Способ получения бутандиола с помощью анаэробной микробной ферментации

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БУТАНДИОЛА С ПОМОЩЬЮ АНАЭРОБНОЙ МИКРОБНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ В изобретении предлагаются способы получения 2,3-бутандиола с помощью анаэробной ферментации. Согласно конкретным способам по изобретению 2,3-бутандиол получают с помощью анаэробной ферментации субстратов, включающих углевод и монооксид углерода.(NZ), Фун Дженнифер Монь Е (US),Лью ФунгМин (NZ) Медведев В.Н. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЛАНЗАТЕК НЬЮ ЗИЛЕНД ЛИМИТЕД (NZ) Область техники Настоящее изобретение относится к получению бутандиола с помощью микробной ферментации,конкретно к получению 2,3-бутандиола с помощью микробной ферментации субстратов, включающихCO. Уровень техники Биотопливо для транспорта представляет собой привлекательную замену бензина, оно быстро проникает на топливные рынки в виде смесей низкой концентрации. Биотопливо, полученное из природных растительных источников, является более экологически сбалансированным, чем топливо, полученное из полезных ископаемых (такое как бензин), причем его использование позволяет уменьшить уровень так называемого ископаемого газа диоксида углерода (CO2), который высвобождается в атмосферу в результате сгорания топлива. Кроме того, биотопливо может быть получено локально во многих географических местностях и может служить для уменьшения зависимости от импортируемых ископаемых энергоресурсов. Спирты, подходящие для использования в качестве биотоплива, включают этанол, бутанол и 2,3-бутандиол. Этанол быстро становится основным богатым водородом жидким транспортным топливом во всем мире. Мировое потребление этанола в 2002 году оценивали на уровне 10,8 миллиардов галлонов (41 млн м 3). Также прогнозировался резкий рост в будущем глобального рынка индустрии топливного этанола благодаря повышенному интересу к этанолу в Европе, Японии, США и некоторых развивающихся странах. Предполагается, что бутандиолы, включающие 1,2-бутандиол, 1,3-бутандиол, 1,4-бутандиол и 2,3 бутандиол, могут иметь разнообразные преимущества по отношению к этанолу. Подобно этанолу, бутандиолы могут непосредственно использоваться в виде топливной присадки. Они могут также относительно легко трансформироваться в ряд потенциально более ценных и/или более высокоэнергетических продуктов. Например, 2,3-бутандиол может легко превращаться с помощью двухстадийного процесса в димер из восьми атомов углерода, который может использоваться в качестве авиационного топлива. Разносторонность 2,3-бутандиола вытекает из его бифункционального остова, т.е. 2 гидроксильные группы расположены на соседних С-атомах, позволяя молекуле трансформироваться достаточно легко в такие вещества, как бутадиен, бутадион, ацетоин, метилэтил кетон и т.д. Эти химические соединения используются как основные молекулы для производства широкого спектра получаемых в промышленном масштабе химических реагентов. Кроме того, 2,3-бутандиол может использоваться в качестве топлива в двигателе внутреннего сгорания. В некоторых отношениях он более похож на бензин, чем на этанол. По мере усиления интереса к получению и применению экологически сбалансированного топлива возрастал интерес к биологическим способам получения 2,3-бутандиола (часто обозначаемого как био-бутанол). 2,3-Бутандиол может быть получен с помощью микробной ферментации углеводсодержащего исходного сырья (Syu MJ, Appl Microbiol Biotechnol 55:10-18 (2001), Qin et al.: Chinese J Chem Eng 14(1): 132-136 (2006. 2,3-Бутандиол также может быть получен с помощью микробной ферментации биомассы из зерновых культур, таких как свекла сахарная, кукуруза, пшеница и сахарный тростник. Однако стоимость этого исходного углеводного сырья находится под влиянием их ценности как пищи человека или животного корма, а культивирование крахмала или сахарсодержащих зерновых культур для получения 2,3-бутандиола экономически невыгодно во всех географических местностях. Таким образом, представляется интересным развивать технологии превращения более низкозатратных и/или более многочисленных источников углевода в 2,3-бутандиол. Монооксид углерода (CO) представляет собой основной побочный продукт неполного сгорания органических веществ, таких как уголь или масло и продукты, полученные из масла. Хотя полное сгорание углеродсодержащих предшественников дает на выходе получение CO2 и воды как единственных конечных продуктов, некоторые производственные процессы нуждаются в оценке благоприятных температур для формирования монооксида углерода по отношению к CO2. Одним из примеров является сталеплавильное производство, где более высокие температуры необходимы для генерирования целевых качеств стали. Например, как опубликовано, сталеплавильное производство Австралии производит и высвобождает в атмосферу более 500000 тонн CO ежегодно. Кроме того, CO также является основным компонентом синтетического газа, где различные количества CO и Н 2 генерируются при газификации углерод-содержащего топлива. Например, синтетический газ может быть получен путем крекинга органической биомассы древесных отходов и древесины с генерированием предшественников топлива и более сложных химических реагентов. Высвобождение CO в атмосферу может иметь значительное влияние на окружающую среду. Кроме того, может существовать необходимость выплат налога на выброс загрязняющих веществ в атмосферу,что увеличивает стоимость производственных предприятий. Так как CO представляет собой реакционноспособную энергетически богатую молекулу, то он может использоваться в качестве соединенияпредшественника для получения разнообразных химических реагентов. Однако это ценное исходное сырье не применяется для получения 2,3-бутандиола. Целью настоящего изобретения является предложение способа, который относится, по меньшей мере, в некоторой степени непосредственно к преодолению вышеуказанных дефектов или, по меньшей мере, к предложению людям приемлемого выбора. Сущность изобретения В одном аспекте в изобретении предлагается способ получения бутандиола с помощью микробной ферментации субстрата, включающего монооксид углерода. В конкретных воплощениях в изобретении предлагается способ получения бутандиола с помощью микробной ферментации, включающий:b) анаэробное ферментирование субстрата в биореакторе, содержащем культуру одного или нескольких микроорганизмов, с получением бутандиола. В определенных воплощениях бутандиол представляет собой 2,3-бутандиол. В другом аспекте в изобретении предлагается способ увеличения эффективности получения 2,3 бутандиола с помощью ферментации, включающий:b) анаэробное ферментирование субстрата в биореакторе, содержащем культуру одного или нескольких микроорганизмов, с получением 2,3-бутандиола. В другом аспекте изобретения предлагается способ получения 2,3-бутандиола с помощью микробной ферментации, включающий:b) анаэробное ферментирование субстрата в биореакторе, содержащем культуру одного или нескольких микроорганизмов, где один или несколько микроорганизмов включают один или несколько генов 2,3-бутандиол-дегидрогеназы;c) положительную регуляцию гена(ов) 2,3-бутандиолдегидрогеназы таким образом, чтобы осуществлялось получение 2,3-бутандиола с помощью микроорганизма(ов). В конкретных воплощениях субстрат включает CO. В конкретных воплощениях различных аспектов субстрат, включающий монооксид углерода, представляет собой газообразный субстрат, включающий монооксид углерода. Газообразный субстрат, включающий монооксид углерода, может быть получен в виде побочного продукта производственного процесса. В определенных воплощениях производственный процесс выбирают из группы, состоящей из производства продуктов черной металлургии, процессов нефтепереработки, газификации биомассы, газификации угля, производства электроэнергии, производства углеродной сажи, производства аммония,производства метанола и производства кокса. В одном воплощении газообразный субстрат включает газ,полученный из сталелитейного производства. В другом воплощении газообразный субстрат включает автомобильные выхлопные газы. В конкретных воплощениях CO-содержащий субстрат, как правило, содержит большую часть CO,как например, по меньшей мере от примерно 20 до примерно 100% CO по объему, от 40 до 95% CO по объему, от 40 до 60% CO по объему и от 45 до 55% CO по объему. В конкретных воплощениях субстрат включает примерно 25, или примерно 30, или примерно 