Способ увеличения количества мононуклеарных клеток у субъекта, страдающего раком, и используемая для этого фармацевтическая комбинация

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК У СУБЪЕКТА, СТРАДАЮЩЕГО РАКОМ, И ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ЭТОГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМБИНАЦИЯ В описании изобретения описаны фармацевтическая комбинация и способ для увеличения количества мононуклеарных клеток у субъекта, страдающего раком, который подвергается терапии с помощью противоопухолевой вакцины. Причем комбинация включает, противоопухолевую вакцину, индуцирующую иммунный ответ у указанного субъекта, и повышающее эффективность указанной вакцины количество альфа-тимозинового пептида, который усиливает иммунной ответ у указанного субъекта. Указанная противоопухолевая вакцина и указанный альфа-тимозиновый пептид могут быть введены в организм субъекта раздельно или совместно. 015510 Перекрестные сведения на родственные заявки По настоящей заявке испрашивается приоритет на основе предварительной заявки на патент СШАUS 60/633175, поданной 6 декабря 2004 г. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к лечению рака. Предпосылки создания изобретения В мире основной причиной смерти являются раковые заболевания. Неспецифические подходы к лечению рака, например хирургия, химиотерапия и радиотерапия, успешно применяются только по отношению к отдельным группам пациентов. Иммунотерапия представляет новое направление в лечении рака. Основной принцип заключается в обеспечении организма пациента, подвергаемого лечению, способностью повышать иммунологическую активность в отношении раковых клеток. Существует ряд стратегий, которые появились в последние годы и в настоящее время изучаются. Эти стратегии включают перенос аллогенных лимфоцитов, внутриопухолевую имплантацию иммунореактивных клеток, системную вакцинацию для выработки опухолеспецифичного иммунного ответа и др. В данной области сохраняется потребность в улучшении противоопухолевого лечения и противораковых композиций. Краткое описание изобретения Согласно настоящему изобретению предложены фармацевтическая комбинация и способ для увеличения количества мононуклеарных клеток у субъекта, страдающего раком, который подвергается терапии с помощью противоопухолевой вакцины. Причем комбинация включает противоопухолевую вакцину, индуцирующую иммунный ответ у указанного субъекта, и повышающее эффективность указанной вакцины количество альфа-тимозинового пептида, который усиливает иммунной ответ у указанного субъекта. Указанная противоопухолевая вакцина и указанный альфа-тимозиновый пептид могут быть введены в организм субъекта раздельно или совместно. Описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения Настоящее изобретение предназначено для лечения опухолей и онкологических заболеваний у субъекта, предпочтительно у млекопитающего, и наиболее предпочтительно у человека. Прогрессирующий рак устойчив к традиционным способам лечения. Некоторые противораковые вакцины продемонстрировали активность по снижению проявления заболевания или по прекращению прогрессирования заболевания, связанную или не связанную с опухолевым ответом, а также повышенную выживаемость пациентов. Введение в организм альфа-тимозинового пептида, например тималфазина (тимозина альфа-1),обладает положительным адъювантным эффектом при лечении вакциной онкологических больных, который проявляется в уменьшении размера опухоли и в повышении выживаемости у пациентов с прогрессирующим раком, в том числе у тех, которые не проявляют ответной реакции на введение в организм только одной противораковой вакцины (например, при иммунизации дендритными клетками). Настоящее изобретение относится к лечению онкологических заболеваний и опухолей. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение направлено на проявление иммуностимулирующей активности альфа-тимозинового пептида, например иммуномодулирующего вещества тималфазина, при лечении пациентов с неопластическим заболеванием, например раком, включая, но не ограничиваясь этим заболеванием, рак груди, при этом лечение включает применение противораковой вакцины. Настоящее изобретение также включает улучшение терапевтического ответа путем добавления альфатимозинового пептида при лечении пациента противораковыми вакцинами, например вакцинами на основе дендритных клеток, но это не является эксклюзивным для такого типа противораковых вакцин. Настоящее изобретение описано на примере лечения рака груди. Однако к числу онкологических заболеваний, которые можно лечить с помощью настоящего изобретения, относятся, но ими не ограничиваются,первичная меланома, метастатическая меланома, аденокарцинома, плоскоклеточная карцинома, железисто-плоскоклеточная карцинома, тимома, лимфома, саркома, рак легкого, рак печени, не-ходжкинская лимфома, ходжкинская лимфома, лейкозы, рак матки, рак простаты, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, множественная миелома, нейробластома, рак носоглотки, рак мочевого пузыря, рак шейки матки, рак почки, рак мозга, рак костей, рак желудка, рак прямой кишки и др. К альфатимозиновым пептидам относятся тимозиновые альфа-1 пептиды (ТА 1), включая природный ТА 1, а также синтетический ТА 1 и рекомбинантный ТА 1, несущий аминокислотную последовательность природного ТА 1, в значительной степени близкие им аминокислотные последовательности или их укороченные формы, а также их биологически активные аналоги, имеющие замещенные, делетированные, элонгированные, перемещенные и иным образом модифицированные последовательности, которые проявляют биологическую активность, близкую активности ТА 1, например, ТА 1-производный пептид, обладает выраженной аминокислотной гомологией с ТА 1, причем этот пептид действует практически таким же образом и проявляет практически такую же активностью, что и ТА 1. Пригодные дозы альфатимозинового пептида могут быть в диапазоне примерно 0,001-10 мг/кг/сутки. Понятия "тимозин альфа-1" и "ТА 1" означают пептиды, обладающие аминокислотной последовательностью, описанной в патенте US 4079137, сущность которого включена в настоящее изобретение в виде ссылки. Эффективные количества альфа-тимозинового пептида являются теми количествами, которые-1 015510 обеспечивают повышение активности противораковых вакцин, которые могут быть дозированные единицами в диапазоне, составляющем для ТА 1 0,1-20 мг, предпочтительно 0,5-10 мг ТА 1. Более предпочтительно дозированная единица включает примерно 1-4 мг ТА 1. Наиболее предпочтительно дозированная единица содержит примерно 1,6-3,2 мг ТА 1. Тимозин альфа-1 (ТА 1), первоначально выделенный из фракции 5 тимозина (ТФ 5), был секвенирован и химически синтезирован. Пептид ТА 1 состоит из 28 аминокислот с молекулярной массой 3108. Противораковыми вакцинами для использования в соответствии с настоящим изобретением являются вакцины дендритных клеток. Противораковые вакцины могут быть введены субъекту в соответствии с настоящим изобретением в одной из эффективных доз. Такие дозы могут быть в диапазоне примерно от 110-9 г до примерно 110-3 г. В других вариантах осуществления настоящего изобретения пригодные эффективные дозы противораковых вакцин могут быть в диапазоне примерно от 110-8 г до примерно 1104 г. Эффективное количество введенных доз противораковой вакцины может быть, например, одним из диапазона 1-20,или более. Предпочтительно противораковую вакцину вводят в виде нескольких доз, например, примерно от 2 до примерно 15 доз, более предпочтительно примерно 4-10 доз и наиболее предпочтительно примерно 6 доз. В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения вакцину вводят субъекту в здоровые лимфатические узлы один раз в три недели на протяжении курса лечения. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения противораковую вакцину,индуцирующую иммунный ответ, вводят субъекту вместе с введением субъекту альфа-тимозинового пептида, причем вакцину и альфа-тимозиновый пептид вводят субъекту раздельно и/или вместе. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения альфа-тимозиновый пептид вводят в основном одновременно с введением вакцины по меньшей мере при одном введении вакцины. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения и вакцину, и альфа-тимозиновый пептид вводят в организм инъекцией. Предпочтительно и вакцину, и альфа-тимозиновый пептид вводят субъекту много раз. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения альфа-тимозиновый пептид вводят дважды в неделю на протяжении курса введения. Особенно предпочтительно, если курс введения длится примерно шесть месяцев. В одном их предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение применимо для лечения рака у субъектов, не являющихся респондентами при лечении рака только одной вакциной. В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения альфатимозиновый пептид вводят в организм подкожной инъекцией дважды в неделю в фармацевтических дозированных единицах, находящихся в диапазоне примерно 1-4 мг (например, 1,6-3,2 мг), вместе с введением субъекту противораковой вакцины. Однако следует учитывать, что фармацевтические дозированные единицы, содержащие альфа-тимозиновый пептид и/или противораковую вакцину, могут быть составлены любым пригодным способом для введения любым пригодным путем. