Применение бактериальной комбинированной композиции для получения средства для профилактики и/или лечения гипероксалурии у людей и животных и способ профилактики и/или лечения указанного заболевания

1 Настоящее изобретение относится к применению видов и/или штаммов бактерий, которые будут указаны ниже, для получения средства для профилактики и/или лечения гипероксалурии и нарушений, связанных с ней, а также к способу лечения указанного заболевания. Соответственно, указанная композиция может принимать форму и проявлять активность диетической композиции или пищевой добавки или истинного лекарственного препарата в зависимости от поддерживающего или профилактического, или непосредственно терапевтического действия, которое композиция предназначена проявлять в зависимости от конкретных индивидуумов, для которых она предназначена. Данное профилактическое или непосредственно терапевтическое действие может быть получено в результате заселения вышеуказанных бактерий в кишечнике субъектов в случае риска возникновения гипероксалурии или нарушений, связанных с гипероксалурией. Гипероксалурия выражается в избыточном присутствии оксалатов в моче (уровень оксалатов в моче 40 мг/день). Она может возникать в результате генетического дефекта, который изменяет метаболизм глиоксиловой кислоты с образованием оксалата вместо глицина, также она может быть побочным эффектом избыточного потребления богатой оксалатами пищи,такой как шпинат, какао, фундук, перец и чай,или лечения, например, препаратами против ожирения (например, ORLISTAT). Следовательно, очевидна полезность обеспечения пищевой добавкой, способной снижать или регулировать присутствие оксалатов в моче. Гипероксалурия представляет преобладающий фактор риска в отношении образования конкрементов в почках и может вызываться повышенным всасыванием оксалатов из ободочной кишки или перегрузкой почек, вызванной гипероксалурией, как это имеет место при первичной гипероксалурии (РН). Уровень оксалатов в моче, по-видимому,представляет решающий фактор в отношении образования оксалатных конкрементов у пациентов с нормальным выделением кальция с мочой, и оксалатные конкременты могут иногда также образовываться у пациентов при диализе при выраженной олигурии и без почечнокаменной болезни в анамнезе, что в рамках данной работы означает, что может иметь место супернасыщение оксалатами даже в случае минимального количества мочи. Суточное выделение оксалатов прямо связано с объемом мочи, потреблением витамина С, массой тела и, наоборот, с поглощением кальция. В исследовании Sutton и Walker на группе людей с идиопатическим образованием оксалатных конкрементов при незначительной гипероксалурии невозможно было показать наличие какого-либо значительного изменения почечной 2 регуляции уровня оксалатов, и был сделан вывод о том, что имелась повышенная пищевая нагрузка оксалатами с возможным механизмом повышенного всасывания. Следовательно, у пациентов не с первичной гипероксалурией наибольшее внимание необходимо обращать на повышенное всасывание оксалатов в кишечнике, которое создает клиническую картину кишечной гипероксалурии и часто рецидивирующего образования конкрементов в почках. Фактически с 1968 г. признается, что почечно-каменная болезнь представляет осложнение при заболевании или резекции кишечника. Повышенное всасывание оксалатов в кишечнике, называемое кишечной гипероксалурией (ЕНО), зависит по меньшей мере от двух механизмов. Первый связан с нарушением всасывания желчных солей при заболевании или резекции подвздошной кишки, что приводит к недостатку желчных солей и нарушению всасывания жиров. Большая часть оксалатов в пищевом рационе связана с кальцием и всасывается плохо, но слабо всасывающиеся жиры связывают кальций в просвете кишечника, снижая его количество, связанное с оксалатом, и приводят к повышенному всасыванию оксалатов. Второй механизм ЕНО связан с повышенной проницаемостью ободочной кишки для оксалатов, вызванной слабо всасывающимися жирными кислотами и желчными солями, возможно ухудшенной вариациями эпителиальных окклюзивных соединений ободочной кишки, вызванных снижением уровня кальция в просвете. Данная гипероксалурия связана со степенью стеатореи и является необычной при резекциях подвздошной кишки 30 см. Пониженное число бактерий,которые метаболизируют оксалаты в ободочной кишке (Oxalobacter