH и VL можно далее подразделить на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), перемежающимися (с вкраплениями) более консервативными областями,называемыми остовными (каркасными, скелетными, FR) областями. Каждая VH и VL область состоит из трх CDR и четырх FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1,CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжлой и лгкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Термин "антигенсвязывающий участок (область, фрагмент)" антитела (или просто "область (участок, фрагмент) антитела") по данному описанию относится к одному или более фрагментов антитела,которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, CD25). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами интактного, или полноразмерного, антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающий участок" антитела включают (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из VH,VL, CL и CHI доменов; (ii) фрагмент F(ab')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab,связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd фрагмент, состоящий из VH И CH1 доменов; (iv) фрагмент Fv, состоящий из VH и VL доменов; (v) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из VH домена; (vi) выделенную вариабельную область (CDR) и (vii) комбинацию из двух или более изолированных CDR, которые, необязательно, могут быть соединены синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH кодируются отдельными генами,они могут быть соединены, с применением методов рекомбинантной ДНК, с помощью синтетического линкера, который позволяет им находиться в виде одиночной белковой цепи, в которой VL И VH области спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см.,например, Bird et al. (1988) Science 242:423- 426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:58795883). Предполагается также, что такие одноцепочечные антитела охватываются термином "антигенсвязывающий фрагмент" антитела. Другим примером являются слитые белки связывающего домена иммуноглобулинов, содержащие (i) полипептид связывающего домена, который слит (гибридизован) с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, (ii) CH2 константную область тяжлой цепи иммуноглобулина, слитую с полипептидом шарнирной области, и (iii) CH3 константную область тяжлой цепи иммуноглобулина, слитую с СН 2 константной областью. Полипептид связывающего домена может быть вариабельной областью тяжлой цепи или вариабельной областью лгкой цепи. Слитые (химерные, гибридизованные) белки связывающего домена иммуноглобулина дополнительно описаны в Патентных заявках США 2003/0118592 и 2003/0133939. Эти фрагменты антитела получены обычными методами, известными специалистам в данной области техники, и фрагменты подвергают скринингу на полезность таким же способом, как и интактные антитела. Термин "эпитоп" означает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных группирующихся на поверхности молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и, как правило, имеют специфические признаки трхмерной структуры, а также специфический заряд. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с первым, но не с последним, утрачиваются в присутствии денатурирующих агентов. Предполагается, что термин "биспецифическая молекула" включает любой агент, например белок,пептид или комплекс белка или пептида, который имеет две различных специфичности связывания. Например, молекула может связываться с, или взаимодействовать с (а) антигеном клеточной поверхности и(b) Fc рецептором на поверхности эффекторной клетки. Предполагается, что термин "полиспецифическая молекула" или "гетероспецифическая молекула" включает любой агент, например белок, пептид или комплекс белка или пептида, который имеет более-7 013677 двух различных специфичностей связывания. Например, молекула может связываться с или взаимодействовать с (а) антигеном клеточной поверхности и (b) Fc рецептором на поверхности эффекторной клетки и (с) по меньшей мере одним другим компонентом. Поэтому изобретение включает, но без ограничения, биспецифические, триспецифические, тетраспецифические и другие полиспецифические молекулы,которые направлены на CD25, и на другие мишени, такие как Fc рецепторы на эффекторных клетках. Термин "биспецифические антитела" также включает "diabodies" ("диатела", "диантитела"). "Диантитела" ("diabodies") представляют собой двухвалентные биспецифические антитела, в которых VH И VL домены экспрессируются на одиночной полипептидной цепи, но, так как используется линкер, слишком короткий для того, чтобы было возможно спаривание двух доменов на одной и той же цепи, это вынуждает домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта (см., например, Hollinger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Set USA 90:6444-6448; Poljak,R.J., et al. (1944) Structure 2: 1121-1123). Термин "производные человеческого антитела" относится к любой модифицированной форме антитела, например, к конъюгату антитела и другому агенту или антителу. Предполагается, что термин "человеческое антитело" по данному описанию включает антитела,имеющие вариабельные и константные области последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела по изобретению могут также включать аминокислотные остатки,не кодируемые последовательностями человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например,мутации, вводимые случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo). Однако термин "человеческое антитело" по данному описанию не предполагает включать антитела, в которых последовательности CDR из зародышевой линии других видов млекопитающих,таких как мышь, могут быть введены ("трансплантированы") в человеческие остовные последовательности. Термины "моноклональное антитело" или "композиция моноклонального антитела" по данному описанию относятся к препарату молекул антитела единого молекулярного состава. Композиция моноклонального антитела демонстрирует единую (общую) специфичность и аффинность в отношении конкретного эпитопа. Следовательно, термин "человеческое моноклональное антитело" относится к антителам, проявляющим единую (общую) специфичность, которые имеют вариабельные и константные области из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. В одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела продуцируются гибридомой, которая включает В клетку,полученную от трансгенного или "трансхромосомного" отличного от человека животного, например трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий трансген человеческой тяжлой цепи и трансген человеческой лгкой цепи, слитый с иммортализованной клеткой. Термин "рекомбинантное человеческое антитело" по данному описанию включает все человеческие антитела, которые получаются, экспрессируются, создаются или выделяются методами рекомбинантной ДНК, такие как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), трангенного или "трансхромосомного" по генам человеческих иммуноглобулинов или полученных из них гибридом (описанных ниже, в разделе 1), (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например, при использовании трансфектомы, (с) антитела, выделенные при использовании комбинаторной библиотеки, содержащей рекомбинантные человеческие антитела, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов человеческих иммуноглобулинов в последовательности других ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Однако в некоторых вариантах изобретения такие рекомбинантные человеческие антитела могут претерпевать in vitro мутагенез (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям человеческого Ig, in vivo соматический мутагенез), и тем самым аминокислотные последовательности VH И VL областей рекомбинантных антител являются такими последовательностями, которые, будучи образованы из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и являясь родственными им, не могут существовать в природе в составе(репертуаре) человеческого антитела зародышевой линии in vivo. Термин "трансфектома" по данному описанию включает рекомбинантную эукариотную клеткухозяина, экспрессирующую антитело, такую как клетки СНО, клетки NS/0, клетки HEK293, растительные клетки или клетки грибов, включая клетки дрожжей. Применяемый в данном описании термин "гетерологическое антитело" определяют в связи с трансгенным, отличным от человеческого, организмом, продуцирующим такое антитело. Этот термин относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность или кодирующую нуклеотидную последовательность, соответствующие последовательностям антитела, обнаруживаемого в организме, не являющемся организмом трансгенного, отличного от человека, животного, и, как правило, вида, иного,нежели вид в трансгенном, отличном от человека, животном. Предполагается, что термин "выделенное антитело" по данному описанию относится к антителу,практически не содержащему других антител, имеющих отличные антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с CD25, практически не содержит анти-8 013677 тел, которые специфически связываются с антигенами, иными, нежели CD25). Выделенное антитело,которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом человеческого CD25, может,однако, быть кросс-реактивным родственным антигенам, например, других видов (например, гомологамCD25 вида). Кроме того, выделенное антитело может практически не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ. В одном варианте изобретения комбинация "выделенных" моноклональных антител, имеющих различные специфичности, объединена в определнную композицию. Применяемый в данном описании термин "специфическое связывание" относится к антителу, связывающемуся с заданным антигеном. Как правило, антитело связывается с аффинностью, соответствующей KD, примерно 10-8 М или меньше, примерно такой как 10-9 М или меньше, примерно такой как 10-10 М или меньше, или примерно такой как 10-11 М или даже меньше, по определению методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе BIAcore 3000 с применением рекомбинантного IL-2R в качестве лиганда и антитела в качестве аналита, связывается с заданным антигеном с аффинностью, соответствующей KD, которая по меньшей мере в десять раз ниже, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз ниже, чем его аффинность связывания с неспецифическим антигеном (например, BSA, казеин),иным, нежели заданный антиген или близкородственный антиген. Выражения "антитело, распознающее антиген" и "антитело, специфичное в отношении антигена" применяются в данном описании взаимозаменяемо, поочердно с выражением "антитело, которое связывается специфически с антигеном". Предполагается, что применяемое в данном описании выражение "kd" (с-1) относится к константе скорости равновесной диссоциации конкретного взаимодействия "антитело-антиген". Указанную величину также называют величиной koff. Предполагается, что применяемое в данном описании выражение "ka" (М-1 с-1) относится к константе скорости равновесной ассоциации конкретного взаимодействия "антитело-антиген". Предполагается, что применяемое в данном описании выражение "KD" (M) относится к константе равновесной диссоциации конкретного взаимодействия "антитело-антиген". Предполагается, что применяемое в данном описании выражение "KA" (М-1) относится к константе равновесной ассоциации конкретного взаимодействия "антитело-антиген" и эту величину получают делением ka на kd. Предполагается, что применяемый в данном описании термин "изотип" относится к классу антител(например, IgM или IgG1), которые кодируются генами константных областей тяжлой цепи. Применяемое в данном описании выражение "переключение изотипа" относится к явлению изменения класса, или изотипа, антитела с одного Ig класса на один из других Ig классов. Применяемое в данном описании выражение "непереключнный изотип" относятся к изотипическому классу тяжлой цепи, которая продуцируется, когда не происходит переключения изотипа; СН ген, кодирующий непереключнный изотип, как правило, представляет собой первый СН ген непосредственно по ходу транскрипции от функционально реаранжированного VDJ гена. Переключение изотипа классифицируют как классическое или неклассическое переключение изотипа. Классическое переключение изотипа происходит с помощью событий рекомбинации, которые включают по меньшей мере одну область последовательности-переключателя в трансгене. Неклассическое переключение изотипа может происходить, например, гомологичной рекомбинацией между человеческойи человеческой(ассоциированная делеция). Могут реализовываться альтернативные неклассические механизмы переключения, среди прочего такие как межтрансгенная и/или межхромосомная рекомбинация, и осуществлять переключение изотипа. Применяемый в данном описании термин "последовательность-переключатель" относится к последовательностям ДНК, ответственным за рекомбинацию с переключением. Последовательность "донора переключения", как правило, ( область переключения, располагается 5' (т.е. upstream, против хода транскрипции) от области конструкции, удаляемой в ходе рекомбинации с переключением. Область "акцептора переключения" находится между удаляемой (делегируемой) областью конструкции и константной областью замены (например, ,и т.д.). Применяемый в данном описании термин "тип гликозилирования, гликозилирующий паттерн" определяется как тип (паттерн) углеводных единиц (элементов), ковалентно связанный с белком, более конкретно, с иммуноглобулиновым белком (белком антитела). Тип гликозилирования гетерологического антитела можно охарактеризовать как практически аналогичный типам гликозилирования, встречающимся в природе на антителах, продуцированных видом отличного от человека трангенного животного,если рядовой специалист в данной области техники поймт, что тип гликозилирования гетерологического антитела более похож на тип гликозилирования вида отличного от человека животного, чем на вид, из которого образованы СН гены трансгена. Термин "природный" по данному описанию, применяемый к объекту, относится к тем случаям, когда объект может встречаться в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), которую можно выделить из природного источника и которая не модифицирована преднамеренно человеком в лаборатории, является природной. Термин "реаранжированный", "перегруппированный" по данному описанию относится к конфигу-9 013677 рации тяжлой цепи или лгкой цепи локуса иммуноглобулина, в котором V сегмент позиционирован как непосредственно прилегающий к D- J или J сегменту в конформации, кодирующей в основном полный VH и VL домен, соответственно. Перегруппированный (реаранжированный) локус гена иммуноглобулина (антитела) можно идентифицировать, сравнивая с ДНК зародышевой линии; перегруппированный локус содержит по меньшей мере один рекомбинированный гептамерный/нонамерный элемент гомологии. Термин "неаранжированный" ("неперегруппированный") или "конфигурация зародышевой линии" по данному описанию по отношению к V сегменту означает конфигурацию, в которой V сегмент не рекомбинирован таким образом, чтобы непосредственно прилегать к сегменту D или J. Предполагается, что термин "нуклеотидная молекула" ("молекула нуклеиновой кислоты") по данному описанию включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Нуклеотидная молекула может быть однонитевой (одноцепочечной) или двухнитевой (двухцепочечной), но предпочтительно двухнитевой ДНК. Предполагается, что термин "выделенная молекула нуклеиновой кислоты" ("выделенная нуклеотидная молекула") по данному описанию касательно нуклеиновых кислот (нуклеотидов), кодирующих полные антитела или участки антител (например, VH, VL, CDR3), которые связываются с CD25, относится к нуклеотидной молекуле, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие интактное антитело или фрагмент антитела, не содержат других нуклеотидных последовательностей, кодирующих полное антитело или фрагменты (участки) антитела, которые связывают антигены, иные, нежели CD25, причм эти другие последовательности могут в природе фланкировать нуклеиновую кислоту в человеческой геномной ДНК. В одном варианте изобретения человеческое антитело против CD25 включает вариабельные аминокислотные области тяжлой цепи (VH) и лгкой цепи (VL) AB1, АВ 7, АВ 11 или АВ 12, кодируемые нуклеотидными последовательностями, представленными SEQ ID NO: 1, 5, 9 или 13 и SEQ IDNO: 3, 7, 11 или 15, соответственно. Как описывается в данном описании и заявляется в формуле данного изобретения, последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1-40, включают "модификации консервативных последовательностей", т.