35, или примерно 40, или примерно 45, или примерно 50, или примерно 55, или примерно 60% CO по объему. Субстраты, имеющие более низкие концентрации CO, как например 6%, также могут быть подходящими, особенно когда присутствуют Н 2 иCO2. В конкретных воплощениях различных аспектов субстрат, включающий CO, предоставляется в достаточном количестве, таким образом, чтобы осуществлялось получение 2,3-бутандиола. В конкретных воплощениях CO предоставляется таким образом, чтобы поддерживалась удельная скорость его поглощения, составляющая по меньшей мере 0,4, или по меньшей мере 0,5 ммоль/г/мин, или по меньшей мере 0,6, или по меньшей мере 0,7, или по меньшей мере 0,8, или по меньшей мере 0,9, или по меньшей мере 1,0, или по меньшей мере 1,2, или по меньшей мере 1,5 ммоль/г/мин. В определенных воплощениях различных аспектов способ включает микробную ферментацию с использованием Clostridium autoethanogenum. В другом аспекте в изобретении предлагается способ получения 2,3-бутандиола с помощью микробной ферментации, включающий:b) анаэробное ферментирование субстрата в биореакторе, включающем культуру Clostridiumautoethanogenum, с получением 2,3-бутандиола. В конкретных воплощениях субстрат представляет собой один или несколько углеводов, таких как фруктоза. Альтернативно, субстрат представляет собой субстрат, включающий монооксид углерода, как правило, газообразный субстрат, включающий монооксид углерода, как описано ранее в настоящем документе. В следующем аспекте в изобретении предлагается способ получения бутандиола с помощью микробной ферментации первого субстрата и второго субстрата, включающего CO. Предпочтительно, бутандиол представляет собой 2,3-бутандиол. В конкретных воплощениях первый субстрат представляет собой углевод. В определенных воплощениях первый субстрат представляет собой фруктозу. В определенных воплощениях второй субстрат представляет собой газообразный субстрат, включающий монооксид углерода, как описано ранее в настоящем документе. В конкретных воплощениях способ включает стадии:(a) микробной ферментации первого субстрата с получением 2,3-бутандиола;(b) микробной ферментации второго субстрата, включающего CO, с получением 2,3-бутандиола. В определенных воплощениях, стадии (а) и (b) могут проводиться одновременно. Альтернативно,стадия (а) может, по существу, предшествовать стадии (b) или следовать за ней. В конкретных воплощениях в способе могут чередоваться стадия (а) и стадия (b). В следующем аспекте изобретения предлагается способ согласно любому из предыдущих аспектов,где ферментацию проводят в биореакторе. В следующем аспекте изобретения предлагается способ согласно любому из предыдущих аспектов,где способ дополнительно включает стадию захвата или извлечения бутандиола. В следующем аспекте предлагается бутандиол, предпочтительно, 2,3-бутандиол, полученный с помощью способов по любому из предыдущих аспектов. Говоря шире, изобретение также может состоять из частей, элементов и признаков, указанных или выявленных в описании заявки, индивидуально или вместе, в любой или во всех комбинациях двух или более указанных частей, элементов или признаков, и где в настоящем документе упоминаются определенные целые числа, которые имеют эквиваленты, известные из области техники, к которой относится изобретение, предполагается, что такие известные эквиваленты включены в настоящий документ, как если бы были в нем индивидуально представлены. Подробное описание изобретения Нижеследующее представляет собой описание настоящего изобретения, включая его предпочтительные воплощения, приведенные в общих терминах. Изобретение дополнительно иллюстрируется в описании с помощью примеров, представленных ниже в настоящем документе под заголовком "Примеры", в которых представлены экспериментальные данные, подтверждающие возможность осуществления изобретения, конкретные примеры аспектов изобретения и способы осуществления изобретения. При использовании в настоящем документе термин "бутандиол" обозначает все структурные изомеры диола, включающие 1,2-бутандиол, 1,3-бутандиол, 1,4-бутандиол и 2,3-бутандиол, и их стереоизомеры. Термин "2,3-бутандиол" следует интерпретировать как включающий все энатиомерные и диастереомерные формы соединения, включающие (R,R), (S,S) и мезомеры в рацемической, частично стереоизомерно чистой и/или, по существу, стереоизомерно чистой форме. Термин "биореактор" включает устройство для ферментации, состоящее из одного или нескольких аппаратов, и/или колонн, или системы труб, которое включает проточный реактор с непрерывным перемешиванием (CSTR), реактор с иммобилизованными клетками (ICR), реактор с орошаемым слоем (TBR),барботажную колонну, газлифтный ферментер, статический смеситель или другой аппарат или другое устройство, подходящее для газожидкостного контакта. Как описано далее в настоящем документе, в некоторых воплощениях биореактор может включать первый реактор роста и второй реактор ферментации. Следует понимать, что, по существу, ссылка на добавление субстрата, например субстрата, включающего монооксид углерода, в биореактор или в реакцию ферментации включает добавление в каждый или в оба эти реактора, когда это целесообразно. Следует понимать, что термин "субстрат, включающий монооксид углерода", и подобные термины включают любой субстрат, в котором монооксид углерода доступен одному или нескольким штаммам бактерий, например, для роста и/или ферментации."Газообразные субстраты, включающие монооксид углерода", включают любой газ, который содержит некоторое количество монооксида углерода. Газообразный субстрат будет, как правило, содержать большую часть CO, предпочтительно по меньшей мере от примерно 15 до примерно 95% CO по объему. Подразумевается, что при использовании в настоящем документе, если из контекста не следует другое, выражения "ферментирование", "процесс ферментации" или "реакция ферментации" и так далее охватывают обе фазы процесса, фазу роста и фазу биосинтеза продукта. Авторы изобретения неожиданно продемонстрировали, что 2,3-бутандиол может быть получен с помощью микробной ферментации с использованием Clostridium autoethanogenum. Они обнаружили, что продукты ферментации включают разнообразные спирты, причем этанол и 2,3-бутандиол представляют собой существенную часть. 2,3-Бутандиол не идентифицировали прежде в виде продукта ферментации с использованием Clostridium autoethanogenum. Конкретно, авторы изобретения определили, что Clostridium autoethanogenum может использоваться для получения 2,3-бутандиола и других продуктов из субстрата, включающего углевод. Конкретно, фруктоза может быть превращена в продукты, включающие ацетат, этанол и 2,3-бутандиол. Также неожиданно было продемонстрировано, что 2,3-бутандиол может быть получен с помощью Clostridium autoethanogenum из субстратов, включающих CO, конкретно, газообразных субстратов, включающих CO. Использование газообразного углеродного источника, конкретно источника, включающего CO, в процессах ферментации не приводило прежде в результате к получению 2,3-бутандиола. В конкретных воплощениях изобретения эффективность получения 2,3-бутандиола может быть увеличена с помощью предоставления субстрата в достаточном количестве для получения 2,3 бутандиола. Было признано, что увеличение количества субстрата, предоставляемого микробной культуре, увеличивает количество 2,3-бутандиол, полученного с помощью культуры. В конкретных воплощениях изобретения субстрат, включающий CO, предоставляется в достаточном количестве для получения 2,3-бутандиола. Было продемонстрировано, что микробная культура,включающая С.autoethanogenum, может поглощать CO с интенсивностью до приблизительно 1,5-2 ммоль/г сухой массы микробных клеток/мин (определенное поглощение CO). В конкретных воплощениях изобретения субстрат, включающий CO, предоставляется микробной культуре, включающей С.autoethanogenum, таким образом, чтобы поддерживать удельную скорость поглощения, составляющую,по существу, или по меньшей мере 0,4, или по меньшей мере 0,5, или по меньшей мере 0,6, или по меньшей мере 0,7, или по меньшей мере 0,8, или по меньшей мере 0,9, или по меньшей мере 1,0, или по меньшей мере 1,2, или по меньшей мере 1,5 ммоль/г/мин. В таких воплощениях 2,3-бутандиол представляет собой существенный продукт ферментации, полученный в количестве по меньшей мере 0,5, или по меньшей мере 1, или по меньшей мере 2, или по меньшей мере 5 г/л. В конкретных воплощениях 2,3 бутандиол получают