способ лечения удара, включающий введение человеку активатора плазминогена альфа 1 из desmodus rotundus

СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ УДАРА, ВКЛЮЧАЮЩИЙ ВВЕДЕНИЕ ЧЕЛОВЕКУ АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА 1 ИЗ DESMODUS ROTUNDUS Изобретение относится к способу лечения удара, включающему введение человеку активатора плазминогена 1 из Desmodus rotundus (DSPA).(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ПАЙОН ДОЙЧЛАНД ГМБХ (DE) 013837 Изобретение относится к внутривенному применению не обладающих нейротоксичностью активаторов плазминогена, в частности генетически модифицированных активаторов плазминогена и активаторов плазминогена из слюны Desmodus rotundus (DSPA) для лечения удара у людей. Лечение удара данными активаторами плазминогена известно из заявки на выдачу международного патента РСТ/ЕР 02/12204, описание которой полностью принято в качестве ссылки. Клиническая характеристика и биохимия инсульта Различные клинические картины суммированы под термином "удар", что соответствует их клиническим симптомам. Согласно относительному патогенезу возможно первое разделение этих клинических картин на так называемые ишемические и геморрагические инсульты. Ишемические инсульты (ишемия) характеризуются снижением или прерыванием циркуляции крови в головном мозге вследствие недостатка подачи артериальной крови. Часто это вызвано тромбозом атеросклеротического стенозированного сосуда или артериоартериальным, соответственно сердечным эмболизмом. Геморрагические инсульты, среди прочего, основаны на перфорации снабжающих мозг артерий,поврежденных артериальной гипертонией. Однако только примерно 20% всех церебральных инсультов вызваны геморрагическими инсультами. Так, инсульт вследствие тромбоза является намного больше относящимся к проблеме. По сравнению с ишемией других тканей ишемия нервной ткани часто сопровождается некрозом клеток, на которые она воздействует. Более высокая частота встречаемости некроза нервной ткани может объясняться новым пониманием феномена "эксайтотоксичности", который представляет собой каскад,включающий в себя много стадий взаимодействия. Каскад инициируется ишемическими нейронами, на которые воздействует недостаток кислорода, и они затем незамедлительно теряют АТФ и деполяризуются. Это приводит к повышенному постсинаптическому высвобождению нейротрансмиттера глутамата,который активирует мембраносвязанные рецепторы глутамата, регулирующие катионные каналы. Однако вследствие повышенного высвобождения глутамата рецепторы глутамата становятся избыточно активированными. Рецепторы глутамата регулируют зависимые от напряжения катионные каналы, которые открываются при связывании глутамата с рецептором. Это приводит к массивному току Na+ и Са 2+ внутрь клетки, что нарушает Са 2+-зависимый клеточный метаболизм. В особенности активация Са 2+-зависимых ферментов катаболизма может стать причиной последующей клеточной гибели (Lee, Jin-Mo et al., "Thechanging landscape of ischaemic brain injury mechanisms"; Dennis W. Zhol "Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system"). Хотя механизм опосредованной глутаматом нейротоксичности пока не полностью понят, имеется общее мнение, что он вносит большой вклад в клеточную гибель нейронов после ишемии (Jin-Mo Lee, et al.). Лечение инсульта Кроме сохранения жизненных функций и стабилизации физиологических параметров первоочередным при лечении острой церебральной ишемии является возвращение открытого состояния закрытого сосуда. Повторное открытие может проводиться разными способами. Сугубо механическое повторное открытие, такое как, например, РТСА после сердечного приступа, пока еще не дало удовлетворительных результатов. Приемлемое улучшение физического состояния пациентов может достигаться только при успешном фибринолизе. Оно может осуществляться за счет местного применения с использованием катетера (PROCAT, исследование с проурокиназой). Однако несмотря на первые положительные результаты, данный способ официально еще не одобрен в качестве фармацевтического лечения. Происходящий в природе фибринолиз основан на протеолитической активности сериновой протеазы плазмина, который происходит из своего неактивного предшественника за счет катализа (активации). Природная активация плазминогена катализируется активаторами плазминогена u-РА (активатор плазминогена урокиназного типа) и t-PA (тканевой активатор плазминогена), присутствующих в организме в природе. В отличие от u-PA, t-PA образует так называемый активаторный комплекс вместе с фибрином и плазминогеном. Таким образом, каталитическая активность t-PA является фибринозависимой и усилена в его присутствии примерно в 550 раз. Кроме фибрина также фибриноген может стимулировать опосредованный t-PA катализ плазминогена до плазмин, хотя в меньшей степени. В присутствии фибриногена активность t-PA возрастает только в 25 раз. Также t-PA стимулируют продукты расщепления фибриномa) Стрептокиназа. Ранние попытки тромболитического лечения острого инфаркта уходят в 1950-е годы. Первые интенсивные клинические испытания стрептокиназы, фибринолитического средства из -гемолитического стрептококка, начались только в 1995 г. Вместе с плазминогеном стрептокиназа образует комплекс, который катализирует другие молекулы плазминогена в плазмин. Лечение стрептокиназой имеет серьезные недостатки, поскольку она является бактериальной протеазой и поэтому может провоцировать в организме аллергические реакции. Более того, вследствие предшествующей стрептококковой инфекции, включающей в себя продукцию антител, пациент может-1 013837 характеризоваться так называемой стрептокиназной устойчивостью, что затрудняет лечение. Кроме этого, клинические испытания в Европе (мультицентровое клиническое испытание острого инсульта в Европе (MAST-E), мультицентровое клиническое испытание острого инсульта в Италии (MAST-I и Австралии (австралийское испытание стрептокиназы (AST указывает на повышенный риск смертности и более высокий риск интрацеребрального кровотечения (интрацеребральная геморрагия, ИЦГ) после лечения пациентов стрептокиназой. Данные испытания скоро должны закончиться.b) Урокиназа. Альтернативно может применяться урокиназа - также классическое фибринолитическое средство. В отличие от стрептокиназы она не проявляет антигенных характеристик, поскольку является ферментом,встречающимся в тканях человеческого организма в природе. Она является активатором плазминогена и не зависит от кофакторов. Урокиназа продуцируется в культурах клеток почек. с) Рекомбинантный t-PA (rt-PA). Обширный опыт терапевтического тромболиза накоплен для активатора плазминогена тканевого типа - так называемого rt-PA (см. ЕР 0093619, патент США 4766075), который продуцируется в рекомбинантных клетках хомяка. В 90-е годы во всем мире проведены некоторые клинические испытания с использованием rt-PA, и они привели к частично непонятым и противоречивым результатам. В так называемом европейском испытании острого инсульта (ECASS) пациентов лечили rt-PA внутривенно в пределах 6-часовых временных рамок после возникновения симптомов инсульта. Через 90 суток оценивали коэффициент смертности, а также индекс Barthel, в виде индекса нетрудоспособности или независимой жизнеспособности пациентов. Не сообщалось о значимом улучшении жизнеспособности, но, хотя и незначимо, повышалась смертность. Так, можно заключить, что тромболитическое лечение rt-PA пациентов, индивидуально выбранных согласно их относительной истории болезни непосредственно после начала инсульта, возможно, может иметь преимущества. Однако общее применение rt-PA в пределах 6 часовых временных рамок после возникновения инсульта не рекомендовано, поскольку применение в течение этого времени повышает риск интрацеребральной геморрагии (ИЦГ) (C. Lewandowski and Wiliam Barsan, 2001: Treatment of Acute Stroke; in: Annals of Emergency Medicine 37:2, S.202 ff.). Тромболитическое лечение удара также является предметом клинического испытания, проводимого Национальным институтом неврологических нарушений и инсульта (так называемое NINDS rtPA StrokeTrial) в США. Данное испытание концентрировалось на эффекте внутривенного лечения rtPA только в пределах 3 ч после возникновения симптомов. Пациентов оценивали через три месяца после лечения. Пациентов оценивали в течение трех месяцев после лечения. Вследствие наблюдаемых положительных эффектов данного лечения на жизнеспособность пациентов лечение rt-PA в пределах данных ограниченных временных рамок, равных 3 ч, было рекомендовано, хотя авторы обнаружили более высокий риск ИЦГ. Два дальнейших исследования (испытание ECASS II: тромболиз алтеплазой для острого неинвазивного лечения при ишемическом инсульте (ATLANTIS оценивали, могут ли повторяться положительные