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения дозированную единицу, содержащую альфа-тимозиновый пептид, вводят субъекту обычным способом. Например, дозированная единица может вводиться чаще одного раза в сутки, в неделю, в месяц и т.д. Дозированная единица может вводиться дважды в неделю, например каждые третьи сутки. Дозированная единица альфатимозинового пептида также может вводиться, например, трижды за неделю. Введение в организм альфа-тимозинового пептида и вакцины может осуществляться каким-либо пригодным способом, например инъекцией, инфузией или перорально. В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения введение в организм осуществляют инъекцией. Если вакцину и альфа-тимозиновый пептид вводят одновременно, эти препараты могут быть представлены в единой композиции, включающей вакцину и альфа-тимозиновый пептид. Композиции, включающие вакцину и/или альфа-тимозиновый пептид, могут также включать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей и необязательно другие терапевтические ингредиенты. К составам, пригодным для инъекции или инфузии, относятся водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут необязательно содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворы, которые обеспечивают составам изотоничность по отношении к крови подвергаемого лечению реципиента, а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители. Составы могут быть помещены в однодозовые или многодозовые контейнеры, например, запечатанные ампулы и флаконы, и могут храниться в лиофилизированном состоянии, а непосредственно перед применением требуется только внести стерильный жидкий носитель,например воду для инъекций. Прогрессирующий рак устойчив к традиционным способам лечения. Некоторые противораковые вакцины продемонстрировали активность, выраженную в снижении проявления заболевания или в повышении выживаемости. Введение в организм альфа-тимозинового пептида, например тималфазина (тимозина альфа-1), обладает положительным эффектом при лечении вакциной, выраженном в снижении размера опухоли и в повышении выживаемости, в том числе у пациентов с прогрессирующим раком,которые не проявляют ответной реакции на введение в организм только одной противораковой вакцины(например, при иммунизации дендритными клетками). Существует три системы, ответственные за поддержание гомеостаза в организме человека: иммунная, эндокринная и нервная. Иммунная система отвечает за репарацию и дифференциацию клеток и тканей, а также за поддержание их идентичности путем сохранения внутренней и внешней среды. Следовательно, двумя основными функциями иммунной системы являются регуляторная функция и эффекторная функция. Обе эти функции осуществляются одной и той же популяцией клеток, активно реагирующих на потребности организма. Иммунная система играет активную роль в терапии рака и может предотвратить дисфункцию органа и появление новообразования. С терапевтической точки зрения иммунотерапия рака, по существу, означает стимулирование иммунной системы с помощью различных реагентов, например вакцин, инфузий Т-клеток или цитокинов. Эти реагенты могут действовать по нескольким механизмам: 1) путем стимулирования противоопухолевого ответа,2) путем понижения механизма супрессии,3) изменением опухолевых клеток для повышения у них иммуногенности и чувствительности к иммунологической защите,4) исправлением устойчивости к цитотоксическим лекарственным средствам или радиотерапии. Рак возникает в результате различных генетических дефектов, образующихся в генах, кодирующих участвующие в росте клеток белки. Составляющие иммунной системы, антитела и Т-клетки, не могут распознать дефектные гены, но они распознают и реагируют на анормальные белки, которые кодируются вызывающими рак генами. Иммунная система может атаковать рак с помощью В- и Т-лимфоцитов. Антитела - это белки, вырабатываемые В-клетками в ответ на чужеродное вещество. Каждое антитело связывается со специфическим антигеном. Основная защита, обеспечиваемая антителами, осуществляется через эффекты амплификации системы "комплемента", состоящей примерно из 20 различных белков. Когда антитело связывается с антигеном, активируется специфический сайт активности антитела. Этот сайт связывает молекулу системы комплемента и вызывает каскад реакций. Опсонизация и фагоцитоз - одни из наиболее важных проявлений комплемента. Они сильно активируют фагоцитоз, осуществляемый нейтрофилами и макрофагами. Этот тип опосредованного антителами эффекта известен как антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (АОКЦ). АОКЦ обладает полезным действием - катализированием активности Т-клеток, поскольку разрушаемые белки чужеродных клеток представлены в молекулах главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) антиген-презентирующих клеток(АПК) в качестве пептидов. Также было установлено, что антитела уничтожают клетки, блокируя механизмы роста, особенно у раковых клеток. Цитотоксичные Т-клетки (CD8+) являются специфичными для молекул класса I ГКГ и реагируют с пептидными антигенами, экспрессированными на поверхности клетки, поскольку они презентированы в качестве белка или пептидных фрагментов, представленных в ГКГ. Пептиды и ГКГ вместе активируют Т-клетки. Эти Т-клетки разрушают несущую клетку путем перфорирования мембраны ферментами или запуская аутодеструктивный апоптический метаболический путь, разрушающий эти инвазивные клетки. Хелперные Т-клетки (CD4+) являются регуляторами активности иммунной системы. CD4+ Тклетки также распознают молекулы класса II ГКГ. CD4+ Т-клетки повышают иммунный ответ за счет секреции цитокинов (например, интерлейкина-2 (ИЛ 2, в результате чего стимулируют либо Тклеточный ответ (Т-хэлпер 1), либо ответ антител (Т-хэлпер 2). Эти цитокины стимулируют образование антител В-клетками или повышают образование CD8+ Т-клеток. CD4+ Т-клетки образуют серии белковых медиаторов, называемых цитокинами, которые воздействуют на другие клетки иммунной системы,усиливая ответное действие иммунной системы в целом. Генетические изменения раковых клеток (онкоцитов) приводят к появлению молекул, отличающихся от молекул неизмененных зрелых клеток. Эти измененные молекулы, называемые опухолевыми антигенами или опухолеассоциированными антигенами, являются мишенью эффекторной реакции. В то же время, онкоциты образуют цитокины для индукции репликации собственной ДНК и собственных процессов дифференциации, например интерферон , который секретируется инфицированными вирусом клетками и прекращает репликацию вируса в соседних клетках. Другие цитокины, например ИЛ 6 и трансформирующий ростовой фактор(ТРФ ), не могут репарировать генетическое повреждение, но индуцируют клеточную дифференциацию и ингибируют действие хелперных Т-лимфоцитов 1 иммунной системы. Токсический эффект, индуцирующий процесс трансформации клеток, может нарушить способность к иммунной защите (иммунный контроль), индуцируя генную мутацию и иммуносупрессию. Кроме того,новые онкоциты, при неудачной попытке репарировать свою измененную ДНК, повышают выработку ТРФ и/или родственных цитокинов, индуцируя иммунную толерантность к себе, поэтому генетически измененные клетки приводят к возникновению новообразования. В последних исследованиях было установлено, что опухоли иммуногенны и предположительно формируют долгосрочную иммунологическую память. Другим важным обстоятельством является реци-3 015510 див опухоли, сокращающий продолжительность жизни онкологических пациентов. Организмы некоторых пациентов могут инициировать ответ на традиционное лечение, например на химиотерапию, хирургическое вмешательство или радиотерапию, но опухоль может образоваться заново. Известно, что у пациентов, подвергшихся трансплантации почки, впоследствии вероятность повторного возникновения рака в 3-5 раз выше, чем средняя вероятность по популяции, что частично может быть связано с длительной иммуносупрессией. Антигены - это чужеродные вещества, распознаваемые и разрушаемые клетками иммунной системы. Становясь канцерогенными, клетки образуют новые, незнакомые организму антигены. Иммунная система может распознать эти антигены в качестве чужеродных, и поглотить или даже разрушить раковые клетки. Вирусные белки - вируса гепатита В (ВГВ), вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ) и папилломавируса человека (ПВЧ) - важны для развития гепатоклеточной карциномы, лимфомы и рака шейки матки,соответственно. Онкогенные белки, гликозилированные белки и карбогидраты являются раковыми антигенами. Многие из этих белков распределяются по разным типам опухолей, причем более 500 опухолевых антигенов было идентифицировано. Достаточно сильного иммунного ответа не возникает в организме больных раком пациентов. Экспрессируемые раковыми клетками белки могут индуцировать иммунный ответ. Вакцинация Может быть много причин, объясняющих, почему неэффективен иммунный ответ. Присутствие цитокинов в среде не допускает амплификации CD4+ Т-клеток. Опухоли по мере роста могут секретировать иммуносупрессорные факторы - либо непосредственно модулируя иммунный ответ, например, вирусные белки, связывающие иммунные рецепторные молекулы и препятствующие их экспозиции на поверхности инфицированных вирусом клеток, либо действуя через