Связывающие множество мишеней белки, обладающие антагонистическими свойствами по отношению к cd86

СВЯЗЫВАЮЩИЕ МНОЖЕСТВО МИШЕНЕЙ БЕЛКИ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ ПО ОТНОШЕНИЮ К CD86 Согласно настоящему изобретению предложен мультиспецифичный связывающий белок для модулирования ингибирования активности T-клеток или блокирования реакций, опосредуемыхT-клетками, содержащий домен, связывающий CD86, соединенный с гетерологичным связывающим доменом посредством промежуточного домена, характеризующийся тем,что указанный гетерологичный связывающий домен представляет собой агонист IL-10. Мультиспецифичный гибридный белок также может содержать промежуточный домен,отделяющий другие участки. Также согласно настоящему изобретению предложены полинуклеотиды, кодирующие мультиспецифичные гибридные белки, композиции, содержащие в составе гибридные белки, и способы применения мультиспецифичных гибридных белков и композиций. Томпсон Питер Армстронг,Баум Питер Роберт, Тэн Филип,Блэнкеншип Джон В., Натараджан Сатиш Кумар (US) Нилова М.И. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭМЕРДЖЕНТ ПРОДАКТ ДИВЕЛОПМЕНТ СИЭТЛ, ЛЛС (US) Перекрестные ссылки на родственные заявки Заявка на данное изобретение испрашивает приоритет согласно 35 U.S.С.119(е) на основании предварительных заявок на патент США : 61/102288 поданной 2 октября 2008 г.; 61/102297, поданной 2 октября 2008 г.; 61/102307, поданной 2 октября 2008 г.; 61/102315, поданной 2 октября 2008 г.; 61/102319, поданной 2 октября 2008 г.; 61/102327, поданной 2 октября 2008 г.; 61/102331, поданной 2 октября 2008 г.; 61/102334, поданной 2 октября 2008 г.; и 61/102336, поданной 2 октября 2008 г., причем содержание указанных предварительных заявок (в количестве девяти) полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. Положения, касающиеся списка последовательностей Список последовательностей, касающихся указанно заявки на данное изобретение, предоставлен в текстовом формате вместо копии на бумаге и включен в настоящее описание посредством ссылки. Название текстового файла,содержащего список последовательностей,910180421PCSEQUENCELISTING.txt. размер текстового файла составляет 705 KB, он был создан 2 октября 2009 г. и был предоставлен в электронном виде посредством сети EFS, одновременно с подачей настоящего описания. Уровень техники Область техники Настоящее изобретение в целом относится к области мультиспецифичных связывающих молекул и их применению для терапевтических целей и, в частности, к гибридному белку, содержащему связывающий домен, обладающий антагонистическими свойствами по отношению к CD86, и другой связывающий домен, обладающий специфичностью по отношению к гетерологичной мишени, например, такой как агонист IL-10, а также к композициям и их применению для терапевтических целей. Описание уровня техники Иммунная система человека обычно защищает организм от вреда, наносимого чужеродными веществами и патогенами. Один из способов защиты организма иммунной системой заключается в образовании специализированных клеток, называемых Т-лимфоцитами или T-клетками. В ходе межклеточных взаимодействий между T-клетками и антиген-презентирующими клетками (АПК) возникают костимулирующие T-клеточные сигналы, которые, в свою очередь, стимулируют реакции T-клеток на антигены. Для полной активации T-клеток требуется связывание рецептора T-клеток (TCR) с комплексом антигенМНС, присутствующим на поверхности антиген-презентирующих клеток, и связывание рецептора CD28 на поверхности T-клеток с его лигандами CD86 и/или CD80, присутствующими на поверхности антигенпрезентирующих клеток, в частности дендритных клеток.CD80 (также обозначаемый как В 7-1) первоначально был описан как активирующий антиген, ассоциированный с B-клетками человека, впоследствии было обнаружено, что он является рецептором родственных молекул T-клеток CD28 и антигена-4, связанного с цитотоксическими Т-лимфоцитами(CTLA-4). В ходе более поздних исследований был обнаружен другой рецептор CTLA-4, называемыйCD86 (также обозначаемый как В 7-0 или В 7-2). Последовательности CD86 и CD80 обладают приблизительно 25% идентичности во внеклеточном участке. Хотя обычно считают, что CD80 и CD86 функционально равноценны в отношении способности вызывать и поддерживать пролиферацию CD4(+) T-клеток(Vasilevko et al. (2002), DNA Cell Biol. 21: 137-49), и данные, полученные с применением растворимого гибридного белка CTLA-4 Ig, блокирующего активность обеих молекул, показали их клиническую эффективность (Genovese et al. (2005), NEJM 353:114-1123), существуют доказательства того, что специфическое ингибирование CD86 может обладать преимуществами. Например, присутствие CD86 или CD80 обладает различным действием на B-клетки. В частности, было показано, что CD80 приводит к образованию негативного сигнала для пролиферации и секреции IgG как в нормальных B-клетках, так и вB-клеточных лимфомах, тогда как CD86 повышает активность B-клеток (Suvas et al. (2002), J. Biol. Chem. 277:7766-7775). Также существуют доказательства того, что CD80 обладает иммуноподавляющим действием на T-клетки (Lang et al. (2002), J. Immunol. 168:3786-3792; Taylor et al. (2004), J. Immunol. 172:34-39;Paust et al. (2004), PNAS, 101:10398-10403), и он может опосредовать дальнейшее подавление иммунного ответа через сигналинг PD-L1 (CD274) на активированных АПК или T-клетках (Butte et al. (2007), Immunity 27:111-122; Keir (2008), Ann. Rev. Immunol. 26:677-704). Соответственно, ингибирование CD86 при отсутствии ингибирования CD80 может обладать преимуществами для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний, а также B-клеточных лимфом.CTLA-4 представляет собой трансмембранный гликопротеин 1 типа, относящийся к суперсемейству иммуноглобулинов, экспрессируемый в основном в активированных T-клетках, а также в небольшой степени в регуляторных T-клетках CD4+CD25+ (Т-рег). CD86 и CD80 считают единственными эндогенными лигандами CTLA-4. Было показано, что CTLA-4 связывает CD86 и CD80 с большими аффинностью и авидностью по сравнению с CD28 (Linsley et al. (1991), J. Exp. Med. 174:561-69; Linsley et al.(1994), Immunity, 1:793-801) и имеет ключевое значение в качестве отрицательного регулятора активацииT-клеток. В частности, связывание CTLA-4 с CD80/CD86 приводит к подавлению реакций T-клеток и сохранению гомеостаза T-клеток и периферической толерантности. Считают, что это происходит как по причине антагонизма зависимой от CD28 костимуляции, так и прямого отрицательного сигналинга через цитоплазматический участок CTLA-4. Для обзора строения и функций CTLA-4 см. Teft et al. (2006),Annu. Rev. Immunol. 24:65-97. Как было упомянуто выше, для эффективного иммунного ответа требуется как контакт с рецептором T-клеток, так и связывание CD28 с CD80 и/или CD86. Связывание с рецептором T-клеток в отсутствие связывания CD28 приводит либо к апоптозу T-клеток, либо к подавлению иммунитета, опосредованного указанными клетками. Также было показано, что сигналинг CD28 усиливает продукцию цитокиновT-клетками. В частности, было показано, что стимуляция CD28 в 5-50 раз усиливает образование IL-2,ФНО-, лимфотоксина, ИФН- и ГМ КСФ в активированных T-клетках. Более того, было показано, что индукция экспрессии гена лимфокина и/или цитокина CD28 осуществляется даже в присутствии иммунодепрессанта циклоспорина (Thompson et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1333-1337). Также было показано, что CD28 способствует выживанию T-клеток путем индуцирования повышенной регуляцией анти-апоптозного BCL-XL (Alegre et al. (2001), Nature Rev. Immunol. 1:220-228). Были сконструированы растворимые формы CTLA-4 путем слияния внеклеточного участкаCTLA-4, подобного вариабельному участку, с константными участками иммуноглобулина с получением гибридных белков CTLA-4-Ig. Было показано, что посредством связывания с CD86 и CD80 растворимыйCTLA-4-Ig предотвращает зависимую от CD28 костимуляцию (Linsley et al. (1991), J. Exp. Med., 174:56169) и ингибирует костимуляцию T-клеток, а также обладает положительным иммуноподавляющим действием в организме человека (BruceBoyce (2007), Ann. Pharmacother. 41:1153-1162). Гибридный белокCTLA4-Ig абатасепт в настоящее время применяют для лечения ревматоидного артрита в случаях неадекватной реакции на терапию, направленную против ФНО-. Тем не менее, не все пациенты отвечают на введение CTLA-4-Ig, и для продолжительного ответа требуется частое введение лекарственного средства, возможно, отчасти по причине того, что блокирование взаимодействия CD28 и CD86/CD80 является слабым стимулятором регуляторных T-клеток и его недостаточно для блокирования ответов, обусловленных активированными эффекторными T-клетками в состоянии заболевания. Краткое описание фигур Фиг. 1 показывает связывание с CD80 различных белков, включая абатасепт, CTLA-4-Ig(N2)(SEQ ID NO: 11), и мультиспецифичный эксцепторный (xceptor) гибридный белок, содержащий эктодомен CTLA-4, соединенный с IL-10 (SEQ ID NO: 9). На фиг. 2 показано, что CTLA-4-Ig(N2) (SEQ ID NO: 11) и мультиспецифичный эксцепторный гибридный белок, содержащий эктодомен CTLA-4, соединенный с IL-10 (SEQ ID NO: 9), способны связываться с растворимым рецептором A IL-10 (sIL-10Ra). На фиг. 3 и 4 показано, что мультиспецифичный эксцепторный гибридный белок, содержащий эктодомен CTLA-4, соединенный с IL-10 (SEQ ID NO: 9), способен вызывать фосфорилирование STAT3 в МКПК. На фиг. 5 показано, что эксцепторные молекулы, содержащие направленные против CD86 связывающие домены из моноклонального антитела 3D1 и гуманизированного моноклонального антителаFUN1, способны связываться с CD86 на поверхности клеток WIL2-S. На фиг. 6 показано, что эксцепторные молекулы, содержащие домен, связывающий CD86, и IL-10 способны одновременно связывать CD86 на поверхности клетки и sIL-10Ra. На фиг. 7 показано, что различные варианты гуманизированных FUN1 SMIP, направленных противCD86, способны связывать CD86. На фиг. 8 показано, что эксцепторные молекулы CTLA-4IL-10, содержащие различные линкеры,присоединяющие IL-10 к карбоксиконцу (BD2) эксцепторной молекулы, способны связывать IL-10R1-Ig.- SEQ ID NO: 173. На фиг. 9 показано, что эксцепторные молекулы CTLA-4IL-10, содержащие более короткие линкеры, присоединяющие IL-10 к карбоксиконцу (BD2) эксцепторной молекулы, способны связыватьIL-10R1-Ig. На фиг. 10 показано, что несколько эксцепторных белков связываются с CD80. На фиг. 11 показано, что несколько эксцепторных белков связываются с CD86. На фиг. 12 показано, что несколько эксцепторных белков связываются с sIL-10Ra. На фиг. 13 показано, что несколько эксцепторных белков способны одновременно связываться сCD80 и с sIL-10Ra. На фиг. 14 показано, что несколько эксцепторных белков обладают перекрестной реакционной способностью в отношении CD80 мыши. На фиг. 15 показано, что несколько эксцепторных белков обладают перекрестной реакционной способностью в отношении CD86 мыши. На фиг. 16 и 17 показано, что несколько эксцепторных белков блокируют ответ, опосредованныйT-клетками человека, при анализе с применением реакции СКЛ (MLR). На фиг. 18-20 показано, что несколько эксцепторных белков блокируют ответ, опосредованный На фиг. 21 и 22 показано, что несколько эксцепторных белков, содержащих вариант IL-10 (как вариант IL-10 с мутацией 187, так и моно-IL-10) или вариант CTLA-4, блокируют ответ, опосредованныйT-клетками человека, при анализе с применением реакции СКЛ. На фиг. 23 показано, что несколько эксцепторных белков, содержащих вариант IL-10 (как вариантIL-10 с мутацией 187, так и моно-IL-10), обладают более слабым иммуностимулирующим действием,чем IL-10 мыши при анализе пролиферации клеток МС/9. На фиг. 24 показано, что несколько эксцепторных белков, содержащих вариант IL-10 (как вариантIL-10 с мутацией I 87, так и моно-IL-10), обладают более слабым иммуностимулирующим действием,чем IL-10 человека при анализе пролиферации клеток МС/9. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение позволяет осуществлять направленное воздействие на антигенпрезентирующие клетки (АПК) с изменением их активности. Например, активность T-клеток можно модулировать путем создания мультиспецифичных эксцепторных гибридных белков, содержащих первый связывающий домен, преимущественно связывающийся с CD86, и второй связывающий домен (гетерологичный связывающий домен). В отдельных вариантах реализации мультиспецифичный эксцепторный гибридный белок содержит первый и второй связывающие домены, первый и второй линкеры и промежуточный домен, причем один конец указанного промежуточного домена соединен посредством линкера с первым указанным связывающим доменом, представляющим собой домен, связывающий CD86, а другой конец соединен посредством линкера со вторым связывающим доменом, представляющим собой антагонист IL-10. В отдельных вариантах реализации домен, связывающий CD86, представляет собой эктодоменCTLA-4, эктодомен CD28 или связывающий домен вариабельной области иммуноглобулина (например,scFv), обладающий специфичностью по отношению к CD86 (например, полученный из моноклонального антитела 3D1 или FUN1). В некоторых вариантах реализации применяют участок, меньший, чем полноразмерный эктодомен. Например, можно применять домены в пределах эктодомена CTLA-4, связывающие CD86 и предотвращающие связывание CD86 с CD28. В дополнительных вариантах реализации агонист IL-10 представляет собой IL-10 или его функциональный фрагмент. Примеры строения указанных мультиспецифичных гибридных белков, обозначаемых в настоящем документе как эксцепторные молекулы, включают N-BD-ID-ED-C, N-ED-ID-BD-С, N-BD1-ID-BD2-C иN-ED-ID-ED-C, где N- и -С обозначают амино- и карбоксиконец соответственно; BD представляет собой иммуноглобулин подобный связывающий домен или связывающий домен вариабельной области иммуноглобулина; ID представляет собой промежуточный домен и ED представляет собой внеклеточный домен или экстодомен, например лиганд-связывающий домен рецептора, лиганд, лектиновую область С-типа, область семафорина или семафорин подобный домен или им подобные. В составе некоторых конструкций ID может включать константную область иммуноглобулина или ее фрагмент, расположенную между указанными первым и вторым связывающими доменами. В других конструкциях, в составе которых каждый из BD и ED связан с ID посредством одинаковых или различных линкеров (например,посредством линкера, включающего от одной до 50 аминокислот), например шарнирной области иммуноглобулина (состоящей, например, из верхней и коровой областей) или ее функционального варианта,или лектинового интердомена или его функционального варианта, или области стебля молекулы кластера дифференцировки (CD) или его функционального варианта. Перед приведением более подробного описания настоящего изобретения для лучшего понимания его может быть полезным предоставление определений отдельных терминов, употребляемых в настоящем документе. Дополнительные определения приведены в ходе описания настоящего изобретения. В настоящем описании подразумевается, что любой интервал концентрации, интервал процентных значений, интервал отношений или интервал чисел включает любое значение любого целого числа в пределах обозначенного интервала и, когда это целесообразно, его дробных частей (например, одна десятая и одна сотая целого числа), если не указано обратного. Также следует понимать, что любой интервал значений, указанный в настоящем описании, относящийся к любому физическому свойству, например к субъединицам полимера, размерам или толщине, включает любое число в пределах указанного интервала, если не указано обратного. При использовании в настоящем описании "приблизительно" или" по существу состоящий из" означают 20% от указанного интервала, значения или структуры, если не указано обратного. Следует понимать, что единственное число, употребляемое в настоящем описании,может относиться к одному или более перечисляемых элементов. Предложение любого выбора (например, при использовании союза "или") может подразумевать под собой одну, две или любое сочетание возможностей. Термины "включает" и "содержит" в тексте настоящего описания являются синонимами. Также следует понимать, что описания определенных соединений или групп соединений, полученных из различных сочетаний структур и заместителей, приведенные в настоящем документе, приведены в тексте в той же степени, как для отдельного соединения или группы соединений. Следовательно, выбор определенных структур или определенных заместителей входит в объем настоящего изобретения."Связывающий домен" или " связывающий фрагмент" согласно настоящему изобретению может представлять собой, например, любой белок, полипептид, олигопептид или пептид, обладающий способ-3 024877 ностью к специфическому распознаванию и связыванию биологической молекулы (например, CD86) или комплекса, состоящего из более одной одинаковых или различных молекул, или совокупности или агрегата, как устойчивого, так и не устойчивого (например, комплекс CD86/CD28). Указанные биологические молекулы включают белки, полипептиды, олигопептиды, пептиды, аминокислоты или их производные,липиды, жирные кислоты или их производные; углеводороды, сахараиды или их производные; нуклеотиды, нуклеозиды, пептиды нуклеиновых кислот, молекулы нуклеиновых кислот или их производные; гликозилированные белки, гликопептиды, гликолипиды, липопротеины, протеолипиды или их производные; другие биологические молекулы, которые могут присутствовать, например, в биологическом образце; или любое сочетание указанных молекул. Связывающий домен включает любой встречающийся в природе, синтезированный, или полусинтезированный, или полученный рекомбинантным путем партнер для связывания с биологической молекулой или другой интересующей мишени. Для определения связывающих доменов согласно настоящему изобретению известно множество различных способов обнаружения специфического связывания с определенной мишенью, включая Вестерн блоттинг, ИФА или анализ с помощью прибора Биакор. Связывающие домены и гибридные белки, содержащие в своем составе указанные домены, согласно настоящему изобретению обладают способностью к связыванию мишени в заданной степени, включая "специфическое или избирательное связывание", при незначительном связывании других компонентов, присутствующих в исследуемом образце, если они связывают молекулу - мишень с аффинностью или Ka (т.