со скоростью, составляющей по меньшей мере 0,5 или по меньшей мере 1 г/л/день. В конкретных воплощениях изобретения аппарат, используемый для осуществления способов по изобретению, дает возможность измерения и/или контроля параметров, таких как подача CO, поглощение CO, количество биомассы, получение 2,3-бутандиола. Например, образцы могут быть взяты из биореактора для определения одного или нескольких из указанных выше параметров, и условия биореактора необязательно регулируются для улучшения получения 2,3-бутандиола. Например, в биореакторе, где микробная культура не продуцирует или продуцирует незначительные количества 2,3-бутандиола, подача CO может быть увеличена таким образом, чтобы осуществлялось получение 2,3-бутандиола. Принято, что продукты, такие как ацетат и этанол, получаются из CO посредством комбинации ацетил-СоА-цикла и THF-цикла, как описано у Phillips, J. R, et al.: 1994, Applied Biochemistry and Biotechnology, 45/46: 145. Однако согласно способам по изобретению неожиданно было продемонстрировано, что 2,3-бутандиол может получаться, особенно в тех случаях, где предоставляется CO, таким образом, чтобы поддерживалась удельная скорость поглощения CO, составляющая по меньшей мере 0,4, или по меньшей мере 0,5, или по меньшей мере 0,6, или по меньшей мере 0,7, или по меньшей мере 0,8, или по меньшей мере 0,9, или по меньшей мере 1,0, или по меньшей мере 1,2, или по меньшей мере 1,5 ммоль/г/мин. Не желая быть связанными теорией, предположили, что с помощью предоставления достаточного или повышенного количества CO во время ферментации могут получаться высокоэнергетические продукты,такие как 2,3-бутандиол. Предполагается, что предшественники продуктов, таких как 2,3-бутандиол,действуют в качестве акцепторов электронов для облегчения микробной клетки от избытка восстановительной способности в форме NAD(P)H, сохраняя таким образом благоприятное равновесиеNAD(P):NAD(Р)Н. Далее предполагается, что углеводы, ферментированные культурой, также могут превращаться в 2,3-бутандиол подобным образом. Следующие гены были предположительно идентифицированы в С.autoethanogenum: -ацетолактат синтаза (ALS), -ацетолактат декарбоксилаза (ALDC) и 2,3-бутандиолдегидрогеназа (2,3BDH). Предполагаемый ген 2,3-бутандиолдегидрогеназы (ORF 12 83) С.autoethanogenum (штамм, депонированный вDSMZ под номером 19630) демонстрирует существенную гомологию с геном 2,3BDH Clostridium novyi(NT01CX0344) при идентичности аминокислот 73% (262/357) и совпадении аминокислот по группам 84% (300/357). ORF 1283 также демонстрирует значительную гомологию с геном YdjL (bdhA) Bacillussubtilis (47% идентичности аминокислот, 63% совпадений аминокислот по группам) и Е-величина составляет 3 е-89. Дальнейшее доказательство того, что ORF 1283 LZ1560 представляет собой 2,3BDH, вытекает из гомологии с 2,3BDH (YAL060W) Saccharomyces cerevisiae (E=2e-53). Не желая быть связанными теорией, предполагается, что 2,3-бутандиол получают из пирувата (интермедиата в анаболизме, получаемого из ацетил СоА) следующим образом: Исследования с помощью ПЦР в реальном времени 2,3-бутандиолдегидрогеназы в С.autoethanogenum выявляют, что она, по существу, подвергается положительной регуляции в культурах, где производятся значительные количества 2,3-бутандиола. Таким образом, 2,3-бутандиолдегидрогеназа может подвергаться положительной регуляции согласно способам по изобретению. Например, там, где CO подается в значительном количестве, происходит положительная регуляция 2,3-бутандиола. Конкретно,там где CO подается так, что удельная скорость поглощения CO микробной культурой составляет по меньшей мере 0,4, или по меньшей мере 0,5, или по меньшей мере 0,6, или по меньшей мере 0,7, или по меньшей мере 0,8, или по меньшей мере 0,9, или по меньшей мере 1,0, или по меньшей мере 1,2, или по меньшей мере 1,5 ммоль/г/мин, происходит положительная регуляция 2,3-бутандиолдегидрогеназы. По существу, в изобретении предлагается способ получения 2,3-бутандиола с помощью микробной ферментации субстрата путем положительной регуляции 2,3-бутандиолдегидрогеназы. Авторы изобретения дополнительно продемонстрировали, что различные субстраты, такие как углеводный субстрат и газообразный субстрат, включающий CO, могут быть исключены во время микробного получения 2,3-бутандиола без негативного воздействия. Кроме того, они предполагают, что субстраты могут чередоваться, например, когда один субстрат недоступен, и при этом будет продолжаться получение 2,3-бутандиола. Согласно полученным результатам в одном воплощении изобретения 2,3-бутандиол получают с помощью микробной ферментации субстрата, включающего углевод. В другом воплощении изобретения субстрат, включающий монооксид углерода, предпочтительно газообразный субстрат, включающий CO,превращается в различные продукты, включающие 2,3-бутандиол, с помощью Clostridium autoethanogenum. В следующем воплощении изобретения первый субстрат, включающий углевод (предпочтительно фруктозу), может использоваться в исходных стадиях реакции ферментации и после полного поглощения субстрата субстрат может переключаться на второй субстрат, включающий CO. Более того, авторы изобретения неожиданно определили, что 2,3-бутандиол получают на начальных стадиях, где первый субстрат, включающий углевод, является единственным источником углерода, и также получают на поздних стадиях, где субстрат, включающий CO, является единственным источником углерода. Авторы изобретения продемонстрировали, что 2,3-бутандиол получают при разнообразных условиях, включающих среды, содержащие альтернативные буферные растворы, такие как ацетатный буфер и цитратный буфер. Авторы изобретения также считают, что в воплощениях, где рН не контролируется и может варьироваться, 2,3-бутандиол все равно получают. Примеры сред, подходящих для проведения ферментации, описаны в разделе примеров, приведенном ниже. Авторы изобретения предполагают, что 2,3-бутандиол, получаемый в таких процессах, может легко извлекаться с использованием методов разделения, известных из уровня техники. Кроме того, 2,3 бутандиол может легко превращаться в вещества, такие как бутадиен, бутадион, ацетион, метилэтилкетон и так далее. Такие химические соединения представляют собой ценные основные молекулы, используемые для производства значительной части всех продуктов химической промышленности. Таким образом, авторы изобретения предполагают, что 2,3-бутандиол, полученный в процессах, раскрытых в настоящем документе, может использоваться в производстве широкого спектра хорошо известных продуктов производства. Изобретение описано в настоящем документе в основном по отношению к предпочтительным воплощениям изобретения, в котором применяется Clostridium autoethanogenum и/или получают 2,3 бутандиол. Однако следует понимать, что альтернативные микроорганизмы могут заменять С.autoethanogenum. Аналогично, способы могут применяться для получения и восстановления бутандиолов, отличных от 2,3-бутандиола. Соответственно, если из контекста не следует другое, ссылка на "2,3 бутандиол" может быть заменена общим термином "бутандиол". Способ В одном воплощении в изобретении предлагается способ получения бутандиола с помощью микробной ферментации. В предпочтительном воплощении способ включает по меньшей мере одну стадию анаэробного ферментирования субстрата, включающего CO, предпочтительно газообразного субстрата,включающего CO, с получением 2,3-бутандиола. В конкретном воплощении изобретения способ включает стадии:(b) анаэробное ферментирование субстрата в биореакторе, содержащем культуру одного или нескольких микроорганизмов, с получением 2,3-бутандиола. В другом воплощении в изобретении предлагается способ увеличения эффективности получения 2,3-бутандиола с помощью ферментации, причем способ включает:(b) анаэробное ферментирование субстрата в биореакторе, содержащем культуру одного или нескольких микроорганизмов, с получением 2,3-бутандиола. В конкретных воплощениях субстрат, включающий CO, предоставляется в количестве, достаточном для получения достаточных количеств 2,3-бутандиола, таких как по меньшей мере 0,5 г/л среды ферментации, или по меньшей мере 1, или по меньшей мере 2, или по меньшей мере 5 г/л. В определенных воплощениях CO предоставляется в количестве, достаточном для получения 2,3-бутандиол со скоростью,составляющей по меньшей мере 0,5 или по меньшей мере 1 г/л/день. В конкретных воплощениях CO предоставляется таким образом, чтобы поддерживалась