факторы, секретируемые самой опухолью, что приводит к нарушению регуляции активации иммунной системы. Иммунотолерантность - важный механизм, с помощью которого опухоли избегают уничтожения иммунной системой. Разработка стратегий иммунотерапии может быть эффективной для полного уничтожения раковых клеток. Они сосредоточены на получении большей "ауто" иммуногенности путем использования активаторов иммунной системы, поставляя антигеннесущие клетки или переводя некоторые из этих опухолевых антигенных белков в иммуногенные пептиды. Клинически применимая противораковая вакцина должна иммунизировать против многих белков,нацеливаясь на важные белки, вовлеченные в злокачественное перерождение. Поэтому применение лекарственных средств или веществ, называемых иммуномодуляторами, может повысить или модифицировать естественный иммунный ответ, улучшая гистологические и клинические результаты вакцинации. Успешная иммунотерапия должна быть сосредоточена на манипулировании регуляторными активностями иммунной системы для разрушения раковых клеток и предупреждения рецидива. В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение сфокусировано на обеих описанных выше иммунных активностях. Живые и модифицированные аутологические опухолевые клетки используются для усиления аутологических не подвергнутых какому-либо воздействию дендритных клеток (ДК). Совместное культивирование клеток обоих типов осуществляется в определенной среде для культуры клеток для дифференциации не подвергавшихся какому-либо воздействию ДК в ДК индукторы эффекторной реакции. Эти ДК вводят инъекцией в здоровый лимфатический узел для начала Т-клеточной эффекторной реакции против опухолевых клеток пациента. Этот подход безопасен, мало токсичен для пациента и обеспечивает существенную и устойчивую противоопухолевую активность в отношении прогрессирующих и хорошо сформировавшихся опухолей. Ниже в первую очередь рассматриваются опухолевые антигены и клетки, участвующие в иммунном контроле, а также дополнительные формы, помогающие избежать развития онкологического заболевания. Также описаны основные иммунотерапевтические стратегии, применяемые в настоящем изобретении. Затем описан патентоспособный терапевтический подход, его принципы, предполагаемые механизмы действия и преимущества над другими подходами. Опухолевые антигены (ОА). Релевантные опухолевые антигены могут быть разделены на две основные категории. К первой категории относятся специфические опухолевые антигены (СОА), обнаруженные исключительно в опухолевых клетках, которые являются идеальной мишенью для иммунной атаки. Ко второй категории относятся опухолеассоциированные антигены (ОАА), обнаруженные в опухолевых клетках, но также и в некоторых здоровых клетках, при этом качественная и количественная оценка экспрессии этих молекул позволяет их использовать для отличия опухолевых клеток от здоровых. Цель противоопухолевой иммунотерапии заключается в эффективном лечении рака путем контроля и повышения иммунного ответа против СОА и ООА. Спонтанная ремиссия, наблюдаемая в некоторых случаях злокачественных меланом и карциномы почки, служит доказательством достижения этой цели. Опухолеспецифичные антигены (ОСА). Эти антигены можно обнаружить только в онкоцитах. Они были идентифицированы в опухолях экспериментальных животных, в белках человека вирусного происхождения, в мутированных онкогенах и белках, связанных со злокачественными фенотипами, спонтанными мутациями, чье возникновение может быть связано с нестабильностью генома, свойственной зло-4 015510 качественным клеткам. Оценка метаболических путей презентации антигена через главный комплекс гистосовместимости(ГКГ) на Т-клетки объясняет, что не только белки измененной клеточной мембраны могут быть обнаружены в качестве антигенов, но также внутренние или интернализированные белки могут стать специфическими опухолевыми антигенами. Т-клетки распознают пептиды малого размера, которые образуются в результате разрушения цитозольных белков и встраиваются в пептидную щель молекулы ГКГ. Эти пептиды вместе с молекулой ГКГ затем транспортируются на поверхность клетки. Следовательно, любые измененные клеточные белки являются потенциальными иммунными агентами, а не только белки, расположенные в мембране. Таким образом, нефункционирующий белок в опухолевой клетке, образуемый мутантным аллелем, как в р 53, потенциально является специфическим опухолевым антигеном. Опухолеассоциированные антигены (ОАА). ОАА являются молекулами опухолевых клеток, которые могут экспрессироваться некоторыми здоровыми клетками на определенных стадиях дифференциации. Их количественные или комбинированные экспрессии в связи с другими линиями клеток или дифференциальными маркерами, или комбинациями обоих, могут использоваться для идентификации трансформированных клеток. Наиболее изученными ОАА являются онкофетальные антигены, которые экспрессируются в ходе эмбриогенеза, но отсутствуют или почти не выявляются в нормальной ткани взрослого организма. Прототипом ОАА является карциноэмбриональный антиген (КЭА). -фетопротеин и семейство белков MAGE относятся к этому типу антигенов. Иммунный контроль Генетически трансформированные клетки содержат антигенные белки, отличающиеся качественно и количественно от белков нормальных клеток (соответственно СОА и ОАА). Клетки и гуморальные компоненты, действующие и во врожденном, и в адаптированном иммунном ответе, принимают участие в деструктивном ответе трансформированной клетки и опухоли, если она была сформирована. Клетки, участвующие в иммунном контроле Природные клетки-киллеры (ПК). Они распознают и разрушают ГКГ-истощенные клетки. Эти клетки выполняют свою функцию через формирование пор в мембране целевой клетки. Эти поры формируются аутосборкой молекул порфирина в плазматической мембране. Структура этих клеток до некоторой степени гомологична комплементу С 9, и ее расположение образует пору, через которую могут легко проходить цитолитические ферменты типа гранзима. Активирование рецепторов Fas и ФНО на поверхности опухолевой клетки представляет собой второй механизм. Оба этих явления активируют апоптоз. Такие цитолитические активности, обусловленные отсутствием молекул ГКГ, являются активностями, соответствующими естественному иммунному ответу. С одной стороны, природные клеткикиллеры также кооперируются в проявлении активности антител, направленных против опухоли. Эти клетки плотно прикрепляются к поверхности опухолевой клетки через рецепторы Fc и вызывают указанный выше литический феномен (перфорин, активирование Fas, воздействие ФНО). Эта активность рассматривается в качестве составляющей адаптивного иммунного ответа, вызванного опухолями. Благодаря своим функциям, природные клетки-киллеры становятся основной причиной разрушения индуцированных вирусом опухолевых клеток и небольших опухолей в начальной стадии их развития,причем они активируются под действием интерферонов и интерлейкина 2. Эти интерлейкины усиливают литические свойства природных клеток-киллеров. Указанные природные клетки-киллеры становятся активированными (лейкин-активированные клетки-киллеры, ЛАК). Разрушение онкоцитов в качестве ответа природных клеток-киллеров подавляется даже при незначительном количестве мембранных белков ГКГ 1. Однако их присутствие не подавляет ответ природных клеток-киллеров, если он вызван литической активностью антител, направленных на опухоль. Фагоцитарные клетки. Клетки с фагоцитарной активностью проявляют специфический противоопухолевый механизм действия, который может использоваться с терапевтическими целями. При активировании Т-лимфоцитами эти клетки могут передавать в опухолевые клетки: лизоцимы, пероксидные радикалы, оксид азота и ФНО, которые разрушают опухолевые клетки с помощью различных механизмов. Однако их наиболее важная противоопухолевая активность осуществляется благодаря антигенпрезентирующей способности, в основном презентирующей способности лимфоцитов CD4. Известно,что опухоли не имеют на своей поверхности молекул ГКГ 2, следовательно, они не могут проявить своих свойств опухолевых антигенов по отношению к клеткам-хелперам.