е. с равновесной константой ассоциации определенного связывающего взаимодействия, измеряемой в единицах, составляющих 1/М) составляющей, например, более чем или приблизительно равной 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 или 1013 М-1. К "высокоаффинным" областям связывания относятся связывающие домены, Ka которых составляет по меньшей мере 107, по меньшей мере 108, по меньшей мере 109, по меньшей мере 1010, по меньшей мере 1011, по меньшей мере 1012, по меньшей мере 1013 М-1 или более. Также аффинность можно определить через равновесную константу диссоциации (Kd) определенных связывающих взаимодействий, измеряемую в единицах, составляющих М (например, от 10-5 до 10-13 М). Аффинность полипептидов и гибридных белков, содержащих связывающий домен согласно настоящему изобретению, можно с легкостью определить при помощи общепринятых методик (см., например, Scatchard et al. (1949), Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660 и патент США 5283173; 5468614 или аналогичные им). Связывающие домены согласно настоящему изобретению можно получать согласно описанному в настоящем документе или при помощи различных способов, известных в данной области техники (см.,например, патент США 6291161; 6291158). Источники включают последовательности генов антител различных видов организмов (которые могут быть оформлены как антитела, фрагменты sFv, scFv или(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:11804), рыбу (Nguyen et al. (2002), Immunogenetics, 54:39), грызунов, птичьих, овечьих, последовательности, кодирующие случайные библиотеки пептидов или последовательности, кодирующие сконструированное разнообразие аминокислот в альтернативных каркасных структурах, не соответствующих антителам, например, в доменах фибриногена (см., например, Weisel etal. (1985), Science, 230:1388), в доменах Кунитца (см., например, патент США 6423498), в доменах липокалина (см., например, ПЗ 2006/095164), в V-образных доменах (см., например, опубликованную заявку на патент США 2007/0065431), в лектиновых доменах С-типа (Zelensky and Gready (2005),FEBS J. 272:6179), mAb2 или Fcab (см., например, РСТ опубликованную заявку на патент СШАПЗ 2007/098934; ПЗ 2006/072620) и т.д. Также для разработки связывающих доменов согласно настоящему изобретению можно применять традиционные стратегии разработки гибридом с применением синтезированного одноцепочечного CD86 как иммуногена в подходящих системах (например, мыши,мышь HuMAb, мышь ТС, KM-мышь, ламы, цыплята, крысы, хомяки, кролики и т.д.). Все общепринятые в данной области термины, относящиеся к методике работы с антителами, в настоящем описании несут смысл, придаваемый им в данной области, если в настоящем документе недвусмысленно не указано обратное. Например, термины "VL" и "VH" относятся к вариабельной связывающей области, полученной из легкой и тяжелой цепей антитела соответственно. Вариабельные связывающие области состоят из дискретных, четко выраженных участков, известных как "гипервариабельные участки" (CDR) и "каркасные участки" (FR). Термины "CL" и "CH" относятся к "константной области иммуноглобулина" т.е. к константной области, полученной из легкой или тяжелой цепи соответственно, с условием, что вторая область далее делится на домены константного участка CH1, CH2, CH3 и CH4, в зависимости от изотипа антитела (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM), из которого был получен указанный участок. Часть участков константной области образует Fc-фрагмент ("кристаллизующийся фрагмент"), содержащий домены, отвечающие за эффекторные функции иммуноглобулина, такие как ADCC (антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность), ADCP(антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз), CDC (комплементзависимая цитотоксичность) и фиксация комплемента, связывание с рецепторами Fc, более длительный период полувыведения in vivo по сравнению с полипептидами, не содержа-4 024877(1989), Nature, 337:525). Далее, полипептид, содержащий Fc-фрагмент, подвержен димеризации и мультимеризации полипептида. "Шарнирная область", также обозначенная в настоящем описании как "линкер", представляет собой аминокислотную последовательность, расположенную между связывающей вариабельной областью и константной областью одной цепи антитела и соединяющую указанные области и, как известно в данной области, подобно шарниру, обеспечивающей подвижность антител и подобных антителам молекул. Доменную структуру иммуноглобулинов можно подвергать конструированию, в ходе которого антигенсвязывающие домены и домены, отвечающие за эффекторные функции, можно переносить между разными классами и подклассами иммуноглобулинов. Структура и функции иммуноглобулинов рассмотрены, например, в Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual., Chapter 14 (Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, 1988). Обширное введение, а также подробную информацию обо всех аспектах методики работы с рекомбинантными антителами можно найти в пособии RecombinantAntibodies (John WileySons, NY, 1999). Полное собрание подробных лабораторных протоколов конструирования антител можно найти в R. Kontermann and S. Dbel, Eds., The Antibody Engineering Lab Manual (Springer Verlag, Heidelberg/New York, 2000). Также протоколы, относящиеся к указанной теме, доступны в Current Protocols in Immunology, August 2009J, опубликованных John WileySons, Inc.,Boston, MA. Термин "биологический образец" включает образец крови, образец, полученный с помощью биопсии, эксплантат ткани, культуру органа, биологическую жидкость, или любую другую ткань, или клетку, или любой другой препарат, полученный от субъекта или из биологического источника. Субъектом или биологическим источником могут являться, например, животные, относящиеся или не относящиеся к роду человек, первичная культура клеток или адаптированная в культуре линия клеток, включая генетически сконструированные линии клеток, которые могут содержать включенные в хромосомы или эписомные рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот, гибридные линии соматических клеток, иммортализованные или подверженные иммортализации линии клеток, линии дифференцированных или подверженных дифференциации клеток, трансформированные линии клеток и им подобные. В дополнительных вариантах реализации настоящего изобретения субъект или биологический образец может быть потенциально поражен заболеванием или иметь риск поражения заболеванием, нарушением или состоянием, включая заболевание, нарушение или состояние, связанное со злокачественной опухолью,или нарушение, связанное с В-клетками. В отдельных вариантах реализации субъект или биологический источник могут быть поражены заболеванием, связанным с повышенной пролиферацией, воспалительным заболеванием или аутоиммунным заболеванием, в других вариантах реализации настоящего изобретения может быть известно, что субъект или биологический источник может находиться вне риска поражения указанным заболеванием, нарушением или состоянием. Домены, связывающие CD86. Как было упомянуто в настоящем описании, CD86 представляет собой трансмембранный белок I типа и является представителем суперсемейства иммуноглобулинов. CD86 экспрессируется антигенпрезентирующими клетками и является лигандом двух белков T-клеток, CD28 и CTLA-4. СвязываниеCD86 с CD28 является костимулирующим сигналом для активации T-клетки, тогда как связывание CD86 с CTLA-4 регулирует активацию T-клетки в отрицательном направлении и снижает иммунный ответ. Альтернативный сплайсинг ведет к появлению двух вариантов транскриптов, кодирующих разные изоформы ( доступа Genbank NP787058.3 и NP008820.2). Домен, связывающий CD86 согласно настоящему изобретению, способен блокировать связываниеCD86 с CD28 и, следовательно, отрицательно регулировать активацию T-клеток. Предусматриваемые согласно настоящему изобретению CD86 связывающие домены включают внеклеточный домен CTLA-4 или его фрагмент, внеклеточный домен CD28 или его фрагмент или связывающий домен, полученный на основе антитела, обладающий специфичностью по отношению к CD86 (например, домен, полученный из моноклонального антитела FUN1 (см., например, J. Pathol. 1993 Mar; 169(3):309-15) или полученный из моноклонального антитела 3D1, направленного против CD86. В некоторых вариантах реализацииCD86-связывающий домен представляет собой внеклеточный домен ("эктодомен") CTLA-4 человека( доступа Genbank NPJD05205), например последовательность зрелого полипептида из SEQ ID NO: 1(сигнальный пептид: 1-37 аминокислоты). Аминокислотная последовательность эктодомена CTLA-4 без сигнального пептида приведена в SEQ ID NO: 410. Заявители отмечают, что в ходе отдельных исследований было показано, что последовательность зрелого полипептида эктодомена CTLA-4 начинается с метионина в положении 38 SEQ ID NO: 1, в ходе других исследований было показано, что последовательность зрелого полипептида начинается с аланина в 37 положении. В дополнительных вариантах реализации связывающий домен CD86 представляет собой эктодомен CTLA-4, который подвергли мутации для повышения авидности к CD86 по сравнению с диким типом или не подвергнутым мутации CTLA-4,согласно описанному, например, в опубликованном патенте СШАUS 2003/0035816. В отдельных вариантах реализации эктодомен CTLA-4, подвергнутый мутации, содержит аланин или тирозин в положении аминокислоты 29 и/или глутаминовую кислоту, аспарагин, аспарагиновую кислоту, глутамин, изо-5 024877 лейцин, лейцин или треонин в положении 104 SEQ ID NO: 410. Аминокислотная последовательность варианта эктодомена CTLA-4 A29Y L104E приведена в SEQ ID NO: 411. В отдельных вариантах реализации связывающий домен CD86 представляет собой подобный вариабельной области домен CTLA-4,например, с последовательностью SEQ ID NO: 3 или участок CDR подобного вариабельной области домена CTLA-4, например, с последовательностью SEQ ID NO: 4 (CDR1), SEQ ID NO: 5, (CDR2) илиSEQ ID NO: 6 (CDR3). Указанные участки CDR описаны, например, в патенте США 7405288. В других вариантах реализации связывающий домен CD86 представляет собой внеклеточный домен ("эктодомен") CD28 ( доступа Genbank NP006130.1), например, согласно приведенному в SEQ ID NO: 2. 1-18 аминокислоты в SEQ ID NO: 2 представляют собой сигнальный пептид. Аминокислотная последовательность эктодомена CD28 без сигнального пептида приведена в SEQ ID NO: 412. В дополнительных вариантах реализации связывающий домен CD86 содержит одноцепочечный иммуноглобулин подобный участок, например, scFv, обладающий специфичностью по отношению к CD86. В отдельных вариантах реализации связывающий домен CD86 содержит связывающие домены вариабельных связывающих областей легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела FUN1 или 3D1. Последовательности тяжелой цепи, легкой цепи, линкера scFv и участков CDR в составе моноклональных антител, FUN1 и 3D1, направленных против CD86, которые можно применять для создания эксцепторных молекул согласно настоящему изобретению, приведены в SEQ NOs: 305-313 и 318-326 соответственно. В одном аспекте связывающий домен CD86 или гибридный белок, содержащий указанный связывающий домен согласно настоящему изобретению, обладает специфичностью по отношению к CD86 и его аффинность описывается константой диссоциации (Kd), значение которой составляет от приблизительно 10-3 до менее чем приблизительно 10-8 М. В отдельных предпочтительных вариантах реализации связывающий домен CD86 или гибридный белок, содержащий указанный связывающий домен, связывает CD86 с аффинностью, составляющей приблизительно 0.3 мкМ. В качестве иллюстративного примера можно привести возможность определения связывающих доменов CD86 согласно настоящему изобретению с применением фаговой библиотеки Fab фрагментов(см., например, Hoet et al. (2005), Nature Biotechnol. 23:344) путем скрининга по признаку связывания с синтезированным или рекомбинантным CD86 (с применением аминокислотной последовательности или ее фрагмента, приведенной подоступа Genbank NP787058.3 или NP008820.2). В отдельных вариантах реализации молекула CD86, применяемая для создания домена, связывающего CD86, может дополнительно содержать промежуточный домен или домен димеризации согласно описанному в настоящем документе, например Fc-фрагмент иммуноглобулина или его участок. В некоторых вариантах реализации домены, связывающие CD86 согласно настоящему изобретению, включают домены VH и VL согласно описанному в настоящем документе (например, FUN1, 3D1,или их гуманизированных вариантов). Другие примеры участков VH и VL включают описанные в патенте США 6827934. В отдельных вариантах реализации домены VH и VL происходят из организма человека. В дополнительных вариантах реализации предложены варианты доменов, связывающих CD86 согласно настоящему изобретению, последовательности которых по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99.5% или по меньшей мере на 100% идентичны аминокислотной последовательности одного или более вариабельных участков в составе легкой цепи (VL) или одного или более вариабельных участков в составе тяжелой цепи (VH) или обоих вариантов согласно SEQ NOs: 305 и 306, SEQ NOs: 318 и 319 или описанным в патенте США 6827934 (включенном в настоящий документ посредством ссылки), где в составе каждого участка CDR содержится ноль, одна, две или три замены аминокислот (т.е. большинство замен расположены в области каркасного участка (участков. Термины"идентична" или "процент идентичности" по отношению к последовательностям двух или более полипептидов или молекул нуклеиновых кислот относятся к двум или более одинаковым или имеющим определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов в составе определенного участка последовательностям или частичным последовательностям (например, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности), при сопоставлении и выравнивании на максимальное соответствие в окне сравнения или обозначенном участке, измеряемые при помощи способов, известных в данной области, например алгоритма сравнения последовательностей, ручного выравнивания или визуальной оценки. Например, предпочтительными алгоритмами, подходящими для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмыBLAST и BLAST 2.0, описанные в Altschul et al. (1977), Nucleic Acids Res. 25:3389 и Altschul et al. (1990),J. MoI. Biol. 215:403 соответственно. В любом из указанных или других вариантов реализации, описанных в настоящем документе, касающихся применения участков VL и VH, домены VL и VH могут быть расположены в любой ориентации и могут быть разделены линкером, длина которого может оставлять до 30 аминокислот согласно описанному в настоящем документе или любой аминокислотной последовательностью, способной обеспечивать функцию спейсера, совместимую с взаимодействием двух связывающихся доменов. В отдельных вариантах реализации линкер, соединяющий домены VL и VH, содержит аминокислотную последовательность согласно приведенному в одном или более из следующих документов: SEQ ID NOs: 43-166, 244, 307, 320,355-379 и 383-398, например 46 линкер (SEQ ID NO: 88), 130 линкер (SEQ ID NO: 163), 131 линкер(SEQ ID NO: 164), 115 линкер (SEQ ID NO: 148) или линкер, приведенный в SEQ ID NO: 244. Мультиспецифичные связывающие домены должны содержать по меньшей мере два специфичных связывающих участка, по аналогии с организацией антитела верблюдовых, или по меньшей мере четыре специфичных связывающих участка, по аналогии с организацией более традиционного антитела млекопитающих, содержащего парные цепи VL и VH. Участки CDR можно определять различными способами, известными в данной области, включаяKabat, Chothia, AbM и связанные способы определения. Определение Kabat основано на вариабельности последовательностей и применяется чаще всего для прогнозирования участков CDR (Johnson et al.(2000), Nucleic Acids Res. 28:214). Определение Chothia основано на расположении структурных петлевых фрагментов (Chothia et al. (1986), J. Mol. Biol. 196:901; Chothia et al. (1989), Nature, 342:877). Определение AbM представляет собой нечто среднее между определениями Kabat и Chothia и является объединенным набором программ для моделирования строения антител, созданным Oxford Molecular Group(Martin et al (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. (США), 86:9268; Rees et al., ABMTM, компьютерная программа,предназначенная для моделирования вариабельных областей антител, Oxford, UK; Oxford Molecular,Ltd.). Дополнительный вариант определения, известный как контактное определение, был представлен ранее (см. MacCallum et al. (1996), J. Mol. Biol. 5:732) и основан на анализе строения доступных в кристаллической форме комплексов. Участки CDR в составе тяжелой цепи принято обозначать как H1, H2 и Н 3, последовательная нумерация которых осуществляется по порядку от N-конца к C-концу. Длина участка CDR-H1 составляет приблизительно от 10 до 12 аминокислотных остатков, она начинается через четыре аминокислотных остатка после Cys согласно способам определения Chothia и AbM или на пять аминокислотных остатков позже согласно способу определения Kabat. За участком H1 могут следовать Trp, Trp-Val, Trp-Ile илиTrp-Ala. Длина H1 составляет приблизительно от 10 до 12 аминокислотных остатков согласно способу определения AbM, тогда как способ определения Chothia исключает последние четыре аминокислотных остатка. Участок CDR-H2 начинается через 15 аминокислотных остатков после окончания H1 согласно способам определения Kabat и AbM, и обычно ему предшествует последовательностьLeu-Glu-Trp-Ile-Gly (хотя известны и некоторые вариации), и обычно за ним следует последовательностьLys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala. Согласно способу определения Kabat длина участка Н 2 составляет приблизительно от 16 до 19 аминокислотных остатков, тогда как способ определения AbM прогнозирует длину указанного участка как 9-12 аминокислотных остатков. Начало участка CDR-H3 обычно расположено через 33 аминокислотных остатка после окончания Н 2, обычно ему предшествует последовательность аминокислот Cys-Ala-Arg, и за ним следует аминокислота Gly, длина указанного участка находится в интервале от 3 до приблизительно 25 аминокислотных остатков. Участки CDR в составе легкой цепи принято обозначать как L1, L2 и L3, последовательная нумерация которых осуществляется по порядку от N-конца к C-концу. Участок CDR-L1 обычно начинается приблизительно с 24 аминокислотного остатка, обычно ему предшествует остаток Cys. За участкомCDR-L1 обычно следует остаток Trp, с которого начинается одна из следующих последовательностей:Trp-Tyr-Gln, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln или Trp-Tyr-Leu. Длина CDR-1 составляет приблизительно от 10 до 17 аминокислотных остатков. Участок CDR-L2 начинается через 16 аминокислотных остатков после окончания участка L1 и обычно ему предшествуют остатки Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys или Ile-Phe. ДлинаCDR-L2 составляет приблизительно семь аминокислотных остатков. Участок CDR-L3 обычно начинается через 33 аминокислотных остатка после окончания участка L2 и обычно ему предшествует остатокCys, после указанного участка обычно следует последовательность Phe-Gly-XXX-Gly, и ее длина составляет от 7 до 11 аминокислотных остатков. Таким образом, связывающий домен согласно настоящему изобретению может включать один участок CDR вариабельной области антитела, направленного против CD86, или указанный связывающий домен может включать множество участков CDR, которые могут быть идентичными или могут различаться. В отдельных вариантах реализации связывающие домены согласно настоящему изобретению включают домены VH и VL, обладающие специфичностью по отношению к CD86, содержащие каркасные участки и участки CDR1, CDR2 и CDR3, где (а) домен VH содержит аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи; или (b) домен VL содержит аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи; или (с) связывающий домен содержит аминокислотную последовательность VH из (а) и аминокислотную последовательность VL из (b); или связывающий домен содержит аминокислотную последовательность VH из (а) и аминокислотную последовательность VL из (b) и где VH и VL находятся в составе одной и той же референтной последовательности. В дополнительных вариантах реализации связывающие домены согласно настоящему изобретению включают домены VH и VL, обладающие специфичностью по отношению к CD86, содержащие каркасные участки и участки CDR1, CDR2 и CDR3, где (а) домен VH содержит аминокислотную последовательность CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи; или (b) домен VL содержит аминокислотную последовательность CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи; или (с) связывающий домен содержит аминокислотную последовательность VH из (а) и аминокислотную последова-7 024877 тельность VL из (b); или связывающий домен содержит аминокислотную последовательность VH из (а) и аминокислотную последовательность VL из (b) и где VH и VL находятся в составе одной и той же референтной последовательности. В любом из вариантов реализации, описанных в настоящем документе,включающих специфичные участки CDR, связывающий домен может содержать (i) домен VH, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности домена VH; или (ii) домен VL, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности домена VL; или (iii) домен VH из (i) и домен VL из(ii); или домен VH из (i) и домен VL из (ii), при этом VH и VL находятся в составе одной и той же референтной последовательности, причем в составе каждого участка CDR содержится не больше трех замен аминокислот (т.