Применение мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством и/или лучевой терапией для лечения метастазов в головном мозге

ПРИМЕНЕНИЕ МАЦИТЕНТАНА В КОМБИНАЦИИ С ЦИТОТОКСИЧЕСКИМ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ СРЕДСТВОМ И/ИЛИ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИЕЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЕТАСТАЗОВ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ Настоящее изобретение относится к применению мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида, или лучевой терапией или как лучевой терапией, так и цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида, для предупреждения распространения метастазов в головной мозг или лечения метастазов в головном мозге.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: БОРД ОФ РИДЖЕНТС, ДЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ ТЕХАС СИСТЕМ (US) Предшествующий уровень техники Метастазирование в головной мозг является одной из самых трудных проблем, с которыми сталкивается онкология. Метастатические опухоли устойчивы к большинству химиотерапевтических средств. Лечениями метастаза в головной мозг являются в основном лучевая терапия всего головного мозга и сфокусированная лучевая терапия, вместе с хирургической резекцией опухолей в меньшем числе случаев. Большинство химиотерапевтических схем включает 2-3 таких средств, как цисплатин, циклофосфамид, этопозид,тенипозид, митомицин, иринотекан, винорелбин, этопозид, ифосфамид, темозоломид и фторурацил (5FU). Их назначают в комбинации с лучевой терапией. Эффект этих химиотерапий на продление срока жизни существует, как правило, менее года. Довольно новой химиотерапией опухолей головного мозга является темозоломид, используемый вместе с облучением всего головного мозга. Результаты являются предварительными, но темозоломид, как представляется, оказывает некоторый ограниченный эффект на степень реакции по сравнению с облучением самим по себе и, как представляется, обладает некоторой клинической активностью в комбинации с облучением в испытаниях фазы II. Несмотря на значительные усилия, ограниченные варианты лечения, имеющиеся в наличие для метастаза в головной мозг, оставались слабыми и к тому же часто больше паллиативными, чем терапевтически эффективными. Такое состояние дел осознавали в течение длительного периода, но до сих пор значительные достижения не реализованы. Соответственно, существует огромная и существующая в настоящий момент медицинская потребность в новых терапевтических подходах и лекарственных средствах, эффективных при лечении метастаза в головной мозг. В представленном ниже описании обсуждаются антагонисты рецепторов эндотелина относительно метастаза в головной мозг. Эндотелин-1 (в дальнейшем "ЕТ-1"), вазоактивный пептид, продуцируется в основном в эндотелиальных, васкулярных гладкомышечных и эпителиальных клетках. ЕТ-1 проявляет свой физиологический эффект через посредство двух сопряженных с белком G рецепторов с высоким сродством, рецепторов эндотелина-А (в дальнейшем "ЕТА") и эндотелина-В (в дальнейшем "ЕТВ"). Антагонисты рецепторов эндотелина (ERA) являются широко известным классом соединений, способных к ингибированию этих рецепторов эндотелина (в дальнейшем "ETR"). Внутри этого класса существуют подклассы антагонистов, специфичных по отношению к ЕТА или ЕТВ, и подклассы, эффективные против них обоих (с двойной специфичностью). Один член подкласса с двойной специфичностью, бозентан,разрешен в настоящее время для применения при лечении артериальной легочной гипертензии. Некоторые ERA были исследованы в отношении применения для лечения рака [Nelson J.B., et al.,Phase 3, randomized, controlled trial of atrasentan in patients with nonmetastatic, hormone-refractory prostatecell lung cancer. Clin Cancer Res, 2008 Mar 1; 14(5): 1464-1469]. В этих исследования почти совершенно исключались пациенты с активным метастазированием в головной мозг [там же]. Такое исключение сделано согласно общей точке зрения, что существующие метастазы в головной мозг не будут реагировать на лечение, и поэтому коэффициент заболеваемости и симптомы вследствие этих метастазов могли бы маскировать эффекты исследуемого лечения на первичную опухоль [Carden C.P., et al., Eligibility of patients with brain metastases for phase I trials: time for a rethink The Lancet Oncology, Vol. 9, Issue 10, Pages 1012-1017, October 2008 doi:10.1016/S1470-2045(08)70257-2]. Эта стандартная стратегия для разработки клинического испытания используется для акцентирования на общем ожидании, что терапии, эффективные против первичных опухолей и даже опухолей, развившихся в результате метастазирования в не являющиеся головным мозгом места, будут неуспешными в воздействии на опухоли, развившиеся в результате метастазирования в головной мозг. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к применению мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида, или лучевой терапией или как лучевой терапией, так и цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида, для предупреждения распространения метастазов в головной мозг или лечения метастазов в головном мозге. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к применению мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида. В следующем варианте осуществления изобретения мацитентан применяется в комбинации с лучевой терапией. В еще одном варианте осуществления изобретения лучевая терапия представляет собой лучевую терапию всего головного мозга или стереотаксическую радиохирургию. Настоящее изобретение также относится к применению мацитентана в комбинации как с лучевой терапией, так и с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида, для предупреждения распространения метастазов в головной мозг или лечения метастазов в головном мозге, в частности, где предупреждение распростране-1 023864 ния метастазов включает снижение риска и/или степени распространения метастазов в головной мозг. Краткое описание чертежей Фиг. 1: in vitro культуру клеток рака молочной железы MDA-МВ-231 (Т) и мышиных астроцитов(А) оценивали с помощью сканирующей электронной микроскопии. Несомненен прямой контакт между астроцитами (с удлиненными отростками-ножками) и опухолевыми клетками. Фиг. 2: при сокультивированиях астроцитов и метастатических раковых клеток выявлялся перенос красителя между подвергнутыми сокультивированию клетками. Фиг. 3: культивирование клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231 или клеток рака легкого человека PC14Br4 с астроцитами (но не с фибробластами 3 Т 3) снижало относительный показатель апоптоза (увеличивало устойчивость) опухолевых клеток, подвергнутых инкубации в течение 72 ч с паклитакселом (5 нг/мл), на 58,38,9% (среднее значениесреднеквадратическое отклонение, Р 0,01) и 61,86,7% (среднее значениесреднеквадратическое отклонение, Р 0,05) соответственно (показатель апоптоза сопоставляли с использованием критерия Стьюдента). Фиг. 4: клетки рака легкого человека PC14Br4 культивировали сами по себе или с астроцитами (для прямого межклеточного контакта) в среде, содержащей ассоциированный с Р-гликопротеином адриамицин (200 нг/мл), паклитаксел (5 нг/мл), винбластин (3 нг/мл), винкристин (8 нг/мл) и диссоциированный от Р-гликопротеина 5-FU (500 нг/мл) или цисплатин (2,4 мкг/мл). Фиг. 5: опосредуемая астроцитами защита метастатически распространяющихся в головной мозг клеток от индуцируемой цитотоксической химиотерапией гибели клеток не длится дольше 72 ч после утраты прямого контакта между астроцитами и метастатически распространяющимися в головной мозг клетками. Фиг. 6: условия определения профилей экспрессии генов позволяли проводить различия между мышиной и человеческой мРНК. Фиг. 7: 1069 генов в клетках MDA-MB-231 и 594 гена в клетках PC14Br4 характеризовались дифференциальной экспрессией. В результате двухгенного множественного сопоставления выявлена увеличенная экспрессия нескольких генов, которые, как хорошо известно, связаны с противодействием апоптозу и выживанием: глутатион-S-трансфераза 5 (GSTA5), BCL2L1, TWIST. Фиг. 8: экспрессия нескольких противоапоптозных генов и генов выживания была подтверждена на уровне белка с помощью анализа с использованием Вестерн-блоттинга. Фиг. 9: относящиеся к транскрипции генов данные были собраны из экспериментов с использованием двух циклов сокультивирования. Фиг. 10: увеличенная экспрессия ETA-R в клетках рака молочной железы человека MDA-MB-231,подвергнутых сокультивированию с астроцитами, но не с фибробластами (3 Т 3). Фиг. 11: экспрессия рАКТ клетками рака молочной железы человека MDA-MB-231, подвергнутыми сокультивированию с астроцитами/таксолом. Фиг. 12: АСТ-064992, добавленный к клеткам рака молочной железы человека MDA-MB-231 сам по себе или вместе с астроцитами или фибробластами 3 Т 3, не вызывал какие-либо поддающиеся измерению цитотоксические эффекты. Фиг. 13: АСТ-064992, добавленный к клеткам рака легкого РС 14 сам по себе или вместе с астроцитами или фибробластами 3 Т 3, не вызывал какие-либо поддающиеся измерению цитотоксические эффекты. Фиг. 14 А-D: иммуноокрашивание на ETAR и ETBR в нескольких in vivo экспериментальных моделях метастатического рака головного мозга выявляет относительно высокую экспрессию, специфически связанную с опухолями, но не с нормальными тканями головного мозга. Фиг. 15: лечение комбинацией паклитаксела и АСТ-064992 клеток рака молочной железы человекаMDA-MB-231, сокультивированных с астроцитами или с фибробластами 3 Т 3. Фиг. 16: лечение комбинацией паклитаксела и АСТ-064992 клеток рака легкого человека PC14Br4,сокультивированных с астроцитами или с фибробластами 3 Т 3. Фиг. 17: добавление АСТ-064992 к сокультурам астроцитов и опухолевых клеток ингибировало экспрессию фактора выживания рАКТ и рМАРК. Фиг. 18: фиксации и окрашиванию для визуализации метастазов в головной мозг подвергали срезы головного мозга групп, подвергнутых лечению контролем (носителем) (фиг. 18 А); темозоломидом("TMZ") 10 мг/кг перорально, ежедневно (фиг. 18 В); АСТ-064992 50 мг/кг, перорально, ежедневно (фиг. 18 С); комбинацией TMZ+ACT-064992 (фиг. 180) или комбинацией TMZ+ACT-064992, при большем увеличении (фиг. 18 Е). Фиг. 19: фиксации и окрашиванию для визуализации метастазов в головной мозг подвергали срезы головного мозга групп, подвергнутых лечению: А. контролем (инъецируемым с использованием раствора носителя); В. паклитакселом (8 мг/кг, вводимым внутрюшинно один раз в неделю); С. АСТ-064992 (50 мг/кг, вводимым перорально один раз в день); и D. Комбинацией АСТ-064992 и