удельная скорость поглощения, составляющая по меньшей мере 0,4, или по меньшей мере 0,5, или по меньшей мере 0,6, или по меньшей мере 0,7, или по меньшей мере 0,8, или по меньшей мере 0,9, или по меньшей мере 1,0, или по меньшей мере 1,2, или по меньшей мере 1,5 ммоль/г/мин. Специалистам в данной области будут понятны методы подачи CO,особенно газообразного CO, таким образом, чтобы достигалась требуемая интенсивность поглощения. Однако в качестве примера факторы, такие как увеличение задержки газа в среде ферментации, будут увеличивать количество CO, доступного для превращения в продукты с помощью микробной культуры. Задержка газа может, как правило, быть увеличена с помощью механических способов, таких как увеличение интенсивности перемешивания в CSTR. Кроме того, подача CO с большей скоростью или при более высоком парциальном давлении также будет увеличивать доступность CO в ферментационном бульоне. В другом воплощении способ включает ферментацию субстрата, включающего углевод, с помощьюClostridium autoethanogenum с получением бутандиола, предпочтительно 2,3-бутандиола. В другом воплощении способ включает стадии:(a) микробной ферментации первого субстрата для получения 2, 3-бутандиола;(b) микробной ферментации второго субстрата, включающего CO, для получения 2,3-бутандиола. В определенных воплощениях первый субстрат представляет собой углевод и в некоторых воплощениях субстрат представляет собой фруктозу. Предпочтительно второй субстрат представляет собой газообразный субстрат, включающий CO. В конкретных воплощениях стадии (а) и (b) могут проводиться одновременно. Альтернативно, стадия (а) может, по существу, предшествовать стадии (b) или следовать за ней. Предпочтительно в способе могут чередоваться стадии (а) и (b). В определенных воплощениях изобретения способ дополнительно включает стадию захвата или извлечения полученного 2,3-бутандиола. Микроорганизмы В воплощениях изобретения один или несколько микроорганизмов, используемых в ферментации,представляют собой Clostridium autoethanogenum. В предпочтительном воплощении Clostridiumautoethanogenum представляет собой Clostridium autoethanogenum, обладающий идентификационными характеристиками штамма, депонированного в Немецком Исследовательском Центре Биологического Материала (DSMZ) под идентификационным депозитным номером 19630. В другом воплощении Clostridium autoethanogenum представляет собой Clostridium autoethanogenum, обладающий идентификационными характеристиками DSMZ с депозитным номером DSMZ 10061. Культивирование бактерий, используемых в способе по изобретению, может проводиться с использованием любого ряда процессов, известных из уровня техники для культивирования и ферментации субстратов с использованием анаэробных бактерий. Типичные методы представлены в разделе "Примеры" настоящего документа. В качестве следующего примера эти процессы, как правило, описаны в следующих статьях, где может применяться использование газообразных субстратов для ферментации:Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160. Методы культивирования бактерий на субстратах,включающих углеводы, также хорошо известны из уровня техники. Субстраты В одном воплощении изобретения 2,3-бутандиол получают с помощью микробной ферментации субстрата, включающего углевод, с использованием Clostridium autoethanogenum. Понятно, что существует множество примеров углеводов, подходящих для ферментации, известных из уровня техники, и много примеров типов процессов, используемых для ферментирования углеводного субстрата. В качестве примера подходящие субстраты могут включать, но не ограничиваясь перечисленным, моносахариды,такие как глюкоза и фруктоза, олигосахариды, такие как сахароза или лактоза, полисахариды, такие как целлюлоза или крахмал. Хотя предполагается, что любой из указанных углеводных субстратов (и их смеси) является подходящим согласно настоящему изобретению, предпочтительными углеводными субстратами являются фруктоза и сахароза (и их смеси). Специалистам в данной области будет понятно, что ферментируемые сахара могут быть получены из целлюлозной и лигноцеллюлозной биомассы посредством процесса переработки и сахарообразования,как описано, например, в US20070031918. Биомасса обозначает любой целлюлозный или лигноцеллюлозный материал и включает материалы, включающие целлюлозу и необязательно дополнительно включающие гемицеллюлозу, лигнин, крахмал, олигосахариды и/или моносахариды. Биомасса включает, но не ограничиваясь перечисленным, биоэнергетические зерновые культуры, сельскохозяйственные отходы,коммунально-бытовые отходы, производственные твердые отходы, шлам бумажного производства, садовые отходы, лесные и древесные отходы. Однако в типичных воплощениях изобретения в качестве источника углерода и энергетического источника для ферментации используют коммерчески доступную фруктозу. В конкретных воплощениях субстрат, включающий монооксид углерода, предпочтительно, газообразный субстрат, включающий монооксид углерода, используют в способах по изобретению. Газообраз-6 018720 ный субстрат может представлять собой газообразные отходы, полученные в качестве побочного продукта производственного процесса, или из других источников, таких как отработанные газы двигателя внутреннего сгорания (например, автомобильного). В определенных воплощениях производственный процесс выбирают из группы, состоящей из производства продуктов черной металлургии, таких как сталелитейное производство, производства продуктов цветной металлургии, процессов нефтепереработки,газификации угля, производства электроэнергии, производство углеродной сажи, производства аммония,производства метанола и производства кокса. В этих воплощениях CO-содержащий газ может улавливаться из производственного процесса перед его выпуском в атмосферу с использованием любого подходящего метода. В зависимости от композиции газообразного субстрата, включающего монооксид углерода, также может быть желательной обработка или удаление любых нежелательных примесей, таких как частицы пыли, перед введением в ферментацию. Например, газообразный субстрат может фильтроваться или очищаться с использованием известных методов. В других воплощениях изобретения источником газообразного субстрата, включающего монооксид углерода, может быть газификация биомассы. Процесс газификации включает частичное сгорание биомассы при ограниченной подаче воздуха или кислорода. Полученный в результате газ, как правило,включает главным образом CO и Н 2 с минимальными объемами CO2, метана, этилена и этана. Например,побочные продукты биомассы, полученные во время экстракции и обработки продуктов питания, таких как сахар из сахарного тростника, или крахмал из маиса или зерна, или отходы непищевой биомассы,генерированные с помощью лесной промышленности, могут быть газифицированы с получением COсодержащего газа, подходящего для использования по настоящему изобретению.CO-содержащий субстрат будет, как правило, содержать большую часть CO, как например, по меньшей мере от примерно 20 до примерно 100% CO по объему, от 40 до 95% CO по объему, от 40 до 60% CO по объему и от 45 до 55% CO по объему. В конкретных воплощениях субстрат включает примерно 25, или примерно 30, или примерно 35, или примерно 40, или примерно 45, или примерно 50, или примерно 55, или примерно 60% CO по объему. Субстраты, имеющие более низкие концентрации CO,как например 6%, также могут быть подходящими, особенно когда присутствуют Н 2 и CO2. В конкретных воплощениях CO подается в количестве, достаточном для получения 2,3-бутандиола. В конкретных воплощениях CO предоставляется таким образом, чтобы поддерживалась удельная скорость поглощения, составляющая по меньшей мере 0,4, или по меньшей мере 0,5, или по меньшей мере 0,6, или по меньшей мере 0,7, или по меньшей мере 0,8, или по меньшей мере 0,9, или по меньшей мере 1,0, или по меньшей мере 1,2, или по меньшей мере 1,5 ммоль/г/мин. Специалистам в данной области будут понятны методы подачи CO, особенно газообразного CO, таким образом, чтобы достигалась требуемая интенсивность поглощения. Однако в качестве примера факторы, такие как увеличение задержки газа в среде ферментации, будут увеличивать количество CO, доступного для превращения в продукты с помощью микробной культуры. Специалистам в данной области будут понятны методы увеличения задержки газа. Однако в качестве примера задержка газа может, как правило, быть увеличена с помощью механических