е. многие замены расположены в каркасном участке (участках. Домен, связывающий CD86 в составе эксцепторных гибридных белков согласно настоящему изобретению, может представлять собой иммуноглобулин подобный домен, например каркасную область иммуноглобулина. Каркасные области иммуноглобулинов, предусматриваемые настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются scFv, антитело, состоящее из одного домена или антитело, состоящее только из тяжелой цепи. В случае scFv настоящее изобретение предусматривает вариабельные области тяжелой и легкой цепей, соединенные с любым пептидным линкером, известным в данной области как совместимый с объединением доменов или участков в составе связывающей молекулы. Примерами линкеров являются линкеры на основе линкерного мотива Gly4Ser, например (Gly4Ser)n, где n=1-5. Если связывающий домен в составе гибридного белка согласно настоящему изобретению получен на основе иммуноглобулина отличного от человека животного или включает участки CDR иммуноглобулина, происходящие не от человека, связывающий домен можно "гуманизировать" в соответствии со способами,известными в данной области. В качестве альтернативы CD86-связывающий домен гибридных белков согласно настоящему изобретению, может представлять собой каркас, отличный от каркасной области иммуноглобулина. Другие каркасы, предусматриваемые настоящим изобретением, представляют собой участок (участки) CDR, обладающие специфичностью по отношению к CD86, находящиеся в функциональной конформации. Другие предусматриваемые каркасы включают, но не ограничиваются, следующими: молекула содержащая домен А, домен фибронектина III, антикалин, полученная методами генной инженерии связывающая молекула с анкириновым повтором, аднектин, домен Кунитца или белковое аффитело с доменом AZ.IL-10. Согласно упомянутому выше в отдельных вариантах настоящего изобретения предложены полипептиды, содержащие домен или участок связывания, обладающий агонистическими свойствами по отношению к IL-10 (т.е. способный усиливать сигналинг IL-10). В некоторых вариантах реализации связывающий домен, обладающий агонистическими свойствами по отношению к IL-10, представляет собойIL-10 или IL-10 Fc или его биологически активный фрагмент. В других вариантах реализации связывающий домен, обладающий агонистическими свойствами по отношению к IL-10, представляет собой одноцепочечный связывающий белок, например scFv, избирательно связывающийся с IL-10R1 или рецептором 2 IL-10 (IL-10R2). В некоторых вариантах реализации связывающий домен, обладающий агонистическими свойствами по отношению к IL-10, представляет собой IL-10, содержащий точечную мутацию в 87 положении SEQ ID NO: 7, например от "I" до "А" или "S" (обозначенные в настоящем документе какI87A или I87S соответственно). Известно, что вариант молекул IL-10 187 обладает более слабыми иммуностимулирующими свойствами по сравнению с IL-10 дикого типа (Ding et al., J. Exp. Med. 191:213,2000). Также IL-10 обычно образует гомодимер с аминоконцевым участком каждой молекулы мономера,связывающейся с C-концевым участком другого мономера). В одном варианте реализации также был исследован связывающий домен, обладающий агонистическими свойствами по отношению к IL-10,представляющий собой молекулу IL-10, содержащую короткий линкер (gggsgg SEQ ID NO: 379), разделяющий две части молекулы (N- и С-фрагменты) таким образом, чтобы указанные части могли образовывать внутримолекулярный димер. Указанные молекулы обозначены в настоящем документе как молекулы моно-IL-10.IL-10 ( доступа Genbank NP 000563.1; SEQ ID NO: 754) является представителем суперсемейства цитокинов, структура которых представляет собой альфа-спираль. Хотя этому и не существует эмпирических доказательств, было сделано предположение о том, что все представители указанного семейства содержат в составе альфа-спираль (Fickenscher, H. et al., (2002), Trends Immunol. 23:89). IL-10 содержит четыре остатка цистеина, только один из которых является консервативным среди представителей семейства. Поскольку в строении IL-10 была показана V-образная складчатость, принимающая участие в его димеризации, похоже, что дисульфидные связи не имеют решающего значения для поддержания его структуры. Значение идентичности аминокислотного состава IL-10 с другими представителями семейства находится в интервале от 20% (IL-19) до 28% (IL-20) (Dumouter et al., (2002), Eur. Cytokine Netw. 13:5). Впервые IL-10 был описан как цитокин Th2 мыши, который ингибировал образование цитокинов ИФН- и ГМ-КСФ клетками Th1 (Moore et al., 2001, Annu. Rev. Immunol. 19:683; Fiorentino et al., (1989),J. Exp. Med. 170:2081). Длина IL-10 человека составляет 178 аминокислот, она содержит сигнальную по-8 024877 следовательность, состоящую из 18 аминокислот и зрелый сегмент, состоящий из 160 аминокислот. Его молекулярная масса составляет приблизительно 18 кДа (в мономерной форме). IL-10 человека не содержит потенциально N-связанного сайта гликозилирования и не подвергается гликозилированиюIL-10 содержит четыре остатка цистеина, образующих две межцепочечные дисульфидные связи. Спирали от А до D в составе одного мономера ковалентно взаимодействуют со спиралями Е и F в составе второго мономера с образованием не ковалентного V-образного гомодимера. Была построена карта функциональных доменов молекулы IL-10. На N-конце остатки 1-9, расположенные перед спиралью А, участвуют в пролиферации тучных клеток, тогда как аминокислотные остатки 152-160 на C-конце, расположенные перед спиралью F, опосредуют секрецию и хемотаксис лимфоцитов. Клетки, для которых была доказана способность к экспрессии IL-10, включают T-клетки CD8+,клетки микроглии, моноциты CD14+ (но не CD 16+), клетки Th2 CD4+ (мыши), кератиноциты, звездчатые клетки печени, T-клетки Th1 и Th2 CD4+ (человека), клетки меланомы, активированные макрофаги,естественные клетки-киллеры, дендритные клетки, B-клетки (CD5+ и CD19+) и эозинофилы. В случаеT-клеток первоначальное наблюдение об ингибировании IL-10 образования ИФН- в настоящее время рассматривается как непрямое действие, опосредованное А-клетками. Дополнительное влияние наT-клетки, тем не менее, включает хемотаксис T-клеток CD8+, индуцированный IL-10, ингибирование хемотаксиса T-клеток CD4+ по отношению к IL-8, подавление образования IL-2 вследствие активации,ингибирование апоптоза T-клеток посредством активации Вс 1-2 и прерывание пролиферации T-клеток вследствие слабой стимуляции антигеном при совместной стимуляции с CD28 (Akdis et al., (2001),Immunology 103:131). В случае B-клеток IL-10 выполняет несколько связанных, но обособленных функций. В совокупности с ФРО- и CD40L, IL-10 индуцирует образование IgA в "не обученных" (IgD+) B-клетках. Считается,что ФРО-P/CD40L стимулирует переключение класса, тогда как IL-10 вызывает дифференциацию и рост. При отсутствии ФРО-Р, IL-10 совместно действует с CD40L в стимулировании IgG1 и IgG3 (человека) и,следовательно, может являться прямым фактором переключения для подтипов IgG. Примечательно, чтоIL-10 оказывает противоположное действие на выделение IgE, вызываемое IL-4. Если IL-10 присутствует во время переключения класса, вызываемого IL-4, он меняет действие на противоположное; если он присутствует после коммитирования IgE, он усиливает секрецию IgE. Наконец, взаимодействие CD27/CD70 в присутствии IL-10 стимулирует образование плазматических клеток из B-клеток памяти (Agematsu etIL-10 также оказывает влияние на тучные клетки и клетки - естественные киллеры. В случае тучных клеток IL-10 вызывает выделение гистамина при блокировании выделения ГМ-КСФ и ФНО-. Указанное действие может иметь аутокринный механизм, поскольку известно, что в организме крысы IL-10 выделяют тучные клетки. В качестве доказательства его плейотропной природы можно привести тот факт, что IL-10 оказывает противоположное действие на клетки - естественные киллеры. Вместо того чтобы блокировать образование ФНО- и ГМ-КСФ, фактически IL-10 стимулирует указанную функцию в случае клеток - естественных киллеров. Также он усиливает пролиферацию клеток - естественных киллеров, вызываемую IL-2, и усиливает секрецию ИФН- в клетках - естественных киллерах, подвергнутых первичному воздействию IL-18. При совместном действии с IL-12 и/или IL-18, IL-10 усиливает цитотоксичность клеток - естественных киллеров (Cai et al., 1999, Eur. J. Immunol. 29:2658).IL-10 обладает ярко выраженным противовоспалительным действием на нейтрофилы. Он ингибирует выделение хемокинов MIP (воспалительного белка макрофагов)-Ia, MIP-1 и IL-8 и блокирует образование провоспалительных медиаторов IL- 1 и ФНО-. Также он снижает способность нейтрофилов к образованию супероксидов, вследствие чего препятствует клеточной цитотоксичности, опосредованной ПМН. Также IL-10 блокирует хемотаксис, вызываемый IL-8 и fMLP, возможно, посредством рецептора 1 СХС (Vicioso et al., (1998) Eur. Cytokine Netw. 9:247). В случае дендритных клеток (DC), IL-10 обычно проявляет иммуносупрессорное действие. Похоже,что он стимулирует дифференциацию макрофагов в CD14+ за счет дендритных клеток. Существуют представления, что IL-10 снижает способность дендритных клеток стимулировать T-клетки, особенно тип клеток Th1. Что касается экспрессии KTC-II, она может подавляться, может сохраняться без изменений или активироваться (Sharma et al., (1999) J. Immunol. 163:5020). По отношению к CD80 и CD86, IL-10 способен как к подавлению, так и к активации экспрессии указанных молекул. B7-2/CD86 выполняет ключевую функцию в активации T-клеток. По отношению к указанной молекуле, IL-10 принимает участие как в активирующем, так и в подавляющем действии. Тем не менее, возможно, наиболее значительное модуляторное действие IL-10 оказывает на CD40 (похоже, что IL-10 снижает его экспрессию). На уровне доменов, IL-10 может блокировать иммуностимуляцию путем ингибирования миграции клеток Лангерганса в ответ на появления провоспалительных цитокинов. Как альтернативный вариант, IL-10 блокирует этап созревания дендритных клеток, стимулируемый процессом воспаления, в ходе которого обычно происходит подавление CCR1, CCR2 и CCR5, и активация CCR7. Указанное блокирование, с сохранением CCR1, CCR2 и CCR5, ведет к невозможности миграции дендритных клеток к региональным лимфатическим узлам. Результатом становится иммобилизованная дендритная клетка, не стимулирующая T-клетки, но связывающая (и освобождающая) провоспалительные цитокины без ответа на нихIL-10 обладает несколькими зарегистрированными действиями на моноциты. Например, IL-10 снижает экспрессию KTC-II на поверхности клеток, а также ингибирует образование IL-12 вследствие стимуляции. Хотя он способствует преобразованию моноцита в макрофаг при совместном действии с М-КСФ, фенотип макрофага неясен (т.е. CD16+/цитотоксический либо CD16-). IL-10 также снижает выделение ГМ-КСФ и образование IL-8, при этом способствуя выделению IL-IRa (Gesser et al., (1997), Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 94:14620). В настоящее время известно, что гиалуронектин, компонент соединительной ткани, секретируется моноцитами в ответ на IL-10. Указанный факт может иметь некоторое значение для миграции клеток, в частности, при образовании метастазов клетками опухоли, поскольку известно, что гиалуронектин препятствует миграции клеток через внеклеточное пространство (Gesser et al.,(1997), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 94:14620). Было показано, что гибридные белки, содержащие IL-10 с Fc фрагментами мыши или макаки (обозначенными в настоящем описании как IL-10 Fc), ингибируют активность макрофагов и увеличивают продолжительность жизни ксенотрансплантата панкреатического островка (Feng et al. (1999),Transplantation 68:1775; Asiedu et al. (2007), Cytokine 40:183), а также снижают септический шок в модели мыши (Zheng et al. (1995), J. Immunol. 154:5590). Рецептор 1 IL-10 (IL-10R1) человека представляет собой трансмембранный гликопротеин I типа,пронизывающий мембрану один раз, длина которого составляет 90-110 кДа, экспрессируемый ограниченным количеством типов клеток (Liu et al., 1994, J. Immunol. 152:1821), слабая экспрессия которого наблюдается в поджелудочной железе, скелетной мускулатуре, мозге, сердце и почках, средние уровни экспрессии наблюдаются в плаценте, легких и печени. Моноциты, B-клетки, большие гранулярные лимфоциты и T-клетки демонстрируют высокий уровень экспрессии IL-10R1 (Liu et al., 1994, J. Immunol. 152:1821). Экспрессируемый белок содержит 578 аминокислот, включает сигнальный пептид, содержащий 21 аминокислот, внеклеточный участок, содержащий 215 аминокислот, трансмембранный сегмент,содержащий 25 аминокислот, и цитоплазматический домен, содержащий 317 аминокислот. В пределах внеклеточного участка находятся два мотива ФН III и сайт посадки STAT3, а также участок связывания сJAK1 в пределах цитоплазматического домена (Kotenko et al., 2000, Oncogene, 19:2557; Kotenko et al.,1997, EMBO J. 16: 5894). Рецептор 1 IL-10 связывает IL-10 человека с Kd, составляющей 200 пМ. В некоторых вариантах реализации связывающие домены согласно настоящему изобретению содержат домены VL и VH, обладающие специфичностью по отношению к рецептору 1 IL-10 или рецептору 2 IL-10, согласно описанному в настоящем документе. В отдельных вариантах реализации домены VL иVH представляют собой домены молекул из организма человека. Домены VL и VH могут быть ориентированы в любом направлении и могут быть разделены аминокислотным линкером, содержащим до приблизительно 30 аминокислот, согласно описанному в настоящем документе, или любой другой последовательностью аминокислот, способной выполнять функцию спейсера, сочетающуюся с взаимодействием двух частей связывающихся доменов. В отдельных вариантах реализации линкер, соединяющий доменыVL и VH, содержит аминокислотную последовательность согласно приведенному в SEQ ID NO: 43-166,244, 307, 320, 355-379 и 383-398, например, линкер, приведенный в SEQ ID NO: 244, 46 линкер(SEQ ID NO: 88), 130 линкер (SEQ ID NO: 163) или 131 линкер (SEQ ID NO: 164). Мультиспецифичные связывающие домены могут содержать по меньшей мере два специфические связывающих фрагмента, по аналогии со строением антитела верблюдовых, или по меньшей мере четыре специфических связывающих фрагмента, по аналогии со строением более часто применяемого антитела млекопитающих, состоящего из парных цепей VL и VH. В дополнительных вариантах реализации связывающие домены согласно настоящему изобретению,обладающие специфичностью по отношению к IL-10R1 или IL-10R2, могут содержать в своем составе один или более гипервариабельный участок ("CDR") или множественные копии одного или более из указанных CDR, которые были получены, произведены от или разработаны на основе scFv или Fabфрагмента, направленного против IL-10R1 или IL-10R2, или вариабельных областей в составе их легкой или тяжелой цепи. Следовательно, связывающий домен согласно настоящему изобретению может содержать один участок CDR из состава вариабельной области молекулы, направленной против IL-10R1 или IL-10R2, или может содержать множественные участки CDR, которые могут быть идентичными или различаться. Мультиспецифичные гибридные белки. Согласно настоящему изобретению предложены мультиспецифичные гибридные белки, содержащие домен, связывающийся с CD86 ("домен, связывающий CD86 "), и домен, связывающийся с молекулой, отличной от CD86 ("гетерологичный связывающий домен"). В отдельных вариантах реализации гетерологичный связывающий домен представляет собой агонист IL-10. В отдельных вариантах реализации гетерологичный связывающий домен представляет собой агонист IL-10, например IL-10, IL-10-Fc или одноцепочечный участок связывания, специфическим образом связывающийся с IL-10R1 или Согласно настоящему изобретению предусмотрены гибридные белки, в составе которых домен,связывающий CD86, может находиться на N-конце, а гетерологичный связывающий домен - на C-конце. В отдельных вариантах реализации эксцепторная молекула соответствует приведенному в SEQ ID NO: 9,13, 17, 24, 28, 31, 35, 42, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 187, 189, 191, 193, 219, 221, 223, 237, 262, 302, 330,336, 338, 340 или 400. Также предусмотрены гибридные белки, в составе которых гетерологичный связывающий домен может находится на N-конце, а домен, связывающий CD86, - на C-конце. В отдельных вариантах реализации эксцепторная молекула соответствует приведенным в SEQ ID NO: 183, 185, 199,201, 203, 205, 207, 211, 213, 254, 258, 266, 276, 350, 352 или 354. Согласно приведенному в настоящем документе связывающие домены согласно настоящему изобретению могут быть соединены с любым концом промежуточного домена (например, константного участка иммуноглобулина или его фрагмента). Далее, каждый из двух или более связывающих доменов может быть соединен с промежуточным доменом посредством линкера согласно описанному в настоящем документе. Термин "промежуточный домен", употребляемый в настоящем описании, относится к аминокислотной последовательности, свободно функционирующей в качестве каркаса для одного или более связывающих доменов таким образом, чтобы указанный гибридный белок находился преимущественно (например, 50% или более от популяции гибридных белков) или главным образом (например, 90% или более от популяции гибридных белков) в форме одноцепочечного полипептида в композиции. Например,отдельные промежуточные домены могут выполнять структурную функцию (например, разделение в пространстве, гибкость, ригидность) или биологическую функцию (например, увеличение периода полувыведения из плазмы, например, из плазмы крови человека). Примеры промежуточных доменов, которые могут увеличивать период полувыведения из плазмы гибридных белков согласно настоящему изобретению, включают альбумин, трансферрин, каркасную область, связывающую белок плазмы и им подобные домены или их фрагменты. В отдельных предпочтительных вариантах реализации промежуточный домен, содержащийся в мультиспецифичном гибридном белке согласно настоящему изобретению, представляет собой "домен димеризации". Указанное определение относится к аминокислотной последовательности, обладающей способностью к стимуляции объединения по меньшей мере двух одноцепочечных полипептидов или белков посредством не ковалентных или ковалентных взаимодействий, например водородных связей, электростатических взаимодействий, сил Ван-дер-Ваальса, солевых мостиков, дисульфидных связей, гидрофобных взаимодействий и т.