Способ отбора средства для лечения злокачественного новообразования с использованием убиквитин-специфической протеазы (usp) и применение usp

СПОСОБ ОТБОРА СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО НОВООБРАЗОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УБИКВИТИН-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОТЕАЗЫ (USP) И ПРИМЕНЕНИЕ USPUSP13, USP26, USP38, USP42 или USP46 для скрининга средства для лечения злокачественного новообразования. Изобретение также относится к способу скрининга указанных средств с использованием USP. Настоящее изобретение относится к применению полипептида, выбранного из группы, состоящей из USP13, USP26, USP38, USP42 или USP46, в качестве инструмента скрининга для средства для лечения злокачественного новообразования. Дифференцировочный белок клеток миелоидного лейкоза (Mcl-1), изначально идентифицированный в дифференцирующихся миелоидных клетках, относится к представителям анти-апоптотическогоBcl-2 семейства (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, А 1). Mcl-1 действует на ранней стадии при апоптозе, индуцируемом различными стимулами гибели, в частности, повреждениями ДНК, и служит в качестве основного фактора выживания. Более точно, Mcl-1, который способствует выживанию клетки путем интерференции в каскаде событий, приводящих к высвобождению цитохрома С из митохондрий, представляет собой белок с малым периодом полураспада. Следовательно, процессы, которые регулируют Mcl-1, являются чрезвычайно важными в патологических ситуациях, таких как злокачественное новообразование. Деградация Mcl-1 может быть блокирована с помощью протеасомных ингибиторов, подтверждая роль убиквитин-протеасомного пути при апоптозе. Опосредованная убиквитином деградация является тщательно регулируемым процессом, где белки метят с помощью убиквитиновых компонентов посредством серий ферментативных реакций, задействующих Е 1-активирующий фермент, Е 2-конъюгирующий фермент и Е 3 убиквитин-лигазу, которая определяет субстратную специфичность. После этого белки расщепляются протеасомой. Также происходит обратный процесс, и он приводит к удалению убиквитиновой цепи, то есть деубиквитинилированию. Эта последняя реакция осуществляется, частично, с помощью ферментов, которые называются убиквитин-специфические протеазы (USP), и приводит к восстановлению субстрата до его нормального состояния. Убиквитин-специфические протеазы (USP) относятся к большому семейству де-убиквитинилирующих ферментов (DUB). Геном человека кодирует около 95 предполагаемых деубиквитинилирующих ферментов (DUB), которые принадлежат к супер-семейству протеаз. Эти ферменты подразделяются на 5 под-семейств, из которых наиболее известными подклассами являются USP (убиквитин-специфические протеазы) и UCH (гидролазы С-конца убиквитина). 60 USP белков человека представляют собой цистеиновые протеазы и их каталитический домен содержит "Цистеиновый бокс" и "Гистидиновый бокс". Основной функцией USP является удаление убиквитина из специфических белковых субстратов. Клинический успех, связанный с применением протеасомных ингибиторов, подкрепляет точку зрения о том, что модуляция других стадий в убиквитин-протеасомных путях, таких как E3 или USP, будет являться терапевтически успешным с большей специфичностью и эффективностью. В публикации также была описана идентификация E3 лигазы, названной Mule/ARF-BP1/UreB1, которая необходима и достаточна для поли-убиквитинилирования Mcl-1. Примечательно, что понижающая регуляция экспрессии указанной лигазы приводит к стабилизации и накоплению Mcl-1, что придает клеткам большую устойчивость к уничтожению при воздействии генотоксичных средств. Результаты, представленные в настоящем изобретении, свидетельствуют о том, что существуютUSP, специфические к Mcl-1 и, таким образом, они будут влиять на стабилизацию клеточного Mcl-1 для контроля апоптоза. Ингибирование этих USP будет приводить к усилению Mcl-1 деградации посредством протеасомы, способствуя началу апоптоза. Это наблюдение предлагает новый путь для нацеливанияMcl-1 путем ингибирования Mcl-1-регулирующего USP белка с помощью низкомолекулярных соединений. Первым объектом изобретения является способ отбора средства для лечения злокачественного новообразования, включающий обеспечение контактирования убиквитин-специфической протеазы (USP),проявляющей активность деубиквитинилирования белков, выбранной из группы, включающей USP26,USP38, USP42 и USP46, или полипептида, имеющего аминокислотную последовательность по меньшей мере на 84% гомологичную аминокислотной последовательности указанной USP, или клетки, экспрессирующей указанную протеазу или указанный полипептид, с дифференцировочным белком клеток миелоидного лейкоза (Mcl-1) и тестируемым соединением, и анализ стабилизации Mcl-1, причем отбирают агент, вызывающий дестабилизацию Mcl-1 за счет