способов, таких как увеличение интенсивности перемешивания в CSTR. Кроме того, подача CO с большей интенсивностью или при более высоком парциальном давлении, также будет увеличивать доступность CO в ферментационном бульоне. Не является необходимым, чтобы газообразный субстрат содержал какое-либо количество водорода, однако это не рассматривается как вредный фактор по отношению к получению 2,3-бутандиола. Газообразный субстрат также может содержать некоторое количество CO2, например, такое как, от примерно 1 до примерно 80% по объему или от 1 до примерно 30% по объему. В одном воплощении он содержит от примерно 5 до примерно 10% по объему. В другом воплощении газообразный субстрат содержит приблизительно 20% CO2 по объему. Как правило, монооксид углерода добавляют к реакции ферментации в газообразном состоянии. Однако добавление субстрата в указанном состоянии не должно рассматриваться как ограничение изобретения. Например, монооксид углерода может быть предоставлен в виде жидкости. Например, жидкость может быть насыщена газом, содержащим монооксид углерода, и затем эту жидкость добавляют в биореактор. Этого можно достичь с использованием стандартной методики. В качестве примера может использоваться микропузырьковый дисперсионный генератор (Hensirisak et. al.: Scale-up of microbubbledispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology. Volume 101,3, октябрь 2002 года). В одном воплощении изобретения авторы изобретения определили, что 2,3-бутандиол может получаться с помощью ферментации первого субстрата и второго субстрата. В одном конкретном воплощении изобретения 2,3-бутандиол будет получаться, когда предоставляется первый субстрат, например углевод, такой как фруктоза, и второй субстрат, предпочтительно включающий CO. В следующем воплощении авторы изобретения определили, что 2,3-бутандиол будет получаться с помощью первого субстрата, и по завершении поглощения первый субстрат может быть заменен на второй субстрат и продолжится получение 2,3-бутандиола. В конкретных воплощениях первый субстрат представляет собой фруктозу, и по завершении поглощения фруктозы может быть предоставлен субстрат, включающий CO. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что будет продолжаться получе-7 018720 ние 2,3-бутандиола. Авторы изобретения далее предположили, что первый субстрат и второй субстрат могут быть взаимозаменяемы, если это необходимо. Например, если первый субстрат недоступен, то может использоваться альтернативный субстрат до тех пор, пока не возобновится доступность первого субстрата. Среды Понятно, что для роста бактерий, необходимых для осуществления ферментации субстрата в бутандиол, дополнительно к субстрату в биореактор необходимо подавать подходящую питательную среду. Питательная среда будет содержать компоненты, такие как витамины и минералы, достаточные для того, чтобы позволить рост используемых микроорганизмов. Анаэробные среды, подходящие для ростаClostridium autoethanogenum, известны из уровня техники и описаны, например, у Abrini et al (ClostridiumMicrobiol., 161: 345-351 (1994. В разделе "Примеры", представленном ниже, приведены примеры подходящих сред. Условия ферментации Ферментацию желательно проводить в подходящих условиях для осуществления ферментации субстрата в бутандиол. Условия реакции, которые, как предполагается, должны включать температуру, расход среды, рН, окислительно-восстановительный потенциал среды, интенсивность перемешивания (если используют проточный реактор с мешалкой), количество инокулята, максимальные концентрации субстрата и интенсивности введения субстрата в биореактор для обеспечения того, чтобы количество субстрата не стало ограниченным, и максимальные концентрации продукта во избежание ингибирования продукта. Примеры условий ферментации, подходящих для анаэробной ферментации субстрата, включающего CO, подробно описаны в WO2007/117157, WO2008/115080, WO2009/022925 и WO2009/064200,описание которых включено в настоящий документ ссылкой. Понятно, что условия ферментации, представленные в указанных документах, могут быть легко модифицированы в соответствии со способами по настоящему изобретению. Авторы изобретения определили, что в одном воплощении, где рН не контролировалось, это не оказывало вредного воздействия на получение 2,3-бутандиола. Биореактор Реакции ферментации могут проводиться в подходящем биореакторе, как описано ранее в настоящем документе. В некоторых воплощениях изобретения биореактор может включать первый реактор роста, в котором культивируются микроорганизмы, и второй реактор ферментации, в который подается бульон из реактора роста и в котором получается большая часть продукта ферментации (2,3-бутандиол,например). Извлечение продукта Ферментация приводит в результате к получению ферментационного бульона, включающего целевой продукт (такой как бутандиол) и/или один или несколько побочных продуктов (таких как этанол,ацетат и бутират), а также бактериальные клетки в питательной среде. В предпочтительном воплощении продукты ферментации включают 2,3-бутандиол. 2,3-Бутандиол или фракция смешанных спиртов, содержащая 2,3-бутандиол и один или несколько других спиртов, могут быть извлечены из ферментационного бульона с помощью методов, известных из уровня техники, таких как фракционная перегонка или выпаривание, перфузия и экстрактивная ферментация. Побочные продукты, такие как кислоты, включающие ацетат и бутират, также могут быть извлечены из ферментационного бульона с использованием методов, известных из уровня техники. Например,может использоваться система адсорбции, включающая фильтр из активированного угля или электродиализ. В определенных воплощениях изобретения 2,3-бутандиол и побочные продукты извлекают из ферментационного бульона с помощью непрерывного удаления части бульона из биореактора, отделения микробных клеток от бульона (например, удобно с помощью фильтрации) и извлечения 2,3-бутандиола и необязательно других спиртов и кислот из бульона. Спирты могут быть удобно извлечены, например, с помощью перегонки, а кислоты могут быть извлечены, например, с помощью адсорбции на активированном угле. Отделенные микробные клетки предпочтительно возвращают в ферментационный биореактор. Свободный от клеток фильтрат, оставшийся после удаления спирта(ов) и кислоты, также предпочтительно возвращают в ферментационный биореактор. Дополнительные питательные элементы (такие как витамины В) могут быть добавлены к свободному от клеток фильтрату для восполнения питательной среды перед его возвращением в биореактор. Также перед возвращением в биореактор, если рН бульона регулировали во время извлечения 2,3 бутандиола и/или побочных продуктов, то рН следует повторно отрегулировать до значения, подобного рН бульона в ферментационном биореакторе. Теперь изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие частные примеры. Приготовление Na2Sx В колбу емкостью 500 мл загружали Na2S (93,7 г, 0,39 моль) и 200 мл H2O. Раствор перемешивали до тех пор, пока соль не растворялась, и добавляли серу (25 г, 0,1 моль) при постоянном потоке N2. Через 2 ч перемешивания при комнатной температуре раствор Na2Sx (приблизительно 4 М по отношению к[Na] и приблизительно 5 М по отношению к сере), теперь представляющий собой бурую жидкость, переносили в сывороточные бутылки, продутые N2, закрытые алюминиевой фольгой. Приготовление раствора Cr(II) Трехгорлую колбу емкостью 1 л оборудовали газонепроницаемым входом и выходом, давая возможность работы в условиях инертного газа и последующего переноса целевого продукта в подходящую колбу для хранения. В колбу загружали CrCl36 Н 2 О (40 г, 0,15 моль), гранулы цинка [20 меш] (18,3 г, 0,28 моль), ртуть (13,55 г, 1 мл, 0,0676 моль) и 500 мл дистиллированной воды. После продувки с помощьюN2 в течение 1 ч смесь нагревали до примерно 80 С для инициирования реакции. После 2 ч перемешивания при постоянном потоке N2 смесь охлаждали до комнатной температуры и непрерывно перемешивали в течение следующих 48 ч, в течение которых реакционная смесь превращалась в раствор темно-синего цвета. Раствор переносили в сывороточные бутылки, продутые N2, и хранили в холодильнике до момента использования. Бактерии Использовали бактерии Clostridium autoethanogenum, депонированные в Немецком Исследовательском Центре Биологического Материала (DSMZ) с присвоенным регистрационным номером 19630. Отбор образцов и аналитические процедуры Образцы среды отбирали из ферментационного