эффекты лечения rtPA в пределах 3 ч после возникновения инсульта даже при лечении в пределах времени, равного 6 ч. Однако на этот вопрос не могло быть получено утвердительного ответа, поскольку не наблюдалось улучшения клинических симптомов и снижения смертности. Сохранялся высокий риск ИЦГ. Согласно обзору всех испытаний по удару, впервые опубликованному в 1997 г. и обновленному в марте 2001 г., все способы лечения тромболитиками (урокиназа, стрептокиназа, rt-PA или рекомбинантная урокиназа) приводили к значительно более высокой смертности в течение первых 10 суток после инсульта, притом, что общее число умерших или инвалидизированных пациентов снижалось, когда тромболитики применяли в течение 6 ч после возникновения инсульта. Данные эффекты имели место в основном вследствие ИЦГ. Поэтому широкое применение тромболитиков для лечения инсульта не было рекомендовано. Даже до этого такие результаты дали некоторым другим авторам повод для сугубо саркастического заявления, что пациенты с инсультом стоят перед выбором, умереть или выжить инвалидами (SCRIP 1997: 2265, 26). Тем не менее, до сих пор лечение rt-PA является единственным способом лечения острой церебральной ишемии, одобренной Food and Drug Administration (FDA) в США. Однако она ограничена применением rt-PA в пределах 3 ч после возникновения инсульта. Рекомбинантный активатор плазминогена в настоящее время продается под обозначением алтеплаза или ретеплаза для аналогичного лекарственного средства. Последнее является терапевтически активным фрагментом rt-PA с более низким периодом полужизни. Терапевтическая доза алтеплазы составляет около 70-100 мг, ретеплазы - 2560 мг, причем алтеплаза в основном применяется путем капельной инфузии, а ретеплаза путем болюсной инъекции, повторяемой два раза с интервалом примерно 30 мин(Mutschler: "Artzneimittelwirkungen", 8th Edition, pages 512-513). Побочные эффекты t-PA. Нейротоксичность и эксайтотоксичность. Одобрение rt-PA достигнуто в 1996 г. Ранее, в 1995 г. стали известны первые сообщения об отрица-2 013837 тельных побочных эффектах t-PA, которые обеспечивали основу для объяснения его драматических эффектов при применении в лечении инсульта после 3-часовых временных рамок. В соответствии с этим,клетки микроглии и нейрональные клетки гиппокампа продуцируют t-PA, который вносит вклад в опосредованную глутаматом нейротоксичность. Данный вывод был сделан из сравнительного исследования дефицитных по t-PA мышей и мышей дикого типа, когда агонисты глутамата соответственно вводили в их гиппокамп. Дефицитные по t-PA мыши характеризовались значительно более высокой устойчивостью в отношении введенного извне (интратекально) глутамата (Tsirka S.E. et al., Nature, Vol.377, 1995, "Excitoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator"). Данные результаты подтверждали в 1998 г., когда Wang et al. смогли доказать наличие примерно вдвое большего количества некротической нервной ткани у дефицитных по t-PA мышей при внутривенном введении tPA. Данный отрицательный эффект внешнего t-PA на мышей дикого типа имел место только примерно на 33% (Wang et al., 1998, Nature, "Tissue plasminogen activator (t-PA) increases neuronal damage after localcerebral ischaemia in wild type and t-PA deficient mice"). Дальнейшие результаты по стимуляции эксайтотоксичности t-РА опубликованы Nicole et al. в начале 2001 г. (Nicole О., Dosagne F., Ali С, Margaill I., Carmeliet P., MacKenzie E.T., Vivien D. and Buisson A.,2001: The proteolytic activity of tissue plasminogen activator enhances NMDA receptor-mediated signaling; in:Nat Med 7, 59-64). Они смогли подтвердить, что t-PA, высвобождаемый деполяризованными кортикальными нейронами, может взаимодействовать с так называемой NR1-субъединицей рецептора глутаматаNMDA-типа, что ведет к расщеплению NR1. Это увеличивает активность рецептора, что приводит к более высокой степени повреждения ткани после применения агониста глутамата NMDA. Агонист NMDA индуцировал эксайтотоксичность. Таким образом, t-PA проявляет нейротоксический эффект за счет активации рецептора глутамата NMDA-типа. Поскольку во время инсульта в области поврежденной ткани нарушается гематоэнцефалический барьер, растворимые белки плазмы, такие как фибриноген и также применяемый в терапии t-PA, контактируют с нервной тканью, где t-PA, будучи стимулированным фибриногеном, проявляет свой эксайтотоксический эффект путем активации рецептора глутамата. Несмотря на его нейротоксический побочный эффект и его эффект повышения смертности, t-PA одобрен FDA. Это может объясняться только отсутствием безвредной и эффективной альтернативы, то есть это является следствием очень прагматичного анализа стоимости и эффективности. Поэтому пока имеется необходимость в безопасных способах лечения. Однако если они по-прежнему будут основываться на тромболитиках, если невозможно найти альтернативы тромболизу, следует рассмотреть проблему нейротоксичности (см., например, Wang et al. a.a.O.; Lewandowski and Barson 2001 а.а.О.). Поэтому завершена дальнейшая оценка известных тромболитиков, включая DSPA (активатор плазминогена Desmodus rotundus) для разработки новых лекарственных средств, хотя в большинстве случаев потенциально подходящими являются все тромболитики. В частности, в случае DSPA его потенциальная применимость по данному медицинскому показанию отмечалась ранее (Medan P., Tatlisumak T., Takanoon Thrombolytic Therapy in Acute Ischaemic Stroke). DSPA представляет собой активатор плазминогена с высокой гомологией (сходством) с t-PA. Поэтому и в дополнение к разочарованию в результате нейротоксических побочных эффектов t-PA не было дальнейших ожиданий того, что DSPA является подходящим лекарственным средством для лечения инсульта. Альтернативные терапевтические подходы Исследование альтернативных терапевтических подходов в настоящее время сфокусировано, например, на таких антикоагулянтах, как гепарин, аспирин или анкрод, активное вещество, происходящее из яда малайской гремучей змеи. Два дальнейших клинических испытания, в которых оцениваются эффекты гепарина (международное испытание инсульта (IST) и испытание ORG 10172 при лечении острого инсульта (TOAST, однако, не указывали на значительное улучшение по смертности или профилактике инсульта. Дальнейший новый способ лечения не фокусируется ни на тромбозе, ни на разжижении крови, ни на коагуляции, но в нем делается попытка повышения жизнеспособности клеток, поврежденных прерыванием подачи крови (WO 01/51613 А 1 и WO 01/51614 А 1). Для достижения этого применяются антибиотики из группы хинонов, аминогликозидов и хлорамфеникол. По сходной причине далее предложено начинать с применения цитихолина непосредственно после начала инсульта. В организме цитихолин расщепляется на цитидин и холин. Продукты расщепления образуют часть нейрональной клеточной мембраны и таким образом поддерживают регенерацию поврежденной ткани (патент США 5827832). Современные исследования безопасного лечения основываются на новом открытии того, что часть фатальных последствий инсульта вызвана лишь опосредованно прерыванием подачи крови, но непосредственно эксайто- и нейротоксичностью, включающей в себя избыточно активированные рецепторы глутамата. Данный эффект повышается за счет t-PA (см. выше). Поэтому концепция по снижению эксайтотоксичности состоит в применении так называемых нейропротекторов. Они могут использоваться отдельно или в комбинации с фибринолитическими средствами для минимизации нейротоксических эффектов. Они могут обеспечивать снижение эксайтотоксичности непосредственно, например, как антаго-3 013837 нисты рецепторов глутамата, или опосредованно, ингибируя зависимые от напряжения натриевые или кальциевые каналы (Jin-Mo Lee et al. a.a.O.). Конкурентное ингибирование (антагонистическое действие) глутаматных рецепторов NMDA-типа возможно, например, 2-амино-5-фосфоновалератом (APV) или 2-амино-5-фосфоногептанатом (АРН). Неконкурентное ингибирование может достигаться, например, веществами, связывающимися с фенилциклидиновой стороны каналов. Такие вещества могут представлять собой фенилциклидин, MK-801,декстрорфан или кетамин. До сих пор способы лечения нейропротекторами не характеризовались ожидаемым успехом, возможно, потому что нейропротекторы должны были комбинироваться с тромболитическими средствами для проявления их протективных эффектов. Это применимо и к другим веществам. Даже комбинация t-PA и нейропротективных средств приводит только к ограниченному повреждению. Тем не менее, неблагоприятная нейротоксичность фибринолитического средства как такового не избегается. Не обладающие нейротоксичностью активаторы плазминогена Активаторы плазминогена для лечения инсульта, ферментативная активность которых высоко избирательно повышается во много раз за счет фибрина, т.