е. модификации нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, которые не оказывают заметного влияния на или не изменяют в значительной степени характеристики связывания антитела,кодируемого нуклеотидной последовательностью или содержащего аминокислотную последовательность. Такие модификации консервативных последовательностей включают нуклеотидные и аминокислотные замены, добавления или делеции. Модификации можно вводить в SEQ ID NO: 1-40 стандартными методами, известными в технике, такими как сайт-направленный мутагенез и ПНР (PCR)опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают замены, в которых аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток с аналогичной боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков, имеющие аналогичные боковые цепи, определены (охарактеризованы) в технике. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота),незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин,тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвлнными боковыми цепями (например, треонин,валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан,гистидин). Таким образом, предварительный остаток заменимой аминокислоты в человеческом антителе против CD-25 предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из семейства с такими же боковыми цепями. Настоящее изобретение также охватывает "производные" аминокислотных последовательностей,представленных SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 17- 40, и модификации их консервативных последовательностей, в которых дериватизированы один или более аминокислотных остатков, например, ацилированием или гликозилированием, что не оказывает значительного влияния или не изменяет заметно характеристики связывания антитела против CD25. Кроме того, настоящее изобретение включает антитела, в которых сделаны изменения в Fc области с целью изменения функциональных или фармакокинетических свойств антител. Такие изменения могут привести к уменьшению или увеличению C1q связывания и CDC или FcR связывания и антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Можно, например, сделать замены в одном или более аминокислотных остатков в положениях 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 константной области тяжлой цепи, тем самым вызывая изменение эффекторной функции при одновременном сохранении способности связываться с антигеном, по сравнению с немодифицированным антителом, ср. Патенты США 5624821 и 5648260. Можно дать дополнительную ссылку на Международную заявку WO 00/42072, описывающую антитела с изменнными Fc областями, которые повышают ADCC, и на Международную заявку WO 94/29351, описывающую антитела, имеющие мутации в N-концевой области СН 2 домена, которые изменяют способность антител связываться с FcRI и тем самым понижают способность антител связываться сC1q, что, в свою очередь, понижает способность антител к фиксации комплемента. Помимо этого, ShieldsS298A/E333A и S298A/E333A/K334A, которые повышают связывание FcRIII.In vivo период полужизни антител можно также увеличить, модифицируя эпитоп рецептора"мусорщика" ("утилизатора") Ig константного домена или Ig-подобного константного домена, так чтобы молекула не содержала интактного СН 2 домена или интактной Ig Fc области, ср. Патенты США 6121022 и 6194551. Кроме того, in vivo период полужизни можно увеличить, осуществляя мутации в Fc области,например, заменой лейцина на треонин в положении 252, заменой серина на треонин в положении 254 или заменой фенилаланина на треонин в положении 256, ср. Патент США 6277375. Помимо этого, тип гликозилирования антител можно модифицировать для того, чтобы изменить эффекторную функцию антител. Например, можно экспрессировать антитела в трансфектоме, которая не добавляет элемент (единицу) фукозы, обычно соединнный с углеводом, связанным с Asn в положении 297 области Fc, чтобы повысить аффинность области Fc к FcRIII, что, в свою очередь приведт к повышенной АЗКЦ (ADCC) антител в присутствии клеток NK, ср. Shield et al. (2002), J. Biol. Chem.,277:26733. Кроме того, для модификации CDC можно модифицировать галактозилирование. Можно дать дополнительную ссылку на Международную заявку WO 99/54342 и на статью Umana et al., Nat. Biotechnol. (1999) 17:176, описывающую CHO клеточную линию, созданную методами рекомбинантной ДНК таким образом, чтобы экспрессировать GntIII, что вызывает экспрессию моноклональных антител с изменнными гликоформами и улучшенной ADCC активностью. Кроме того, фрагменты антитела, например фрагменты Fab по изобретению можно ПЭГировать для повышения периода полужизни. Это можно осуществить реакциями ПЭГ(пэг)ирования, известными в технике, как описано, например, в Focus on Growth Factors (1992) 3:4-10; европейских патентах ЕР 154316 и ЕР 401384. Или же, в другом варианте изобретения, можно вводить мутации произвольно по всей или по участку последовательности кодирующей антитело против CD-25, например, с помощью мутагенеза насыщения, и полученные в результате модифицированные антитела против CD-25 можно подвергнуть скринингу на активность связывания. Таким образом, антитела, кодированные (вариабельными областями тяжлой и лгкой цепи) нуклеотидными последовательностями по данному описанию и/или содержащие (вариабельные области тяжлой и лгкой цепи) аминокислотные последовательности по данному описанию (т.е. SEQ ID NO:2, 4,6, 8, 10, 12, 14, 16 и 17-40), включают практически аналогичные антитела, кодированные аналогичными последовательностями или содержащие аналогичные последовательности, которые были "консервативно модифицированы". Дополнительное обсуждение того, как эти практически аналогичные антитела можно получить, исходя из частичных (например, вариабельных областей тяжлой и лгкой цепи) последовательностей по данному описанию, таких как SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 17-40, дано ниже. В случае нуклеотидных и аминокислотных последовательностей термин "гомология" указывает степень идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей при оптимальном наложении и сравнении, при наличии соответствующих инсерций или делеций. Или же практическая гомология существует, когда сегменты ДНК гибридизуются в селективных условиях гибридизации с комплементом цепи. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для последовательностей (например, % гомологии =идентичных положений/общее числоположений 100), принимая во внимание число гэпов и протяжнность каждого гэпа, которые требуется ввести для оптимального совмещения (наложения) двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно выполнять, используя математический алгоритм, описанный в неограничивающих примерах, приведнных ниже. Процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определить, используяhttp://www.gcg.com), используя матрицу NWSgapdna.CMP и средневзвешенное гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 и средневзвешенное длины ("length weight") последовательности 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей можно также определить с помощью алгоритма Е. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988, который встроен в программуALIGN (вариант 2.0), используя РАМ 120 таблицу масс остатков, штрафную функцию длины гэпа 12 и штрафную функцию гэпа 4. Кроме того, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определить с помощью алгоритма Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444- 453 (1970,который встроен в программу GAP в программном обеспечении GCG (доступном по адресу в Интернетеhttp://www.gcg.com), используя либо матрицу Blossum 62, либо матрицу РАМ 250 и средневзвешенное гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и средневзвешенное длины ("length weight") последовательности 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности по данному изобретению можно использовать далее в качестве "последовательности по запросу" для осуществления поиска в доступных базах данных, например, для идентификации родственных последовательностей. Такой поиск можно осуществлять, например, используя программы NBLAST и XBLAST (версия 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol.Biol. 215:403- 10. Поиск нуклеотидов BLAST можно осуществлять с помощью программы NBLAST,оценка (степень) = 100, длина кода - 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот по изобретению. Поиск BLAST белков можно осуществлять с помощью программы XBLAST, оценка = 50, длина кода = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам по изобретению. При проведении совмещения последовательностей с гэпами ("гэпированных") для сравнения можно использовать программу Gapped BLAST,описанную Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389- 3402. При использовании программBLAST и Gapped BLAST можно использовать параметры соответствующих программ (например,XBLAST и NBLAST) по умолчанию. См. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках, в клеточном лизате или в частично очищенном или практически чистом виде. Нуклеиновая кислота является "выделенной" или "представленной практически чистой", когда она очищена от других клеточных компонентов или других примесей, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включая обработку щлочью/SDS, CsCl бэндинг (дифференциальное окрашивание хромосом), колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие общеизвестные в технике методы. См. F. Ausubel,et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Составы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, хотя часто имеющие нативную последовательность (за исключением модифицированных сайтов рестрикции и т.п.), любой кДНК, геномной или их смесей, можно сделать мутантными стандартными методами с целью получения последовательностей генов. Если требуется, в случае кодирующих последовательностей эти мутации могут влиять на аминокислотную последовательность. В частности, рассматриваются последовательности ДНК, практически гомологичные нативным V, D, J, константным, переключателям и другим таким последовательностям по данному описанию, или последовательности ДНК, образованные из этих последовательностей(где "образованный" ("derived") указывает на то, что последовательность идентична другой последовательности или получена модификацией другой последовательности). Нуклеиновая кислота "функционально связана", если она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности. Что касается транскрипции регуляторных последовательностей, "функционально связанный" означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, являются соседними и, если необходимо соединить две области кодирующие белок, соседними и в рамке считывания. В случае последовательностей-переключателей,"функционально связанный" указывает, что последовательности способны осуществлять рекомбинацию переключения. Предполагается, что термин "вектор" по данному описанию относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить (транспортировать) другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним типом вектора является "плазмида", термин, относящийся к петле кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные ДНК сегменты. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные ДНК сегменты могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены(например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и тем самым реплицированы вместе с геномом-хозяином. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном описании называются "рекомбинантными векторами экспрессии" (или просто "векторами экспрессии", "экспрессирующими векторами"). В целом векторы экспрессии, применяемые в методах рекомбинантной ДНК, часто находятся в виде плазмид. В настоящем описании "плазмида" и "вектор" могут применяться взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее общеупотребительной формой вектора. Предполагается, однако, что изобретение включает другие формы векторов экспрессии (экспрессирующих векторов), такие как вирусные векторы(например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы), которые выполняют аналогичные функции. Предполагается, что термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") по данному описанию относится к клетке, в которую вводят вектор рекомбинантной экспрессии. Следует понимать, что предполагается, что такие термины относятся не только к клетке конкретного субъекта, но и к потомству такой клетки. Так как в последующих поколениях могут встречаться некоторые модификации вследствие либо мутации, либо влияния окружающей среды, на самом деле, такое потомство может не быть идентичным родительской клетке, но, тем не менее, охватывается термином "клетка-хозяин" по данному изобретению. Рекомбинантные клетки-хозяева включают, например, трансфектомы, такие как клетки СНО, клетки NS/0 и лимфоциты. Термин "субъект" по данному описанию включает человека или отличное от человека животное. Термин "отличное от человека животное" включает всех позвоночных, например млекопитающих и не млекопитающих, таких как отличные от человека приматы, овца, собака, корова, куры, земноводные,- 12013677 пресмыкающиеся и т.д. Выражение "трансгенное отличное от человека животное" относится к отличному от человека животному, имеющему геном, содержащий один или более трансгенов или транс хромосом с тяжлой и/или лгкой цепью человеческого происхождения (интегрированных или неинтегрированных в природную геномную ДНК животного), и способный экспрессировать полностью человеческие антитела. Например,трансгенная мышь может иметь трансген с лгкой цепью человеческого происхождения и либо трансген с тяжлой цепью человеческого происхождения, либо трансхромосому с тяжлой цепью человеческого происхождения, так что мышь, будучи иммунизирована CD25 антигеном и/или клетками, экспрессирующими CD25, продуцирует человеческие антитела против CD25. Трансген и/или трансхромосому с тяжлой цепью человеческого происхождения можно интегрировать в хромосомную ДНК мыши или можно сохранять вне хромосомы. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши (в целом называемые в данном описании "трансгенные мыши") способны продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител к CD25 (например, IgG, IgA, IgM, IgD и/или IgE), если претерпевают V-D-V рекомбинацию и переключение изотипа. Трансгенное отличное от человека животное можно также использовать для продуцирования специфического антитела против CD25 с помощью введения генов, кодирующих такое специфическое антитело против CD25, например, с помощью функционального связывания генов с геном, который экспрессируется в молоке животного. Различные аспекты изобретения более подробно описаны в подразделах, приведнных ниже.I. Получение человеческих антител к CD25 Человеческие моноклональные антитела по изобретению можно получать многими методами,включая обычную методологию моноклональных антител, например стандартный метод гибридизации соматических клеток Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975). Хотя методы гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе для получения моноклонального антитела можно применять другие методы, например вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов или методы фагового дисплея, используя библиотеки генов человеческих антител. Предпочтительной животной системой для получения гибридом, которые секретируют человеческие моноклональные антитела, является мышиная система. Получение гибридом в мыши является общепризнанным методом. Протоколы иммунизации и методы выделения иммунизированных спленоцитов для слияния (гибридизации) известны в технике. Гибридообразующие клетки-партнры (например, клетки мышиной миеломы) и методики гибридизации также известны. В предпочтительном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела против CD25 можно получать, используя трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих скорее фрагменты иммунной системы человека, нежели фрагменты мышиной системы. Эти трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, обозначенных в данном описании мыши HuMAb, например, мыши Нсо 7,мыши Нсо 12 и мыши KM, соответственно, и в данном описании имеют общее название "трансгенные мыши". Мышь HuMAb содержит "минилокусы" гена человеческого иммуноглобулина, которые кодируют нереаранжированные последовательности тяжлой ( и ) и лгкойцепи человеческого иммуноглобулина, вместе с нацеленными мутациями, которые инактивируют локусы эндогенныхицепей (Lonberg, N. et al (1994) Nature 368 (6474): 856-859). Следовательно, мыши проявляют пониженную экспрессию лгкой цепи мышиного IgM илии, в ответ на иммунизацию, введнные трансгены тяжлой и лгкой цепи человеческого происхождения, претерпевают переключение класса и соматическую мутацию с образованием человеческих моноклональных антител IgG,(Lonberg, N et al. (1994), см. выше; обзор вAcad. Sci 764:536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. См. дополнительно патенты США 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; и 5770429; все выданы Lonberg and Kay, а также Патент США 5545807, выданный Surani et al; Международные заявки WO 98/24884, 94/25585, 93/1227, 92/22645, 92/03918 и 01/09187. Мыши НСо 7 имеют JKD разрыв в эндогенных генах лгкой цепи (каппа) (как описано в Chen et al.(1993) EMBO J. 12: 821- 830), CMD разрыв в эндогенных генах тяжлой цепи (как описано в примере 1 Международной заявки WO 01/14424), KCo5 трансген лгкой цепи каппа человеческого происхождения(как описано в Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851) и НСо 7 трансген тяжлой цепи каппа человеческого происхождения (как описано в патенте США 5770429). Мыши НСо 12 имеют JKD разрыв в эндогенных генах лгкой цепи (каппа) (как описано в Chen et al.(1993) EMBO J. 12: 821- 830), CMD разрыв в эндогенных генах тяжлой цепи (как описано в примере 1- 13013677 Международной заявки WO 01/14424, Korman et al.), KCo5 трансген лгкой цепи каппа человеческого происхождения (как описано в Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851) и НСо 12 трансген тяжлой цепи каппа человеческого происхождения (как описано в примере 2 Международной заявки WO 01/14424, Korman et al.). У мышей штамма KM эндогенный ген мышиной лгкой цепи каппа гомозиготно разрывается, как описано в Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820, а эндогенный мышиный ген тяжлой цепи каппа гомозиготно разрывается, как описано в примере 1 Международной заявки WO 01/09187. Этот штамм мышей нест трансген лгкой цепи каппа человеческого происхождения, KCo5, описанный в Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Этот штамм мышей нест также трансхромосому тяжлой цепи человеческого происхождения, состоящую из фрагмента hCF (SC20) хромосомы 14, описанного в Международной заявке WO 02/43478. Иммунизация Для получения полностью человеческих моноклональных антител к CD25 трансгенных или трансхромосомньгх мышей, содержащих гены человеческих иммуноглобулинов (например, мышей НСо 12,НСо 7 или KM), можно иммунизировать препаратом, обогащнным CD25 антигеном, рекомбинантнымCD25 и/или клетками, экспрессирующими CD20, описанными, например, в Lonberg et al. (1994), см. выше; Fishwild et al. (1996), см. выше, и в Международной патентной заявке WO 98/24884. Или же, мышей можно иммунизировать ДНК, кодирующими человеческий CD25. Предпочтительно для первой инфузии берут мышей в возрасте 6-16 недель. Например, обогащнный препарат антигена CD25 или рекомбинантного антигена CD25 можно использовать для иммунизации мышей HuMAb интраперитонеально. В событии, когда иммунизация с использованием очищенного и обогащнного антигена CD20 не приводит к антителам, для стимулирования иммунного ответа мышей можно также иммунизировать клетками,экспрессирующими CD25, например, клеточной линией. Кумулятивный опыт с различными антигенами показал, что трансгенные мыши HuMAb лучше всего отвечают (реагируют), когда их сначала иммунизируют интраперитонеально (IP) или подкожно (SC) клетками, экспрессирующими CD25, в полном адъюванте Фрейнда или неполном адъюванте Фрейнда с последующими IP иммунизациями (всего вплоть до 10) клетками, экспрессирующими CD25, в фосфатносолевом буферном растворе (PBS). Мониторинг иммунного ответа можно проводить в течение курса иммунизации по протоколу с образцами сыворотки, полученными при ретроорбитальном кровотечении. Скрининг сыворотки можно проводить с помощью анализа FACS (описанного ниже), а мышей с удовлетворительными титрами человеческого иммуноглобулина против CD25 можно использовать для слияний(гибридизации). Мышам можно внутривенно вводить бустер-инъекцию клеток, экспрессирующих CD25,например, за 3 или 2 дня до умерщвления и удаления селезнки и лимфатических узлов. Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклоналъные антитела против CD 25 Для получения гибридом, продуцирующих человеческие моноклоналъные антитела к человеческому CD25, спленоциты и клетки лимфатических узлов иммунизированных мышей можно выделить и гибридизовать с соответствующей иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия мышиной миеломы. Полученные гибридомы можно затем подвергнуть скринингу на продуцирование антиген- специфических антител. Например, единую клеточную суспензию лимфоцитов селезнки иммунизированных мышей можно гибридизовать с клетками миеломы SP2/0-Ag14 (ATCC, CRL 1581) с 50%PEG (ПЭГ, вес/об.). Клетки можно засевать с примерной плотностью 1105 на лунку в плоскодонный титрационный микропланшет с последующей двухнедельной инкубацией в селективной среде, содержащей помимо обычных реагентов 10% фетальной сыворотки для клонирования, 5% фактора начала клонирования гибридомы (IGEN) и 1X HAT (Sigma). Примерно через две недели клетки можно культивировать в среде, в которой HAT замещают на НТ (Sigma). Затем индивидуальные клетки можно подвергнуть скринингу методом ELISA на антитела, содержащие лгкую цепь каппа человеческого происхождения, и анализом FACS с применением клеток, экспрессирующих CD25, на CD25 специфичность. Обычно, когда происходит интенсивный рост гибридом, клоны можно подвергать скринингу на продуцирование IgG,обычно через 7-10 дней. Гибридомы, секретирующие антитело, можно снова засевать, снова подвергнуть скринингу и, если они вс ещ позитивны в отношении человеческого IgG, моноклональные антитела против CD25 можно субклонировать, по меньшей мере, дважды с помощью ограниченного разведения. Стабильные субклоны можно затем культивировать in vitro для получения антитела в тканевой культуральной среде для характеристики. Получение трансфектом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к CD25 Человеческие антитела по изобретению также можно получать в трансфектоме клетки-хозяина, используя, например, комбинацию методов рекомбинантной ДНК и методов трансфекции гена, таких как хорошо известные в технике (Morrison, S. (1985) Science 229:1202). Например, для экспрессии антител или фрагментов антител стандартными методами молекулярной биологии (например, ПЦР (PCR) амплификацией, сайт-направленным мутагенезом) можно получать ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные лгкие и тяжлые цепи, и встраивать их в экспрессирующие векторы таким образом, что гены функционально связываются с последовательностями, контролирующими транскрипцию и трансляцию. Предполагается, что в этом контексте выражение "функционально связанный" означает, что ген антитела таким образом, что эти последовательности контроля- 14013677 транскрипции и трансляции, в векторе, выполняют свою функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессирующий вектор (вектор экспрессии) и последовательности регуляции экспрессии выбирают таким образом, чтобы они были совместимы с используемой клеткой-хозяином. Ген лгкой цепи антитела и ген тяжлой цепи антитела можно встроить в отдельные векторы или, более обычно, оба гена встраивают в один и тот же вектор экспрессии. Гены антитела вводят в вектор экспрессии стандартными методами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела или датированием по тупым концам, если отсутствуют сайты рестрикции). Вариабельные области лгкой и тяжлой цепи антител по данному описанию можно использовать для создания генов полноразмерного антитела любого изотипа, встраивая их в векторы экспрессии, уже кодирующие константную область тяжлой цепи и константную область лгкой цепи заданного изотипа, таким образом, что сегмент VH функционально связывается с CH сегментом(-ами) в векторе, a VL сегмент функционально связывается с CL сегментом в векторе. В качестве дополнения или альтернативы вектор рекомбинантной экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела при использовании клетки- хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в вектор таким образом, что сигнальный пептид сливается в рамке считывания с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом(т.е. сигнальным пептидом неиммуноглобулинового белка). Помимо генов цепей антитела рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клетке-хозяине. Предполагается, что термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны,например, в Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,Calif. (1990). Специалисты в данной области техники поймут, что дизайн вектора экспрессии, включая отбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемых клеток-хозяев, нужный уровень экспрессии белка и т.д. Предпочтительные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих включают вирусные элементы, которые определяют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры из цитомегаловируса (CMV), Simian Virus 40 (SV40, вирус зелной мартышки 40), аденовируса, (например,главный поздний промотор аденовируса (AdMLP и полиомы. Или же можно использовать невирусные регуляторные последовательности, такие как промотор убиквитина или -глобина. Помимо генов цепей антитела и регуляторных последовательностей, рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, ориджины репликации) и гены селективных маркров. Ген селективного маркра облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введн вектор (см., например, патенты США 4399216, 4634665 и 5179017, все Axel et al.). Например, как правило, ген селективного маркра придат резистентность к лекарственным веществам, таким как G418,гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую введн вектор. Предпочтительные гены селективных маркров включают ген дигидрофолат редуктазы (DHFR) (для применения в dhfr-клеткаххозяевах с селекцией/амплификацией метотрексата) и нео ген (для селекции G418). Для экспрессии лгкой и тяжлой цепей вектор(-ы) экспрессии, кодирующий тяжлую и лгкую цепи, трансфецируют в клетку-хозяина стандартными методами. Предполагается, что различные формы термина "трансфекция" охватывают широкий ряд методов, применяемых обычно для введения экзогенной ДНК в клетки-хозяева прокариот и эукариот, такие как электропорация, преципитация фосфатом кальция, опосредованная DEAE-декстраном трансфекция и т.д. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела по изобретению в клетках-хозяевах либо прокариот, либо эукариот, наиболее предпочтительной является экспрессия антител в клетках-хозяевах эукариот и самой предпочтительной в клетках-хозяевах млекопитающих, потому что такие клетки эукариот, и, в частности, клетки млекопитающих, скорее нежели клетки прокариот, собирают и секретируют соответствующим образом скрученные и иммунологически активное антитело. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают СНО клетки (в том числе клетки dhfr-СНО, описанные в Urlaub and Chasin,(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, используемые с DHFR селективным маркром, например,как описано в R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), клетки миеломы NS/0, клеткиCOS, клетки HEK293 и клетки SP2 cells. В частности, для применения с клетками миеломы NS/0 другой предпочтительной системой экспрессии является система экспрессии гена GS (глутамин синтетазы),описанная в Международных заявках WO 87/04462, 89/01036 и в Европейском патенте ЕР 338841. Когда рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются с помощью культивирования клеток-хозяев или, более предпочтительно секрецией антитела в культуральную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Антитела можно выделить из этой культуральной среды стандартными методами очистки белков.- 15013677 Дополнительные рекомбинантные методы продуцирования человеческих моноклоналъных антител к CD25 В качестве альтернативы гены клонированных антител можно экспрессировать в других системах экспрессии, включая клетки прокариот, такие как клетки микроорганизмов, например, Е. coli для получения scFv антител, водоросли, а также клетки насекомых. Помимо этого, антитела могут продуцироваться в трансгенных животных, отличных от человека, например, в молоке овец и кроликов или в яйцах кур, или в трансгенных растениях. См., например, Verma, В. et al. (1998). Antibody engineering: Comparison bacterial., yeast, insect and mammalian expression systems. J. Immunol. Meth. 216:165-181; Pollock, et al(1999). Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies. J. Immunol Meth. 231:147157 и Fischer, B. et al. (1999). Molecular farming of recombinant antibodies in plants. Biol. Chem. 380:825839. Применение частичных последовательностей антител для экспрессии интактных антител Антитела взаимодействуют с антигенами- мишенями, преимущественно, за счт аминокислотных остатков, которые расположены на шести CDR тяжлой и лгкой цепи. По этой причине аминокислотные последовательности в CDR являются более разнообразными в индивидуальных антителах, нежели последовательности вне CDR. Так как последовательности CDR ответственны за большинство взаимодействий антиген-антитело, возможно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые подражают свойствам специфичных природных антител, путм конструкции экспрессирующих векторов, включающих последовательности CDR специфичного природного антитела, "пересаженные" в остовные последовательности отличного (другого) антитела с отличными (другими) свойствами (см., например,Riechmann, L. Et al. (1998) Nature 332:323- 327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522- 525; и Queen, С. Et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029- 10033). Такие остовные последовательности можно получить из доступных баз данных ДНК, которые включают последовательности генов антител зародышевой линии. Эти последовательности зародышевой линии отличаются от последовательностей зрелых генов антител, так как они не включают полностью собранных вариабельных генов, которые образуются соединением V(D)J в процессе созревания В клетки. Последовательности гена зародышевой линии у индивидуума также будут отличаться от последовательностей вторичного антитела спектра с высокой аффинностью, которые содержат мутации по всему вариабельному гену, но, как правило, они в виде кластеров собираются в CDR. Например, соматические мутации являются относительно нечастыми на аминоконцевой части остовной области 1 и на карбоксиконцевой части остовной области 4. Кроме того, многие соматические мутации незначительно изменяют свойства связывания антитела. По этой причине нет необходимости получать полную последовательность ДНК, кодирующей конкретное антитело, чтобы воссоздать интактное рекомбинантное антитело, обладающее свойствами связывания, аналогичными свойствам связывания оригинального (первоначального) антитела (см. WO 99/45962). Как правило, для этой цели достаточно частичной последовательности тяжлой и лгкой цепи, охватывающей CDR области. Частичную последовательность используют для определения, какие сегменты вариабельных и соединительных генов зародышевой линии вносят вклад в вариабельные гены рекомбинированного антитела. Последовательность зародышевой линии используют затем для заполнения недостающих частей вариабельных областей. Лидерные последовательности тяжлой и лгкой цепей отщепляются в процессе созревания белка и не вносят вклад в свойства конечного антитела. Для добавления недостающих последовательностей клонированные последовательности кДНК можно соединять с синтетическими олигонуклеотидами лигированием или ПЦР-амплификацией. Или же полный вариабельный домен можно синтезировать в виде набора коротких перекрывающихся олигонуклеотидов и объединять с помощью ПЦР-амплификации, чтобы создать клон полностью синтетической вариабельной области. Этот процесс имеет определнные преимущества, такие как элиминирование или включение конкретных сайтов рестрикции или оптимизация конкретных кодонов. Нуклеотидные последовательности транскриптов тяжлой и лгкой цепей из гибридом используют для дизайна перекрывающегося набора синтетических олигонуклеотидов с целью создания синтетических V последовательностей с идентичной природным последовательностям способностью кодировать аминокислоты. Синтетические последовательности тяжлой и каппа цепей могут отличаться от природных последовательностей тремя путями: ряды повторяющихся нуклеотидных оснований прерываются,чтобы упростить синтез олигонуклеотидов и ПЦР-амплификацию; оптимальные сайты инициации трансляции вводятся согласно правилам Козака (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870); и сайтыHindIII создают в направлении 3'-5' (upstream, против хода) от сайтов инициации трансляции. Для вариабельных областей как тяжлой, так и лгкой цепей оптимизированные кодирующие и соответствующие некодирующие последовательности цепей разбиваются на 30-50 нуклеотидов примерно посередине (в средней точке) некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для каждой цепи олигонуклеотиды можно собрать в перекрывающиеся двухцепочечные наборы, которые охватывают сегменты из 150-400 олигонуклеотидов. Затем пулы используют в качестве матриц для получения продуктов ПЦРамплификации из 150-400 олигонуклеотидов. Как правило, единый набор олигонуклеотидов вариабельной области разбивают на два пула, которые амплифицируют раздельно, получая два перекрывающихся- 16013677 ПЦР-продукта. Затем эти перекрывающиеся продукты соединяют ПЦР-амплификацией с образованием полной вариабельной области. Также может быть желательным ввести перекрывающийся фрагмент константной области тяжлой или лгкой цепи (включающий сайт BbsI лгкой цепи каппа или сайт AgeI тяжлой цепи гамма) в ПЦР-амплификацию, чтобы получить фрагменты, которые можно легко клонировать в конструкции векторов экспрессии. Реконструированные вариабельные области тяжлой и лгкой цепей затем соединяют с клонированными промоторной, лидерной последовательностью, последовательностями инициации трансляции,константной области, 3' нетранслируемой области, последовательностями полиаденилирования и терминации транскрипции с образованием экспрессирующих векторных конструкций. Экспрессирующие конструкции тяжлой и лгкой цепей можно объединить в единый вектор, котрансфецировать, последовательно трансфецировать или по отдельности трансфецировать в клетки-хозяева, а затем слить (гибридизовать) с образованием клетки-хозяина, экспрессирующей обе цепи. Аналогичную процедуру можно применять для того, чтобы "пересадить" новую антигенспецифичность в имеющееся природное антитело. Предпочтительно выбирают акцепторное антитело,которое происходит из того же самого гена вариабельной области зародышевой линии, что и CDRдонорное антитело. Затем одну или более областей CDR переносят из донорного антитела описанными выше методами. Примеры плазмид для применения в конструкции экспрессирующих векторов для человеческогоIgG описаны ниже. Плазмиды конструированы таким образом, чтобы ПЦР-амплифицированные последовательности кДНК V тяжлой и V каппа лгкой цепей можно было использовать для реконструкции минигенов полной тяжлой и лгкой цепей. Эти плазмиды можно использовать для экспрессии полностью человеческих IgG1, или IgG4, антител. Аналогичные плазмиды можно конструировать для экспрессии других изотипов лгкой цепи или для экспрессии антител, содержащих лгкие цепи лямбда. Соответственно, в другом варианте изобретение включает различные способы получения человеческих антител против CD25. В одном варианте способ включает получение антитела, содержащего (1) остовные области тяжлой цепи человеческого происхождения и CDR тяжлой цепи человеческого происхождения, в которых по меньшей мере одна из CDR тяжлой цепи человеческого происхождения содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей CDR, показанных на фиг. 1-10 (или соответствующих аминокислотных остатков в SEQ ID NO:17-19, 23-25, 29-31 или 35-37); и (2) остовные области лгкой цепи человеческого происхождения и CDR лгкой цепи человеческого происхождения, в которых по меньшей мере одна из CDR лгкой цепи человеческого происхождения содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей CDR, показанных на фиг. 1-10 (или соответствующих аминокислотных остатков в SEQ ID NO.20-22, 26-28, 32-34 или 38-40); в которых антитело сохраняет способность связываться с CD25. Способность антитела связываться с CD25 можно определить стандартными анализами связывания,такими, которые представлены в примерах (например, FACS анализ). Так как в технике хорошо известно, что домены CDR3 тяжлой и лгкой цепи играют особо важную роль в специфичности/аффинности связывания антитела с антигеном, рекомбинантные антитела по изобретению, полученные как представлено выше, предпочтительно содержат области CDR3 тяжлой и лгкой цепи АВ 1, АВ 7, АВ 11 или АВ 12. Антитела дополнительно могут содержать области CDR2 АВ 1,АВ 7, АВ 11 или АВ 12. Кроме того, антитела могут содержать области CDR1 АВ 1, АВ 7, АВ 11 или АВ 12. Следовательно, изобретение далее содержит антитела против CD25, включающие: (1) остовные области тяжлой цепи человеческого происхождения, область CDR1 тяжлой цепи человеческого происхождения, область CDR2 тяжлой цепи человеческого происхождения и область CDR3 тяжлой цепи человеческого происхождения, в которых область CDR3 тяжлой цепи человеческого происхождения представляет собой CDR3 АВ 1, АВ 7, АВ 11 или АВ 12, показанные на фиг. 1-10 (или соответствующие аминокислотные остатки, показанные в SEQ ID NO:19, 25, 31 или 37); и (2) остовные области лгкой цепи человеческого происхождения, область CDR1 лгкой цепи человеческого происхождения, область CDR2 лгкой цепи человеческого происхождения и область CDR3 лгкой цепи человеческого происхождения, в которых область CDR3 лгкой цепи человеческого происхождения представляет собой CDR3 АВ 1, АВ 7,АВ 11 или АВ 12, показанные на фиг. 1-10 (или соответствующие аминокислотные остатки, показанные вSEQ ID NO: 22, 28, 34 или 40), где антитело связывается с CD25. Антитело может дополнительно содержать CDR2 тяжлой и/или лгкой цепи АВ 1, АВ 7, АВ 11 или АВ 12. Кроме того, антитело может дополнительно содержать области CDR1 тяжлой и/или лгкой цепи АВ 1, АВ 7, АВ 11 или АВ 12. Предпочтительно CDR1, 2 и/или 3 антител, полученных методом рекомбинантной ДНК, описанные выше, содержат точно такую(-ие) же аминокислоту(-ы), которая содержит АВ 1, АВ 7, АВ 11 или АВ 12 по данному описанию. Однако рядовой специалист в данной области понимает, что возможно некоторое отклонение от точных CDR последовательностей АВ 1, АВ 7, АВ 11 или АВ 12 при вс ещ сохраняющейся способности антитела эффективно связывать CD25 (например, консервативные замены). Соответственно, в другом варианте изобретения антитело, полученное методом рекомбинантной ДНК, может со- 17013677 стоять из одной или более областей CDR, которые, например, на 90, 95, 98 или 99,5% гомологичны одной или более областей CDR АВ 1, АВ 7, АВ 11 или АВ 12. Помимо простого связывания CD25 или в дополнение к простому связыванию CD25 антитела, полученные методом рекомбинантной ДНК, такие как описанные выше, можно выбирать из-за сохранения ими других функциональных свойств антител по изобретению, таких как:(1) высокая аффинность связывания с CD25;(2) ингибирование или блокирование связывания CD25 с IL-2;(6) ингибирование индуцированной антителом против CD3 Т-клеточной пролиферации РМВС;(8) интернализация CD25, экспрессированных на Т клетках. Характеристика связывания моноклоналъных антител с CD25 Человеческие антитела против CD25 по изобретению можно выделять и характеризовать различными способами. Например, выбранные гибридомы можно выращивать в соответствующих колбах для очистки моноклональных антител. Затем супернатанты можно отфильтровать и упарить перед аффинной хроматографией с протеин А-сефарозой (для антител изотипа IgG1) (Pharmacia, Piscataway, NJ) или с сефарозой, покрытой антителом против человеческого IgG или протеин G-сефарозой в случае антител изотипа IgG3. Для гарантии чистоты элюированный IgG можно проверять с помощью гельэлектрофореза или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Буферный раствор можно заменить на PBS и концентрацию можно определять по OD280, используя коэффициент экстинкции 1.43. Моноклональные антитела можно аликвотировать и хранить при -80 С. Для того, чтобы определить, связываются ли выбранные человеческие моноклональные антитела против CD25 с уникальными эпитопами, можно использовать сайтнаправленный или полисайтнаправленный мутагенез. Для определения изотипа очищенных антител можно осуществлять изотипический ELISA. Лунки микротитрационных планшетов можно покрывать плнкой из 10 мкг/мл антитела против человеческогоIg в течение ночи при 4 С. После блокирования с помощью 5% BSA (альбумин бычьей сыворотки) содержимое планшетов реагирует с 10 мкг/мл моноклональных антител или контрольных очищенных изотипов при комнатной температуре в течение двух часов. Затем содержимое лунок может реагировать с зондами либо человеческих IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, IgE, IgA1, IgA2, либо человеческого IgMконъюгированной специфической щелочной фосфатазы. После отмывания планшеты обрабатывают субстратом pNPP (1 мг/мл) и анализируют при OD 405 нм. Чтобы продемонстрировать присутствие антител против CD25 в сыворотках иммунизированных мышей или связывание моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими CD25, можно применять проточную цитометрию. Коротко говоря, клеточные линии, экспрессирующие CD25 (выращенные в стандартных условиях культивирования) смешивают с моноклональными антителами в различных концентрациях в PBS, содержащем 0,1 BSA и 0,02% азида натрия, и инкубируют при 4 С в течение 30 мин. После отмывания клетки реагируют с меченным флуоресцеином антителом против человеческого IgG в тех же условиях, что и первичное окрашивание антитела. Образцы можно анализировать проточной цитометрией на проточном цитометре (например, на приборе Becton Dickinson FACS), используя светорассеяние и боковое рассеяние на одиночных живущих клетках. Альтернативный анализ с применением флуоресцентной микроскопии можно использовать, как дополнение к или вместо, проточной цитометрии. Этот метод делает возможной визуализацию отдельных клеток, но может иметь пониженную чувствительность, зависящую от плотности антигена. Человеческие IgG против CD25 можно дополнительно тестировать на реактивность в отношенииCD25 Вестерн-блоттингом. Коротко говоря, можно приготовить клеточные экстракты клеток, экспрессирующих CD25, и подвергнуть их электрофорезу на додецилсульфат натрия (SDS)-полиакриламидном геле. После электрофореза разделнные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют 20% нежирным молоком и гибридизуют с зондом испытуемых моноклональных антител. Связывание человеческого IgG можно обнаружить, применяя щелочную фосфатазу против IgG и обрабатывая (проявляя) таблетками субстрата BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO). Ингибирование активности клеток, экспрессирующих CD25 Помимо специфического связывания с CD25, человеческие моноклональные антитела против CD25 можно тестировать на их способность ингибировать различные активности клеток, таких как Т клеток и других лимфоцитов, экспрессирующих CD25. Например, можно, пользуясь обычными методами, провести анализы Т-клеточной пролиферации. В одном методе человеческие РВМС разводят в подходящей среде, а затем стимулируют, например, антителом против CD3 перед тем, как добавлять различные концентрации экспериментальных антител для определения влияния, которое они оказывают на Тклеточную пролиферацию. Т-клеточную пролиферацию очищенных Т клеток можно также оценивать в присутствии моноклональных антител против CD3 и против CD28.