Усеченный нейротрофический фактор глиальной клеточной линии, днк, кодирующая указанный фактор, вектор, содержащий указанную днк, способ получения фактора, фармацевтическая композиция и способ лечения
Формула / Реферат
1. Усечённый нейротрофический фактор глиальной клеточной линии (GDNF), имеющий следующую аминокислотную последовательность
X-[Cys41-Cys133]-Y,
причем [Cys41-Cys133] представляет собой аминокислотную последовательность от Cys41 до Cys133 в соответствии с фиг. 1 (SEQ ID NO:2);
Y представляет собой концевую карбоксильную группу Cys133 или карбоксиконцевой участок аминокислотного остатка Ilе134; а
Х представляет собой метионилированную или неметионилированную аминогруппу Cys41 или аминоконцевой участок аминокислотного остатка или аминоконцевые последовательности, выбранные из группы, включающей
или аналог указанного фактора, обладающий такой же биологической активностью.
2. Усечённый GDNF по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность RQAAA ANPENSRGKG (SEQ ID NO:24) или аналог указанного фактора.
3. Усечённый GDNF по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность NPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:18) или аналог указанного фактора.
4. Усечённый GDNF по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность PENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:17) или аналог указанного фактора.
5. Усечённый GDNF по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность SRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:14) или аналог указанного фактора.
6. Усечённый GDNF по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность RGQRGKNRG (SEQ ID NO:8) или аналог указанного фактора.
7. Усечённый GDNF по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность GQRGKNRG (SEQ ID NO:7) или аналог указанного фактора.
8. Усечённый GDNF по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность KNRG (SEQ ID NO:3) или аналог указанного фактора.
9. Усечённый GDNF по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность NRG или аналог указанного фактора.
10. Усечённый GDNF по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что он гликозилирован.
11. Усечённый GDNF по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что он негликозилирован.
12. Усечённый GDNF по п.1, отличающийся тем, что он конъюгирован с водорастворимым полимером.
13. ДНК, кодирующая усечённый GDNF по п.1.
14. ДНК по п.13, имеющая структуру, приведенную на фиг. 1.
15. ДНК по п.13, имеющая структуру, приведенную на фиг. 3.
16. ДНК по п.13, имеющая структуру, приведенную на фиг. 4.
17. ДНК по п.13, имеющая структуру, приведенную на фиг. 5.
18. ДНК по п.13, имеющая структуру, приведенную на фиг. 6.
19. ДНК по п.13, имеющая структуру, приведенную на фиг. 7.
20. Вектор, содержащий ДНК по п.13, функционально связанную с последовательностью, контролирующей экспрессию.
21. Штамм прокариотических клеток-хозяев, трансформированных или трансфицированных ДНК по п.13.
22. Линия эукариотических клеток-хозяев, трансформированных или трансфицированных ДНК по п.13.
23. Способ получения усечённого GDNF, включающий выращивание штамма или линии клеток по любому из пп.21-22 в соответствующей питательной среде, и выделение GDNF из клеток или питательной среды.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что штамм прокариотических клеток-хозяев представляет собой штамм Escherichia coli.
25. Способ по п.23, отличающийся тем, что линия эукариотических клеток-хозяев представляет собой линию клеток яичника китайского хомячка.
26. Способ получения усечённого GDNF, включающий осуществление следующих стадий:
(а) культивирование линий прокариотических или эукариотических клеток-хозяев, трансформированных или трансфицированных вектором по п.20 в соответствующей питательной среде в условиях, обеспечивающих экспрессию усечённого GDNF, и
(б) возможное выделение усечённого GDNF, экспрессируемого указанными клетками-хозяевами.
27. Усечённый GDNF по п.1, отличающийся тем, что представляет собой продукт рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах прокариотического штамма или эукариотической линии, трансформированных или трансфицированных ДНК по п.13 или вектором по п.20.
28. Фармацевтическая композиция, содержащая усечённый GDNF по п.1 и, по крайней мере, один фармацевтически приемлемый носитель.
29. Фармацевтическая композиция, содержащая усечённый GDNF по п.27 и фармацевтически приемлемый носитель.
30. Способ лечения болезни Паркинсона, включающий введение больному фармацевтической композиции по п.28.
31. Способ лечения болезни Паркинсона, включающий введение больному ДНК по п.13 для обеспечения in vivo экспрессии усечённого GDNF.
32. Способ лечения болезни Паркинсона, включающий имплантацию больному клеток, трансформированных ДНК по п.13 для обеспечения in vivo экспрессии усечённого GDNF.
33. GDNF гетеродимер, включающий полную и усеченную молекулы GDNF по п.1.
34. GDNF димер, включающий две усечённые молекулы GDNF по п.1.
35. Усечённый GDNF по п.1, отличающийся тем, что он является продуктом расщепления зрелого GDNF, рекомбинантно экспрессируемого клетками бактерий или млекопитающих.
36. Усечённый GDNF по п.35, отличающийся тем, что Х представляет собой аминоконцевой участок аминокислотного остатка или аминоконцевые последовательности, выбранные из группы, включающей
37. Усечённый GDNF по п.35, отличающийся тем, что зрелый GDNF рекомбинантно экспрессируется модифицированными клетками бактерий in vitro или in vivo.
38. Способ приготовления фармацевтической композиции по п.28, заключающийся в том, что терапевтически эффективное количество усечённого GDNF по п.1 смешивают, по крайней мере, с одним фармацевтически приемлемым носителем.
39. Применение усечённого GDNF по п.1 для лечения заболеваний или повреждений нервной системы.
40. Применение усечённого GDNF по п.39, отличающееся тем, что заболевание нервной системы представляет собой болезнь Паркинсона.
41. Применение усечённого GDNF по п.1 для приготовления фармацевтической композиции для лечения заболеваний или повреждений нервной системы.
Текст
1 Область, к которой относится изобретение В целом настоящее изобретение относится к белкам, называемым ниже нейротрофическими факторами глиальной клеточной линии(также называемыми глиальным нейротрофическим фактором или GDNF), которые характеризуются способностью стимулировать поглощение дофамина дофаминэргическими нейронами и поддерживать жизнеспособность нейронов,которые отмирают при болезни Паркинсона. Предпосылки создания изобретения Нейротрофические факторы представляют собой белки, находящиеся в нервной системе и не нервных тканях, иннервированных нервной системой, функцией которых является стимулирование выживания и поддержание фенотипической дифференцировки нервных и/или глиальных клеток (Varon et al., Ann. Rev. Neuroscience 1:327, 1979; Thoenen et al., Science 229:238,1985). Вследствие этой физиологической роли нейротрофические факторы полезны при лечении дегенерации нервных клеток и утраты функции дифференцировки, которая наблюдается при ряде нейротрофических заболеваний. Чтобы конкретный нейротрофический фактор являлся потенциально пригодным для лечения нервных заболеваний, класс или классы поражнных нервных клеток должны быть чувствительны к этому фактору. Обычно различные нейротрофические факторы действуют на заметно отличающиеся классы нервных клеток. Следовательно, полезно иметь ряд различных нейротрофических факторов для лечения каждого класса поражнных нейронов, которые могут встречаться при различных формах заболевания или поражения. Нейротрофические факторы могут защищать чувствительные нейроны от ряда нежелательных поражений (травм). Например, фактор роста нервной ткани (NGF) может спасти значительную часть сенсорных нейронов от отмирания, вызванного прекращением процессов в их аксонах (Rich et al., J. Neurocytol 16:261, 1987;Otto et al., J. Neurosci. 83:156, 1987), от онтогенетической смерти во время развития эмбриона(Hamburger et al., J. Neurosci. 4:767, 1984), и от поражения, вызванного введением таксола или цисплатина (Apfel et al., Ann. Neurol. 29:87,1991). Эта наблюдаемая общность защиты привела к теории, что, если нейротрофический фактор защищает чувствительные нейроны от экспериментального поражения, то он может быть применим при лечении заболеваний, при которых поражаются эти нейроны у больных, даже если этиология может быть неизвестна. Данный нейротрофический фактор, кроме того, что он обладает корректной нейронной специфичностью, может в достаточном количестве применяться в качестве фармацевтического препарата. Так как нейротрофические факторы обычно находятся в тканях в малых количествахLin et al., Science 246:1023, 1989), неудобно получать фармацевтические количества нейротрофических факторов непосредственно из тканей животных. В качестве альтернативы для продуцирования заданного белка желательно использовать систему рекомбинантной экспрессии.Lin et al. ранее описали способ скрининга биологических образцов на нейротрофическую активность на примере эмбриональных предшественников дофаминэргических нейронов черного вещества (см. патентную заявку США 08/182,183, поданную 23 мая 1994 г. и заявку(WO 93/06116); и Европейскую заявку 92921022.7 (публикацияEP 610254), которые приведены здесь в качестве ссылок). Эта биопроба применима для идентификации нейротрофических факторов, которые могут быть использованы для лечения болезни Паркинсона(Friedman et al., Neuro. Sci. Lett. 79:65-72, 1987),так как заболевание характеризуется дегенерацией дофаминэргических нейронов среднего мозга, которые иннервируют полосатое тело.Lin et al. далее дали характеристику нового нейротрофического фактора, который был выделен чистым из одного такого источника, кондиционированной культуральной среды из клеточной линии глиобластомы. В 49 (Schubert etal., Nature 249:224-27, 1974). Кондиционированная среда из этой клеточной линии, как ранее сообщалось, обладает дофаминэргической нейротрофической активностью (Bohn et al., Soc.al., нейротрофический фактор глиальной клеточной линии (GDNF) не идентифицировался в виде отдельного биологически активного вещества или в виде практически чистого белка. Кроме того, Lin et al. описали процессы клонирования генов человека, кодирующих GDNF последовательность генов человека, которые кодируют GDNF, и аминокислотные последовательности белка GDNF. GDNF-ген был субклонирован в экспрессирующий вектор, и вектор применяли для экспрессии биологически активного GDNF. Белок GDNF представлял собой гомодимер, состоящий из 134 аминокислот, 22kDa, субъединицы были соединены дисульфидными связями. Описание далее содержало применение GDNF для профилактики и лечения нервного поражения и нервных заболеваний,таких как болезнь Паркинсона.GDNF-терапия полезна при лечении нервного поражения, вызванного условиями, которые ставят под угрозу выживание и/или функционирование одного или более типов нервных клеток. Такое нервное поражение может происходить вследствие большого ряда различных причин. Нервное поражение может вызываться в одном или более типах нервных клеток: (1) физическим повреждением, которое вызывает дегенерацию аксонных процессов и/или телец нервных клеток рядом с местом (сайтом) по 3 вреждения; (2) временным или полным прекращением кровотока к отделам нервной системы,как при ударе; (3) намеренной или случайной экспозицией нейротоксинов, таких как химиотерапевтические агенты (такие как цисплатин) для лечения рака или дидезоксицитидин (ddC) для лечения СПИД'а; (4) хроническими метаболическими заболеваниями, такими как диабет или почечная дисфункция; или (5) нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и боковой амиотрофический склероз (ALS), возникающий вследствие дегенерации специфических популяций нейронов.GDNF-терапия может быть особенно полезна при лечении нейродегенеративных состояний, включающих дегенерацию дофаминэргических нейронов черного вещества, например,болезнь Паркинсона. Единственные на сегодня способы лечения паркинсонизма являются паллиативными, имеющими цель увеличить уровень дофамина в полосатом теле. Ожидаемый эффект GDNF-терапии представляет собой не просто увеличение дофаминэргической нейротрансмиссии на концах дофаминэргических нервов в полосатом теле (что приводит к ослаблению симптомов), но также ослабление или даже прекращение развития дегенеративных процессов и восстановление пораженного (нигростратиального) пути через черное вещество полосатого тела и его функции. GDNF также может применяться для лечения других форм поражения или несоответствующей функции дофаминэргических нервных клеток у больных людей. Такое поражение или неадекватная функция могут возникать при шизофрении и других формах психоза. Единственные на сегодня способы лечения таких состояний являются симптоматическими и требуют лекарств, которые действуют на рецепторы дофамина или места поглощения дофамина, из-за того, что неадекватное функционирование дофаминэргических нейронов, которые иннервируют эти несущие рецепторы популяции нейронов, присуще заболеванию. Сущность изобретения В одном аспекте данное изобретение представляет усеченные белки нейротрофического фактора глиальной клеточной линии (GDNF). В одном варианте воплощения изобретения усеченные GDNF-белки получают техникой рекомбинантной ДНК. В альтернативном варианте воплощения изобретения усеченные GDNFбелки синтезируют химическими способами или сочетанием методов рекомбинантной ДНК и химических способов. Усеченные GDNF-белки по данному изобретению представляют собой белки, представляемые аминокислотной последовательностьюX-[Cys41-Cys133]-Y. Для того чтобы облегчить сравнение со зрелым GDNF-белком, используют аминокислотную схему нумерации фиг. 1 (SEQID NO:2). [Cys41-Cys133] представляет собой аминокислотную последовательность от Cys41 до Cys133, как изображено на фиг. 1 (SEQ IDNO:2). Y представляет собой концевую карбоксильную группу Cys133 или карбоксиконцевой участок аминокислотного остатка Ilе 134. Х представляет собой метионилированную или неметионилированную аминогруппу Cys41 или аминоконцевой участок аминокислотного остатка или аминоконцевые последовательности, выбранные из группыGDNF-белки включают усечнный GDNF-белок с аминокислотной последовательностью, представляющей собой X-[Cys41-Cys133]-Y, а также е варианты и производные. Таким образом,процессированный GDNF-белок по данному изобретению также включают варианты с введением (прибавлением), заменой и внутренней делецией и производные аминокислотной последовательности, представленной как X-[Cys41Cys133]-Y. Усечнный GDNF-белок также включают метионилированные и неметионилированные формы, а также гликозилированные и негликозилированные формы процессированного 5 Примеры усечнного GDNF-белка по данному изобретению включают [Arg16-Ile134],[Asn22-Ile134], [Pro23-Ile134], [Ser26-Ile134], [Arg32Ile134], [Gly33-Ile134], [Lys37-Ile134] и [Asn38-Ile134] процессированные GDNF-белки как метионилированные, так и неметионилированные, и их варианты и производные. Предпочтительные процессированные GDNF-белки по данному изобретению включают [Lys37-Ile134] и [Asn38IIe134] усечнные GDNF-белки как метионилированные, так и неметионилированные, и их варианты и производные. Примерами вариантов с заменой являются [Asn22Ser22-Ile134] и [Pro23Lys37Asn37-Ile134] усечнные GDNF-белки. Примером варианта с введением является Sег[Рго 23-Ilе 134] усечнный GDNF-белок. В другом аспекте данного изобретения усечнные GDNF-белки могут быть получены в гликозилированной или негликозилированной формах. Производные процессированного(связывание) усечнного GDNF-белка к водорастворимому полимеру. Например, процессированный GDNF-белок может связываться с одной или более молекул лолиэтиленгликоля с целью уменьшения осаждения продукта усечнного GDNF-белка в водной среде. Еще один аспект данного изобретения включает различные полинуклеотиды, кодирующие усечнные GDNF-белки. Эти нуклеотидные последовательности обычно применяются при экспрессии усечнной GDNF в эукариотической или прокариотической клеткехозяине, в которой продукт экспрессии или его производное характеризуется способностью повышать усвоение дофамина дофаминэргическими клетками. Полинуклеотиды также можно использовать в клеточной терапии или генной терапии. Соответствующие нуклеотидные последовательности включают те, которые изображены на фигурах, а также дополнительные вырожденные последовательности и природные аллельные варианты. Еще один аспект данного изобретения включает векторы, содержащие полинуклеотиды, кодирующие усечнные GDNF-белки,функционально связанные с последовательностями, контролирующими амплификацию и/или экспрессию. Как прокариотические, так и эукариотические клетки-хозяева могут устойчиво трансформироваться или трансфицироваться такими векторами, при этом экспрессируется усечнный нейротрофический фактор глиальной клеточной линии. Данное изобретение далее включает получение усечнного GDNF-белка техникой рекомбинантной ДНК, при которой такие трансформированные или траснфицированные клеткихозяева выращиваются в соответствующей питательной среде, и процессированный GDNF,экспрессированный клетками, по возможности, 001204 6 отделялся от клеток-хозяев и/или питательной среды. Данное изобретение дополнительно включает применение полинуклеотидов, кодирующих усечнный GDNF, и векторов, содержащих такие полинуклеотиды, в генной или клеточной терапии. В другом аспекте данное изобретение включает гетеродимер, содержащий полную и усеченную молекулу GDNF, и димер, содержащий две усеченные молекулы GDNF. Другой аспект данного изобретения включает фармацевтические композиции, содержащие усечнный GDNF-белок. Обычно белковый продукт усечнного GDNF готовят вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Ряд других веществ может применяться в рецептуре для того, чтобы упростить производство, хранение, обработку, доставку и/или эффективность. Усечнный GDNF-белок повышает усвоение дофамина и выживание дофаминэргических нейронов. Таким образом, усечнный GDNFбелок особенно подходит для лечения поражения нервной системы, вызванного повреждением или заболеванием, например, болезнью Паркинсона. Дополнительные аспекты и преимущества данного изобретения будут очевидны специалистам в данной области после рассмотрения последующего описания, которое подробно излагает данное изобретение. Краткое описание фигур Многочисленные особенности и преимущества данного изобретения станут очевидными после рассмотрения фигур, на которых Фиг. 1 изображает нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:1), кодирующую зрелый нейротрофический фактор глиальной клеточной линии человека (hGDNF). Также изображена аминокислотная последовательность(SEQ ID NO:2) зрелого человеческого GDNFбелка; фиг. 2 изображает карту плазмиды, полученную для экспрессии рекомбинантных усечнных GDNF-белков; фиг. 3 изображает рестрикционную карту альтернативной нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO:39), кодирующей полинуклеотиды GDNF и усечнного GDNF; фиг. 4 изображает рестрикционную карту еще одной нуклеотидной последовательностиGDNF и усечнного GDNF; фиг. 5 изображает нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:41), кодирующую[Pro23-Lys37Asn37-Ile134] вариант с заменой усечнного GDNF-белка (SEQ ID NO:42). Этот белок можно также описать как Met-Ser-[Pro23Lys37Asn37-Ile134] вариант усечнного GDNFбелка с введением/заменой; фиг. 6 изображает нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:43), кодирующуюNO:44); фиг. 7 изображает нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:45), кодирующуюNO:46); фиг. 8 изображает аминокислотную последовательность зрелого hGDNF (SEQ ID NO:47) по сравнению с несколькими примерами усечнных GDNF-белков: Met-[Arg32-Ile134] (SEQ IDNO:48), Met-[Gly33-Ile134] (SEQ ID NO:49) и MetSer-[Pro23-Lys37Asn37-Ile134] (SEQ ID NO:50). Подробное описание изобретения Человеческий фактор глиальной клеточной линии (hGDNF) синтезируют в виде предшественника, который процессирует и секретирует в виде зрелого белка из 134 аминокислот. Ранее было отмечено, что зрелый человеческий GDNF имеет аминокислотную последовательность,изображенную на фиг. 1 (SEQ ID NO:2). Данное изобретение основано на неожиданном открытии, что зрелый GDNF-белок может быть уменьшенным в размере (усечннымGDNF-белком) и при этом сохранять свою биологическую активность. Усеченный белок был впервые открыт при получении GDNF методом рекомбинантной ДНК в клетке яичников китайского хомячка (СНО). Рекомбинантный человеческий GDNF (rhGDNF) был получен следующим образом. Нуклеотидную последовательность, кодирующую полную открытую рамку считывания зрелого человеческого GDNF-белка,клонировали в экспрессирующую плазмиду. Нуклеотидная последовательность, корректность которой была подтверждена (секвенированием ДНК как эквивалента rhGDNFпоследовательности, депонированной в GeneBank), была транслирована в аминокислотную последовательность, идентичную опубликованной последовательности зрелого человеческогоGDNF (Lin et al., Science 260, 1130-1132, 1993). Плазмида ДНК была переведена в линейную форму и трансфицирована в СНО-клетки с дефицитом дигидрофолатредуктазы(СНОd-клетки) путем осаждения фосфатом кальция. Трансфицированные клетки были культивированы в селективную среду и те колонии, которые выживали в процессе отбора, отбирались для индивидуального анализа экспрессииhGDNF. Бессывороточные кондиционированные среды из индивидуальных клонов собирали и анализировали с помощью вестерн-блоттинга,используя иммунную сыворотку, специфичную к hGDNF. Иммунная сыворотка содержала антитела кроличьей поликлональной сыворотки из кроликов иммунизированных рекомбинантнымhGDNF, экспрессируемым Escherichia coli. В восстанавливающих условиях hGDNF, который присутствовал в этих образцах, распадался на две главные полосы с молекулярными весами примерно 22 и 18 kDa. Каждая полоса состояла 8 из близко расположенного дублета, примерно 22+22,5 kDa и 18+17,5 kDa соответственно (для простоты эти дублеты обозначаются как 22 kDa и 18 kDa полосы или виды). Как сообщалось ранее, GDNF существует в виде димера с дисульфидной связью, состоящего из двух идентичных субъединиц зрелогоGDNF с молекулярным весом примерно от 20 до 22 kDa. Когда GDNF анализировали не в восстанавливающих условиях, сообщалось, что идентифицировали широкую полосу от 32 до 42kDa (Lin et al., Science 260, 1130-1132, 1993) или от 33 до 44 kDa (Lin et al., J. Neurochem. 63(2),758-768, 1994). Существование зоны (области распространения) объясняли гетерогенностью гликозилирования зрелых мономеров и подтверждали дополнительно экспериментами по дегликозилированию. Хотя имеющаяся 22 kDa полоса соответствует зрелому GDNF-белку, описанному в литературе, о полосе 18 kDa ранее не сообщали. Относительные количества белков 22 kDa и 18 kDa менялись в образцах отдельных клонов. Кроме того, найдено, что многие урожаи клеток одного и того же клона показывают переменное соотношение двух полос. Более того, было найдено,что хранение СНО-экспрессируемого GDNFбелка часто приводило к увеличению полосы 18kDa при одновременном уменьшении полосы 22kDa. Когда кондиционированную среду из трансформированных СНОdклеток анализировали не в восстанавливающих условиях с помощью Вестерн-блоттинга, наблюдали три хорошо разрешенных полосы с примерными молекулярными весами 36, 40 и 44 kDa. Это наблюдение также противоречило предыдущим сообщениям. Относительная интенсивность этих полос менялась, но она хорошо коррелировалась с соотношением мономерных полос 22 и 18 kDa,присутствующих в каждом образце. После дополнительного анализа с помощью моноклональной иммунной сыворотки было найдено,что три полосы в невосстановленном геле соответствуют трем возможным димерам, состоящим из двух мономеров. Наибольший 44 kDa белок является димером из двух зрелых GDNFбелков 22 kDa, как сообщалось ранее. Промежуточный 40 kDa белок состоит из димера, в котором один зрелый белок уменьшил молекулярный вес до 18 kDa формы. Наименьший димер 36 kDa, по-видимому, состоит из двух 18 kDa белков, т.е. обе 22 kDa формы уменьшились по молекулярному весу. Эти данные показали в первый раз не только наличие новой формы мономера GDNF, но также наличие усеченногоGDNF-белка в димерной конфигурации. Также было найдено, что при хранении мономерная композиция образцов сдвигалась к композиции усеченной формы и соответствующих димерных видов, т.е. наблюдалось увеличение количества 36 kDa белка. 9 Были проведены исследования по определению того, какая часть белка элиминировала или изменялась, вызывая уменьшение молекулярного веса по сравнению с ранее описанным зрелым GDNF-белком. Впервые было определено, что уменьшение молекулярного веса происходило не вследствие изменения при гликозилировании.GDNF содержит два потенциальных Nсвязанных сайта гликозилирования, и сообщалось, что он был гликозилирован. Усеченный белок, однако, является не просто негликозилированной или неполностью гликозилированной формой зрелого GDNF. Это было показано в экспериментах по дегликозилированию, в которых образцы обрабатывали N-гликаназой, Oгликаназой и нейраминидазой. На восстанавливающих гелях 18 kDa белок при расщепленииN-гликаназой восстанавливался (уменьшался) до полосы 13,5 kDa, что указывает на наличиеN-связанного сахара, эквивалентного 4,5 kDa. Обработка нейраминидазой и О-гликаназой вызвала небольшой сдвиг полосы 18 kDa к 17 kDa. Это указывает на наличие O-связанных cахаров в белке. Полоса зрелого 22 kDa белка, как сообщалось, гликозилировалась и также уменьшалась до 18 kDa (т.е. также на 4,5 kDa) Nгликаназой. Это было дополнительно подтверждено при использовании антитела моноклональной иммунной сыворотки, специфичного к белку с полосой 22 kDa в геле. Образец, полученный расщеплением гликаназой невосстановленного (неуменьшенного) димера, был более сложным, но интерпретируемым и согласовывался с первоначальным утверждением о трх формах. В результате уменьшение молекулярного веса белка на 4,5 kDa рассматривали скорее как результат делеции примерно 30-35 аминокислотных остатков, нежели как результат изменений при гликозилировании. По следующим причинам наиболее вероятно было ожидать, что делеция происходила по аминоконцу зрелогоGDNF-белка. Зрелый GDNF содержит всего семь остатков цистеина. Если бы делеция происходила по карбоксильному концу, от 2 до 4 из семи цистеиновых остатков было бы утрачено и это, по-видимому, привело бы к неактивному белку. Однако, когда испытуемый образец, состоящий преимущественно из усеченной формы, подвергли биоанализу с целью определения нейротрофической активности дофаминэргических нейронов, образец проявил активность,сравнимую с таковой образца, содержащего больше зрелой формы GDNF. Затем был определн сайт расщепления анализом аминокислотной последовательности очищенного белка. Образцы были секвенированы в соответствии с рекомендациями производителя, с применением белкового секвенатораApplied Biosystems 494A в течение десяти циклов. Хотя аналитическая техника секвенирова 001204 10 ния хорошо известна специалистам в данной области, более подробное описание секвенирования белков приведено в Fausset et al., Electrophoresis 12:22-27, 1991 и патентной заявке США 08/576316, поданной 24 августа 1990 г. (Европейской заявке 90310899, опубликованной подEP 423980, поданной 4 октября 1990 г.,название "Фактор стволовых клеток"), которые приведены здесь в качестве ссылок. Анализом было определено, что аминоконцы усеченного белка представляют собой "RGQRGK" или ArgGly-Gln-Arg-Gly-Lys. Следовательно, первые 31 аминокислоты были удалены из зрелого белка в кондиционированной среде. Остающаяся аминокислотная последовательность усеченного белка, начиная с аминокислоты Arg32, в остальном согласуется с аминокислотной последовательностью зрелого GDNF, изображенного на фиг. 1 (SEQ ID NO:2). Анализом дофаминэргических нейронов было найдено, что [Arg32-Ile134] усечнныйGDNF является активным. Анализ дофаминэргической нейротрофической активности применяется для определения нейротрофических факторов, которые могут быть полезны при лечении болезни Паркинсона. Анализ основан на ранее описанном способе (Friednan et al., Neuro. Sci.Lett. 79:65-72, 1987, который приведн здесь в качестве ссылки) и может модифицироваться,как описано Lin et al. (см. патентную заявку США 08/182,183, поданную 23 мая 1994 г. и заявку, из которой она выделена; PCT/US 92/07888, поданную 17 сентября 1992 г. (WO 93/06116); и Европейскую заявку 92921022.7( публикации ЕР 610254). Подробное описание анализа приведено в примере 5. Последующий процесс очистки и секвенирования аминокислот привел к открытию другого белка, в котором первые 36 аминокислотных остатков были удалены на N-конце зрелогоVL. Оставшиеся аминокислотные остатки усеченного белка в остальном соответствовали аминокислотной последовательности зрелого человеческого GDNF. Биопроба [Lys37-Ile134] усечнного GDNF-белка также была проанализирована для определения усвоения (поглощения) дофамина. Было найдено, что активность этого усечнного GDNF-белка в отношенииED50 составляет, примерно, 50 пг/мл, подобно активности очищенного рекомбинaнтного экспрессированного Е.соli зрелого GDNF. Далее было найдено, что экспрессируемый бактериями зрелый GDNF может быть заменн усечнной формой. Зрелый GDNF, экспрессированный в трансформированных Е.соli (как описано в Lin et al. в заявке США 08/182,183, см. выше), термостатировали с полученными из клеток СНО кондиционированными средами. Рекомбинантный Е.соli GDNF имел примерный молекулярный вес 17 kDa в геле в восстанавли 11 вающих условиях. Когда материал смешали с кондиционированными средами из клеток СНО и термостатировали в течение пяти дней при 4 С, белок был усечен до 12,5 kDa. Это расщепление было менее полным при термостатировании в течение одного часа или 24 часов, что предполагает зависимость процесса от времени в данных условиях. Было также найдено, что простое термостатирование рекомбинантногоE.coli GDNF в течение ночи со средой, содержащей 0,1% эмбриональной бычьей сыворотки,не дат усеченную форму. Таким образом, наличие живых клеток в культуре, по-видимому,необходимо для того, чтобы происходило усечение. Возможно, следовательно, чтобы усечение осуществлялось также in vivo в определенных тканях. Кроме того, было найдено, что производные зрелого Е.соli-экспрессируемого hGDNF,такие как пэгированный GDNF (также описанный Lin et al., в заявке США 08/182,183, см. выше), могут быть процессированы до усечнной формы в присутствии кондиционированных сред из СНО-клеток. Зрелый GDNF может быть пэгирован по аминному концу для того, чтобы увеличить скорость выведения из кровообращения. Пэгирование увеличивает размер белка, и модифицированный зрелый GDNF в восстановительных условиях достигает, примерно, 45GDNF с кондиционированными средами из СНО-клеток (нетрансфицированных) дало полосу 12,5 kDa. В обоих случаях формы 12,5 kDa присутствовали в виде димера с дисульфидной связью, как показано в геле в невосстанавливающих условиях. Образование такой усеченной формы из пэгированного по N-концу зрелого белка дополнительно показало, что усечение происходило на N-конце белка, так как пэгированный остаток был утрачен при усечении. Исходя из этих открытий и из-за того, что усечение может также происходить in vivo, усечнная форма GDNF-белка может быть последней процессируемой в естественных физиологических условиях формой hGDNF. Следовательно, полезно получить усечнный GDNFбелок или его производное для применения в терапии. Предполагалось, что непосредственно экспрессированный или синтезированный усечнный GDNF-белок, такой как [Arg32-Ile134] усечнный GDNF-белок, является устойчивым к вышеописанной протеолитической активности. Более того, было желательно получить усечнный GDNF-белок, например, пэгированный[Arg32-Ile134] усечнный GDNF-белок, так как образующееся производное, как ожидалось, не является чувствительным к специфическому усечению, что наблюдалось у производного зрелого GDNF. Ожидалось, что продукты усечнного 12 вами. Во-первых, рI усечнного белка, например, [Arg32-Ile134] усечнного GDNF-белка,уменьшается с 10 до примерно 8,0-8,5. Это делает белок значительно менее основным, что, в свою очередь, оказывает положительное действие, включая лучшее рецепторное связывание и пониженную цитотоксичность в месте введения,например, при инъекции в подоболочечную область. Во-вторых, у первых 26 аминокислот аминокислотной последовательности зрелогоGDNF имеется два сайта деамидирования: ArgAsn-Arg (аминокислоты 14-16) и Glu-Asn-Ser(аминокислоты 24-26). Ожидается, что отсутствие одного или обоих этих сайтов в усечнномGDNF-белке повышает устойчивость белка. Продукты усечнного GDNF-белка В основном варианте изобретения усечнные GDNF-белки по данному изобретению могут быть представлены следующей аминокислотной последовательностью, в которой для облегчения сравнения со зрелым GDNF-белком используется схема нумерации аминокислотных остатков, применяемая на фиг. 1[Cys41-Cys133] представляет собой аминокислотную последовательность от Cys41 поCys133, как изображено на фиг. 1 (SEQ ID NO:2);Y представляет собой концевую карбоксильную группу Cys133 или карбоксильный конец аминокислотного остатка Ilе 134; и Х представляет собой метионилированную или неметионилированную аминогруппу Cys41 или аминный конец аминокислотного(ых) остатка(ов), выбранного(ых) из группы Употребляемый ниже термин "усечнныйGDNF-белок" включает биологически активные синтетические или рекомбинантные усечнныеGDNF-белки, усечнные GDNF-белки, полученные из зрелого GDNF, биологически активные усечнные GDNF-варианты (включая варианты с инсерциями, заменами или делециями) и их химически модифицированные производные. Также включены усечнные GDNF-белки, которые практически гомологичны человеческомуGDNF-белок проявляет нейротрофические свойства, но не обязательно все те же самые свойства и не обязательно в той же степени, что и свойства GDNF-белка с аминокислотной последовательностью, изображенной на SEQ IDNО:2. Выбор конкретных нейротрофических свойств, представляющих интерес, зависит от того, для чего применяется вводимый усечнный GDNF-белок. Усечнные GDNF-белки являются биологически активными и проявляют свойства способствовать выживанию дофаминэргических нейронов, подобные таковым, проявляемым зрелым GDNF-белком, если применять оценку поглощения (усвоения) дофамина и экспрессии тирозингидроксилазы (ТН) в качестве примера биоанализа, как описано в нижеприведенных примерах. Термин "практически гомологичный",употребляемый ниже, означает степень гомологии человеческому GDNF с аминокислотной последовательностью, изображенной на SEQ IDNО:2, которая (степень гомологии) составляет предпочтительно более 70%, более предпочтительно более 80% и еще более предпочтительно свыше 90% и даже 95%. Процент гомологии,как описано в тексте, рассчитывается как процентное содержание аминокислотных остатков,найденных в меньшей из двух последовательностей, которые совмещаются с идентичными аминокислотными остатками в сравниваемой последовательности, когда при длине 100 аминокислот может быть введено четыре щели (гэпа) для того, чтобы способствовать совмещению, как описано Dayhoff, в Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5, p. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., который приведен здесь в качестве ссылки. Также в понятие практически гомологичный включается любой усечнный GDNFбелок, который может быть выделен с помощью перекрестно реагирующих антител к GDNF,изображенному на SEQ ID NO:2, или гены которого могут быть выделены гибридизацией сGDNF, изображенный на SEQ ID NO:1. Как станет очевидным специалистам в данной области из настоящего описания, практически гомологичные белки содержат одну или более делеций из, или добавления к, или замены аминокислотных остатков усечнного GDNFбелка, изображенного как X-[Cys41-Cys133]-Y. Получение таких вариантов описано ниже в деталях. Понятно, что так как данное изобретение направлено на "усечнные" GDNF-белки, то сюда включаются варианты с добавлением аминного конца как содержащие прибавление метионинового остатка или не-GDNF аминокислотный остаток или последовательность, но не включают прибавление (введение) аминокислотного(ых) остатка(ов), который(ые) приводит(ят) к реконструкции зрелого GDNF-белка. Усечнные GDNF-белки на основе природных аллельных мутантов или вариантов также входят в объм данного изобретения. Получение варианта усечнного GDNF-белка дано в деталях ниже.Lin et al. (заявка США 08/182,183, см. выше) описали усечение зрелого GDNF по карбоксильному концу путем протеолиза Lys-Arg остатков, которые представляют собой шестой и пятый остаток, соответственно, от карбоксильного конца зрелого GDNF (т.