е. с коэффициентом свыше 650, известны из заявки на выдачу международного патента РСТ/ЕР 02/12204, описание которой полностью принято в качестве ссылки. Свойства и введение данных активаторов плазминогена основаны на знании того, что нейротоксичность активатора тканевого плазминогена (t-PA) в основном является следствием того факта, что гематоэнцефалический барьер ослабляется или нарушается как следствие разрушения ткани головного мозга,вызванного инсультом, и что фибриноген, циркулирующий в крови, может, таким образом, проникать в нервную ткань головного мозга. Там он активирует t-PA, который опосредованно индуцирует последующее повреждение ткани путем активации глутаматного рецептора или путем активации плазминогена (см. выше). Для предотвращения данного эффекта применяют активатор плазминогена, который проявляет повышенную избирательность в отношении фибрина, и, наоборот, сниженный потенциал в плане активации фибриногена. Это имеет то следствие, что данные активаторы плазминогена не будут активироваться или будут активироваться по сравнению с t-PA в значительно меньшей степени, когда фибриноген будет проникать из крови в нервную ткань вследствие поврежденного гематоэнцефалического барьера,поскольку их активатор фибрин не может войти в нервную ткань по причинам его размера и нерастворимости. Таким образом, данные активаторы плазминогена не являются нейротоксичными. а) Генетически модифицированные активаторы плазминогена. По предпочтительному варианту осуществления изобретения используют нетоксичные активаторы плазминогена, которые включают в себя по меньшей мере один элемент так называемой зимогенной триады. Сравнимая триада известна из каталитического центра сериновых протеаз семейства химотрипсина, состоящего из трех взаимодействующих аминокислот аспартата 194, гистидина 40 и серина 32. Однако данная триада не существует в t-PA, который также принадлежит к семейству химотрипсина, как и сериновые протеазы. Тем не менее, известно, что направленный мутагенез нативного t-PA с целью введения по меньшей мере одной из указанных выше аминокислот в подходящем положении приводит к сниженной активности профермента (одноцепочечного t-PA) и к повышенной активности зрелого фермента (двухцепочечного t-PA) в присутствии фибрина. Поэтому введение по меньшей мере одной аминокислоты триады или аминокислоты с соответствующей функцией в триаде может увеличивать зимогенность t-PA (т.е. отношение между активностью зрелого фермента и активностью профермента). В результате заметно возрастает специфичность к фибрину. Это является следствием конформационного взаимодействия между введенным аминокислотным остатком и/или аминокислотными остатками последовательности дикого типа. Известно, что мутагенез нативного t-PA с заменой Phe 305 на His (F305H) и Ala 292 на Ser (A292S) приводит к 20-кратному повышению зимогенности, в то время как только вариант F305H уже приводит к 5-кратно более высокой зимогенности (E.L. Madison, Kobe A., Gething M-J., Sambrook J.F., Goldsmith E.J. 1993: Converting Tissue Plasminogen Activator to a Zymogen: A regulatory triad of Asp-His-Ser; Science: 262,419-421). В присутствии фибрина данные мутанты t-PA характеризуются повышением активности в 30000 раз (F305H) и в 130000 раз (F305H, A292S) соответственно. В дополнение данные мутанты содержат замену Arg275 R275E для предотвращения расщепления плазмином в участке расщепления Arg275Ile276, с преобразованием одноцепочечного t-PA в двухцепочечную форму. Участок мутации R275E один приводит к увеличению специфичности t-PA к фибрину в 6900 раз (K. Tachias, E.L. Madison 1995:Journal of Biological Chemistry 270, 31: 18319-18322). Положения 305 и 292 t-PA гомологичны положениям His40 и Ser32 известной триады химотрипсиновых сериновых протеаз. Путем соответствующих замен, вводящих гистидин или, соответственно, серин, данные аминокислоты могут взаимодействовать с аспартатом 477 t-PA, что приводит к возникновению функциональной триады в мутантах t-PA (Madison et al., 1993).-4 013837 Данные мутанты t-PA могут использоваться для лечения инсульта по изобретению, поскольку они характеризуются отсутствием или по сравнению с t-PA дикого типа значительным снижением нейротоксичности вследствие их повышенной специфичности в отношении фибрина. С целью описания указанных мутантов t-PA F305H; F305H, A292S отдельно или в комбинации с R275E авторы настоящего изобретения включают полностью в качестве ссылки публикации Madison et al., 1993, и Tachias and Madison,1995. Повышение специфичности к фибрину активаторов плазминогена может альтернативно достигаться точечной мутацией Asp 194 (или аспартата в гомологичном положении). Активаторы плазминогена принадлежат к группе сериновых протеаз семейства химогрипсина и поэтому содержат консервативную аминокислоту Asp 194, которая отвечает за стабильность каталитически активной конформации зрелых протеаз. Известно, что Asp 194 взаимодействует с His 40 в зимогенной форме сериновых протеаз. После того как зимоген активируется путем расщепления, данное специфичное взаимодействие прерывается, и боковая цепь Aspl94 вращается примерно на 170 для образования нового солевого мостика с Ile 16. Данный солевой мостик вносит существенный вклад в стабильность оксианионного кармана каталитического центра зрелых сериновых протеаз. Он также присутствует в t-PA. Введение точечной мутации, замещающей Asp 194, на первый взгляд, препятствует образованию каталитической конформации сериновых протеаз и, соответственно, ее стабильности. Несмотря на это,мутантные активаторы плазменогена характеризуются значительным повышением активности в присутствии их кофактора фибрина, особенно по сравнению со зрелой формой дикого типа, что может объясняться только тем, что взаимодействие с фибрином обеспечивает конформационное изменение, способствующее каталитической активности (L. Strandberg, E.L. Madison, 1995: Variants of Tissue-type Plasminogen Activator with Substantially Enhanced Response and Selectivity towards Fibrin co-factors, in: Journal ofBiological Chemistry 270, 40: 2344-2349). В заключение следует отметить, что мутанты активаторов плазминогена Asp 194 характеризуются сильным повышением активности в присутствии фибрина, что дает возможность для их применения по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления изобретения используется мутантный t-PA, в которомAsp l94 замещен глутаматом (D194E) или, соответственно, аспарагином (D194N). В данных мутантах активность t-PA снижена в 1-2000 раз в отсутствие фибрина, тогда как в присутствии фибрина может достигаться повышение активности в 498000-1050000 раз. Данные мутанты могут, кроме того, содержать замену Arg15 R15E, которая предотвращает расщепление одноцепочечного t-PA по пептидной связиArgl5-Ilel6 плазмином, что ведет к образованию двухцепочечной формы t-PA. Одна данная мутация повышает активацию t-PA фибрином в 12000 раз. Для описания мутаций t-PA в положениях 194 и 15 в качестве ссылки полностью включены публикации Strandberg and Madison (1995). Повышение фибриновой зависимости активаторов плазминогена также может достигаться введением точечных мутаций в так называемую "петлю автолиза". Данный элемент известен из трипсина; он также может быть обнаружен в виде гомологичной части в сериновых протеазах и, в частности, характеризуется тремя гидрофобными аминокислотами (Leu, Pro и Phe). Петля автолиза в активаторах плазминогена отвечает за взаимодействие с плазминогеном. Точечные мутации в данной области могут иметь такой эффект, что белок-белковое взаимодействие между плазминогеном и активаторами плазминогена не может больше эффективно образовываться. В отсутствие фибрина данные мутации имеют отношение только к функции. В присутствии фибрина они, наоборот, отвечают за повышенную активность активаторов плазминогена (K. Song-Hua, K. Tachias, D. Lamba, W. Bode, E.L. Madison, 1997: Identification of aJournal of Biochemistry 272; 3, 1811-1816). В предпочтительном варианте осуществления применяют t-PA, характеризующиеся точечные мутации 420-423. Если данные остатки замещены направленным мутагенезом, то это повышает фибриновую зависимость t-PA максимум в 61000 раз (K. Song-Hua et al.). Song-Hua et al. оценивали точечные мутации L420A, L420E, S421G, S421E, P422A, P422G, P422E, F423A и F423E. Данные публикации включены сюда полностью в качестве ссылки для описания применения по изобретению. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления применяют модифицированный тканевой активатор плазминогена с аминокислотной последовательностью по SEQ ID No. 13 (фиг. 9). Данный модифицированный t-PA отличается от t-PA дикого типа заменой гидрофобных аминокислот в положении 420-423 в петле автолиза следующим образом: His420, Asp421, Ala422 и Cys423. Данный t-PA преимущественно содержит фенилаланин в положении 194. Далее положение 275 может быть занято глутаматом. Предпочтительно положение 194 занято фенилаланином. Кроме того, по изобретению может использоваться модифицированная урокиназа. Урокиназа по изобретению может включать в себя аминокислотную последовательность по SEQ ID No. 2 (фиг. 14), в котором гидрофобные аминокислоты петли автолиза замещены Val420, Thr421, Asp422 и Ser423. Предпочтительно урокиназа несет Ile275 и Glu194. Данный мутант характеризуется по сравнению с урокиназой дикого типа 500-кратным увеличением специфичности в отношении фибрина. Оба мутанта - урокиназа и t-PA - анализировали в полуколичественных тестах, и они характеризо-5 013837 вались повышенной специфичностью в отношении фибрина по сравнению с t-PA дикого типа.b) Активатор плазминогена из Desmodus rotundus (DSPA). Активатор плазминогена (DSPA) из слюны летучей мыши вампира (Desmodus rotundus) также характеризуется сильно повышенной активностью в присутствии фибрина, в частности повышенной в 100000 раз. Таким образом, он может предпочтительно использоваться по изобретению. Термин DSPA включает в себя четыре разных протеазы, которые выполняют существенную для летучей мыши вампира, а именно обеспечивают повышенную длительность кровотечения из раны жертвы (Cartwright, 1974). Данные четыре протеазы (DSPA1, DSPA2, DSPA , DSPA ) характеризуются высоким сходством(гомологией) друг в отношении друга и в отношении человеческого t-PA. Они также характеризуются сходной физиологической активностью, что ведет к их общей классификации под родовым терминомDSPA. DSPA описан в патентах ЕР 0352119 А 1 и патентах США 6008019 и 5830849, которые включены сюда полностью в качестве ссылки с целью описания.DSPA пока является наиболее хорошо проанализированной протеазой из данной группы. Он характеризуется аминокислотной последовательностью с гомологией более 72% по сравнению с известной аминокислотной последовательностью человеческого t-PA (Krtzschmar et al., 1991) Однако имеется два существенных различия между t-PA и DSPA. Во-первых, все DSPA характеризуются полной протеазной активностью в виде одноцепочечной молекулы, поскольку они, в отличие от t-PA, не конвертируются в двухцепочечную форму (Gardell et al., 1989; Ktzschmar et al., 1991). Во-вторых, каталитическая активность DSPA почти абсолютно зависит от фибрина (Gardell et al., 1989; Bringmann et al., 1995; Toschie etal., 1998). Например, активность DSPA1 повышена в 100000 раз в присутствии фибрина, в то время как активность t-PA повышается только в 550 раз. Наоборот, активность DSPA значительно менее сильно индуцируется фибриногеном, поскольку он характеризуется только 7-9-кратным повышением (Bringmann et al., 1995). В заключение, DSPA значительно более зависим от фибрина и намного более специфичен в отношении фибрина, чем t-PA дикого типа, который активируется фибрином только в 550 раз. Из-за своих фибринолитических характеристик и сильным сходством с t-PA DSPA является интересным кандидатом на предмет разработки тромболитического средства. Несмотря на это, терапевтическое применение DSPA в качестве тромболитического средства в прошлом было ограничено лечением инфаркта миокарда, поскольку вследствие участия t-PA в индуцированной глутаматом нейротоксичности не существовало обоснованной надежды на то, что активатор плазминогена, родственный t-PA, может рационально применяться для лечения острого инсульта. Неожиданно было показано, что DSPA не имеет нейротоксического действия даже несмотря на то,что он характеризуется высоким сходством (гомологией) с t-PA, и даже несмотря на то, что физиологическое действие данных молекул в большой степени сравнимо. Указанный выше вывод привел к той идее, что DSPA все же может успешно применяться в качестве тромболитического средства для лечения инсульта без сильного риска повреждения нервной ткани. Особенно интересен факт, что DSPA также может использоваться позднее 3 ч после возникновения симптомов инсульта. Экспериментальное подтверждение отсутствия нейротоксичности DSPA Новое учение основано на сравнительных оценках in vivo нейродегенеративного действия t-PA, с одной стороны, и DSPA, с другой стороны, которые проводят с использованием так называемой модели каиновой кислоты и модели для оценки индуцированного NMDA повреждения полосатого тела. Модель каиновой кислоты (также модель повреждения каиновой кислотой) основана на стимуляции нейротоксического глутаматного каскада путем внешнего применения каиновой кислоты (KA), в качестве агониста глутаматного рецептора типа каиновой кислоты (KA-типа) и глутаматных рецепторовNMDA и АМРА. С использованием линии дефицитных по t-PA мышей в качестве экспериментальной модели возможно показать, что чувствительность лабораторных животных к каиновой кислоте достигала уровня мышей дикого типа только после дополнительного применения внешнего t-PA. Инфузия эквимолярной концентрации DSPA в тех же экспериментальных условиях не восстанавливает чувствительность к каиновой кислоте (KA). Сделан вывод, что нейротоксический эффект t-PA не индуцируется DSPA. Данные результаты суммированы на фигуре 15 (табл. 1). Количественные оценки, основанные на данной модели, выявили, что даже 10-кратное повышение концентрации DSPA не могло восстановить чувствительность дефицитных по t-PA мышей к обработкеKA, в то время как в 10 раз более низкая концентрация t-PA приводила к индуцированным KA повреждениям тканей. Это ведет к тому заключению, что DSPA обладает по меньшей мере в 1000 раз меньшим нейротоксическим потенциалом, чем t-PA, в отношении стимуляции нейродегенерации после обработкиKA (см. также фиг. 11 и 12). Во второй модели нейродегенерации возможные эффекты t-PA, а также DSPA на стимуляциюNMDA-зависимой нейродегенерации сравнивали на мышах дикого типа. Для данной цели NMDA (как агонист глутаматного рецептора NMDA-типа) вводили путем инъекции мышам дикого типа отдельно или в комбинации с t-PA или DSPA. Данная модель позволяет сравнивать эффекты данных протеаз в условиях, которые всегда ведут к нейродегенерации и к выбросу белков плазмы вследствие нарушения гематоэнцефалического барьера (Chen et al., 1999).-6 013837 При действии этой модели инъекция NMDA вела к образованию воспроизводимых очагов повреждения полосатого тела у мышей. Объем очагов повреждения повышался при комбинированной инъекцииNMDA и t-PA по меньшей мере на 50%. Совместная инъекция с DSPAal, наоборот, не приводила к увеличению или удлинению очагов, вызванных NMDA. Даже в присутствии белков плазмы, которые могут свободной диффундировать в области повреждения, индуцированного NMDA, DSPA не приводил к повышенной нейродегенерации. Данные результаты суммированы на фиг. 16 (табл. 2). Первые результаты клинических испытаний выявили переносимость данных результатов на лечение инсульта у людей. Было обнаружено, что значительные улучшения достигались у пациентов после успешной перфузии (улучшение на 8 пунктов NIHSS или коэффициент NIHSS от 0 до 1). Это показано на фиг. 17 (табл. 3). В дальнейшем эксперименте тестировали, способны ли t-PA или DSPA проникать через поврежденный гематоэнцефалический барьер при внутривенном введении и, как следствие, увеличивать очаги повреждения в головном мозге. Для ответа на данный вопрос мышам проводили стереотактическую инъекцию NMDA для продукции очагов повреждения ткани в полосатых телах, с последующим внутривенным применением t-PA или DSPA через 6 или 24 ч после инъекции NMDA. По сравнению с отрицательным контролем экспериментальные животные характеризовались увеличением области ткани с индуцированным NMDA повреждением примерно на 30%, когда t-PA вводили путем инфузии через 24 ч после инъекции NMDA; такая же обработка DSPA, наоборот, не продуцировала такое повышение повреждения ткани, хотя его проникновение в область поврежденной ткани положительно выявляли посредством окрашивания антителами (см. фиг. 18, 19). Когда t-PA или DSPA применяли внутривенно соответствующим образом через 6 ч после инъекции NMDA, увеличение области поврежденной ткани еще не выявлялось. Это может объясняться тем, что гематоэнцефалический барьер предоставлял достаточную барьерную функцию в данный момент инъекции t-PA или DSPA. Данные результаты показывают, что DSPA представляет собой наиболее инертную протеазу в центральной нервной системе млекопитающего (и,таким образом, также человека) и, в отличие от t-PA, не способствует потенцированию нейротоксичности, индуцированной KA или NMDA. Это отсутствие нейротоксичности, вопреки общим соображениям,делает DSPA подходящим тромболитиком для лечения острого инсульта. Терапепевтический потенциал не обладающих нейротоксичностыо активаторов плазминогена Отсутствие