ингибирования активности USP и увеличения скорости убиквитинилирования Mcl-1.Mcl-1-регулирующие USP, описанные в изобретении, представляют собой USP13 (GI: 4507848),USP26 (GI: 13994267), USP38 (GI: 31559774), USP42 (GI: 79750943), USP46 (GI: 31377708) и могут расщеплять либо пептидные связи, связывающие убиквитин в виде части предшественника слитого белка,высвобождая свободные убиквитиновые компоненты, или расщеплять связи, конъюгирующие убиквитин(пост-трансляционно) к белкам. В одном из вариантов осуществления изобретение обеспечивает применение USP46, его функционального фрагмента или, по существу, гомологичной последовательности в качестве инструмента скрининга для средства для лечения злокачественного новообразования.USP46 представляет собой небольшой белок, состоящих из 366 аминокислот, неизвестной функции,который содержит UCH домен, каталитический домен, задействованный в деубиквитинилирующие действия. Было обнаружено, что USP46 широко распространен в тканях человека и является активным в условиях vitro. Недавно в глиобластомах был описан ампликон на хромосоме 4q12, содержащий USP46 в качестве фланкирующего гена. Амплификация гена USP46 была определена в нескольких глиобластомах и клеточных культурах глиобластом. При анализе последовательности USP46 был идентифицирован паралог человека, USP12=UBH1 (NP872294), который проявляет 88% идентичность относительно белковой последовательности и 76% идентичность относительно нуклеотидной последовательности. Кроме того, каталитический домен USP46 и USP12 проявляют 100% идентичность относительно белковой последовательности. При биохимическом анализе было обнаружено, что UBH1 мыши, с 98,3% аминокислотной идентичностью к UBH1 человека, проявляет деубиквитинилирующую ферментативную активность."Функциональный фрагмент" охватывает одну или несколько биологических активностей белка,такие как способность гидролизовать пептидные связи с убиквитином, или содержит домен или мотив,например, каталитический сайт, USP характерный признак, домен, включающий сайты распознаваний цистеина или гистидина убиквитина, сайты связывания убиквитина, или сайты, важные для осуществления других функций протеазы. Термины "гомология" и "по существу гомологичная", если используется в настоящем изобретении по отношению к последовательности, обозначает, что последовательность, при сравнении с ее соответствующей последовательностью сравнения, имеет, по существу, такую же структуру и функцию. Если положение в последовательности сравнения занято такой же аминокислотой, то молекулы являются гомологичными в этом положении (то есть имеет место идентичность в этом положении). Процент гомологии между, по существу, гомологичной последовательностью и последовательностью сравнения желательно составляет по меньшей мере 85%, более желательно по меньшей мере 88%, предпочтительно по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере 99%. Вторым аспектом изобретения является применение убиквитин-специфической протеазы (USP),проявляющей активность деубиквитинилирования белков, выбранной из группы, включающей USP26,USP38, USP42 и USP46, или полипептида, имеющего аминокислотную последовательность по меньшей мере на 84% гомологичную аминокислотной последовательности указанной USP, в способе по п.1. А также применение клетки, экспрессирующей убиквитин-специфическую протеазу (USP), проявляющую активность деубиквитинилирования белков, выбранную из группы включающей USP26, USP38,USP42 и USP46, или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 84% гомологичную аминокислотной последовательности указанной USP, в способе по п.1. Выражение "инструмент скрининга", как используется в настоящей заявке, обозначает инструмент,используемый для скрининга, более предпочтительно полипептид или клетку, экспрессирующую полипептид, используемый для скрининга. Как используется в настоящей заявке, выражение "средство для лечения злокачественного новообразования" включает не только лекарственное средство для лечения пациента, страдающего от злокачественного новообразования, но также и лекарственное средство для предотвращения прогрессирования злокачественного новообразования. "Лечение злокачественного новообразования" относится к профилактическому или предпочтительно терапевтическому (включая, но, не ограничиваясь только ими, паллиативное, радикальное, облегчающее симптомы, уменьшающее симптомы, подавляющее заболевание или симптомы, замедляющее прогрессирование) лечение злокачественного новообразования. Термин "злокачественное новообразование" обозначает предпочтительно различные пролиферативные заболевания, включая заболевания, указанные ниже, но, не ограничиваясь только ими, солидные опухоли (включая доброкачественного типа или в особенности злокачественного типа), такие как саркома (например, саркома Юинга, саркома Капоши или саркомы