е. Lys129-Arg130 в соответствии с нумерацией аминокислотных остатков на фиг. 1 (так же как на SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2). Такое усечение освобождает два цистеиновых остатка из зрелого GDNFбелка. Это, по-видимому, приводит к неуместному скручиванию белка и, следовательно, к образованию неактивного белка. Напротив,продукты X-[Cys41-Cys133]-Y усечнного GDNFбелка по данному изобретению удерживают остатки Cys131 и Cys133 и с помощью анализа поглощения дофамина обнаруживаются активные белки. При одной форме воплощения данного изобретения в предпочтительных усечнныхGDNF-белках отсутствуют один или более сайтов деамидирования. Такая нехватка сайтов деамидирования может привести к повышенной биохимической устойчивости очищенного белка и уменьшению возможных продуктов распада,что дает белок, более устойчивый при хранении. Примером усечнного GDNF-белка является[Ser26-Ile134] усечнный GDNF-белок, у которого не хватает сайтов, которые иначе могли бы привести к деамидированию зрелого белка. Или же в [Arg16-Ile134] усечнном GDNF-белке не хватает, по меньшей мере, первого сайта деамидирования, имеющегося в зрелом белке. В настоящее время предпочтительным усечнным GDNF-белком является [Arg32-Ile134] усечнный GDNF-белок. У этого усечнногоGDNF-белка отсутствует сайт в или рядом с местом протеолитического усечения зрелого белка. Следовательно, ожидается, что этот усе 15 чнный GDNF-белок будет устойчив к процессингу, который может происходить in vivo. Другим предпочтительным усечнным GDNFбелком является [Lys37-Ile134] усечнный GDNFбелок. Это усечение дополнительно снижает рI усечнного белка, как и другие усечения, при которых остатки до и включая Gly40 и Ilе 134 удаляются с N- и O-концов соответственно. В настоящее время наиболее предпочтительные усечнные GDNF-белки сохраняют все цистеиновые остатки, обнаруженные в зрелом GDNFбелке, но у них отсутствует какой-либо заметный сайт быстрого протеолитического процессинга усечнного GDNF-белка во время экспрессии, или получения или последующего введения in vivo. Эти предпочтительные белки включают [Arg32-Ile134], [Gly133-Ile134], [Gln34Ile134], [Arg35-Ile134], [Gly36-Ile134], [Lys37-Ile134],[Asn38-Ile134] и [Arg39-Ile134] усечнных GDNFбелков. Подобно результатам, ранее описанным для зрелого GDNF-белка Lin et al. (заявка США 08/182,183, см. выше), усечнные GDNFбелки по данному изобретению проявили способность повышать поглощение дофамина эмбриональными предшественниками черного вещества дофаминэргических нейронов. Биоанализы усечнных GDNF-белков далее описаны в примере 4. Новые усечнные GDNF-белки обычно выделяли и очищали, чтобы получить усечнные GDNF-белки, которые практически свободны от присутствия других (не-GDNF) белковых материалов. Предпочтительно, чтобы усечнныеGDNF-белковые продукты были примерно на 80% свободны от других белков, которые могли бы присутствовать, благодаря способу получения, применяемому при производстве усечнного GDNF-белкового продукта. Более предпочтительно, чтобы усечнные GDNF-белковые продукты были на 90% свободны от других белков,особенно предпочтительна чистота от других белков на около 95% и наиболее предпочтительна 98% чистота от других белков. Кроме того, данное изобретение предоставляет уникальную возможность получения полинуклеотидных последовательностей для производства гомогенных усечнных GDNF-белков. Например, применение полинуклеотидной последовательности, кодирующей [Arg32-Ile134] усечнныйGDNF-белок, делает возможным получение усечнного GDNF-белка в Е.соli и других подходящих экспрессирующих системах методом рекомбинантной ДНК. Другими словами, новые полинуклеотиды позволяют получать усечнныеGDNF-белки, которые нечувствительны к протеолитическому процессингу или имеют пониженную чувствительность к такому процессингу, или действию других биохимических процессов, как описано выше. Таким образом, новые полинуклеотиды облегчают процесс получения и/или выделения единичного вида усе 001204 16 чнных GDNF-белков и, следовательно, усечнные белки и/или их продукты не содержат или содержат небольшое количество вышеописанной смеси гетеро- и гомодимеров. Нужно понимать, однако, что конечные усечнные GDNFбелки могут комбинироваться с другими факторами, химическими композициями и/или соответствующими фармацевтическими добавками до их введения, как описано подробно ниже. При одном варианте данного изобретения усечнные GDNF-белки преимущественно получали методами рекомбинантной ДНК, так как они способны давать сравнительно большие количества белка большей чистоты. Рекомбинантные усечнные GDNF-белковые формы включают гликозилированные и негликозилированные формы белка и белка, экспрессируемого в клеточных системах бактерий, млекопитающих или насекомых. Или же усечнныеGDNF-белки могут быть химически синтезированы. Предпочтительные на сегодня способы получения описаны ниже более детально. Усечнные GDNF-варианты и производные А. Усечнные GDNF-варианты. Другой аспект данного изобретения включает варианты усечнного GDNF-белка. Термин"усечнные GDNF-белки", употребляемый ниже, включает варианты белков, в которых аминокислоты были делетированы из ("варианты с делецией"), введены в ("варианты с прибавлением"/введением), заменены на ("варианты с заменой") остатки аминокислотной последовательности природного GDNF. Такие варианты получают введением соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК, кодирующую белок, или химическим синтезом in vitro заданного белка. Специалисты в данной области поймут, что можно осуществить много комбинаций делеций,инсерций и замен при условии, что конечный белок будет обладать GDNF-биологической активностью. Методы мутагенеза для замены, инсерции или делеции одного или более отобранных аминокислотных остатков хорошо известны специалистам в данной области (например, патент США 4,518,584, который приведен здесь в качестве ссылки). Есть две основных переменных в конструкции вариантов аминокислотной последовательности: расположение сайта мутации и природа мутации. При конструировании вариантов усечнного GDNF расположение сайта мутации и природа мутации будет зависеть от биохимической(их) характеристики(ик), которая должна быть изменена. Сайты мутации можно модифицировать индивидуально или по порядку, например, (1) заменяя, во-первых, набором из консервативных аминокислот, а затем более радикальным отбором в зависимости от достигнутых результатов, (2) делетируя нацеленные аминокислотные остатки, или (3) вводя (инсерция) аминокислотные остатки, прилегающие к определенному сайту. 17 Делеции аминокислотных последовательностей, в основном, содержат примерно от 1 до 30 аминокислотных остатков, более обычно примерно от 1 до 10 остатков и, как правило,примерно от 1 до 5 остатков. Например, делеции в части "X" аминокислотных остатков, расположенных N-терминально по отношению кCys41, могут быть в размере от примерно 1 до 30 остатков, тогда как делеции между остатками цистеина [Cys41-Cys133] обычно содержат от примерно 1 до 5 остатков, в зависимости от расположения, так, чтобы не нарушать скручивание(свертывание) белков. Делеции в усечнных белках GDNF могут быть сделаны на участках с низкой гомологией с представителями семейства активинов(трансформирующими факторами роста (TGF-). Делеции из усечнных GDNF-белков в областях практической гомологии с другими последовательностями семейства TGF-, по-видимому, в более значительной степени изменяют биологическую активность. Общее число делеций и/или последовательность делеций выбирается так, чтобы сохранить третичную структуру усечнногоGDNF-белка в подвергаемой воздействию области, например, (перекрестное) сшивание цистеиновых остатков. Введения (прибавления) в аминокислотную последовательность могут включать аминои/или карбоксилконцевые сшивки, содержащие от одного остатка до ста или более остатков, а также инсерции из одного или многих аминокислотных остатков внутри последовательности. Внутренние введения (прибавления) могут содержать от примерно 1 до 10 аминокислотных остатков, более типично от примерно 1 до 5 аминокислотных остатков и обычно от примерно 1 до 3 аминокислотных остатков. Как описано выше, предполагается, что варианты по данному изобретению с введениями (прибавлениями) на аминном конце включают введение (прибавление) метионина (например, как артефакт непосредственной экспрессии GDNF в бактериальной рекомбинантной клеточной культуре) или не-GDNF аминокислотный остаток или последовательность. Варианты с введениями на аминном конце не включают введения аминокислотных остатков, которые приводят к реконструкции зрелого GDNF-белка. Дополнительный пример концевой инсерции включает присоединение гетерологичной N-концевой сигнальной последовательности к N-концу с целью облегчить секрецию белка из рекомбинантной клетки-хозяина. Такие сигнальные последовательности обычно получают из заданных видов клеток-хозяев и поэтому они им гомологичны. Инсерции или введения могут также включать аминокислотные последовательности, образованные из последовательности других нейротрофических факторов. 18 Другая группа вариантов представляет собой варианты замещения аминокислот. В этих вариантах, по меньшей мере, один аминокислотный остаток удален, и на его место введен другой остаток. См., например, фиг. 5, на которой природный Arg22 был заменен на Ser с целью облегчить дальнейшее удаление (снятие)Met-остатка. Если взять в качестве примера последовательность X-[Cys41-Cys133]-Y и применить данное определение усечнного GDNFбелка, то усечнным GDNF-белком мы можем называть как вариант с заменой - Met[Asn22Ser22-Ile134] усечнного GDNF-белка, так и вариант с введением - Met-Ser-[Pro23-Ile134] усечнного GDNF-белка. Варианты с заменой включают аллельные варианты, которые характеризуются изменениями в природной нуклеотидной последовательности или не могут вызвать изменения в аминокислотной последовательности. Специфические мутации последовательностей усечнных GDNF-белков могут включать модификации сайта гликозилирования (например, серин, треонин или аспарагин). Отсутствие гликозилирования или только частичное гликозилирование могут быть вызваны заменой или делецией аминокислоты по любому, связанному с аспарагином, сайту белка, который модифицирован введением О-связанного углевода. Аспарагин-связанный сайт распознавания гликозилирования содержит трипептидную последовательность, которая специфически распознается соответствующими клеточными фрагментами гликозилирования. Эти трипептидные последовательности представляют собой или Asn-XaaThr или Asn-Xaa-Ser, где Хаа может быть любой аминокислотой, отличной от Pro. Ряд аминокислотных замен или делеций в одном или обоих первом или третьем положении аминокислоты сайта гликозилирования (и/или делеция аминокислоты во втором положении) не приводит к гликозилированию в модифицированной трипептидной последовательности. Таким образом,экспрессия соответствующим образом измененных нуклеотидных последовательностей дает варианты, негликозилированные по этому сайту. Или же последовательность может быть модифицирована для того, чтобы прибавить (ввести) сайты гликозилирования к усечнномуGDNF-белку. Один способ определения аминокислотных остатков или (участков) зон усечнногоGDNF на мутагенез называется "аланинсканирующий мутагенез", как описано Cunningham and Wells (Science, 244:1081-1085, 1989). По этому способу аминокислотный остаток или группа нацеленных остатков определяется (например, заряженные остатки, такие как Arg,Asp, His, Lys и Glu) и заменяются на нейтральную или отрицательно заряженную кислоту(наиболее предпочтителен аланин или полиаланин), чтобы вызвать взаимодействие аминокис 19 лот с окружающей водной средой в или вне клетки. Домены, проявляющие функциональную чувствительность к заменам, очищаются введением дополнительных или измененных остатков по сайтам замены. Таким образом, сайт для введения модификации аминокислотной последовательности определяется заранее, и чтобы оптимизировать мутацию по данному сайту, можно провести сканирование аланином или случайный мутагенез и скрининг вариантов на оптимальную комбинацию заданной активности и степени активности. Сайты, представляющие наибольший интерес для заместительного мутагенеза, включают сайты, в которых аминокислоты, обнаруженные в GDNF-белках из различных видов,практически отличны по объму боковой цепи,заряду и/или гидрофобности. Другие сайты,представляющие интерес, включают таковые, в которых специфические остатки GDNFподобных белков, полученных из различных видов, идентичны. Такие положения вообще важны для биологической активности белка. Сначала эти сайты модифицируются относительно консервативной заменой. Такие консервативные замены показаны на табл. 1 в графе Предпочтительные замены. Если такие замены приводят к изменению биологической активности, тогда вводят более существенные изменения (Примеры замен) и/или могут быть проведены другие введения/делеции, и образующийся продукт подвергают скринингу. Таблица 1 Аминокислотные замены Первоначальный Предпочтительные Примеры замен остаток замены Аlа (А) Предполагается, что консервативные модификации аминокислотной последовательности (и соответствующие модификации кодирующих нуклеотидных послeдовательностей) продуцируют усечнные GDNF-белки с функциональными и химическими характеристиками, подобными таковым усечнных GDNF 20 белков, описанных в примерах, данных ниже. Напротив, существенные изменения функциональных и/или химических характеристик усечнных GDNF-белков могут быть достигнуты отбором замен, которые значительно отличаются по своему действию на сохранение (а) структуры полипептидного остова (каркаса) в области замены, такой как, например, складчатая или спиральная конформация, (b) заряда или гидрофобности белка в нацеленном сайте или (с) объма боковой цепи. Природные остатки делят на группы в соответствии с общими свойствами боковой цепи: 1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val,Leu, Ile; 2) нейтральные гидрофильные: Sys, Ser,Thr; 3) кислые: Asp, Glu; 4) основные: Asn, Gln, His, Lys, Arg; 5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и 6) ароматические: Тrр, Туr, Phe. Неконсервативные замены могут вызвать переход представителя одного из этих классов в другой класс. Такие замещающие остатки могут вводиться в области усечнных GDNF-белков,которые гомологичны с другими белками TGF, или в негомологичные области белка. В. Производные усечнных GDNF Химически модифицированные производные усечнного GDNF или усечнных GDNFвариантов могут быть получены специалистами в соответствии с данным ниже описанием. Химические остатки, наиболее пригодные для получения производных усечнных GDNF-белков,содержат водорастворимые полимеры. Водорастворимый полимер желателен, так как белок, к которому он присоединяется, не осаждается в водной среде, например, физиологической среде. Предпочтительно, чтобы полимер был фармацевтически приемлем для получения терапевтического продукта или композиции. Специалисты в данной области смогут отобрать желаемый полимер, принимая во внимание то, будет ли конъюгат полимер/белок применяться терапевтически, и если да, то какова необходимая доза, время выведения из организма, устойчивость к протеолизу и др. Эффективность образования производных может быть подтверждена введением производного в нужной форме (например, с помощью осмотического насоса или более предпочтительно инъекцией или инфузией, или в виде препаратов для орального, лгочного или других путей введения) и определяя их эффективность. Соответствующие водорастворимые полимеры включают, но не ограничиваются указанными: полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, монометоксиполиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлоза,декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6 21 триоксан, сополимер этилен/малеиновый ангидрид, полиаминокислоты (как гомополимеры, так и случайные сополимеры), поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры полиэтиленгликоля, сополимеры полипропиленоксид/этиленоксид, полиоксиэтилированные спирты (например, глицерин), полиэтиленгликольпропионовый альдегид и их смеси. Употребляемый ниже полиэтиленгликоль охватывает любую из форм ПЭГ, которая используется для дериватизации других белков, например, моно(С 1-С 10)-алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль. Полиэтиленгликоль-пропионовый альдегид может быть удобен в промышленности из-за устойчивости в воде. Полимер может иметь любой молекулярный вес и может быть разветвленным или неразветвленным. Данное изобретение, в частности, относится к усечнному GDNF-белку, связанному, по меньшей мере, с одной молекулой ПЭГ. В другом аспекте данное изобретение относится к усечнному GDNF-белку, соединенному с, по меньшей мере, одной молекулой ПЭГ ацильной или алкильной связью. Пэгирование можно проводить любой реакцией пэгирования, известной из уровня техники. См., например, Focus on Growth Factors 3(2):4-10 (1992); ЕР 0 154 316; ЕР 0 401 384; и(сообщает о пэгировании GM-CSF с помощью трезилхлорида). Предпочтительно, чтобы пэгирование проводили реакцией ацилирования или алкилирования реакционноспособным водорастворимым полимером. Эти предпочтительные способы дериватизации обсуждаются ниже более подробно. Для реакций ацилирования предпочтительно выбираемый(ые) полимер(ы) содержит(ат) одну реакционноспособную эфирную группу. В случае реакций восстановительного алкилирования, предпочтительно выбираемый (ые) полимер(ы) содержит(ат) одну реакционноспособную альдегидную группу. Кроме того, выбранный полимер может быть модифицирован так, чтобы иметь одну реакционноспособную группу, например активную эфирную для ацилирования или альдегидную для алкилирования, так, что можно контролировать степень полимеразации. Вообще водорастворимый полимер не следует выбирать из природных гликозильных остатков, так как их обычно получают более удобным путем при помощи систем рекомбинантной экспрессии млекопитающих. Ацилирование Согласно данному изобретению, пэгирование ацилированием обычно включает обеспечение реакции активного эфирного производного полиэтиленгликоля с усечнным GDNF-белком. Любая известная или открытая впоследствии реакционноспособная молекула ПЭГ может быть применена для процесса пэгирования. Предпочтительным активированным ПЭГ 001204 22 эфиром является ПЭГ, этерифицированный с получением N-гидроксисукцинимида ("NHS"). Так, как употребляется ниже, термин "ацилирование" включает без ограничения следующие типы связывания между усечнным GDNFбелком и водорастворимым полимером, таким как ПЭГ: амид, карбамат, уретан и тому подобное. См. Bioconjugate Chem. 5:133-140 (1994). Условия реакции можно выбрать из любых, известных в технике пэгирования, или тех, которые откроют позже, но следует избегать или ограничивать такие условия реакции, как такой температуры, таких растворителей и таких величин рН, которые инактивируют усечнныйGDNF-белок, который должен модифицироваться. Пэгирование с помощью ацилирования обычно дат полипэгированный усечнныйGDNF-белок, в котором -аминогруппы лизина пэгированы за счет связывания ацильной группой. Предпочтительно, чтобы связь была амидной. Также предпочтительно, чтобы образующийся продукт был практически только (например, 95%) моно-, ди- или трипэгированным. Однако некоторые конъюгаты с более высокими степенями пэгирования могут образовываться в количествах, зависящих от конкретных условий реакции. Если нужно, из смесей могут быть получены более чистые пэгированные конъюгаты стандартными методами очистки, включая, среди прочих, диализ, высаливание, ультрафильтрацию, ионообменную хроматографию, гельфильтрацию и электрофорез. Алкилирование Согласно данному изобретению пэгирование алкилированием обычно включает обеспечение реакции производного ПЭГ с концевым альдегидом с усечнным GDNF-белком в присутствии восстановителя. Пэгирование с помощью алкилирования может также дать полипэгированный усечнный GDNF-белок. Кроме того, можно изменять условия реакции, чтобы предпочтительно пэгирование шло по аминогруппе N-конца белка (т.