Активированные макрофаги могут производить презентирование этих антигенов и индуцировать активирование и регуляторных, и эффекторных CD4+ лимфоцитов. Они также презентируют антигены лимфоцитам CD8+ и В-клеткам. Наиболее специализированными клетками в иммунной системе, благодаря присущей им фагоцитарной способности и способности к презентации, являются дендритные клетки. Одна дендритная клетка может контактировать с 1000 не подвергнутых какому-либо воздействию лимфоцитов CD4, и по этой причине дендритные клетки представляются в организме наиболее эффективными. В связи с этим их используют в терапевтических целях. В настоящее время ДК рассматривают в качестве наилучших адъювантов, поскольку их сигнал в искусственно контролируемой среде индуцирует стимулирование иммунной системы против опухоли. Эти клетки также являются мишенью для ингибирующей секреции-5 015510 опухолевых клеток. Секреция опухолью простогландина, ТРФ и ИЛ 10 оказывает отрицательное воздействие на макрофаги за счет индукции генерации ингибирующих (и регулирующих) свойств популяции лимфоцитов при отторжении. Лимфоциты. Наиболее сильным противоопухолевым действием обладают Т-лимфоциты группы эффекторов CD4 и CD8. Появление и развитие таких супрессорных Т-клеточных популяций, к сожалению, не препятствует росту и метастазированию опухолей по всему организму. Эти супрессорные лимфоциты были описаны в качестве субпопуляции CD4 лимфоцитов, несущих CD25-положительный маркер на клеточной мембране. Эффекторный ответ Т-клеток непосредственно убивает клетки опухоли и активирует остальные компоненты иммунной системы. Противоопухолевое иммунное действие, направленное против популяций CD4 и CD8, является антигенспецифичным. Эти лимфоциты обнаружены не только в периферической крови пациентов, но также в инфильтрующихся опухолевых клетках. Ранее было описано, что активность клеток CD4 наиболее важна в качестве сдерживающего фактора качественного и количественного противоопухолевого ответа. Однако их действие зависит от антигенной презентации, осуществляемой соответствующими специализированными клетками, поскольку опухоли не экспрессируют молекулы ГКГ II. Напротив, цитотоксические Т-клетки могут распознавать клеточные антигены в ГКГ I. Однако в упорядоченных условиях и из-за утраты ко-стимулирующих молекул опухолевые клетки индуцируют иммунологическую толерантность клеток CD8, специфических в отношении опухолей. В противоположность им, лимфоциты CD8 не нуждаются в таких ко-стимулирующих сигналах для лизиса опухолей. Механизмы лизиса, которые они используют, схожи с аналогичными механизмами, используемыми клетками-киллерами: апоптоз и формирование пор в плазматической мембране. В-клетки. Мощное действие ответа реципиента на иммунитет опухоли было подтверждено неожиданным обнаружением реакционноспособных противоопухолевых антител в сыворотке больных. Фундаментальный механизм действия заключается в лизисе клеток с помощью антител (АОКЦ). Механизм антибактериальной деструкции, которому способствует комплемент, предположительно имеет меньшее значение в противоопухолевом действии. В итоге, несколько экспериментов подтвердило предположение о том, что атака специфического антитела на опухоль приводит к исчезновению антигена, индуцирующего иммунный ответ, в результате формируются (за счет отрицательной селекции) популяции, устойчивые к такому литическому механизму. Отсюда следует, что клетки становятся чувствительными к разрушению клетками-киллерами, если антитела приводят к исчезновению комплексов ГКГ I в клеточной мембране. Несколько моноклональных антител, например, герцептин, действующий против белка онкогена HER2-NEU, разрабатывалось в качестве коммерческого препарата для терапевтического применения. Эта молекула экспрессируется в 25% клеток метастазов рака яичников и рака груди, причем Управление по контролю над продуктами и лекарствами США одобрило его терапевтическое применение для лечения пациентов с такими диагнозами. Вторым таким антителом является продукт ритуксимад, который направлен против детерминанта клеток CD20, и поэтому успешно применяется для лечения В-лимфом. Другие антитела в настоящее время проходят клинические испытания. Иммунология опухолевых клеток. Опухолевые клетки имеют несколько молекул, которые могут быть мишенью воспалительного противоопухолевого ответа. Однако хотя лимфоциты, распознающие эти антигены, были выделены из крови в области опухоли, нельзя вызвать результативной эффекторной функции в отношении новообразования. Цитологические свойства опухолевых клеток объясняют или дают основание для объяснения этого феномена: опухолевые клетки не имеют на своей поверхности комплексов ГКГ II, и это является причиной, почему они не могут презентировать свои противоопухолевые белки лимфоцитам CD4, а также обладают слабой экспрессией комплекса ГКГ I. Эти свойства приводят к подавлению активности природных клеток-киллеров и к слабой активации ответа в клетках CD8. Это последнее обстоятельство усугубляется тем, что большинство опухолевых клеток не презентирует ко-стимулирующих молекул на своих поверхностях. Такая утрата рецепторов для ко-стимулирующих молекул вызывает развитие анергии у лимфоцитов CD8. Опухолевые клетки в большом количестве секретируют противовоспалительные вещества. Некоторые из этих веществ пока еще не идентифицированы. Образование простогландина происходит путем блокирования активации макрофагов. Это вещество может подавляться одновременным введением индометацина или ингибиторов СОХ 2. Опухолевые клетки также могут образовывать большое количество ТПФ или ИЛ 10. Эти цитокины являются молекулами, контролирующими дифференциацию клеток. Поскольку опухолевые клетки утрачивают нормальную клеточную дифференциацию, они также утрачивают сигналы отрицательной регуляции, для того чтобы контролировать синтез этого вещества. Проведенные исследования позволили установить параллель между способностями к метастазированию опухолей поджелудочной железы, опухолей груди, глиом, внутриклеточного рака и других и синтезом этих цитокинов. Их наиболее важное действие заключается в приведении в определенное состояние антигенпрезентирующих клеток таким образом, что они индуцируют появление специфических супрессорных лимфоцитов против раковых антигенов. Динамическая связь между иммунной системой и опухолью. Методики смешанной культуры опухоли и опухолевых клеток позволили детально исследовать антигенную композицию цитотоксичных Т-6 015510 клеток, действующих против пептидов меланомы. Были клонированы и изучены аминокислотные последовательности специфических опухолевых антигенов. В этих исследованиях сделано три важных открытия. Первое: у меланом имеется не менее пяти различных антигенов, которые могут распознаваться в качестве цитотоксических Т-клеток. Второе открытие заключается в том, что цитотоксические Тлимфоциты, действующие против антигенов меланомы, не размножаются in vivo. Это означает, что ранее упомянутые антигены не иммуногены in vivo. Третье открытие заключается в том, что возможна отрицательная селекция in vitro, а также возможна in vivo экспрессия этих антигенов из-за присутствия специфических цитотоксических Т-клеток. Эти открытия позволяют надеяться на применение противоопухолевой иммунотерапии. Кроме того, установлено, что эти антигены в своей природной форме не обладают высокой иммуногенностью, поэтому следует осторожно относиться к возможности селекции опухолевых клеток in vivo, которая может быть не распознана и не элиминирована цитотоксическими Тклетками. Для того чтобы обеспечить себе возможность роста, опухоль должна генерировать серию механизмов динамического уклонения. В случае противоречия с какой-либо противоопухолевой стратегией,опухоль отвечает адаптацией через развитие новой формы уклонения. Появление измененных молекул вызывает формирование гуморальных иммунных ответов через появление специфических антител и их последующей деструкции за счет АОКЦ. Природные клеткикиллеры принимают активное участие в этом явлении. Происходит индукция селекции популяции таких клеток с низкой экспрессией соответствующих поверхностных антигенов или даже без этой экспрессии. В то же время фагоцитоз разрушенных клеток индуцирует отсроченный клеточный иммунный ответ против этих внутриклеточных антигенов, которые могут быть отнесены к классу I молекул ГКГ. Происходит новая селекция клеток, несущих различные антигены, и/или клеток без ко-стимулирующих молекул. В итоге селекция в большей степени недифференцированных клеток непосредственно связана с повышением уровня ингибирующих факторов, например интерлейкина 10 и ТРФ , образуемых опухолью. Эти вещества индуцируют дендритные клетки таким образом, что они становятся промоторами специфических супрессорных клеток. Это явление способствует развитию устойчивости опухоли, которая может расти и распространяться совершенно свободно. Такие терапевтические подходы, основанные на манипулировании иммунной системой, игнорирующие такие динамические изменения клеточной популяции,обречены на неудачу, поскольку единственный выбранный методический подход приводит к указанному выше явлению селекции и из-за этого к неудачным результатам на протяжении длительного времени. Процент опухолей, отвечающих на единственный иммунотерапевтический подход, составляет менее 20%, несмотря на эффективность и силу такого подхода. Следовательно, для получения желаемого эффекта в удовлетворительные сроки должна применяться комбинированная методика, отражающая описанную динамику. Иммунотерапия Хотя иммунная система организма хозяина часто неспособна уничтожить рост опухоли, имеется несколько индикаторов возможного манипулирования и улучшения иммунной системы для уничтожения опухоли. Некоторые из этих индикаторов следующие: присутствие выявляемых опухолевых антигенов в большинстве опухолевых клеток, обнаружение фиксируемого, хотя и неэффективного, ответа организма хозяина, и лучшее понимание механизмов, с помощью которых опухолевые клетки отторгают иммунный ответ. Предшествующие методологические достижения в этой области дали новый импульс для иммунотерапии опухолевыми антигенами. Среди них: методики выделения субпопуляций лимфоцитов, идентификации и очистки опухолевых антигенов, получения селективных по антигену Т-клеток, повышения иммунных ответов цитокинами и получения антител, которые нацеливаются на антигены на поверхности опухоли. Моноклональные антитела (МКА) против опухолевых антигенов используются либо