д., или любого сочетании указанных взаимодействий. Примеры доменов димеризации включают константные области тяжелой цепи иммуноглобулина или их фрагменты. Следует понимать, что домен димеризации будет преимущественно стимулировать образование димеров, но будет сохранять способность образования мультимерных комплексов более высокого порядка (например, тримеров, тетрамеров, пентамеров, гексамеров, септамеров, октамеров и т.д.). Термин "фрагмент константной области" употребляется в настоящем описании в отношении последовательности пептида, полипептида или белка, соответствующей или полученной из фрагмента или полноразмерной одной или более области константного участка, но не всех участков константной области исходного антитела. В предпочтительном варианте реализации фрагмент константной области представляет собой СН 2 СН 3 IgG, предпочтительно СН 2 СН 3 IgG1. В некоторых вариантах реализации участки константной области гибридного белка согласно настоящему изобретению не обладают или обладают минимальными эффекторными функциями в антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), антитело-зависимом клеточно-опосредованном фагоцитозе (ADCP) или активации комплемента и комплемент - зависимой цитотоксичности (CDC), при этом сохраняя способность связывать некоторые рецепторы Fc (например, связывание FcRn) и сохраняя относительно длительный период полувыведения in vivo. В отдельных вариантах реализации связывающий домен согласно настоящему изобретению соединен с константной областью IgG1 человека или ее фрагментом, при этом одна или боле аминокислот в составе константной области или IgG1 или ее фрагмента подвергнуты мутации: лейцин в 234 положении (L234), лейцин в 235 положении (L235), глицин в 237 положении (G237), глутамат в 318 положении (Е 318), лизин в 320 положении (K320), лизин в 322 положении (K322) или любое их сочетание (нумерация согласно EU). Например, любую из указанных аминокислот или более чем одну аминокислоту можно заменить на аланин. В дальнейшем варианте реализации каждая из аминокислот L234,L235, G237, E318, K320 и K322 (нумерация согласно EU) в составе Fc-фрагмента IgG1 заменена на аланин (т.е. L234A, L235A, G237A, E318A, K320A и K322A соответственно), и, возможно, также внесена мутация N297A (т.е., по существу, снятие гликозилирования участка СН 2). Методы внесения мутаций в Fc-фрагмент и вне его, способные изменять взаимодействия Fc с рецепторами Fc (CD 16, CD32, CD64, CD89, FcR1, FcRn) или с компонентом комплемента C1q (см., например, патент США 5624821; Presta (2002), Curr. Pharma. Biotechnol. 3:237), известны в данной области. Отдельные варианты реализации настоящего изобретения включают композиции, содержащие иммуноглобулин или гибридные белки, содержащие константную область IgG человека или ее фрагмент,где сохраняется связывание с FcRn и белком А и где Fc-фрагмент более не взаимодействует или взаимодействует в минимальной степени с другими рецепторами Fc или C1q. Например, связывающий домен согласно настоящему изобретению может быть соединен с константной областью IgG1 или ее фрагмен- 11024877 том, в которой аспарагин в 297 положении (N297 в соответствии с нумерацией EU) был подвергнут мутации замены на другую аминокислоту со снижением степени или исключением гликозилирования по этому сайту и, следовательно, отменой эффективного связывания Fc с рецептором Fc и C1q. Другим примером мутации является P331S, выключающая связывание C1q, но не влияющая на связывание Fc. В дальнейших вариантах реализации Fc-фрагмент иммуноглобулина может иметь измененный характер гликозилирования по сравнению с референтной последовательностью иммуноглобулина. Например, можно применять множество генетических методик для замены одного или более конкретного аминокислотного остатка из остатков, образующих сайт гликозилирования (см. Со et al. (1993), Mol.Immunol. 30:1361; Jacquemon et al. (2006), J. Thromb. Haemost. 4:1047; Schuster et al. (2005), Cancer Res. 65:7934; Warnock et al. (2005), Biotechnol. Bioeng. 92:831), например N297 в составе участка СН 2 (нумерация согласно EU). В качестве альтернативного варианта, для того чтобы добиться измененного характера гликозилирования, можно создавать клетки-хозяева, в которых получают гибридный белок. Например, один способ, известный в данной области, позволяет добиваться изменения гликозилирования в форме разделенных пополам, нефукозилированных вариантов, повышающих ADCC. Варианты, получаемые в результате экспрессии в клетке-хозяине, содержат фермент, модифицирующий олигосахариды. В качестве альтернативного варианта, предусмотрено применение методики Potelligent BioWa/KyowaHakko для снижения содержания фукозы в составе гликозилированных молекул согласно настоящему изобретению. В одном способе, известном в данной области, предусмотрены клетки СНО в качестве клеток-хозяев для получения рекомбинантного белка, в котором модифицируют характер гликозилированияFc-фрагмента иммуноглобулина через образование ГДФ-фукозы. В качестве альтернативного варианта, для изменения характера гликозилирования гибридных белков согласно настоящему изобретению применяют химические методики. Например, многие ингибиторы глюкозидазы и/или маннозидазы оказывают одно или более желательное действие по увеличению активности ADCC, усилению связывания рецептора Fc и изменению характера гликозилирования. В отдельном варианте реализации клетки, экспрессирующие мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению (включающий домен, обладающую антагонистичными свойствами по отношению к CD86, соединенный с агонистом IL-10, выращивают в среде культивирования, содержащей в составе модифицирующее вещество углеводородной природы в концентрации, повышающей ADCC молекул иммуногликопротеина, образуемых указанными клетками-хозяевами, где указанное модифицирующее вещество углеводородной природы содержится в концентрации меньшей 800 мкМ. В предпочтительном варианте реализации клетки, экспрессирующие указанные мультиспецифичные гибридные белки, выращивают в среде культивирования, содержащей кастаноспермин или кифуненсин, более предпочтительно кастаноспермин в концентрации 100-800 мкМ, например 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 или 800 мкМ. Способы изменения характера гликозилирования при применении модифицирующего вещества углеводородной природы, например кастаноспермина, описаны в опубликованной заявке на патент США 2009/0041756 или публикации РСТWO 2008/052030. В другом варианте реализации Fc-фрагмент иммуноглобулина может содержать модификации аминокислот, влияющие на связывание рецепторов Fc эффекторных клеток. Указанные модификации можно создавать при применении любой методики, известной в данной области, например, подхода, описанного в Presta et al. (2001), Biochem. Soc. Trans. 50:487. Согласно другому подходу для конструирования фрагментов константных областей, соответствующих Fc-фрагментам, для улучшения эффекторной функции клеточного цитолиза, доступна методика Xencor XmAb (см. Lazar et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci(USA), 103:4005). При применении указанного подхода, например, возможно создание фрагментов константных областей с повышенной специфичностью и связыванием с рецептором Fc, и, следовательно, с улучшенной эффекторной функцией клеточного цитолиза. Также существуют варианты реализации, в которых константная область или ее фрагмент, возможно, способны увеличивать период полувыведения из сыворотки или усиливать плацентарный перенос по сравнению с соответствующим гибридным белком, не содержащим промежуточный домен. В отдельных вариантах реализации увеличенный период полувыведения гибридного белка согласно настоящему изобретению в организме человека составляет по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4,по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 18, по меньшей мере 20,по меньшей мере 24, по меньшей мере 30, по меньшей мере 36, по меньшей мере 40, по меньшей мере 48 ч, по меньшей мере несколько дней, по меньшей мере неделю, по меньшей мере две недели, по меньшей мере несколько недель, по меньшей мере месяц, по меньшей мере два месяца, по меньшей мере несколько месяцев или более. Фрагмент константной области может включать часть или все из приведенных ниже доменов: домен CH2 и домен CH3 (IgA, IgD, IgG, IgE или IgM), или домен CH3 и домен CH4 (IgE или IgM). Следовательно, термин фрагмент константной области, согласно определенному в настоящем документе, может относиться к полипептиду, соответствующему фрагменту константного участка иммуноглобулина. Фрагмент константной области может включать домен CH2 и домен CH3, полученные из одинаковых или различных иммуноглобулинов, серотипов антител или аллельных вариантов. В некоторых вариантах реализации домен CH3 является усеченным и содержит C-концевую последовательность, приведенную в заявке на патент США 12/041590 (представляющей собой CIP PCT/US2007/071052) какSEQ ID NOs: 366-371. В отдельных вариантах реализации фрагмент константной области полипептида согласно настоящему изобретению включает домен CH2 и домен CH3, которые, возможно, могут содержать аминоконцевой линкер, карбоксиконцевой линкер или линкеры на обоих концах молекулы."Линкер" представляет собой пептид, соединяющий или связывающий другие пептиды или полипептиды, например линкер, содержащий в составе от приблизительно 2 до приблизительно 150 аминокислот. В составе гибридных белков согласно настоящему изобретению, линкер может соединять промежуточный домен (например, фрагмент константной области, полученный из иммуноглобулина) со связывающим доменом, или линкер может соединять два вариабельных участка связывающего домена или два участка в пределах одноцепочечного полипептида, образованного из гетеродимерной молекулы,например, EBI3 (SEQ ID NO: 25) и субъединица р 35 IL-12 (SEQ ID NO: 26) из состава IL-35. Например,линкер может представлять собой аминокислотную последовательность, полученную, из, произведенную от или разработанную на основе последовательности шарнирной области антитела, последовательности,соединяющей связывающий домен с рецептором или последовательности, соединяющей связывающий домен с трансмембранным участком поверхности клетки или мембранным якорем. В некоторых вариантах реализации линкер может содержать в своем составе по меньшей мере один остаток цистеина, способный участвовать в образовании по меньшей одной дисульфидной связи при нормальных условиях или при других стандартных условиях реакций пептидов (например, в условиях очистки пептидов, в условиях хранения пептидов). В отдельных вариантах реализации линкер, соответствующий или аналогичный пептиду шарнирной области иммуноглобулина, сохраняет остаток цистеина, соответствующий остатку цистеина, расположенного в направлении аминотерминального конца указанной шарнирной области. В дальнейших вариантах реализации предусмотрен линкер из состава шарнирной области IgG1 илиIgG2A, содержащий в составе один или два остатка цистеина, соответствующих остаткам цистеина в составе шарнирной области. В отдельных вариантах реализации между промежуточными доменами образованы одна или более внутренние дисульфидные связи. В других вариантах реализации гибридные белки согласно настоящему изобретению могут содержать промежуточный домен, непосредственно соединенный со связывающим доменом (т.е., в отсутствие линкера или шарнирной области). В некоторых вариантах реализации промежуточный домен представляет собой домен димеризации, напримерFc-фрагмент СН 2 СН 3 из состава IgG1. Промежуточный домен или домен димеризации в составе гибридных белков согласно настоящему изобретению может быть связан с одним или более концевым связывающим доменом посредством пептидного линкера. В дополнение к обеспечению функции пространственного разделения, линкер может сообщать гибкость или ригидность, способствующие правильной ориентации одного или более связывающих доменов гибридного белка, как в пределах молекулы гибридного белка, так и между гибридными белками или гибридным(и) белком (белками) и мишенью (мишенями). Далее, линкер может поддерживать экспрессию полноразмерного гибридного белка и стабильность очищенного белка как in vitro, так и in vivo после введения субъекту, нуждающемуся в этом, например, человеку, и предпочтительно является не иммуногенным или слабо иммуногенным в организме указанных субъектов. В отдельных вариантах реализации линкер, соединяющий промежуточный домен или домен димеризации в составе мультиспецифичных гибридных белков согласно настоящему изобретению, может включать часть шарнирной области иммуноглобулина или указанную область целиком. Также связывающий домен может включать области VH и VL, и указанные области вариабельного участка могут быть связаны посредством линкера. Примеры линкеров, соединяющих связывающий домен вариабельного участка, включают линкеры, принадлежащие к семейству (GlynSer), например(GIy3SeT)n(GIy4SeT)1, (Gly3Ser)1(Gly4Ser)n, (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n или (Gly4Ser)n, где n представляет собой число от 1 до 5 (см., например, 22, 29, 46, 89, 90, 116, 130 и 131 линкеры, соответствующиеSEQ ID NOs: 64, 71, 88, 131, 132, 149, 163 и 164 соответственно). В предпочтительных вариантах реализации указанные линкеры на основе мотива (GlynSer) применяют для присоединения вариабельных областей и не применяют для присоединения связывающие домены (например, scFv) к промежуточному домену (например, CH2CH3 IgG). Примеры линкеров, подходящих для применения для соединения промежуточного домена (например, фрагмента константной области, полученного на основе молекулы иммуноглобулина) со связывающим доменом или соединения двух вариабельных участков связывающего домена, приведены вSEQ ID NOs: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 и 383-398. Линкеры, предусматриваемые настоящим изобретением, включают, например, пептиды, полученные из любого участка внутри области молекулы представителя суперсемейства иммуноглобулинов (например, шарнирной области антитела) или "стебель" в составе лектинов С-типа, семейства белков мембраны II типа. Длина указанных линкеров находится в интервале от приблизительно 2 до приблизительно 150 аминокислот, или от приблизительно 2 до приблизительно 40 аминокислот, или от приблизительно 8 до приблизительно 20 аминокислот, предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 60 аминокислот, более предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 30 аминокислот и наибо- 13024877 лее предпочтительно от приблизительно 15 до приблизительно 25 аминокислот. Например, длина 1 линкера составляет две аминокислоты, а длина 116 линкеров - 36 аминокислот (1-133 линкеры приведены в SEQ ID NOs: 43-166 соответственно; дополнительные примеры линкеров приведены вSEQ ID NOs: 244, 307, 320, 355-379 и 383-398). Помимо общих требований к длине, линкер, подходящий для применения в составе гибридных белков согласно настоящему изобретению, включает шарнирную область антитела, выбранную из следующих: шарнирная область IgG, шарнирная область IgA, шарнирная область IgD, шарнирная область IgE или варианты указанных областей. В отдельных вариантах реализации линкер может представлять собой шарнирную область антитела (верхняя и коровая область), выбранного из следующих: IgG1 человека,IgG2 человека, IgG3 человека, IgG4 человека или фрагменты или варианты указанных областей. Определение линкера, представляющего собой "шарнирную область иммуноглобулина", употребляемое в настоящем описании, относится к аминокислотам, расположенным между C-концом СН 1 и N-концом СН 2(для IgG, IgA и IgD) или N-концом СН 3 (для IgE и IgM). Определение "шарнирная область иммуноглобулина дикого типа", употребляемое в настоящем описании, относится к аминокислотной последовательности, встречающейся в природе, расположенной между участками СН 1 и СН 2 (для IgG, IgA и IgD), и связывающей их, или расположенной между участками СН 2 и СН 3 (для IgE и IgM) и связывающей их, в составе тяжелой цепи антитела. В предпочтительных вариантах реализации последовательности шарнирных областей иммуноглобулина дикого типа происходят из организма человека. По данным кристаллографических исследований, шарнирную область IgG структурно и функционально можно подразделить на три участка: верхняя шарнирная область, коровая или центральная шарнирная область и нижняя шарнирная область (Shin et al., Immunological Reviews, 130:87 (1992. Примеры верхних шарнирных областей включают EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 383), находящуюся в составе IgG1,ERKCCVE (SEQ ID NO: 384) находящуюся в составе IgG2, ELKTPLGDTT HT (SEQ ID NO: 385) илиEPKSCDTPPP (SEQ ID NO: 386) находящуюся в составе IgG3, и ESKYGPP (SEQ ID NO: 387), находящуюся в составе IgG4. Примеры центральных шарнирных областей включают СРРСР (SEQ ID NO: 398),находящуюся в составе IgG1 и IgG2, CPRCP (SEQ ID NO: 388) находящуюся в составе IgG3, и CPSCP(SEQ ID NO: 389), находящуюся в составе IgG4. Тогда как антитела IgG1, IgG2 и IgG4, похоже, содержат одинаковые верхние и центральные шарнирные области, IgG3 содержит четыре последовательно расположенные области: одну область ELKTPLGDTT HTCPRCP (SEQ ID NO: 390) и три областиEPKSCDTPPPCPRCP (SEQ ID NO: 391). Похоже, что в составе антител IgA и IgD отсутствует IgG-подобная коровая область, a IgD содержит две последовательно расположенные верхние шарнирные области (см. SEQ ID NOs: 392 и 393). Примеры верхних шарнирных областей дикого типа, встречающихся в составе антител IgA1 и IgA2, приведены в(SEQ ID NOs: 394 и 395, соответственно. Антитела IgE и IgM, напротив, вместо типичной шарнирной области содержат домен СН 2, обладающий свойствами, сходными со свойствами шарнирной области. Примеры доменов СН 2 дикого типа,подобных верхним шарнирным областям IgE и IgM, приведены в SEQ ID NO: 396 (VCSRDFTPPTTYKVTSTLTI KESDWLGQSM FTCRVDHRGL TFQQNASSMC VP) соответственно. Определения "видоизмененная шарнирная область иммуноглобулина " или "видоизмененная шарнирная область иммуноглобулина дикого типа" относится к (а) шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, содержащей до 30% изменений в аминокислотном составе (например, до 25, 20, 15, 10 или 5% замен или делеций аминокислот), (b) фрагменту шарнирной области иммуноглобулина дикого типа,длина которого составляет по меньшей мере 10 аминокислот (например, по меньшей мере 12, 13, 14 или 15 аминокислот), и содержащий до 30% изменений в аминокислотном составе (например, до 25, 20, 15,10 или 5% замен или делеций аминокислот) или (с) фрагменту шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, включающий центральную шарнирную область (длина указанного фрагмента может составлять 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот). В отдельных вариантах реализации один или более остатков цистеина в составе шарнирной области иммуноглобулина дикого типа могут быть заменены на один или более остатков другой аминокислоты (например, один или более остатков серина). Видоизмененная шарнирная область иммуноглобулина в качестве альтернативного или дополнительного варианта может включать остаток пролина шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, замененный на другой аминокислотный