е. монопэгирование). Как в случае монопэгирования, так и в случае полипэгирования группы ПЭГ предпочтительно соединяются с белком через -CH2-NHгpyппy. Отдавая предпочтение старшинству-СН 2-группы, этот тип связи называют ниже"алкильная" связь. Селективные химические модификации поN-концу могут быть осуществлены путем восстановительного алкилирования, которое использует различную реакционную способность разных типов первичных аминогрупп (лизин относительно N-концевого), способных к дериватизации в конкретном белке. В соответствующих условиях реакции достигается практически селективная дериватизация белка по Nконцу полимером, содержащим карбонильную группу. Например, можно селективно пэгиро 23 вать белок по N-концу, проводя реакцию при рН, который позволяет использовать различия между рКa -аминогруппой остатков лизина и таковым -аминогруппы N-концевого остатка белка. Такой селективной дериватизацией контролируется присоединение водорастворимого полимера к белку: конъюгация с полимером происходит преимущественно по N-концу белка и никакой существенной модификации других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковой цепи, не происходит. При применении восстановительного алкилирования водорастворимый полимер имеет единственную реакционноспособную альдегидную группу для соединения с белком. Можно использовать полиэтиленгликоль пропиональдегид, содержащий одну реакционноспособную альдегидную группу. Данное изобретение включает полипэгированные усечнные GDNF-белки, в которых ПЭГ-группа(ы) соединена(ены) через ацильную или алкильную группы. Как обсуждалось ранее,такие усечнные GDNF-белковые продукты могут быть монопэгированными или полипэгированными (например, содержащими 2-6, предпочтительно 2-5 групп ПЭГ). Обычно ПЭГгруппы соединены с белком по - или аминогруппам аминокислот, но также полагается, что ПЭГ-группы могут быть соединены по любой реакционноспособной группе белка, которая достаточно реакционноспособна, чтобы соединиться с ПЭГ-группой в соответствующих условиях реакции. Так, полиэтиленгликоль может быть ковалентно связан с белком через реакционноспособную группу, такую как свободная амино- или карбоксильная группа. Реакционноспособными группами являются такие, с которыми может быть связана активированная молекула ПЭГ. Аминокислотные остатки, содержащие свободную аминогруппу, могут включать остатки лизина и N-концевой остаток аминокислоты. Аминокислотные остатки, содержащие свободную карбоксильную группу,могут включать остатки аспартиковой кислоты,глутаминовой кислоты и С-концевой остаток аминокислоты. В качестве реакционноспособной группы для связывания с молекулой(ами) ПЭГ могут быть использованы сульфгидрильные группы. Для терапевтических целей обычно предпочтительно присоединение по аминогруппе, например присоединение по N-концу или группе лизина. Присоединения по остаткам,важным для рецепторного связывания, надо избегать, если требуется рецепторное связывание. В одном аспекте данное изобретение предлагает практически гомогенный препарат конъюгата монополимер/усечнный GDNF-белок, в котором молекула полимера присоединена практически только (т.е. 95%) в единственном месте. Более конкретно, если применяется ПЭГ, 001204 24 данное изобретение также предоставляет пэгированный усечнный белок с недостатком предполагаемых антигенных связывающих групп, в котором молекула ПЭГ непосредственно связана с усечнным GDNF-белком. Кроме того, могут быть получены производные при использовании гликозилированных,негликозилированных или дегликозилированных усечнных GDNF-белков. Обычно применяются негликозилированные усечнные GDNFбелки. Например, экспрессируемый клетками прокариот [Arg32-Ile134] усечнный GDNF-белок можно дериватизировать так, чтобы он содержал моно- или поли-, например, 2-4 частицы ПЭГ, соединенные через ацильную или алкильную группу. В основном, химическую дериватизацию можно проводить в соответствующих условиях,применяемых для реакций биологически активного вещества с активированной молекулой полимера. Способы получения пэгированных усечнных GDNF-белков обычно содержат стадии(а) реакции усечнного GDNF-белка с полиэтиленгликолем (таким как реакционноспособное эфирное или альдегидное производное ПЭГ) в условиях, при которых усечнный GDNF-белок связывается с одной или более группами ПЭГ, и(b) получения продукта(ов) реакции. В целом оптимальные условия реакций ацилирования определяются постепенно, исходя из известных параметров и желаемого результата. Например,чем больше соотношение ПЭГ:белок, тем выше процент полипэгированного продукта. Оптимальное соотношение (с точки зрения эффективности реакции, в которой нет (избытка) непрореагировавшего белка или полимера) может определяться факторами, такими как заданная степень дериватизации (например, моно-, ди-,три- и т.д.), молекулярный вес выбранного полимера, является ли полимер разветвленным или линейным, и применяемыми условиями реакции. Восстановительное алкилирование для получения практически гомогенного конъюгата монополимер/усечнный GDNF-белок, как правило, включает стадии: (а) реакцию усечнногоGDNF-белка с реакционноспособной молекулой ПЭГ в условиях восстановительного алкилирования при рН, делающим возможным селективную модификацию -аминогруппы по аминному концу усечнного GDNF-белка, и (b) получение продукта(ов) реакции. Для получения практически гомогенного конъюгата монополимер/усечнный GDNFбелок условия реакции являются такими, чтобы было возможно селективное присоединение частицы водорастворимого полимера к N-концу усечнного GDNF-белка. Такие условия реакции обычно выявляют разницу между рКa аминогруппы лизина и -аминогруппы на N-конце 25 аминогрупп протонируется и 50% не протонируетcя). рН также влияет на то, какое соотношение полимер/белок надо использовать. В целом,если рН ниже, нужно брать больший избыток полимера по отношению к белку (т.е. чем менее реакционноспособна N-концевая -аминогруппа, тем больше полимера нужно для получения оптимальных условий). Если рН выше, соотношение полимер/белок не должно быть таким большим (т.е. чем более реакционноспособны применяемые группы, тем меньше молекул полимера требуется). Для целей данного изобретения рН обычно составляет 3-9, предпочтительно 3-6. Другим важным фактором является молекулярный вес полимера. В целом, чем выше молекулярный вес полимера, тем меньшее число полимерных молекул может присоединиться к белку. Подобным образом разветвлнность полимера надо принимать во внимание при оптимизации этих параметров. Обычно, чем выше молекулярный вес полимера (или большая разветвлнность), тем выше соотношение полимер/белок. В целом, для реакций пэгирования,рассматриваемых в описании, предпочтителен средний молекулярный вес от примерно 2 kDa до примерно 100 kDa (термин "примерно","около" указывает, что в препаратах полиэтиленгликоля некоторые молекулы имеют больший молекулярный вес, чем указано, а некоторые - меньший). Предпочтителен средний молекулярный вес от около 5 kDa до около 50 kDa,особенно предпочтителен от около 12 kDa до около 25 kDa. Соотношение водорастворимого полимера и усечнного GDNF-белка находится обычно в интервале от 1:1 до 100:1, предпочтительно (для полипэгирования) от 1:1 до 20:1 и(для монопэгирования) от 1:1 до 5:1. При применении вышеуказанных условий восстановительное алкилирование обеспечивает селективное присоединение полимера к любому усечнному GDNF-белку с -аминогруппой на аминном конце и практически гомогенный препарат конъюгата монополимер/GDNF-белок. Термин"конъюгат монополимер/усечнный GDNFбелок" применяется здесь для обозначения производного, содержащего одну полимерную молекулу, соединенную с усечнным GDNFбелком. Конъюгат монополимер/усечнныйGDNF-белок предпочтительно содержит полимерную молекулу, расположенную на N-конце,а не в аминных группах лизина. Препарат предпочтительно содержит более 90% конъюгата монополимер/усечнный GDNF-белок и более предпочтительно выше 95% конъюгата монополимер/усечнный GDNF-белок, при этом остается непрореагировавший белок (т.е. белок без полимерной частицы). Для восстановительного алкилирования восстанавливающий агент должен быть устойчив в водном растворе и предпочтительно дол 001204 26 жен восстанавливать только основание Шиффа,первоначально образующееся при восстановительном алкилировании. Примеры восстановителей можно выбрать из группы, состоящей из натрийборгидрида, натрийцианборгидрида, диметиламинборана, триметиламинборана и пиридинборана. Особенно предпочтительным восстановителем является натрийцианборгидрид. Другие условия реакции, такие как растворитель, время реакции, температура и т.д. и способы очистки продуктов, можно определить, исходя из имеющихся данных о дериватизации белков водорастворимыми полимерами. По выбору смесь конъюгатов полимер/белок можно получать алкилированием или ацилированием, и преимуществом является то,что можно регулировать соотношение монополимер/белок в конъюгате. Так, если нужно,можно получить белок с различным числом соединенных с ним полимерных молекул (т.е. ди-,три-, тетра- и т.д.) и объединить с конъюгатом монополимер/белок, полученным с применением данных способов, и получить смесь с заведомым соотношением монополимер/белок в конъюгате. Полинуклеотиды, кодирующие усечнныеGDNF-белки Далее данное изобретение предлагает нуклеотиды, которые кодируют усечнные GDNFбелки. Если используют зонд для гибридизации или праймер для амплификации, нуклеотидная последовательность практически свободна от других нуклеотидных последовательностей. При применении для экспрессии рекомбинантных белков нуклеотидная последовательность должна быть, как правило, практически свободна от нуклеотидных последовательностей, кодирующих другие белки, если не нужен слитый белок. Исходя из данного описания и применяя таблицу универсальных кодов, обычный специалист в данной области может легко определить все нуклеотидные последовательности,которые кодируют аминокислотные последовательности усечнных GDNF-белков. В настоящее время предпочтительные нуклеотидные последовательности включают полинуклеотиды, кодирующие [Arg16-Ile134], [Ser26-Ile134],[Arg32-Ile134] и [Lys37-Ile134] усечнные GDNFбелки. Примеры разных полинуклеотидов изображены на фиг. 5, 6 и 7, а также на тех частях фиг. 1, 3 и 4, где кодируют усечнные GDNFбелки. Специалисты также поймут, что новые полинуклеотиды, которые кодируют усечнныеGDNF-белки, включают также нуклеотидные последовательности, которые кодируют варианты усечнных GDNF-белков, как искусственно полученных человеком, так и природных. Методами экспрессии рекомбинантной ДНК, осуществляемыми в соответствии с описаниями, данными ниже, можно получать эти полинуклеотиды и экспрессировать различные усечнные GDNF-белки. Например, встраивая 27 нуклеотидную последовательность, которая кодирует усечнный GDNF-белок в соответствующий вектор, специалист в данной области может легко получать большие количества заданной нуклеотидной последовательности. Последовательности затем могут быть использованы для генерирования детекторных зондов и праймеров амплификации. Или же, полинуклеотид, кодирующий усечнный GDNF-белок, может быть встроен в экспрессирующий вектор. Введением вектора экспрессии в соответствующего хозяина можно получить заданный усечнный белок в больших количествах. Как далее здесь описано, есть много систем хозяин/вектор, пригодных для получения нуклеотидных последовательностей и/или получения усечнных GDNF-белков. Таковые включают, но не ограничиваются указанными, плазмидные, вирусные и инсерционные векторы и клетки-хозяева прокариот и эукариот. Специалисты в данной области могут адаптировать систему хозяин/вектор, способную воспроизводить (размножать) или экспрессировать последовательности по данному изобретению. С помощью таких методов рекомбинантной ДНК усечнные GDNF-белки в соответствии с настоящим изобретением легко получают в промышленных количествах. Более того, специалисты в данной области поймут, что в свете настоящего описания, новые нуклеотидные последовательности содержат вырожденные нуклеиновые кислоты, кодирующие усечнныеGDNF-белки, конкретно представленные на фиг., варианты таких усечнных GDNF-белков и такие нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются, предпочтительно в жестких условиях гибридизации, с комплементами этих нуклеотидных последовательностей (см. Maniatis et al., Molecular Cloning (A LaboratoryManual); Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 387389, 1982). Примерные жесткие условия гибридизации представляют собой гибридизацию в 4 х SSC при 62-67 С с последующим промыванием в 0,1 х SSC при 62-67 С, примерно, в течение часа. Или же, примерными условиями гибридизации являются гибридизация в 45-55% формамиде, 4 х SSC при 40-45 С. Последовательности ДНК, которые гибридизуются с последовательностями,комплементарными усечнномуGDNF-белку, в мягких условиях гибридизации и которые кодируют усечнный GDNF-белок,по данному изобретению, также включены сюда. Примером таких мягких условий гибридизации являются 4 х SSC при 45-55 С или гибридизация в 30-40% формамиде при 40-45 С. Также данное изобретение относится к конструкциям рекомбинантных ДНК, включающих вектор вместе с последовательностью ДНК, кодирующей усечнный GDNF-белок. В таких конструкциях нуклеотидная ДНКпоследовательность, кодирующая усечнныйGDNF-белок (с сигнальным пептидом или без 28 него), функционально связана с соответствующей контролирующей или регуляторной последовательностью экспрессии, способной направлять репликацию и/или экспрессию усечнногоGDNF-белка Получение полинуклеотидов, кодирующих усечнный GDNF. Нуклеотидная последовательность, кодирующая усечнный GDNF-белок или исходный материал для зрелого GDNF, может быть легко получена рядом способов, включая, без ограничения, химический синтез или скрининг кДНКовой библиотеки или геномной библиотеки,скрининг библиотеки экспрессии и/или PCR амплификацию кДНК. Эти способы и другие,пригодные для выделения таких нуклеотидных последовательностей, представлены, например,Sambrook et al., (Molecular Cloning: A LaboratoryCloning Techniques, vol. 152, Academic Press,Inc., San Diego, CA, 1987). Предпочтительными нуклеотидными последовательностями, кодирующими GDNF, являются последовательности млекопитающих. Химический синтез нуклеотидной последовательности, которая кодирует усечнныйGDNF-белок, может быть осуществлен с применением хорошо известных способов, таких как описанные Engels et al., (Angew. Chem. Intl. Ed.,28:716-734, 1989). Эти способы включают interalia, фосфотриэфирный, фосфорамидитный и нфосфонатный способы синтеза нуклеотидной последовательности. Нуклеотидная последовательность, кодирующая усечнный GDNFбелок, будет иметь протяжнность в несколько сот пар оснований (bр, п.о.) или нуклеотидов. Протяжнные нуклеотидные последовательности, например, такие, длина которых более 100 нуклеотидов, можно синтезировать в виде нескольких фрагментов. Фрагменты можно лигировать друг с другом с образованием нуклеотидной последовательности, кодирующей усечнный GDNF-белок. Предпочтительным способом является синтез на полимерной подложке с применением стандартной химии фосфамидитов. Соответствующая нуклеотидная последовательность может быть получена и скринингом библиотеки надлежащей кДНК (т.е. библиотеки,полученной из одного или более источника ткани, предположительно экспрессирующей белок) или геномной библиотеки (библиотеки, полученной на основе тотальной геномной ДНК). Источником кДНК-овой библиотеки обычно является ткань любого образца, предположительно экспрессирующая GDNF в приемлемых 29 количествах. Источником геномной библиотеки может быть любая ткань или ткани любого млекопитающего или других видов, где предположительно находится ген, кодирующий GDNF или гомолог GDNF. Можно провести скрининг библиотеки на наличие кДНК/гена GDNF, применяя один или более нуклеотидных зондов(олигонуклеотиды, фрагменты кДНК или геномной кДНК, которые имеют приемлемую степень гомологии с кДНК или клонируемого гена GDNF, или GDNF), которые селективно гибридизуют с кДНК(ами) или геном(генами)GDNF или гомолога GDNF, присутствующими в библиотеке. Зонды, обычно применяемые для такого скрининга библиотек, как правило, кодируют малую область последовательности ДНКGDNF того же вида или вида подобного тому,из которого была приготовлена библиотека. Или же зонды могут быть вырожденными, как здесь обсуждается. Скрининг библиотек, как правило, осуществляется гибридизацией олигонуклеотидного зонда или кДНК с библиотечными зондами в условиях, степень жсткости которых предотвращает неспецифическое связывание, но позволяет связывание тех клонов, которые имеют значительный уровень гомологии, с зондом или праймером. Типичные условия гибридизации и отмывания зависят частично от размера (т.е. числа нуклеотидов) кДНК или нуклеотидного зонда и того, является ли зонд вырожденным. Возможность получения клона(ов) тоже принимается во внимание при конструировании (подборе) раствора для гибридизации (т.е. ведтся скрининг кДНК-овой библиотеки или геномной библиотеки; если это кДНК-овая библиотека,возможность того, что присутствует интересующая кДНК, высока). Когда фрагменты ДНК (так же, как кДНК) применяются в качестве зондов, типичные условия гибридизации включают такие, которые описаны в Ausubel et al., eds., см. выше. После гибридизации содержащий библиотеку блот промывают в условиях соответствующей жсткости, зависящей от нескольких факторов, таких как размер зонда, ожидаемая гомология зонда,который должен быть клонирован, тип библиотеки, скрининг которой проводят, число клонов,которые подвергают скринингу и тому подобное. Примеры растворов для отмывания в "жстких" условиях (у которых обычно низкая ионная сила и которые применяются при относительно высоких температурах) следующие. Один такой "жсткий" раствор для отмывания содержит 0,015 М NaCl, 0,005 М Na-цитрат и 0,1% SDS (55-65 С). Другой такой "жсткий" буфер содержит 1 мМ Na2EDTA, 40 мМ NaHPO4, pH 7,2, и 1% SDS (примерно 40-50 С). Еще один буфер содержит 0,2 х SSC и 0,1% SDS(примерно 50-65 С). Имеются также примерные методики отмывания в жстких условиях, где применяют 30 олигонуклеотидные зонды для скрининга кДНК-овых или геномных библиотек. Например, первая методика использует 6 х SSC с 0,05% пирофосфата натрия при температуре между примерно 35 и 62 С в зависимости от длины зонда. Например, зонды с 14 основаниями отмывают при 35-40 С, зонды с 17 основаниями при 45-50 С, зонды с 20 основаниями при 52-57 С и зонды с 23 основаниями при 57-63 С. Температуры могут быть повышены на 2-3 С,где фоновое неспецифическое связывание, повидимому, высоко. Вторая методика подразумевает использование для промывания тетраметиламмонийхлорида. Один такой раствор для промывания в жстких условиях содержит 3 М ТМАС, 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0 и 0,2% SDS. Другой удобный способ получения нуклеотидной последовательности, кодирующей усечнный GDNF-белок, представляет собой полимеразную цепную реакцию (PCR). По этому способу poly (A) + РНК или тотальная РНК извлекаются из ткани, которая экспрессируетGDNF. кДНК далее получают на основе РНК с помощью обратной транскриптазы (ревертазы). Затем к кДНК добавляют два олигонуклеотидных праймера, обычно комплементарных двум отдельным областям кДНК GDNF, вместе с полимеразой, например, полимеразой Tag. Если выбранный способ получения нуклеотидной последовательности, кодирующей заданный усечнный GDNF-белок, требует применения олигонуклеотидных праймеров или проб (например, PCR, скрининг кДНК-овых или геномных библиотек), олигонуклеотидные последовательности, выбранные в качестве зондов или праймеров, должны быть адекватной длины и достаточно однозначны для того, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание,которое происходит при библиотечном скрининге или PCR-амплификации. Основу действительной последовательности проб или праймеров обычно составляют консервативные или высокогомологичные последовательности или области того же или подобного гена из другого организма. По возможности, зонды или праймеры могут быть полностью или частично вырожденными,т.