отдельно, либо в соединении с токсинами, препятствующими росту опухоли. Появление моноклональных антител означает, что существует возможность нацеливаться на опухоли и разрушать их. Специфические опухолевые антитела правого изотипа могут направлять лизис опухолевых клеток природными клетками-киллерами и активировать природные клетки-киллеры по их Fc рецепторам. Для этого следует обнаружить специфический опухолевый антиген, являющийся молекулой клеточной мембраны. После этого мышь иммунизируют выбранным антигеном. Затем селезенку мыши удаляют и ее ткань разделяют для получения суспензии клеток лимфоцитов. Затем лимфоциты гибридизуют с клетками миеломы, образующими IgG. Полученная суспензия гибридных клеток называется гибридомой. Суспензию разводят и культивируют в 96-луночном планшете. Гибридные клетки наслаивают таким образом, что в каждой лунке оказывается несколько из них. Затем их оставляют расти, а супернатант из каждой лунки анализируют для определения тех клеточных клонов, которые образуют антитела. Затем секретирующие IgG клоны размножают и образуемое антитело анализируют для определения его специфичности и эффективности в распознавании различных опухолей того же клеточного типа, но полученных от разных пациентов. После этого отобранные клоны размножают. Антитела, пригодные для использования, экстрагируют из супернатантов этих клонов. Когда с помощью молекулярной инженерииFc часть антитела замещают аналогичной частью, но человеческого происхождения, антигенность такой-7 015510 молекулы снижается. Такие антитела называются "гуманизированными". Управление по контролю над продуктами и лекарствами США недавно одобрило применение препарата гуманизированных моноклональных антител, герцептина, для лечения рака груди. Это антитело взаимодействует с рецептором ростового фактора HER-2/neu. Этот рецептор избыточно экспрессируется почти у четверти пациентов с раком груди. Такая избыточная экспрессия отвечает за HER-2/neuиндуцированный противоопухолевый ответ Т-клеток, хотя HER-2/neu связывали с худшим прогнозом. Предполагают, что герцептин действует путем блокирования взаимодействия рецептора и его природного лиганда, тем самым, снижая уровень экспрессии рецептора. Действие этого антитела может возрасти при сочетании его применения с обычной химиотерапией. Вторым антителом, применение которого одобрило Управление по контролю над продуктами и лекарствами США, является продукт ритуксимаб, действующий через распознавание CD 20. Оно применяется для лечения В-клеток не-ходжкинской лимфомы. Слияние и группировка CD 20 посылает сигнал,который индуцирует апоптоз лимфоцитов. Моноклональные антитела, конъюгированные с эмульгированными радиоизотопами, применялись с целью визуализации опухолей для мониторинга размера опухоли и постановки диагноза. В первом известном случае успешного лечения рака моноклональными антителами использовали антиидиотипичные антитела к мишени тех В-клеток, чей иммуноглобулин экспрессировал соответствующий идиотип. Первая часть лечения обычно приводит к ремиссии, но опухоль появляется снова в мутантной форме, которая не связывает антитело, использовавшееся в начальной стадии лечения. Этот случай является убедительным примером генетической нестабильности, которая помогает опухоли сохраниться. Другие проблемы, связанные с терапевтическим применением опухолеспецифичных или опухолеселективных моноклональных антител, заключаются в неэффективном уничтожении клеток после слияния с моноклональным антителом и в неэффективном проникновении антитела в массу опухоли. Первую проблему часто удается избежать за счет связывания токсина с антителом. Для этого предназначен реагент, называемый иммунотоксином. Два токсина, показанных для этого способа, называются цепью А рицина и токсином Pseudomonas. Для обоих подходов требуется интернализация антитела, для того чтобы произошло отделение молекулы токсина от молекулы антитела в эндоцитном компартменте, в результате становится возможным проникновение цепи токсина и в результате гибель клетки. В двух других исследованиях используют конъюгированные моноклональные антитела, соединенные с химиотерапевтическими лекарственными средствами, например, с адриамицином, или с радиоизотопами. В первом случае за счет специфичности моноклонального антитела к антигену опухолевых клеток происходит концентрация лекарственного средства по месту локализации. После интернализации лекарственное средство высвобождается в эндосомы и проявляет свой цитостатический или цитотоксический эффект. Моноклональные антитела, связанные с радиоизотопами, концентрируются в очаге на поверхности опухоли. Оба эти подхода полезны, поскольку они убивают соседние опухолевые клетки за счет высвобождения лекарственного средства или эмиссии радиоактивного вещества, которые могут влиять на клетки, соседние с теми, к которым присоединилось антитело. Карциноэмбриональный антиген (КЭА) является примером опухолевого антигена - мишени моноклональных антител. Рецидивирующий колоректальный рак может быть выявлен с помощью радиоактивно меченого моноклонального антитела против КЭА. Этот способ в настоящее время находится на стадии исследования для диагностики и терапии этой формы новообразования. Дендритные клетки Было установлено, что ДК являются "родоначальниками" антиген-презентирующих клеток, чьей естественной функцией является обработка и доставка чужеродных антигенов и "сигналов опасности" в лимфоузлы для презентации Т-клеткам и выработки защитного иммунного ответа. После активирования и "созревания" ДК повышается их способность стимулировать Т-клетки. В норме ДК присутствуют в коже и в других висцеральных органах, где они могут столкнуться с патогенами и другими антигенами, и в ранних исследованиях было установлено, что внутрикожная инъекция ДК, после их усиления антигенами, индуцирует регрессию меланомы и колоректального рака. ДК образуются в костном мозге. ИЛ 2, ИЛЗ, SCF, Fit3L, ФНО и ГМ-КСМ влияют на их раннюю дифференциацию. Этот последний цитокин индуцирует пролиферацию находящихся на ранней стадии дифференцировки форм и способствует высвобождению этих клеток в кровяное русло. Однако ДК являются наиболее мощными векторами, способными к генерации иммунных ответов от не подвергнутых какому-либо воздействию Т-клеток, применяемых в процессинге и доставке противораковых антигенспецифичных вакцин. Противораковые вакцины медицинского назначения, основанные на дендритных клетках (ДК), нагруженных противораковыми антигенами, представляют особый интерес, поскольку они играют главную роль в иммунитете. ДК были обнаружены по всему организму, в частности в тех областях, которые служат входными вратами инфекции. В многочисленных исследованиях, выполненных на животных моделях, установлено, что ДК, нагруженные противораковыми антигенами, могут защищать от опухолевого-8 015510 стимула и что иммунизации на основе ДК могут снизить прогрессирование ранее имплантированных опухолей. Например, мыши, иммунизированные дендритными клетками, нагруженными антигенами клеточной линии меланомы В 16, могут предупредить прогрессирование имплантированных опухолей. Для имитации физиологической миграции ДК в региональные лимфоузлы ДК вводили различными способами: внутривенно (ВВ), подкожно (ПК), внутрикожно, в лимфоузлы, в лимфатические сосуды и внутрь опухоли. Введение цитокинов, наряду с ДК, может усилить иммунный ответ, индуцированный иммунизациями. В настоящем изобретении тималфазин применяется в качестве иммуностимулятора,усиливающего клинический ответ на вакцинацию ДК у пациентов, не являющихся респондентами. В большинстве исследований вакцин на основе ДК следуют примерно единой схеме. Пациентов подвергают лейкоферезу для получения ДК. Обычно фракция ДК используется для первой иммунизации свежей, а оставшиеся ДК консервируют замораживанием для последующего применения. ДК нагружают антигеном перед иммунизацией, хотя в некоторых исследованиях нагрузку проводят перед консервированием замораживанием таким образом, что вакцина ДК готова к применению после оттаивания. Оптимальный интервал или длительность иммунизации неизвестны, но обычно иммунизация проводится один раз в 1-3 недели. ДК, нагруженные неподходящими антигенами, также используют в качестве положительных и отрицательных контролей иммунизации. Периферическую кровь отбирают для мониторинга индукции иммунного ответа, но для проведения интенсивных иммунных анализов конечного продукта может проводиться повторный лейкоферез. Для клинических исследований в настоящее время проводятся разные анализы. Помимо измерения активности in vivo, можно описать Т-клеточный ответ invitro путем определения образования цитокина, по пролиферации или по цитотоксической активности Тклеток в ответ на иммунизирующий антиген. Поскольку представляемое исследование является обычным, вакцины ДК были с выраженной устойчивостью к минорной токсичности. В настоящее время проводятся исследования с другими мощными онкологическими вакцинами (клеточными вакцинами, вакцинами мелацинами, аллогенными клеточными вакцинами с/без БЦЖ, вакцинными онколизатами, вакцинами не содержащих клеток супернатантов,генетическими вакцинациями, вакцинами вирусных векторов). Было предпринято много попыток повысить иммуногенность противораковых вакцинаций, в том числе