нейротоксичности у DSPA и других не обладающих нейротоксичностью активаторов плазминогена (см. выше) предоставляет особое преимущество при лечении инсульта, которое заключается в том, что применение данных активаторов плазминогена, в отличие от t-PA дикого типа, не ограничено только 3 ч после начала инсульта. Лечение может, наоборот, начинаться позже, например через 6 ч или даже позже, поскольку почти нет риска стимулировать эксайтотоксические реакции. Первые клинические испытания с DSPA подтвердили безопасность лечения пациентов даже во временном интервале свыше 6-9 ч после возникновения симптомов инсульта. Данное свойство неограниченного временем лечения не обладающими нейротоксичностью активаторами является особо важным, поскольку оно позволяет в первый раз безопасно лечить пациента с симптомами острого инсульта, даже если диагноз задержался или время начала инсульта не может быть установлено с достаточной надежностью. На предшествующем уровне техники данную группу пациентов исключали из тромболитической терапии активаторами плазминогена из-за неблагоприятной оценки риска. Следовательно, устраняется существенный контраргумент разрешенного применения тромболитического средства. Применение активаторов плазминогена В отличие от уже принятого средства для лечения инсульта rt-PA, пока не доступна какая-либо подтвержденная информация о возможном способе применения для лечения инсульта не обладающих нейротоксичностью активаторов плазминогена. Таким образом, целью изобретения является предоставление предпочтительного способа применения данных, не обладающих нейротоксичностью активаторов плазминогена. По изобретению активаторы плазминогена, активность которых повышена в присутствии фибрина более чем в 650 раз, внутривенно применяются для лечения инсульта. Внутривенное введение данных, не обладающих нейротоксичностью активаторов плазминогена,для лечения инсульта уже оценивали в клинических испытаниях, в которых DSPA как пример данной группы фибринолитиков вводили данным пациентам внутривенно, что вызывало только минимальные побочные эффекты. Данные результаты клинических исследований были неожиданными, поскольку было хорошо известно, что внутривенное применение t-PA и других обычных фибринолитиков ассоциировано с сильным риском церебральных кровотечений (см. выше). Для снижения интрацеребральных кровотечений недавно были сделаны попытки развития стратегий для применения данных веществ не внутривенным, а внутриартериальным путем в непосредственной близости от внутрисосудистого тромба посредством катетера. Такой практический опыт уже доступен для рекомбинантно продуцированной урокиназы (PROKAT как исследование проурокиназы). Поскольку данный способ применения позволяет значительно снизить общую дозу, реализуется снижение зависимых от дозы побочных эффектов, таким образом, также церебральных кровотечений.-7 013837 Данным значительным преимуществам внутриартериального применения, однако, противопоставлены два возможных недостатка. Во-первых, для данного лечения необходима длительная подготовка пациента, которую при лечении инсульта невозможно реализовать в данный интервал времени, равный только 3 ч. С одной стороны, действительно можно достигнуть более низкой общей дозы. Однако более высокая концентрация лекарственного средства местно достигает терминальных артериальных сосудов. Как следствие нарушенной барьерной функции сосудистого эндотелия в случае инсульта фармакологическое вещество также достигнет окружающих тканей в повышенной концентрации. Там оно может затем проявлять нежелательные побочные эффекты. В отличие от указанного, в случае внутривенного введения концентрация фармакологического веществ разбавляется венозной кровью. Таким образом, внутриартериальная инъекция проблематична в случае лекарственных средств, имеющих потенциал по деструкции ткани (Forth, Henschler, Rummel,Starke: "Pharmakologie und Toxikologie", 6th Edition, 1992, page 29). Однако данные ограничения, осложняющие внутриартериальное применение, - узкий интервал времени и повреждающие ткань побочные эффекты - не действуют для активаторов плазминогена по изобретению. Таким образом, внутриартериальное применение по причине его несомненных преимуществ (см. выше) в принципе представляет собой многообещающий способ применения не обладающих нейротоксичностью активаторов плазминогена. Таким образом, очевидно следовать данному пути при поиске предпочтительного способа применения данных лекарственных средств. Тем не менее, для не обладающих нейротоксичностью активаторов плазминогена заявителем также решено полагаться на несколько проблематичное внутривенное применение, которое неожиданно было признано предпочтительным. Более того, способ применения по изобретению также избегает обычной терапевтической практики,состоящей по большей части в применении внутримышечных инъекций или внутривенной капельной инфузии для введения белков с повышенным иммуногенным потенциалом, что имеет целью снизить риск анафилактического шока (Mebs: "Gifttiere", 2nd Edition, 2000). В отличие от t-PA как природного вещества организма активаторы плазминогена, применяемые по изобретению, являются чужеродными белками, происходящими из животных (как, например, DSPA) или генетически модифицированными белками организма, экспонирующими новые эпитопы вследствие их структурных различий. Сопутствующая проблема анафилактических реакций, в частности, при применении высоких терапевтических доз, таких как те, что необходимы в случае внутривенного применения,имеет место также для других фибринолитиков, состоящих из чужеродных белков, таких как стрептокиназа. В особенно предпочтительном варианте осуществления активаторы плазминогена по изобретению вводят посредством болюсной инъекции (внутривенной быстрой инъекции), которая также может вводиться в виде единичной внутривенной быстрой инъекции, содержащей полную терапевтическую дозу. В контексте клинических исследований было обнаружено, что даже внутривенное применение неожиданно низких терапевтических доз приводит к благоприятным результатам. Предпочтительные терапевтические результаты, например, были достигнуты с дозами от 90 до 230 мкг/кг. Особенно предпочтительные терапевтические результаты здесь достигнуты с дозами от 62,5 до 90 мкг/кг. У оцениваемых пациентов периоды между инсультом и применением лекарственного средства составляли от 3 до 9 ч. Посредством подходящих способов оценки было возможно определить начало терапевтического действия (см. фиг. 20-29).DSPA, как и другие, не обладающие нейротоксичностью активаторы плазминогена, не характеризуются побочными эффектами, связанными с повреждением ткани. Однако может быть предпочтительным применять их в комбинации с нейропротекторным средством для лечения инсульта с целью ограничения повреждения ткани, индуцированного глутаматом, встречающимся в природе в человеческом организме. Могут применяться нейропротекторные средства, ингибирующие глутаматные рецепторы конкурентно или неконкурентно. Подходящие комбинации осуществляются, например, с известными ингибиторами глутаматных рецепторов NMDA-типа, типа каиновой кислоты или типа квисквалата, напримерAPV, АРН, фенилциклидин, MK-801, декстрорфан или кетамин. Далее может быть предпочтительной комбинация с катионами, особенно с ионами Zn, которые блокируют катионный канал, регулируемый глутаматным рецептором, и могут, таким образом, снижать нейротоксические эффекты. В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления не обладающие нейротоксичностью активаторы плазминогена могут комбинироваться, по меньшей мере, с другим терапевтическим средством или с фармацевтически переносимым средством. Комбинация с терапевтическим средством, которая поддерживает снижение повреждения ткани путем оживления клеток, является особо предпочтительной,поскольку она участвует в регенерации уже поврежденной ткани или служит для предотвращения дальнейших случаев инсульта. Предпочтительными примерами являются комбинации с антибиотиками, как хиноны, с антикоагулянтами, как гепарин или гирудин, а также с цитихолином или ацетилсалициловой кислотой. Комбинация по меньшей мере с одним тромбиновым ингибитором также может быть предпочти-8 013837 тельной. Преимущественно могут использоваться тромбомодулин и аналоги тромбомодулина, например солулин, триабин и паллидипин. Дальнейшие комбинации с противовоспалительными веществами являются предпочтительными, поскольку они влияют на инфильтрацию лейкоцитов. Ниже способ применения и получения препаратов по изобретению выделен посредством различных терапевтических примеров. Примеры Сравнительная оценка t-PA и DSPA. А. Способы. 1. Животные. Мыши дикого типа (с 57/Black 6) и мыши, дефицитные t-PA (мыши t-PA-/-) (c57/Black 6) (Carmelietet al., 1994), были поставлены д-ром Peter Carmeliet, Leuven, Бельгия. 