- 18013677 Анализы на MLR можно также проводить известными методами. Например, РВМС первого донора можно подвергнуть облучению и смешать с РВМС второго донора. Затем, меняя концентрации антител,можно их добавлять к клеткам, а затем измерять MLR ответ.II. Получение трансгенных отличных от человека животных, которые генерируют человеческие моноклональные антитела против CD25 Ещ в одном аспекте изобретение включает трансгенных или трансхромосомных отличных от человека животных, таких как трансгенные или трансхромосомные мыши, которые способны экспрессировать человеческие антитела, специфично связывающиеся с CD25. В особом варианте изобретение включает трансгенную или трансхромосомную мышь, имеющую геном, содержащий трансген тяжлой цепи человеческого происхождения, так что при иммунизации клетками, экспрессирующими CD25, мышь продуцирует человеческие моноклональные антитела против CD25. Трансген тяжлой цепи человеческого происхождения можно интегрировать в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенных, например, HuMAb, мышей, как подробно описано и показано на примерах в данном описании. Или же трансген тяжлой цепи человеческого происхождения можно сохранять вне хромосомы, как в случае трансхромосомных мышей (например, KM), описанных в Международной заявке WO 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные животные способны продуцировать многие изотипы человеческих моноклональных антител против CD25 (например, IgG, IgA и/или IgE), претерпевая V-D-V/V-J рекомбинацию и переключение изотипа. Дизайн трансгенного или трансхромосомного отличного от человека животного, которое отвечает на стимуляцию чужеродным антигеном с помощью спектра гетерологичных антител, требует, чтобы трансгены гетерологичных иммуноглобулинов в организме трансгенного животного корректно функционировали на всм пути развития В клетки. Это включает, например, переключение изотипа гетерологичного трансгена тяжлой цепи. Поэтому трансгены строят таким образом, чтобы можно было индуцировать переключение изотипа и один или более следующих признаков генов антитела: (1) высокий уровень экспрессии и е специфичность в отношении клеточного типа, (2) функциональную реаранжировку (перегруппировку) гена, (3) активацию исключения аллеля и ответ на него, (4) экспрессию достаточного первичного спектра (спектра первичных антител), (5) сигнальную трансдукцию,(6) соматическую гипермутацию и (7) доминирование локуса трансгена антитела в процессе иммунного ответа. Не все вышеуказанные критерии должны присутствовать обязательно. Например, в тех вариантах изобретения, в которых эндогенные локусы иммуноглобулинов трансгенного животного функционально разрушены (разорваны), трансген не нуждается в активации аллельного исключения. Кроме того, в тех вариантах изобретения, в которых трансген содержит функционально реаранжированный ген тяжлой и/или лгкой цепи иммуноглобулина, необязательным является второй критерий функциональной реаранжировки гена, по меньшей мере, для того трансгена, который уже является реаранжированным. Сведения общего характера о молекулярной иммунологии см. в Fundamental Immunology, 2nd edition (1989),Paul William E., ed. Raven Press, N.Y. В некоторых вариантах изобретения трансгенные или трансхромосомные отличные от человека животные, используемые для получения человеческих моноклональных антител по изобретению, в своей зародышевой линии (трансгенного животного) содержат реаранжированные, нереаранжированные трансгены или комбинацию реаранжированных и нереаранжированных гетерологичных трансгенов тяжлой и лгкой цепи иммуноглобулина. Каждый из трансгенов тяжлой цепи содержит, по меньшей мере, один CH ген. Кроме того, трансген тяжлой цепи может содержать функциональные последовательности-переключатели изотипа, которые способны поддерживать переключение изотипа гетерологичного трансгена, кодирующего многие CH гены в В клетках трансгенного животного. Такими последовательностями-переключателями могут быть такие последовательности, которые встречаются в природе в локусе зародышевой линии иммуноглобулина вида, который служит в качестве источника СН генов трансгена,или такие последовательности переключатели могут быть образованы из последовательностей, встречающихся в виде, который служит для получения трансгенной конструкции (трансгенное животное). Например, трансгенная конструкция человеческого происхождения, которая применяется для получения трансгенной мыши, может продуцировать более высокую частоту событий переключения изотипа, если она вводит последовательности-переключатели, аналогичные последовательностям-переключателям,которые встречаются в природе в локусе мышиной тяжлой цепи, так как, предположительно, мышиные последовательности-переключатели оптимизированы таким образом, чтобы функционировать с мышиной системой переключения, контролируемой рекомбиназой, тогда как последовательностипереключатели человеческого происхождения не оптимизированы таким образом. Последовательностипереключатели можно выделить и клонировать обычными методами клонирования или их можно синтезировать de novo из перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, созданных на основе опубликованной информации о последовательностях, относящихся к последовательностям области переключения (Mills et al., Nucl. Acids Res. 15:7305- 7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1:631-642 (1989. В случае каждого из вышеприведнных трансгенных животных функционально реаранжированные гетерологичные трансгены тяжлой и лгкой цепи иммуноглобулина обнаружены в значительной части В клеток трансгенного животного (по меньшей мере 10%).- 19013677 Трансгены, используемые для получения трансгенных отличных от человека животных по изобретению, включают трансген тяжлой цепи, содержащий ДНК, кодирующую (правильнее "соответствующую") по меньшей мере один вариабельный сегмент гена, один дополнительный сегмент, один соединяющий сегмент гена и по меньшей мере один сегмент константной области гена. Трансген лгкой цепи иммуноглобулина содержит ДНК, кодирующую (соответствующую) по меньшей мере один вариабельный сегмент гена, один соединяющий сегмент гена и по меньшей мере один сегмент константной области гена. Сегменты гена, "кодирующие" (вернее, соответствующие) сегменты (сегментам) генов лгкой и тяжлой цепи, являются гетерологичными для трансгенного животного в том отношении, что они образованы из или соотносятся с ДНК, соответствующей сегментам генов тяжлой и лгкой цепи, вида, не состоящего из трансгенного отличного от человека животного. В одном аспекте изобретения трансген построен таким образом, что отдельные сегменты гена являются неаранжированными, т.е. трансген не аранжирован таким образом, чтобы кодировать функциональную лгкую или тяжлую цепь иммуноглобулина. Такие неаранжированные трансгены содействуют рекомбинации V, D и J сегментов гена (функциональная реаранжировка) и предпочтительно содействуют включению всего или части D сегмента гена в полученную в результате реаранжированную тяжлую цепь иммуноглобулина в трансгенном животном при экспозиции с антигеном CD25. В альтернативном варианте изобретения трансгены содержат неаранжированный "минилокус". Такие трансгены, как правило, содержат значительную часть С, D и J сегментов, а также "субпопуляцию" сегментов V генов. В таких трансгенных конструкциях различные регуляторные последовательности,например промоторы, энхансеры, области-переключатели класса, последовательности доноров и акцепторов сплайсинга для процессирования РНК, сигналы рекомбинации и т.п., содержат соответствующие последовательности гетерологичной ДНК. Такие регуляторные последовательности могут быть включены в трансген того же самого или родственного вида отличного от человека животного, используемого в изобретении. Например, сегменты гена человеческого иммуноглобулина можно соединять в трансгене с энхансерной последовательностью иммуноглобулина грызунов для использования в трансгенной мыши. Или же синтетические регуляторные последовательности могут быть включены в трансген, в котором такие синтетические регуляторные последовательности не являются гомологичными функциональной последовательности ДНК, о которой известно, что она встречается в природе в геномах млекопитающих. Синтетические регуляторные последовательности создают по правилам согласованности (консенсуса), таким образом, что регуляторными последовательностями являются такие, которые определяют разрешнные последовательности акцепторного сайта сплайсинга или промоторного/энхансерного мотива. Например, минилокус содержит часть геномного локуса иммуноглобулина, имеющего по меньшей мере одну внутреннюю делецию (т.е. не на конце участка) заменимого участка ДНК (например, интрон или его часть) по сравнению с природным Ig локусом зародышевой линии. Предпочтительные трансгенные и трансхромосомные отличные от человека животные, например мыши, продуцируют значительный спектр иммуноглобулинов, практически в идеале похожий на спектр иммуноглобулинов человека после поправки на объм. Спектр в идеале приближается к спектру человека после поправки на объм, обычно разнесении(разнообразии) по меньшей мере около 10%, предпочтительно 25-50% или более. В целом получается по меньшей мере тысяча различных иммуноглобулинов (в идеале IgG), предпочтительно 104-106 или более,в зависимости от числа различных V, J и D областей, введнных в геном мыши и управляемых дополнительным разнообразием, вызванным реаранжировками V-(D)-J сегментов гена и случайными добавлениями в соединяющих областях. Как правило, иммуноглобулины проявляют аффинность (KD) к предварительно выбранным антигенам ниже 10-8 М, такую как аффинность, более низкая, чем 10-9 М, 10-10 М или 10-11 М или даже ниже. Трансгенные и трансхромосомные отличные от человека животные, например мыши, описанные выше, могут быть иммунизированы, например, клетками, экспрессирующими CD25. Или же трансгенные животные могут быть иммунизированы ДНК, кодирующей человеческие CD25. Животные затем продуцируют В клетки, которые претерпевают переключение класса путм рекомбинации-переключения (циспереключение) и экспрессируют иммуноглобулины, реактивные в отношении CD25. Иммуноглобулины могут представлять собой человеческие антитела (также называемые "антитела с последовательностями человеческого происхождения"), в них полипептиды тяжлой и лгкой цепи кодируются последовательностями трансгена человеческого происхождения, которые могут включать последовательности, образованные при использовании соматической мутации и рекомбинаторных (рекомбинированных) соединений V области, а также последовательности, кодируемые генами зародышевой линии; эти человеческие антитела можно считать практически идентичными полипептидной последовательности, кодируемой сегментами VL И JH или VH, DH и JH генов человеческого происхождения, даже несмотря на то, что в результате соматической мутации и различия V-J и V-D-J рекомбинированных соединяющих частей, могут присутствовать другие последовательности незародышевой линии. Вариабельные области каждой цепи антитела, как правило, по меньшей мере на 80% аналогичны сегментам V, J зародышевой линии и, в случае тяжлых цепей, V, D и J генным сегментам зародышевой цепи человеческого происхождения; часто по меньшей мере на 85% аналогичны последовательностям- 20013677 зародышевой линии в трансгене; часто на 90 и 95% аналогичны последовательностям зародышевой линии в трансгене. Однако, так как последовательности незародышевой линии вводятся соматической мутацией и VJ, и VDJ соединением, антитела с последовательностью человеческого происхождения часто будут иметь некоторые последовательности вариабельной области, которые не кодируются сегментамиV, D или J гена человеческого происхождения, обнаруженными в трансгене(ах) человеческого происхождения в зародышевой линии мышей. Как правило, такие последовательности нечеловеческого происхождения (или отдельные положения нуклеотидов) являются кластером (собираются в кластер) в или около CDR, или в областях, где, как известно, соматические мутации собираются в кластер. Другой аспект изобретения включает В клетки трансгенных или трансхромосомных отличных от человека животных по данному описанию. В клетки можно использовать для получения гибридом, экспрессирующих человеческие моноклональные антитела, которые связываются с высокой аффинностью(например, константа равновесной диссоциации (KD) ниже 10-8 М) с человеческим CD25. Так, в другом варианте изобретение включает гибридому, которая продуцирует человеческое антитело, имеющее аффинность (KD) ниже 10-8 М, такую как аффинность, более низкая, чем 10-9 М, 10-10 М или 10-11 М или даже ниже, если е определять, анализируя клетки, экспрессирующие CD25, по методу Скэтчарда, используя меченное радиоактивной меткой моноклональное антитело, или определяя полумаксимальную концентрацию связывания методом FACS анализа, или анализом с применением поверхностного плазмонного резонанса на приборе BIAcore. Моноклональные антитела по данному описанию содержат лгкую цепь с последовательностью человеческого происхождения, состоящую из (1) вариабельной области лгкой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой генным сегментом VL человеческого происхождения и генным сегментом VL человеческого происхождения, и 2) константной области лгкой цепи, кодируемой генным сегментом CL человеческого происхождения; и тяжлую цепь с последовательностью человеческого происхождения, состоящую из (1) вариабельной области тяжлой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой генным сегментом VH человеческого происхождения,областью D и генным сегментом JH человеческого происхождения, и 2) константной области тяжлой цепи, кодируемой генным сегментом CL человеческого происхождения. Следует отметить, что человеческие D гены могут быть значительно изменены событиями рекомбинации и соматической мутации, так что первоначальную последовательность человеческой зародышевой линии бывает нелегко распознать. Создание человеческих моноклональных антител с высокой аффинностью против CD25 можно упростить с помощью метода расширения спектра сегментов вариабельной области человеческого гена в трансгенном отличном от человека животном, имеющем геном, содержащий интегрированный трансген человеческого иммуноглобулина, причм указанный метод включает введение в геном V гена трансгена,содержащего генные сегменты V области, которые отсутствуют в указанном интегрированном трансгене человеческого иммуноглобулина. Часто трансген V области представляет собой искусственную хромосому дрожжей (YAC, И.х.д.), содержащую часть набора генных сегментов VH И VL (VK) человеческого происхождения, которые могут встречаться в геноме человека или могут быть по отдельности сплайсироваться вместе методами рекомбинантной ДНК, они могут включать нестандартные или выпадающиеV-генные сегменты. Часто по меньшей мере пять или более функциональных V-генных сегментов содержится на YAC (И.х.д.). В этом варианте возможно получить трансгенное животное методом расширения V спектра, при этом животное экспрессирует цепь иммуноглобулина, содержащую последовательность вариабельного домена, кодируемую сегментом V-генной области, присутствующим в трангене V области, и С области, кодируемой трансгеном человеческого Ig. С помощью метода расширения V спектра можно получать трансгенных животных, имеющих по меньшей мере 5 различных V генов; а также можно получить животных, содержащих по меньшей мере около 24 V генов или более. Некоторые Vгенные сегменты могут быть нефункциональными (например, псевдогены и т.