используя гемоцианин моллюска блюдечка (ГМБ) - белка из морского моллюска Megathura crenulaa, обитающего у побережья Калифорнии и Мексики. ГМБ является крупным белком, вызывающим иммунный ответ и действующим в качестве носителя противораковых клеточных антигенов. Противораковые антигены часто являются белками относительно небольшого размера, которые могут быть незаметными для иммунной системы. ГМБ обеспечивает дополнительные сайты распознавания для клеток иммунной системы, называемых Т-хелперными клетками, и могут повысить активацию других клеток иммунной системы, называемых цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ). Бацилла Кальмета-Герена (вакцина БЦЖ): неактивная форма вызывающей туберкулез бактерии,традиционно используемой на протяжении десятилетий для вакцинации против туберкулеза. Вакцину БЦЖ добавляют в некоторые противораковые вакцины, рассчитывая, что она усилит иммунный ответ на антиген вакцины. Четко не установлено, почему БЦЖ может быть особенно эффективна для индукции иммунного ответа. Тем не менее, БЦЖ годами применяется с другими вакцинами, в том числе с вакциной против туберкулеза. Интерлейкин-2 (ИЛ 2). Белок, образуемый иммунной системой организма, который может усилить способность уничтожать рак у определенных специализированных клеток иммунной системы, называемых клетками-киллерами. Хотя он может активировать иммунную систему, многие исследователи считают, что только один ИЛ-2 не может предотвратить рецидив рака. Некоторые противоопухолевые вакцины используют ИЛ 2 для усиления иммунного ответа на специфические раковые антигены. Колониестимулирующий фактор гранулоцитов и моноцитов (ТМ-КСФ). Белок, который стимулирует пролиферацию антиген-презентирующих клеток.QS21. Растительный экстракт, который при добавлении в некоторые вакцины может улучшить иммунный ответ. Эти препараты предназначены для повышения биологической реакции на противораковые вакцины. Ранее не было описано применение иммуностимулирующего препарата широкого действия тимозина альфа-1 (тималфазина) в качестве иммуностимулятора в комбинации с противораковыми вакцинами. В настоящем изобретении было обнаружено, что этот агент модифицирует или повышает биологический ответ на вакцинацию дендритными клетками (противораковые вакцины). Было применено иммуностимулирующее лекарственное средство для лечения пациентов с раком груди, у которых ранее не было получено выраженного ответа на вакцинирование дендритными клетками. Тималфазин альфа 1 или T 1 - пептид, использовавшийся благодаря присущему ему иммуномодулирующему действию и, в связи с этим, терапевтическому эффекту при некоторых заболеваниях, в том числе при хронических гепатитах В и С, синдроме приобретенного иммунодефицита (СПИД), первичных иммунодефицитных заболеваниях, при пониженном ответе на вакцинацию и при раке. Основа эффективности T 1 при этих заболеваниях проявляется главным образом через модулирование иммунологи-9 015510 ческой реактивности. Было установлено, что это лекарственное средство обладает благоприятным воздействием на многие параметры иммунной системы и повышает дифференциацию и созревание Тклеток. Природный тималфазин альфа 1 впервые был выделен из ткани вилочковой железы. Чистый синтетический пептид состоит из 28 аминокислот и ацилирован с амино-конца (молекулярная масса 3108). В настоящее время ТА 1 получают твердофазным пептидным синтезом. Эндогенный тималфазин может быть обнаружен в сыворотке, и его уровни у здоровых взрослых людей, определяемые иммуноанализом, находятся в диапазоне 0,1-1 нг/мл. Источник и механизм выделения и регуляции циркуляции тималфазина неизвестны. Возможно, тималфазин имеет внутриклеточные рецепторы, поскольку он может складываться в структурированную спираль в органических растворителях и, таким образом, может пересекать мембрану самостоятельно. Тималфазин стимулирует стволовые клетки продуцировать повышенное количество зрелых Тклеток. Добавление тималфазина в культуру стволовых клеток CD34 человека повышает тимопоэз, приводящий к увеличению общего числа CD3 Т-клеток и синтезу интерлейкина-7 (ИЛ 7) - цитокина, необходимого для созревания тимоцитов. Возросшей доминирующей субпопуляцией были хэлперные Т-клетки(CD4). Повышенное формирование клеток CD3, CD4 и CD8 у пациентов с хроническим гепатитом В 24 и раком. Повышенная активность природных клеток-киллеров в разных животных моделях, у здоровых людей и у ВИЧ-инфицированных пациентов. Тималфазин может повысить продуктивность -интерферона, ИЛ 2, ИЛ 3 и экспрессию рецептора ИЛ 2 с последующей активацией митогенами или антигенами. Такая схема повышенного образования цитокина, т.е. -интерферона и ИЛ 2, показывает, что тималфазин индуцирует тип хелперных Тлимфоцитов 1 иммунного ответа и вызывает значительное увеличение уровня образования ИЛ 2, а также понижает уровни образования цитокинов хелперных Т-лимфоцитов 2 ИЛ 4 и ИЛ 10. Тималфазин противодействует индуцированному дексаметазоном апоптозу в тимоцитах in vitro по типу зависимости доза-эффект. Это явление было наиболее выраженным у дважды позитивных(CD4CD8) незрелых Т-клеток. Апоптоз тимоцитов, вызванный сывороткой от мышей с опухолями, также понижался при использовании тимозина. Ранее исследовали применение тималфазина для лечения у людей инфекционных заболеваний (гепатита В, гепатита С, синдрома приобретенного иммунодефицита) в качестве агента, усиливающего действие вакцины, а также для лечения некоторых раковых заболеваний, но тималфазин не использовали в качестве иммуномодулятора при лечении противораковыми вакцинами. Это лекарственное средство показало свою эффективность на нескольких модельных животных с раком, заключающуюся в улучшении иммунной функции. У многих больных раком подавлен клеточный иммунитет, и прогрессирование некоторых форм рака вероятно связано с ослабленной супрессией опухолей иммунной системой. Механизм действия, объясняющий, каким образом тималфазин может улучшить клинический ответ на противораковые вакцины, полностью не установлен. Его действие может быть связано со многими механизмами, свойственными этому лекарственному средству, и/или с другими, которые до сих пор не установлены. Его действие может быть связано с поляризацией цитокина по отношению к хелперному Тлимфоциту 1 и компоненту комплемента С 1, что в свою очередь приводит к индукции ДК проявлять скорее эффекторной, чем супрессорной иммунной активности. Тималфазин является безопасным лекарственным средством и его возможные побочные эффекты незначительны. В настоящем изобретении описано, что применение ДК - ОВГ является активным иммунотерапевтическим лечением, заключающимся в периодической иммунизации пациентов с аутологическими дендритными клетками (ДК), культивируемыми совместно с аутологическими раковыми клетками, гибридизированными с активированными аутологическими В-клетками (ОВГ). ОВГ применяют в качестве раковых антигенов, а ДК используют в качестве антигенпрезентирующих клеток. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения описаны некоторые свойства, обладающие преимуществом для достижения терапевтических результатов у пациентов с прогрессирующими неопластическими заболеваниями. Хотя целесообразно получить большое количество клеток, что возможно, например, хирургическим отсечением кусочка ткани опухоли, количество раковых клеток, полученных с помощью пункционной биопсии, достаточно для разработки ОВГ. При этом пациенты избавлены от необходимости подвергать себя какому-либо излишнему хирургическому риску. С другой стороны, и об этом упоминается ниже,антигенность метастазов, очевидно, является разной в разных органах. Следовательно, предпочтительно использовать неизвазивный способ получения опухолевых клеток практически от каждого участка метастаза у пациента. В-лимфоциты - клетки, которые, будучи однократно инициированными, становятся из-за своей эф- 10015510 фективности вторым наиболее мощным типом антиген-презентирующих клеток в иммунной системе. С другой стороны, если культуры В-клеток стимулируются ИЛ 6, они могут продолжать рост на протяжении по меньшей мере 6 месяцев. Такая чувствительность к ИЛ 6 передается популяции ОВГ после слияния клеток. Следовательно, ОВГ можно получить от нескольких клеток опухоли и поддерживать in vitro в течение нескольких месяцев, без утраты их потенциала и антигенного разнообразия. После обработки ДК таким гибридом, они захватывают практически все возможные опухолевые антигены, которые присутствуют в естественном состоянии различных популяций неопластических клеток. Эти антигены презентированы на поверхности ОВГ вместе с группой костимулирующих и адгезивных молекулярных свойств активированных В-клеток, которые позволяют осуществлять крайне эффективный захват и переработку дендритными клетками, даже при низком уровне концентрации. Эффективность терапевтического лечения с участием ДК очевидно непосредственно связана с тем,из какого источника получены эти клетки. Согласно литературным обобщениям, примерно у 68% пациентов, которых лечили ДК, полученными путем мобилизации молодых и зрелых форм из костного мозга, наблюдалась редукция массы опухоли более чем на 50%, а у пациентов, которых лечили ДК, полученными in vitro путем дифференциацииCD34+ или циркулирующих моноцитов, редукция была менее 20%. ДК, применявшиеся в