е. содержать смесь зондов/праймеров, которые кодируют ту же самую аминокислотную последовательность, но используют для этого различные кодоны. Альтернативой получению вырожденных зондов является помещение инозина в некоторые или все те положения кодона, которыми отличаются различные виды. Олигонуклеотидные зонды или праймеры можно получить химическими методами синтеза, описанными выше для ДНК. Усечнные GDNF-белки на основе этих нуклеотидных последовательностей, кодирующих GDNF, а также мутантные последовательности и варианты последовательностей также входят в объм данного изобретения. Как описано выше, мутантная последовательность или 31 вариант последовательности представляет собой последовательность, которая содержит одну или более нуклеотидных замен, делеций и/или инсерций по сравнению с последовательностью дикого типа и которая приводит к экспрессии вариантов аминокислотной последовательности по сравнению с аминокислотной последовательностью дикого типа. В некоторых случаях могут существовать природныеGDNFаминокислотные мутанты или варианты вследствие существования природного аллельного варианта. Усечнные GDNF-белки на основе таких природных мутантов или вариантов также входят в объм данного изобретения. Получение синтетических мутантных последовательностей также хорошо известно из уровня техники и описано, например, Wells et al. (Gene, 34:315,1985) и Sambrook et al., см. выше. Векторы кДНК или геномную ДНК, кодирующую усечнный GDNF-белок, встраивают в вектор для дальнейшего клонирования (амплификация ДНК) или для экспрессии. Соответствующие векторы коммерчески доступны, или вектор может быть специально сконструирован. Выбор или конструкция соответствующего вектора будет зависеть от того, 1) будет ли он применяться для амплификации или для экспрессии ДНК, 2) размера ДНК, которую нужно встроить в вектор, и 3) природы клетки-хозяина (например, является ли она клеткой млекопитающего,насекомого, дрожжей, грибов, растений или бактерий), которая трансформируется вектором. Каждый вектор содержит различные компоненты в зависимости от его функции (амплификация ДНК или экспрессия ДНК) и его совместимости с заданной клеткой-хозяином. Векторы обычно содержат, но не ограничиваются перечисленными, один или более из следующих элементов: сигнальную последовательность,ориджин репликации, один или более селективный или маркерный ген, энхансер, промотор,последовательность терминации транскрипции и тому подобное. Эти элементы могут быть получены из природных источников или синтезированы известными способами. Векторы по данному изобретению включают нуклеотидную последовательность, которая кодирует интересующий усечнный GDNF-белок, функционально связанный с одной или более контролирующих или регулирующих экспрессию последовательностей, способных направлять, контролировать или по-иному воздействовать на экспрессию усечнного GDNF-белка выбранной клеткой-хозяином. Сигнальная последовательность Сигнальная последовательность может быть компонентом вектора или это может быть частью ДНК GDNF, которая внедрена в вектор. ДНК природного GDNF кодирует сигнальную последовательность на аминном конце белка,которая отщепляется во время посттрансляци 001204 32 онного процессинга белка с образованием зрелого GDNF-белка. В объм данного изобретения включены усеченные GDNF-полинуклеотиды с природной сигнальной последовательностью и другие пре-про-последовательности, так же как и усечнные GDNF-полинуклеотиды, у которых природная сигнальная последовательность делетирована и заменена гетерологичной сигнальной последовательностью. Выбранная гетерологичная сигнальная последовательность должна быть такой, чтобы е распознала и процессировала, т.е. отщепила сигнальной пептидазой клетка-хозяин. Для прокариотических клетокхозяев, которые не распознают и не процессируют сигнальную последовательность природного GDNF, сигнальную последовательность заменяют сигнальной последовательностью прокариот, выбранной, например, из группы лидерных последовательностей щелочной фосфатазы, пенициллиназы или термостойкого энтеротоксина Il. Для секреции в дрожжах сигнальная последовательность природного GDNF может быть заменена последовательностью дрожжевой инвертазы, альфа-фактора или кислой фосфатазы. Для экспрессии клетками млекопитающих пригодна природная сигнальная последовательность, хотя могут быть использованы и другие сигнальные последовательности белков млекопитающих. Ориджин репликации Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно включают аминокислотную последовательность, которая делает вектор способным к репликации в одной или более выбранных клеток-хозяев. В клонирующих векторах эта последовательность обычно обеспечивает репликацию вектора независимо от хромосомной ДНК, клетки-хозяина и включает ориджин репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны для многих бактерий, дрожжей и вирусов. Ориджин репликации из плазмиды pBR322 пригоден для большинства грамотрицательных бактерий, и различные ориджины (например, ориджин SV40, вируса полиомы, аденовируса, VSV или BPV) применимы для клонирующих векторов в клетках млекопитающих. Обычно ориджин репликации не требуется для экспрессирующих векторов млекопитающих (например, ориджин SV40 часто применяют только потому, что он содержит ранний промотор). Селективный ген Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат селективный ген. Этот ген кодирует "маркерный" белок, необходимый для выживания или роста трансформированных клеток-хозяев при выращивании в селективной культуральной среде. Клетки-хозяева, которые не были трансформированы вектором, не будут содержать селективный ген и, следовательно, не выживут в культуральной среде. Типичные се 33 лективные гены кодируют белки, которые а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину; б) восполняют ауксотрофную недостаточность или в) снабжают необходимыми питательными веществами, не поступающими из культуральной среды. Другие селективные гены могут быть использованы для амплификации гена, который будет экспрессироваться. Амплификация представляет собой процесс, при котором гены, более нужные для получения необходимого для роста белка, многократно тандемно повторяются в хромосомах эффективно растущих рекомбинантных клеток. Примеры соответствующих селективных маркеров для клеток млекопитающих включают дигидрофолатредуктазу (DHFR) и тимидинкиназу. Клеточные трансформанты млекопитающих подвергают давлению, которое могут пережить только те трансформанты, которые вследствие действия маркера приспособлены к выживанию. Давление отбора проводят,культивируя трансформированные клетки в условиях изменения концентрации селективного агента в среде, что, таким образом, приводит к амплификации как селективного гена, так и ДНК, кодирующей усечнный GDNF. В результате на основе амплифицированной ДНК синтезируется повышенное количество усечнногоGDNF. Например, клетки, трансформированные селективным геном DHFR, отбирают при выращивании всех трансформантов в культуральной среде, которая содержит метотрексат, конкурентный антагонист DHFR. Подходящей клеткой-хозяином, если используют DHFR дикого типа, является линия клеток яичника китайского хомячка с дефицитом DHFR-активности (см.,например, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad.Sci., USA 77(7): 4216-4220 (1980. Трансформированные клетки затем экспонируют с повышенным количеством метотрексата. Это приводит к синтезу множественных копий DHFR-гена и, соответственно, многочисленных копий другой ДНК, в составе экспрессирующего вектора,например, ДНК, кодирующей усечнный GDNFбелок. Промотор Экспрессирующие и клонирующие векторы по данному изобретению обычно содержат промотор, который распознатся клетками хозяина и функционально связывается с нуклеотидной последовательностью, кодирующей усечнный GDNF-белок. Промоторы представляют собой нетранслируемые последовательности,расположенные выше ("upstream") (5') относительно инициирующего кодона структурного гена (обычно между примерно от 100 до 1000 п.о.), который контролирует транскрипцию и трансляцию конкретной нуклеотидной последовательности, например, кодирующей усечнныйGDNF. Промоторы условно делят на два класса: индуцибельные промоторы и конститутивные промоторы. Индуцибельные промоторы инициируют повышенный уровень транскрипции ДНК под их контролем в ответ на некоторое изменение в среде, например, наличие или отсутствие питательного вещества или изменение температуры. Большое количество промоторов,распознаваемых потенциальными клеткамихозяевами, хорошо известно. Эти промоторы функционально связывают с ДНК, кодирующими усечнный GDNF, удаляя промотор из источника ДНК расщеплением рестриктазой и вводя заданную последовательность промотора в вектор. Последовательность нативного (природного) GDNF-промотора можно применять для непосредственной амплификации и/или экспрессии ДНК усечнного GDNF. Гетерологичный промотор предпочтителен, однако, если он обеспечивает более эффективную транскрипцию и более высокие выходы экспрессируемого белка по сравнению с нативным промотором и если он совместим с выбранной системой клетки-хозяина. Промоторы, пригодные для применения в случае прокариотических хозяев, включают бета-лактамазную и лактозную промоторные системы; щелочную фосфатазу, промоторную систему триптофана (trp); гибридные промоторы,такие как промотор tac. Также применимы другие известные бактериальные промоторы. Их нуклеотидные последовательности были опубликованы, что, таким образом, позволяет специалистам в данной области лигировать их с нужной(ыми) последовательностью(ями) ДНК,используя линкеры или адаптеры, как необходимые для восполнения любых требуемых сайтов рестрикции. Соответствующие промотирующие (стимулирующие) последовательности для применения с дрожжевыми клетками-хозяевами также хорошо известны из уровня техники. Дрожжевые энхансеры преимущественно применяются с дрожжевыми промоторами. Соответствующие промоторы для применения с клеткамихозяевами млекопитающих хорошо известны и включают таковые, которые получены из генома вирусов, например, вируса полиомы, вируса оспы птиц, аденовируса (например, аденовируса 2), вируса бычьей папилломы, вируса саркомы птиц, цитомегаловируса, ретровируса, вируса гепатита В и наиболее предпочтительно вируса зелной мартышки (SV40. Другие промоторы,применимые в клетках-хозяевах млекопитающих, включают гетерологичные промоторы,например, промоторы теплового шока и промотор астмы. В настоящее время для полученияGDNF-белков в клетках СНО применяется промотор SR. См. Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8(1):466-472 (1988). Применимым экспресси 35 рующим вектором является pDSR2, который дополнительно описан ниже. Энхансер Энхансерную последовательность можно встраивать в вектор для усиления транскрипции последовательности ДНК, кодирующей усечнный GDNF-белок по данному изобретению, в клетках высших эукариот. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК,обычно около 10-300 п.о. в длину, которые воздействуют на промотор, повышая его транскрипционную активность. Энхансеры имеют различную локализацию и ориентацию. Они были найдены на 5'- и 3'-участках по отношению к транскрипционной единице. Известно несколько полезных энхансерных последовательностей генов млекопитающих (например,глобина, элактазы, альбумина, альфа-фето-белка и инсулина). Обычно, однако, используют вирусный энхансер. Энхансер SV40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы и энхансеры аденовирусов являются примерами элементов, усиливающих активацию промоторов эукариот. Хотя энхансер можно сплайсировать в вектор в положения 5'или 3'-ДНК усечнного GDNF, он обычно располагается в положении 5'-промотора. Терминация транскрипции Экспрессирующие векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (клетках дрожжей, грибов, насекомых, растений, животных, человека или содержащих ядро клетках других многоклеточных организмов), должны включать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно получают из 5'- и иногда 3'-нетранслируемых областей ДНК или кДНК эукариот. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов на нетранслируемом участке мРНК, кодирующей усечнный GDNF. Конструирование соответствующих векторов, содержащих один или более вышеперечисленных элементов вместе с кодирующей последовательностью заданного усечнного GDNF,осуществляется стандартными методами лигирования. Выделенные фрагменты плазмид или ДНК отщепляют, "шьют на заказ" и снова лигируют в заданном порядке с образованием нужной плазмиды. Чтобы подтвердить получение должным образом ориентированных последовательностей, смеси для лигирования можно использовать для трансформации Е. coli, и трансформанты можно отобрать известными способами, например, по устойчивости к ампициллину, как описано выше. Затем из трансформантов выделяли плазмиды, анализировали их расщеплением рестриктазами и/или секвенировали,подтверждая наличие заданной конструкции. Векторы, которые обеспечивают временную экспрессию ДНК, кодирующей усечнныйGDNF в клетках млекопитающих, могут также быть использованы. В общем, временная экспрессия включает применение экспрессирующего вектора, который может эффективно реплицироваться в клетке-хозяине, так что в клетке-хозяине накапливаются многочисленные копии экспрессирующего вектора и, в свою очередь, синтезируется в высокой степени заданный белок, кодируемый экспрессирующим вектором. Временные системы экспрессии, представляющие собой соответствующий вектор экспрессии и клетку-хозяина, обеспечивают возможность удобной идентификации белков,кодируемых клонированными ДНК, а также быстрый скрининг таких белков на биологические или физиологические свойства. Таким образом, временные системы экспрессии особенно полезны при определении вариантов белка. Отбор и трансформация клеток-хозяев Клетки-хозяева (например, клетки бактерий, млекопитающих, насекомых, дрожжей или растительные клетки), трансформированные нуклеотидными последовательностями для экспрессии рекомбинантного усечнного GDNFбелка также входят в объем данного изобретения. Трансформированную клетку-хозяин культивируют в соответствующих условиях, обеспечивающих экспрессию нуклеотидной последовательности. Соответствующие клетки-хозяева и способы трансформации, выращивания, амплификации, скрининга и получения и очистки продукта хорошо известны из уровня техники. См., например, Gething and Sambrook, Nature 293:620-625 (1981), или же Kaufman et al., Mol.WO 93/06116, которые относятся к экспрессии зрелого GDNF. Другие примеры материалов и способов обсуждаются дополнительно ниже. Трансформированную клетку-хозяин культивируют в соответствующей среде и экспрессируемый белок затем, по возможности, выделяют и очищают от культуральной среды (или от клеток, если экспрессия внутриклеточная) подходящими способами, известными специалистам в данной области. Подходящие клетки-хозяева для клонирующих или экспрессирующих векторов в соответствии с данным изобретением представляют собой клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот, описанные выше. Прокариотические клетки-хозяева включают, но не ограничиваются указанными клетками эубактерий, грамотрицательных или грам-положительных организмов, например, Е. coli, бацилл таких как В.subtilis, Pseudomonas, например, Р. aeruginosa,Salmonella typhimurium или Serratia marcescans. Или же применимы способы клонирования invitro, например PCR или другие реакции полимераз нуклеиновых кислот. Кроме прокариотических клеток-хозяев,подходящими хозяевами для экспрессии усечнных GDNF-белков могут быть, например,нитевидные грибы или дрожжи. Saccharomycescerevisiae, или обычные пекарские дрожжи,наиболее широко используются среди низших эукариотических хозяев-микроорганизмов, но ряд других родов, видов и штаммов хорошо известны и общедоступны. Соответствующие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного усечнного GDNFбелка получают из многоклеточных организмов,такие клетки-хозяева способны к сложному процессингу и гликозилированию. В принципе,можно использовать культуру любых высших эукариотических клеток как культуру клеток позвоночных, так и беспозвоночных, в том числе клеток растений и насекомых. Применение клеток позвоночных для их размножения в культуре (тканевая культура) является хорошо известной. Примеры подходящих линий клетокхозяев млекопитающих включают, но не ограничиваются этим, клеточную линию почки зеленой мартышки CV1, трансформированнуюCV40 (COS-7), зародышевую линию человеческой почки (293, или 293 клетки, субклонированные для выращивания в суспендированной культуре), клетки почки детеныша хомяка и клетки яичника китайского хомячка. Другие подходящие клеточные линии включают, но не ограничиваются указанным, HeLa, клетки мышиL-929, 3 Т 3-клетки линий мышей Swiss, Balb-c или NIH, линии клеток хомяка ВНК или НаК. Подобным образом применимы в качестве клеток-хозяев по данному изобретению бактериальные клетки. Например, различные штаммы Е. coli (например, НВ 101, DH5, DH10 и МС 1061) хорошо известны в качестве клетокхозяев в биотехнологии. Различные штаммыStreptomyces spp. и тому подобные могут также применяться. Предпочтительными в настоящее время клетками-хозяевами для получения усечнных GDNF-белков являются бактериальные клетки (например, Escherichia coli) и клетки млекопитающих (такие как клетки яичника китайского хомячка, COS-клетки и т.