Cпособ получения фактора ix из биологических источников и фактор ix, полученный этим способом

1 Данное изобретение относится к способу получения фактора IX из биологических источников с помощью хроматографии, а также к фактору IX, получаемому способом согласно изобретению. Когда фактор IX получают, например, из плазмы крови, сначала отделяется криопреципитат. Замороженный цитрат плазмы оттаивают и основную часть фактора VIII и фибриногена отделяют центрифугированием. Полученная таким образом криообедненная плазма содержит зависимые от витамина К факторы коагуляции с активностью порядка 0,01 IU/мг белка. Согласно способу из известного уровня техники, зависимые от витамина К факторы коагуляции связываются при экстракции с анионообменниками, например ДЭАЭ Сефадексом без нежелательных примесей альбумина. Однако вследствие плохой текучести ДЭАЭ Сефадекса, этот этап обычно приходится выполнять в периодическом режиме твердофазной экстракции. Фракции, получаемые после элюции из ДЭАЭ Сефадекса, затем служат в качестве исходного материала для очистки фактора IX. Однако эти фракции обогащены также протеазами, содержащимися в плазме, что приводит к потерям выделяемого материала - фактора IX,вследствие его протеолитического расщепления,и увеличению риска, связанного с тромбогенностью препарата. Целью изобретения является разработка способа, который позволяет уменьшить указанные недостатки без применения ингибиторов протеаз. Эта цель достигается способом, заключающимся в обработке биологического источника, содержащего фактор IX, веществом, осаждающим белок. Возможными биологическими источниками являются, в частности, плазма крови или криопреципитат, истощенный по фактору VIII и фибриногену (криообедненная плазма). Концентрация вещества, осаждающего белок, обычно составляет от 1,5 до 2,3 мол/л,предпочтительно от 1,75 до 1,9 мол/л. Эти величины относятся к концентрациям вещества,осаждающего белок, присутствующего в источниках, содержащих фактор IX (конечная концентрация). В качестве вещества, осаждающего белок,в частности, рассматривается сульфат аммония. Способ согласно данному изобретению уменьшает протеолитическую активность, по крайней мере, на порядок. Кроме того, мешающие компоненты, такие как фактор VII и факторII, удаляются на стадии осаждения перед фактической хроматографической очисткой фактораIX. Удаляются также белки С и S. Достигается почти полное удаление фактора VII. Достаточно полно удаляется фактор II (70-90%), тогда как белки С и S удаляются приблизительно на 50%. В супернатанте фракции, обработанной веществом, осаждающим белок, типичная ак 000222IU/мл, что соответствует удельной активности 1-5 IU/мг. После стадии осаждения согласно изобретению, в которой предпочтительно используется сульфат аммония, следует хроматографическое отделение фракции, обогащенной фактором IX. Это имеет преимущество, что при высокой концентрации соли белки могут подвергаться гидрофобным взаимодействиям в разной степени. Согласно изобретению в присутствии относительно высоких концентраций соли, образующихся при осаждении белка, фактор IX предпочтительно связывается с хроматографическим материалом, который может быть использован для хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC). В то же время это уменьшает высокую концентрацию соли, образующуюся при осаждении белка. В частности, может быть использован хроматографический материал, который имеет связанный с материалом субстрата гидрофильный гибкий фиксатор (щупальца). В этом случае с этими спейсерами ковалентно связываются соответствующие лиганды, в частности гидрофобные лиганды, такие как группы пропила, бутила, фенила. Супернатант фракции, обработанный веществом, осаждающим белок, наносится на соответствующий хроматографический материал и, при необходимости, промывается. Элюция фактора IX, связанного с колонкой и пока еще содержащего фактор X, может быть выполнена с помощью буфера, содержащего осаждающее белок вещество в малой концентрации, при этом ионная сила элюирующего раствора должна быть понижена по сравнению с ионной силой раствора для нанесения образца. Фракцию,включающую фактор IX, элюируемый из хроматографической колонки, которая содержит материал HIC, собирают и подвергают последующим этапам обессоливания с использованием соответствующих способов. Например, это можно осуществить с помощью ультрафильтрации и/или диафильтрации. Дальнейшее отделение фактора IX, например от примеси фактора X, выполняется в предпочтительном варианте настоящего изобретения с помощью аффинной хроматографии на субстрате, модифицированном гепарином. Когда ионная сила раствора, содержащего эти факторы, относительно мала, последний из названных будет связываться с хроматографическим материалом. Элюция мешающего фактора X, если он есть, достигается путем обработки раствором,содержащим хлористый натрий в концентрации от 150 до 300 ммол/л. При таких условиях фактор IX будет оставаться связанным с субстратом, обладающим сродством к гепарину. При увеличении ионной силы водного раствора приблизительно в два раза относительно указанной величины, фактор IX начинает отделяться от поверхности аффинного субстрата. 