мягких тканей, такие как возвышающаяся дерматофибросаркома), стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (GIST), семинома, карциноидные опухоли, опухоли тучных клеток, рак легких, такой как мелкоклеточный или немелкоклеточный рак легких, бронхиальные злокачественные опухоли, такие как мелкоклеточный рак бронхов, семиномы,дисгерминомы, внутриэпителиальные неоплазии яичек, меланомы, рак молочной железы, нейробластомы, папиллярный/фолликулярный рак щитовидной железы, злокачественные лимфомы, неходжкинская лимфома, множественная эндокринная неоплазия 2 типа (MEN 2), феохромоцитома, рак щитовидной железы, например медуллярный рак щитовидной железы, гиперплазия/аденома паращитовидной железы,рак молочной железы, рак ободочной кишки, аденома ободочной и прямой кишки, рак яичников, рак предстательной железы, глиобластома, опухоли головного мозга, рак предстательной железы (также включая аденокарциномы и метастазы костей), злокачественные глиомы (анапластические астроцитомы/глиобластомы), рак поджелудочной железы, злокачественная мезотелиома плевры, гемангиобластома, гемангиома, рак почек, печени, надпочечников, мочевого пузыря, желудка (в особенности опухоли желудка), прямой кишки, влагалища, шейки матки, эндометрия, множественная миелома, опухоли головы и шеи, например, ороговевающий рак головы и шеи, включая новообразования, в особенности эпителиального характера, например, в случае рака молочной железы, злокачественный нефросклероз; или дополнительно других гиперплазии или пролиферативных заболеваний."Клетка, которая трансформирована", как используется в настоящей заявке, относится к прокариотической или эукариотической клетке, которая содержит гетерологичную ДНК, которая была введена в клетку с помощью любых методов, например, электропорации, осаждением фосфатом кальция, микроинъекцией, трансформацией, инфицированием вирусом, и др. "Вектор" представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, в которую может быть вставлена гетерологичная нуклеиновая кислота, которую затем вводят в подходящую клетку-хозяин. Векторы предпочтительно имеют одну или несколько точек начала репликации и один или несколько сайтов, в которые может быть вставлена рекомбинантная ДНК. Общеизвестные векторы включают плазмиды, вирусные геномы и искусственные хромосомы. В способе скрининга согласно настоящему изобретению, средство для лечения злокачественного новообразования представляет собой агент, дестабилизирующий Mcl-1 за счет ингибирования каталитической активности USP согласно изобретению. В способе скрининга согласно настоящему изобретению,средство для лечения злокачественного новообразования представляет собой ингибитор USP13, USP26,USP38, USP42 или USP46, или полипептида по существу с гомологичной последовательностью. Как используется в настоящей заявке, "стабилизация" и "дестабилизация" относится к анализу периода полужизни Mcl-1. Один из аспектов способа скрининга средства для лечения злокачественного новообразования предусматривает контактирование клетки, которая трансформирована экспрессионным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий полипептид, состоящий из USP13, USP26, USP38, USP42 или USP46,или по существу гомологичную последовательность тестируемым соединением и анализа скорости убиквитинилирования. Итак, средство для лечения злокачественного новообразования представляет собой ингибитор убиквитин-специфических протеаз (USP), который вызывает увеличение концентрации убиквитинилированного субстрата, например убиквитината Mcl-1. Клеточные системы в исследованиях скрининга лекарственных средств могут быть нативными или задействовать рекомбинантные клетки-хозяева, экспрессирующие убиквитин-специфические протеазы. Идентифицированное средство, модулирующее убиквитин-специфические протеазы, может повышать или снижать аффинность к убиквитинилированному субстрату, повышать или снижать скорость связывания известной связывающей молекулы с USP, конкурировать или вытеснять известную связывающую молекулу к убиквитин-протеазе."Средство, снижающее активность", как используется в настоящей заявке, может относиться к соединению, обладающему способностью ингибировать каталитическую /деубиквитинирующую активность убиквитин-специфической протеазы или взаимодействие между убиквитин-специфической протеазой и молекулой-мишенью, которая нормально взаимодействует с убиквитин-специфической протеазой. Мишенью может являться убиквитин или убиквитинилированный субстрат. Как используется в настоящей заявке выражение "средство, активное по отношению к злокачественному новообразованию", относится к антипролиферативным средствам, включая, но, не ограничиваясь только ими, ингибиторы ароматазы; антиэстрогены; ингибиторы топоизомеразы I; ингибиторы топоизомеразы II; средства, действующие на микротрубочки; алкилирующие средства; ингибиторы