п.); если требуется, эти сегменты можно сохранять или можно селективно делетировать (удалять) методами рекомбинантной ДНК, доступными специалистам в данной области техники. Когда методом рекомбинантной ДНК создана такая мышиная последовательность зародышевой линии, которая содержит функциональную YAC, имеющую расширенный спектр V сегментов, практически отсутствующий в трансгене человеческого Ig, содержащем J и С генные сегменты, признак можно размножить и "развести" в других генетических средах, включая среды, в которых функциональныеYAC, имеющие расширенный спектр V сегментов, введены в зародышевую линию отличного от человека животного, имеющую трансген другого человеческого Ig. Многие функциональные YAC, имеющие расширенный спектр V сегментов, можно ввести в зародышевую линию для работы с трансгеном человеческого Ig (или многими трансгенами человеческих Ig). Хотя такие трансгены в данном описании называются YAC трансгенами, такие трансгены, будучи интегрированы в геном, могут практически утратить последовательности дрожжей, такие как последовательности, требуемые для автономной репликации в дрожжах; такие последовательности могут необязательно быть удалены методом рекомбинантной ДНК (например, рестрикцией при гидролизе и гель-электрофорезом в пульсирующем электрическом поле или другим подходящим методом), после репликации в дрожжах они более не нужны (например, пе- 21013677 ред введением в мышиную клетку ES или мышиный фагоцит). Методы распространения признака экспрессии иммуноглобулина с последовательностями человеческого происхождения включают разведение трансгенного животного, имеющего трансген(-ы) человеческого(их) Ig, и, необязательно, также имеющего функциональную YAC с расширенным спектром V сегментов. Как VH, так и VL генные сегменты могут присутствовать на YAC. Трансгенное животное можно разводить в любой (генной) среде, нужной практику, включая среды, содержащие (хранящие) другие трансгены человеческого происхождения,включающие трансгены человеческих Ig и/или трансгены, кодирующие другие белки человеческих лимфоцитов. Изобретение также включает высокоаффинный иммуноглобулин с последовательностью человеческого происхождения, продуцируемый трансгенной мышью, имеющей трансген с YAC, содержащей расширенный спектр V области. Хотя вышесказанное описывает предпочтительный вариант трансгенного животного по изобретению, рассматриваются другие варианты изобретения, которые делятся на три класса:I) трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с нереаранжированной тяжлой и реаранжированной лгкой цепью;II) трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с нереаранжированной тяжлой и нереаранжированной лгкой цепью; иIII) трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с реаранжированной тяжлой и нереаранжированной лгкой цепью. Порядок предпочтительности этих классов (категорий) трансгенного животного следующий: IIIIII, где гены эндогенной лгкой цепи (или, по меньшей мере,ген) нокаутированы с помощью гомологичной рекомбинации (или другим методом), и IIIIII, где гены эндогенной лгкой цепи не нокаутированы и должны быть доминирующими при использовании аллельного исключения.III. Биспецифические/Полиспецифические молекулы, связывающиеся с CD25 Ещ в одном варианте изобретения человеческие моноклональные антитела к CD25 могут быть дериватизированы или связаны с другой функциональной молекулой, например другим пептидом или белком (например, с Fab' фрагментом) с образованием биспецифической или полиспецифической молекулы,которая связывается со многими сайтами связывания или эпитопами-мишенями. Например, антитело по изобретению может быть функционально связано (например, химической связью, генетическим слиянием (гибридизацией), нековалентной ассоциацией или иным способом) с одной или более связующих молекул, таких как другое антитело, пептид или связующий миметик. Следовательно, настоящее изобретение включает биспецифические и полиспецифические молекулы, содержащие по меньшей мере одну специфичность связывания с CD25 и вторую специфичность связывания со вторым эпитопом-мишенью. В особом варианте изобретения вторым нацеленным эпитопом(эпитопом-мишенью) является CD3, CD4, IL-15R, мембраносвязанный или рецепторносвязанный TNFили мембраносвязанный или рецепторносвязанный IL-15R. В другом варианте изобретения вторым эпитопом-мишенью является человеческий FcRI (CD64) или человеческий FcRI (CD89), или Т-клеточный рецептор. Следовательно, изобретение включает биспецифические и полиспецифические молекулы, способные связываться с эффекторными клетками, экспрессирующими как FcR, FcR, так и FcR (например, моноцитами, макрофагами или полиморфонуклеарами (PMN, и с клетками-мишенями, экспрессирующими CD25. Эти биспецифические и полиспецифические молекулы нацеливают клетки, экспрессирующие CD25, на эффекторную клетку и, подобно человеческим моноклональным антителам по изобретению, включают активности эффекторных клеток, опосредованные Fc рецептором, такие как фагоцитоз клеток, экспрессирующих CD25, ADCC, высвобождение цитокинов или образование аниона супероксида. Кроме того, биспецифические и полиспецифические молекулы по изобретению могут включать третью специфичность связывания, помимо специфичности связывания антител против Fc и специфичности связывания антител против CD25. В одном варианте изобретения третья специфичность связывания представляет собой участок фактора противоусиления (anti-enhancement) (EF), например молекула,которая связывается с поверхностным белком, включнным в цитотоксическую активность, и тем самым,повышает иммунный ответ на клетку-мишень. Участком (частью) фактора противоусиления (antienhancement) (EF) может быть антитело, функциональный фрагмент антитела или лиганд, который связывается с данной молекулой, например, антигеном или рецептором, и тем самым приводит к усилению влияния детерминант связывания на Fc рецептор или антиген клетки-мишени. "Участок фактора противоусиления" может связываться с Fc рецептором или антигеном клетки-мишени. Или же "участок фактора противоусиления"может связываться с объектом (частицей), отличным от объекта, с которым связываются первая и вторая специфичности. Например, участок фактора противоусиления может связывать цитотоксическую Т клетку (например, через CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 или другую иммунную клетку, которая приводит к повышенному иммунному ответу против клетки-мишени). В одном варианте изобретения биспецифические и полиспецифические молекулы по изобретению содержат в качестве специфичности связывания по меньшей мере одно антитело, включая Fab, Fab',F(ab')2, Fv или scFv. Антитело также может димером лгкой или тяжлой цепи или его минимальным- 22013677 фрагментом, таким как Fv, или одноцепочечной конструкцией, описанной Ladner et al. в патенте США 4946778. Антитело может также быть химерным белком связывающего домена иммуноглобулина, описанным в патентных заявках США 2003/0118592 и 2003/0133939. В одном варианте изобретения специфичность связывания с Fc рецептором обеспечивается человеческим моноклональным антителом, связывание которого не блокируется человеческим иммуноглобулином G (IgG). Применяемый в данном описании термин "IgG рецептор" относится к любому из восьми генов -цепи, локализованных на хромосоме 1. Эти гены кодируют всего двенадцать изоформ трансмембранных или растворимых рецепторов, которые группируются в три класса Fc рецепторов: FcRI(CD64), FcRII(CD32) и FcRIII (CD16). В одном предпочтительном варианте изобретения Fc рецептор представляет собой человеческий высокоаффинный FcRI. Продуцирование и характеристика этих предпочтительных моноклональных антител описаныFanger et al. в Международной заявке WO 88/00052 и в Патенте США 4954617. Эти антитела связываются с эпитопом FcRI, FcRII и FcRIII в сайте, который отличен от сайта связывания Fc рецептора и, таким образом, их связывание практически не блокируется физиологическими уровнями IgG. Специфические антитела против FcRI, применимые по данному изобретению, представляют собой MAb 22, MAb 32, MAb 44, MAb 62 и MAb 197. В других вариантах изобретения антитело против FcRI представляет собой гуманизированную форму Mab 22 (Н 22). Продуцирование и характеристика антитела Н 22 описаны в Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 и в Международной заявке WO 94/10332. Клеточная линия, продуцирующая Н 22 антитело, депонирована в Американской коллекции типовых культур 4 ноября 1992 г. под названием HA022CL1 и имеет No. CRL 11177. В других предпочтительных вариантах изобретения специфичность связывания с Fc рецептором обеспечивается антителом, которое связывается с рецептором человеческого IgA, например с Fc-альфа рецептором (FcRI (CD89, связывание которого предпочтительно не блокируется человеческим иммуноглобулином A (IgA). Предполагается, что термин "IgA рецептор" включает генный продукт одного гена (FcRI), локализованного на хромосоме 19. Известно, что этот ген кодирует несколько альтернативно сплайсированных трансмембранных изоформ от 55 до 110 кДа. FcRI (CD89) конститутивно экспрессируется на моноцитах/макрофагах, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, но не на популяции неэффекторных клеток. FcRI имеет аффинность среды как в отношении IgA1, так и в отношении IgA2,которая повышается при экспозиции с цитокинами, такими как G-CSF или GM-CSF (Morton, H.C. et al.(1996) Critical Reviews in Immunology 16:423- 440). Описаны четыре FcRI-специфических моноклональных антитела, идентифицированные как A3, А 59, А 62 и А 77, которые связывают FcRI вне лигандсвязывающего домена IgA (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).FcRI и FcRI являются предпочтительными триггерными рецепторами для применения по изобретению, так как они (1) экспрессируются первично на иммунных эффекторных клетках, например на моноцитах, PMN, макрофагах и дендритных клетках; (2) экспрессируются с высокими уровнями (например,5000-100000 на клетку); (3) являются медиаторами цитотоксических активностей (например, ADCC, фагоцитоза) и (4) опосредуют повышенную антигенную презентацию антигенов, включая аутоантигены,нацеленные на них. Выражение "специфическое антитело эффекторной клетки" по данному описанию относится к антителу или функциональному фрагменту антитела, которые связываются с Fc рецептором эффекторных клеток. Предпочтительные антитела для применения в качестве предмета изобретения связываются с эффекторными клетками по сайту, который не связан эндогенным иммуноглобулином. Применяемый в данном описании термин "эффекторная клетка" относится к иммунной клетке, которая участвует в эффекторной фазе иммунного ответа, в противоположность когнитивной фазе и фазе активации иммунного ответа. Примеры иммунных клеток включают клетки миелоидного или лимфоидного происхождения, например, лимфоциты (например, В клетки и Т клетки, включая цитолитические Т клетки (CTL), киллерные клетки (клетки-киллеры), природные клетки-киллеры, макрофаги, моноциты,эозинофилы, нейтрофилы, полиморфонуклеары, гранулоциты, тучные клетки и базофилы. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют специфические Fc рецепторы и несут специфические иммунные функции. В предпочтительных вариантах изобретения эффекторная клетка способна индуцироватьADCC, например нейтрофил, способный индуцировать ADCC. Например, моноциты, макрофаги, которые экспрессируют FcR, участвуют (включены) в специфическом киллинге клеток-мишеней и презентации антигенов другим компонентам иммунной системы, или в связывании с клетками, которые презентируют антигены. В других вариантах изобретения эффекторная клетка может фагоцитировать нацеленный антиген, клетку-мишень или микроорганизм. Экспрессия конкретного FcR на эффекторной клетке может регулироваться гуморальными факторами, такими как цитокины. Найдено, например, что экспрессия FcRI апрегулируется интерфероном гамма (IFN-). Эта повышенная экспрессия повышает цитотоксическую активность FcRI-несущих клеток против мишеней. Эффекторная клетка может фагоцитировать или лизировать антиген-мишень или клетку-мишень. Термин "клетка-мишень" должен означать любую клетку субъекта (например, человека или животного), на которую может быть нацелена композиция (например, моноклонального антитела, биспецифи- 23013677 ческой или полиспецифической молекулы) по изобретению. В предпочтительных вариантах изобретения клетка-мишень представляет собой клетку, экспрессирующую или сверхэкспрессирующую CD25. Клетки, экспрессирующие CD20, как правило, включают активированные Т клетки, моноциты и В клетки. Биспецифические и полиспецифические молекулы по настоящему изобретению можно получать химическими методами (см., например, D.M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807), методами "полидома" (см. Патент США 4474893, выданный Reading), или методами рекомбинантной ДНК. В частности, биспецифические и моноспецифические молекулы по данному изобретению можно получать конъюгацией компонентов специфичностей связывания, например специфичностей связывания против FcR и CD25, применяя методы, известные в технике и приведнные в примерах в данном описании. Например, каждую специфичность связывания биспецифической и полиспецифической молекулы можно получать отдельно, а затем конъюгировать друг с другом. Когда специфичности связывания представляют собой белки или пептиды, для ковалентной конъюгации можно использовать множество линкеров и сшивающих агентов. Примеры сшивающих агентов включают протеин А, карбодиимид, Nсукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA), 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойную кислоту) (DTNB), офенилендималеинимид (oPDM), N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (SPDP) и сульфосукцинимидинил 4-(N-малеинимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) (см., например, Karpovskyet al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M.A. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Другие методы включают методы, описанные Paulus, Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118- 132); Brennan et al. (Science(1985) 229:81-83) и Gleimie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Предпочтительными конъюгирующими агентами являются SATA и сульфо-SMCC, оба выпускаются Pierce Chemical Co. (Rockford, IL). Если специфичности связывания представляют собой антитела, их можно конъюгировать с помощью связывания сульфгидрильных групп С-концевых шарнирных областей двух тяжлых цепей. В особенно предпочтительном варианте изобретения шарнирная область модифицирована таким образом, чтобы перед конъюгацией содержать нечтное число сульфгидрильных остатков, предпочтительно один. Или же, обе специфичности связывания можно кодировать в одном и том же векторе, а экспрессировать и собирать в той же самой клетке- хозяине. Этот метод особенно применим в тех случаях, когда биспецифическая и полиспецифическая молекула представляет собой химерный белок MAbMAb,MAbFab, FabF(ab')2 или лигандFab. Биспецифическая и полиспецифическая молекула по изобретению, например биспецифическая молекула, может быть одноцепочечной молекулой, такой как одноцепочечное биспецифическое антитело, одноцепочечная биспецифическая молекула, содержащая одноцепочечное антитело и детерминанту связывания, или одноцепочечная биспецифическая молекула, содержащая две детерминанты связывания. Биспецифические и полиспецифические молекулы могут также представлять собой одноцепочечные молекулы или могут содержать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Методы получения би- и полиспецифических молекул описаны, например, в патентах США 5260203; 5455030; 4881175; 5132405; 5091513; 5476786; 5013653; 5258498 и 5482858. Связывание биспецифических и полиспецифических молекул с их специфическими мишенями можно подтвердить твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA), радиоиммуноанализом (RIA),анализом FACS, биоанализом (например, ингибированием роста), BIAcore анализом или вестернблоттингом. Каждый из этих анализов, как правило, обнаруживает присутствие комплексов белокантитело, представляющих особый интерес, с помощью меченого реагента (например, антитела), специфического в отношении представляющего интерес комплекса. Например, комплексы FcR-антитело можно обнаружить, используя, например, связанное с ферментом антитело или фрагмент антитела, который распознат и специфически связывается с комплексами антитело-FcR. Или же, комплексы можно обнаруживать, используя любой из множества других иммуноанализов. Например, антитело можно метить радиоактивной меткой и использовать в радиоиммуноанализе (RIA) (см., например, Weintraub, В., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The EndocrineSociety, March, 1986). Радиоактивный изотоп можно обнаружить такими способами, как применение счтчика -излучения или сцинтилляционного счтчика, или ауторадиографией.IV. Иммуноконъюгаты В другом аспекте настоящего изобретения человеческие моноклональные антитела против CD25 конъюгированы с терапевтической частицей, такой как цитотоксин, лекарственным веществом (например, иммуносупрессором) или радиоизотопом. Такие конъюгаты называются в данном описании "иммуноконъюгатами". Иммуноконъюгаты, которые включают один или более цитотоксинов, называются"иммунотоксинами". Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который является вредным для клеток (например, убивает клетки). Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидинD, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1 дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Подходящие терапевтические агенты для образования иммуноконъюгатов по изобретению включают, но без ограничения, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, ци- 24013677 тарабин, флюдарабин, 5-флуорурацил декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин,thioepa, хлорамбуцил, мельфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан,дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиамин платина (II) (DDP), цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (прежнее название дауномицин) и доксорубицин), антибиотики(АМС и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин). Другие примеры терапевтических цитотоксинов, которые можно конъюгировать с антителом по изобретению, включают калихеамицины и дуокармицины. Антитела по данному изобретению также могут быть конъюгированы с радиоизотопом, например с йодом-131, иттрием-90 или индием-111, для получения цитотоксических радиофармацевтических средств для лечения нарушения, связанного с CD25, такого как рак. Конъюгаты антител по изобретению можно использовать для модификации данного биологического ответа, а долю лекарственного вещества не следует конструировать как ограничивающуюся классическими химическими терапевтическими агентами. Например, частица, (доля) лекарственного вещества может представлять собой белок или полипептид, обладающий заданной биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активный токсин или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин А, экзотоксин псевдомонад или дифтерийный токсин, или агент, активный на клеточной поверхности, такой как ферменты фосфолипазы, например фосфолипаза С. Методы конъюгации таких терапевтических фрагментов с антителами хорошо известны, см., например, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drags In Cancer Therapy", в Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985), Hellstrom etPress 1985), и Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58(1982). Ещ в одном варианте человеческие моноклональные антитела по изобретению присоединены к линкеру-хелатору (например, тиуксетану), который способствует конъюгации антитела с радиоизотопом.V. Фармацевтические композиции В другом аспекте настоящее изобретение охватывает композиции, включая фармацевтические композиции, содержащие одно или комбинацию человеческих моноклинальных антител по настоящему изобретению. Композиции можно готовить с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, а также с другими известными адъювантами и эксципиентами, в соответствии с традиционными методами, такими как методы, описанные в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition,Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Композиции по изобретению можно также применять в комбинированной терапии, т.е. объединять с другими агентами, релевантными для заболевания или состояния, которое следует лечить. Например,комбинированная терапия может включать композицию по настоящему изобретению по меньшей мере с одним иммунодепрессантом (иммуносупрессором), по меньшей мере с одним противовоспалительным агентом, по меньшей мере одним антипсориатическим агентом или по меньшей мере одним химиотерапевтическим агентом. В одном варианте изобретения такие агенты включают один или более иммунодепрессантов, таких как циклоспорин, азатиоприн, микофенольную кислоту, микофенолят мофетила, кортикостероиды, такие как преднизон, метотрексат, соли золота, сульфасалазин, противомалярийные средства, бреквинар, лефлюномид, мизорибин, 15-дезоксиспергуалин, 6-меркаптопурин, циклофосфамид, рапамицин, такролимус(FK-506), OKT3, антитимоцит глобулин и т.д. В другом варианте изобретения композиции по изобретению применяют в комбинации с двумя или более иммунодепрессантов (иммуносупрессоров), таких как преднизон или циклоспорин; преднизон,циклоспорин и азатиоприн или преднизон, циклоспорин и микофенолят мофетила. В другом варианте изобретения такие терапевтические агенты включают один или более противовоспалительных агентов, таких как стероидное лекарственное средство или НСПВС (нестероидное противовоспалительное средство). Предпочтительные агенты включают, например, аспирин и другие салицилаты, ингибиторы Сох-2, такие как рофекоксиб и целекоксиб, НСПВС, такие как ибупрофен, фенопрофен, напроксен, сулиндак, диклофенак, пироксикам, кетопрофен, дифлунизал, набуметон, этодолак,оксапрозин и индометацин. В другом варианте изобретения такие терапевтические агенты включают одно или более DMARD,таких как метотрексат, гидроксихлорокин, сульфасалазин, ингибиторы синтеза пиримидина, например лефлуномид, блокаторы IL-1 рецептора, например анакинра, и блокаторы TNF-, например этанерсепт,инфликсимаб и адалимумаб. Другими подходящими DMARD являются антитела против IL-6R, CTLA4Ig и антитела против IL-15.- 25013677 В другом варианте изобретения такие терапевтические агенты включают один или более агентов для лечения воспалительных или гиперпролиферативных заболеваний кожи, такие как лекарственные вещества местного действия, включая угольную смолу, витамин А, антралин, кальципотриен, таразотен,и кортикостероиды, лекарственные вещества для перорального применения или для инъекций, такие как кортикостероиды, метотрексат, ретиноиды, например ацикретин, циклоспорин, этанерсепт, алефасепт,эфалузимаб, 6-тиогуанин, микофенолят мофетила, такролимус (FK-506) и гидроксимочевина. Другими примерами являются CTLA4Ig и инфликсимаб. Другие методы лечения включают экспозицию с солнечным светом и фототерапию, в том числе УФВ (ультрафиолет В, широкая и узкая полоса), УФА (ультрафиолет А) и PUVA (ПУФА, псорален метоксален плюс ультрафиолет А). В другом варианте композиции по изобретению применяют в комбинации с двумя или более вышеприведнных методов терапии, таких как метотрексат + фототерапия (PUVA или УФА); метотрексат + ациретин; ациретин + фототерапия (PUVA или УФА); метотрексат + ациретин + фототерапия (PUVA или УФВ); гидроксимочевина + фототерапия (PUVA или УФВ); гидроксимочевина + ациретин; циклоспорин+ метотрексат или кальципотриен + фототерапия (УФВ). Ещ в одном варианте изобретения такие терапевтические агенты включают один или более химиотерапевтических агентов, таких как доксорубицин, цисплатин, блеомицин, кармустин, циклофосфамид,виндезин, винкристин и хлорамбуцил. Ещ в одном варианте антитела по настоящему изобретению можно вводить в сочетании с лучевой терапией и/или с трансплантацией костного мозга. Ещ в одном варианте антитела по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с другими антителами, например с другими иммуносупрессорными человеческими моноклональными антителами, такими как антитела, связывающиеся с р 75 IL-2 рецептора, или антитела, связывающиеся, например, с МНС, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, В 7, CD40, CD45, IFN-, TNF-, IL-4, IL-5, IL-6R, IL-7, IL-8, IL10, CD11a, CD20 или CD58, или антитела, связывающиеся с их лигандами; или в комбинации с другими иммуномодуляторами, например растворимым IL-15R или IL-10. Выражение "фармацевтически приемлемый носитель" включает все физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и снижающие всасывание агенты и т.п. Предпочтительно носитель пригоден для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, с помощью инъекции или вливания (инфузии. Выражение "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли, которая сохраняет заданную биологическую активность исходного соединения и не имеет никакого нежелательного токсикологического действия (см., например, Berge, S.M. et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1- 19). Примеры таких солей включают соли присоединения кислоты и соли присоединения основания. Соли присоединения кислоты включают соли, образованные присоединением нетоксических неорганических кислот, таких как хлористо-водородная, азотная, фосфорная, серная, бромисто-водородная, йодисто-водородная, фосфорная кислоты и т.п., а также нетоксических органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещнные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, ароматические сульфокислоты и т.п. Соли присоединения основания включают соли, образованные присоединением оснований щелочных и щелочно-земельных металлов, таких как натрий, калий, магний,кальций и т.п., а также нетоксических органических аминов, таких как N,N'-дибензилэтилендиамин, Nметилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п. Композиции по данному изобретению, включая фармацевтические (терапевтические) композиции,можно вводить различными методами, известными в технике. Как понятно специалисту в данной области техники, путь и/или способ введения меняется в зависимости от желаемого результата. Активные соединения можно приготовить с носителями, которые предохраняют соединение от быстрого высвобождения, как в препарате пролонгированного действия (с регулируемым выделением), включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые (биоразрушающиеся), биосовместимые полимеры, такие как сополимер этилена с винилацетатом, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры и полимолочную кислоту. Методы приготовления таких препаратов хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker,Inc., New York, 1978. Для введения композиций по изобретению определнными методами может быть необходимо покрыть соединение оболочкой из материала, предупреждающего его инактивацию, или вводить соединение одновременно с этим материалом. Например, соединение можно вводить субъекту в подходящем носителе, например, в липосомах, или в разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический солевой раствор и водные буферные растворы. Липосомы включают эмульсииCGF вода-в-масле-в-воде, а также обычные липосомы (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27). Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии или стерильные порошки для мгновенного приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в техни- 26013677 ке. Рассматривается применение в фармацевтических композициях по изобретению любых обычных сред или агентов за исключением тех, которые несовместимы с активным компонентом. В композиции могут вводиться активные добавки. Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильны и устойчивы в условиях производства и хранения. Композицию можно готовить в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, пригодной для высоких концентраций лекарственного вещества. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол(например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Соответствующую текучесть можно сохранять, например, с помощью покрытия, такого как лецитин, путм сохранения требуемого гранулометрического состава в случае дисперсии и с помощью поверхностноактивных веществ. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические агенты,например сахара, полиолы, такие как маннит, сорбит, или хлористый натрий. Пролонгированное всасывание инъецированных композиций можно обеспечить, включая в композицию агент, который замедляет всасывание, например, солей-моностеаратов и желатина. В одном варианте человеческие моноклональные антитела по изобретению вводят в кристаллической форме в виде подкожной инъекции, ср. Yang et al. (2003), PNAS, 100(12):6934- 6939. При необходимости стерильные растворы для инъекций можно приготовить, вводя активное соединение в требуемом количестве в подходящем растворителе с одним из или с комбинацией ингредиентов,перечисленных выше, с последующей стерилизационной микрофильтрацией. Как правило, дисперсии получают, вводя активное соединение в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие нужные ингредиенты, выбранные из вышеперечисленных. В случае применения стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными методами приготовления являются вакуумная сушка и сушка в замороженном состоянии (лиофилизация), которые дают порошок активного ингредиента плюс любого нужного ингредиента из их раствора, предварительно очищенного стерилизационной микрофильтрацией. Схемы прима доз корректируют таким образом, чтобы обеспечить оптимальную нужную реакцию(например, терапевтический ответ). Например, можно вводить единичный болюс, можно вводить несколько раздельных доз во времени или дозу можно пропорционально снизить или повысить, в соответствии с острой необходимостью, возникающей при лечении. Особенно предпочтительными являются парентеральные композиции, приготовленные в виде стандартной лекарственной формы, из-за простоты введения и однородности лекарственной формы. Выражение "стандартная лекарственная форма (доза)" по данному описанию относится к физически дискретным единицам лекарственной формы, применяемым как единичные дозы, для проходящих лечение субъектов; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, вычисленное исходя из того, что требуется получить заданный терапевтический эффект, в сочетании с нужным фармацевтическим носителем. Технические условия для стандартных лекарственных форм по изобретению диктуются (а) уникальными характеристиками активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который требуется достичь, и (б) ограничениями,присущими технике приготовления препарата из такого активного соединения, для лечения чувствительности у индивидуума, - и непосредственно зависят от требований, указанных в (а) и (б). Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеин гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфит натрия,сульфит натрия и т.п.; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как алкорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфатокоферол и т.п.; и (3) агенты, хелатирующие металлы, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п. Терапевтические композиции по настоящему изобретению можно готовить для конкретных способов введения, таких как пероральный, назальный, местный (включая трансбуккальное и подъязычное),ректальный, вагинальный и/или парентеральный. Обычно препараты могут находиться в виде стандартной лекарственной формы (в виде унифицированных доз) и могут быть приготовлены любыми методами, известными в технике фармации. Количество активного ингредиента, которое можно объединять с материалом носителя для получения стандартной лекарственной формы, в значительной мере зависит от субъекта, проходящего лечение, и конкретного способа применения. Количество активного ингредиента,которое можно объединять с материалом носителя для получения стандартной лекарственной формы,как правило, таково, чтобы композиция вызывала терапевтический эффект. Обычно, если исходить из ста процентов, это количество находится в интервале, примерно 0,01-99% активного ингредиента, предпочтительно около 0,1-70%, наиболее предпочтительно около 1-30%. Препараты по настоящему изобретению, пригодные для вагинального применения, включают также пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или препараты в виде спрея, содержащие такие носители, о которых известно в технике, что они являются подходящими. Лекарственные формы композиций по данному изобретению для местного или трансдермального (чрескожного) применения включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и летучие препараты для ингаляций. Активное соединение можно смешивать в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носите- 27013677 лем и с любыми нужными консервантами, буферами или диспергаторами. Выражения "парентеральное введение (применение)" и "применяемый парентерально" по данному описанию означают способы введения (применения), иные нежели энтеральный и местный, обычно с помощью инъекции, и включает, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, подоболочечную, интракапсулярную, интраорбитальную, интракардиальную, интрадермальную,интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, интраартикулярную, субкапсулярную, субарахноидную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию. Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях по изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло,и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Должна сохраняться подходящая текучесть, например, за счт использования материалов для покрытия, таких как лецитин, за счт сохранения гранулометрического состава, в случае дисперсий, и за счт использования поверхностноактивных веществ. Эти композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, увлажняющие средства, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предупреждение присутствия микроорганизмов можно обеспечить как с помощью стерилизации, см. выше, так и включением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Также может быть желательным включение в композиции изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, пролонгированное всасывание фармацевтической формы для инъекций можно осуществить, включая агенты, которые замедляют всасывание, такие как моностеарат алюминия и желатин. Когда соединения по настоящему изобретению вводят в виде фармацевтических препаратов людям или животным, их можно давать индивидуально или в виде фармацевтической композиции, содержащей,например, 0,01-99,5% (более предпочтительно 0,1-90%) активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Вне зависимости от выбранного способа применения, соединения по настоящему изобретению, которые могут применяться в соответствующей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции по настоящему изобретению готовят в фармацевтически приемлемых лекарственных формах обычными методами, известными специалистам в данной области техники. Действительные уровни доз активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут варьироваться таким образом, чтобы получать количество активного ингредиента, которое позволяет эффективно достигать нужный терапевтический ответ у конкретного пациента,для композиции и способа введения, не являясь при этом токсическим для пациента. Выбранный уровень дозы зависит от ряда фармакокинетических факторов, включая активность конкретных применяемых композиций соединений по данному изобретению, или их сложного эфира, соли или амида; способ применения, время применения, скорость экскреции конкретного применяемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, применяемые в комбинации с конкретными применяемыми композициями, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и историю болезни проходящего лечение пациента и другие подобные общеизвестные в медицинской технике факторы. Врач или ветеринар, имеющий обычный опыт в данной области техники, может легко определить и прописать требуемое эффективное количество фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать с доз соединений по изобретению, применяемых в фармацевтических композициях по изобретению, более низких, чем требуется, для достижения нужного терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозу до достижения нужного эффекта. Как правило, подходящей суточной дозой соединения по изобретению является такое количество соединения, которое является самой низкой эффективной для получения терапевтического эффекта дозой. Такая эффективная доза, как правило, зависит от описанных выше факторов. Предпочтительно, чтобы введение было внутривенным, внутримышечным, интраперитонеальным или подкожным, предпочтительно проксимальное введение в нужное место. Хотя соединение по настоящему изобретению можно вводить индивидуально, предпочтительно его вводить в виде фармацевтического состава (композиции, препарата). Лекарственную дозу можно определять или корректировать, определяя количество моноклональных антител против CD25 в кровотоке в различные временные точки после введения в биологический образец, используя антиидиотипические антитела, нацеленные на антитела против CD25. Человеческие моноклональные антитела по изобретению можно вводить для предупреждения отторжения трансплантата при индукционном лечении, т.е. в качестве профилактической кратковременной терапии для однократного или многократного применения перед трансплантацией и в самой ранней фазе после трансплантации, например незадолго до трансплантации и вплоть до 3 месяцев после трансплантации. В одном варианте изобретения моноклональные антитела по изобретению можно, например, вво- 28013677 дить для предупреждения отторжения трансплантата в общей дозе около 20-100 мг, например, в виде внутривенных вливаний (инфузий) по 15 или 20 мг, причм первую дозу вводят перед операцией, а последующие дозы вводят в первые 10 дней после операции. Или же дозы можно вводить в виде болюсных инъекций. В другом варианте моноклональные антитела по изобретению для предупреждения отторжения трансплантата можно вводить в виде доз 0,5-1,5 мг/кг внутривенно, через неделю, до пяти доз, причм первую дозу вводят перед операцией. Такое применение можно соединять с терапией иммунодепрессантами, например стероидами, такими как преднизон или метилпреднизолон, и циклоспорин; стероидами, такими как преднизон или метилпреднизолон, циклоспорин и азатиоприн; или стероидами, такими как преднизон или метилпреднизолон, циклоспорин и микофенолят мофетила. Преимущество введения человеческих антител позволит обойтись без стероидов или может привести к быстрой отмене стероидов. В другом варианте человеческие моноклональные антитела по изобретению можно вводить для лечения или предупреждения отторжения трансплантата по схеме: две внутривенных инфузий (доза около 20 мг в день трансплантации и доза около 20 мг в день 4 после транплантации). Такое введение можно объединять с терапией иммуносупрессорами, например, описанными выше. Например, 1 г микофенолята мофетила можно вводить перорально перед хирургической операцией, и 500 мг метилпреднизолона - во время введения анестетика. Циклоспорин можно вводить на второй день после трансплантации, и лечение продолжить, вводя 1 г микофенолята мофетила после трансплантации. Дозу стероидов можно постепенно уменьшать до 20 мг перорально на четвртый день. Ещ в одном варианте человеческие моноклональные антитела по изобретению для лечения или предупреждения отторжения трансплантата можно вводить по схеме: индукционная терапия в виде двух доз: первую дозу 1 мг/кг дают за 1 ч до операции, а вторую дозу - через 4 дня после операции. Такое введение можно соединять с терапией иммунодепрессантами, например, такой, как описанная выше. Человеческие моноклональные антитела по изобретению можно вводить для лечения или предупреждения отторжения трансплантата в виде долговременной терапии, например, вводя дозы в интервале 10-150 мг, такие как 20-40 мг еженедельно или ежемесячно, например 3-8 раз еженедельно, необязательно с последующими одним или более ежемесячным введением. С помощью долговременной терапии можно уменьшить поддерживающую терапию циклоспорином или избежать е. Терапевтические композиции антител можно вводить с применением медицинских устройств, известных в технике. Например, в предпочтительном варианте изобретения терапевтическую композицию по изобретению можно вводить с помощью безыгольного гиподермического инъектора, такого как устройства, описанные в патентах США 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 или 4596556. Примеры общеизвестных имплантатов и модулей, применимых в данном изобретении, включают патент США 4487603, в котором описан имплантируемый микроинфузионный насос для распределения медицинского препарата с регулируемой скоростью; патент США 4486194, в котором описано терапевтическое устройство для введения медицинских препаратов через кожу; патент США 4447233, в котором описан медицинский инфузионный насос для доставки медицинского средства с точной скоростью вливания; патент США 4447224, в котором описан имплантируемое инфузионное устройство с переменной скоростью потока для непрерывной доставки лекарственного вещества; патент США 4439196,в котором описана осмотическая система доставки лекарственного вещества с многокамерными ячейками и патент США 4475196, в котором описана осмотическая система доставки лекарственного вещества. Специалистам в данной области техники известны многие другие имплантаты, системы доставки и модули. В некоторых вариантах человеческие моноклональные антитела по изобретению можно приготовить таким образом, чтобы гарантировать соответствующее распределение in vivo. Например, гематоэнцефалический барьер (ВВВ) исключает многие высокогидрофильные соединения. Для того, чтобы гарантировать возможность проникновения лекарственных соединений по изобретению (если требуется) через ВВВ, они должны быть приготовлены, например, в липосомах. О методах получения липосом см., например, патенты США 4522811; 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать одну или более частиц,которые селективно переносятся (транспортируются) в конкретные клетки или органы, что повышает нацеленную доставку лекарственного вещества (см., например, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Примеры нацеленных частиц включают фолат или биотин (см., например, патент США 5416016,принадлежащий Low et al.); маннозиды (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); антитела (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owaiset al. (1995) AntimicrobAgents Chemother. 39:180); рецептор протеина сурфактанта А (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), различные виды которого могут включать рецептуры по изобретению, а также компоненты молекул по изобретению; р 120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); см. также K. Keinanen; M.L.Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. В одном варианте изобретения лекарственные соединения по изобретению приготовлены в липосомах; в более предпочтительном варианте изобретения липосомы включают целевую частицу. В наиболее предпочтительном варианте изобретения лекарственные соединения в липосомах доставляются с помощью болюсной инъекции к месту, проксимально к нужной области, например к месту воспаления или инфекции или к опу- 29013677 холи. Композиция должна быть настолько жидкой, чтобы е можно было легко набирать в шприц. Она должна быть стабильной в условиях получения и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Эффективные дозы и схемы прима человеческих моноклональных антител по изобретению зависят от заболевания или состояния, которое следует лечить, и могут определяться специалистами в данной области техники."Терапевтически эффективная доза" для предупреждения отторжения трансплантата снижает число и тяжесть ранних эпизодов отторжения трансплантата."Терапевтически эффективная доза" при ревматоидном артрите предпочтительно приводит к улучшению по критериям ACR20 предварительного определения улучшения, более предпочтительно приводит к улучшению по критериям ACR50 предварительного определения улучшения и ещ более предпочтительно приводит к улучшению по критериям ACR70 предварительного определения улучшения. Критерии ACR20 предварительного определения улучшения определяют как 20% улучшение показателей: числа болезненных суставов (TCJ) и числа опухших суставов (SWJ) и 20% улучшение 3 из 5 следующих оценок: оценка болевых ощущений пациентом (VAS), общая оценка состояния пациентом(VAS), общая оценка состояния врачом (VAS), самооценка пациентом нетрудоспособности (HAQ), реагент в острой фазе (CRP или ESR).ACR50 и ACR70 определяются таким же способом с улучшениями 50% и 70%, соответственно. Более подробно см. в Felson et al. в American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism (1995) 38: 727-735. Или же терапевтически эффективную дозу для ревматоидного артрита можно определять с помощью DAS (оценка активности заболевания), в том числе DAS28, и более предпочтительно DAS56, по определению ELUAR."Терапевтически эффективная доза" для лечения псориаза предпочтительно дат в результатеPASI50, более предпочтительно PASI75 и ещ более предпочтительно PASI90 у больных или снижение общей оценки псориаза, сравнивающей впечатление после лекарственного лечения с состоянием до лечения. PASI (индекс площади и тяжести псориаза) представляет собой оценочную систему для оценки площади и тяжести заболевания. PASI50 определяется как 50% улучшение оценки. Аналогично PASI75 и PASI90 определяются как 75% и 90% улучшение оценки, соответственно."Терапевтически эффективную дозу" для терапии опухоли можно определять с помощью объективных ответов опухоли, который может быть либо полным, либо частичным. Полный ответ (CR) опухоли определяется как отсутствие клинических, радиологических или других свидетельств заболевания. Частичный ответ (PR) определяют на основании того, что общий размер опухоли уменьшился более чем на 50%). Среднее время развития (прогрессирования) есть мера, которая характеризует продолжительность объективного ответа опухоли."Терапевтически эффективную дозу" средства терапии опухолей можно также измерять его способностью стабилизировать прогрессирование заболевания. Способность соединения подавлять раковое заболевание можно оценивать на животной модельной системе, которая позволяет прогнозировать эффективность лечения человеческих опухолей. Или же это свойство композиции можно оценивать, изучая способность соединения подавлять рост клеток или индуцировать апоптоз, с помощью in vitro анализов,известных опытному практику. Терапевтически эффективное количество лекарственного соединения может уменьшить размер опухоли или иным способом ослабить симптомы у субъекта. Рядовой специалист в данной области техники способен определить такие количества на основе таких факторов как габариты субъекта, симптомы у субъекта и конкретная композиция или конкретный способ, выбранный для применения.IV. Применение и способы по изобретению Человеческие антитела по данному изобретению, а также производные/конъюгаты и их композиции имеют различное применение, в том числе лечение нарушений, опосредованных CD25, или нарушений,включающих клетки, экспрессирующие CD25. В одном варианте человеческие антитела по данному изобретению можно вводить in vivo субъекту для блокирования или ингибирования связывания CD25 с его лигандом (IL-2). Это, в свою очередь, можно использовать для предупреждения или ингибирования заболеваний, ассоциированных с клетками,несущими CD25. Примеры заболеваний, которые можно лечить (например, уменьшать интенсивность симптомов) или предупреждать, включают, но без ограничения, отторжение трансплантата, в том числе отторжение аллотрансплантата и ксенотрансплантата, у пациентов, которым делают или которые перенесли трансплантацию органа или ткани, например сердца, лгкого, комбинированную трансплантацию сердца- лгкого, трансплантацию трахеи, почки, печени, поджелудочной железы, пищевода, кишечника, кожи, конечности, пуповины, стволовых клеток, инсулоцитов и т.д. Такие пациенты включают взрослых, но также могут быть педиатрическими пациентами. Антитела по данному изобретению можно, следовательно, применять в качестве профилактики от- 30