паклитаксела. Фиг. 20: репрезентативные срезы головного мозга из четырех групп, подвергнутых лечению, окрашивали на CD31 (маркер эндотелиальных клеток) и Ki67 (маркер клеточной пролиферации): А. контрольные мыши; В. мыши, подвергнутые лечению лишь паклитакселом; С. мыши, подвергнутые лече-2 023864 нию лишь АСТ-064992; D. мыши, подвергнутые лечению паклитакселом и АСТ-064992. Фиг. 21: срезы головного мозга из различных групп, подвернутых лечению, исследовали посредством in situ dUTP-мечения концов в месте разрыва цепей с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы (TUNEL): А. Контрольные мыши; В. мыши, подвергнутые лечению паклитакселом; С. мыши,подвергнутые лечению АСТ-064992; D. мыши, подвергнутые лечению комбинацией АСТ-064992 плюс паклитаксел. Фиг. 22: срезы головного мозгов мышей из четырех групп, подвергнутых лечению, подвергали иммуноокрашиванию для выявления совместной локализации ETAR (красного) и фосфосерина (зеленого),приводившей к оранжево-желтому цвету. А. Головной мозг от контрольных мышей. В. Головной мозг мышей, подвергнутых лечению паклитакселом. С. Головной мозг мышей, подвергнутых лечению АСТ 064992 самим по себе. D. Головной мозг мышей, подвергнутых лечению комбинацией АСТ-064992 + паклитаксел. Фиг. 23 демонстрирует исследование выживания в случае лечения АСТ 064992 и таксолом экспериментального метастаза в головной мозг клеток рака молочной железы человека MDA231. Подробное описание настоящего изобретения Определения. Используемое в настоящем описании единственное число при использовании совместно с термином "включающий" в формуле изобретения и/или описании может означать "один", но оно также соответствует значению "один или несколько", "по крайней мере один" и "один или более чем один". Более того, термины "имеющий", "содержащий" и "включающий" являются равноценными, и квалифицированный в данной области техники специалист знает, что эти термины являются терминами с возможностью расширения. Используемый здесь термин "лечение" относится к назначению субъекту терапевтически эффективного медицинского вмешательства, такого как химиотерапия, чтобы у субъекта отмечалось улучшение параметров, относящихся к раку. Улучшением является любое наблюдаемое или измеряемое улучшение, включающее изменения размера злокачественной опухоли, снижение скорости роста злокачественной опухоли или субъективных или объективных показателей боли, сопровождающей злокачественную опухоль. Таким образом, квалифицированный в данной области техники специалист понимает, что лечение может улучшить состояние пациента, но может не быть полным излечением заболевания. Используемый здесь термин "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" относится к количеству, которое приводит к ослаблению или исключению симптомов заболевания или состояния. Используемый здесь термин "имеющаяся опухоль, развившаяся в результате метастазирования в головной мозг", относится к состоящей из множества клеток опухоли головного мозга и метастазу в головной мозг, окруженному и инфильтрированному GFAP-положительными астроцитами. Существует два клинически отличных типа имеющихся опухолей, развившихся в результате метастазирования в головной мозг: микрометастазы, которые являются слишком маленькими, чтобы быть визуализированными радиологическим способом, и видимые метастазы, которые являются такими опухолями, которые являются достаточно большими, чтобы быть различимыми с помощью клинического радиологического способа, такого как магнитно-резонансная томография, компьютерная томография или позитронноэмиссионная томография. Эти метастатические очаги отличны от метастатических раковых клеток в системном кровотоке и единичных раковых клеток, проникающих из сосудов в ткань головного мозга или латентно находящихся в ней [см. в целом Johanna A. JoyceJeffrey W. Pollard, Microenvironmental regulation of metastasis, Nat Rev Cancer 9, 239-252 (April 2009)doi:10.1038/nrc2618]. Как здесь используется,"микрометастаз" предпочтительно определяют как группу конфлюэнтных раковых клеток, имеющую максимальную ширину от больше 0,2 мм и/или содержащую больше 200 клеток до 2 мм. Предпочтительнее "микрометастаз" определяют как группу конфлюэнтных раковых клеток с максимальной шириной от 0,2 до 2 мм. См. The AJCC Cancer Staging Manual and Handbook, 7th ed. (2010), Edge, S.В.; Byrd,D.R.; Compton, C.C.; Fritz, A.G.; Greene, F.L.; Trotti, A. (Eds.), ISBN: 978-0-387-88440-0. Альтернативным предпочтительным определением "микрометастаза" является группа по крайней мере из 1000 конфлюэнтных раковых клеток и с самым большим размером по ширине от по крайней мере 0,1 мм вплоть до 1 мм. Микрометастазы являются, как правило, невидимыми при ЯМР-томографии с использованием стандартных контрастных веществ или при других клинических методах визуализации. Однако в случае некоторых раков радиоактивные антитела, направленные против селективных опухолевых антигенов (например, Her2 в случае метастазирования рака молочной железы), позволят визуализировать микрометастаз. Другие непрямые способы выявления включают просачивание контрастного вещества в места метастазирования в головной мозг вследствие индуцируемого VEGF пропотевания жидкости через сосуды[Yano S; et al. (2000), Expression of vascular endothelial growth factor is necessary but not sufficient for production and growth of brain metastasis. Cancer research 2000; 60(17): 4959-4967]. Для выявления микрометастазов могут также применяться более чувствительные способы визуализации. Например, объем циркулирующий крови можно визуализировать с помощью ЯМР, используя альтернативное контрастное вещество USPIO (Molday Iron, Biopal, Worcester, MA, продаваемое как Molday ION), для выявления мик-3 023864cell extravasation and regional blood volume in an experimental brain metastasis model. Clin Exp Metastasis. 2009; 26(5): 403-414. Epub 2009 Mar 11]. Используемый здесь термин "опосредуемая астроцитом защита" относится к способности астроцита к уменьшению цитотоксичности химического вещества по отношению к другому типу клеток при прямом физическом контакте с астроцитом. Этот физический контакт включает астроциты, соединенные с раковыми клетками, в частности, через посредство соединения в виде нексуса (GJC). Используемый здесь термин "индуцируемая цитотоксической химиотерапией гибель клеток" относится к индукции апоптоза или некротической гибели клеток с помощью цитотоксического химического вещества. Большинство используемых для лечения химиотерапевтических средств действуют с уничтожением быстро делящихся опухолевых клеток таким образом. Используемый здесь термин "антагонист рецепторов эндотелина" относится к классу соединений,признанных в данной области техники в качестве таковых, и, в частности, к соединению, которое, после подвергания "Анализу для определения IC50 по отношению к ЕТА или ЕТВ", описанному в настоящем патенте, характеризуется IC50, равной или меньшей 1 мкМ, по отношению к ЕТА, по отношению к ЕТВ или по отношению и к ЕТА, и к ЕТВ. ERA представляет собой лекарственное средство, которое препятствует взаимодействию рецепторов эндотелина с ЕТ-1 или не позволяет ETR реагировать на связанный ЕТ 1. Существуют два основных вида ERA: селективные ERA, такие как ситаксентан, амбрисентан и атрасентан, которые воздействуют на рецепторы ЕТА и ERA с двойной специфичностью, такие как бозентан,которые воздействуют на оба рецептора ЕТА и ЕТВ. Приводимые в качестве примеров члены класса соединений ERA можно найти в патентной литературе, приведенной в [НАМ Mucke "Small-molecule endothelin receptor antagonists: A review of patenting activity across therapeutic areas", IDrugs 2009, 12: 366-375]. Репрезентативные ERA, которые уже были исследованы в ходе клинических испытаний на людях или разрешены для медицинского применения, включают ситаксентан, тезосентан, клазосентан, амбрисентан, бозентан, мацитентан (также известный как АСТ-064992) и/или атрасентан. Используемый здесь термин "антагонист ЕТА" относится к соединению, которое, после подвергания"Анализу для определения IC50 по отношению к ЕТА или ЕТВ", описанному в настоящем патенте, характеризуется IC50, равной или меньшей 1 мкМ, по отношению к ЕТА. Используемый здесь термин "антагонист ЕТВ" относится к соединению, которое, после подвергания"Анализу для определения IC50 по отношению к ЕТА или ЕТВ", описанному в настоящем патенте, характеризуется IC50, равной или меньшей 1 мкМ, по отношению к ЕТВ. Используемый здесь термин "антагонист рецепторов эндотелина с двойной специфичностью" или"ERA с двойной специфичностью" относится к соединению, которое, после подвергания "Анализу для определения IC50 по отношению к ЕТА или ЕТВ", описанному в настоящем патенте, характеризуется IC50,равной или меньшей 1 мкМ, по отношению к ЕТА, и IC50, равной или меньшей 1 мкМ, по отношению к ЕТВ. ERA с двойной специфичностью включают бозентан и мацитентан. Используемый здесь термин "цитотоксическое химиотерапевтическое средство" относится к веществу, индуцирующему апоптоз или некротическую гибель клеток. Примеры цитотоксических химиотерапевтических средств, которые могут использоваться в комбинации с ERA в соответствии с настоящим изобретением, включают: алкилирующие агенты (например, мехлоретамин, хлорамбуцил, циклофосфамид, ифосфамид,стрептозоцин, кармустин, ломустин, мелфалан, бусульфан, дакарбазин, темозоломид, тиотепу или алтретамин); лекарственные средства на основе платины (например, цисплатин, карбоплатин или оксалиплатин); являющиеся антиметаболитами лекарственные средства (например, 5-фторурацил, капецитабин, 6 меркаптопурин, метотрексат, гемцитабин, цитарабин, флударабин или пеметрексед); противоопухолевые антибиотики (например, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, актиномицин-D, блеомицин, митомицин-С или митоксантрон); митотические ингибиторы (например, паклитаксел, доцетаксел, иксабепилон, винбластин, винкристин, винорелбин, виндезин или эстрамустин) и ингибиторы топоизомеразы (например, этопозид, тенипозид, топотекан, иринотекан, дифломотекан или эломотекан)."