образце протокола настоящего изобретения, были получены из лейкоцитной пленки пациентов, которых стимулировали низкими дозами ГМ-КСФ на протяжении пяти суток. Они включают коллекцию зрелых и незрелых форм и медленное течение CD34+. С другой стороны, культивирование in vitro с ГМ-КСФ и ФНО только в течение трех суток и в отсутствии ИЛ 4 допускает дифференциацию эффекторных ДК и препятствует дифференциации других возможных презентирующих клеточных форм, например, CD34+, CD14+ или моноцитов. Не было обнаружено достоверных статистических различий между иммунным ответом и выживаемостью пациентов, если ДК, применявшиеся для иммунизации, были получены путем осаждения или отрицательной селекцией с использованием смеси антител, среди которых нет CD34+ и CD14+. Образец протокола ДК поступают из костного мозга. ИЛ 3, ЦСЖ, Fit3L, ФНО и ГМ-КСФ влияют на их раннюю дифференциацию. Этот последний цитокин индуцирует пролиферацию форм ранней стадии дифференциации и способствует попаданию этих клеток в кровяное русло. Подкожное введение ГМ-КСФ обеспечивает важный процесс - перемещение ДК в кровь. Затем их можно выделить в терапевтически необходимом количестве из образца крови, полученного аферезом, с последующей отрицательной селекцией, используя для этой цели коммерческий наборStemSep для ДК фирмы Stem Cell Technology, Ванкувер, Канада. Использовавшийся в настоящем изобретении ГМ-КСФ является человеческим рекомбинантом в Е. coli, выпускаемым фирмой Cassara Laboratory, Аргентина. Выбранная доза составляет 150 мкг, введение в организм проводили ежедневно вечером (примерно в 19 ч) на протяжении пяти суток подряд. Следуя этой схеме доз и введения установлено,что высокий эффект связан с числом полученных ДК, низким увеличением гранулоцитов и появлением побочных эффектов. С этого момента ДК из костного мозга, способные проникать в кровяное русло, обладают следующими свойствами:(1) Способностью проходить через стенки капилляров. Они также обладают низкой подвижностью.(2) Выраженной способностью к фагоцитозу, но слабой антигенпрезентирующей способностью.(3) Нельзя определить, что они индуцируют - эффекторную реакцию или реакцию устойчивости. Они поступают в ткань и остаются в ней в состоянии готовности, а под воздействием цитокина в микроокружении, а также для фагоцитарного действия, они дифференцируют в зрелые формы, приобретающие следующие характеристики:(1) Эти мембранные рецепторы мутируют и приобретают способность мигрировать из тканей в капилляры лимфатической системы и проходить сквозь них. Они приобретают большую подвижность, но утрачивают свою способность проходить через стенки капилляров.(2) Они утрачивают способность к фагоцитозу, но повышают свою антиген-презентирующую способность.(3) Они проявляют себя в качестве индукторов регуляторной или эффекторной иммунной реакции. Описание лечения Образцы получали от разных метастазов пациента. С помощью аферезиса и последующего процесса, выполняемого в лаборатории, В-клетки пациента очищали и активировали in vitro в течение 48 ч путем добавления ИЛ 4 и ИЛ 6. В итоге пациентов иммунизировали активированными аутогибридными Вклетками или гибридными В-клетками, совместно культивировавшимися с дендритными клетками пациента. Такая иммунизация производилась в здоровый лимфузел один раз каждые три недели. Одновременно пациентам вводили подкожно 1,6 мг тималфазина в вечернее время (от 19 до 21 ч) раз втрое суток на протяжении времени иммунизации, и в последующие шесть месяцев после протокола вакцинации завершают. Такой план вакцинации может, например, включать 4-10 доз, хотя их число может быть другим.- 11015510 В-клетки были получены из лейкоцитной пленки периферической крови пациентов методом гемафереза. В результате методом афереза получают материал, который затем высевают в градиент FicollHypaque. Мононуклеарное клеточное кольцо, полученное в ранней интерфазе, является источником Вклеток, которые выделяют отрицательной селекцией, используя коммерческий набор фирмы Stem CellTechnology, Ванкувер, Канада. В-клетки культивируют в среде без сыворотки, обогащенной ИЛ 4 и ИЛ 6. Образец опухоли получают хирургическим путем или пункционной биопсией. Одновременное цитологическое подтверждение выделенного материала проводят в каждом случае. Образец опухоли механически разделяют на отдельные клетки. Полученную суспензию отдельных клеток культивируют в среде без сыворотки, обогащенной альбумином человека, инсулином и эпидермальным ростовым фактором. Активированные лимфоциты и выделенные клетки опухоли затем гибридизуют с использованием раствора полиэтиленгликоля. Формирование ОВГ контролируется иммунным двойным окрашиванием с применением CD20 в качестве В-клеточного маркера и антицитокератина или антивиментина в зависимости от источника опухолевых клеток. Затем гибриды культивируют в среде без сыворотки, обогащенной инсулином, эпидермальным ростовым фактором и ИЛ 6. Аутологические ДК, полученные гемаферезом после мобилизации из костного мозга. Мобилизацию проводят путем стимулирования пациента ГМ-КСФ в течение 5 суток. Лейкоцитную пленку, соответствующую двойному объему крови по данному способу, собирают путем аферезиса на шестые сутки. Смешанную популяцию незрелых и дифференцированных ДК концентрируют из лейкоцитной пленки пациента. Такое концентрирование и стадия очистки могут выполняться либо дифференциальным адгезивным методом, либо отрицательной селекцией. Мононуклеарные клетки расположены слоями во флаконе для культуры ткани, и через четыре часа супернатант аккуратно удаляют. Затем прикрепленные к субстрату клетки культивируют в пригодной среде для культуры ткани, описанной ниже. При отрицательной селекции мононуклеарные клетки инкубируют со смесью 8 моноклональных антител(МАТ) против: CD3, CD14, CD16, CD19, CD 34, CD56, CD66b и гликофорина А. Каждое моноклональное антитело конъюгируют с иммунной магнитной сферой. Суспензию меченых клеток очищают, пропуская через магнитное поле. Маркированные клетки удерживаются, а не маркированные клетки собираются в стерильной пробирке. Полученная суспензия немаркированных клеток состоит на 50% (40-60%) из незрелых и зрелых ДК. Суспензию аутологических обогащенных ДК культивируют совместно с аутологом ОВГ в течение трех суток в среде без сыворотки, обогащенной альбумином человека, ГМ-КСФrh и ФНОrh. ДК отмывают, концентрируют и вводят инъекцией в один из здоровых лимфоузлов пациента после культивирования ДК в течение 72 ч, затем определяют безопасность, чистоту и потенцию. Данная методика показывает несколько свойств, полезных для получения хороших терапевтических результатов у пациентов с прогрессирующими новообразованиями. Хотя целесообразно получить большое количество клеток, что возможно, например, хирургическим отсечением кусочка ткани опухоли, количество раковых клеток, полученных с помощью пункционной биопсии, достаточно для разработки ОВГ. Антигенность метастазов, очевидно, является разной в разных органах. Следовательно, предпочтительно использовать неизвазивный способ получения опухолевых клеток практически от каждого участка метастаза у пациента. В-лимфоциты - клетки, которые после активирования становятся вторым наиболее мощным типом антиген-презентирующих клеток в иммунной системе. С другой стороны, если культуры В-клеток стимулируются ИЛ 6, они могут продолжать расти по меньшей мере 6 месяцев. Эта чувствительность к ИЛ 6 переносится на популяцию ОВГ после слияния клеток. Следовательно, ОВГ могут быть получены от нескольких опухолевых клеток, поддерживаться и размножаться in vitro в течение нескольких месяцев без потери своего потенциала и антигенного разнообразия. После экспозиции ДК таким гибридом они захватывают практически все возможные опухолевые антигены, присутствующие в естественном состоянии на клетках различных неопластических клеточных популяций. Эти антигены презентированы на поверхности ОВГ вместе с группой ко-стимулирующих и адгезивных молекул, свойственных активированным В-клеткам, что позволяет ДК крайне эффективно захватывать и перерабатывать их, даже при низких уровнях концентрации. Поскольку ОВГ презентируется в ДК с начала процессов созревания и активирования in vitro, допускается инкорпорирование опухолевых антигенов за короткий период, в течение которого ДК способны выполнить этот процесс. Вскоре после поглощения опухолевых антигенов способность ДК процессировать и презентировать антигены достигает максимального уровня эффективности. Они также приобретают способность мигрировать из кровеносных сосудов в ткани. Таким образом, инъекция в лимфоузлы представляется более эффективной, чем трансфузия вакцины ДК в кровь. Однако за одну процедуру мобилизации из костного мозга получают небольшое число ДК. Когда эти ДК стимулируются применением антигенов, которые представляют всю опухоль, например, лизатом хирургически удаленного кусочка опухоли, или гибридом опухолевых клеток и ДК, образцы могут быть разделены на разные части для достижения эффективности со временем.