деацетилазы гистонов; соединения, которые индуцируют процессы дифференциации клеток; ингибиторы циклооксигеназы; ингибиторы ММР; ингибиторы mTOR; противоопухолевые антиметаболиты, соединения платины; соединения, нацеливающие /снижающие активность протеин- или липид-киназы и другие антиантиогенные соединения; соединения, которые нацеливают, снижают или ингибируют активность протеин- или липид-фосфатазы; агонисты гонадорелина; анти-андрогены; ингибиторы метионинаминопептидазы; бифосфонаты; модификаторы биологической ответной реакции; антипролиферативные антитела; ингибиторы гепараназы; ингибиторы онкогенных изоформ Ras; ингибиторы теломеразы; ингибиторы протеасомы; средства, используемые для лечения гемобластозов; соединения, которые нацеливают, снижают или ингибируют активность Flt-3; ингибиторы Hsp90 и темозоломид. Средство, активное по отношению к злокачественному новообразованию, представляет собой АВТ 737, которое имеет низкое сродство к Mcl-1 и А 1, представители антиапоптотического Bcl-2 семейства и может проявлять ограниченные цитотоксические эффекты в клетках с высокими эндогенными уровнями Mcl-1. В конечном счете, ингибирование USP46 с помощью низкомолекулярных соединений будет облегчать Mcl-1 нацеливание и придавать чувствительность к Bcl-2/Bcl-XL ингибиторам. В изобретении дополнительно идентифицировано АВТ-737 сенсибилизация с последующим USP46 молчанием в различных клеточных линиях, таких как клеточные линии рака ободочной кишки, шейки матки, предстательной железы и легкого, в соответствии с клеточными линиями НСТ 116, HeLa, РС-3,Н 196 и Н 1703 в указанном порядке. В еще другом аспекте изобретение относится к способу замедления прогрессирования злокачественного новообразования, который включает введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества средства, снижающего активность полипептида, раскрытого в изобретении, например USP13,USP26, USP38, USP42 или USP46. Фигуры Фиг. 1 (Фиг. 1.1, 1.2, 1.3): Схематическое представление Mcl-1 модуляции с последующим USP молчанием при t=0, 30 мин или 1 ч лечения циклогексимидом в НСТ 116 клетках. Mcl-1 повышение и снижение соответственно представлены синим цветом и зеленым цветом и миРНК токсичность представлена серым цветом. Отсутствие цвета соответствует отсутствию любого эффекта. Выбранный USP для подтверждающих экспе-3 021677 риментов выделен зеленым цветом (USP5, USP13, USP19, USP21, USP22, USP26, USP28, USP38, USP42 и USP46). МиРНК, созданная для целевых пар USP, указана справа в таблице. Фиг. 2: USP13 скрининг в НСТ 116 клетках. Вестерн-блоттинг (анти-Mcl-1) показывает экспрессию эндогенного Mcl-1 в присутствии различных нацеливающих миРНК либо Люц (люцифераза, отрицательный контроль), Mcl-1, (положительный контроль) или USP13 (миPHK13V1, миPHK13V2, миPHK13V3) В НСТ 116 клетках. Слабая экспозиция также представлена в В. Aнти-stat3 антитело использовали в качестве загрузочного контроля. Зависимость от времени соответствует времени, в течение которого клетки подвергали воздействию ингибитора синтеза белка (циклогексимид) перед анализом. Фиг. 3: USP26 скрининг в НСТ 116 клетках. Вестерн-блоттинг (анти-Mcl-1) показывает экспрессию эндогенного Mcl-1 в присутствии различных нацеливающих миРНК либо Люц (люцифераза, отрицательный контроль), Mcl-1, (положительный контроль) или USP26 (миPHK26V1, миPHK26V2, миPHK26V3) В НСТ 116 клетках. Aнти-stat3 антитело использовали в качестве загрузочного контроля. Зависимость от времени соответствует времени, в течение которого клетки подвергали воздействию ингибитора синтеза белка (циклогексимид) перед анализом. Фиг. 4: USP38 скрининг в НСТ 116 клетках. Вестерн-блоттинг (анти-Mcl-1) показывает экспрессию эндогенного Mcl-1 в присутствии различных нацеливающих миРНК либо Люц (люцифераза, отрицательный контроль), Mcl-1, (положительный контроль) или USP38 (миPHK38V1, миPHK38V2, миPHK38V3) В НСТ 116 клетках. Aнти-stat3 антитело использовали в качестве загрузочного контроля. Зависимость от времени соответствует времени, в течение которого клетки подвергали воздействию ингибитора синтеза белка (циклогексимид) перед анализом. Фиг. 5 : USP42 скрининг в НСТ 116 клетках. Вестерн-блоттинг (анти-Mcl-1) показывает экспрессию эндогенного Mcl-1 в присутствии различных нацеливающих миРНК либо Люц (люцифераза, отрицательный контроль), Mcl-1, (положительный контроль) или USP42 (миPHK42V1, миPHK42V2, миPHK42V3) В НСТ 116 клетках. Aнти-stat3 антитело использовали в качестве загрузочного контроля. Зависимость от времени соответствует времени, в течение которого клетки подвергали воздействию ингибитора синтеза белка (циклогексимид) перед анализом. Фиг. 6: USP46 скрининг в НСТ 116 клетках. Вестерн-блоттинг (анти-Mcl-1) показывает экспрессию эндогенного Mcl-1 в присутствии различных нацеливающих миРНК либо Люц (люцифераза, отрицательный контроль), Mcl-1, (положительный