Суперсенсибилизацию" или "суперсенсибилизировать" определяют как относительное увеличение гибели клеток, вызванной цитотоксическим химиотерапевтическим средством(ами), при физическом контакте с астроцитами по сравнению с таковой, наблюдаемой в клетках либо в отсутствие астроцитов,либо без прямого физического контакта с астроцитами. Термин "одновременно" или "одновременный", при ссылке на терапевтическое применение, означает в настоящем изобретении, что рассматриваемое терапевтическое применение заключается во введении двух или более активных ингредиентов одним и тем же способом и в одно и то же время. Термин "отдельно" или "отдельный", при ссылке на терапевтическое применение, означает в настоящем изобретении, что рассматриваемое терапевтическое применение заключается во введении двух или более активных ингредиентов в примерно одно и то же время по крайней мере двумя отличными способами. Под терапевтическим введением "в течение периода времени" подразумевается в настоящем изобретении введение двух или более ингредиентов в различные моменты времени и, в частности, способ введения, в соответствии с которым полное введение одного из активных ингредиентов завершается до начала введения другого или других. Таким образом, можно вводить один из активных ингредиентов в течение нескольких дней, недель или месяцев до введения другого активного ингредиента или ингредиентов. В этом случае не имеет место одновременное введение. Описание В паренхиме головного мозга роль астроцитов в поддержании гомеостаза является общепризнанной. Астроциты окутывают каждый кровеносный сосуд специализированными синаптическими нервными окончаниями и устанавливают связь с другими клетками головного мозга, такими как нейроны. Эта уникальная структура позволяет астроцитам переносить необходимые питательные вещества, такие как глюкоза и аминокислоты, из кровотока к получающим помощь нейронам, и недавно было установлено,что гликолиз в астроцитах регулирует нейронную активность, так называемая "нейрон-астроцитная метаболическая связь". В патологических условиях, таких как гипоксия, ишемия и дегенеративные заболевания, астроциты станут активированными и будут экспрессировать белок, названный GFAP. Установлено, что GFAP-реагирующие астроциты защищают нейроны от различных проблем и спасают нейроны от эксайтотоксичности, вызванной накоплением глутамата. Активированные астроциты могут также предохранять нейроны от апоптоза, вызываемого этанолом, перекисью водорода, и катализируемой медью цитотоксичности цистеина. Клинические метастазы в головной мозг обычно окружены и инфильтрированы активированнымиvessels. J. Neurosurg. 62: 414-418]. Авторы настоящего изобретения подтвердили, что это явление воспроизводится в описанной ниже модели с использованием ксенотрансплантации. Согласно этому представлены различные варианты осуществления настоящего изобретения. 1) Во-первых, настоящее изобретение относится к антагонисту рецепторов эндотелина для применения для предупреждения или лечения метастазов в головной мозг в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, лучевой терапией или с тем и с другим. 2) В соответствии с один основным подвариантом варианта осуществления 1) антагонист рецепторов эндотелина будет служить для применения в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством. 3) В соответствии с один подвариантом варианта осуществления 2) цитотоксическое химиотерапевтическое средство будет включать (и, в частности, представлять собой) алкилирующий агент. 4) В частности, алкилирующий агент варианта осуществления 3) будут выбирать из группы, состоящей из мехлоретамина, хлорамбуцила, циклофосфамида, ифосфамида, стрептозоцина, кармустина,ломустина, мелфалана, бусульфана, дакарбазина, темозоломида, тиотепы и алтретамина. 5) В соответствии с другим подвариантом варианта осуществления 2) цитотоксическое химиотерапевтическое средство будет включать (и, в частности, представлять собой) лекарственное средство на основе платины. 6) В частности, лекарственное средство на основе платины варианта осуществления 5) будут выбирать из группы, состоящей из цисплатина, карбоплатина и оксалиплатина. 7) В соответствии с еще одним подвариантом варианта осуществления 2) цитотоксическое химиотерапевтическое средство будет включать (и, в частности, представлять собой) являющееся антиметаболитом лекарственное средство. 8) В частности, являющееся антиметаболитом лекарственное средство варианта осуществления 7) будут выбирать из группы, состоящей из 5-фторурацила, капецитабина, 6-меркаптопурина, метотрексата,гемцитабина, цитарабина, флударабина и пеметрекседа. 9) В соответствии с дальнейшим подвариантом варианта осуществления 2) цитотоксическое химиотерапевтическое средство будет включать (и, в частности, представлять собой) противоопухолевый антибиотик. 10) В частности, противоопухолевый антибиотик варианта осуществления 9) будут выбирать из группы, состоящей из даунорубицина, доксорубицина, эпирубицина, идарубицина, актиномицина-D,блеомицина, митомицина-С и митоксантрона. 11) В соответствии с другим подвариантом варианта осуществления 2) цитотоксическое химиотерапевтическое средство будет включать (и, в частности, представлять собой) митотический ингибитор. 12) В частности, митотический ингибитор варианта осуществления 11) будут выбирать из группы,состоящей из паклитаксела, доцетаксела, иксабепилона, винбластина, винкристина, винорелбина, виндезина и зстрамустина. 13) В соответствии с еще одним подвариантом варианта осуществления 2) цитотоксическое химиотерапевтическое средство будет включать (и, в частности, представлять собой) ингибитор топоизомеразы 14) В частности, ингибитор топоизомеразы II варианта осуществления 13) будут выбирать из группы, состоящей из этопозида, тенипозида, топотекана, иринотекана, дифломотекана и эломотекана. 15) В предпочтительном подварианте варианта осуществления 2) цитотоксическое химиотерапевтическое средство будут выбирать из группы, состоящей из паклитаксела, доксорубицина, винбластина,винкристина, 5-фторурацила, цисплатина, циклофосфамида, этопозида, тенипозида, митомицина-С, иринотекана, винорелбина, ифосфамида и темозоломида (и, в частности, из пакситаксела и темозоломида). 16) В частности, цитотоксическое химиотерапевтическое средство варианта осуществления 15) будут выбирать из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида. 17) В соответствии с предпочтительным подвариантом варианта осуществления 16) антагонист рецепторов эндотелина варианта осуществления 16) будут выбирать из группы, состоящей из бозентана,мацитентана и смеси мацитентана и бозентана (и будет исключительно представлять собой мацитентан). 18) Настоящее изобретение также относится к антагонисту рецепторов эндотелина для применения в комбинации по крайней мере с одним из цитотоксических химиотерапевтических средств, упомянутых в одном из вариантов осуществления 2)-17), и с лучевой терапией. 19) В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления этого изобретения, антагонист рецепторов эндотелина, применяемый в вариантах осуществления 1)-18), будет включать (и, в частности,представлять собой) антагонист рецепторов эндотелина с двойной специфичностью. 20) В частности, антагонист рецепторов эндотелина с двойной специфичностью варианта осуществления 19) будут выбирать из группы, состоящей из бозентана, мацитентана и смеси бозентана и мацитентана. 21) В особенно предпочтительном варианте осуществления антагонист рецепторов эндотелина с двойной специфичностью варианта осуществления 20) будет представлять собой мацитентан. 22) В соответствии с одним подвариантом вариантов осуществления 1)-21) антагонист рецепторов эндотелина и цитотоксическое химиотерапевтическое средство будут вводиться отдельно. 23) В соответствии с другим подвариантом вариантов осуществления 1)-21) антагонист рецепторов эндотелина и цитотоксическое химиотерапевтическое средство будут вводиться одновременно. 24) В соответствии с еще одним подвариантом вариантов осуществления 1)-21) антагонист рецепторов эндотелина и цитотоксическое химиотерапевтическое средство будут вводиться в течение периода времени. 25) В соответствии с еще одним основным подвариантом варианта осуществления 1) антагонист рецепторов эндотелина будет служить для применения в комбинации с лучевой терапией (в соответствии с чем эта лучевая терапия предпочтительно является лучевой терапией всего головного мозга или стереотаксической радиохирургией). 26) В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления этого изобретения антагонист рецепторов эндотелина, применяемый в варианте осуществления 25), будет включать (и, в частности,представлять собой) антагонист рецепторов эндотелина с двойной специфичностью. 27) В частности, антагонист рецепторов эндотелина с двойной специфичностью варианта осуществления 26) будут выбирать из группы, состоящей из бозентана, мацитентана и смеси бозентана и мацитентана. 28) В особенно предпочтительном варианте осуществления антагонист рецепторов эндотелина с двойной специфичностью варианта осуществления 27) будет представлять собой мацитентан. 29) В другом основном варианте этого изобретения антагонист рецепторов эндотелина для применения с цитотоксическим химиотерапевтическим средством в соответствии с одним из вариантов осуществления 2)-23) будет служить для применения вместе с лучевой терапией (в соответствии с чем эта лучевая терапия предпочтительно является лучевой терапией всего головного мозга или стереотаксической радиохирургией). 30) Другим основным вариантом этого изобретения, комбинируемым с любым одним или несколькими из вышеприведенных вариантов осуществления 1)-29), является антагонист рецепторов эндотелина для применения при лечении имеющейся опухоли, развившейся в результате метастазирования в головной мозг, у субъекта, причем имеющаяся опухоль, развившаяся в результате метастазирования в головной мозг, представляет собой микрометастатическую опухоль, такую как микрометастатическая опухоль, выбираемая из группы, состоящей из опухоли вследствие микрометастазирования рака легкого,рака молочной железы, рака ободочной кишки, меланомы или карциномы почек в головной мозг. 31) Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования опосредуемой астроцитами защиты подвергшейся метастазированию в головной мозг клетки, который включает применение эффективного количества антагониста рецепторов эндотелина к подвергшейся метастазированию в головной мозг клетке и астроциту для ингибирования опосредуемой астроцитами защиты. 32) Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу варианта осуществления 31), который дополнительно включает применение эффективного количества по крайней мере одного цитотоксического химиотерапевтического средства к клетке метастаза в головной мозг. 33) Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу варианта осуществления 31), который дополнительно включает подвергание клетки метастаза в головной мозг лучевой терапии (в соответствии с чем эта лучевая терапия предпочтительно является лучевой терапией всего головного мозга или стереотаксической радиохирургией). 34) Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу варианта осуществления 31), который дополнительно включает применение эффективного количества по крайней мере одного цитотоксического химиотерапевтического средства к клетке метастаза в головной мозг и подвергание клетки метастаза в головной мозг лучевой терапии (в соответствии с чем эта лучевая терапия предпочтительно является лучевой терапией всего головного мозга или стереотаксической радиохирургией). 35) Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу производства лекарственного средства для применения в соответствии с любым из вышеприведенных вариантов 1)-34) и любыми их комбинациями. Предпочтительно лекарственное средство, произведенное вышеприведенным способом, дополнительно помещают в промышленную упаковку с инструкций в отношении выполнения одного или нескольких вариантов 1)-34) и любых их комбинаций. 36) Настоящее изобретение, кроме того, относится к антагонисту рецепторов эндотелина для применения для снижения риска и/или уменьшения степени распространения метастазов в головной мозг, в том числе микрометастаза в головной мозг, в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, лучевой терапией или с тем и с другим, в соответствии с любым одним или несколькими из вариантов 1)-34) и любыми их комбинациями. Экспериментальная часть Эксперимент 1. Иммунофлуоресцентный анализ метастаза в головной мозг. Материалы и методы. Экспериментальные метастазы в головной мозг были порождены посредством инъекции клеток аденокарциномы легкого человека PC14Br4 во внутреннюю сонную артерию бестимусных мышей (S1). Спустя 5 недель мышей умерщвляли и образцы тканей подвергали обработке в соединении ОСТ в случае замороженных срезов, как описано ранее (S2). Делали срезы тканей (8-10 мкм), их монтировали на положительно заряженные предметные стекла и высушивали на воздухе в течение 30 мин. Фиксацию тканей выполняли, используя протокол, состоящий из трех последовательных погружений в ледяные растворы ацетона, смеси 50:50 (об./об.) ацетон: хлороформ и ацетона (каждое в течение 5 мин). Затем образцы трижды промывали PBS, инкубировали с раствором для блокирования белков, содержащим 5% нормальной лошадиной сыворотки и 1% нормальной козьей сыворотки в PBS, в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем инкубировали с кроличьим поликлональным антителом против GFAP(Biocare Medical, Concord, CA) в разведении 1:400 в течение 18 ч при 4 С. Образцы промывали четыре раза PBS в течение 3 мин в случае каждой промывки, а затем инкубировали в течение 1 ч с козьим антителом против Су 5 кролика (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) в разведении 1:1500. Контрольные образцы метили с использованием той же самой концентрации подобранного по изотипу контрольного антитела и козьего антитела против Су 5 кролика. Все образцы промывали, а затем подвергали короткой инкубации с красителем для нуклеиновых кислот Sytox зеленым (Eugene, OR). Покровные стекла заделывали с использованием раствора глицерина в PBS, содержащего 0,1 моль/л пропилгалата(Sigma), для минимизации выцветания флуоресцентных красителей. Конфокальные изображения были получены в системе лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss, Inc., Thornwood,NY), оснащенной микроскопом с электроприводом Axioplan, аргоновым лазером, гелий-неоновым лазером, программным обеспечением для контроля и получения изображений LSM 510 и подходящими фильтрами (Chroma Technology Corp., Brattleboro, VT). 18 комбинированных изображений были создано с помощью программного обеспечения Photoshop(Adobe Systems, Inc., Mountain View, CA). Результаты. Результаты истекали из цветных изображений (не продемонстрированных) прореагировавших иммуногистохимически образцов. Опухолевые клетки были окружены и инфильтрированы GFAPположительными (красными) астроцитами. Это эксперимент подтвердил предшествующие данные наблюдений инфильтрации астроцитами в клинических образцах метастазов в головной мозг. Такая же инфильтрация GFAP-положительными астроцитами наблюдалась при использовании сингенной мышиной модели. При иммуногистохимическом анализе карциномы легких Льюиса у мышей (3LL) в головном мозге мыши С 57, делящиеся клетки 3LL (PCNA-положительные, синие) были инфильтрированы и окружены активированными астроцитами (GFAP-положительными, коричневыми). Вместе эти эксперименты обосновывали модель с использованием ксенотрансплантатов клеток человека на мышах, которая воспроизводила явление, наблюдаемое в клинических образцах человека и в сингенной мышиной модели. Поэтому одним аспектом настоящего изобретения является in vivo модель с использованием клеток человека для метастазирования в головной мозг мышей, которая применима, например, при изучении явления развившегося в результате метастазирования в головной мозг рака у людей. Эксперимент 2. Исследования с использованием сканирующей электронной микроскопии. После установления того, что мышиные астроциты взаимодействуют in vivo с опухолевыми клетками человека при образовании метастаза в головном мозге таким же образом, как это наблюдается в первичных клинических образцах от людей, авторы настоящего изобретения исследовали взаимодейст-7 023864 вия этих двух типов клеток in vitro в простейшей системе с использованием сокультивирования. Не было точно известно, приведет ли к какому-либо межклеточному взаимодействию такая система, гораздо меньше физиологически соответствующая in vivo ситуации, описанной выше. Поэтому неожиданным было обнаружение, что межклеточные взаимодействия между линиями метастатических раковых клеток человека и мышиными астроцитами достигается in vitro. Материалы и методы. Линии клеток и условия культивирования. Линия клеток рака молочной железы человека, MDA-231(S3), метастатически распространяющийся в головной мозг вариант линии клеток аденокарциномы легкого человека PC14Br4 (Si) и мышиные фибробласты NIH 3 Т 3 поддерживали в виде монослойных культур в минимальной поддерживающей среде полной среды Игла (СМЕМ), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS; HyClone, Logan, UT), L-глютамином-пируватом, заменимыми аминокислотами,двукратным раствором витаминов и пенициллином-стрептомицином (GIBCO/Invitrogen, Carlsbad, CA). Все используемые для культуры тканей реагенты не содержали эндотоксин, что определено с помощью анализа с использованием лизата амебоцитов Limulus (Associate of Cape Cod, Woodshole, MA), а линии клеток не содержали следующие патогены мышей: Mycoplasma spp, хантавирус, вирус гепатита, минутвирус, аденовирус (MAD1, MAD2), цитомегаловирус, вирус оспы мышей, повышающий уровень лактатдегидрогеназы вирус, вирус полиомы и вирус Сендай (анализ которых проведен Research Animal Diagnostic Laboratory, University of Missouri, Columbia, MO). Используемые в этом исследовании клетки были из замороженного стока, и все эксперименты проводили в рамках 10 in vitro пассажей после оттаивания. Выделение и поддержание мышиных астроцитов. Новорожденных мышей, гомозиготных по чувствительному к температуре большому Т-антигену SV40, (мышей H-2Kb-tsA58; гибридовCBA/caxC57BL/10; Charles River Laboratories, Wilmington, MA) подвергали эвтаназии в камере с углекислым газом, и обычным образом подготавливали кожу к хирургическому вмешательству (S4). Стерильные микропинцеты (Roboz Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD) использовали, чтобы сдвинуть кожу с черепа, а микроножницы использовали для создания дугового разреза сзади от отверстия левого уха до отверстия правого уха. Другой разрез делали по срединной линии головного мозга, и череп разделяли для обеспечения доступа в полость черепа. Зрительные нервы обрезали, и головной мозг извлекали с использованием пинцета с тупыми концами и помещали в 100-мм холодный как лед забуференный фосфатом солевой раствор (PBS). Целые неокортексы рассекали, и гиппокамп и внутренние структуры удаляли с оставлением лишь корковых слоев. Оболочки головного мозга удаляли, и корковые слои измельчали с помощью скальпеля и подвергали расщеплению в течение 30 мин при 37 С в модифицированной Дульбекко поддерживающей среде (DMEM), содержащей 0,1% коллагеназы (150 Е/мл; Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ) и 40 пг/мл дезоксирибонуклеазы (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Корковую ткань затем растирали в порошок в DMEM, содержащей 10% FBS, и фильтровали через 50-пм стерильную сетку. Результирующую суспензию одиночных клеток высевали в 75-см 2 матрасы для культивирования тканей, которые были предварительно покрыты 5 мкг/мл мышиного ламинина (Sigma). Клеткам позволяли расти в течение 7 дней в DMEM, содержащей 10% FBS и добавки (см. выше), в атмосфере,содержащей 8% углекислого газа (для создания надлежащего рН при 33 С). В этот момент времени астроглиальные клетки образовывали конфлюирующий монослой с нейронами, олигодендроцитами и фибробластами, растущими наверху. Эти загрязняющие клетки удаляли посредством встряхивания при вращении матрасов в течение ночи при 250 об/мин в теплой комнате. Результирующие культуры состояли из более чем 95% астроцитов, что определено по иммунореактивности с антителами, направленными против GFAP. Эти культуры наращивали, процедуру повторяли, и процент астроцитов в этих культурах,как определено, превышал 99%. Получение с помощью сканирующей электронной микроскопии изображений подвергнутых культивированию опухолевых клеток и астроцитов. Клетки рака молочной железы человека MDA-MB-231 и мышиные астроциты высевали в DMEM, содержащей 5% FBS, на стерилизованные покровные стекла в 24-луночных планшетах с плотностью 2,4104. Спустя 48 ч покровные стекла извлекали и фиксировали в течение 1 ч при комнатной температуре в растворе, содержащем 3% глутаральдегида/2% параформальдегида/7,5% сахарозы в 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,3). Затем образцы промывали 0,1 М какодилатным буфером и после фиксировали в течение 1 ч с помощью 1% забуференного какодилатом раствора тетроксида осмия, содержащего 7,5% сахарозы. Образцы промывали 0,1 М какодилатным буфером, а затем дистиллированной водой и один за другим обрабатывали в течение 30 мин в темноте Milliporeпрофильтрованным 1% раствором дубильной кислоты в воде, промывали дистиллированной водой иMillipore-профильтрованным 1% раствором уранилацетата в воде в течение 1 ч в темноте. Образцы тщательно промывали дистиллированной водой, обезвоживали благодаря ряду растворов этанола в возрастающих концентрациях, а затем