реактора (например, CSTR или из сывороточной бутылки) через определенные интервалы времени на протяжении ферментации. Каждый раз среду отбирали аккуратно для гарантии того, чтобы не позволить газу войти в реактор или выйти из него. ВЭЖХ ВЭЖХ-система серии Agilent 1100. Подвижная фаза: 0,0025 н. серная кислота. Поток и давление: 0,800 мл/мин. Колонка: Alltech IOA; каталог 9648, 1506,5 мм, размер частиц 5 мкм. Температура колонки: 60 С. Детектор: показатель преломления. Температура детектора: 45 С. Метод приготовления образца 400 мкл образца, 50 мкл 0,15 М ZnSO4 и 50 мкл 0,15 М Ва(ОН)2 загружали в пробирку Eppendorf. Пробирки центрифугировали в течение 10 мин при 12000 об/мин, 4 С. 200 мкл супернатанта переносили в ВЭЖХ-пробирку и 5 мкл инъецировали в ВЭЖХ-аппарат. Анализ свободного пространства над продуктом Измерения проводили на Varian CP-4900 micro GC с двумя инсталлированными каналами. Канал 1 представлял собой колонку с молекулярным ситом 10 м, работающую при 70 С, 200 кПа аргона и с временем промывки обратным потоком 4,2 с, в то время как канал 2 представлял собой колонку 10 м PPQ,работающую при 90 С, 150 кПа гелия и при отсутствии промывки обратным потоком. Температура инжектора для обоих каналов составила 70 С. Время прогона устанавливали 120 с, но все пики, представляющие интерес, как правило, элюировали до момента 100 с. Определенное поглощение CO определяли путем расчета поглощения CO на грамм клеток (сухая массасм. ниже). Плотность клеток Плотность клеток определяли путем подсчета клеток в определенной аликвоте ферментационного бульона. Альтернативно измеряли поглощение образцов при 600 нм (спектрофотометр) и определяли сухую массу посредством расчета согласно опубликованным методикам. Раствор 1 сульфида металла Приблизительно 950 мл раствора А переносили в ферментер емкостью 1 л и барботировали азотом. Добавляли Н 3 РО 4 (85%-ный раствор, 1,5 мл) и рН доводили до 5,3 с использованием концентрированного раствора NH4OH (водн.). Добавляли диазорезорцин (1 мл раствора 2 г/л) и раствор барботировали с помощью N2. Добавляли хлорид хрома(II) до тех пор, пока ORP раствора не уменьшится до приблизительно -150 мВ. Добавляли 10 раствор(ы) С перед добавлением полисульфида натрия (1,44 мл 4,3 М или 1 мл 6 М раствора) и раствор барботировали с помощью N2. Пример 1 А. Получение 2,3-бутандиола с помощью ферментации. Ферментативное превращение субстрата с использованием Clostridium autoethanogenum проводили в CSTR-реакторе в течение двухнедельного периода с периодическим мониторингом. Среду, используемую для экспериментов CSTR, готовили в соответствии с компонентами, перечисленными в таблице (Е). Смесь фосфатных солей состояла из 0,65 мМ Na2HPO4 и 15,3 мМ NaH2PO4. Все другие компоненты, такие как фосфорная кислота, соли аммония и цистеин-гидрохлорид, смешивали в 800 мл воды перед добавлением буферных солей в раствор. Такой порядок гарантирует, что значение рН, превышающее примерно 6,5, помогает избежать выпадения в осадок компонентов среды. Раствор разводили до объема 1 л и создавали анаэробные условия, нагревая его до кипения и давая раствору возможность охладиться до комнатной температуры при постоянном потоке газа N2. После охлаждения раствор доводили до конечного рН 5,3 и добавляли витамины В. Анаэробность поддерживали на протяжении эксперимента. Углевод (5 г/л фруктозы) добавляли к основному составу среды. Растворы среды вводили в ферментеры и необязательно барботировали с помощью соответствующих CO-содержащих газов с момента начала эксперимента или после определенного интервала. Во время этих экспериментов рН контролировали,поддерживая на уровне 5,5 путем добавления водного раствора NaOH. Активно растущую культуру Clostridium autoethanogenum инокулировали в реактор в количестве 5% (об./об.). Температуру реактора поддерживали при 37 С, и интенсивность перемешивания составляла 400 об/мин. Результаты Изначально реакция ферментации содержала фруктозу в качестве субстрата, в результате которой получалась уксусная кислота, этанол и 2,3-бутандиол. В течение времени фруктоза поглощалась, и поток газа, включающий CO (95% CO, 5% CO2), барботировали сквозь среду. рН среды поддерживали на уровне 5,5 (табл. 1). Следует отметить, что даже когда углевод поглощался, концентрация вышеупомянутых продуктов увеличивалась, ясно демонстрируя, что CO использовался для получения 2,3-бутандиола. Таблица 1. Мониторинг получения 2,3-бутандиола, этанола и ацетата Пример IB. Получение 2,3-бутандиола с помощью ферментации. В следующем эксперименте превращение субстрата с помощью Clostridium autoethanogenum проводили в CSTR-реакторе в течение 10-дневного периода с периодическим мониторингом. В этом случае ферментер и среду готовили согласно примеру 1 А, однако субстрат имитировался исключительно газом сталелитейного завода (70% CO, 1% Н 2, 14% N2, 15% CO2), который непрерывно барботировался, и рН среды поддерживали при постоянном значении 5,5 (табл. 2). Превращение субстрата снова приводило к получению уксусной кислоты, этанола и 2,3-бутандиола, демонстрируя, что даже в отсутствие углеводного субстрата в начале ферментации осуществляется получение уксусной кислоты, этанола и бутандиола. Таблица 2. Мониторинг получения 2,3-бутандиола, этанола и ацетата (концентрации в г/л) в течение времени в CSTR-реакторе периодического действия Пример 2. Получение 2,3-бутандиола с помощью ферментации. В следующем эксперименте превращение субстрата с помощью Clostridium autoethanogenum проводили в CSTR-реакторе в течение трехдневного периода с периодическим мониторингом. В этом случае ферментер и среду готовили согласно примеру 1 А, однако субстрат имитировался газом сталелитейного производства (70% CO, 1% Н 2, 14% N2, 15% CO2), который непрерывно барботировался, и фруктозой (10 г/л) и рН среды поддерживали на постоянном значении 5,5 (табл. 3). Превращение субстрата снова приводило в результате к получению уксусной кислоты, этанола и 2,3-бутандиола. Таблица 3. Мониторинг получения 2,3-бутандиола, этанола и ацетата (концентрации в г/л) в течение времени в CSTR-реакторе периодического действия Конечные концентрации ацетата, этанола и 2,3-бутандиола также сравнивали между экспериментами в ферментере, представленными в примерах 1 А, 1 В и 2, в конце каждого эксперимента (отмечено, что эти результаты относятся к конечным концентрациям, измеренным в табл. 1-3, и результаты суммированы в табл. 4). Таблица 4. Примеры получения 2,3-бутандиола с использованием альтернативных субстратов в CSTR-реакторе, измеренные в заключение каждого эксперимента. Результаты представлены в г/л Пример 3. Получение 2,3-бутандиола с помощью ферментации. С целью установления того, как условия среды могут влиять на получение 2,3-бутандиола, готовили сывороточные бутылки, содержащие среду, включающую выбранные буферы, и продукты ферментации анализировали в конце эксперимента (табл. 5). Инкубацию проводили в запаянных сывороточных бутылках емкостью 234 мл, каждая из которых содержала 50 мл вышеописанной среды (табл. Е), необязательно забуферированных или ацетатным буфером (0,02 М), или цитратным буфером (0,02 М), и рН доводили до 5,3. 184 мл свободного пространства над продуктом каждой сывороточной бутылки исходно заполняли N2 и затем заполняли под повышенным давлением 30 фунтов/кв. дюйм (206,8 кПа) или 95%CO, 5% CO2, или 70% CO, 15% CO2, 14% N2, 1% Н 2. В каждую пробирку инокулировали 2 мл культурыClostridium autoethanogenum. Использовали инкубатор со встряхиванием и температуру реакции поддерживали на уровне 37 С. Еще раз, понятно, что 2,3-бутандиол получают независимо от буфера, используемого в эксперименте. Кроме того, также следует заметить, что так как растворы сывороточных бутылок не контролировали по рН, продукт, по-видимому, также получают с ограниченным контролем по pH или в его отсутствие. Таблица 5. Примеры получения 2,3-бутандиола в различных средах. Среды сывороточных бутылок анализировали после активного роста,т.