3 Инактивацию вируса можно выполнить с помощью химических и/или физических процессов. Физический метод инактивации вируса состоит, в основном, в тепловой обработке соответствующей фракции при 60-65 С в течение 5-30 ч. Такую тепловую обработку можно выполнить, в частности, после гепаринаффинной хроматографии. Химическая инактивация вируса состоит, например, в обработке фракции, содержащей фактор IX, неионными поверхностноактивными веществами и диалкил- или триалкилфосфатами. В частности, могут быть использованы комбинации Твина и три-nбутилфосфата (ТNВР). Методы инактивации вируса описаны в ЕР 0131740 или в Horowitz etal., Blood, 79 (1992) 826. Методы инактивации вируса могут быть комбинированными, так как описано в WО 94/17834. Предпочтительно химическая инактивация вируса выполняется после ультрафильтрации/диафильтрации с последующей гидрофобной хроматографией. При использовании способа согласно изобретению суммарный выход высокоочищенного фактора IX может быть увеличен до 20-30% относительно его содержания в плазме. На схеме изображен способ согласно изобретению с последовательными этапами хроматографической очистки в виде схемы производственного процесса. Стрелками показано, какие фракции отделяются и какие остаются в соответствующих элюатах и супернатантах. Нижеследующий пример иллюстрирует это изобретение. Замороженную плазму с добавкой цитрата оттаивают и перемешивают при 0-3 С. ФакторVIII и фибриноген отделяют с помощью центрифугирования. Полученная криообедненная фракция плазмы содержит зависящие от витамина К факторы коагуляции с удельной активностью около 0,01 IU/мг белка. Следующий этап захвата включает твердофазную экстракцию или хроматографию на ДЭАЭ ионообменниках, отделение IgG и альбумина. Зависимые от витамина К факторы коагуляции присутствуют с активностью от 10 до 50 IU/мл, что соответствует степени обогащения около 3500 по фактору IX. За этапом захвата следует фактическая очистка. К фракции, полученной на этапе захвата, добавляется раствор сульфата аммония из расчета получения конечной концентрации около 1/9 мол/л. Белки С и S удаляются на 50%,тогда как фактор II удаляется на 70-90%, и фактор VII удаляется почти полностью. Супернатант, полученный после осаждения сульфатом аммония, подвергают хроматографии гидрофобного взаимодействия на соответствующим образом модифицированном геле с щупальцами. Концентрация сульфата аммония в растворе для нанесения образца составляет около 1,75 мол/л. Буфер для нанесения образца содержит также 4 ионы фосфата. Хроматография с гидрофробным взаимодействием приводит к связыванию остатка фактора VII и фактора IX. Фактор Х связывается с материалом на 70-80%. Элюцию смеси фактора IX/фактора Х выполняют раствором сульфата аммония, содержащим от 1,2 до 1,4 мол/л. Элюент не содержит фактор VII и не имеет существенную протеолитическую активность. Удельная активность фактора IX в смеси фактор IX/фактор Х составляет от 5 до 15 IU/мг белка. Сульфат аммония, присутствующий в элюате, удаляют путем ультрафильтрации и диафильтрации. Инактивацию вируса с помощью детергентов выполняют путем обработки в 1% Твин 80/0,3 % TNBP. Затем, после отделения детергента, полученную фракцию подвергают гепаринаффинной хроматографии. Факторы Х и IX связываются с гепариновым гелем при низких осмолярностях. Фактор Х получают с помощью промывки буфером, содержащим 0,25 мол/лNaCl. Фактор IX элюируют при повышении концентрации хлористого натрия до 0,45 мол/л. После этого фактор IX присутствует в элюате при 30-50 IU/мл с удельной активностью 100. Полученную таким образом фракцию, содержащую фактор IX, обессоливают и лиофилизуют. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения фактора IX из биологических источников с помощью хроматографии, отличающийся тем, что перед разделением с помощью аффинной хроматографии указанный источник обрабатывается сульфатом аммония в концентрации от 1,5-2,3 моль/л. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанным биологическим источником является плазма крови или плазма, истощенная по фактору VIII и фибриногену путем отделения криопреципитата (криообедненная плазма). 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем,что после осаждения белка осуществляют удаление сульфата аммония и обогащение фактораIX путем адсорбции фактора IX на хроматографическом материале, который может быть использован для хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC). 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанный хроматографический материал,имеющий адсорбированный фактор IX, обрабатывается водным раствором, имеющим ионную силу, приводящую к отделению фактора IX от указанного материала для HIC. 5. Способ по пп.3 и/или 4, отличающийся тем, что фракции, полученные после отделения фактора IX от указанного материала, подвергают этапу, в котором уменьшается концентрация соли раствора, содержащего фактор IX, напри 5 мер, с помощью ультрафильтрации/диафильтрации. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что далее проводят аффинную хроматографию на материале субстрата, модифицированном гепарином. 7. Способ по одному из пп. с 1 по 6, отличающийся тем, что осуществляют инактивацию вируса с помощью химических и/или физических способов. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что физическая инакитвация вируса включает тепловую обработку при 60-65 С в течение 5-30 ч,в частности, после аффинной хроматографии на гепарине согласно п.6. 6 9. Способ согласно п.7, отличающийся тем, что химическая инактивация вируса включает обработку образца, содержащего факторIX, неионными детергентами/диалкилированными или триалкилированными фосфатами. 10. Фактор IX, полученный способом, по крайней мере, по одному из пп.1-9. Евразийский патент действует на территории всех Договаривающихся государств, кроме