перемещали на 5 мин каждый раз в ряд ступенчато возрастающих концентраций гексаметилдисилазана, и допускали их высыхание на воздухе в течение ночи. Образцы монтировали на угольные вставки с удвоенной толщиной (Ted Pella, Inc., Redding, CA), которые были предварительно вставлены в алюминиевые оправы для образцов (Electron Microscopy Sciences, Ft. Washington,PA). Затем образцы покрывали в вакууме, используя испаритель Balzer MED 010 (Technotrade International, Manchester, NH), платиновым сплавом на толщину 25 нм и затем тотчас же покрывали в вакууме углеродом. Образцы перемещали в эксикатор для исследования позднее. Образцы исследовали, используя сканирующую электронную микроскопию JSM-5910 (JEOL, Inc., Peabody, MA), при ускоряющем напряжении = 5 кВ. Результаты. Результаты представлены на фиг. 1. In vitro культуру клеток рака молочной железы MDA-MB-231(Т) и мышиных астроцитов (А) оценивали с помощью сканирующей электронной микроскопии. Несомненен прямой контакт между астроцитами (с удлиненными отростками-ножками) и опухолевыми клетками. Один астроцит может контактировать с множеством опухолевых клеток. Эти контакты, как представляется, являются полностью сформированными нексусами что-то вроде тех, которые наблюдаются между астроцитами и нейронами центральной нервной системы. Схожие результаты отмечены при использовании линий клеток меланомы, рака молочной железы и рака легкого (не представленные данные). Эксперимент 3. Исследования нексусов. Для дальнейшей валидации функционального характера нексусов, продемонстрированных на фиг. 1, авторы настоящего изобретения выполнили эксперименты по переносу красителя, чтобы выяснить,являются ли функциональными нексусы, подобные структурам, наблюдаемым в эксперименте 2. Материалы и методы. Соединение в виде нексуса. Соединение в виде нексуса между реципиентными опухолевыми клетками (MDA-MB-231) и донорными клетками (астроцитами, клетками 3 Т 3, MDA-MB-231) исследовали с помощью проточной цитометрии, в случае которой определялся перенос красителя. Вкратце, реципиентные клетки (300000 клеток/лунку) засевали в 6-луночный планшет и культивировали в течение ночи. В этот момент времени донорные клетки метили в течение 45 мин 1 мкг/мл зеленым кальцеином-АМ (Molecular Probes) с последующей тщательной отмывкой. Донорные клетки (60000 клеток/лунку) подвергали сокультивированию в течение 5 ч с реципиентными клетками либо напрямую, либо в камере с трансвелом (Transwell-Boyden Chamber, с составляющим 0,4 нм размером пор; Costar, Corning, NY). Клетки собирали, промывали, фиксировали в этиловом спирте и исследовали с помощью проточной цитометрии. Образование нексусов рассчитывали как процент сдвинутого пика ФИТЦ (S9-S11). Результаты. Как продемонстрировано на фиг. 2, при сокультивировании астроцитов и метастатических раковых клеток выявлялся перенос красителя между подвергнутыми сокультивированию клетками. Используемая авторами настоящего изобретения система с использованием сокультивирования, таким образом, приводит к образованию активных нексусов между мышиными астроцитами и линиями метастатических раковых клеток человека. Контрольные эксперименты с использованием трансвела показывают, что нексус является подлинным межклеточным взаимодействием. Поэтому вторым аспектом настоящего изобретения является in vitro система с использованием сокультивирования мышиных астроцитов и метастатических клеток человека, которая применима, например, при исследовании явления взаимодействия метастатически распространяющихся в головной мозг раковых клеток человека с астроцитами в манипулируемой ex vivo ситуации. Эксперимент 4. Анализы защиты от химиотерапии. Моделирование устойчивости к химиотерапии метастаза в головной мозг является и будет основным применением вышеприведенных и in vivo системы с использованием модели, и vitro системы с использованием сокультивирования клеток. Поскольку система с использованием сокультивирования на основе клеток является более податливой экспериментальному манипулированию, ее в дальнейшем оценивали для определения, воспроизводит ли система с использованием культивирования на основе клеток наблюдаемую in vivo устойчивость к химиотерапии метастазов в головной мозг. Материалы и методы.In vitro исследование защиты от химиотерапии с использованием сокультивирования. В астроциты и фибробласты NIH 3 Т 3 трансфицировали гены GFP, как описано ранее (S5, S6). Опухолевые клеткимишени, астроциты или фибробласты 3 Т 3 получали из 60-70% конфлюэнтной культуры посредством подвергания короткому (2-минутному) воздействию 0,25% трипсина в растворе 0,1% EDTA/PBS. Клетки выбивали посредством отрывистого обстукивания матрасов для культивирования и ресуспендировали в СМЕМ. Мышиные астроциты, фибробласты 3 Т 3 и опухолевые клетки высевали сами по себе или в виде сокультуры в составляющем 1:2 соотношении опухолевых клеток и астроцитов/клеток 3 Т 3 в каждую лунку диаметром 35 мм стерильного 6-луночного планшета для культивирования тканей. Клеткам позволяли прикрепляться в течение ночи во влажном инкубаторе при 37 С в атмосфере, состоящей из 6,4% углекислого газа плюс воздух. Затем культуры промывали и инкубировали с новой СМЕМ (в качестве отрицательного контроля) или со средой, содержащей различные концентрации TAXOL (паклитаксела;NDC 0015-3476-30, Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ) и других химиотерапевтических средств (см. ниже). Спустя 72 ч меченные GFP астроциты или клетки NIH 3 Т 3 сортировали, и апоптозную фракцию опухолевых клеток определяли посредством окрашивания иодидом пропидия и анализа с использованием FACS (клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) (см. ниже). Для определения, является ли прямой контакт между опухолевыми клетками и астроцитами (или фибробластами, служащими в качестве контроля) необходимым условием для вызова индукции устойчивости к химиотерапии, было выпол-9 023864 нено исследование с использованием сокультивирования, используя камеру Transwell-Boyden, т.е. засева опухолевых клеток в камеру, а иммортализованных астроцитов (или фибробластов) в лунку. После инкубации в течение 72 ч относительный показатель апоптоза опухолевых клеток определяли, как описано ниже. Во втором ряде in vitro исследований авторы настоящего изобретения определили, является ли опосредуемая астроцитами индукция устойчивости опухолевых клеток к химиотерапевтическим средствам кратковременной или долговременной. Клетки рака легкого человека PC14Br4 подвергали сокультивированию либо с астроцитами, либо с фибробластами 3 Т 3 в среде самой по себе или в среде, содержащей 5 нг/мл паклитаксела. Спустя 72 ч астроциты или клетки 3 Т 3 отделяли от опухолевых клеток с помощьюFACS, и относительный показатель апоптоза опухолевых клеток определяли во множестве лунок посредством окрашивания иодидом пропидия, как описано ниже. Из параллельных лунок извлекали оставшиеся в живых опухолевые клетки, и их пересевали на отличные монослои из астроцитов или клеток 3 Т 3. Эти сокультуры содержали опухолевые клетки, сначала подвергнутые сокультивированию с астроцитами, а затем либо с астроцитами, либо с клетками 3 Т 3, или опухолевые клетки, сначала подвергнутые культивированию с клетками 3 Т 3, а затем либо с клетками 3 Т 3, либо с астроцитами. При втором цикле в сокультуры затем вносили среды, содержащие 5 нг/мл паклитаксела. Спустя 72 ч относительный показатель апоптоза опухолевых клеток определяли посредством окрашивания иодидом пропидия и анализа с использованием FACS. Подготовка к окрашиванию иодидом пропидия и анализу с использованием FACS. Супернатантные среды, содержащие плавающие клетки, собирали из каждой чашки в 15-мл коническую центрифужную пробирку. Прикрепленные клетки собирали посредством подвергания клеток короткому воздействию 0,25% трипсина в растворе, содержащем 0,1% EDTA/PBS. Клетки объединяли с соответствующими супернатантными средами. Образцы осаждали с помощью центрифугирования при 100g в течение 5 мин. Осадки ресуспендировали в 10 мл HBSS и далее осаждали при 100g в течение 5 мин. Образцы ресуспедировали с помощью вортекса и клетки фиксировали в 1 мл 1% параформальдегида в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем образцы переносили в микроцентрифужные пробирки из полипропилена и подвергнутые фиксации клетки промывали в 1 мл PBS, а затем осаждали при 10000g в течение 1 мин. Осадки ресуспендировали с помощью вортекса и клетки фиксировали в течение ночи в 1 мл этилового спирта при -20 С. Впоследствии клетки встряхивали и осаждали с использованием микроцентрифуги при 10000g в течение 1 мин. Затем образцы встряхивали и осадки ресуспендировали и окрашивали в 300 раствора иодида пропидия (50 мкг/мл; каталожныйР 4864, Sigma), содержащего РНКазу (15 мкг/мл; каталожныйА 7973, Promega, Madison, WI), в течение 20-30 мин при 37 С. Наконец, образцы переносили в 5-мл пластмассовые пробирки для культивирования для анализа с использованием FACS, используя цитометр Coulter EPICS (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA). Относительный показатель апоптоза определяли с помощью сопоставления показатель апоптоза опухолевых клеток/показатель апоптоза опухолевых клеток и иммортализованных астроцитов или опухолевых клеток и фибробластов NIH 3 Т 3100(%) (S7). Результаты. Культивирование клеток рака молочной железы человека MDA-МВ-231 или клеток рака легкого человека PC14Br4 с астроцитами (но не с фибробластами 3 Т 3) снижало относительный показатель апоптоза (т.