е. увеличение клеточной массы выравнивалось через несколько дней (4-7 дней). Результаты представлены в г/л Пример 4. Периодическая ферментация в CSTR. Приблизительно 1,3 л раствора переносили в ферментер емкостью 2 л и барботировали азотом. Добавляли диазорезорцин (1,35 мл раствора 2 г/л). Н 3 РО 4 (85%-раствор, 2,025 мл) добавляли и доводили рН до 5,3, используя конц. NH4OH (водн.). Добавляли хлорид хрома (II) до тех пор, пока ORP раствора не уменьшался до приблизительно -150 мВ. Добавляли полисульфид натрия (6,07 мл 4,3 М раствора) и доводили рН до 5,5 с использованием концентрированной HCl. Раствор барботировали с помощью N2 в течение 1 ч перед добавлением раствора 1 сульфида металла (150 мл) и раствора В (15 мл). Раствор барботировали с помощью N2, затем CO-содержащим газом (3% Н 2; 30% N2; 47% CO; 20% CO2), перед инокуляцией культуры Clostridium autoethanogenum в фазе активного роста в количестве, составляющем приблизительно 5% (об./об.). Расход газа регулировали с целью поддержания высокого определенного поглощения CO, чтобы гарантировать, что микробная культура не будет ограничена в CO. Результаты ферментации продемонстрированы в табл. 6. Таблица 6. Продуктивность 2,3-бутандиола в периодической культуре при варьировании определенных поглощений CO Общее аккумулирование 2,3-бутандиола в течение 7,5 дня составило приблизительно 7,5 г/л. Понятно, что 2,3-бутандиол получают в низких количествах при более низких удельных скоростях поглощения CO. Однако, когда газ подается так, что удельная скорость поглощения CO может поддерживаться около 0,4 ммоль/г/мин, при этом продуктивность 2,3-бутандиола значительно увеличивается. В этом случае удельная скорость поглощения CO поддерживается в среднем около 0,8 ммоль/г/мин в течение нескольких дней, и 1,3-бутандиол получают с избыточной интенсивностью 1 г/л. Пример 5. Периодическая ферментация в CSTR. Приблизительно 1,3 л раствора А переносили в ферментер емкостью 2 л и барботировали азотом. Добавляли Н 3 РО 4 (85%-ный раствор, 2,025 мл, 30 мМ) и доводили рН до 5,3, используя конц. NH4OH(водн.). Добавляли раствор В (13,5 мл) и раствор барботировали с помощью N2. Добавляли хлорид хрома(II) до тех пор, пока ORP раствора не уменьшался до приблизительно -150 мВ. Добавляли диазорезорцин (1,35 мл раствора 2 г/л). Добавляли полисульфид натрия (2,85 мл 6 М раствора) и раствор барботировали с помощью N2 в течение 12 ч перед переключением на CO-содержащий газ (1% Н 2; 14% N2; 70%CO; 15% CO2). Доводили рН до 5,5 с использованием концентрированной HCl перед добавлением раствора 1 сульфида металла (150 мл). Раствор барботировали с помощью CO-содержащего газа в течение следующих 30 мин перед инокуляцией культуры Clostridium autoethanogenum в фазе активного роста в количестве, составляющем приблизительно 5% (об./об.). Снова расход газа регулировали с целью поддержания высокого определенного поглощения CO, чтобы гарантировать, что микробная культура не будет ограничена в CO. Результаты ферментации продемонстрированы в табл. 7. Таблица 7. Продуктивность 2,3-бутандиола в периодической культуре при варьировании определенных поглощений CO ное определенное поглощение CO приводит в результате к значительно более высокой продуктивности 2,3-бутандиола, составляющей по меньшей мере 0,5 г/л/день. Пример 6. Периодическая ферментация в CSTR. Приблизительно 1,3 л раствора А переносили в ферментер емкостью 1,5 л и барботировали азотом. Добавляли Н 3 РО 4 (85%-ный раствор, 2,25 мл) и доводили рН до 5,3, используя конц. NH4OH (водн.). Добавляли раствор В (15 мл) и раствор барботировали с помощью N2. Добавляли хлорид хрома(II) до тех пор, пока ORP раствора не уменьшался до приблизительно -150 мВ. Добавляли диазорезорцин (1,5 мл раствора 2 г/л). Добавляли полисульфид натрия (1,5 мл 3 М раствора) и раствор барботировали с помощью N2 в течение 1 часа. Добавляли 0,1 М растворы FeCl2 (3,75 мл), CoCl2 (1,875 мл), NiCl2 (1,875 мл),Н 3 ВО 3 (0,375 мл), Na2MoO4 (0,375 мл), MnCl2 (0,375 мл), Na2WO4 (0,375 мл) и ZnCl2 (0,1875 мл) и раствор барботировали CO-содержащим газом (50% Н 2; 32% CO; 4% CO2; 32% СН 4). pH доводили до 5,5 с помощью концентрированной HCl перед добавлением раствора С (150 мл). Раствор барботировали COсодержащим газом в течение следующих 30 мин перед инокуляцией культуры Clostridium autoethanogenum в активной фазе роста в количестве приблизительно 5% (об./об.). Расход газа регулировали с целью поддержания высокого определенного поглощения CO, чтобы гарантировать, что микробная культура не будет ограничена в CO. Результаты ферментации продемонстрированы в табл. 8. Таблица 8. Продуктивность 2,3-бутандиола в периодической культуре при варьировании определенного поглощения CO Общая концентрация 2,3-бутандиола через 4 дня составила 3 г/л. В то время как достигнутые интенсивности были меньше, чем в предыдущих ферментациях (примеры 4 и 5), фракция субстрата включала существенную часть водорода. Результаты демонстрируют, что 2,3-бутандиол получают при использовании смешанного субстрата CO/Н 2. Пример 7. Непрерывная ферментация в проточном реакторе с непрерывным перемешиванием. Среду готовили при рН 5,5 следующим образом. Смешивали все ингредиенты раствора D за исключением цистеина-HCl в 400 мл дистиллированной воды. Этот раствор делали анаэробным, нагревая его до кипения и давая раствору возможность охладиться до комнатной температуры при постоянном потоке газа 95% CO, 5% CO2. После охлаждения добавляли цистеин-HCl и рН раствора доводили до 5,5 перед доведением объема до 1000 мл; анаэробность поддерживали на протяжении всех экспериментов. В биореактор емкостью 5 л загружали 4,9 л среды LM33, приготовленной, как описано выше. Газ переключали на CO-содержащий газ (1% Н 2; 14% N2; 70% CO; 15% CO2) при атмосферном давлении перед инокуляцией 100 мл культуры Clostridium autoethanogenum. Биореактор поддерживали при 37 С,перемешивая при 200 об./мин в начале культивирования. Во время фазы роста интенсивность перемешивания увеличивали до 400 об./мин. рН доводили до 5,5 и поддерживали путем автоматического добавления 5 М NaOH. Свежую анаэробную среду непрерывно добавляли в биореактор для поддержания определенной биомассы и количества ацетата в биореакторе. Продуктивность 2,3-бутандиола представлена в табл. 9. Таблица 9. Продуктивность 2,3-бутандиола в непрерывной культуре Во время первых 89 дней непрерывной работы ферментер работал в условиях ограничения по CO, и получалось минимальное количество 2,3-бутандиола. Однако около 88 дня поток газа увеличивали таким образом, чтобы увеличивалось определенное поглощение CO. На этой стадии продуктивность 2,3 бутандиола значительно увеличивалась по меньшей мере до 1,2 г/л/день. Около 92 дня поток газа уменьшали таким образом, чтобы определенное поглощение культуры уменьшилось до около 0,4 ммоль/г/мин,и продуктивность 2,3-бутандиола также падала. Однако даже при среднем определенном поглощении,составляющем приблизительно 0,4 ммоль/г/мин, продуктивность 2,3-бутандиола оставалась на уровне по меньшей мере 0,5 г/л/день. Пример 8. Периодическая ферментация в CSTR. Приблизительно 1,3 л раствора А переносили в ферментер емкостью 2 л и барботировали с помощью азота. Добавляли Н 3 РО 4 (85%-ный раствор, 1,5 мл) и доводили рН до 5,3, используя конц. NH4OH(водн.). Добавляли раствор В (15 мл) и раствор барботировали с помощью N2. Добавляли хлорид хрома(II) до тех пор, пока ORP раствора не уменьшался до приблизительно -150 мВ. Добавляли поли- 14018720(1% Н 2; 14% N2; 70% CO; 15% CO2). Добавляли диазорезорцин (1 мл раствора 2 г/л). Доводили рН до 5,5 с использованием концентрированной HCl и раствор барботировали с помощью CO-содержащего газа в течение следующих 30 мин перед инокуляцией культуры Clostridium autoethanogenum в фазе активного роста в количестве, составляющем приблизительно 5% (об./об.). Табл. 10 демонстрирует аккумулированный продукт 2,3 бутандиола в ферментере после приблизительно 2 недель работы. Удельную скорость поглощения CO корректировали по жизнеспособности культуры. Жизнеспособность культуры определяли с использованием методов, описанных в WO2009/022925, который включен в настоящий документ ссылкой. Таблица 10. Аккумулирование 2,3-бутандиола через 14 дней периодической ферментации В течение 24-часового периода на 13-14 день определенное поглощение CO поддерживали на уровне приблизительно 0,5 ммоль/г/мин, и продуктивность 2,3-бутандиола составляла 0,6 г/л/день. Пример 9. Генная регуляция получения 2,3-бутандиола в LZ1560. Образцы отбирали из трех ферментеров для определения генной экспрессии во время получения 2,3-бутандиола. Один образец отбирали из периодической ферментации, описанной в примере 8, на 13 день, где получаются продукты, включающие этанол и 2,3-бутандиол. В результатах, представленных ниже, образец обозначают R12. Второй образец отбирают из периодической ферментации, получающей оба продукта, этанол и 2,3-бутандиол. В результатах