д.). Клетки-хозяева трансфицируются и предпочтительно трансформируются вышеописанными экспрессирующими или клонирующими векторами и выращиваются в традиционной питательной среде. Среду можно модифицировать, сделав пригодной для индуцирования промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих заданные последовательности. Трансфекцию и трансформацию осуществляют с применением стандартных методик, которые хорошо известны специалистам в данной области и выбор которых зависит от природы клеток-хозяев. Например, для клеток млекопитающих, не имеющих клеточных 38 оболочек, может быть использован способ осаждения фосфатом кальция. Электропорация,микроинъекция и другие известные способы также могут быть использованы. Культивирование клеток-хозяев Трансформированные клетки, применяемые для получения усечнных GDNF-белков в соответствии с данным изобретением, выращиваются в соответствующих средах. Среды могут быть при необходимости дополнены гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлористый натрий, кальций, магний или фосфат), буферами(например, HEPES), нуклеозидами (например,аденозином и тимидином), антибиотиками (такими как гептамицин), микроэлементами (определяемыми как неорганические соединения,обычно присутствующие в конечных составах в микромолекулярных концентрациях) и глюкозой или другими источниками энергии. Могут быть включены другие добавки в соответствующих концентрациях по усмотрению специалистов в данной области. Соответствующие условия культивирования, такие как температура,рН и тому подобное для выбранных клетокхозяев, также хорошо известны специалистам в данной области. Усечнные GDNF-белки могут быть получены и гомологичной рекомбинацией или в соответствии со способами рекомбинантного продуцирования с использованием контролирующих элементов, введенных в клетки, уже содержащие ДНК, кодирующую GDNF. Гомологичная рекомбинация представляет собой метод,первоначально предназначенный для того, чтобы заставить гены вызвать или скорректировать мутации в транскрипционно активных генахBiol. 36:301 (1989. Первоначально указанный способ был предложен для введения специфических мутаций в специфические области генома млекопитающих (Thomas et al., Cell. 44:419428, 1986; Thomas and Capecchi, Cell. 51:503512, 1987; Doetschman et al., Proc. Natl. Acad.Sci. 85:8583-8587, 1988) или корректировки специфических мутаций в дефектных генах(Doetschman et al., Nature, 330:576-578, 1987). Примеры методов гомологичной рекомбинации описаны в патенте US 5,272,071 (ЕР 91903051,опубликованной под 505500; заявке PCT/US 90/07642, опубликованной подWO 91/09955),которые приведены здесь в качестве ссылок. С помощью гомологичной рекомбинации последовательность ДНК, которая должна быть встроена в геном, может быть "направлена" в конкретную область интересующего гена за счет присоединения к целевой ДНК. Целевая ДНК представляет собой ДНК, комплементарную (гомологичную) участку геномной ДНК. Небольшие участки целевой ДНК, которые комплементарны специфической области гено 39 ма, вступают в контакт с родительской нитью в ходе процесса репликации ДНК. Это общее свойство ДНК, которая была внедрена в клетку,с целью гибридизации и, следовательно, рекомбинации с другими частями эндогенной ДНК через общие гомологичные области. Если эта комплементарная нить соединена с олигонуклеотидом, который содержит мутацию или отличающуюся последовательность ДНК, она также внедряется во вновь синтезированную нить в результате рекомбинации. В результате функционирования системы исправления ошибок новая последовательность ДНК может служить в качестве матрицы. Таким образом, перенесенная ДНК внедряется в геном. Если последовательность конкретного гена известна, например, нуклеотидная последовательность GDNF, пре-про-последовательность или последовательность, контролирующая экспрессию, то часть ДНК, которая комплементарна выбранной части гена, можно синтезировать или получить другим способом, например соответствующей рестрикцией нативной ДНК на специфических (сайтах) участках распознавания, расположенных вокруг интересующей области. Эти части служат в качестве последовательностей-мишеней при инсерции в клетку и будут гибридизоваться с гомологичной областью в геноме. Если гибридизация происходит во время репликации ДНК, этот участок ДНК и любая дополнительная последовательность, соединенная с ним, будет вести себя как фрагмент Оказаки и будет вшит во вновь синтезированную дочернюю нить ДНК. В соответствии с настоящим изобретением к частям ДНК-мишени присоединяют области ДНК, которые могут взаимодействовать с экспрессией GDNF-белка. Например, промотор/энхансер, супрессор или элемент, модулирующий экзогенную транскрипцию, встраивается в геном клетки-хозяина в такой пространственной близости и ориентации, чтобы влиять на транскрипцию ДНК, кодирующей заданный усечнный GDNF. Контролирующий элемент не кодирует усечнный GDNF, а контролирует часть ДНК, присутствующую в геноме клеткихозяина. Таким образом, экспрессия усечнныхGDNF-белков может быть достигнута не трансфекцией ДНК, которая кодирует сам усечнныйGDNF-ген, но скорее применением целевой ДНК (содержащей области гомологии с интересующим эндогенным геном), объединнной с регуляторными сегментами ДНК, которые обеспечивают последовательность эндогенного гена распознаваемыми сигналами для транскрипции усечнного GDNF-белка. В соответствии с данным изобретением могут быть использованы также способы гомологичной рекомбинации для модификации клетки, которая содержит транскрипционноGDNF. GDNF-белок затем можно процессировать с образованием усечнного(ых) GDNFбелка(ов). Фармацевтические композиции на основе усечнного GDNF Фармацевтические композиции на основе усечнных GDNF-белков обычно содержат терапевтически эффективное количество продукта усечнного GDNF-белка в смеси с одной или более фармацевтически и физиологически приемлемыми добавками. Соответствующие добавки включают, но не ограничиваются перечисленными, антиоксиданты, консерванты, красители, вкусовые добавки и агенты для разведения, эмульгаторы, суспендирующие вещества,растворители, наполнители, вещества, увеличивающие объем, буферы, средства доставки (наполнители), разжижители, носители и/или фармацевтические адъюванты. Например, соответствующим растворителем может быть вода для инъекций, физиологический раствор или искусственная спиномозговая жидкость, возможно,дополненные другими веществами, обычными для композиций для парентерального введения. Нейтральный забуференный физиологический раствор или физиологический раствор, смешанный с сывороточным альбумином, также являются примерами носителей (наполнителей). Основной растворитель в носителе может быть водным или неводным по природе. Кроме того, носитель может содержать другие фармацевтически приемлемые наполнители для изменения или сохранения рН, осмотического давления, вязкости, прозрачности, цвета, стерильности, устойчивости, скорости растворения или запаха лекарственного средства. Подобным образом носитель может содержать другие фармацевтически приемлемые наполнители для изменения или сохранения стабильности, скорости растворения или скорости высвобождения усечнного GDNF-белка или для стимулирования всасывания или проникновения усечнногоGDNF-белка через гематоэнцефалический барьер. Такие наполнители представляют собой вещества, традиционно применяемые для приготовления дозированных препаратов для парентерального введения, содержащих как однократные, так и многократные дозы, или для непосредственного вливания в спинномозговую жидкость путем непрерывной или периодической инфузии из имплантированного насоса. Будучи приготовлена терапевтическая композиция может храниться в стерильных сосудах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или дегидратированного или лиофилизированного порошка. Такие препараты могут храниться в форме, готовой к применению, или в форме, например, лиофилизированной, требующей растворения перед введением. Оптимальная фармацевтическая рецептура определяется специалистом в данной области в 41 зависимости от способа введения и заданной дозировки. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack PublishingCo., Easton, PA 18042) pp. 1435-1712 (руководство приведено здесь в качестве ссылки). Композиция может также содержать корпускулярные препараты полимерных соединений, такие как полиактиновая кислота, полигликолевая кислота и т.д. Может также применяться гиалуроновая кислота, которая может обеспечивать пролонгированное действие при введении препарата в кровоток. Такие композиции могут влиять на физические параметры, устойчивость,скорость in vivo выделения и скорость in vivo выведения данных белков и их производных. Другие эффективные формы введения, например, парентеральные препараты пролонгированного действия, аэрозоли для ингаляции,препараты, активные при пероральном приме или суппозитории также предусмотрены. Фармацевтические композиции на основе усечнного GDNF-белка могут приготовляться для парентерального введения, например, для интрацеребровентрикулярной инъекции. Такие парентерально вводимые терапевтические композиции обычно находятся в форме апирогенного,водного раствора, содержащего усечнныйGDNF-белок в фармацевтически приемлемом носителе. Предпочтительным носителем является физиологический раствор. Также фармацевтическая композиция, содержащая усечнный GDNF-белок, может вводиться перорально. Усечнный GDNF-белок,который вводится таким образом, может быть заключен в капсулу и может быть приготовлен с применением или без тех носителей, которые обычно применяются в приготовлении твердых дозированных препаратов. Капсулы могут быть изготовлены таким образом, чтобы высвобождать активную часть препарата в желудочнокишечном тракте, когда биологическая доступность максимальна, а предварительный распад препарата минимален. Дополнительные носители могут быть включены в препарат для облегчения всасывания усечнного GDNF-белка. Разбавители, вкусовые добавки, низкоплавкие воски, растительные масла, смазывающие вещества, суспендирующие агенты, дезинтегрирующие вещества и связывающие агенты также могут применяться. Введение усечнного GDNF-белка Усечнный GDNF-белок можно вводить парентерально путем подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрилгочного,трансдермального, подоболочечного и интрацеребрального введения. Белковые ростовые факторы, которые не проходят через гематоэнцефалический барьер, могут вводиться непосредственно интрацеребральным или иным путем вместе с другими веществами, которые переносят их через барьер. Предпочтительно, чтобы усечнный GDNF-белок вводили интрацеребровен 001204 42 трикулярно или в субарахноидальное пространство головного или спинного мозга. УсечнныйGDNF-белок можно также вводить интрацеребрально непосредственно в паренхиму мозга. Усечнный GDNF-белок можно также вводить путем освобождения из имплантата пролонгированного действия в мозгу, содержащего нейротрофический фактор, помещнный в матрицу из биологически разлагаемого полимера. Усечнный GDNF-белок можно вводить экстрацеребрально в форме, которая была химически модифицирована или так упакована, что она проходит через гематоэндефалический барьер или может быть введена вместе с одним или более агентами, способными стимулировать проникновение усечнного GDNF-белка через указанный барьер. Например, конъюгат NGF и моноклональных антител к рецепторам антитрансферрина, как было показано, переносится в мозг за счет связывания с рецепторами трансферрина. Чтобы обеспечить заданную дозу усечнного GDNF-белка, можно осуществлять повторные инъекции ежедневно или менее часто,или усечнный белок может вливаться непрерывно или периодически из имплантированного насоса с постоянными или программируемыми инъекциями. Частота инъекций будет зависеть от фармакокинетических параметров усечнного GDNF-белка в составе препарата и способа введения. Независимо от способа введения конкретную дозу обычно рассчитывают в соответствии с весом тела и площадью поверхности тела. В случае заболеваний мозга, конкретную дозу вычисляют в соответствии с приблизительным весом мозга больного, который также можно оценить, исходя из веса тела или площади поверхности тела. Дальнейшее уточнение расчетов, необходимое для определения примерной дозы для лечения, включающее каждую из вышеупомянутых составляющих, обычно проводят специалисты в данной области, особенно на основе информации о дозе и методах анализа,раскрытых в настоящем описании. Соответствующие дозировки могут быть подтверждены с помощью установленных методов анализа для определения доз в сочетании с соответствующими данными о реакции на дозу. Окончательный порядок прима препарата, являющийся частью способа лечения специфического состояния, будет определяться лечащим врачом,исходя из различных факторов, которые влияют на действие лекарств, например, возраст, состояние, вес тела, пол и диета больного, тяжесть любой инфекции, время введения и другие клинические факторы. Усечнный GDNF-белок по данному изобретению также может применяться, сам по себе или в сочетаниях с другими факторами роста,для лечения заболеваний нервной системы. Например, усечнный GDNF-белок может быть применн для лечения некоторых форм таких 43 заболеваний в сочетании с фактором роста нервов. Кроме того, другие ростовые факторы или другие вещества, включая химические композиции, могут применяться вместе с усечннымGDNF-белком. При лечении болезни Паркинсона принимается во внимание, что усечнныйGDNF-белок будет применяться как самостоятельно, так и в сочетании с L-дофамином, когда усечнный GDNF повышает продукцию эндогеного дофамина и поглощение нейронами дофамина. Как сказано выше, также принимается во внимание, что дополнительные нейротрофические или нейронные факторы будут полезны или необходимы для обработки некоторых типов клеточных популяций нейронов или лечения определенных поражений или заболеваний. Другие факторы, которые можно использовать в сочетании с усечнным GDNF, включают, но не ограничиваются указанными: митогены, такие как инсулин, инсулиноподобные факторы роста,эпидермальный фактор роста, вазоактивный фактор роста, полипептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза, интерферон и соматостатин; нейротрофические факторы, например,нейротрофический фактор роста мозгового происхождения, нейротрофин-3, нейротрофин-4,5,нейротрофин-6, инсулиноподобный фактор роста, цилиарный нейротрофический фактор, кислый и основный фактор роста фибробластов,фактор роста фибробластов-5, -трансформирующие факторы роста (активины), кокаинамфетаминный регуляторный транскрипт(CART) и зрелый GDNF, и другие факторы роста, например эпидермальный фактор роста, фактор, ингибирующий лейкоз, интерлейкины, интерфероны, колониестимулирующие факторы; а также молекулы и вещества, функционально эквивалентные этим факторам. Можно также предвидеть, что непрерывное введение или пролонгированное высвобождение усечнного GDNF-белка может быть благоприятным для данной процедуры лечения. Хотя непрерывное введение может быть выполнено механическими способами, например, с помощью инфузионного насоса, предполагается, что можно на практике применять другие способы непрерывного или почти непрерывного введения. Например, химическая дериватизация может обеспечить получение форм белка с пролонгированным действием, что приводит к постоянному их наличию в кровотоке, в заданных количествах, в зависимости от определнного режима введения. Таким образом, усечнныйGDNF-белок представляет собой и GDNF-белок,который модифицирован с целью осуществления непрерывного введения. Клеточная терапия с помощью усечнногоGDNF-белок, также включена в объем изобретения. Она может включать имплантацию боль 001204 44 ным клеток, которые способны синтезировать и секретировать биологически активную форму усечнного GDNF-белка. Такие клетки представляют собой продуцирующие GDNF-белок клетки, которые в нормальном состоянии не синтезируют нейротрофический фактор, но модифицируются для продуцирования усечнногоGDNF, или клетки, способность которых продуцировать GDNF повышена в результате трансформации полинуклеотидом, обеспечивающим экспрессию и секрецию усечнногоGDNF-белка. Чтобы свести к минимуму потенциальную иммунологическую реакцию больных на введение чужеродного GDNF других видов,предпочтительно, чтобы клетки были человеческого происхождения и продуцировали усечнный GDNF-белок человека. Имплантированные клетки могут быть помещены в капсулы, чтобы избежать проникновения клетки в ткани мозга. Клетки человека или животного могут быть имплантированы больным в биосовместимой полупроницаемой полимерной оболочке или мембране, которая делает возможным транслокацию усечнногоGDNF-белка, но предотвращает разрушение клеток иммунной системой больного или другими факторами окружающей ткани. Или же собственные клетки больного, трансформированные ex vivo, чтобы продуцировать усечнный GDNF, могут быть имплантированы больному непосредственно без такой оболочки. Методология инкапсулирования в мембрану живых клеток известна специалисту в данной области и, следовательно, приготовление инкапсулированных клеток и их имплантация больному могут быть легко осуществлены. См.,например, патенты США 4,892,538,5,011,472 и 5,106,627, которые приведены здесь в качестве ссылки. Способ инкапсулирования живых клеток также описан в опубликованной заявке WO 91/10425 (Aebischer et al.), которая приведена здесь в качестве ссылки. См. также опубликованную заявку WO 91/10470 (Aebischeret al.), Winn et al., Exper. Neurol., 113:322-329,1991; Aebischer et al., Exper. Neurol., 111:269275, 1991; Tresco et al., ASAIO, 38:17-23, 1992,которые приведены здесь в качестве ссылки. Возможна также генная терапия in vivo на основе усечнного GDNF-белка, при этом нуклеотидная последовательность, кодирующая усечнный GDNF-белок, вводится непосредственно больному. Например, нуклеотидная последовательность,кодирующая усечнныйGDNF-белок, вводится в клетку-мишень с помощью местной инъекции конструкции нуклеиновой кислоты с или без соответствующего вектора-переносчика, например, адено-ассоциированного вируса. Альтернативные вирусные векторы включают, но не ограничиваются указанными: векторы ретровируса, аденовируса,вируса герпеса и папилломы. Физический перенос может быть осуществлен in vivo с помощью 45 местной инъекции заданной конструкции нуклеиновой кислоты или другого подходящего вектора-переносчика, содержащего нужную нуклеотидную последовательность; переносом,опосредованным липосомой; непосредственной инъекцией (депротеинизированная ДНК); переносом, опосредованным рецептором (комплекс лиганд-ДНК); или бомбардировкой микрочастицами (генное ружь). Описанные препараты усечнного GDNFбелка можно применять также и в ветеринарии,и термин "больной" надо понимать в широком смысле. При применении в ветеринарии интервалы между инъекциями должны быть такими же, как описано выше. В качестве средства дополнительной характеристики усечнных GDNF-белков по данному изобретению могут применяться антитела,которые связываются с усечнным GDNFбелком так, как с эпитопами в X-[Cys41-Cys133]Y аминокислотной последовательности. Специалист в данной области может при помощи известных способов получить антитела моноклональной или поликлональной сыворотки,или рекомбинантные антитела, которые специфически распознают и связываются с различными белками, кодируемыми аминокислотными последовательностями по данному изобретению. Такие антитела можно затем применять для очистки и определения природы усечнногоGDNF-белка. Или же антитела можно применять в качестве терапевтических ингибиторов белков, на которые они направлены. Другие аспекты и преимущества данного изобретения будут понятны после рассмотрения следующих примеров. Пример 1 иллюстрирует экспрессию зрелого GDNF в клеточной системе млекопитающего и получение усечнногоGDNF-белка. Пример 2 относится к экспрессии зрелого GDNF в бактериальной клеточной системе. Пример 3 касается экспрессии различных усечнных GDNF-белков в бактериальной клеточной системе. В примере 4 сравнивается биологическая активность зрелого GDNF-белка и усечнного GDNF-белка в анализе на нейротрофическую активность дофаминэргических нейронов. Примеры Пример 1. Экспрессия зрелого человеческого GDNF в клетках СНО и очистка полученного из клеток СНО усечнного GDNF-белка. Материалы. Следующие материалы использовались при экспрессии человеческого GDNF в СНОклетках с дефицитом дигидрофолатредуктазыand Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77(7):4216-4220 (1980. СНОdсреда содержала: модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM)с высоким содержанием глюкозы (Gibco/BRL); 5% эмбриональная бычья сыворотка (HyClone);(Gibco/BRL); и глутамин/пенициллин/стрептомицин (1%) (Irvine Scientific). Элективная избирательная среда содержала: DMEM (с высоким содержанием глюкозы); 5% диализованную эмбриональную бычью сыворотку (HyClone); MEM заменимые аминокислоты; и глутамин/пенициллин/стрептомицин. 