е. увеличивало устойчивость к химиотерапевтическим средствам) опухолевых клеток, подвергнутых инкубации в течение 72 ч с паклитакселом (5 нг/мл), на 58,38,9% (среднее значениесреднеквадратическое отклонение, Р 0,01) и 61,86,7% (среднее значениесреднеквадратическое отклонение, Р 0,05) соответственно (показатель апоптоза сопоставляли с использованием критерия Стьюдента) (фиг. 3). Это снижение зависело от прямого контакта между опухолевыми клетками и астроцитами. Авторы настоящего изобретения основывают этот вывод на данных, показывающих, что, когда опухолевые клетки и астроциты были разделены полупроницаемой мембраной (Transwell-Boyden Chamber, мембраной с составляющим 0,4 пм размером пор; Costar, Corning, NY), эффект защиты астроцитами от химиотерапевтических средств не отмечался. Сокультивирование опухолевых клеток с фибробластами 3 Т 3 не защищало опухолевые клетки от химиотерапии (фиг. 3). Сокультивирование опухолевых клеток человека с альтернативным контролем, используя фибробласты, выделенные от мыши H-2kb-tsA58,также не защищало опухолевые клетки от химиотерапевтических средств (не представленные данные). Аналогичные результаты были отмечены при использовании стандартных анализов на основе МТТ (34,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолий бромида) для определения степени цитотоксичностиsoluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture". Cancer Communications 3 (7): 207-212.] Эти данные обосновывают описанную здесь систему с использованием сокультивирования на основе клеток в качестве системы, воспроизводящей явление устойчивости метастаза в головной мозг к химиотерапии. Неожиданная способность системы с использованием сокультивирования к воспроизводству устойчивости к химиотерапии, таким образом, делает ее полностью подходящей для применения при исследовании механизма устойчивости к химиотерапии и возможных терапевтических вмешательств для аннулирования устойчивости к химиотерапии у имеющегося метастаза в головной мозг in vivo. Для расширения этих первоначальных экспериментов авторы настоящего изобретения проверили несколько дополнительных химиотерапевтических средств, типичных представителей основных классов лекарственных средств, используемых на сегодняшний день. Клетки рака легкого человека PC14Br4 культивировали сами по себе или с астроцитами (для прямого межклеточного контакта) в среде, содержащей ассоциированный с Р-гликопротеином адриамицин (200 нг/мл), паклитаксел (5 нг/мл), винбластин(2,4 мкг/мл). Сокультивирование с астроцитами индуцировало значимую (Р 0,01) защиту от всех лекарственных средств (фиг. 4). Это неожиданное обнаружение служит дополнительной валидацией системы с использованием сокультивирования на основе клеток. Система с использованием культивирования клеток показывает надежность устойчивости к химиотерапии, индуцируемой астроцитами, до некоторой степени, которая полностью сопоставима с устойчивостью к химиотерапии метастаза в головной мозг,наблюдаемой in vivo в клинической ситуации. Поэтому третьим аспектом настоящего изобретения является in vitro исследование на основе клеток устойчивости к химиотерапии, которое применимо, например, при исследовании явления опосредуемой астроцитами защиты клеток метостазов в головной мозг от индуцируемой цитотоксической химиотерапией гибели клеток. В конкретных вариантах осуществленияin vitro исследование на основе клеток устойчивости к химиотерапии может использоваться для скрининга одного или нескольких являющихся кандидатами химиотерапевтических средств для оценки степени опосредуемой астроцитами защиты от цитотоксических эффектов химиотерапевтических агентов. Дополнительные эксперименты, резюмированные на фиг. 5, показывают, что опосредуемая астроцитами защита метастатически распространяющихся в головной мозг клеток от индуцируемой цитотоксической химиотерапией гибели клеток не длится дольше 72 ч после утраты прямого контакта между астроцитами и метастатически распространяющимися в головной мозг клетками. Кроме того, клетки,лишившиеся защитного действия, привносимого прежним контактом с астроцитами, можно вновь защитить с помощью второго сокультивирования с астроцитами для обретения вновь опосредуемой астроцитами защиты от цитотоксических эффектов химиотерапевтических средств. Это служит отражением клинических наблюдений первичных опухолей и даже отличного метастаза не в головной мозг, которые реагируют на химиотерапию, в то время как производные от них метастазы в головной мозг являются устойчивыми к химиотерапии. Эксперимент 5. Механизм опосредуемой астроцитами защиты от химиотерапии. Авторы настоящего изобретения использовали вышеприведенное исследование на основе клеток устойчивости к химиотерапии для изучения возможных механизмов, лежащих в основе этого явления. Определение профилей экспрессии генов плюс подтверждение с помощью Вестерн-блоттинга продукции белка использовали для изучения опосредуемой астроцитами защиты клеток метастазов в головной мозг от индуцируемой цитотоксической химиотерапией гибели клеток. Материалы и методы. Профили экспрессии генов, определяемые с помощью анализа с использованием микрочипов РНК. В первом ряде экспериментов клетки MDA-MB-231 или PC14Br4 инкубировали сами по себе, с мышиными астроцитами или с фибробластами NIH 3 Т 3 в 6-луночном планшете с составляющим 35 мм диаметром каждой лунки (каталожный 353046, BD Falcon TM, San Jose, CA). Для установления межклеточного контакта соотношение опухолевых клеток и мышиных астроцитов или клеток NIH 3 Т 3 составляло 1:2. Спустя 72 ч меченные GFP мышиные астроциты или фибробласты сортировали с помощьюFACS, и опухолевые клетки подвергали обработке для анализа с использованием микрочипов. Во втором ряде экспериментов определяли, зависит ли экспрессия генов, связанных с устойчивостью опухолевых клеток к химиотерапевтическим средствам, от непрекращающего контакта с астроцитами. Клетки MDA231 или PC14Br4 подвергали сокультивированию либо с мышиными астроцитами, либо с клетками NIH 3 Т 3 в течение 72 ч. Мышиные астроциты или клетки NIH 3 Т 3 сортировали, и опухолевые клетки либо подвергали обработке для определения профилей экспрессии генов с помощью анализов с использованием микрочипов, либо высевали для второго цикла сокультивирования либо с мышиными астроцитами,либо с фибробластами. Таким образом, опухолевые клетки, сначала подвергнутые культивированию с мышиными астроцитами, подвергали сокультивированию снова с мышиными астроцитами или с фибробластами, и наоборот, опухолевые клетки, сначала подвергнутые культивированию с фибробластами,подвергали сокультивированию снова с фибробластами или с астроцитами. После инкубации в течение 72 ч мышиные астроциты или фибробласты сортировали, и опухолевые клетки подвергали обработке для анализов с использованием микрочипов. Анализы с использованием микрочипов. Тотальную РНК (500 нг) использовали для мечения и гибридизации согласно протоколам производителя (Illumina, Inc., San Diego, CA). Вкратце, кДНК создавали на основе тотальной РНК, используя набор для амплификации РНК Illumina Total Prep RNA Amplification Kit (Applied Biosystem, Austin, TX). Затем в течение 4 ч при 37 С проводили in vitro транскрипцию с включением меченных биотином нуклеотидов в кРНК. Всего 1500 нг меченной биотином кРНК подвергали гибридизации с чипами BeadChip для анализа экспрессии 6-v2 у людей Sentrix от Illumina при 58 С в течение ночи (16 ч) согласно инструкциям производителя. Подвергнутую гибридизации, биотилированную кРНК детектировали с помощью 1 мкг/мл цианин 3-стрептавидина (GE Healthcare, Piscataway, NJ), и чипы BeadChip сканировали с использованием считывающего устройства Illumina BeadArray Reader (Illumina, Inc.). Результаты сведений, полученных с использованием микрочипов, получали с помощью Bead Studio 3.7 (Illumina, Inc.) без какой-либо нормализации или вычитания фона. Относящиеся к экспрессии генов данные нормализовали, используя основанный на квантилях метод нормализации в пакете LIMMA в R (www.r-project.org) (S12). Уровень экспрессии каждого гена преобразовывали в log2 до дальнейшего анализа. Для отбора генов с дифференциальной экспрессией в двух группах тканей авторы настоящего изобретения использовали средство для сравнения классов в инструментальных средствах для ранжированных рядов BRB (версии 3.6; Biometrics Research Branch, National Cancer Institute, Bethesda, MD) в качестве метода проверки по двухвыборочному критерию Стьюдента с приблизительной оценкой FDR. Анализ с использованием Вестерн-блоттинга. Вестерн-блоттинг использовали для подтверждения результатов, полученных с использованием микрочипа. Вкратце, цельноклеточные лизаты отсортированных с использованием FACS опухолевых клеток готовили, используя 1 мл буфера для лизиса (10 мМ Трис [рН 8,0], 1 мМ EDTA, 0,1% SDS, 1% дезоксихолата, 1% NP40, 0,14 М NaCl, 1 мкг/мл лейпептина, 1 мкг/мл апротинина и 1 мкг/мл пепстатина), содержащего смесь ингибиторов протеаз (Roche, Indianapolis, IN). Образцы, содержащие равные количества белка (30 fag), разделяли посредством электрофореза в 4-12% Nu-PAGE гелях (Invitrogen) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. После блокирования с использованием TTBS (TBS + 0,1%Tween 20), содержащего 5% обезжиренного молока, мембраны инкубировали при 4 С в течение ночи с мышиным моноклональным антителом против BCL2 (1:1000, BD PharMingen, San Diego, CA), кроличьим поликлональным антителом против BCL2L1 (1:1000, Cell Signaling, Beverly, MA), кроличьим поликлональным антителом против TWIST (1:1000, Cell Signaling), мышиным моноклональным антителом против глутатион-S-трансферазы (1:1000, BD PharMingen) и мышиным моноклональным антителом против-актина (Sigma). Затем блоты подвергали воздействию конъюгированных с пероксидазой хрена вторых антител (1:3000) и визуализировали с помощью системы для увеличенной хемилюминесценции от Amersham (Piscataway, NJ). Загрузку равного количества белка подтверждали посредством очистки блотов и повторного зондирования их с использованием антитела против -актина. Статистический анализ. Для статистического анализа профилей экспрессии генов уровень экспрессии каждого гена преобразовывали в log2 до дальнейшего анализа. Средство для сравнения классов в инструментальных средствах для ранжированных рядов BRB (версии 3.6; Biometrics Research Branch, National Cancer Institute, Baltimore, MD) для проверки по двухвыборочному критерию Стьюдента с приблизительной оценкой FDR было методом, используемым для определения статистической значимости генов с дифференциальной экспрессией между опухолевыми клетками, подвергнутыми сокультивированию с различными клеткамихозяевами. Гены для диаграммы Венна отбирали с помощью одномерного критерия (двухвыборочного критерия Стьюдента) с использованием критерия множественных перестановок (10000 произвольных перестановок). Авторы настоящего изобретения применяли отсечку Р-значения, составляющую менее 0,001, для сохранения генов, экспрессия которых значимо отличается между двумя группами проверенных тканей. Результаты. Авторы настоящего изобретения идентифицировали гены в опухолевых клетках, экспрессия которых, как правило, изменена после сокультивирования с астроцитами, посредством использования проверок по двухвыборочному критерию Стьюдента (Р 0,001). Используя этот метод, авторы настоящего изобретения идентифицировали 1069 генов в клетках MDA-MB-231 и 594 гена в клетках PC14Br4, которые характеризовались дифференциальной экспрессией (фиг. 7). В результате двухгенного множественного сопоставления выявлена увеличенная экспрессия нескольких генов, которые, как хорошо известно, связаны с