контроль) или USP46 (миPHK46V1, миPHK46V2, миPHK46V3) В НСТ 116 клетках. Aнти-stat3 антитело использовали в качестве загрузочного контроля. Зависимость от времени соответствует времени, в течение которого клетки подвергали воздействию ингибитора синтеза белка (циклогексимид) перед анализом. Фиг. 7: Исследование корреляции фенотип/молчание в PC3 клетках Эндогенный уровень Mcl-1 определяли в PC3 клетках в присутствии нескольких нацеливающих миРНК либо люциферазы, Mcl-1 или USP46 (А). Антитело к актину использовали в качестве загрузочного контроля. Mcl-1 (В) и USP46 (С) уровни мРНК определяли с помощью количественной ОТ-ПЦР с последующей PC3 трансфекцией с нацеливающими миРНК либо люциферазы (Люц, отрицательный контроль), Mcl-1 или USP46. Результаты представлены в виде средних значений +/- СКО в четырех повторах. Фиг. 8: Исследование корреляции фенотип/молчание в Н 196 клетках Эндогенный уровень Mcl-1 определяли в Н 196 клетках в присутствии нескольких нацеливающих миРНК либо люциферазы, Mcl-1 или USP46 (А). Антитело к актину использовали в качестве загрузочного контроля. Mcl-1 (В) и USP46 (С) уровни мРНК определяли с помощью количественной ОТ-ПЦР с последующей PC3 трансфекцией с нацеливающими миРНК либо люциферазы (Люц, отрицательный контроль), Mcl-1 или USP46. Результаты представлены в виде средних значений +/- СКО в четырех повторах. Фиг. 9: Исследование корреляции фенотип/молчание в Н 1703 клетках Эндогенный уровень Mcl-1 определяли в Н 1703 клетках в присутствии нескольких нацеливающих миРНК либо люциферазы, Mcl-1 или USP46 (А). Антитело к актину использовали в качестве загрузочного контроля. Mcl-1 (В) и USP46 (С) уровни мРНК определяли с помощью количественной ОТ-ПЦР с последующей PC3 трансфекцией с нацеливающими миРНК либо люциферазы (Люц, отрицательный контроль), Mcl-1 или USP46. Результаты представлены в виде средних значений +/- СКО в четырех повторах. Фиг. 10: Исследование корреляции фенотип/молчание в HEK293 клетках Эндогенный уровень Mcl-1 определяли в HEK293 клетках в присутствии нескольких нацеливающих миРНК либо люциферазы, Mcl-1 или USP46 (А). Антитело к актину использовали в качестве загрузочного контроля. Mcl-1 (В) и USP46 (С) уровни мРНК определяли с помощью количественной ОТ-ПЦР с последующей PC3 трансфекцией с нацеливающими миРНК либо люциферазы (Люц, отрицательный контроль), Mcl-1 или USP46. Результаты представлены в виде средних значений +/- СКО в четырех повторах. Фиг. 11: Исследование корреляции фенотип/молчание в клетках HeLa Эндогенный уровень Mcl-1 определяли в Н 196 клетках в присутствии нескольких нацеливающих миРНК либо люциферазы, Mcl-1 или USP46 (А). Антитело к актину использовали в качестве загрузочного контроля. Mcl-1 (В) и USP46 (С) уровни мРНК определяли с помощью количественной ОТ-ПЦР с последующей PC3 трансфекцией с нацеливающими миРНК либо люциферазы (Люц, отрицательный контроль), Mcl-1 или USP46. Результаты представлены в виде средних значений +/- СКО в четырех повторах. Фиг. 12: Влияние USP46 молчания на сенсибилизацию клеток HeLa к АВТ-737. Анализ каспазы 3 использовали для мониторинга активности каспазы 3 в клетках HeLa, трансфектированных с нацеливающими миРНК либо люциферазы (люц, отрицательный контроль), mcl-1 илиUSP-46 и обработанных с помощью ДМСО (отрицательный контроль) или АВТ-737 (3-10 мкМ) в течение 6 ч. Лизаты клеток тестировали относительно активности каспазы (А). Результаты представлены в виде средних значений +/-СКО в трех повторах и они являются репрезентативными двух независимых экспериментов. Эндогенный уровень Mcl-1, а также отщепленный PARP, также определяли в присутствии нацеливающих миРНК либо люциферазы, Mcl-1 или USP46 (В). Aнти-stat3 антитело использовали в качестве загрузочного контроля. Фиг. 13 : Проточная цитометрия раковых клеток HeLa, трансфектированных с помощью люц, mcl-1,USP46v1, USP46v4 или USP46 пула миРНК. Клеточный цикл определяли через 72 ч после трансфекции миРНК и через 18 ч после АВТ-737 лечения (3 мкМ). Фиг. 14: АВТ-737-индуцированную subG1 транзицию в клетках HeLa определяли через 72 ч после трансфекции миРНК и через 24 ч после лечения АВТ-737. Процент клеток в subG1 (2N) представляют собой средние значения +/- СКО в двух повторах (А). Также определяли эндогенный уровень Mcl-1 в присутствии нацеливающих миРНК либо люциферазы, Mcl-1 или USP46. Aнти-Stat3 антитело использовали в качестве загрузочного контроля (В). Фиг. 15: Деубиквитинилирующая активность дикого типа и каталитического мутанта (С 44 А) GSTUSP46 белка, очищенного из E.coli. Ферментативную активность дикого типа и каталитического мутанта USP46 белка оценивали в условиях in vitro при различных концентрациях фермента и при фиксированном времени инкубирования(90 мин.), используя UbAMC (400 нМ) в качестве субстрата (А). Кинетические исследования ферментативной активности дикого типа и каталитического мутанта USP46 белка при фиксированной концентрации фермента (400 нМ) и субстрата (800 нМ) (В). Все результаты представлены в виде средних значенийbias. Cell 115, 209-16). Инструмент, предназначенный для исследования специфичности миРНК, разрабатывали на фирме. Вкратце, NCBI NR и EST базы данных запрашивали с каждой миРНК и целевым геном с помощью BLAST алгоритма. миРНК, соответствующую полностью (19/19) или частично (18/19 нуклеотидов) с нерелевантным NR или EST вхождением, отбрасывали. 