остаток(например, на остаток серина). Альтернативные последовательности шарнирной области и линкера можно создавать из фрагментов рецепторов поверхности клетки, связывающих IgV-подобные или IgC-подобные домены. Также в качестве соединительных областей или линкерных пептидов можно применять участки, расположенные между IgV-подобными доменами, в случае когда рецептор поверхности клетки содержит множественные последовательно расположенные IgV-подобные домены, и между IgC-подобными доменами, когда рецептор поверхности клетки содержит множественные последовательно расположенные IgC-подобные домены. В отдельных вариантах реализации длина последовательностей шарнирной области и линкерного участка составляет от 5 до 60 аминокислот, и они могут быть изначально гибкими, но также могут обладать более ригидными свойствами, и могут обладать первичной структурой -спирали с минимальной -складчатой структурой. В предпочтительном варианте последовательности стабильны в плазме и сыворотке и устойчивы к протеолитическому расщеплению. В некоторых вариантах реализации последовательности могут включать естественный или внесенный мотив, например СРРС (SEQ ID NO: 422),сообщающий способность к образованию дисульфидной связи или множественных дисульфидных связей для стабилизации С-терминального конца молекулы. В других вариантах реализации последовательности могут включать один или более сайтов гликозилирования. Примеры последовательности шарнирной области и линкерного участка включают участки, расположенные между IgV-подобными и IgCподобными доменами или между между IgV-подобными доменами или IgC-подобными доменами в составе CD2, CD4, CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD86, CD96, CD150, CD166 и CD244. Альтернативные способы создания шарнирных областей включают создание из областей рецепторов II типа,содержащих дисульфидные мостики, не относящихся к суперсемейству иммуноглобулинов, напримерCD69, CD72, и CD161. В отдельных вариантах реализации линкер согласно настоящему изобретению включает линкерscorpion. Линкеры scorpion включают пептиды, полученные из междоменных участков представителей суперсемейства иммуноглобулинов, например шарнироподобные пептиды, полученные из шарнирных участков иммуноглобулинов, например из шарнирных участков IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgE. В отдельных вариантах реализации в составе шарнироподобного линкера scorpion остается по меньшей мере один остаток цистеина, способный к образованию внутрицепочечной дисульфидной связи при нормальных условиях. Линкеры scorpion, полученные из IgG1, могут содержать 1 остаток цистеина или 2 остатка цистеина, и в их составе могут оставаться остаток цистеина, соответствующий цистеину шарнирной области на N-конце в составе IgG1 дикого типа. Не шарнироподобные пептиды также предусматриваются в качестве линкеров scorpion при условии, что указанные пептиды обеспечивают достаточное расстояние и гибкость для создания одноцепочечного полипептида, способного образовать два связывающих фрагмента, каждый из которых расположен в направлении конца белка (N и С) относительно более центрально расположенного фрагмента константного участка. Примеры не шарнироподобных линкеров scorpion включают пептиды в составе участка стебля из лектиновых областей стебля С-типа белков мембраны IL типа, например области стебля молекул CD69, CD72, CD94, NKG2A и NKG2D. В некоторых вариантах реализации линкер scorpion включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 355-359 и 365. В некоторых вариантах реализации линкер содержит один остаток цистеина для образования внутрицепочечной дисульфидной связи. В других вариантах реализации линкер содержит два остатка цистеина для образования внутрицепочечных дисульфидных связей между цепями. В дальнейших вариантах реализации линкер получают из междоменного участка иммуноглобулина (например, из шарнирной области иммуноглобулина) или из области "стебля" II типа лектина С-типа (полученного из белка мембраны II типа; см., например, примеры последовательностей областей "стебля" лектина, приведенные в опубликованной заявке РСТWO 2007/146968, например SEQ ID NOs: 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123,125, 127, 129, 131, 133, 135, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 231, 233, 235, 237, 239,241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 287,289, 297, 305, 307, 309-311, 313-331, 346, 373-377, 380 или 381 из указанной публикации, указанные последовательности включены в настоящий документ посредством ссылки). В одном аспекте настоящего изобретения примеры мультиспецифичных гибридных белков, содержащих в составе домен, связывающий CD86, согласно описанному в настоящем документе, также будут включать по меньшей мере один дополнительный домен или участок связывания, обладающий специфичностью по отношению к мишени, отличной от CD86 ("гетерологичный связывающий домен"). Например, гибридный белок согласно настоящему изобретению может содержать домен, связывающийCD86, соединенный посредством промежуточного домена с агонистом IL-10. В отдельных вариантах реализации мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению содержит первый и второй связывающие домены, первый и второй линкер и промежуточный домен, где один конец указанного промежуточного домена соединен посредством первого линкера с первым связывающим доменом, представляющим собой домен, связывающий CD86 (например, эктодомен CTLA4, эктодомен CD28,молекулу, направленную против CD86), а другой конец соединен посредством второго линкера с другим связывающим доменом, который представляет собой, например, агонист IL-10. В отдельных вариантах реализации первый линкер и второй линкер в составе мультиспецифичного гибридного белка согласно настоящему изобретению независимо выбраны, например, из 1-133 линкеров,приведенных в SEQ ID NOs: 43-166, и линкеров, приведенных в SEQ ID NOs: 244, 307, 320, 355-379 и 383-398. Например, в качестве первого и второго линкеров можно применять любой из 47, 58, 126-131 линкеров (SEQ ID NOs: 89, 100, и 159-164, соответственно) или линкеры, приведенные в SEQ ID NO: 244 или 355-379, или любое их сочетание. В дальнейших примерах один линкер представляет собой 47 лин- 15024877 кер (SEQ ID NO: 89) или 132 линкер (SEQ ID NO: 165), а другой линкер представляет собой линкер, приведенный в SEQ ID NO: 355, или 127 линкер (SEQ ID NO: 160), или один линкер представляет собой 58 линкер (SEQ ID NO: 100) или 133 линкер (SEQ ID NO: 166), а другой линкер представляет собой 126 линкер (SEQ ID NO: 159), или один линкер представляет собой 58 линкер (SEQ ID NO: 100) или 133 линкер (SEQ ID NO: 166), а другой линкер представляет собой 127 линкер (SEQ ID NO: 160), или один линкер представляет собой 58 линкер (SEQ ID NO: 100) или 133 линкер (SEQ ID NO: 166), а другой линкер представляет собой 128 линкер (SEQ ID NO: 161), или один линкер представляет собой 58 линкер(SEQ ID NO: 100) или 133 линкер (SEQ ID NO: 166), а другой линкер представляет собой 129 линкер(SEQ ID NO: 162). В дальнейших примерах, связывающие домены согласно настоящему изобретению,включающие домены VH и VL, например, домены, обладающие специфичностью по отношению к CD86,могут содержать в составе дополнительный (третий) линкер, расположенный между участками VH и VL,например, линкер, приведенный в SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 89, 46 линкер (SEQ ID NO: 88), 130 линкер (SEQ ID NO: 163) или 131 линкер (SEQ ID NO: 164). В любом из указанных вариантов реализации линкеры могут быть фланкированы одной-пятью дополнительными аминокислотами в пределах последовательности (например, 131 линкер содержит аланин в пределах коровой последовательности (G4S,на любом из концов (например, 130 линкер содержит серин на N-конце коровой последовательности(G4S или по обоим концам (например, 120 линкер содержит две аминокислоты (аспарагин-тирозин) на одном конце, и три аминокислоты (глицин-аспарагин-серин) на другом конце коровой последовательности (G4S, что может являться просто результатом создания указанной рекомбинантной молекулы (например, применение определенного фермента рестрикции для соединения молекул нуклеиновых кислот может привести к вставке от одной до нескольких аминокислот), или для целей настоящего изобретения может быть предусмотрен любой фрагмент любой определенной коровой последовательности линкера. В дальнейших вариантах реализации промежуточный домен в составе мультиспецифичного гибридного белка согласно настоящему изобретению состоит из константной области иммуноглобулина или ее фрагмента, где указанный промежуточный домен расположен между доменом, связывающим CD86, и связывающим доменом, представляющим собой агонист IL-10. В отдельных вариантах реализации промежуточный домен в составе мультиспецифичного гибридного белка согласно настоящему изобретению содержит домен, связывающий CD86 на N-конце и связывающий домен, представляющую собой агонистIL-10 - на карбоксиконце. В других вариантах реализации промежуточный домен в составе мультиспецифичного гибридного белка согласно настоящему изобретению содержит связывающий домен, представляющий собой агонист IL-10 на N-конце, и домен, связывающий CD86 на карбоксиконце. В дальнейших вариантах реализации фрагмент константного участка иммуноглобулина содержит в своем составе домены СН 2 и СН 3 из состава иммуноглобулина G1 (IgG1). В сходных вариантах реализации одна из следующих аминокислот в составе участков СН 2 и СН 3 IgG1 подвергнута мутации (т.е. в указанном положении содержится другая аминокислота): лейцин в 234 положении (L234), лейцин в 235 положении (L235), глицин в 237 положении (G237), глутамат в 318 положении (Е 318), лизин в 320 положении (K320), лизин в 322 положении (K322), также возможно любое сочетание указанных мутаций (нумерация в соответствии со способом Kabat). Например, любую из указанных аминокислот можно заменить на аланин. В другом варианте реализации в соответствии с нумерацией Kabat каждый из аминокислотных остатков L234, L235 и G237 в составе участка СН 2 подвергнут мутации замены на аланин (т.е.L234A, L235A и G237A соответственно) и каждый из аминокислотных остатков Е 318, K320 и K322 в составе участка СН 2 IgG1 подвергнут мутации замены на аланин (т.е. E318A, K320A и K322 А соответственно). В отдельных вариантах реализации мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению может включать иммунофармацевтическое средство на основе модульного белка малого размера" (SMIP). В этом отношении термин SMIP относится к классу высокомодульных веществ,обладающих улучшенными лекарственными свойствами по сравнению с моноклональными и рекомбинантными антителами. SMIP содержат одну полипептидную цепь, включающую участок, обладающий специфичностью по отношению к мишени, на основе, например, вариабельного участка антитела, в сочетании с вариабельным FC-фрагментом, благодаря которому возможен специфический рекрутинг целевых эффекторных клеток (например, макрофагов и клеток - естественных киллеров (NK и/или вовлечение процесса уничтожения, опосредованного комплементом. В зависимости от выбора мишени и шарнирных областей, SMIP способны проводить сигнал или блокировать передачу сигнала посредством рецепторов поверхности клетки. Сконструированные гибридные белки, обозначенные в настоящем документе как "иммунофармацевтические средства на основе модульного белка малого размера " или "продукты SMIP ", соответствуют описанию, приведенному в патентной публикации США 2003/133939,2003/0118592 и 2005/0136049, а также в международных патентных публикациях WO 02/056910,WO 2005/037989 и WO 2005/017148. В некоторых вариантах реализации мультиспецифичный гибридный белок может содержать молекулу PIMS, аналогичную описанным в патентной публикации США 2009/0148447 и международной патентной публикации WO 2009/023386. В отдельных вариантах реализации можно сконструировать мультиспецифичные гибридные белки согласно настоящему изобретению, передний и задний концы молекул которых обладают различной аффинностью, для направления на определенные типы клеток. Например, применение связывающего домена, обладающего специфичностью по отношению к CD86 (например, 3D1, FUN1 или их гуманизированные варианты), обладающего более высокой аффинностью по отношению к CD86, чем аффинность сконструированного агониста IL-10 (например, с внесенной мутацией 187 А или I87S, или конструкция моноIL-10) по отношению к IL-10R1 человека, и сочетание подобных молекул в составе эксцепторной молекулы согласно настоящему изобретению может благоприятствовать ее нацеливанию на определенный тип клеток, например на антигенпрезентирующие клетки (АПК). В этом направлении возможно создание гибридных белков, которые могут обладать более высокой или более низкой аффинностью по отношению к CD86 или более высокой или более низкой аффинностью по отношению к любому из гетерологичных белков направленного действия, описанных в настоящем документе, в зависимости от целевого типа клеток, выбранных в качестве мишени. В предпочтительных вариантах реализации связывающий домен, обладающий антагонистическими свойствами по отношению к CD86, предпочтительно нацеливает мультиспецифичную эксцепторную молекулу направленного действия на АПК за счет более высокой аффинности по отношению к CD86, чем аффинность указанного гетерологичного связывающего домена по отношению к его партнеру по связыванию. В некоторых вариантах реализации мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению содержит домен, связывающий CD86, включающий внеклеточный домен CTLA4 или его фрагмент, внеклеточный домен CD28 его фрагмент или связывающий домен, полученный из антитела, обладающего специфичностью по отношению к CD86. В отдельных вариантах реализации связывающий домен, полученный из антитела, обладающего специфичностью по отношению к CD86, получают из моноклонального антитела FUN1 (см., например, J. Pathol. 1993 Mar; 169(3):309-15) или получают из моноклонального антитела 3D1, направленного против CD86. В отдельных вариантах реализации домен, связывающий CD86, представляет собой sCTLA4, например, с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO: 1. В отдельных вариантах реализации домен, связывающий CD86, представляет собой sCTLA4, например, с последовательностью SEQ ID NO: 1 или участок, подобный вариабельному участку, CTLA4, например, приведенный в SEQ ID NO: 3, или его фрагмент. В других вариантах реализации домен, связывающий CD86, представляет собой sCD28, например,с последовательностью зрелого полипептида SEQ ID NO: 2 (сигнальный пептид: 1-18 аминокислоты). Также существуют варианты реализации, согласно которым домен, связывающий CD86, содержит вариабельные области легкой и тяжелой цепей FUN1 (например, SEQ ID NOs: 305 и 306) или 3D1 (например, SEQ ID NOs: 318 и 319), предпочтительно, в форме scFv. В дальнейших вариантах реализации мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению содержит домен связывания CD86 и гетерологичный связывающий домен, представляющий собой агонист IL-10 (см., например, аминокислотные последовательности гетерологичных доменов, приведенные в SEQ ID NOs: 7, 14, 15, 18-22, 25,26, 29, 32, 33, 36, 39 и 40). Примеры строения указанных мультиспецифичных гибридных белков, обозначенных в настоящем описании как эксцепторные молекулы, включают N-BD1-ID-BD2-C, N-BD2-ID- BD1-C, где N и С обозначают аминоконец и карбоксиконец молекулы соответственно; BD1 представляет собой домен, связывающий CD86, например иммуноглобулинподобный вариабельный участок или вариабельный участок иммуноглобулина или эктодомен; X представляет собой промежуточный домен, a BD2 представляет собой связывающий домен, являющийся агонистом IL-10. В составе некоторых конструкций X может представлять собой константный участок иммуноглобулина или его фрагмент, расположенный между первым и вторым связывающими доменами. В некоторых вариантах реализации мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению содержит промежуточный домен (X), имеющий следующее строение, в направлении от N-конца к C-концу: -L1-X-L2-, где каждый из L1 и L2 независимо представляет собой линкер, содержащий в составе от двух приблизительно до 150 аминокислот; и X представляет собой константную область иммуноглобулина или ее фрагмент. В дальнейших вариантах реализации мультиспецифичный гибридный белок содержит в составе промежуточный домен, представляющий собой альбумин, трансферрин или другой белок, связывающий белок сыворотки, где гибридный белок остается главным образом или по существу в форме одноцепочечного полипептида в композиции. Аминокислотные последовательности примеров эксцепторных гибридных белков приведены в Также существуют варианты реализации, согласно которым мультиспецифичные гибридные белки согласно настоящему изобретению имеют следующее строение: N-BD1-X-L2-BD2-C, где BD1 представляет собой домен, связывающий CD86, например связывающий домен, по меньшей мере на 90% идентичный эктодомену CTLA4; -X-представляет собой -L1-CH2CH3-, где L1 представляет собой первую шарнирную область IgG1, возможно, подвергнутую мутации замены первого или второго остатка цистеина,и где -СН 2 СН 3- представляет собой участок СН 2 СН 3 Fc-фрагмента IgG1; L2 представляет собой линкер,выбранный из SEQ ID NOs: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 и 383-398; и BD2 представляет собой связывающий домен, являющийся агонистом IL-10, согласно описанному в настоящем документе. В отдельных вариантах реализации мультиспецифичный эксцепторный гибридный белок содержит в составе (а) домен, связывающий CD86, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или по меньшей мере на 100% идентична последовательности зрелого полипептида SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, и (b) связывающий домен, представляющий собой агонистIL-10, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или по меньшей мере на 100% идентична последовательности зрелого полипептида гетерологичных связывающих белков, упомянутых выше, приведенной в SEQ ID NOs: 7, 14, 15, 18-22, 25, 26, 29, 32, 33, 36, 39 и 40,где в направлении от аминоконца к карбоксиконцу или от C-концу к N-концу (i) домен, связывающийCD86 варианта (а) или связывающий домен варианта (b) соединен с первым линкером, (ii) первый линкер соединен с константным участком СН 2 и СН 3 тяжелой цепи иммуноглобулина, приведенным в любой изSEQ ID NOs: 409 и 415-417, (iii) полипептид константного участка CH2CH3 соединен со вторым линкером,и (iv) второй линкер соединен с доменом, связывающим CD86 из (а) или связывающим доменом из (b). В отдельных вариантах реализации первый линкер представляет собой 47 линкер (SEQ ID NO: 89), 132 линкер (SEQ ID NO: 165) или 133 линкер (SEQ ID NO: 166), второй линкер представляет собой любой из 126-129 линкеров (SEQ ID NOs: 159-162), и дополнительный (третий) линкер, расположенный между доменами, связывающими CD86, в составе VH и VL, представляет собой 130 линкер (SEQ ID NO: 163) или 131 линкер (SEQ ID NO: 164). Примеры аминокислотных последовательностей эксцепторных гибридных белков приведены вSEQ ID NOs: 9, 13, 17, 24, 28, 31, 35, 38, 42, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195,197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 237, 239, 252, 254, 256, 258, 260, 262,266, 276, 302, 330, 334, 336, 338, 340, 350, 352 и 354; кодируемые полинуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NOs: 8, 12, 16, 23, 27, 30, 34, 37, 41, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184,186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 236, 238, 251,253, 255, 257, 259, 261, 265, 275, 301, 329, 333, 335, 337, 339, 349, 351 и 353 соответственно. Получение мультиспецифичных гибридных белков. Для производства любого из полипептидов или гибридных белков, содержащих связывающий домен, описанных в настоящем документе, с достаточным выходом, применяют лидерный пептид для усиления экспрессии вырабатываемых полипептидов и гибридных белков. Предполагается, что применение любого из стандартных лидерных пептидов (сигнальной последовательности) позволит направлять новообразованные полипептиды или гибридные белки по секреторному пути и добиваться отщепления лидерного пептида от зрелого полипептида или гибридного белка в области соединения лидерного пептида и полипептида или гибридного белка, или рядом с ней. Определенный лидерный пептид следует выбирать на основе факторов, известных в данной области, например применение последовательностей, кодируемых полинуклеотидами, позволяющими легкое введение или вырезание сайтов расщепления эндонуклеазой в начале или в конце кодирующей последовательности для лидерного пептида, для облегчения разработки молекулы лидерного пептида, с условием, что указанные последовательности определяют аминокислоты, не производящие нежелательного влияния на любой целевой процессинг лидерного полипептида новообразованного белка или не производящие нежелательного влияния на любую целевую функцию молекулы полипептида или гибридного белка, если лидерный пептид не отщепляется в ходе созревания полипептидов или гибридных белков. Примеры лидерных пептидов согласно настоящему изобретению включают естественные лидерные последовательности (т.