образец обозначали R11. Третий образец (R2) отбирали в дни 1-89 из непрерывной ферментации, работающей при условиях, подобных примеру 7. Микробная культура была ограничена по CO, и ферментационный бульон имел стабильную концентрацию ацетата, составляющую приблизительно 13 г/л; концентрацию этанола менее чем 1 г/л и незначительные количества 2,3-бутандиола. Для определения положительной регуляции или отрицательной регуляции генов по отношению к R2 использовали ПЦР в реальном времени. Методика выделения РНК и синтеза кДНК Суммарную РНК выделяли из приблизительно 2,5109 бактериальных клеток с использованием набора реагентов Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Kit (Biorad). ДНК гидролизовали на колонке с использованием свободного от РНК-азы комплекта ДНК-азы (Biorad). Суммарную РНК оценивали количественно с использованием спектрофотометра, а ее чистоту (измеренную по соотношению А 260/280) определяли перед синтезом кДНК с использованием набора реагентов iScript Select cDNA synthesis kit (Biorad). Методика ПЦР в реальном времени Праймеры для ПЦР в реальном времени были разработаны с использованием свободно распространяемого программного обеспечения Primer3 на основе запатентованного продукта собственной разработки LanzaTech для геномных последовательностей. Составляли реакционные смеси ПЦР в реальном времени, содержащие 12,5 мкл 2SYBR зеленого ПЦР-Мастер-Микса (Biorad), 1,5 мкл каждого из праймеров 1 мкМ, прямого и обратного, 5 мкл 10 разведенной кДНК-матрицы и добавляли стерильную воду до общего объема 25 мкл. Смеси нагревали до 95 С в течение 3 мин, с последующими 40 циклами 95 С в течение 15 с, 55 С в течение 15 с и 72 С в течение 30 с. Для детектирования димеризации праймеров или других артефактов амплификации, проводили анализ кривой плавления сразу после завершения ПЦР в реальном времени (38 циклов от 58 до 95 С со скоростью 1 С/с). Все реакции проводили трижды. Количественную оценку генной экспрессии проводили с использованием системы детектирования ПЦР в реальном времени MyiQ Single Colour Real-Time PCR Detection System (Biorad), и данные ПЦР в реальном времени анализировали с использованием программного обеспечения оптической системы iQ5 (Biorad). Результаты Групповые величины Ct вместе с относительной генной экспрессией и стандартными ошибками,генерированными в результате анализа ПЦР в реальном времени, представлены в табл. 11. Бета-цепь РНК-полимеразы (rpoB) выбирали в качестве эталонного гена для нормализации генной экспрессии. Относительную количественную оценку с использованием метода сравнения СТ использовали для расчета относительной генной экспрессии 2,3BDH. Ацетат-получающую культуру (R2) выбирали в качестве калибратора (эталонный стандарт) во всех анализах. Таблица 11. Вывод величин относительной генной экспрессии из групповых данных Ct. Относительные экспрессии нормализовали по rpoB и калибровали с использованием реактора 2(Любая относительная экспрессия выше 1 демонстрировала положительную регуляцию) Данные ПЦР в реальном времени, представленные в настоящем исследовании, демонстрируют, что экспрессия гена 2,3-бутандиола значительно выше в сольвентогенных культурах (R11/R12) по сравнению с ацетогенными культурами (R2). Микробная культура R12, которая получала приблизительно 0,6 г/л/день 2,3-бутандиола в момент сбора клеток, демонстрирует наивысшую положительную регуляцию гена (в 7,640,8 раза) по отношению к R2. За ней следует R11 с положительной регуляцией гена в 4,751,8, которая осуществляла общее получение 2,3-бутандиола на уровне 1,53 г/л при сборе клеток. Чертеж демонстрирует относительную генную экспрессию 2,3-бутандиолдегидрогеназы (2,3BDH) в трех ферментерах (R11, R12 и R2). Ацетат-получающую R2 выбирали в качестве калибратора и генную экспрессию нормализовали с использованием rpoB в качестве эталонного гена. Величина ошибки равна стандартной ошибке среднего. N=3. Очевидно, что 2,3-бутандиолдегидрогеназа положительно регулируется в микробных культурах, которые получают 2,3-бутандиол. Микробная культура в R2 обладает удельным поглощением CO, составляющим приблизительно 0,3 ммоль/г/мин, тогда как культура R12 обладает удельным поглощением, составляющим приблизительно 0,6 ммоль/г/мин. Увеличение количества CO, предоставляемого культуре, приводит в результате к увеличению поглощения CO и к последующему увеличению генной экспрессии 2,3-бутандиолдегидрогеназы. Увеличение генной экспрессии 2,3-бутандиолдегидрогеназы приводит в результате к увеличению общей продуктивности 2,3 бутандиола. Изобретение описано в настоящем документе со ссылкой на определенные предпочтительные воплощения с целью дать возможность читающему осуществить на практике изобретение без чрезмерного экспериментирования. Специалисту в данной области понятно, что изобретение подвержено вариациям и модификациям, отличным от тех, что были конкретно описаны. Следует понимать, что изобретение включает все такие вариации и модификации. Кроме того, заглавия, заголовки или подобные представлены для усиления понимания читающим настоящего документа и не должны рассматриваться как ограничения рамок настоящего изобретения. Полное описание всех применений, патентов и публикаций, цитированных выше и ниже, если необходимо, включены в настоящий документ ссылкой. В настоящем описании ссылка на любой известный уровень техники не является и не должна рассматриваться как подтверждение или любая форма предположения того, что известный уровень техники образует часть общеизвестных сведений в Соединенных Штатах Америки или в любой стране мира. На протяжении настоящего описания и любых пунктов формулы изобретения, которые следуют далее, до тех пор пока из контекста не следует другое, слова "включает", "включающий" и подобные, следует понимать как включающий в себя в противоположность исключающему смыслы, другими словами,в смысле "включающий, но не ограничиваясь перечисленным". ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения 2,3-бутандиола с помощью микробной ферментации газообразного субстрата,содержащего CO, включающий:b) анаэробное ферментирование газообразного субстрата, содержащего CO, в биореакторе, причем биореактор содержит культуру одного или нескольких микроорганизмов, где один или несколько микроорганизмов включают один или несколько генов 2,3-бутандиол-дегидрогеназы;c) положительную регуляцию гена(ов) 2,3-бутандиолдегидрогеназы таким образом, чтобы осуществлялось получение 2,3-бутандиола с помощью микроорганизма(ов),где газообразный субстрат, содержащий CO, представляется таким образом, чтобы в культуре поддерживалась удельная скорость поглощения CO, составляющая по меньшей мере 0,4 ммоль CO/г сухой массы клеток бактерий/мин. 2. Способ по п.1, где субстрат предоставляется таким образом, чтобы поддерживалась удельная скорость поглощения CO, составляющая по меньшей мере 0,6 ммоль CO/г/мин. 3. Способ по п.1, где субстрат предоставляется таким образом, чтобы поддерживалась удельная скорость поглощения, составляющая по меньшей мере 0,8 ммоль CO/г/мин. 4. Способ по п.1, где субстрат предоставляется таким образом, чтобы в культуре поддерживалась удельная скорость поглощения, составляющая по меньшей мере 1,0 ммоль CO/г/мин. 5. Способ по любому из пп.1-4, где положительную регуляцию гена 2,3-бутандиолдегидрогеназы осуществляют путем предоставления газообразного субстрата, содержащего CO, таким образом, чтобы в культуре поддерживалась удельная скорость поглощения CO одним или несколькими микроорганизмами, которая составляет по меньшей мере 0,4 ммоль CO/г сухой массы клеток бактерий/мин. 6. Способ по любому из пп.1-5, где газообразный субстрат, содержащий CO, содержит по меньшей мере от примерно 15 до примерно 100% CO по объему. 7. Способ любому из пп.1-6, где субстрат, содержащий CO, включает газ, полученный в качестве побочного продукта производственного процесса. 8. Способ по п.7, где субстрат, содержащий CO, включает газ, полученный от сталелитейного завода. 9. Способ по любому из пп.1-8, где один или несколько микроорганизмов представляют собой Clostridium autoethanogenum. 10. Способ по любому из пп.1-9, где один или несколько микроорганизмов имеют, по крайней мере,некоторые определенные признаки штамма Clostridium autoethanogenum, депонированного в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под номером депонирования DSM19630. 11. Способ по любому из пп.1-10, где продуктивность 2,3-бутандиола составляет более чем 0,2 г/л/день.