противодействием апоптозу и выживанием: глутатион-S-трансфераза 5 (GSTA5), BCL2L1, TWIST(фиг. 7). Экспрессия этих генов была подтверждена на уровне белка с помощью анализа с использованием Вестерн-блоттинга (фиг. 8). Затем авторы настоящего изобретения определяли, является ли измененный характер экспрессии генов в опухолевых клетках, подвергнутых сокультивированию с астроцитами(но не с фибробластами), долговременным или кратковременным. Авторы настоящего изобретения подвергли опухолевые клетки сокультивированию в течение одного цикла с астроцитами или фибробластами, а затем собрали опухолевые клетки и засеяли их во втором цикле на астроциты или фибробласты. После сбора относящихся к экспрессии генов данных на основе экспериментов с использованием двух циклов сокультивирования влияние второго сокультивирования было главенствующим в характерах экспрессии генов в раковых клетках. Независимо от условия первого сокультивирования, раковые клетки,подвергнутые сокультивированию с астроцитами во втором цикле, продемонстрировали дифференциальные характерные черты экспрессии генов, которые были выявлены в экспериментах с использованием культивирования в первом цикле (высокую экспрессию GSTA5, BCL2L1 и TWIST), тогда как раковые клетки, подвергнутые сокультивированию с астроцитами в первом цикле, утрачивали специфические черты экспрессии генов, когда их подвергали сокультивированию с фибробластами во втором цикле(фиг. 9). Этот результат соответствует результатам in vitro исследования защиты от химиотерапии, резюмированным на фиг. 5, и подтверждает, что характер экспрессии генов в опухолевых клетках зависит от постоянного контакта с астроцитами. Опухолевые клетки, подвергнутые во втором цикле сокультивированию с астроцитами, также экспрессировали гены TCF4, CD24, CARD14 и EFNB2 на высоком уровне(не представленные данные). Клинические исследования показали, что имеется корреляция между экспрессией этих генов в опухолевых клетках и плохим прогнозом. Поэтому четвертым аспектом настоящего изобретения является in vitro исследование на основе клеток устойчивости к химиотерапии, имеющее компонент молекулярной диагностики, которое применимо, например, при исследовании явления опосредуемой астроцитами защиты клеток метастазов в головной мозг от индуцируемой цитотоксической химиотерапией гибели клеток в ex vivo ситуации. В определенных вариантах осуществления компонентом молекулярной диагностики является одно или более из следующего: стадии определения профиля экспрессии генов и анализа внутриклеточных концентраций белков. В конкретных вариантах осуществления заранее определенные характерные черты экспрессии генов используются для оценки эффектов экспериментальных вмешательств, например, для аннулирования опосредуемой астроцитами защиты. Пятым аспектом настоящего изобретения являются характерные черты экспрессии генов или комбинация профилей уровней белков, указывающие на опосредуемую астроцитами защиту клеток метастазов в головной мозг от индуцируемой цитотоксической химиотерапией гибели клеток. Шестым аспектом настоящего изобретения является способ обеспечения указанных характерных черт экспрессии генов или профилей уровней белков, описанных и приведенных в качестве примеров выше. Эксперимент 6. Экспрессия рецепторов эндотелина опухолевыми клетками и астроцитами. 300000 клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231 подвергали в течение 24 ч культивированию с 600000 меченными GFP астроцитами или с меченными GFP фибробластами 3 Т 3. Клетки затем собирали и сортировали с выделением клеток MDA-MB-231. Белки экстрагировали, анализировали с помощью Вестерн-блоттинга и подвергали гибридизации с антителом против ETAR. Представленные на фиг. 10 данные четко показывают, что опухолевые клетки, подвергнутые сокультивированию с астроцитами, экспрессируют ETAR на более высоком уровне. В следующем ряде исследований 10000 меченных GFP клеток MDA-MB-231 подвергали сокультивированию с 20000 астроцитов в планшетах с камерами. Спустя 24 ч культуры обрабатывали в течение 24 ч таксолом (15 нг/мл), а затем окрашивали для выявления фосфорилированной формы рАКТ (фиксации с использованием 4% PFA). Как продемонстрировано на фиг. 11, опухолевые клетки, подвергнутые сокультивированию с астроцитами (и таксолом), экспрессируют рАКТ на высоких уровнях. Следовательно, сокультивирование с астроцитами вызывает увеличение экспрессии ETR и факторов выживания опухолевыми клетками, которые связаны с повышенной устойчивостью опухолевых клеток к химиотерапевтическим средствам. Аналогичные исследования с использованием антитела против ETBR выявили экспрессию ETBR. Эксперимент 7. Антагонисты рецепторов эндотелина не вызывают цитотоксические эффекты по отношению к опухолевым клеткам. Используя описанную выше схему in vitro исследования на основе клеток устойчивости к химиотерапии, авторы настоящего изобретения исследовали два антагониста рецепторов эндотелина, обладающих двойным сродством и к ETAR, и к ETBR, для оценки степени опосредуемой астроцитами защиты от цитотоксических эффектов химиотерапевтических средств. Одним из исследованных антагонистов ETR был бозентан, который разрешен ЕМЕА (Европейским агентством по оценке лекарственных препаратов) для применения в лечении артериальной легочной гипертензии (РАН). Второе исследованное лекарственное средство было названо АСТ-064992 и является производным бозентана, также обладающим двойным ETAR/ETBR сродством. АСТ-064992 официально называют мацитентаном, и он имеет структуру Первоначальный текст описания молекулы АСТ-064992, ее синтеза и ее фармакологической активности можно найти в WO 02/053557. АСТ-064992 примерно в три раза фармацевтически активнее бозентана (т.е. в его случае требуется 1/3 дозы). Детализированные данные, приведенные здесь, относятся к экспериментам с использованием АСТ-064992, однако аналогичные результаты получены согласно экспериментам с использованием более высокой дозы бозентана. АСТ-064992 (100 нМ) добавляли в описанное выше исследование с помощью сокультивирования клеток с использованием составляющего 1:2 соотношения между опухолевыми клетками и астроцитами или опухолевыми клетками или фибробластами 3 Т 3 в течение 48 ч, и степень апоптоза определяли, как описано выше. Как продемонстрировано на фиг. 12 (в случае клеток рака молочной железы MDA-231) и на фиг. 13 (в случае клеток рака легкого РС 14), АСТ-064992,добавленный сам по себе или с астроцитами, или с фибробластами 3 Т 3, не вызывал какие-либо поддающиеся измерению цитотоксические эффекты. Эксперимент 8. Антагонисты рецепторов эндотелина в комбинации с химиотерапевтическими средствами. Как показано выше, антагонисты ETR были неэффективными в качестве химиотерапии с использованием одного средства. Этот отрицательный результат сделал в высокой степени неожиданным сильный эффект, наблюдаемый при использовании антагонистов ETR в качестве компонента комбинированных терапий. В экспериментах с использованием сокультивирования клеточные соотношения при культивировании являлись составляющими 1:2 соотношениями между опухолевыми клетками и астроцитами(50000:100000), и осуществляли обработки, используя паклитаксел (TAXOL) (6 нг/мл) и/или АСТ 064992 (100 нМ), в течение 48 ч (фиг. 15; р 0,01). В случае контрольных экспериментов с использованием клеток MDA-MB-231, проявлялась такая же опосредуемая астроцитами защита от паклитаксела,как и в предшествующих экспериментах. Были получены два неожиданных результата этих экспериментов с использованием комбинаций. Во-первых, комбинация паклитаксела с АСТ-064992 в контролях, в которых отсутствовали астроциты, не привела к значимому увеличению гибели клеток по сравнению с паклитакселом самим по себе. Этот результат был обнаружен в по крайней мере трех независимых экспериментах (фиг. 15). Эти результаты были повторены при использовании клеток рака легкого человекаPC14Br4 (фиг. 16). Таким образом, в исследованных условиях антагонисты ETR были так же неэффективными в комбинации, как и в случае, наблюдаемом в эксперименте б, когда они использовались в виде единственных средств. При сокультивированиях опухолевых клеток с астроцитами АСТ-064992 продемонстрировал неожиданную способность к своду на нет опосредуемой астроцитами защиты от паклитаксела. Даже более неожиданным было то, что АСТ-064992 в действительности увеличивал эффективность паклитаксела, по сравнению с контрольными экспериментами без астроцитов, с суперсенсибилизацией метастатических опухолевых клеток к паклитакселу. Добавление АСТ-064992 к сокультурам астроцитов и опухолевых клеток ингибировало экспрессию факторов выживания рАКТ и рМАРК (фиг. 17). Отмечалась прямая связь между этим ингибированием и увеличение гибели опухолевых клеток, опосредованной химиотерапевтическим средством. Этот синергизм стал даже более неожиданным, поскольку в экспериментах, в которых отсутствовали астроциты, не проявлялись даже аддитивные эффекты. Эти поразительные результаты показывают значение новых способов скрининга с использованием сокультивирования, описанных здесь, поскольку эффекты антагонистов ETR при комбинированной терапии невозможно было бы наблюдать в стандартной схеме анализа с использованием линии опухолевых клеток, в которой отсутствуют подвергнутые сокультивированию астроциты. Поэтому седьмым аспектом настоящего изобретения является применение антагонистов рецепторов эндотелина в комбинации с одним или несколькими другими цитотоксическими химиотерапевтическими средствами и/или лучевой терапией для лечения имеющейся опухоли, развившейся в результате метастазирования в головной мозг, у субъекта. В конкретных вариантах осуществления эта комбинированная терапия суперсенсибилизирует имеющийся метастаз в головной мозг к цитотоксическим химиотерапевтическим средствам и/или лучевой терапии,которые назначают вместе с антагонистом ETR.In vivo терапия с использованием антагонистов рецепторов эндотелина для имеющегося метастаза в головной мозг.In vivo доставки антагониста(ов) рецепторов эндотелина и совместно вводимых химиотерапевтических средств можно достичь с помощью одной и той же пероральной или системной доставки, уже разработанной и использованной в предшествующих клинических испытаниях различных членов этого класса соединений. Разработка и оптимизация таких схем лечения является общепринятой практикой в данной области техники [Clinical trials: a practical guide to design, analysis and reporting Edited by AmeetBakhai and Duolao Wang. Remedica, London 2005]. Одной проблемой, специфичной для раков головного мозга, является воздействие на гематоэнцефалический барьер. Хотя ее в течение длительного времени именовали технической проблемой, мешающей системным лечениям метастаза в головной мозг, в настоящее время в данной области техники признано, что даже при микрометастазах гематоэнцефалический барьер частично нарушен [Cavaliere R. and Schiff D., Chemotherapy and cerebral metastases: misperception or reality Neurosurg Focus. 