1.2 Клеточная культура и трансфекция Клетки рака ободочной кишки человека НСТ 116 поддерживали в McCoy 5A среде, содержащей 10% FBS. Культуральную среду дополняли 100 единиц/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина и клеточные линии инкубировали при 37C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2. Для скрининга, указанные количества миРНК (40 пмоль, конечная 72 нМ) комплексовали с 2 мкл олигофектамина (Invitrogen) в Opti-MEM (Invitrogen) и добавляли к планшетам на 24 лунок перед высеванием клеток. После этого высевали 150 000 НСТ 116 клеток. Opti-MEM заменяли подходящей средой через 5 ч после трансфекции. Через 72 ч после трансфекции и перед сбором, клетки обрабатывали или не обрабатывали циклогексимидом (30 мкг/мл) в течение 30 мин или 1 ч или обрабатывали с помощьюMG132 (30 мкМ) в течение 90 мин. 1.3 Приготовление лизатов клеток и анализ вестерн-блоттинг Клетки промывали один раз с помощью закаленного PBS и собирали путем трипсинизации. Незакрепленные и трипсинизированные клетки объединяли и собирали путем центрифугирования. Клеточную массу ресуспендировали в лизирующем буфере (2% CKOS, содержащим 1 Х коктейль ингибитора протеазы, Sigma), помещали при 100C в течение 10 мин и обрабатывали ультразвуком в течение 5 с. Количественно определяли белки, используя бицинхониновую кислоту (Sigma-Aldrich) в соответствии с инструкциями производителя. Лизаты восстанавливали с помощью CKOS-полиакриламидного (10%) гель-электрофореза (CKOS-PAGE), переносили на нитроцеллюлозную мембрану и зондировали с помо-5 021677 щью Mcl-1 кроличьего поликлонального антитела (sc-819; SantaCruz), Stat3 кроличьего поликлонального антитела (9132; Cell Signaling), актинового мышиного моноклонального антитела (А 4700; Sigma), илиGAPDH мышиного моноклонального антитела (Ab8245; AbCam). HRP-конъюгированное анти-кроличье(7074; Cell Signaling) и HRP конъюгированное анти-мышиное (115-035-003; Jackson ImmunoResearch) антитела использовали в качестве вторичных антител. Сигнал определяли, используя ECL реагент (Amersham) согласно инструкциям производителя. 1.4 Клеточная культура, трансфекция и фармакологическое лечение Все используемые клеточные линии поддерживали в их соответствующей среде. Все культуральные среды дополняли с помощью 100 единиц/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина, и клеточные линии инкубировали при 37C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2. Для трансфекции миРНК, миРНК (40 пмоль, конечная 72 нМ) комплексовали с 2 мкл олигофектамина (Invitrogen) в Opti-MEM (Invitrogen) и добавляли к планшетам на 24 лунки перед высеванием клеток. Во всех условиях, Opti-MEM заменяли подходящей средой через 5 ч после транфекции. Если использовали Hiperfect (Qiagen), то миРНК (40 пмоль, конечная 72 нМ) комплексовали с 3 мкл Hiperfect(Qiagen) в Opti-MEM (Invitrogen) и добавляли к планшетам на 24 лунки после высевания клеток. Через 48 ч или 72 ч после трансфекции и перед собиранием, клетки обрабатывали или не обрабатывали с помощью АВТ 737 в указанные периоды времени и в указанных концентрациях. Клетки, тяжело поддающиеся трансфекции, такие как Н 1703 клетки, трансфектировали, используя АМАХА процедуру. Сначала клетки суспендировали в специальной кювете в присутствии миРНК, представляющей интерес. Затем подавали электрический импульс, определенный в соответствии с используемой клеточной линией, в устройстве Nucleofector. После этого нуклеофектированные клетки высевали в планшеты на 24 или 6 лунок в соответствии с инструкциями производителя и обрабатывали с помощью АВТ 737, как описано выше. 1.5 Исследование деубиквитинилирования Деубиквитинилирующую активность фермента определяли в флуориметрическом исследовании,используя убиквитин-АМС или Ub-AMC (убиквитин-7-амидо-4-метилкумарин, Boston Biochem, U-550) в качестве субстрата, как было описано ранее (Dang и др. (1998) Kinetic and mechanistic studies on the hydrolysis of ubiquitin C-terminal 7-amido-4-methylcoumarin by deubiquitinating enzymes. Biochemistry. 