е., последовательности, экспрессируемые с нативным белком) или применение гетерологичных лидерных последовательностей, например, H3N-MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG(X)n -CO2H, где X представляет собой любую аминокислоту, а значение n составляет от нуля до трех (SEQ ID NOs: 167, 419, 420 и 421), илиH3N-MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG-CO2H (SEQ ID NO: 168). Согласно упомянутому в настоящем документе предложены варианты и производные связывающих доменов, например эктодоменов, вариабельных областей тяжелой и легкой цепей и участков CDR, описанных в настоящем документе. В одном примере предложены варианты, полученные при помощи вставок, где один или более аминокислотных остатков дополняют последовательность специфичного связывающего агента. Вставки могут быть расположены на любом из концов или на обоих концах белка, или могут быть помещены в состав внутренних областей аминокислотной последовательности специфического связывающего агента. Варианты продуктов согласно настоящему изобретению также включают зрелые продукты специфических связывающих агентов, т.е. продукты специфических связывающих агентов, из состава которых удалена лидерная или сигнальная последовательность, и итоговый белок содержит дополнительные остатки на аминотерминальном конце. Дополнительные остатки на аминотерминальном конце могут быть получены из другого белка или могут включать один или более остатков, не определяемых как полученные из определенного белка. Предусмотрены полипептиды с дополнительным метионином в -1 положении, а также полипептиды согласно настоящему изобретению с дополнительными остатками метионина и лизина в -2 и -1 положениях. Варианты, содержащие в составе дополнительные остатки Met, Met-Lys или Lys (или один или более из основных остатков в целом), особенно удобны для повышенного образования рекомбинантного белка в бактериальных клетках-хозяевах. Термин "аминокислоты", употребляемый в настоящем описании, относится к природной (встречающейся в природе) аминокислоте, природной аминокислоте, содержащей заместители, неприродной аминокислоте, неприродной аминокислоте, содержащей заместители, или к любому их сочетанию. В настоящем описании приведены как стандартные однобуквенные обозначения природных аминокислот,так и трехбуквенные обозначения. Природные полярные аминокислоты включают аспарагин (Asp или N) и глутамин (Gln или Q); к основным аминокислотам относится аргинин (Arg или R), лизин (Lys или K),гистидин (His или Н) и их производные; и кислые аминокислоты, например, аспарагиновая кислота (Asp или D) и глутаминовая кислота (Glu или Е) и их производные. Природные гидрофобные аминокислоты включают триптофан (Trp или W), фенилаланин (Phe или F), изолейцин (Ile или I), лейцин (Leu или L),метионин (Met или М), валин (Val или V) и их производные; а также другие неполярные аминокислоты,например, глицин (Gly или G), аланин (Ala или А), пролин (Pro или Р) и их производные. Природные аминокислоты с промежуточными значениями полярности включают серин (Ser или S), треонин (Thr или Т), тирозин (Tyr или Y), цистеин (Cys или С) и их производные. Если не указано обратного, любая аминокислота, описанная в настоящем документе, может находиться как в D-, так и в L-конфигурации. Варианты, полученные путем замены, включают гибридные белки, из состава аминокислотных последовательностей которых один или более аминокислотных остатков удалены и замещены на другие остатки. В некоторых вариантах реализации характер замен является консервативным; тем не менее,объем настоящего изобретения также охватывает замены, являющимися не консервативными. Аминокислоты можно классифицировать на основе их физических свойств и их участия во вторичной и третичной структуре белка. В данной области консервативной заменой считают замену одной аминокислоты на другую аминокислоту, обладающую сходными свойствами. Примеры консервативных замен приведены в табл. 1 (см. ПЗ 97/09433, стр. 10, опубликовано 13 марта 1997 г.). Таблица 1 Консервативные замены I Другим вариантом классификации консервативных замен аминокислот является вариант, предложенный Lehninger (Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), p. 71-77), приведенный в табл. 2. Таблица 2 Консервативные замены II Варианты или производные также могут содержать дополнительные аминокислотные остатки,включающиеся за счет применения специфических систем экспрессии. Например, применение коммерчески доступных векторов, экспрессирующих целевой полипептид в форме фрагмента гибридного продукта глутатион-S-трансферазы (GST) позволяет получать целевой полипептид с дополнительным остатком глицина в -1 положении после отщепления компонента GST от целевого полипептида. Также предусмотрены варианты, образующиеся в результате экспрессии в системах других векторов, включая системы, в которых в состав аминокислотной последовательности включаются гистидиновые метки, обычно на С- и/или N-конце последовательности. Также предусмотрены варианты, получаемые в результате делеций, где один или более аминокислотных остатков удалены из состава связывающего домена согласно настоящему изобретению. Делецию можно осуществлять по одному или по обоим концам гибридного белка или путем удаления одного или более остатков внутри аминокислотной последовательности. В отдельных иллюстративных вариантах реализации гибридные белки согласно настоящему изобретению подвергаются гликозилированию, характер гликозилирования зависит от различных факторов,включая клетку-хозяина, в которой экспрессируется белок (в случае получения в рекомбинантных клетках-хозяевах) и условий культивирования. Также согласно настоящему изобретению предложены производные гибридных белков. Производные включают специфичные полипептидные связывающие домены, содержащие модификации, отличные от вставок, делеций или замен аминокислот. В отдельных вариантах реализации характер модификаций является ковалентным и включает, например, образование химических связей с полимерами, липидами и другими органическими и неорганическими молекулами. Производные согласно настоящему изобретению можно создавать для увеличения периода полувыведения полипептида специфичного связывающего домена или можно разрабатывать для улучшения направленной способности полипептидов воздействовать на целевые клетки, ткани или органы. Далее, в объем настоящего изобретения входят гибридные белки, подвергнутые ковалентной модификации или образующие производные путем присоединения одного или более водорастворимого полимера, например, полиоксиэтиленгликоля или полипропиленгликоля, согласно описанному в патентах США 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 и 4179337. Другие полезные полимеры, известные в данной области, включают монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу и другие полимеры на основе углеводородов, поли-(N-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры полипропиленгликоля, сополимер полипропиленоксид/этиленоксид, полиоксиэтилированные полиолы (например,глицерол) и поливиниловый спирт, а также смесь указанных полимеров. Особо предпочтительные варианты реализации включают белки, являющиеся производными полиэтиленгликоля (ПЭГ). Водорастворимые полимеры могут быть присоединены в определенных положениях, например, к аминотерминальному концу белков и полипептидов согласно настоящему изобретению или случайным образом присоединены к одной или более боковых цепей полипептида. Применение ПЭГ для улучшения терапевтических свойств описано в патенте США 6133426. В отдельном варианте реализации настоящего изобретения предложен гибридный белок, содержащий иммуноглобулин или Fc-фрагмент иммуноглобулина. Указанный гибридный белок может характеризоваться длительным периодом полувыведения, например, несколько часов, день или более, или даже неделя и более, в частности, если Fc-фрагмент способен взаимодействовать с FcRn, рецептором Fc новорожденных. Сайт связывания с FcRn в составе Fc-фрагмента также является сайтом связывания белков А и G бактерий. Сильное связывание между указанными белками можно использовать как средство очистки антител или гибридных белков согласно настоящему изобретению, при применении аффинной хроматографии с белком А или белком G в ходе очистки белка. Методики очистки белка хорошо известны специалистам в данной области. Указанные методики включают на одном из уровней, предварительное разделение на полипептидную и не - полипептидную фракции. Часто требуется дальнейшая очистка, включающая применение методик хроматографии и электрофореза для достижения частичной или полной очистки (или очистки до состояния гомогенности). К аналитическим методам, особенно подходящим для создания чистого гибридного белка, относятся ионно-обменная хроматография, эксклюзионная хроматография, электрофорез в полиакриламидном геле и изоэлектрическое фокусирование. Особенно эффективными методами очистки полипептидов являются жидкостная хроматография и ВЭЖХ. Отдельные аспекты настоящего изобретения касаются очистки и в отдельных вариантах реализации существенной очистки гибридного белка. Термин "очищенный гибридный белок", употребляемый в настоящем документе, относится к композиции, отделяемой от других компонентов, где гибридный белок очищают до любого состояния, сопоставимого с состоянием белка, получаемого в естественных условиях. Следовательно, термин "очищенный гибридный белок" также относится к гибридному белку, свободному от окружающей среды, вкоторой он встречается в природе. В общем случае "очищенный" будет относиться к композиции, содержащей в составе гибридный белок, подвергнутой разделению на фракции с удалением других различных компонентов, по существу,сохраняющей свою выраженную биологическую активность. В случаях, когда употребляется термин "по существу очищенный", указанное определение относится к композиции, в составе которой гибридный белок составляет основной элемент, например составляет приблизительно 50%, приблизительно 60%,приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 99% или более белка по массе в композиции. Специалистам в данной области техники известны различные методы количественной оценки степени очистки, в свете настоящего изобретения. Указанные методы включают, например, определение специфичной связывающей активности активной фракции или измерение количества гибридного белка во фракции при помощи анализа методом SDS/PAGE. Предпочтительным методом измерения чистоты белковой фракции является вычисление связывающей активности фракции, сравнение ее со связывающей активностью исходного экстракта и, таким образом, вычисление степени очистки, измеряемое в настоящем описании в "-кратный количественный показатель очистки". Фактические единицы, применяемые для представления величины связывающей активности, разумеется, будут зависеть от определенной методики анализа, выбранной для контроля очистки и определения, проявляет ли экспрессируемый гибридный белок измеряемую связывающую активность. Специалистам в данной области хорошо известны различные методики, подходящие для применения в очистке белков. Указанные методики включают, например, преципитацию с сульфатом аммония,ПЭГ, антителами и т.д. или путем тепловой денатурации с последующим центрифугированием; этапы хроматографии, например ионный обмен, гель-фильтрация, обращенная фаза, гидроксилапатит и аффинная хроматография; изоэлектрическое фокусирование; гель-электрофорез и сочетание перечисленных, а также других методик. В соответствии с общими представлениями в данной области техники считается,что порядок проведения этапов очистки можно изменять или можно исключать отдельные этапы, тем не менее, с получением в результате применения указанного метода по существу очищенного белка. Не существует общих требований, говорящих о том, что гибридный белок всегда должен применяться в его наиболее очищенном состоянии. Действительно, предусматривается, что в отдельных вариантах реализации будут применяться менее по существу очищенные белки. Частичную очистку можно осуществить путем применения сочетания меньшего количества этапов очистки или путем применения других видов той же общей схемы очистки. Например, известно, что использование катионнообменной колоночной хроматографии, проводимой с применением аппарата для ВЭЖХ, в общем случае приведет к большей степени очистки, чем указанная методика с применением системы хроматографии низкого давления. Методы, представляющие более низкую степень относительной очистки, могут иметь преимущества в общем выделении белкового продукта или в сохранении связывающей активности экспрессируемого белка. Известно, что перемещение полипептида может изменяться, иногда в значительной степени, при различных условиях проведения SDS/PAGE (Capaldi et al. (1977), Biochem. Biophys. Res. Comm. 76:425). Следовательно, стоит понимать, что при различных условиях проведения электрофореза кажущаяся молекулярная масса продуктов экспрессии очищенного и частично очищенного гибридного белка может различаться. Полинуклеотиды, векторы экспрессии и клетки-хозяева. Согласно настоящему изобретению предложены полинуклеотиды (выделенные или очищенные или чистые полинуклеотиды), кодирующие мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению, векторы (включая векторы клонирования и векторы экспрессии), содержащие указанные полинуклеотиды, и клетки (например, клетки-хозяева), трансформированные или трансфицированные при помощи полинуклеотида или вектора согласно настоящему изобретению. В отдельных вариантах реализации предусмотрен полинуклеотид (ДНК или РНК), кодирующий связывающий домен согласно настоящему изобретению, или мультиспецифичный гибридный белок,содержащий один или более указанных доменов. Кластеры экспрессии, кодирующие конструкции мультиспецифичных гибридных белков, приведены в примерах, прилагающихся к настоящему описанию. Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим полинуклеотид согласно настоящему изобретению, в частности к рекомбинантным экспрессионным конструкциям. В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий мультиспецифичный гибридный белок, включающий домен, связывающий CD86 и агонист IL10, согласно настоящему изобретению, вместе с другими полинуклеотидными последовательностями,вызывающими или усиливающими транскрипцию, трансляцию и процессинг указанных последовательностей, кодирующих мультиспецифичные гибридные белки. Соответствующие векторы экспрессии и клонирования, предназначенные для применения в прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах, описаны, например, в Sambrook et al., MolecularCloning: A Laboratory Manual., Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989). Примеры векторов клонирования/экспрессии включают векторы клонирования, челночные векторы и векторы экспрессии, которые можно создавать на основе плазмид, фагмид, фазмид, космид, вирусов, искусственных хромосом или любого средства переноса нуклеиновой кислоты, известного в данной области и подходящего для амплификации, переноса и/или экспрессии полинуклеотида, заключенного в нем. Термин "вектор", употребляемый в настоящем описании, означает молекулу нуклеиновой кислоты,способную к переносу другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Примеры векторов включают плазмиды, искусственно созданные хромосомы дрожжей и геномы вирусов. Отдельные векторы способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине, тогда как другие векторы можно включать в геном клетки-хозяина, вследствие чего они будут реплицироваться с геномом хозяина. Также отдельные векторы обозначены в настоящем документе как "рекомбинантные векторы экспрессии" (или просто "векторы экспрессии"), содержащие последовательности нуклеиновых кислот, функционально связанные с последовательностью, контролирующей экспрессию и, следовательно, способные направлять экспрессию указанных последовательностей. В отдельных вариантах реализации экспрессионные конструкты получают из векторов на основе плазмид. Иллюстративные конструкции включают модифицированный вектор pNASS (Clontech, PaloAlto, CA), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген устойчивости к ампициллину, сигнал полиаденилирования и сайт-промотор Т 7; pDEF38 и pNEF38 (CMC ICOS Biologies,Inc.), содержащие промотор CHEF1; и pD18 (Lonza), содержащий промотор CMV. Хорошо известны и другие подходящие векторы экспрессии млекопитающих (см., например, Ausubel et al., 1995; Sambrook etal., выше; также см., например, каталоги Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, WI; Pharmacia,Piscataway, NJ). Возможно создание удобных конструкций, включающих последовательность, кодирующую дигидрофолат редуктазу (ДГФР), при подходящем регулирующем воздействии, для повышения уровней образования гибридных белков, которые являются результатом амплификации гена вследствие применения соответствующего селектирующего агента (например, метотрексата). В общих чертах, рекомбинантные векторы экспрессии должны включать точки начала репликации и селектируемые маркеры, обеспечивающие трансформацию клетки-хозяина, и промотор, полученный из гена с высоким уровнем экспрессии, для направления транскрипции структурной последовательности в 5'-3' направлении согласно описанному выше. Вектор, функционально связанный с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению, запускает клонирование экспрессионной конструкции. Примеры конструкций, предназначенных для экспрессии/клонирования, содержат по меньшей мере один элемент контроля экспрессии, например промотор, функционально связанный с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению. В составе векторов и конструкций, предназначенных для экспрессии/клонирования, согласно настоящему изобретению также предусмотрены такие дополнительные элементы контроля экспрессии, как энхансеры, фактор-специфичные сайты связывания, терминаторы и сайты связывания рибосом. Гетерологичную структурную последовательность полинуклеотидов согласно настоящему изобретению с последовательностями инициации и терминации трансляции присоединяют в соответствующей фазе. Следовательно, например, нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению, кодирующие гибридные белки, можно включать в состав любого из различных сконструированных векторов экспрессии как рекомбинантную экспрессионную конструкцию для экспрессии указанного белка в клетке-хозяине. Соответствующую последовательность (соответствующие последовательности) ДНК можно включить в состав вектора, например, посредством различных методик. В общих чертах, последовательность ДНК вносят в соответствующий сайт (соответствующие сайты) для расщепления эндонуклеазой, посредством методик, известных в данной области. Предусмотрены общепринятые методики клонирования,выделения ДНК, амплификации и очистки, для ферментативных реакций с участием лигазы, расщепления эндонуклеазами и т.