2007 Mar 15; 22(3): E6]. Поэтому есть основания ожидать, что при системной доставке антагонист(ы) рецепторов эндотелина будет проникать и оказывать терапевтический эффект в опухолях, развившихся в результате метастазирования в головной мозг. Кроме того, некоторые члены семейства антагонистов рецепторов эндотелина обладают способностью пересекать даже ненарушенный гематоэнцефалический барьер, что делает их, таким образом, особенно подходящими для применения при лечении опухоли, развившейся в результате метастазирования в головной мозг, in vivo [Vatter H., et al., Cerebrovascular characterization of clazosentan, the first nonpeptide endothelin receptor antagonistshown to be clinically effective for the treatment of cerebral vasospasm. Part II: effect on endothelin(B) receptormediated relaxation. J. Neurosurg. 2005 Jun; 102(6): 1108-1114]. Наконец, прямая инфузия или инъекция антагониста(ов) рецепторов эндотелина в опухоли может применяться, когда размер метастатических опухолей делает такой подход возможным.In vivo терапия метастаза в головной мозг у мышей. Для дальнейшего подтверждения эффективности терапии с использованием антагонистов рецепторов эндотелина в случае имеющегося метастаза в головной мозг авторы настоящего изобретения выполнили показательные in vivo эксперименты, используя мышей. Бестимусным мышам инъецировали 10000 жизнеспособных клеток MDA231 через внутреннюю сонную артерию. При предварительном патологическом исследовании было обнаружено, что видимые укоренившиеся метастазы образуются через две недели после инъекции (не представленные данные). Поэтому авторы настоящего изобретения начинали лечения в этот момент времени. Эксперимент 9. Эффекты АСТ-064992 и темозоломида на in vivo рост опухолей. Бестимусным мышам инъецировали во внутреннюю сонную артерию 10000 жизнеспособных клеток MDA231. Группами, подвергнутыми лечению через две недели после инъекции, были группы, подвергнутые лечению контролем (носителем) (фиг. 18 А); темозоломидом ("TMZ") 10 мг/кг перорально,ежедневно (фиг. 18 В); АСТ-064992 50 мг/кг, перорально, ежедневно (фиг. 18 С); или комбинациейTMZ+ACT-064992 (фиг. 18D). Всех мышей убивали в день 28 лечения. Срезы головного мозга фиксировали и окрашивали. Метастазы в головной мозг оценивали визуально. Показательные образцы представлены на фиг. 18 А-D при одних и тех же увеличениях. Как можно детальнее видеть на фиг. 18 Е, комбинация TMZ и АСТ-064992 значительно уменьшала размер и плотность опухолевых метастазов по сравнению с TMZ самим по себе. Это свидетельствует о том, что имеется прямая корреляция описанных выше результатов применения системы с использованием культивирования клеток с наблюдаемыми in vivo эффектами. Эксперимент 10. Эффекты АСТ-064992 и паклитаксела на in vivo рост опухолей. Самкам бестимусных мышей (возрастом 10-12 недель) инъецировали во внутреннюю сонную артерию 10000 жизнеспособных клеток MDA231. Спустя две недели после инъекции, когда метастазы в головной мозг укоренились, мышей разделяли в случайном порядке на 4 группы, подвергаемые лечению(n=10): 1) контролем (с инъекцией раствора носителя); 2) паклитакселом (8 мг/кг, вводимым внутрибрюшинно один раз в неделю); 3) АСТ-064992 (50 мг/кг, вводимым перорально один раз в день); и 4) комбинацией АСТ-064992 и паклитаксела. Всех мышей подвергали эвтаназии через 28 дней лечения и производили вскрытие трупов. Производили выемку головного мозга для гистологического исследования и иммуногистохимического анализа. Показательные результаты представлены на фиг. 19. Во всех группах, подвергнутых лечению контролем (19 А), АСТ-064992 (19 В) и паклитакселом (19 С), имелись полностью определяемые метастатические опухоли. В отличие от этого, группа, подвернутая лечению комбинацией АСТ-064992 + паклитаксел (19D), имела намного меньше колоний опухолевых клеток. Результаты, полученные при использовании темозоломида и паклитаксела, показывают, что терапия с использованием антагонистов рецепторов эндотелина сенсибилизирует метастаз в головной мозг к химиотерапевтическим средствам в целом. Эксперимент 11. Эффекты АСТ-064992 и паклитаксела на in vivo пролиферацию опухолевых клеток. Репрезентативные срезы головного мозга из четырех групп, подвергнутых лечению, окрашивали наCD31 (маркер эндотелиальных клеток) и Ki67 (маркер клеточной пролиферации). В головных мозгах контрольных мышей, мышей, подвергнутых лечению лишь паклитакселом или лишь АСТ-064992, содержалось большое количество пролиферирующих клеток. В резком отличии от этого, в головных мозгах мышей, подвергнутых лечению как паклитакселом, так и АСТ-064992, содержалось лишь небольшое число делящихся клеток. См. фиг. 20 А, В, С и D соответственно. Эксперимент 12. Эффекты АСТ-064992 и паклитаксела на in vivo апоптоз опухолевых клеток. Срезы головного мозга мышей различных групп, подвернутых лечению, исследовали посредствомin situ дезоксиуридиного мечения концов в месте разрыва цепей с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы (TUNEL) [Negoescu A, et al., J. Histochem Cytochem. 1996 Sep, 44(9): 959-968]. В головных мозгах контрольных мышей, мышей, подвергнутых лечению таксолом, и мышей, подвергнутых лечению АСТ-064992, содержалось от небольшого числа апоптозных клеток до их отсутствия. См. фиг. 21 А-С. В резком отличии от этого, в головных мозгах мышей, подвергнутых лечению комбинацией АСТ 064992 плюс таксол, содержалось большое число апоптозных опухолевых клеток (зеленых) и эндотелиальных клеток (желтых) (фиг. 21D). Эксперимент 13. Срезы головного мозга мышей четырех групп, подвергнутых лечению, подвергали иммуноокрашиванию для выявления совместной локализации ETAR (красного) и фосфосерина (зеленого), приводившей к оранжево-желтому цвету. Фосфорилированная форма ETAR была представлена в головных мозгах контрольных мышей, как и в головных мозгах мышей, подвергнутых лечению паклитакселом (фиг. 22 А-В). Лечение АСТ-064992 самим по себе и комбинацией ACT-064992 + паклитаксел предотвращало фосфорилирование ETAR (фиг. 22 С-D). Этот результат подтверждает связь между активностью антагонистов рецепторов эндотелина и сенсибилизацией метастатических опухолей к химиотерапевтическим средствам. Эксперимент 14. Исследование выживания в случае лечения АСТ 064992 и таксолом экспериментального метастаза в головной мозг клеток рака молочной железы человека MDA231. Детали эксперимента. 5103 клеток MDA231 инъецировали согласно протоколу в эксперименте 10. Лечение начинали в день 14 после инъекции согласно протоколу в эксперименте 10. Вычерчена кривая выживания и установлено р-значение для сопоставления статистической значимости среди подвергнутых лечению групп. Группы, подвергнутые лечению контролем (носителем): ежедневные пероральные введения и внутрибрюшинные инъекции раз в неделю; паклитакселом (5 мг/кг): ежедневные пероральные введения носителя и внутрибрюшинные инъекции раз в неделю паклитаксела; АСТ 064992 (10 мг/кг): ежедневные пероральные введения АСТ 064992 и внутрибрюшинные инъекции раз в неделю паклитаксела. Результаты. День смерти (после лечения) в контрольной группе: 42, 43, 53, 60, 64, 68, 68, 69, 69; в группе, подвергнутой лечению паклитакселом: 49, 53, 60, 63, 74, 74, 78; в группе, подвергнутой лечению АСТ 064992: 51, 63, 68, 75, 78, 82; в группе, подвергнутой лечению комбинацией паклитаксел + ACT: 48; Результаты представлены на фиг. 23. Анализ для определения IC50 по отношению к ЕТА или ЕТВ. Для исследований конкурентного связывания используют мембраны клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантные рецепторы ЕТА или ЕТВ человека. Из рекомбинантных клеток СНО готовят микросомные мембраны и анализ связывания осуществляют, как описано ранее (Breu V., et al., FEBS Lett.EDTA и 0,5% (мас./об.) BSA в титрационных микропланшетах из полипропилена. Мембраны, содержащие 0,5 мкг белка, инкубируют в течение 2 ч при 20 С с 8 пМ [125I]ЕТ-1 (4000 импульсов в минуту) и увеличивающимися концентрациями немеченых антагонистов. Максимальное и минимальное связывание оценивают в образцах без 100 нМ ЕТ-1 и с ним соответственно. Спустя 2 ч мембраны отфильтровывают на планшетах с фильтрами, содержащими фильтры GF/C (Unifilterplate от Canberra Packard S.A.Zurich, Швейцария). В каждую лунку добавляют 50 мкл сцинтилляционной смеси (MicroScint 20, Canberra Packard S.A. Zurich, Швейцария), и планшеты с фильтрами подсчитывают в счетчике для микропланшетов (TopCount, Canberra Packard S.A. Zurich, Швейцария). Все исследуемые соединения растворяют, разбавляют и добавляют в DMSO. Анализ выполняют в присутствии 2,5% DMSO, которые, как установлено, не мешают значительно связыванию. IC50 рассчитывают как концентрацию антагониста, ингибирующую 50% специфического связывания ЕТ-1. Ссылки предшествующего уровня техники. 1. НАМ Mucke "Small-molecule endothelin receptor antagonists: A review of patenting activity acrossNegoescu A., et al., J. Histochem Cytochem. 1996 Sep; 44 (9): 959-68. Все ссылки, приводимые или иначе идентифицируемые здесь, включены тем самым посредством ссылки в их полных объемах и, в частности, ради любой конкретной информации, ради которой они приводятся. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством,выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида, или лучевой терапией или как лучевой терапией, так и цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида, для предупреждения распространения метастазов в головной мозг или лечения метастазов в головном мозге. 2. Применение по п.1, где мацитентан используется в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида. 3. Применение по п.1, где мацитентан используется в комбинации с лучевой терапией. 4. Применение по п.3, где лучевая терапия представляет собой лучевую терапию всего головного мозга или стереотаксическую радиохирургию. 5. Применение по п.1, где мацитентан используется в комбинации как с лучевой терапией, так и с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида. 6. Применение по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что предупреждение распространения метастазов включает снижение риска и/или степени распространения метастазов в головной мозг.