37(7): 1868-79). Высвобождение АМС из С-конца убиквитина проявляется усилением флуоресценции, за которым можно наблюдать с помощью флуоресцентного анализатора. Фермент и субстрат оба использовали свежеприготовленными в USP46 реакционном буфере (50 мМ Tris-HCl [pH 8,4], 0,5 мМ EDTA, 0,05 мг/мл BSA, 5 мМ DTT) для каждого прогона. Реакционную смесь между USP46 и Ub-AMC инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч и реакцию останавливали путем добавления 10 мкл уксусной кислоты (конечная концентрация 250 мМ). Интенсивность флуоресцентной эмиссии изменяли на приборе PHERAstar (BMG Labtech), используя набор кумариновых фильтров (возб=360 нм, эм=460 нм). 2. Результаты 2.1 USP скрининг в НТС 116 клетках Для идентификации убиквитин-специфических протеаз, задействованных в Mcl-1 деубиквитинилирование и, следовательно, Mcl-1 стабилизации, целое USP семейство подвергали скринингу с помощью интерференции РНК на время полужизни Mcl-1 в раковых клетках НСТ 116. Из 60 белков USP, подвергнутых скринингу, было идентифицировано 10 USP (USP5, USP13, USP19, USP21, USP22, USP26, USP28,USP38, USP42 и USP46) с предполагаемым фенотипом, то есть существенное снижение Mcl-1 (по меньшей мере 2 из 3 миРНК, проявляющих более, чем 50% Mcl-1 снижение в один момент времени). Схематическое представление Mcl-1 модуляции с последующим USP молчанием и обработкой циклогексимидом представлено на фиг. 1. 2.2 Подтверждающие эксперименты на выбранном USP Для подтверждения результатов, полученных при первичном скрининге, осуществляли независимый эксперимент с 10 выбранными USP. Данные были подтверждены для 5 USP (USP13, USP26, USP38,USP42 и USP46) из 10 USP из результатов первичного скрининга. Результаты вестерн-блоттинга подтверждающих экспериментов представлены на фиг. 2-6. Эти результаты свидетельствуют о том, что существенное снижение эндогенного Mcl-1 наблюдается после обработки циклогексимидом (по сравнению с Люц миРНК в различные моменты времени) и после Mcl-1 молчания. Примечательно, что из этих белков, для трех различных USP было показано, что они имеют существенное влияние уровень устойчивого состояния Mcl-1 с 2 миРНК из 3: USP13, USP42 и USP46. Следовательно, для скрининга 60 USP человека с помощью интерференции РНК для периода полужизни Mcl-1 в НСТ 116 клетках, было подтверждено вовлечение 5 USP (USP13, USP26, USP38, USP42 иUSP46) в Mcl-1 стабилизацию. Все эти белки содержат аминокислоты, важные для каталитической активности, таким образом подтверждая функциональную деубиквитинилирующую активность. Действительно, ранее было показано, что USP42, USP46 и USP38 проявляют активность в условиях in vitro. 2.3 Влияние USP46 молчания на уровни мрНК и белка Mcl-1 в клетках PC3, Н 196, Н 1703, HEK293 иHeLa Влияние Mcl-1 миРНК на эндогенный уровень белка Mcl-1 в клетках PC3, Н 196, Н 1703, HEK293 иHeLa анализировали и было показано существенное снижение уровня Mcl-1, что указывает на очень хорошую эффективность трансфекции в этих клеточных линиях (соответственно фиг. 7-11). В этом контексте, эндогенный уровень Mcl-1 белка оценивали после USP46 молчания. Наблюдали существенное снижение уровня Mcl-1 белка с независимыми USP46 миРНК в клетках PC3, Н 196, Н 1703, HEK293 и HeLa(USP46v3, USP46v4 и пулом активных USP46 миРНК) (соответственно фиг. 7-11). После этого определяли эндогенные уровни мРНК Mcl-1 с помощью количественной ПЦР в клетках PC3, Н 196, Н 1703,HEK293 и HeLa для исключения транскрипционной регуляции уровня Mcl-1 посредством USP46. Не было обнаружено существенного снижения уровней мРНК Mcl-1 после USP46 молчания (соответственно фиг. 7-11), что свидетельствует о том, что USP46-опосредованная Mcl-1 регуляция в клетках PC3, Н 196,Н 1703, HEK293 и HeLa представляет собой пост-транскрипционное событие. В завершение, в качестве контроля, все тестируемые нацеливающие миРНК USP46 оказывали влияния на уровни мРНК USP46: 68% снижение в PC3 клетках 62% снижение в Н 196 клетках 46% снижение в Н 1703 клетках 90% снижение в HEK293 клетках 80% снижение в клетках HeLa было подтверждено (соответственно фиг. 7-11). Эти данные указывают на то, что USP46 вовлечен в Mcl-1 стабилизацию в клеточных линиях PC3,Н 196, Н 1703, HEK293 и HeLa и, таким образом, подтверждают ранее полученные данные в НСТ 116 клетках. 2.4 Влияние Mcl-1 и USP46 молчания на АВТ-737-индуцированную гибель клеток HeLa Это исследование использовали для оценки влияния миРНК USP46 на сенсибилизацию клетокHeLa к АВТ-737-опосредованному апоптозу. Наш положительный контроль, Mcl-1 миРНК, сенсибилизирует клетки к АВТ-737-опосредованному апоптозу, о чем свидетельствует повышение в 2,7 раза активности каспазы 3 (фиг. 12 А). Интересно, что миРНК USP46v1 и USP46v4 приводит к существенному повышению активности каспазы 3 после обработки АВТ-737 (v1: 1,5-кратная; v4: 2-кратная индукция при 3 мкМ АВТ-737) (фиг. 12 А). Важно, что наблюдали индукцию активности каспазы 3, опосредованную АВТ-737, которая сильно коррелировала с уровнем нокдауна Mcl-1 (фиг. 12 В). Также наблюдали заPARP отщеплением в идентичных условиях и наблюдали повышение отщепленной PARP полосы с Mcl-1 миРНК и промежуточное