formigenes), a также их ингибирование слабо всасывающимися желчными солями может, вероятно, вносить свой вклад в развитие ЕНО. Наконец, гипероксалурию можно наблюдать при длительном парентеральном питании, а также у пациентов с колэктомией и при минимальном пероральном приеме пищи,возможно, за счет повышенного синтеза эндогенного оксалата. Оксалаты слабо растворимы в воде, но моча может стать супернасыщенной за счет присутствия ингибиторов кристаллизации. Гипероксалурия в сочетании с пониженным объемом мочи и пониженными уровнями этих ингибиторов, предрасполагает к образованию конкрементов в почках. Отложение оксалатов в паренхиме почек может вызвать интерстициальный нефрит и нефрокальциноз с острой или хронической почечной недостаточностью. Лечение пациентов с кальциевыми оксалатными конкрементами является комплексным и описывается ниже. 3 Стадия 1. Повышенное потребление жидкостей для выделения мочи 3 л/день; Пищевой рацион с низким содержанием оксалатов (избегать шпината, ревеня, свеклы,фундука, чая, колы, шоколада, пшеничных отрубей, клубники); Пищевой рацион с низким уровнем жиров(50 г/день); Добавки кальция (1-2 г/день); Холестирамин (по 4 г четыре раза в день). Стадия 2 (если конкременты возникают вновь, несмотря на лечение по стадии 1). Подщелачивание мочи и добавки цитратов(например, цитрата калия, цитрата натрия = по 30 мэкв основания четыре раза в день); Добавки магния (для коррекции уровней в моче); Аллопуринол 300 мг/день (если конкременты содержат мочевую кислоту). Возможность желудочно-кишечной биологической регуляции уровня оксалатов известна с 1955 г. из данных по разложению оксалатов содержимым рубца коров, и позднее, смешанной бактериальной флорой толстого кишечника других травоядных.Allison в 1985 г. отнес специфическое разложение оксалатов за счет Oxalobacter formigenes, которые заселяют толстый кишечник человека, а также других животных. Позднее Ito показал разложение оксалатов в продуктах питания в условиях in vitro с помощью Eubacterium lentum WIH-1. Впоследствии было высказано предположение о том, что отсутствие Oxalobacter formigenes является фактором риска в отношении возникновения гипероксалурии у пациентов с кистозным фиброзом. Следовательно, кишечная гипероксалурия является результатом повышенного всасывания оксалатов в кишечнике за счет повышенной проницаемости слизистой или повышенной растворимости и биодоступности оксалатов в фекалиях, когда содержание кальция в пищевом рационе снижено. Отсутствие Oxalobacter formigenes может представлять новый патофизиологический механизм, который важен с точки зрения терапии. В настоящее время неожиданно было установлено, что следующие бактерии: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve способны к росту в присутствии оксалата и/или разлагающегося оксалата. Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает применение Streptococcus thermophilus и по меньшей мере одного штамма следующих бактерий: Lactobacillus brevis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve для получения диетического 4 и/или фармацевтического средства для профилактики и/или лечения гипероксалурии и нарушений, связанных с ней. Предпочтительно штаммом Lactobacillusbrevis является штамм Lactobacillus brevis CD2,хранящийся по Будапештскому соглашению вDSM - Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур Gmbh, Braunschweig, Германия, с 6 февраля 1998 г. под инвентарным номером DSM 11988. Конкретнее, гипероксалурия и нарушения,связанные с ней, включают кишечную гипероксалурию, образование кальциевых оксалатных камней в почках, гипероксалурию в результате воспалительных заболеваний кишечника, почечную недостаточность, везикулярный калькулез, кардиопатию в результате гипероксалурии,кистозный фиброз и вульводинию. Применение изобретения включает применение в области ветеринарии. Комбинированная диетическая и/или фармацевтическая композиция по изобретению способна заселять указанными бактериями кишечник субъектов при риске возникновения гипероксалурии или нарушений в результате гипероксалурии, или нарушений в результате образования кальциевых оксалатных конкрементов. По одному воплощению изобретения штамм Streptococcus thermophilus смешивается со штаммом Lactobacillus, выбранным из группы, состоящей из Lactobacillus brevis, Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus plantarum или их смесей. Предпочтительно штаммом Lactobacillus brevis является штамм Lactobacillus brevisCD2, хранящийся по Будапештскому соглашению в DSM - Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культурGmbh,Braunschweig, Германия, с 6 февраля 1998 г. под инвентарным номером DSM 11988. По другому воплощению изобретения штамм Streptococcus thermophilus смешивается со штаммом Bifidobacterium, выбранным из группы, состоящей из Bifidobacterium infantis,Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve или их смесей. В данном случае предпочтительно, чтобы соотношения между концентрациямиBifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve в смеси, выраженные в КОЕ/г композиции, предпочтительно равнялись 1:1:1. По предпочтительному воплощению соотношение между концентрациями Streptococcusthermophilus и бактерией рода Lactobacillus, выраженные в КОЕ/г композиции, равно от 1000:1 до 1:1000, в то время, как соотношение между концентрациями Streptococcus thermophilus и бактерией рода Bifidobacterium или смесью бактерий рода Bifidobacterium, выраженные в КОЕ/г композиции, равно от 1000:1 до 1:1000. 5 Общая концентрация бактерий предпочтительно составляет от 106 до 1012 КОЕ/г композиции. Согласно изобретению, композиция может дополнительно включать или вводиться в комбинации с- веществами, способными связывать оксалаты в просвете кишечника, в частности, холестирамином (например, 0,5-4 г/день) и органическими гидроколлоидами морского происхождения;- ферментами, молочно-кислыми бактериями, гормонами и диуретиками, иммуномодуляторами, противоопухолевыми препаратами,липидами, подщелачивателями мочи, подкислителями мочи, насыщенными и ненасыщенными жирными кислотами и фосфолипидами;- препаратами, приводящими гипероксалурии в качестве побочного действия, например,препаратами против ожирения (например,ORLISTAT). В основном композицию можно вводить перорально или в просвет кишечника, или субаквально, в виде гранул, таблеток, капсул, суппозиториев или клизмы для кишечника. Изобретение также обеспечивает применение композиции, содержащей Streptococcusthermophilus и по меньшей мере один штамм бактерий, выбранный из Lactobacillus brevis,Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum,Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve, в количестве, достаточном для заселения кишечника субъектов при риске возникновения гипероксалурии или нарушений, возникающих в результате гипероксалурии в составе продукта питания на основе шоколада, какао, спаржи, томата, напитков для питья/жидкостей, шпината, грецких орехов,фундука, клетчатки, злаковых, картофеля, чая и арахисового масла. Наконец, изобретение обеспечивает способ профилактики и/или лечения гипероксалурии и нарушений, связанных с ней, введением пациенту при риске возникновения гипероксалурии или нарушения, возникающего в результате гипероксалурии, от 0,5 до 4 г/день композиции по изобретению. Пациенты в том смысле, в котором этот термин здесь используется, включает людей и животных в целом, и, в частности, сельскохозяйственных животных, спортивных животных и домашних животных. 6 Пример 1. Чистые культуры. Для следующего опыта использовали Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis иStreptococcus thermophilus. Все штаммы хранили лиофилизованными в холодильнике. Bifidobacterium infantis культивировали в бульоне MRS (Difco)+0,5% глюкозы,инкубировали в анаэробных условиях при 37 С в течение 18 ч в Gas Pak в атмосфере СO2 и Н 2,Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus plantarum в бульоне MRS (Difco), инкубировали при 37 С в течение 18 ч, Lactobacillus brevis в бульоне MRS (Difco), инкубировали при 30 С в течение 18 ч, и Streptococcus thermophilus в бульоне М 17 (Difco) + 0,5% лактозы и инкубировали при 37 С в течение 18 ч. Среды. Для приготовления культуральных сред,содержащих 10 и 20 мМ оксалата аммония(BDH), к 10 мл основной среды (составленной следующим образом: 10 г протеозного пептона 3 (Difco) + 5 г дрожжевого экстракта (Difco)(MERCK) + 0,05 г MnSO4 (MERCK) + вода до 500 мл и стерилизованного при 121 С в течение 15 мин) добавляли 10 мл растворов следующих сахаров и оксалата аммония, стерилизованных пропусканием через фильтр 0,45 мкм, а именно: для L. acidophilus, L. plantarum и L. brevis 1 А: 20 мM оксалата аммония + 40 г/л глюкозы (BDH) 1 В: 40 мМ оксалата аммония + 40 г/л глюкозы для S. thermophilus 2 А: 20 мМ оксалата аммония + 40 г/л глюкозы + 10 г/л лактозы (Difco) 2 В: 40 мМ оксалата аммония + 40 г/л глюкозы + 10 г/л лактозы для В. infantis 3 А: 20 мМ оксалата аммония + 50 г/л глюкозы 3 В: 40 мМ оксалата аммония + 50 г/л глюкозы. После смешивания пробы, помеченные А,содержали 10 мМ оксалата аммония, в то время,как пробы, помеченные В, содержали 20 мМ оксалата аммония. Культуральные бульоны затем засевали 10% свежей культурой и инкубировали в соответствующих для каждого описанного выше штамма условиях. В каждой растущей бульонной культуре подсчитывали число микроорганизмов, находящихся в культуральных средах в соответствующих условиях и, в частности:- В. infantis на агаре HHD (HI Media Laboratories) инкубировали в анаэробных условиях при 37 С в течение 3 суток;- L. acidophilus на агаре MRS (Difco) инкубировали в анаэробных условиях при 37 С в течение 3 суток;(Difco) инкубировали в анаэробных условиях при 37 С в течение 3 суток;- S. thermophilus на агаре M17 (Difco) инкубировали при 37 С в течение 2 суток. Определение щавелевой кислоты. Подготовка проб. Бульонные культуры пастеризовали при 90 С в течение 15 мин, затем центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин и, наконец,супернатант фильтровали через фильтр 0,45 мкм. Метод. Концентрацию щавелевой кислоты определяли с помощью набора Щавелевая кислота(Boehringer Mannheim), специфичного для данной кислоты. Анализ проводили на спектрофотометре (Perkin Elmer - Lambda 5) при 340 нм. Щавелевая кислота Результаты. Как следует из табл. 1, приведенной ниже,все штаммы в основном растут в присутствии 10 мМ оксалата аммония, в то время как концентрация 20 мМ частично ингибирует рост микробов, особенно в случае L. acidophilus и S. thermophilus. Однако, вероятно, корреляция между ростом бактерий и разложением оксалата отсутствует. Так, L. plantarum и L. brevis вызывают незначительное, если вообще таковое имеется,разложение оксалата, даже если они показывают значительный рост. С другой стороны, L. acidophilus и S. thermophilus разлагают оксалат при обеих концентрациях, несмотря на пониженный рост в присутствии 20 мМ оксалата аммония. Наконец, В.infantis проявляет очень хорошую активность в отношении деградации и не ингибируется под действием оксалата в любой концентрации. Пример 2. Случаи. После полученного согласия 7 пациентам с гипероксалурией вводили Streptococcus thermophilus перорально по 6 г в день в течение 3 недель, и оксалурию оценивали в течение 24 ч на нулевой момент времени и через 3 недели. Оксалаты в моче определяли стандартными методами, используемыми в клинической биохимии, и выражали в мг оксалатов в моче,собранной в течение 24 ч. Через 3 недели результаты по оксалемии были следующими: Пациент 1 2 3 4 5 6 7 Совершенно очевидно, что у пациентов с высокими уровнями оксалатов в моче, лечение привело к заметному снижению концентраций оксалатов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение бактериальной комбинированной композиции, включающей в качестве штаммов бактерий(b) по меньшей мере одним штаммом бактерий, выбранным из группы, состоящей изLactobacillus brevis, Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium infantis,Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve или их смесей,для получения диетического, фармацевтического или ветеринарного средства для профилактики и/или лечения гипероксалурии и нарушений, связанных с ней. 2. Применение по п.1, где штаммом Lactobacillus brevis является штамм Lactobacillus brevis CD2 DSM 11988. 3. Применение по п.1, где соотношение концентраций Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve в смеси, выраженных в КОЕ/г композиции, равно 1:1:1. 4. Применение по пп.1-2, где соотношение концентраций Streptococcus thermophilus и штамма Lactobacillus, выраженных в КОЕ/г композиции, равно от 1000:1 до 1:1000. 5. Применение по п.1, где соотношение концентраций Streptococcus thermophilus и штамма Bifidobacterium, выраженных в КОЕ/г композиции, равно от 1000:1 до 1:1000. 6. Способ профилактики и/или лечения гипероксалурии и нарушений, связанных с ней,который включает введение пациенту, в случае необходимости, от 0,5 до 4 г/день бактериаль 10 ной комбинированной композиции, включающей(b) по меньшей мере одним штаммом бактерий, выбранным из группы, состоящей из