2. Экстракция белка из ткани головного мозга. Оценку протеолитической активности головного мозга после инфузии t-PA или DSPA1 проводили путем зимографического анализа (Granelli-Piperno and Reich, 1974). После инфузии в течение периода 7 суток в гипокамп мышей подвергали наркозу, затем перфузировали PBS через сердце и извлекали головной мозг. Удаляли область гиппокампа, переносили в пробирки Eppendorf и инкубировали в равном объеме (мас./об.) (примерно 30-50 мкл) лизирующего буфера с 0,5% NP-40, не содержащего ингибиторы протеаз (0,5% NP-40, 10 мМ Tris-HCl pH 7,4, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 1 мМ EDTA). Экстракты головного мозга гомогенизировали посредством ручного стеклянного гомогенизатора и оставляли на льду в течение 30 мин. Затем образцы центрифугировали и удаляли надосадочную жидкость. Определяли количество присутствующего белка (реагент Bio-Rad). 3. Зимографический анализ протеаз. Протеолитическая активность в образцах и экстрактах ткани головного мозга определяли путем зимографического анализа по способу Granelli, Piperno and Reich (1974). Образцы с рекомбинантными белками (до 100 нМ) или экстрактов ткани головного мозга (20 мкг) подвергали (10%) SDS-PAGE в невосстановительных условиях. Гели удаляли из планшетов, промывали в 1% Triton X100 в течение 2 ч и затем перекладывали на агарозный гель, содержащий полимеризованный фибриноген и плазминоген (Granelli, Piperno and Reich, 1974). Гели инкубировали при 37 С в увлажненной камере до появления зон протеолиза. 4. Инфузия t-PA, DSPA внутрь гиппокампа и последующая инъекция каиновой кислоты. Модель повреждения каиновой кислотой основывалась на исследованиях Tsirka et al. (1995). Животных подвергали внутрибрюшинной (в./б.) инъекции атропином (4 мг/кг) и затем подвергали наркозу путем в./б. инъекции пентобарбитола натрия (70 мг/кг). После этого мышей помещали в стереотаксическую рамку и подкожно между лопатками имплантировали микроосмотический насос (модель Alzet 1007D, Alzet CA., США), содержащий 100 мкл PBS или рекомбинантного человеческого t-PA (0,12 мг/мл, 1,85 мкМ) или DSPA1 (1,85 мкМ). Насосы соединяли посредством стерильных трубок с канюлей для головного мозга и встраивали через пробуравленное отверстие, сделанное в черепе, с координатами: темя -2,5 мм, медиолатерально 0,5 мм и дорзовентрально 1,6 мм для введения жидкости вблизи средней линии. Канюлю фиксировали в требуемом положении и позволяли насосам вливать соответствующие растворы со скоростью 0,5 мкл/ч всего в течение 7 суток. Через двое суток после инфузии протеаз мышей повторно вводили в наркоз и помещали в стереотаксическую рамку. После этого унилатерально в гиппокамп вводили путем инъекции 1,5 нмоль каиновой кислоты (KA) в 0,3 мкл PBS. Координаты были следующими: темя -2,5 мм, медиолатерально 1,7 мм и дорзовентрально 1,6 мм. Эксайтотоксин (KA) доставляли в течение 30 с. После обработки каиновой кислотой иглу для инъекции оставляли в тех же координатах в течение дальнейших 2 мин для предотвращения обратного тока жидкости. 5. Процедура обработки головного мозга. Через 5 суток после инъекции KA животных подвергали наркозу и перфузировали через сердце 30 мл PBS, после чего перфузировали 70 мл 4% раствора параформальдегида, фиксировали в том же фиксирующем растворе с последующей инкубацией в 30% сахарозе в течение следующих 24 суток. Фронтальные срезы (40 мкм) головного мозга затем получали на микротоме с замораживанием и негативно окрашивали тионином (BDH, Австралия) или обрабатывали путем иммуногистохимической оценки, как описано ниже. 6. Количественный анализ утраты нейронов в гиппокампе. Количественный анализ утраты нейронов в подполях гиппокампа СА 1-СА 3 проводили, как описано выше (Tsirka et al., 1995; Tsirka et al., 1996). Пять последовательных частей дорзального гиппокампа из всех групп обработки получали, заботясь о том, чтобы эти части обязательно содержали место инъекцииKA и область повреждения. Подполя гиппокампа (СА 1-СА 3) данных срезов помечали посредством чертежей гиппокампа, полученных с помощью камеры-люциды. Полную длину подполей измеряли путем сравнения со стандартами 1 мм, намеченными при том же увеличении. Определяли длину участков ткани с жизнеспособными пирамидальными нейронами (имеющими нормальную морфологию) и длину участ-9 013837 ков ткани, лишенной нейронов (отсутствуют клетки, нет окрашивания тионином). Значения длины,представляющие интактные нейроны и утрату нейронов по каждому подполю гиппокампа, усредняли по срезам и определяли значения стандартного отклонения. 7. Очаги эксайтотоксического повреждения за счет NMDA в полосатых телах с t-PA или DSPA и без них. Мышей дикого типа (с 57/Black 6) подвергали наркозу и помещали в стереотаксическую рамку (см. выше). Затем мыши получали унилатеральную инъекцию 50 нмоль NMDA в левое полосатое тело, которую проводили отдельно или в сочетании с 46 мкМ rt-PA или 46 мкМ DSPAal. В качестве контроля также проводили отдельную инъекцию t-PA или DSPA (оба в концентрации 46 мкМ). Координаты инъекции представляли собой: темя -0,4 мм, медиолатерально 2,0 мм и дорзовентрально 2,5 мм. Растворы (1 мкл общего объема для всех способов обработки) переносили в течение периода 5 мин со скоростью 0,2 мкл/мин и иглу оставляли на месте в течение дальнейших 2 мин после инъекции для минимизации обратного тока жидкости. Через 24 ч мышей подвергали наркозу и перфузировали через сердце 30 мл PBS с последующей перфузией 70 мл 4% раствора параформальдегида, фиксировали в том же фиксирующем растворе с последующей инкубацией в 30% сахарозе в течение следующих 24 суток. Делали срезы головного мозга (40 мкм) на микротоме с замораживанием и монтировали в покрытые желатином стеклянные слайды. 8. Количественный анализ объема повреждения после инъекции NMDA. Количественный анализ объема повреждения полосатых тел проводили с использованием способа,описанного Callaway et al. (2000). Получали десять последовательных фронтальных срезов, пронизывающих поврежденную область. Поврежденную область визуализировали способом Callaway и проводили количественный анализ объема повреждения с использованием микрокомпьютерного устройства для получения изображений (MCID, Imaging Research Inc, Brock University, Онтарио, Канада). 9. Иммуногистохимия. Иммуногистохимию проводили с использованием стандартных методологий. Фронтальные срезы погружали в раствор 3% Н 2 О 2 и 10% метанола на 5 мин с последующей инкубацией в 5% нормальной сыворотке козы в течение 60 мин. Срезы инкубировали в течение ночи с антителом против GFAP(1:1000; Dako, Carpinteria, Калифорния, США) для выявления астроцитов или с антителом против МАС-1(1:1000; Serotec, Raleigh, Северная Каролина, США) для выявления микроглии или с поликлональными антителами против DSPA (Schering AG, Берлин). После промывки срезы инкубировали с подходящими биотинилированными вторичными антителами (Vector Laboratories, Burlingame, Калифорния, США). Затем следовала конечная инкубация с комплексом биотин/авидин (Vector Laboratories, Burlingame, Калифорния, США) в течение 60 мин перед визуализацией 3,3'-диаминобебциклидином/0,03% H2O2. Затем срезы монтировали в покрытые желатином слайды, сушили, дегидратировали и покрывали покровными стеклами с пермаунтом. 10. Усиление повреждения ткани, индуцированного инъекцией NMDA, путем внутривенного введения t-PA или DSPA. Для индукции повреждения ткани в полосатом теле мышей подвергали стереотаксической инъекции NMDA. Через 6 ч после инъекции NMDA через хвостовую вену вводили t-PA или DSPA (100 мкл; 10 мг/кг). В качестве контроля вводили инъекцией 100 мкл 0,9% NaCl и впоследствии вливали PBS. Через 28 ч животных убивали и определяли объем повреждения. Во втором испытании группам животных, включающим до 15 мышей, делали соответствующие инъекции с инфузиями t-PA или DSPA через 24 ч после инъекции NMDA и последующего определения повреждения ткани. Для доказательства присутствия DSPA в головном мозге фронтальные срезы окрашивали антителом против DSPA по стандартным способам. В. Результаты. 1. Введенные путем инфузии t-PA или DSPA распространяются в гиппокамп мышей t-PA-/- и сохраняют протеолитическую активность. Исходные эксперименты планировали для подтверждения того, что DSPA и t-PA сохраняют свою протеолитическую активность в течение периода 7 суток после инфузии. Для этого аликвоты t-PA иDSPA (100 нмоль) инкубировали при 37 С и при 30 С в течение 7 суток на водяной бане. Для определения протеолитической активности 5-кратные серийные разведения проб подвергали SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях и оценивали протеолитическую активность путем зимографических анализов. Аликвоту t-PA и DSPA, которую держали в течение периода 7 суток замороженной, использовали в качестве контроля. Как можно видеть на фиг. 1, имеется только малая потеря активности DSPA или t-PA при инкубации при 25 С или 37 С. 2. Активность t-PA и DSPA восстанавливается в экстрактах гиппокампа, полученных из мышей tPA-/- после инфузии. Вначале требовалось подтвердить, что введенные путем инфузии протеазы присутствовали в головном мозге подлежащих инфузии животных и также сохраняли свою протеолитическую активность при нахождении в данном компартменте. Для решения данной проблемы мышам tPA-/- вводили инфузией в течение семи суток t-PA или DSPA (см. выше). Мышей затем перфузировали через сердце PBS и- 10013837 удаляли головной мозг. Ипсилатеральные и контралатеральные области гиппокампа выделяли, как и область мозжечка (взятую в качестве отрицательного контроля). Образцы ткани (20 мкг) подвергали SDSPAGE и зимографическому анализу по описанию в разделе способу. Как можно видеть на фиг. 2, активность t-PA и DSPA выявляли в ипсилатеральной области гиппокампа, в то время как некоторую активность также выявляли с контралатеральной стороны. Это указывало на то, что вводимые путем инфузии протеазы не только сохраняли свою активность в головном мозге, но также и диффундировали в область гиппокампа. В экстрактах, полученных из мозжечка в качестве контроля, не смогли выявить какой-либо активности. 3. Иммуногистохимическая оценка DSPA. Для дальнейшего подтверждения того, что DSPA действительно диффундирует в область гиппокампа, фронтальные срезы головного мозга мышей t-PA-/- анализировали иммуногистохимически после инфузии DSPA. Антиген DSPA выявляли в области гиппокампа с наиболее выраженным окрашиванием в области участка инфузии. Данный результат подтверждает, что введенный инфузией DSPA растворим и действительно присутствует в гиппокампе. 4. Инфузия DSPA не восстанавливает опосредованную каиновой кислотой нейродегенерацию invivo. Мыши t-PA-/- характеризуются устойчивостью к опосредованной каиновой кислотой (KA) нейродегенерации. Однако инфузия внутрь гиппокампа rt-PA полностью восстанавливает чувствительность опосредованного KA повреждения. Для определения того, может ли DSPA быть замещен в данной модели на t-PA, мышам t-PA-/- вводили инфузией в гиппокамп t-PA или DSPA с использованием миниосмотического насоса. В обеих группах тестировали 12 мышей. Через 2 суток животным вводили инъекцией каиновую кислоту и позволяли им восстановиться. Через 5 суток животных убивали, и изымали и препарировали (см. выше). В качестве контроля мышам t-PA-/- также подвергали инфузией PBS перед обработкой KA (N=3). Получали фронтальные срезы головного мозга и выявляли нейроны окрашиванием по Нисслю. Как показано на фиг. 4 а и 4b, мыши t-PA-/-, которым путем инфузии вводили PBS, были устойчивы к последующему выбросу KA. Однако инфузия рекомбинантного t-PA сохраняла чувствительность к обработкеKA. Инфузия той же концентрации DSPA в область гиппокампа, наоборот, не изменяла чувствительность животных к KA. Количественный анализ данных результатов основан на данных, полученных от 12 мышей, в каждой группе. У 2 из 12 мышей, получавших инфузию DSPA, наблюдали малую степень нейродегенерации. Причины этого неясны и возможно не связаны с присутствием DSPA. В объединенных данных учитываются данные малые эффекты, которые наблюдались в случае 2 животных. Все 12 мышей, обработанных t-PA, были чувствительны к обработке KA. Данные результаты показывают, что в случае инфузии tPA или DSPA1 в эквимолярных концентрациях только введение t-PA приводит к восстановлению чувствительности индуцированной KA нейродегенерации. 5. Инфузия DSPA не приводит к активации микроглии. Восстановление чувствительности к KA в мышах t-PA-/-, вызванная инфузией t-PA, также приводит к активации микроглии (Rogove et al., 1999). Для оценки степени активации микроглии после инфузии tPA и DSPA и последующей обработки фронтальные срезы мышей подвергали иммуногистохимической окраске активированных клеток микроглии с использованием антитела против Мас-1. Восстановление чувствительности KA после инфузии t-PA приводило к четкому увеличению Мас-1-положительных клеток. Это явление не наблюдалось у мышей, подвергавшихся инфузии DSPA. Следовательно, присутствиеDSPA не приводит к активации клеток микроглии после обработки KA. 6. Титрование DSPA и t-PA в области гиппокампа мышей. Концентрация t-PA, используемая для инфузии, основывалась на концентрации, описанной Tsirka etal. (1995) (100 мкл с концентрацией 0,12 мг/мл [1,85 мкМ]). Эксперименты по повреждению KA повторяли с использованием в 10 раз более низкой концентрацией t-PA (0,185 мкМ) и в 10 раз более высокого количества DSPA (18,5 мкМ). Более низкая концентрация t-PA все же была способна восстанавливать чувствительность к обработке KA (n=3). Особый интерес представляет обнаружение того, что инфузияDSPA в концентрации, увеличенной 10 раз, вызывала только малую потерю нейронов после обработкиKA. Эти данные явно показывают, что DSPA не вызывает чувствительности к KA. 7. Действие t-PA и DSPA на NMDA-зависимую нейродегенерацию в мышах дикого типа. Эффекты t-PA и DSPA также оценивали в модели нейродегенерации у мышей дикого типа. Инъекция t-PA в полосатое тело данных мышей, возможно, приводила к повышению нейродегенеративных эффектов, вызванных аналогом глутамата NMDA (Nicole et al., 2001).NMDA вводили путем инъекции в область полосатых тел мышей дикого типа в присутствии t-PA или DSPA (46 мкМ каждого) в общем объеме 1 мкл. Через 24 ч мозг изымали и подвергали количественному анализу способом Callaway (Callaway et al., 2000) (см. выше). Как можно видеть на фиг. 4, инъекция только NMDA вызывала воспроизводимое повреждение у всех обработанных мышей (N=4). Когда применяли t-PA и NMDA одновременно, размер очагов повреждения повышался примерно на 50% (Р 0,01,- 11013837n=4). В качестве явного отличия совместная инъекция NMDA и той же концентрации DSPA не приводила к повышению размера повреждения по сравнению с одним NMDA. Инъекция одного t-PA или DSPA не приводила к выявляемой нейродегенерации. Отсутствие эффекта t-PA при его отдельном введении согласуется с результатами Nicole et al., 2001. Эти данные показывают, что присутствие DSPA не усиливает нейродегенерацию даже во время нейродегенеративного явления. Для подтверждения того что введенный инъекцией DSPA действительно распространяется в область гиппокампа, проводили иммуногистохимию фронтальных срезов с использованием антитела против DSPA. Данная оценка показала, что DSPA действительно проникает в область полосатого тела. Кинетический анализ активации плазминогена путем непрямого хромогенного теста. Непрямые хромогенные тесты активности t-PA проводили с использованием субстрата Lysплазминоген (American Diagnostica) и Spectrocyme PL (American Diagnostica) по Madison E.L., GoldsmithMadison E.L., Goldsmith E.J., Gething M.-J., Sambrook J.F. and Gerard R.D. (1990) J. Biol. Chem. 265, 2143221426. Тесты проводили в присутствии и в отсутствие кофактора DESAFIB (American Diagnostica). DESAFIB представляет собой препарат растворимых мономеров фибрина, полученных путем расщепления высокочистого человеческого фибриногена протеазой батробоксином. Батробоксин расщепляет связьArg16-Gly17 в А-цепи фибриногена и, таким образом, высвобождает фибринопептид А. Полученный в результате дез-АА-фибриноген, представляющий собой мономеры фибрина I, растворим в отсутствие пептида Gly-Pro-Arg-Pro. Концентрация Lys-плазминогена изменялась от 0,0125 до 0,2 мкМ в присутствии DESAFIB и от 0,9 до 16 мкМ в отсутствие кофактора. Непрямые хромогенные тесты в присутствии различных стимулов. Непрямые хромогенные стандартные тесты проводили по цитируемым выше публикациям. Использовали пробы с общим объемом 100 мкл, содержащие 0,25-1 нг фермента, 0,2 мкМ Lys-плазминогена и 0,62 мМ Spectrocyme PL. Тесты проводили в присутствии буфера, 25 мкг/мл DESAFIB, 100 мкг/мл расщепленных бромцианом фрагментов фибриногена (American Diagnostica) или 100 мкг/мл пептидастимулятора Р 368 длиной 13 аминокислот. Анализ проводили в планшетах для микротитрования и определяли оптическую плотность на длине волны 405 нм каждые 30 с в течение 1 ч в Molecular DevicesThermomax. Температура взаимодействия составляла 37 С. 8. DSPA не вызывает усиления повреждений нервной ткани также в случае внутривенного введения. В полосатом теле мышей повреждение ткани индуцировали путем инъекции NMDA с последующим внутривенным применением t-PA или DSPA через 6 или 24 ч после этого. По сравнению с отрицательным контролем экспериментальные животные характеризовались повышением примерно на 30% площади поврежденной ткани, возникшей за счет инъекции NMDA, когда t-PA вводили в виде внутривенной инфузии через 24 ч после инъекции NMDA; это отличалось от DSPA, который