повышение отщепленной PARP полосы с USP46 миРНК, таким образом подтверждая результаты каспазы (фиг. 12 В). Для подтверждения эффекта USP46 миРНК на сенсибилизацию клеток к АВТ-737 индуцированному апоптозу в клетках HeLa, количественно определяли число клеток в subG1-фазе, что главным образом отображает апоптоз. Подобно Mcl-1 миРНК, USP46 миРНК индуцирует апоптоз в необразованных раковых клетках HeLa (фиг. 13 А и 14 А). Действительно, обработанные люциферазой клеток представляют собой 21,40,6% subG1 клеток, тогда как Mcl-1-обработанные клетки (46,22,2%),USP46v1-обработанные клетки (344%), USP46v4-обработанные клетки (29,30,3%) и SР 46 пулобработанные клетки (4011%) проявляют более высокое количество subG1 клеток (фиг. 13 А и 14 А). Незначительное повышение subG1 клеток наблюдали в присутствии АВТ-737 (3 мкМ) в обработанных люциферазой клетках (35%6,6% subG1 клеток) (фиг. 13 А и 14 А). В отличие от этого, наблюдали сильное увеличение subG1 клеток, если клетки обрабатывали с Mcl-1 миРНК в присутствии АВТ-737(63%2% subG1 клеток) (фиг. 13 А и 14 А). Интересен тот факт, что USP46v1, USP46v4, также как и пулактивной USP46 миРНК, также индуцирует существенное увеличение subG1 клеток, обработанных с помощью АВТ-737, при сравнении с контрольными миРНК-трансфектированными клетками (v1: 60,7%5,4%; v4: 51,3%1,2% пул: 62,4%0,1% subG1 клеток) (фиг. 13 А и 14 А). Наблюдали, что степень индукции subG1 в присутствии АВТ-737 сильно коррелирует с уровнем нокдауна Mcl-1 (фиг. 13 В). В заключение, аналогично Mcl-1 молчанию, USP46 молчание снижает уровень Mcl-1, индуцирует апоптоз в необработанных раковых клетках HeLa и сенсибилизирует клетки HeLa к АВТ-737 индуцированной клеточной гибели. Интересен тот факт, что эти различия в АВТ-737 сенсибилизации всегда коррелируют с эффективностью молчания на уровень Mcl-1: больше Mcl-1 снижается после трансфекции USP46 миРНК, больше SР 46-опосредованной сенсибилизации наблюдали. Показано, чтоUSP46 молчание существенно сенсибилизирует клетки к АВТ-737 на промежуточном уровне между отрицательным контролем (Люц миРНК) и положительным контролем (Mcl-1 молчание), что оценивали с помощью анализа каспазы 3, отщепления PARP и анализа subG1 Совместно, эти результаты подтверждают вовлечение USP46 в Mcl-1 регуляцию в клетках рака шейки матки. Аналогичные результаты также получали в клетках НСТ 116, PC3, Н 1703 и Н 196. 2.5 Протеолитическая активность USP46 в условиях in vitro Деубиквитинилирующую активность очищенных белков дикого типа, а также мутантных белков сравнивали в условиях in vitro. Оба фермента - дикого типа и мутантный - тестировали в дозозависимых реакциях, используя Ub-AMC анализ (фиг. 15). Интересен тот факт, что белок USP46 дикого типа гидролизирует Ub-AMC дозозависимым образом. В отличие от этого, не наблюдали какого-либо дозозависимого влияния каталитически неактивного мутанта, что таким образом указывает на отсутствие любой деубиквитинилирующей активности, совместно очищенной с мутантом GST-USP46 (фиг. 15 А). Для подтверждения этих данных проводили кинетические эксперименты с GST-USP46. При фиксированных концентрациях фермента и субстрата, наблюдали дозозависимое повышение гидролиза Ub-AMC с белком USP46 дикого типа, но не с мутантной формой (фиг. 15 В). Совместно, эти результаты обосновывают идентификацию специфической USP46-опосредованной деубиквитинилирующей активности с корректированным соотношением сигнал/фон. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ отбора средства для лечения злокачественного новообразования, включающий обеспечение контактирования убиквитин-специфической протеазы (USP), проявляющей активность деубиквитинилирования белков, выбранной из группы, включающей USP26, USP38, USP42 и USP46, или полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 84% гомологичную аминокислотной последовательности указанной USP, или клетки, экспрессирующей указанную протеазу или указанный полипептид, с дифференцировочным белком клеток миелоидного лейкоза (Mcl-1) и тестируемым соединением и анализ стабилизации Mcl-1, причем отбирают агент, вызывающий дестабилизациюMcl-1 за счет ингибирования активности USP и увеличения скорости убиквитинилирования Mcl-1. 2. Применение убиквитин-специфической протеазы (USP), проявляющей активность деубиквитинилирования белков, выбранной из группы, включающей USP26, USP38, USP42 и USP46, или полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 84% гомологичную аминокислотной последовательности указанной USP, в способе по п.1. 3. Применение клетки, экспрессирующей убиквитин-специфическую протеазу (USP), проявляющую активность деубиквитинилирования белков, выбранную из группы, включающей USP26, USP38,USP42 и USP46, или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 84% гомологичную аминокислотной последовательности указанной USP, в способе по п.1.