2 Х HEPES-буферизованный физиологический раствор (HBS) содержал: 280 мМ NaCl; 10 мМ КСl; 1,5 мМ Na2HPO4; 12 мМ декстрозы; и 50 мМ HEPES.Tris-буферизованный физиологический раствор плюс Tween (TBST) содержал: 137 мМNaCl; 20 мМ Tris/HCl pH 7,5; и 0,1% Tween-20. Способы. Трансфекция и отбор. Клетки CHOd- (пассаж 20) засевали в 60 миллиметровые плашки с культурой ткани (Falcon) при плотности 8105 клеток на плашку в СНОdпитательной среде. На следующий день примерно за три часа до трансфекции среду в клетках заменяли свежей. Плазмидную конструкцию, содержащую к ДНК соответствующую GDNF, получали хорошо известными методами. Например, плазмидная конструкция pDSR2 была приготовлена в соответствии со способом, описанным в заявке США 08/501,904, поданной 29 марта 1990 г.(см. также европейская патентная заявка 90305433,публикации ЕР 398753, подана 18 мая 1990 г. и WO 90/14363 (1990), которые приведены здесь в качестве ссылок. Пример плазмидной карты, которая иллюстрирует структурную организацию вектора, изображена на фиг. 2. Специалистам в данной области будет понятно, что также могут быть использованы многие нуклеотидные последовательности, кодирующие зрелый GDNF-белок, например, последовательности, изображнные на фиг. 1, 3 и 4.HindIII-Xbal ДНК-фрагмент, содержащий кодирующие последовательности человеческогоGDNF и консенсусные последовательности трансляции Козака, CCACC(ATG), был получен расщеплением рестриктазой из экспрессирующего вектора на основе pcDNA3 (Invitrogen, SanDiego, CA). Фрагмент ДНК непосредственно клонировали в pDSR2, усеченную HindIII/Xbal. Образовавшуюся плазмиду обозначили pSW5. Перед трансфекцией плазмидную ДНК pSW5 перевели в линейную форму по сайту PuvI.pDSR2 (фиг. 2) представляет собой производную от плазмиды pCD (Okayama and Berg,Mol. Cell Biol. 3:280-289, 1983) с тремя основными модификациями: (i) сигнал полиаденилированияSV40 заменили сигналом субъединицы бычьего фолликулярного стимулирующего гормона -bFSH (Goodwill et al.,Nucleic Acids Res. 11:6873-6882, 1983); (ii) мы 47 шиный миниген дигидрофолатредуктазы (Gasseret al., Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6522-6526, 1982) внедрили ниже ("downstream") кассеты экспрессии, чтобы были возможны отбор и амплификация трансформанта; и (iii) фрагмент протяжнностью 267 п.о., содержащий "R-элемент" и часть "U5" последовательностей длинного концевого повтора (LTR) вируса человеческого Тклеточного лейкоза типа I (HTLV-I) был клонирован и внедрен между промотором SV40 и сигналами сплайсинга, как описано ранее (Takebe et al., Mol. Cell Biol. 8:466-472, 1988). Были приготовлены растворы ДНК с конечной концентрацией GDNF-плазмидной ДНК 3,0 мг/плашка, носитель геномной ДНК мышиной почки (Clontech) 7,0 мг/плашка, 2,5 М CaCl2 25 мкл/плашка и стерилизованная дистиллированная вода до конечного объeма 250 мкл/плашка. Растворы ДНК, содержащиеpDSR2-вектор ДНК или только носитель ДНК,были подобным образом приготовлены в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Растворы ДНК добавляли по каплям к равному объему к 2 Х HEPESбуферизованному физиологическому раствору при пропускании воздуха (в виде пузырьков) через раствор. Растворы ДНК/HBS термостатировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Среду удаляли из клеточных культурCHOd- и в каждую плашку добавляли 500 мкл раствора ДНК. Плашки термостатировали при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего в каждую плашку добавляли СНOdсреду(5,0 мл). Затем плашки термостатировали при 37 С в течение ночи. На следующий день среду заменяли свежей СНОdсредой. На следующий день, когда клетки достигли состояния монослоя, культуры обрабатывали трипсином и перенесли в 100 миллиметровые плашки (Falcon) при соотношении 1 Х 60 мм плашка к 8 Х 100 мм плашек. Клетки поместили в селективную среду. Подпитку культур свежей средой повторяли каждые два-три дня. Через 15 дней колонии трансфицированных клеток выделяли, используя стеклянные цилиндры для клонирования, обрабатывали трипсином и переносили в 24-луночные планшеты (Falcon). В целом 40 колоний было выделено из GDNF/pSW5-трансфицированных клеток. Оставшиеся в плашках клетки обрабатывали трипсином, объединяли и переносили в 100 миллиметровые плашки (один пул для каждой конструкции ДНК). Скрининг трансформированных клеток. Культуры в 24-луночных планшетах и пулах выращивали до состояния монослоя, в это время питательную среду удаляли и заменяли на бессывороточную среду (400 мк/лунка или 4 мл/плашка). Клетки термостатировали в течение 48 ч и кондиционированную среду собирали. 48 Образцы кондиционированной среды анализировали на экспрессию GDNF-белка вестернблоттингом. Аликвоты кондиционированной среды (20 мкл или 40 мкл) разбавляли буфером для нанесения электрофоретического образца (с или без -меркаптоэтанола). Образцы, содержащие -меркаптоэтанол, кипятили три минуты(условия восстановления). Как восстановленные, так и невосстановленные образцы делили на 16% гелях трис-глицина (Novex). Гели электроосаждались на нитроцеллюлозных фильтрах(Schleicher and Schuell BA-83, 0,2 мк). Их промывали TBST и затем термостатировали в блокирующем растворе 5% сухого молока (Carnation) в TBST в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем фильтры обрабатывалиcoli; 1:1000 в 5% молоке/TBST) в течение одного часа при комнатной температуре. Затем фильтры промывали с помощью TBST и далее 1% молока/TBST (1 Х 10 мин и 2 X 5 мин). Далее обрабатывали конъюгатом вторичного антитела антикроличьей lg-лошадиной сыворотки с пероксидазой хрена (1:15,000 в 1% молоко/TBST 1 Х 20 мин и 2 Х 10 мин с последующей обработкой реагентами ECL (Amersham) в течение одной минуты и экспозицией с HyperfilmECL (Amersham). Следующий процесс описывает очистку СНО-экспрессируемого GDNF и обрезанногоGDNF-гомодимера из СНО из одного литра кондиционированных сред. Из-за значительного воздействия в СНО-среде протеазы, разрезающей цепь при остатке 31, методика может включать применение ингибитора протеазы в процессе очистки. Стадия 1. Гель-фильтрация. Бессывороточную кондиционированную среду готовили с содержанием 20 мМ 2-[Nморфолино]этансульфоната (MES), рН 6,0, добавляя одну пятую объема 1-молярного MES,рН 6,0. Двадцать пять миллилитров гранулированной смолы SP Serharose Big Bead (Pharmacia), уравновешанную с 20 мМ MES, pH 6,8,добавляли и перемешивали при 4 С в течение одного часа. Смолу собирали, декантируя после отстаивания кондиционированную среду. Декантированную среду фильтровали через дисковый фильтр из фритты (стеклянный фильтр) для регенерации всей неосажденной смолы. Осажденную смолу и смолу, регенерированную фильтрованием, вновь суспендировали и выливали в колонку диаметром 2,5 см, промывали тремя объмами колонки 0,15 М NaCl, 20 мМMES, рН 6,0 (А-буфер). Белок элюировали 300 мл в градиенте от А-буфера до 1,0 М NaCl, 20 мМ MES, рН 6,0 (В-буфер) при скорости потока 0,2 объма колонки/минута при мониторинге поглощения при 280 нм. Собирали фракции, 49 содержащие 1,1 объма колонки. НаличиеGDNF во фракции определяли вестернблоттингом. Фракции, содержащие GDNF, собирали для дополнительной очистки (пул).GDNF элюировали в градиенте концентраций от 0,3 до 0,6 М NaCl. Стадия 2. ВЭЖХ С 4 хроматография. В объединнные фракции с GDNF (пул) из стадии 1 добавляли трифторуксусную кислоту(v/v по объему), фильтровали в вакууме через фильтр 0,45 микрон и помещали на колонкуVydac C4 (0,46 Х 25 см), кондиционированную с 10% водным ацетонитрилом, 0,1% TFA (Абуфер). Белок элюировали в линейном градиенте концентрации 2%/минута в течение 50 мин от А-буфера до 90% водного ацетонитрила, 0,1%TFA (В-буфер) с измерением поглощения при 280 нм. Собирали фракции один миллилитр и наличие GDNF определяли вестерн-блоттингом.GDNF элюировали в градиенте концентрации между 45% и 55% ацетонитрила. Фракции сушили в вакууме. Стадия 3. Высокоэффективная S хроматография. Фракции, содержащие GDNF из стадии 2,растворяли в одном миллилитре 0,1 М NaCl, 10 мМ Tris, pH 8,0 и наносили на колонку TSK-Gel 5WP высокого разрешения S (Toso Haas) размером 0,75 X 7,5 см. Разделение проводили в градиенте концентрации 0,4%/минута от 0,15 МNaCl, 10 мМ Tris, pH 8,0 (В-буфер) в течение 50 мин при скорости тока 1 мл/мин. Одноминутные фракции собирались при измерении абсорбции при 280 нм. При 35% В-буфера градиент изменяли до 6,5%/минута через 10 мин. Вестерн-блоттинг фракций показал наличие четырх главных GDNF-компонентов. Три из компонентов элюировали в градиенте 0,4%/минута и четвртый элюировал в градиенте 6,5%/минута. Делали пулы сходных компонентов и подвергали секвенированию. Анализ секвенированием определил пул примерно 29-36 kD как [Arg32Ile134] усечнный GDNF-белок. Компонент при примерно 38-40 kD был идентифицирован как гетеродимерGDNF/зрелый GDNF. Наконец, компонент около 41-44 kD, выделенный с последней порцией градиента, был определен секвенированием как гомодимер зрелого GDNF. Пример 2. Зрелый человеческий GDNF,продуцированный в Е. соli. Экспрессию зрелого человеческого GDNF бактериальными клетками можно достичь в соответствии со способом, описанным Lin et al. в заявке США 08/182,183, поданной 23 мая 1994 г. и PCT/US 92/07888, поданной 17 сентября 1992 г. (WO/92/10227), а также ЕР 610 254,которые приведены здесь в качестве ссылок. На основании описания настоящего изобретении специалист в данной области поймт, что мно 001204 50 жество материалов и методов можно использовать или адаптировать для соответствующей экспрессии Е. соli или другими бактериальными клетками. Например, в процессе экспрессии могут быть использованы чередующиеся полинуклеотиды, такие как изображены на фиг. 1, 3 и 4. Повторное скручивание (разупорядочивание) и очистка экспрессированного зрелогоGDNF. Трансформированные клетки процессировали при 5 С (если не указано иначе) следующим образом: клеточную пасту (30 г) суспендировали в конечном объме 200 мл, используя 25 мМ Трис, рН 8,5, содержащий 5 мМ EDTA, получая в результате 15%-ную (по объму) клеточную кашицу. Клетки тщательно диспергировали, используя ручной гомогенизатор Biospec с низким сдвигом. Кашицу дважды пропускали через микрофлюидизатор при 14,500 psi с целью разрушить клетки и выделить тельца включения. Образовавшийся гомогенат затем центрифугировали в течение 30 мин при 16,000xg. Осадок телец включения, образовавшийся в результате центрифугирования, промывали повторным суспендированием в охлажднной воде до конечного объма 240 миллилитров, используя гомогенизатор Biospec, как и ранее, с образованием кашицы. Образцы этой кашицы оставляли для ВЭЖХ-анализа уровня экспрессииGDNF. Оставшуюся кашицу центрифугировали в течение 30 мин при 16,000xg. Надосадочную жидкость сливали и добавляли небольшое количество холодной воды в сосуд для центрифугирования и осторожно перемешивали, чтобы удалить независимо образованный мембранный слой на поверхности осадка телец включения. Осадок снова суспендировали с помощью гомогенизатора Biospec с количеством воды, достаточным, чтобы получить концентрацию GDNF 2 ммл. Затем тельца включения растворяли, смешивая конечную суспензию телец включения(25 мл) с 8 М гуанидин НСl (25 мл), содержащим 180 мМ цистеина НСl и 50 мМ Tris HCl, рН 8,7. Смесь для растворения перемешивали при 25 С от 60 до 90 мин, после чего е выливали при перемешивании в 2 М мочевину (450 мл,при 5 С), содержащую 2 мМ Tris HCl, рН 8,75 и 0,2 М гуанидин НСl. Эта смесь для разупорядочивания медленно перемешивалась при 5 С в течение 72 ч. Разупорядоченный GDNF частично очищали следующим образом: 20 мМ буфера ацетата натрия (250 мл, рН 5) при 5 С добавляли при быстром перемешивании к разупорядоченной смеси и рН доводили до 5 ледяной уксусной кислотой. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 13,000xg в течение 45 мин при 5 С. Надосадочную жидкость от центрифугирования применяли в качестве загружаемого (наносимого) раствора на следующей стадии очистки, включающей катионообменную 51 хроматографию с SP-смолой в виде крупных гранул (Pharmacia). Колонка функционировала при 5 С с 20 мМ раствором ацетата натрия в качестве буферной системы для уравновешивания, промывания и элюирования. Смола для насадки (5 мл) была дезинфицирована (промыта) 5 объмами колонки (CV) 0,2 N NaOH и затем уравновешена с ацетатным буфером (5 CV). Загружаемый раствор (190 мл) наносили на колонку при 0,5 CV/минута с последующим промыванием с помощью 10 CV ацетатного буфера при той же скорости потока. Затем GDNF элюировали со смолы 20 CV NaCl в линейном градиенте концентрации от 0,3 М до 0,9 М в ацетатном буфере при скорости потока 0,1 CV/минута. Элюат с колонки проверяли (проводили мониторинг) при 280 нм и собирали фракции, которые анализировали с помощью SDS-PAGE. Фракции, содержащие GDNF, объединяли, начиная от фронта GDNF-пика при 10% от веса пика до хвоста пика при 10% от веса пика. Белок в этом пуле был исключительно GDNF и в зависимости от используемого в процессе штамма содержал от 34 до 12% примесей в виде модифицированных форм GDNF. Пул затем подвергали диализу против буфера PBS или буфера другого состава и в некоторых случаях уменьшали объм ультрафильтрацией до 25 мг/мл. Как GDNF дикого типа, так и его аналоговые формы, очищенные таким способом, были охарактеризованы ВЭЖХ с обратной фазой,катионообменной (хроматографией) ВЭЖХ,масс-спектрометрией и уровнями эндоксина для сравнения частоты препарата в зависимости от соответствующих применяемых для его получения штаммов. Пример 3. Получение усечнного GDNF в Е. coli методом рекомбинантной ДНК. Образцы усечнных GDNF-белков были получены практически в соответствии с методами, описанными в Lin et al. (заявка США 08/182,183, поданная 23 мая 1994 г., см. выше). Также могут быть использованы другие бактериальные материалы и способы экспрессии, как описано выше. Е. соli-экспрессированные усечнные GDNF-белки включали [Pro23-Ile134],[Arg32-Ile134] и [Gly33-Ile134] усечнные GDNFбелки, как изображено на фиг. 5, 6 и 7 соответственно. Полинуклеотиды, кодирующие эти иллюстрированные примеры усечнных GDNFбелков, были построены так, как изображено на фиг. 5, 6 и 7, но также можно использовать такие полинуклеотиды, как изображенные на фиг. 1, 3 и 4. Полинуклеотиды конструировали стандартными PCR-методами, как описано в PCRDNA), которое приведено здесь в качестве ссылки. 52 Пример 4. Биоанализ на дофаминэргическую нейронную нейротрофическую активность. Е. соli-экспрессируемые[Arg -Ile ], [Gly -Ile ] и [Lys -Ile134] усечнные GDNF-белки по примеру 3 и полученный из СНО [Arg32-Ile134] усечнный GDNF по примеру 1 оценивались качественно по их способности стимулировать усвоение (поглощение) дофамина черным веществом дофаминэргических нейронов. Материалы. Следующие материалы использовали при анализе оценки выживаемости дофаминэргических нейронов в присутствии усечнных GDNFбелков: Клеточная культуральная среда. Модифицированная по Дульбекко среда Игла с высоким содержанием глюкозы (DMEM;в каталоге 11965-092), Среда Хэма (Ham,F12;11765-012), Среда Лейбовица L-15 без карбонатa натрия ( 41300-039), добавка к среде В 27( 17504-010),пенициллин/ стрептомицин ( 15070-014), L-глутамин ( 25030-016), физиологический раствор, буферизованный фосфатом Дульбекко (D-PBS;14190-052), сбалансированный солевой раствор Хэнка (Hank) с солями кальция и магния (HBSS;24020-026), N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'2-этансульфоновая кислота (HEPES;15630015), мышиный ламинин ( 23017-015) и альбумин бычьей сыворотки фракция V ( 110-18017) все от GIBCO, Grand Island, NY. Термоинактивированная лошадиная сыворотка от HyClone, Logan, Utah. Conalbumin (C-7786), полиL-орнитингидробромид (Р-3655), бычий инсулин (1-5500), человеческий трансферрин (Т 2252), путресцин (Р-6024), прогестерон (Р 6149), селенит натрия (S-9133), метризамид (М 3383) поставлены Sigma Chemical Company,Saint-Louis, МО. Папаин, дезоксирибонуклеаза IFalcon ( 3072), пластмассовая посуда для тканевых культур и полипропиленовые пробирки для центрифуги поставлены Becton-Dickinson,Oxnard, CA. Nunc Lab-Tek покровные стекла для камер для тканевых культур (культуральных камер) ( 136439) были от Baxter, Irvine, CA; 20 м ( 460) нейлоновые сита от Tetko, Elmsford,NY; и 4" препаровальные пинцеты и 4" анатомические ножницы были от Roboz Surgical,Washington, DC. Антитела и сопутствующие реагенты. Поликлональные кроличьи антитела, специфичные к антитирозингидроксилазе (ТЕ 101) были от Eugene Tech, Ridgefield Park, NJ; поликлональные кроличьи антитела, специфичные к антинейронспецифичной енолазе (NSE, AB951) были от Chemicon, Temecula, CA; и биотинили 53 рованный козий антикроличий IgG и пероксидаза, конъюгированная с комплексом авидин/биотин (АВС Elite; набор Vectastain PK6100) были от Vector Laboratories, Burlingame,CA. 3,3'-диаминобензидин был от Cappel Laboratories, West Chester, PA. Superblockблокирующий буфер - в PBS ( 37515) - был отSigma. Ингибитор поглощения дофамина GBR12909 (D-052) от RBI, Natick, NA. 3H-дoфаминSupermix сцинтилляционный коктейль от Wallac, Turku, Finland. Белые микропланшетыCorporation, Meriden, СТ. Все другие реагенты получены от Sigma Chemical Company, если не указано иначе. Приготовление