д. Некоторые общепринятые методики описаны, например, в Ausubel et al.Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK, 1985); Hames and Higgins (Eds.) (Nucleic Acid Hybridization,IRL Press, Oxford, UK, 1985); также возможно использование каких-либо других источников. Последовательность ДНК в составе вектора экспрессии функционально связывают по меньшей мере с одной последовательностью, регулирующей экспрессию (например, конститутивный промотор или регулируемый промотор) для направления синтеза мРНК. Иллюстративные примеры указанных последовательностей, регулирующих экспрессию, включают промоторы эукариотических клеток или вирусы эукариотических клеток согласно описанному выше. Промоторные области можно отобрать из любого целевого гена при помощи векторов CAT (хлорамфеникол-ацетилтрансферазы) или других векторов,несущих маркеры селекции. Эукариотические промоторы включают предранний белок ЦМВ, тимидин киназу HSV, ранний и поздний SV40, длинные концевые повторы (LTR) ретровируса и металлотионеин-I мыши. Выбор соответствующего вектора и промотора находится в пределах компетенции обычного специалиста в данной области, а создание отдельных особо предпочтительных рекомбинантных экспрессионных конструкций, включающих по меньшей мере один промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей белок или полипептид согласно настоящему изобретению, описано в настоящем документе. Также предусмотрены варианты полинуклеотидов согласно настоящему изобретению. Варианты полинуклеотидов по меньшей мере на 90%, а предпочтительно на 95, 99 или 99.9% идентичны полинуклеотидам заданной последовательности согласно описанному в настоящем документе, или вступают в реакцию гибридизации с указанными полинуклеотидами заданной последовательности в жестких условиях реакции гибридизации с 0.015 М хлоридом натрия, 0.0015 М цитратом натрия приблизительно при 65-68 С или с 0.015 М хлоридом натрия, 0.0015 М цитратом натрия и 50% формамидом приблизительно при 42 С. Варианты полинуклеотидов сохраняют способность кодировать связывающий домен или гибридный белок, содержащий в составе указанный домен, обладающий функциональной активностью согласно описанному в настоящем документе. Термин "жесткие" употребляется в отношении условий, обычно рассматриваемых в данной области как жесткие. Строгость условий гибридизации обычно определяется температурой, ионной силой и кон- 22024877 центрацией денатурирующих агентов, например формамида. Примерами жестких условий гибридизации и отмывки являются 0.015 М хлорид натрия, 0.0015 М цитрат натрия при приблизительно 65-68 С или 0.015 М хлорид натрия, 0.0015 М цитрат натрия и 50% формамид при приблизительно 42 С (см.Spring Harbor, N.Y., 1989). Также можно применять более жесткие условия (например, более высокая температура, большая ионная сила, более концентрированный формамид или другой денатурирующий агент); однако будет затронута степень гибридизации. В случаях, когда речь идет и гибридизации дезоксиолигонуклеотидов,дополнительные жесткие условия гибридизации включают отмывку в 6 стандартном цитратно-солевом буфере (SSC), 0.05% пирофосфат натрия при 37 С (для олигонуклеотидов, состоящих из 14 оснований),48 С (для олигонуклеотидов, состоящих из 17 оснований), 55 С (для олигонуклеотидов, состоящих из 20 оснований) и 60 С (для олигонуклеотидов, состоящих из 23 оснований). Согласно дальнейшему аспекту настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная при помощи или в другом варианте содержащая любой из полинуклеотидов или любую векторную/экспрессионную конструкцию согласно настоящему изобретению. Полинуклеотиды или векторные/экспрессионные конструкции вводят в любую соответствующую клетку при применении любого способа, известного в данной области, включая трансформацию, трансфекцию и трансдукцию. Клетки-хозяева включают клетки, применяемые в данной области, подвергающиеся терапии ex vivo, включая, например, генную терапию ex vivo. Клетки-хозяева эукариот, предусматриваемые данным аспектом настоящего изобретения при условии содержания полинуклеотида, вектора или белка согласно настоящему изобретению, включают, в дополнение к собственным клеткам субъекта (например, собственным клеткам пациента - человека), клетки VERO, клетки HeLa, линии клеток яичника китайского хомячка (СНО) (включая измененные клетки СНО, способные видоизменять характер гликозилирования экспрессируемых поливалентных связывающих молекул, см., например, опубликованную заявку на патент США 2003/0115614), клетки COS (например, COS-7), W138, BHK, HepG2, 3 Т 3, RIN,MDCK, A549, PC12, K562, клетки HEK293, клетки HepG2 cells, N клетки, клетки 3 Т 3, клетки Spodopterafrugiperda (например, клетки Sf9), клетки Saccharomyces cerevisiae или любые другие клетки эукариот,известные в данной области как удобные для экспрессии и, возможно, выделения, белка или полипептида согласно настоящему изобретению. Также предусмотрены клетки прокариот, включая Escherichia coli,Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, стрептомицеты или любые другие клетки прокариот, известные в данной области как удобные для экспрессии и, возможно, выделения, белка или полипептида согласно настоящему изобретению. В ходе выделения белка или пептида согласно настоящему изобретению из клеток прокариот, в частности, предусмотрена возможность применения методик экстракции белка из телец включений, известных в данной области. Выбор соответствующей клетки находится в пределах компетенции специалиста в данной области на основе сведений, изложенных в настоящем документе. Предусмотрены клетки-хозяева, гликозилирующие гибридные белки согласно настоящему изобретению. Термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") относится к клетке, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии. Следует понимать, что подобные термины употребляются с намерением обозначения не только отдельной целевой клетки, но также в отношении потомства указанной клетки. По причине того, что из-за мутаций или влияния окружающей среды в последующих поколениях могут появляться отдельные изменения, подобное поколение на практике может не являться идентичным родительской клетке, но, тем не менее, входит в понятие "клетка-хозяин", употребляемое в настоящем документе. Рекомбинантные клетки-хозяева можно культивировать в обычно применяемой питательной среде,измененной соответствующим образом для активации промоторов, отбора трансформантов или амплификации определенных генов. Условия культивирования определенных клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, например температура, рН и т.д., будут известны специалистам в данной области. Также для экспрессии рекомбинантного белка можно применять различные системы культур клеток млекопитающих. Примеры систем культур клеток млекопитающих включают линии COS-7 фибробластов почки обезьяны, описанные Gluzman (1981), Cell, 23:175, и другие клетки, способные к экспрессии совместимого вектора, например, линии клеток С 127, 3 Т 3, СНО, HeLa и BHK. Векторы экспрессии млекопитающих будут включать точку начала репликации, соответствующий промотор и, возможно, энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорный и акцепторный сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие последовательности, не подвергающиеся транскрипции, например, согласно описанному в настоящем документе, имеющие отношение к созданию поливалентных связывающих экспрессионных конструкций. Для получения целевых генетических элементов, не подвергающихся транскрипции, можно применять последовательности ДНК, полученные в результате сплайсинга SV40, и сайты полиаденилирования. Введение конструкции в клетку-хозяина можно осуществлять различными способами, хорошо знакомыми специалистам в данной области, включая кальций-фосфатную трансфекцию, DEAE-опосредованную декстраном трансфекцию или электропорацию (Davis et al. (1986), Basic Methods in Molecular Biology). В одном варианте реализации клетку-хозяин трансдуцируют рекомбинантной вирусной конструкцией, направляющей экспрессию белка или полипептида согласно настоящему изобретению. Трансдуцированная клетка-хозяин образует частицы вируса, содержащие белок или полипептид, полученный из фрагментов мембраны клетки-хозяина, включенных вирусными частицами в ходе активной репликации вируса в клетке. Композиции и способы применения. Для лечения млекопитающих, относящихся или не относящихся к роду человек, находящихся в болезненном состоянии, связанным с нарушением регуляции CD86, IL-10, HLA-G, IL-35, PD-1, BTLA,LIGHT, GITRL или CD40, пациенту вводят мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению в количестве, являющимся эффективным для облегчения симптомов болезненного состояния в результате проведения курса, включающего одно или более введений. Поскольку белки согласно настоящему изобретению являются полипептидами, их можно суспендировать или растворять в фармацевтически приемлемом растворителе, возможно, включающем стабилизатор или другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые можно применять при внутривенном введении путем инъекции или инфузии, согласно более подробному описанию, приведенному ниже. Фармацевтически эффективной дозой является доза, требуемая для предотвращения, подавления развития или лечения (облегчение симптома в определенной степени, предпочтительно всех симптомов) болезненного состояния. Фармацевтически эффективная доза зависит от формы заболевания, применяемой композиции, режима введения, типа пациента, подвергаемого лечению, физических характеристик конкретного пациента, рассматриваемых в связи с лечением, от одновременно принимаемых лекарств и других факторов, известных специалисту в области медицины. Например, можно вводить количество действующего вещества, находящееся в промежутке от 0.1 до 100 мг/кг массы тела (которое можно вводить однократно или в виде нескольких доз, вводимых каждый час, ежедневно, ежемесячно или в любой комбинации указанных режимов, составляющих соответствующий интервал), в зависимости от активности полипептидного связывающего домена или мультиспецифичного гибридного белка согласно настоящему изобретению. В отдельных аспектах настоящего изобретения предложены композиции гибридных белков. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению обычно включают один или более тип связывающих доменов или гибридного белка в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем,вспомогательным веществом или растворителем. Указанные носители не должны быть токсичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях. Фармацевтически приемлемые носители, применяемые в терапии, хорошо известны в области фармацевтики и описаны, например, в Remington'sPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro (Ed.), 1985). Например, можно применять стерильный солевой и фосфатный солевой буфер при физиологическом значении рН. В состав фармацевтических композиций можно включать консерванты, стабилизаторы, красители и им подобные. Например,в качестве консервантов можно добавлять бензоат натрия, сорбиновую кислоту или сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты. Id. at 1449. Также можно применять антиоксиданты и суспендирующие агенты. Id. Соединения согласно настоящему изобретению можно применять как в форме свободного основания, так и в форме соли, обе формы предусматриваются объемом настоящего изобретения. Фармацевтические композиции также могут содержать растворители, например, буферы, антиоксиданты, например, аскорбиновую кислоту, низкомолекулярные (менее приблизительно 10 остатков) полипептиды, белки, аминокислоты, углеводороды (например, глюкозу, сахарозу или декстрины), хелатообразующие вещества (например, ЭДТА), глутатион или другие стабилизаторы или вспомогательные вещества. Примерами соответствующих растворителей являются нейтральный буферный солевой раствор или солевой раствор в смеси с неспецифическим альбумином сыворотки. Предпочтительно, продукт оформляют в лекарственную форму в виде лиофилизата, с соответствующими растворами вспомогательных веществ в качестве растворителей. Композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения болезненных состояний у млекопитающих, относящихся или не относящихся к роду человек, развивающихся в результате или связанных с нарушением регуляции CD86, IL-10. Согласно приведенному выше описанию было показано, что блокирование связывания CD86 с CD28, например, путем введения Ig к CTLA4, обладает эффективностью при лечении аутоиммунных заболеваний, например, ревматоидного артрита. Известно,что IL-10 обладает иммуносупрессивными свойствами (Commins et al. (2008), J. Allergy Clin. Immunol. 121:1108-11; Ming et al., (2008), Immunity 28:468-476), и в ходе введения IL-10 пациентам, пораженным псориазом, наблюдали положительное воздействие (Asadullah et al. (1999), Arch. Dermatol. 135:187-92)and inflammatory bowel disease (Schreiber et al. (2000), Gastroenterology, 119:1461-72). Следовательно,мультиспецифичные гибридные белки согласно настоящему изобретению полезны для лечения различных аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, юношеский ревматоидный артрит, астма, системная красная волчанка (СКК), воспалительные заболевания кишечника (включая болезнь Крона и язвенный колит), реакция трансплантат-против-хозяина, псориаз, множественный склероз, дерматомиозит, полимиозит, злокачественная анемия, первичный билиарный цирроз,острый рассеянный энцефаломиелит (ADEM), болезнь Аддисона, анкилозирующий спондилит, анти- 24024877(также известный как "гигантоклеточный артериит"), аутоиммунная гемолитическая анемия, буллезный пемфигоид, васкулит, глютеновая энтеропатия, эндометриоз, гнойный гидраденит, интерстициальный цистит, кольцевидная склеродермия, склеродерма, нарколепсия, нейромиотония, витилиго и аутоиммунное заболевание внутреннего уха. Также мультиспецифичные гибридные белки согласно настоящему изобретению полезны для подавления неблагоприятных аллогенных иммунных реакций в ответ на трансплантацию органа (включая трансплантаты паренхиматозных органов или аллотрансплантаты),трансплантаты клеток и им подобные. Определение "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли полипептида, содержащего связывающий домен, или гибридного белка согласно настоящему изобретению, являющейся фармацевтически приемлемой и обладающей целевой фармакологической активностью исходного соединения. Указанные соли включают следующие: (1) соли, образованные путем добавления кислоты, в реакции с неорганической кислотой, например, с хлороводородной кислотой, бромоводородной кислотой, серной кислотой, азотной кислотой, фосфорной кислотой и так далее; или в реакции с органической кислотой,например, с уксусной кислотой, пропионовой кислотой, гексановой кислотой, циклопентапропионовой кислотой, гликолевой кислотой, пировиноградной кислотой, молочной кислотой, малоновой кислотой,янтарной кислотой, яблочной кислотой, малеиновой кислотой, фумаровой кислотой, винной кислотой,лимонной кислотой, бензойной кислотой, 3-(4-гидроксибензоил)бензойной кислотой, коричной кислотой,миндальной кислотой,метансульфоновой кислотой,этансульфоновой кислотой,1,2-этан-дисульфоновой кислотой, 2-гидроксиэтансульфоновой кислотой, бензолсульфоновой кислотой,4-хлорбензолсульфоновой кислотой, 2-нафталинсульфоновой кислотой, 4-толуолсульфоновой кислотой,камфорсульфоновой кислотой, 4-метилбицикло[2,2,2]окто-2-ен-1-карбоновой кислотой, глюкогептоновой кислотой, 3-фенилпропионовой кислотой, триметилуксусной кислотой, трет-бутилуксусной кислотой, лаурилсерной кислотой, глюконовой кислотой, глутаминовой кислотой, гидроксинафтойной кислотой, салициловой кислотой, стеариновой кислотой, муконовой кислотой и т.д.; или (2) соли, образованные в ходе реакции замещения кислого протона в составе исходного соединения на ион металла, например ион щелочного металла, щелочно-земельного металла или ион алюминия; или в результате образования координационной связи с органическим основанием, например с этаноламином, диэтаноламином,триэтаноламином, N-метилглюкамином или им подобными. В отдельных иллюстративных вариантах реализации полипептид или гибридный белок согласно настоящему изобретению вводят внутривенно, например, в форме болюсной инъекции или инфузии. Пути введения, в дополнение к внутривенному введению, включают оральный путь, местный, парентеральный (например, сублингвально или буккально), сублинвальный, ректальный, вагинальный, интраназальный и периспинальный. Термин "парентеральный", употребляемый в настоящем описании, включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрастенальные, внутрикавернозные, интратекальные, интрамеатальные, интрауретральные методики инъекций или инфузий. Фармацевтическую композицию создают таким образом, чтобы обеспечить действующим веществам, заключенным в ней,биологическую доступность при введении композиции пациенту. Композиции, предназначенные для введения пациенту, будут оформлены в одну или более стандартных лекарственных форм, где, например,таблетка может представлять собой лекарственную форму для однократного введения, а емкость для одного или более соединений согласно настоящему изобретению в форме аэрозоля может содержать множество единиц дозировки. В составе композиций, предназначенных для орального введения, может присутствовать вспомогательное вещество и/или связывающее вещество, например сахароза, каолин, глицерин, декстраны крахмала, циклодекстрины, альгинат натрия, этилцеллюлоза и карбоксиметилцеллюлоза. Как вариант, могут присутствовать подслащивающие агенты, консерванты, красители/красящие вещества, усилители вкуса или любое их сочетание. Также возможно применение покрывающей оболочки. В состав композиции, предназначенной для введения в форме инъекции, можно включить один или более из следующих агентов: поверхностно-активное вещество, консервант, увлажняющий агент, диспергирующий агент, суспендирующий агент, буфер, стабилизатор, изотонический агент, а также любое их сочетание. Для лекарственных форм на основе нуклеиновых кислот или для лекарственных форм, содержащих продукты экспрессии согласно настоящему изобретению, предусмотрена доза, находящаяся в промежутке от приблизительно 0.01 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг массы тела, например, путем внутрикожного, подкожного, внутримышечного или внутривенного введения или любым путем, известным в данной области, подходящим при данных условиях. Предпочтительная доза составляет, например, от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг, особо предпочтительная доза составляет от приблизительно 5 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Специалистам в данной области будет очевидно, что количество и частота введений будут зависеть от реакции реципиента. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут находиться в любой форме, позволяющей осуществлять введение композиции в организм пациента, например, в твердой, жидкой форме или в состоянии газа (аэрозоль). Композицию можно предоставлять в форме жидкости, например в форме эликсира, сиропа, раствора, эмульсии или суспензии, для введения любым из путей, описанных в настоящем документе. Жидкая фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, как в форме раствора,так и в форме суспензии или в другой подобной форме может включать один или более из следующих компонентов: стерильные растворители, например вода для инъекций, солевой раствор (например, физиологический солевой раствор), раствор Рингера, изотонический хлорид натрия, жирные масла, например синтетические моно- или диглицериды, которые могут служить растворяющей или суспендирующей средой, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; противобактериальные агенты, например бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, например аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; буферы, например ацетатные, цитратные или фосфатные буферы; хелатирующие агенты, например этилендиаминтетрауксусная кислота; и агенты, регулирующие тонус мышц,например натрий, хлорид или декстроза. Лекарственную форму, предназначенную для парентерального введения, можно поместить в ампулы, шприцы для одноразового применения или ампулы многоразового применения, произведенные из стекла или пластика. Предпочтительной добавкой является физиологический солевой раствор. Фармацевтическая композиция, предназначенная для инъекций, предпочтительно является стерильной. Также может быть желаемо включение других компонентов в состав лекарственной формы, например средства доставки, включая соли алюминия, эмульсии типа вода-в-масле, биодеградируемые масляные среды, эмульсии типа масло-в-воде, биодеградируемые микрокапсулы и липосомы. Примеры адъювантов, применяемых с указанными средами, включают N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглутамин(MDP), липополисахариды (ЛПС), глюкан, IL-12, ГМ-КСФ, интерферон- и IL-15. Хотя в составе фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению можно применять любой подходящий носитель, известный обыкновенному специалисту в данной области, вид носителя будет изменяться в зависимости от режима введения и в зависимости от того, требуется ли замедленное высвобождение. В композициях, предназначенных для парентерального введения, носитель может представлять собой воду, солевой раствор, спирт, спирт, воск, буфер или любое их сочетание. В композициях, предназначенных для орального введения, можно применять любой из указанных выше носителей или твердый носитель, например маннитол, лактозу, крахмал, стеарат магния, натрия сахарин,тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния или любое их сочетание. Также предусмотрено введение композиций, содержащих в составе мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению, в сочетании со вторым агентом. Второй агент может представлять собой агент, принятый в данной области в качестве стандартного лекарственного средства для лечения определенного болезненного состояния, например, воспалительного, аутоиммунного или ракового заболевания. Примеры предусматриваемых дополнительных агентов включают цитокины, факторы роста, стероиды, NSAIDs, DMARDs, хемотерапевтические агенты, радиотерапевтические агенты или другие действующие и вспомогательные агенты. Настоящее изобретение предусматривает единицу дозирования, содержащую фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению. Указанные единицы дозирования включают, например,ампулу или шприц одно- или многоразового применения, включая двухкамерную ампулу или шприц, где в одной камере содержится фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению в лиофилизированной форме, а в другой - растворитель. Единица дозирования многоразового применения также может представлять собой, например, контейнер или трубку, связывающуюся с устройством внутривенного введения. Также согласно настоящему изобретению предусмотрен набор, содержащий фармацевтическую композицию в емкости, предназначенной для одно- или многоразового применения, например в ампуле,и набор инструкций по введению композиции пациентам, пораженным заболеванием согласно описанному в настоящем документе. Все патенты США, публикации патентных заявок США, заявки на патент США, иностранные патенты, заявки на иностранные патенты, не патентные публикации, таблицы, последовательности, интернет - страницы и так далее, относящиеся к настоящему изобретению, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Следующие примеры приведены в иллюстративных целях и не ограничивают собой объем настоящего изобретения. Примеры Последовательности эксцепторных молекул. Аминокислотные последовательности примеров мультиспецифичных гибридных белков, содержащих эктодомен CTLA4, приведены в SEQ ID NOs: 8, 12, 16, 23, 27, 30, 34, 37 и 41 и SEQ ID NOs: 9, 13,17, 24, 28, 31, 35, 38 и 42 соответственно. Активность указанных примеров мультиспецифичных гибридных белков исследовали в соответствии с описанием, приведенным ниже, в примерах 1-6. Аббревиатуры,использованные в приведенных ниже примерах, включают следующие термины: ФСБ-Т: ФСБ, рН 7.2-7.4 и 0.1% Tween 20; рабочий буфер: ФСБ-Т с 1% БСА; блокирующий буфер: ФСБ-Т с 3% БСА. Пример 1. Связывающие домены, направленные против CD86. Применяли гибридомы 3D1 и FUN1 для клонирования вариабельных связывающих областей указанных моноклональных антител, направленных против CD86. Последовательности, соответствующие тяжелой цепи, легкой цепи, линкеру scFv и участкам CDR в составе моноклональных антител FUN1 и 3D1, моноклональных антител, направленных против CD86, приведены в SEQ NOs: 305-313 и 318-326 соответственно. Для конструирования белков SMIP и эксцепторных белков применяли следующие вариабельные области гуманизированного моноклонального антитела FUN1, направленного против CD86. УчасткиCDR FUN1 трансплантировали в эмбриональные последовательности человека следующим образом:(1) FUN1-11 содержал FR Igkv4-401 для легкой цепи и FR IgHVI-F01 для тяжелой цепи;(2) FUN1-21 содержал FR Igkv4-101 для легкой цепи и FR IgHVI-202 для тяжелой цепи;(3) FUN1-31 содержал FR Igkv4-101 для легкой цепи и FR IgHV3-1101 для тяжелой цепи;(4) FUN1-12 содержал FR Igkvi-2701 для легкой цепи и FR IgHVI-F01 для тяжелой цепи;(5) FUN1 -22 содержал FR Igkvi-2701 для легкой цепи и FR IgHVI-202 для тяжелой цепи;(6) FUN1-32 содержал FR Igkvi-2701 для легкой цепи и FR IgHV3-1101 для тяжелой цепи. Участки CDR эмбриональной последовательности гуманизированных молекул аналогичны участкам в составе исходных молекул FUN1. В результате, также были созданы шесть следующих версий гуманизированных белков SMIP FUN1:(6) FUN1-32 (SEQ ID NO: 235). Связывающая активность указанных гуманизированных молекул SMIP FUN1 показана на фиг. 7. Также для создания эксцепторных молекул применяли вариабельные участки (scFv) FUN1 и гуманизированные scFv FUN1, например IL-10FUN1 (SEQ ID NO: 183); FUN1IL-10 (SEQ ID NO: 187);(SEQ ID NO: 258); и также была сконструирован связывающий домен моно-IL-10FUN1-21 с применением короткой шарнирной области А 2 (SEQ ID NO: 276) (где аминокислотная последовательность шарнирной области А 2 приведена в SEQ ID NO: 364). Указанные, а также все другие конструкции, описанные в настоящем документе, клонировали в соответствующие векторы экспрессии млекопитающих и экспрессировали в различных линиях клеток с образованием белка для различных функциональных исследований. Пример 2. Анализ связывания эксцепторных молекул с рецептором 1 IL-10 с помощью BIAcore. Активность связывания IL-10-R1 эксцепторной молекулой, включающей эктодомен CTLA4 и доменIL-10 (SEQ ID NO: 9), исследовали, по существу, следующим способом. Измерения поверхностного плазмонного резонанса (ППР) проводили с помощью BIAcore T100SPR (Pharmacia Biotech AB, Uppsala) с применением HBS-P+ (GE Healthcare) в качестве подвижного буфера. IL-10R1 (25 мкг/мл в 10 мМ ацетате натрия, рН 4.0; RD Systems) непосредственно иммобилизовали на чипе СМ 5 с применением стандартной химии сопряжения аминов (Biacore Amine Coupling Kit,GE Healthcare), с итоговыми уровнями иммобилизации, составлявшими 867, 2687 и 6719 Ru (единиц резонанса). Конструкции, содержащие IL-10, вводили в течение 300 с, при скорости потока, составлявшей 50 мкл/мин, в серии концентраций, составлявших от 100 пМ до 10 нМ. Диссоциацию наблюдали в течение 1200 с и поверхность восстанавливали путем ведения 2 М хлорида магния, рН 7.58, в течение 60 с и с последующим введением 20 мМ ЭДТА (в HBS-P+) в течение 60 с. Взаимодействия путем связывания с поверхностью были стабильны в течение по меньшей мере 30 циклов восстановления. Анализ данных осуществляли с помощью BiaEvaluation для Т 100, версии 2.0 (GE Healthcare). Кинетические параметры связывания эксцепторной молекулы CTLA4/IL-10 с иммобилизованным IL-10R1 не соответствовали модели связывания Лэнгмюра 1:1, но с высокой точностью подходили под бивалентную модель связывания аналитов. Величины равновесных констант диссоциации (KD) с высокой точностью можно рассчитать для каждой конструкции путем обработки наблюдаемой реакции при насыщении в стационарной модели равновесия, указанные значения приведены в табл. 3. Введение эктодомена CTLA4 в состав эксцепторного гибридного белка не оказывало значительного влияния на взаимодействие IL-10/IL-10R1. Таблица 3 Значение получено из литературного источника (Yoon et al. (2006), J. Biol. Chem. 281:35088-35096).Подсчитано на основе ka1 и kd1. Пример 3. Анализ связывания эксцепторной молекулы с CD80 и с CD80 и IL-10 методом ИФА. Оценку активности связывания CD80 и IL-10R проводили с помощью метода ИФА для абатасепта,конструкции состава CTLA4-Ig, обозначенной в настоящем документе как CTLA4-N2 (SEQ ID NO: 10 и 11) и для эксцепторной молекулы CTLA4/IL-10 согласно SEQ ID NO: 9, по существу, следующим способом. Связывание CD80. В каждую лунку 96-луночного черного планшета Maxisorp CD80 (Nunc Catalog 437111) наносилиCD80-mIg (Ancell Catalog 510-020) в форме раствора, концентрация которого составляла 2 мкг/мл, и инкубировали планшет в течение ночи при 4C. После этого блокировали планшет с помощью блокирующего буфера (ФСБ-Т с 3% нежирным сухим молоком). В лунки, покрытые CD80-mIg, добавляли образцы белков, предназначенных для исследования, в серийных разведениях в блокирующем буфере, в двух повторах, планшет накрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение приблизительно 1 ч. После отмывки в лунки вносили по 100 мкл конъюгата пероксидазы хрена с IgG козла, направленными против иммуноглобулинов человека (гамма), разведенных 1:1000 в блокирующем буфере,планшет накрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин, после чего инкубировали в течение 10 мин с флуорогенным субстратом пероксидазы QuantaBlu (Thermo Scientific Catalog 15169) при комнатной температуре. Величину поглощения в каждой лунке измеряли при 420 нм. В качестве отрицательного контроля применяли не родственный гибридный белок TRU-015. Результаты описанных экспериментов приведены на фиг. 1. Обнаружили, что CTLA4-N2 связывается с CD80-mIg в ходе ИФА так же, как абатасепт, тогда как для эксцепторной молекулы CTLA4/IL-10 наблюдали более слабое связывание с CD80. Одновременное связывание эксцепторной молекулы с растворимым рецептором 1 IL-10 (sIL-10R1) и растворимым CD80 (sCD80). В каждую лунку 96-луночного черного планшета Maxisorp CD80 (Nunc Catalog 437111) наносилиsIL-10Ra (RD Systems Catalog 510-020) в форме раствора, концентрация которого составляла 2 мкг/мл,и инкубировали планшет в течение ночи при 40 С. Планшет блокировали с помощью блокирующего буфера (ФСБ-Т с 3% не жирным сухим молоком). В лунки планшета, покрытые sIL-10Ra, добавляли образцы белков, предназначенных для исследования, в серийных разведениях в блокирующем буфере, в двух повторах, планшет накрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение приблизительно 1 ч. После отмывки добавляли антитело, направленное против CD152 (Ancell 359-020), в концентрации, составлявшей нг/мкл, или CD80-mIg (Ancell510-020) в концентрации, составлявшей 5 мкг/мл,с последующим добавлением конъюгата пероксидазы хрена с IgG козла (Fc), направленным против иммуноглобулинов мыши (Pierce 31439), разведенного 1:10,000 в блокирующем буфере, планшет накрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин, после чего инкубировали в течение 10 мин с флуорогенным субстратом пероксидазы QuantaBlu (Thermo Scientific Catalog 15169) при комнатной температуре. Величину поглощения в каждой лунке измеряли при 420 нм. В качестве отрицательного контроля применяли не родственный гибридный белок TRU-015. На фиг. 2 приведены результаты, полученные для CTLA4-N2 и эксцепторной молекулыCTLA4IL-10, согласно SEQ ID NO: 9. Приведенные результаты показывают, что участки CTLA4 и IL-10 в составе эксцепторной молекулы CTLA4-Ig-IL-10 способны к одновременному связыванию их лиганда/рецептора. Пример 4. Фосфорилирование STAT3, вызываемое эксцепторной молекулой. Известно, что связывание IL-10 с IL-10-R1 активирует Jak-1 и Тук, которое, в свою очередь, ведет к активации STAT3 (см., например, Williams et al. (2007), J. Biol. Chem. 282:6965-6975). Также существуют исследования, в ходе которых было показано, что для изучения фосфорилирования STAT3 в МКПК можно применять метод проточной цитометрии (Lafarge et al. (2007), BMC Mol. Biol. 8:64). Способность различных конструкций, содержащих в составе IL-10, включая эксцепторную молекулу CTLA4/IL-10,приведенную в SEQ ID NO: 9, вызывать фосфорилирование STAT3 в МКПК человека, исследовали, по существу, следующим способом. МКПК выделяли у донора-человека и культивировали в течение ночи в полной среде (RPMI, 10% ФСБ, пенициллин/стрептомицин), концентрация клеток составляла 2106 клеток/мл. На следующее утро проводили одну отмывку МКПК, ресуспендировали их в предварительно согретой RPMI 1640 (без добавок), концентрация клеток составляла 4106 клеток/мл, и инкубировали при 37 С в течение 2.5 ч. Исследуемые образцы готовили в 2 Х концентрации в 0.25 мл RPMI 1640 и смешивали с 1106 РВМС, концентрация которой составляла 1106, в 0.25 мл RPMI 1640. После этого образцы инкубировали в течение 15 мин при 37C. После завершения 15-минутной инкубации в каждую пробирку добавляли по 0.5 мл ледяного буфера BD Cytofix (BD Biosciences, cat554655). После этого клетки инкубировали на льду в течение 30 мин, после чего отмывали 2 мл Д-ФСБ+2.5% ФСБ (буфер FACS). После декантирования и откручивания образцов на вортексе в каждую пробирку добавляли по 0.5 мл ледяного буфера III BDPERM (BD Biosciences, cat558050) и образцы инкубировали на льду в течение 30 мин. После этого образцы отмывали 3 Х в 2 мл буфера FACS и ресуспендировали в 0.2 мл буфера FACS после итоговой отмывки. К каждому образцу добавляли 20 мкл конъюгированного mAb, направленного против STAT3 человека, с ФИТЦ (BD Biosciences, клон PY705). Клетки инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. После этого образцы отмывали 3 Х в буфере FACS для удаления любых не связавшихся антител. Анализ образцов проводили на проточном цитометре LSRII. Окно для живых лимфоцитов применяли на основе графиков SSC (бокового светорассеяния) и FSC (прямого светорассеяния) и определяли значение MFI (среднюю интенсивность флуоресценции) для ФИТЦ. Как показано на фиг. 3 и 4, все конструкции, содержащие в составе IL-10, усиливали фосфорилирование STAT3, пропорционально дозе. Пример 5. Связывание эксцепторной молекулы с CD86 и с CD86 и IL-10 одновременно. Для оценки связывания CD86 применяли линию В-лимфобластоидных клеток человека, экспрессирующих CD86 (WIL2-S), и для оценки одновременного связывания антагониста CD86 и агониста IL-10,присутствующих в составе эксцепторных молекул, применяли линию клеток СНО, экспрессирующихCD86 (клетки HuCD86-2A2) на поверхности, в сочетании с гибридным белком, содержащим растворимый рецептор 1 IL-10 (IL-10R1), связанный с Fc-фрагментом IgG мыши или с антителом, направленным против IL-10. Вкратце, клетки WIL2-S или HuCD86-2A2 инкубировали с исследуемыми молекулами,содержащими антагонист CD86 в концентрациях, находящихся в интервале от насыщенных до фоновых уровней. Далее, к клеткам HuCD86-2A2 добавляли гибридный белок IL-10R1-muIg или антитело мыши,направленное против IL-10, в форме комплекса с исследуемыми молекулами, связывающимися с поверхностью клеток посредством CD86. После завершения инкубации клетки отмывали и вносили антитело F(ab')2, обладающее специфичностью по отношению к Fc-фрагменту эксцепторной молекулы, меченное флуорофором (R-фикоэритрином), гибридный белок IL-10R-Ig или антитело, направленное против IL-10. После этого клетки с внесенной в них меткой пропускали через проточный цитометр, и данные анализировали с помощью построения графика средней интенсивности флуоресценции для каждого образца. Как показано на фиг. 5, для связывания эксцепторных молекул, содержащих связывающий домен, направленный против CD86 (например, полученную из гибридомных антител 3D1 и FUN1), с CD86 на поверхности клеток WIL2-S наблюдали более высокую аффинность, чем для связывания эксцепторных молекул, содержащих эктодомен CTLA4. В частности, эксцепторная молекула 3D1IL-10(SEQ ID NO: 189), содержащая участок 3D1, направленный против CD86, обладала несколько более высокой аффинностью к CD86, чем эксцепторная молекула FUN1IL-10 (SEQ ID NO: 187), содержащая участок FUN1, направленный против CD86, тогда как эксцепторные молекулы, содержащие CTLA4-Ig(SEQ ID NO: 11) и CTLA4 (SEQ ID NO: 173), обладали значительно более низкой аффинностью по отношению к CD86, чем связывающие домены, направленные против CD86, полученные из гибридомных антител 3D1 и FUN1. Как показано на фиг. 6, эксцепторные молекулы, содержащие антагонист CD86 и агонист IL-10, способны одновременно связывать CD86 на поверхности клеток HuCD86-2A2 (клеток СНО собственной разработки, экспрессирующих CD86 на поверхности) и растворимый IL-10R1. Более того, на фиг. 6 показано, что варианты IL-10 обладают различной аффинностью по отношению к(SEQ ID NO: 173) обладают одинаковой аффинностью по отношению к IL-10R1, но для эксцепторных молекул, содержащих мутированную форму IL-10 вируса, CTLA4IL-10 187A (SEQ ID NO: 191) иCTLA4IL-10 187S (SEQ ID NO: 193), наблюдали значительно более низкую аффинность по отношению к IL-10R1. В ходе другого эксперимента, исследовали связывание CD86 различными версиями SMIP на основе гуманизированного FUN1. Супернатанты клеток НЕК 293, временно трансфицированные шестью различными версиями SMIP на основе гуманизированного FUN1, исследовали по признаку связывания