не вызывал такое повышение повреждений ткани (см. фиг. 14). Путем окрашивания фронтальных срезов антителом противDSPA было возможно выявить, что DSPA, введенный внутривенно через 24 ч после инъекции NMDA,проникал в области поврежденной ткани (см. фиг. 15). В случае соответствующего внутривенного применения t-PA или DSPA через 6 ч после инъекции NMDA повышение площади поврежденной ткани пока не было выявлено. Причиной этого может быть то, что к данному моменту применения t-PA или DSPA гематоэнцефалический барьер еще предоставлял достаточную барьерную функцию. Таким образом,DSPA в случае внутривенного применения не проявлял нейротоксические побочные эффекты. Перечень фигур На фиг. 19 изображена иммуногистохимия на DSPA во фронтальных срезах мышей дикого типа. Панель А. Мышам проводили стереотаксическую инъекцию NMDA в область полосатого тела. Через 24 ч проводили инъекццию DSPA в хвостовую вену. Срезы получали через следующие 24 ч. Панель В. Мышам проводили стереотаксическую инъекцию NMDA+DSPA в область полосатого тела. Срезы получали через 24 ч. Панель С. Мышам проводили стереотаксическую инъекцию NMDA Срезы получали через 24 ч. Срезы показывают участок инъекции NMDA. На фиг. 20 приведены данные до 7 суток по первым 47 пациентам (не слепое исследование), данные по всем пациентам группы дозы 62,5 мкг (слепое исследование завершено с 19 пациентами; 15 получали десмотеплазу и 4 - плацебо) и по пациентам группы 90 мкг (слепое исследование продолжается, использовано 15 пациентов, 3 или 4 - плацебо и 10 или 11 - десмотеплаза, распределение чисел основано на блоках, использованных для рандомизации; получение данных по острой фазе завершено, данные на 7 сутки доступны для 13 пациентов). Распределение доз Популяция пациентовDIAS: не слепое исследование 16 пациентов плацебо,- 12013837 17 пациентов лечили 25 мг (в среднем 312,5 мкг/кг),13 пациентов лечили 37,5 мг (в среднем 545,5 мкг/кг) (7-37,5 мг, 6-50 мг),DIAS и DEDAS: пока слепое исследование 19 пациентов (4 плацебо, 15 лечили 62,5 мкг/кг) (DIAS),17 пациентов (3 плацебо, 12 лечили 90 мкг/кг) (15 DIAS, 2 DEDAS). На фиг. 21 описаны наиболее релевантные исходные данные, где сравниваются все исследованные до настоящего времени пациенты. Важно отметить, что в группе 90 мкг, как представляется больше пациентов старшего возраста (фактор риска для кровотечения), и что, как представляется, имеется тенденция к более позднему времени лечения. Однако это является истинным для сравнения "старых" и "новых" пациентов и возможно является следствием того факта, что окно лечения изменилось во время первой части испытания DIAS. К настоящему времени в группе дозы 90 мкг произошло одно симптоматическое кровотечение и ни одного - в группе 62,5 мкг. NIHSS (тяжесть инсульта) вначале сравнима с таковой в группе 25 мг. Ниодно из различий между группами, как полагают, не имеет какого-либо статистического или медицинского значения, поскольку представляется, что между группами имеется хорошее перекрывание и распространение. Диаграммы представляют верхний и нижний квартили. Медиана показана выделенной линией. Синие диаграммы представляют данные промежуточного анализа, красные представляют группу 62,5 мкг, а зеленые - группу 90 мкг. На фиг. 22 описан основной результат аспектов безопасности исследования (sИЦГ). С того времени, как исследование было возобновлено, имело место одно симптоматическое кровотечение у 36 пациентов (группы доз 62,5 и 90 мкг/кг). По сравнению с предшествующими случаями кровотечения, интересно несколько аспектов. Кровотечение произошло намного позже (через 28 ч после лечения), это, как представляется, был пациент, который не характеризовался какими-либо присутствующими ранее факторами риска (возраст, высокий уровень глюкозы, высокий NIHSS). Бессимптомные трансформации, как представляется, не характеризуются зависимостью от дозы, что согласуется, по существу, с их довольно высокой встречаемостью у пациентов без лечения, известной из ранее опубликованных испытаний. Пациенты, имевшие sИЦГ, характеризовались признаками реперфузии и момент времени 4-8 ч MRI также признаками бессимптомной геморрагической трансформации. На фиг. 23 изображено открытие сосудов, измеренное по изменению TIMI. Как было отмечено некоторыми из исследователей на последних исследовательских встречах, MRA приуменьшает величину открытия сосудов. Авторы изобретения вынуждены были учитывать это при оценке по новой шкалеTISS (данная шкала была сконструирована для испытания DIAS и DEDAS, и представляет собой комбинацию изменений TIMI и PWI, которые были адаптированы на основе данных по первым 47 пациентам и использованы в исследовательской манере). Реперфузию оценивали посредством PWI (фиг. 25 дает несколько иную картину). Следует помнить, что шкала TIMI показывает реперфузию только больших сосудов, в то время как PWI представляет собой последующее (т.е. более позднее) изменение потока крови В PENUMBRA, что также может отражать улучшение микроциркуляции. Таким образом, кажется логичным, что временная диаграмма и кинетика/амплитуда данных способов измерения, как оказывается, следуют по несколько различным алгоритмам. Однако следует насторожиться, если они показывают разные направления. По обоим способам группа 90 мкг достигает значений, сходных с таковыми в группе 25 мг,которая является лучшей группой старых пациентов (т.е. первый неслепой набор данных промежуточного анализа). Трудно оценить, действительно ли реальная скорость открытия выше или немного ниже, но она определенно лучше, чем в группе плацебо. Для необработанных данных см. табл. 1 и 2. На фиг. 24 показана реперфузия в виде изменения PWI. На фиг. 25 показаны TIMI, PWI и TISS после 4-8 ч. Показаны признаки колоколообразной кривой доза-ответ для PWI, но не для TIMI. To, что здесь, как представляется, имеется повышение TIMI в зависимости от дозы, в то время как TIMI и TISS уже характеризуются колоколообразной кривой, объясняется тем фактом, что TIMI всего лишь характеризует (крупные) сосуды, тогда как PWI и TISS характеризуют эффекты реперфузии ткани. Поскольку более высокие дозы вызывают ускоренное и более полное раскрытие сосудов, это может также вести к некоторому реперфузионному повреждению, которое может быть причиной колоколообразной кривой результатов PWI и TISS. На фиг. 26 показано, как реперфузия переносится на острое клиническое улучшение у пациентов с инсультом, измеренное как улучшение шкалы инсульта NIHSS. Удивительно, что дозы 62,5 мкг/кг и 90 мкг/кг действуют лучше, чем любая доза, через 4-8 ч после лечения. Можно предположить, что это указывает на то, что в предшествующих высоких дозировках происходит повреждение за счет реперфузии. Эта тенденция продолжается до 7 суток, где в обеих группах дозировки ситуация лучше, чем в лучшей из предыдущих групп (25 мг), при включении или исключении кровотечений из анализа. Важным моментом является то, что на 7 сутки группа дозы 62,5 мкг/кг соответствует группе 25 мг, а в группе 90 мкг/кг действие лучше, чем в группе 25 мг. Улучшение NIHSS через 4-8 ч после лечения и на 7 сутки. На фиг. 27 изображена гипотетическая кривая доза-ответ для деспотеплазы у пациентов с инсультом.administration. Circulation. 90:421-426. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение активатора плазминогена 1 из desmodus rotundus (DSPA) для изготовления лекарственного средства, включающего активатор плазминогена 1 из desmodus rotundus (DSPA) в количестве от 60 до 230 мкг/кг веса тела человека для лечения удара. 2. Применение по п.1, где количество активатора плазминогена 1 из desmodus rotundus (DSPA) составляет от 60 до 130 мкг/кг веса тела человека. 3. Применение по пп.1 и 2, где количество активатора плазминогена 1 из desmodus rotundus(DSPA) составляет от 90 до 130 мкг/кг веса тела человека. 4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где количество активатора плазминогена 1 из desmodus rotundus (DSPA) составляет 125 мкг/кг веса тела человека. 5. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство, включающее активатор плазминогена 1 из desmodus rotundus (DSPA), вводится человеку внутривенно. 6. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство, включающее активатор плазминогена 1 из desmodus rotundus (DSPA), вводится человеку болюсной инъекцией. 7. Применение по любому из предшествующих пунктов, где активатор плазминогена 1 из desmodus rotundus (DSPA) вводится по меньшей мере через 3 ч после удара. 8. Применение по любому из предшествующих пунктов, где активатор плазминогена 1 из desmodus rotundus (DSPA) вводится по меньшей мере через 6 ч после удара. 9. Применение по любому из предшествующих пунктов, где активатор плазминогена 1 из desmodus rotundus (DSPA) вводится по меньшей мере через 9 ч после удара.