питательной среды. Основную питательную среду готовили в виде смеси 1:1 DMEM и среды F12 и дополняли добавкой В 27, добавляемой в виде исходного раствора 50-кратной концентрации. L-глутамин добавляли до конечной концентрации около 2 мМ, пенициллин около 100 мед/л и стрептомицин около 100 мг/л. Термоинактивированную лошадиную сыворотку добавляли до конечной концентрации около 15%. После смешения рН доводили примерно до 7,3 и питательную среду хранили при 4 С. Свежую среду готовили непосредственно перед употреблением, чтобы свести к минимуму межэкспериментальные расхождения. Для уменьшения до минимума адсорбции белка применяли пластиковые пипетки и контейнеры. Подложка для культивирования. Чтобы способствовать оптимальному связыванию образовавшегося субстрата нейронов и нейритов, поверхности микропланшетов (подложка для культивирования) модифицировали,последовательно покрывая пленкой поли-Lорнитина и ламинина следующим образом. Поверхности планшетов целиком покрывали стерильным раствором поли-L-орнитина с концентрацией 0,1 мг/мл в 0,1 М борной кислоте (рН 8,4) в течение, по меньшей мере, одного часа при комнатной температуре с последующим стерильным промыванием водой Super-Q. Промывную воду отсасывали, добавляли раствор мышиного ламинина в PBS с концентрацией 1,0 мкг/мл и термостатировали при 37 С в течение двух часов. Эти процедуры проводили непосредственно перед применением микропланшетов, чтобы быть уверенным в воспроизводимости результатов. Приготовление эмбриональных культур черного вещества крысы. В качестве источника дофаминэргических нейронов черного вещества использовали мозг эмбрионов крыс. Использовали крыс Sprague 001204Dawley в определенный момент беременности при возрасте эмбриона 15 дней. В эксперименте участвовало максимум 36 зародышей (около трх пометов). Беременных крыс убивали, экспонируя с СО 2, их брюшную полость вскрывали анатомическими ножницами и зародыши извлекали из матки. Мозг зародыша вскрывали, очищали от крови и оболочек и, используя хорошо известные анатомические ориентиры, рассекали вентральный оболочечный участок, содержащий чрное вещество (Altman and Bayer, Atlas ofRaton, FL, 1995). Ткани собирали в охлажденный льдом D-PBS, переносили в 10 миллилитров среды для диссоциации (120 единиц папаина и 2000 единиц ДНК-азы в HBSS) и затем термостатировали в течение 45 мин примерно при 37 С на роторной качалке, примерно при 200 rpm (об/мин). Клетки затем диспергировали,растирая оплавленными на огне пастеровскими пипетками, просеивали через 2 мкм сито Nitex,отделяя недиссоциированные ткани и центрифугировали в течение пяти минут при 200xg на медицинской центрифуге IEC. Образовавшийся клеточный осадок снова суспендировали вHBSS, содержащем овальбумин и около 500 единиц ДНК-азы, находящегося в виде слоя на поверхности 4% раствора овальбумина (вHBSS), и центрифугировали в течение 10 мин при 500xg. Конечный осадок снова суспендировали в питательной культуральной среде полного состава (см. выше), доводили примерно до 28000 клеток/мл и засевали в виде аликвот (90 мкл) в 6 миллиметровые лунки 96-луночных планшетов, предварительно покрытых плнкой полиорнитина и ламинина. Прикрепление клеток происходило быстро, и эффективность засевания составляла примерно 75%. Иммуногистохимия дофаминэргических нейронов. Был применен непрямой иммунопероксидазный способ, описанный Louis et al. (J. Pharmacol. Exp. Therap., 262:1274-1283, 1992; Science, 259:689-692, 1993) с небольшими изменениями, представленными ниже, для того, чтобы охарактеризовать дофаминэргические нейроны в культурах чрного вещества. Культуры фиксировали около 30 мин при комнатной температуре с 4% параформальдегида в D-PBS, рН 7,4 с последующим трхкратным промыванием в DPBS (200 мкл на 6 миллиметровую лунку). Фиксированные культуры затем термостатировали вSuperblock-блокирующем буфере в PBS, содержащем 1% NP-40 для повышения проникающей способности антител. Затем вводили первичные кроличьи антитела, специфичные к антитирозингидроксилазе в разведении примерно 1:2000 в том же буфере и термостатировали в течение одного часа при 37 С на роторной качалке. После трх промываний D-PBS связанные антитела определяли, применяя козий-антикроличий биотинилированный IgG в разведении примерно 55 1:500; эти вторичные антитела термостатировали с клетками в течение примерно одного часа при 37 С. Затем клетки промывали трижды DPBS и вторичные тела определяли комплексом авидин-биотин-пероксидаза,разбавленным 1:500, и клетки термостатировали в течение примерно 45 мин при 37 С. После еще трех промываний D-PBS культуры реагировали в течение 5-20 мин в растворе 0,1 М Tris-HCl, рН 7,4, содержащем 0,04% 3,3'-диаминобензидин(НСl)4, 0,06% NiCl2 и 0,02% перекиси водорода. Определение выживаемости нейронов. Культуры черного вещества фиксировали и окрашивали с использованием иммунной метки, как описано выше, а затем исследовали с помощью просветлнной оптики при 200 х увеличении. Число нейронов, окрашенных тирозингидроксилазой, считали во всех 6 миллиметровых лунках 96-луночных планшетов. Жизнеспособные нейроны характеризовались, как имеющие правильной формы клеточное тельце с главным аксоноподобным отростком и несколькими дендритоподобными отростками. Нейроны, проявляющие признаки вырождения,такие как неправильные перикарионы с вакуолями или (разорванные) фрагментированные нейриты, не учитывались (большинство вырожденных нейронов, однако, отделялись от подложки для культивирования). Число дофаминэргических нейронов выражали либо в виде ТНположительных нейронов/6 мм-вая лунка или в виде отношения плотности дофаминэргических нейронов с измененной четвертичной структурой к плотности контрольных дофаминэргических нейронов. Определение поглощения дофамина. Поглощение дофамина определяли в культурах чрного вещества 15-дневных эмбрионов крыс, которые помещались в белых микропланшетах ViewPlate-96. Культуры промывали предварительно нагретым буфером для поглощения (около 100 мкл), который состоит из модифицированного раствора Кребса-Рингера, рН 7,4, содержащего около 120 мМ NaCl, 4,7 мМ КСl, 1,8 мМ CaCl2, 1,2 мМ MgSO4, 32 мМ NaHPO4, 1,3 мМ EDTA и 5,6 мМ D-глюкозы. Буфер для поглощения также содержал 1 мМ аскорбиновой кислоты и 5 мкМ паргилина для предотвращения окисления дофамина. Клетки предварительно термостатировали при 37 С в течение 10 мин в буфере для поглощения. Затем добавляли тритированный дофамин (3H-DA, 21Ci/ммол) к культурам чрного вещества при концентрации примерно 50 нм в 75 мл буфера для поглощения, и культуры термостатировали в течение примерно 60 мин при 37 С. Неспецифическое поглощение дофамина определяли,термостатируя культуры с буфером для поглощения, содержащим ингибитор поглощения дофамина GBR-12909 (1 мкМ). Неспецифическое поглощение составляло примерно менее одного процента общего поглощения. Опреде 001204 56 ление поглощения прекращали отсасыванием термостатируемой среды с последующими тремя быстрыми промываниями ледяным буфером для поглощения (около 120 мкл). Затем клетки лизировали, добавляя Optiphase Supermix сцинтилляционный коктейль (200 мкл), и определяли радиоактивность сцинтилляционной спектрометрией, используя счтчик Wallac для MicrobetaPlus 96-луночного планшета (т.е. поглощение дофамина, считая сцинтилляции трития,оставшегося в культурах). Результаты выражали либо в виде dpm/6 мм-вая лунка, или в виде отношения культур с изменением скручивания к контрольным культурам. Анализы. Выживаемость (жизнеспособность) и морфологическое развитие дофаминэргических нейронов Культуры чрного вещества эмбрионов крыс на 15 день развития (Е 15), обогащнные дофаминэргическими нейронами, применяли для демонстрации действия усечнных GDNFбелков на жизнеспособность дофаминэргических нейронов. Культуры выращивали в 96 луночных планшетах с покрытием из полиорнитина и ламинина до шести дней в отсутствие или в присутствии различных концентраций (в интервале от примерно 1 нг/мл до примерно 10 нг/мл) следующих белков: Е. coli-экспрессированный зрелый hGDNF; Е. соli-экспрессированные [Рго 23-Ilе 134], [Arg32-Ile134], [Gly33-Ile134] и[Arg32-Ile134] усечнный GDNF-белок из СНОклеток. Культуральная среда состояла изDMEM/F12, дополненных 15% термоинактивированной лошадиной сывороткой (Е 15 культуры) или 2,5% термоинактивированной лошадиной сывороткой, D-глюкозой, HEPES, инсулином и трансферрином (Р 6 культуры). В качестве маркера для дофаминэргических нейронов использовали иммунологическое окрашивание тирозингидроксилазой(ТН),скоростьлимитирующий фермент при биосинтезе дофамина. Так как норадренэргические нейроны первичного заднего мозга (третьего мозгового пузыря) также окрашиваются ТН (ТНпозитивные), были предприняты большие предосторожности, чтобы вскрыть (рассечь) область, ограниченную вентральной оболочкой среднего мозгового пузыря и чтобы избежать нижних участков, содержащих тельца норадренэргических клеток. Через шесть дней Е 15 культуры обычно содержали около 70% нейронов, как определено специфическим иммунологическим окрашиванием нейронов енолазой(которые на вид были уплощнные, темнофазные); дофаминэргические нейроны составляли около 10-15% популяции нейронов. Через шесть дней культуры фиксировали формальдегидом и окрашивали иммунологически тирозингидроксилазой, маркером, который 57 идентифицирует дофаминэргические нейроны в этих культурах. Все тирозин-гидроксилазпозитивные нейроны, присутствующие в 6 ммвой лунке, считали с помощью просветленной оптики. Для каждых экспериментальных условий анализировали от трх до шести различных 6 миллиметровых лунок. Результаты выражали в процентах от числа тирозин-гидроксилазпозитивных нейронов в контрольных культурах. Культуры E15 чрного вещества обрабатывали 1,0 нг/мл GDNF, GDNF, экспрессируемого клетками СНО или Е. coli, содержащим примерно на 38% и 27% больше ТН-иммунореактивных нейронов соответственно, чем непрореагировавшие контрольные культуры; это указывает, что оба вида GDNF стимулируют выживание дофаминэргических нейронов. Культуры Е 15 чрного вещества, обработанного усечнным GDNF-белком с концентрацией 1,0 нг/мл,показали подобное увеличение числа ТНпозитивных нейронов в культурах через шесть дней in vitro: 42% для [Arg32-Ile134] усечнныйGDNF-белка из СНО-клеток; и 26% и 17% для Е. соli-экспрессируемого [Arg32-Ile134] и [Gly33Ile134] усечнных GDNF-белков соответственно. Сравнения контрольных культур и культур, обработанных зрелым и усечннымиGDNF-белками, также показали явное влияние всех GDNF-белков на морфологическую дифференцировку дофаминэргических нейронов. Действие [Arg32-Ile134] и [Gly33-Ile134] усечнныхGDNF-белков было идентично действию соответствующих аналогов зрелого GDNF-белка. ТН-иммунореактивные нейроны во всех GDNFобработанных культурах имели значительно более сложную и обширную аксонную арборизацию, так же как более высокую степень разветвления аксонов и больший общий размер тела, чем проявляют ТН-позитивные нейроны в контрольных культурах. Поглощение дофамина. Поглощение дофамина измеряет число и активность сайтов транспорта с высоким сродством к повторному поглощению дофамина и отражает функциональную дифференцировку дофаминэргических нейронов. Поглощение дофамина измеряли в культурах Е 15 чрного вещества крыс через шесть дней in vitro с или без зрелого GDNF или усечнных GDNF-белков. В этих культурах поглощение дофамина имело характеристику фармакологического профиля дофаминэргических нейронов, т.е. оно было почти полностью блокировано (более чем на 98%) 1,0 мкМ GBR-12909 ингибитором транспорта дофамина, специфичным к дофаминэргическим нейронам (ID50 = 20 нМ). Это указывает на то, что измерения поглощения дофамина не отражают наличия примесей норадренэргических нейронов, которые могут поглощать дофамин с помощью переносчиков норапинэфрина,но не чувствительны к 58 прессируемого клетками СНО и [Arg32-Ile134] усечнного GDNF-белка из СНО было идентичным: увеличение примерно 65% с ED50 с концентрацией около 20 пг/мл. Е. соliэкспрессируемый [Pro23-Lys37Asn37-Ile134] усечнный GDNF-белок, как изображено на фиг. 5,показал увеличение 65% с ED50 около 40 пг/мл. Действие на поглощение дофамина Е. соliэкспрессируемого зрелого белка и Е. сoliэкспрессируемых [Arg32-Ile134], [Gly33-Ile134] иGDNF-белки ведут себя как потенциальные стимулирующие выживаемость и индуцирующие дифференцировку факторы в отношении дофаминэргических нейронов чрного вещества. В таком качестве они особенно полезны для лечения болезни Паркинсона и неврологического расстройства, характеризуемого пониженной остротой эмоций, замедленностью как произвольных, так и непроизвольных движений мышц, мышечной ригидностью и тремором. Такие симптомы относятся к прогрессирующему вырождению дофамин-продуцирующих нейронов, расположенных в чрном веществе. Вырождение этих нейронов ("дофаминэргических нейронов") приводит к уменьшению дофамина в прилегающей области мозга, называемой полосатым телом. Список последовательностей
МПК / Метки
МПК: C07K 14/00, A61P 25/00, A61K 38/00
Метки: нейротрофический, кодирующая, получения, указанную, вектор, фактор, клеточной, днк, указанный, фактора, усеченный, содержащий, способ, глиальной, композиция, линии, фармацевтическая, лечения
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-1204-usechennyjj-nejjrotroficheskijj-faktor-glialnojj-kletochnojj-linii-dnk-kodiruyushhaya-ukazannyjj-faktor-vektor-soderzhashhijj-ukazannuyu-dnk-sposob-polucheniya-faktora-farmacevtich.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Усеченный нейротрофический фактор глиальной клеточной линии, днк, кодирующая указанный фактор, вектор, содержащий указанную днк, способ получения фактора, фармацевтическая композиция и способ лечения</a>
Производные пиридо[2,3-d]пиримидина и их фармацевтически приемлемые соли, фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующей протеин-тирозин-киназу активностью, способ лечения заболеваний, опосредованных клеточной пролиферацией, и способ лечения рака, атеросклероза, псориаза или рестеноза
Номер патента: 897
Опубликовано: 26.06.2000
Авторы: Клачко Сильвестер, Доэрти Эннет Мэриэн, Босчелли Дайянэ Хэррис, Блэнкли Клифтон Джон, Пэнек Роберт, Хэмби Джэймс Марино
МПК: A61K 31/519, C07D 471/04, A61P 35/00...
Метки: лечения, протеин-тирозин-киназу, обладающая, фармацевтическая, клеточной, пролиферацией, ингибирующей, псориаза, производные, опосредованных, активностью, заболеваний, приемлемые, рестеноза, рака, способ, композиция, атеросклероза, пиридо[2,3-d]пиримидина, соли, фармацевтически
Формула / Реферат:
1. Производные пиридо[2,3-d]пиримидина общей формулы (I) где X означает иминогруппу, N-ацил, кислород или серу; R1 означает группы NR3R4S(O)mR3, где m является 0,1 или 2, или ОR3; R2, R3 и R4 независимо означают водород, группу (СН2)nPh, где Ph является фенилом, не замещенным или замещенным 1-3 остатками из группы, включающей галоген, гидроксил, карбоксил, алкил с 1-6 атомами углерода, не замещенный или замещенный гидроксилом,...
Cпособ получения фактора ix из биологических источников и фактор ix, полученный этим способом
Номер патента: 222
Опубликовано: 24.12.1998
Авторы: Хоффер Лутц, Морфельд Франк, Йосич Дьюро
Метки: способом, этим, фактор, полученный, источников, получения, cпособ, биологических, фактора
Формула / Реферат:
1. Способ получения фактора IX из биологических источников с помощью хроматографии, отличающийся тем, что перед разделением с помощью аффинной хроматографии указанный источник обрабатывается сульфатом аммония в концентрации от 1,5-2,3 моль/л. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанным биологическим источником является плазма крови или плазма, истощенная по фактору VIII и фибриногену путем отделения криопреципитата (криообедненная...
Производные индолилпирролиденметилпиррола, способ их получения, фармацевтическая композиция и комбинированный препарат на их основе, способ лечения с их использованием и промежуточный продукт для их получения
Номер патента: 1055
Опубликовано: 28.08.2000
Авторы: Д`алессио Роберто, Тиболла Марчеллино, Барджотти Альберто, Колотта Франческо, Феррари Марио, Изетта Анна Мария
МПК: C07F 5/02, C07D 403/14
Метки: фармацевтическая, комбинированный, лечения, способ, получения, индолилпирролиденметилпиррола, композиция, производные, использованием, промежуточный, препарат, основе, продукт
Формула / Реферат:
1. Производные (1Н-индол-2-ил)-5-[(2Н-пиррол-2-илиден)метил]-1H-пиррола формулы (I) где каждый из R1, R2, R3 и R4, которые являются одинаковыми или разными, представляет независимо водород, (C1-C6)-алкил, галоген, циано, нитро, гидрокси, (C1-C6)-алкокси, незамещенный или замещенный фенилом, (C1-C6)-алкилкарбонилокси, -NRaRb, в котором каждый из Ra и Rb независимо представляет водород или (C1-C6)-алкил, (C1-С6)-алкилкарбониламино, карбокси,...
Белок, соответствующий зрелому участку морфогенетического белка кости мр-52, фармацевтическая композиция для лечения заболеваний и дефектов хрящей и костей и способ получения белка
Номер патента: 582
Опубликовано: 29.12.1999
Авторы: Сатох Есике, Кацуура Миеко, Макисима Фусао, Каваи Синдзи, Еномото Коити, Такамацу Хироюки, Мики Хидео, Кимура Митио, Мацумото Томоаки
МПК: A61K 38/17, C12N 15/12, C07K 14/51...
Метки: заболеваний, дефектов, способ, соответствующий, кости, белка, участку, зрелому, фармацевтическая, белок, мр-52, костей, хрящей, получения, лечения, морфогенетического, композиция
Формула / Реферат:
1. Белок, соответствующий зрелому участку морфогенетического белка кости МР-52, имеющий следующую структуру: Рго-Leu-Ala-Thr- ... (SEQ ID NO 1). 2. Белок, охарактеризованный в п.1, в гомодимерной форме. 3. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний и дефектов хрящей и костей, содержащая терапевтически эффективное количество очищенного белка по п.2 формулы и фармацевтически приемлемый носитель. 4. Фармацевтическая композиция по п.3,...
Применение олигосахарида и аспирина для лечения тромбоэболических заболеваний, фармацевтическая композиция, способ лечения
Номер патента: 48
Опубликовано: 30.04.1998
Авторы: Стикема Якобус, Кариу Роже
МПК: A61K 31/725
Метки: тромбоэболических, композиция, олигосахарида, аспирина, способ, заболеваний, фармацевтическая, применение, лечения
Формула / Реферат:
1. Применение синтетического олигосахарида, который представляет собой селективный ингибитор фактора Ха, действующий через антитромбин III, в комбинации с аспирином для получения лекарственных средств, предназначенных для предупреждения или лечения тромбоэмболических заболеваний, имеющих место у млекопитающего, подвергающегося чрезкожной внутрипросветной ангиопластике. 2. Применение по п.1, отличающееся тем, что олигосахарид представляет собой...
Предыдущий патент: Замещенные имидазолы, обладающие антиканцерогенной и цитокин-ингибирующей активностью
Следующий патент: Новые фенантридины.
Случайный патент: способ лечения удара, включающий введение человеку активатора плазминогена альфа 1 из desmodus rotundus