- 12015510 С точки зрения клинической эволюции, немногие пациенты обладают спонтанной успешной эволюцией при введении только одной вакцины. Известно, что у пациентов с прогрессирующим раком груди, устойчивым к химио-, радио- и гормонотерапии, низкая выживаемость. Был разработан протокол вакцины аутологических дендритных клеток (ВДК), в результате чего может улучшиться результат лечения пациентов. Было установлено, что тималфазин (фирма ZADAXIN) повышает ответ хелперных Т-лимфоцитов 1, ассоциированных с регрессией опухоли. Последующее исследование было проведено для оценки иммунизации дендритными клетками и выяснения способности тималфазина положительно влиять на последующее состояние пациентов с прогрессирующим раком груди, которые не отвечали на лечение только одной вакциной. Приводимый ниже пример иллюстрирует настоящее изобретение, но не ограничивает его. Пример Подвергают лечению восемнадцать пациентов с прогрессирующим раком груди, устойчивым к химио-, радио- и гормонотерапии. Все пациенты - женщины с раком груди четвертой стадии (с метастазами). Возраст составляет от 39 до 71 года. Пациентов лечат вакциной дентритных клеток (по протоколу: Annals of Oncology 15, 2004, приложение 3, реферат iii40- Dendritic Cell Vaccine for Metastases Breast Cancer). После второго курса вакцинации клеточную иммунизацию оценивают, и при величине ИПЛ 20 ЕД. (Индекс пролиферации лимфоцитов - ИПЛ) вакцинацию продолжают. При ответе ИПЛ 20 ЕД. пациентов делят на две группы (рандомизированно) с 5 и 7 пациентами. В группе из пяти пациентов получают вакцину дендритных клеток вместе с тималфазином (1,6 мг/дважды в неделю в течение 6 месяцев). 7 пациентов в другой группе не получают иммуностимулятор, а проходят программный курс вакцинации дендритными клетками. Критическая точка успеха такого режима иммунотерапии является ранним иммунным ответом пациента после второй вакцинации ДК. Иммунный ответ пациента определяют, используя хорошо известный тест in vitro, называемый анализом пролиферации лимфоцитов. Вкратце, мононуклеарные клетки пациента смешивают с суспензией опухолевых клеток пациента в соотношении 10:1 (3000 лимфоцитов-моноцитов против 300 опухолевых клеток). Суспензию смеси клеток высевают в многолуночные планшеты и инкубируют при 37 С. Через 96 ч клетки собирают и подсчитывают в автоматическом гематоцитометре. Если число мононуклеарных клеток превышает 20000 (Индекс пролиферации лимфоцитов 20 ЕД.),пациент обладает хорошим результатом и длинным сроком выживания. В другом варианте, если смешанная культура клеток не достигает этой величины, результат лечения пациента признают плохим, а срок выживания оказывается значительно короче, чем у пациентов - иммунных респондентов. Лечение тималфазином является важным усилением иммунного ответа хелперных Т-лимфоцитов 1,которые играют основную роль в процессе отторжения опухоли. Пять пациентов в возрасте от 39 до 71 года с последовательно прогрессирующим раком груди, которые после второй иммунизации ДК имеют ИПЛ ниже 20 ЕД., лечат тималфазином (1,6 мг/дважды в неделю в течение 6 месяцев), а также с ними проводят 4 дополнительных курса введения вакцины дендритных клеток. Тималфазин показывает способность улучшить ИПЛ, и у большинства подвергнутых этому лечению пациентов установлен эффективный ответ опухоли. Собирают данные по клиническому ответу и по срокам выживания у 18 пациентов с метастатическим раком груди и для проведения серийного статистического анализа разделяют общую популяцию на три разные группы. В группе 1 (n = 7) пациентам шесть раз проводят иммунизацию дендритными клетками (1 иммунизация каждые 3 недели), и после второй вакцинации индекс пролиферации лимфоцитов (ИПЛ) составляет 20 ЕД. (иммунный ответ). В группе 2 (n=6) пациентам шесть раз проводят иммунизацию дендритными клетками, и после второй вакцинации индекс пролиферации лимфоцитов (ИПЛ) составляет 20 ЕД. (нет иммунного ответа). В группе 3 (n=5) пациентам шесть раз проводят иммунизацию дендритными клетками, и после второй вакцинации ИПЛ составляет 20 ЕД. (нет иммунного ответа), причем они получают тималфазин (1,6 мг/дважды в неделю). Иммунный ответ измеряют путем анализа пролиферации лимфоцитов. Результаты оценивают через 6 месяцев: наблюдают уменьшение опухоли более чем на 50% у 100% пациентов в группе 1 (респондеры), на 50% в группе 2 (не респондеры) и на 80% в группе 3 (не респондеры, в лечении использовали тималфазин). Выживаемость пациентов через 12 месяцев составила 57% в группе 1, 0% в группе 2 и 80% в группе 3. Результаты показывают, что иммунный ответ (ИПЛ 20 ЕД.) на лечение ВДК после второй вакцинации ассоциирован с уменьшением размера опухоли и большей выживаемостью. Лечение тималфази- 13015510 ном показывает положительный эффект в лечении пациентов с прогрессирующей формой рака груди, не отвечающих на иммунизацию дендритными клетками. Выживаемость пациентов была выше в группе лечения тималфазином по сравнению с иммунными респондерами и неиммунными респондерами, которые не получали тималфазина (см. табл. 1). Табл. 1 показывает клинический ответ через 6 месяцев и выживаемость пациентов через 12 месяцев. Таблица 1 Проводят ретроспективный анализ 18 пациентов с метастатическим раком груди. Группа 1 (n = 7), пациентов шесть раз иммунизируют дендритными клетками (1 иммунизация каждые 3 недели), и после второй иммунизации индекс пролиферации лимфоцитов (ИПЛ) составляет 20 ЕД. (иммунный ответ). Группа 2 (n = 6), пациентов шесть раз иммунизируют дендритными клетками, и после второй вакцинации ИПЛ составляет 20 ЕД. (нет иммунного ответа). Группе 3 (n = 5), пациентов шесть раз иммунизируют дендритными клетками, и после второй вакцинации ИПЛ составляет 20 ЕД. (нет иммунного ответа), пациенты также получают тималфазин (1,6 мг/дважды в неделю). Результаты: через 6 месяцев наблюдают уменьшение опухоли более чем на 50% у 100% пациентов в группе 1 (респондеры), у 50% пациентов в группе 2 (не респондеры) и у 80% в группе 3 (не респондеры, лечение тималфазином). Количество пациентов, доживших до 12 месяцев, составляет 57% в группе 1,0% в группе 2 и 80% в группе 3. Применение иммуностимулирующего лекарственного средства не ограничивается пациентами с раком груди, подвергшимися лечению вакцинами дендритных клеток, и может улучшить эволюцию и клинические результаты применения вакцин дендритных клеток у пациентов с другими формами рака. Тималфазин также может улучшить клинический результат при использовании других типов иммунологических вакцин. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Фармацевтическая комбинация для увеличения количества мононуклеарных клеток у субъекта,страдающего раком, который подвергается терапии с помощью противоопухолевой вакцины, и для повышения эффективности указанной противоопухолевой вакцины у субъекта, включающая: а) противоопухолевую вакцину, индуцирующую иммунный ответ у указанного субъекта и б) повышающее эффективность указанной вакцины количество альфа-тимозинового пептида, который усиливает иммунной ответ у указанного субъекта,причем указанная противоопухолевая вакцина и указанный альфа-тимозиновый пептид могут быть введены в организм субъекта раздельно или совместно. 2. Фармацевтическая комбинация по п.1, где указанный субъект является человеком, а указанная вакцина включает дендритные клетки, нагруженные противораковыми антигенами. 3. Фармацевтическая комбинация по п.1, в которой указанная вакцина содержится в количестве примерно от 110-9 г до примерно 110-3 г, а указанный альфа-тимозиновый пептид содержится в количестве примерно 0,1-20 мг. 4. Фармацевтическая комбинация по п.1, в которой указанная вакцина содержится в количестве примерно от 110-8 г до примерно 110-4 г, а указанный альфа-тимозиновый пептид содержится в количестве примерно 0,5-10 мг. 5. Фармацевтическая комбинация по п.4, в которой указанным альфа-тимозиновым пептидом является пептид ТА 1, и его количество составляет примерно 1,6-3,2 мг. 6. Фармацевтическая комбинация по п.1, где указанный субъект страдает раком груди. 7. Фармацевтическая комбинация по п.1, где указанный субъект страдает раком, выбранным из группы, включающей первичную меланому, метастатическую меланому, аденокарциному, плоскоклеточную карциному, железисто-плоскоклеточную карциному, тимому, лимфому, саркому, рак легкого,рак печени, не-ходжкинскую лимфому, ходжкинскую лимфому, лейкозы, рак матки, рак простаты, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, множественную миелому, рак носоглотки, рак- 14015510 мочевого пузыря, рак шейки матки, рак почки, рак мозга, рак костей, рак желудка и рак прямой кишки. 8. Фармацевтическая комбинация по п.1, где указанный субъект не отвечает на первое введение противоопухолевой вакцины. 9. Способ увеличения количества мононуклеарных клеток у субъекта, страдающего раком, который подвергается терапии с помощью противоопухолевой вакцины, предусматривающий введение субъекту фармацевтической комбинации по п.1, причем указанная противоопухолевая вакцина и указанный альфа-тимозиновый пептид, входящие в комбинацию, могут быть введены в организм субъекта раздельно или совместно. 10. Способ по п.9, в котором указанный субъект является человеком, а указанная вакцина включает дендритные клетки, нагруженные противораковыми антигенами. 11. Способ по п.9, в котором указанная вакцина содержится в комбинации в количестве примерно от 110-9 г до примерно 110-3 г, а указанный альфа-тимозиновый пептид вводят в организм субъекта в количестве примерно 0,1-20 мг. 12. Способ по п.9, в котором указанную вакцину вводят в количестве примерно от 110-8 г до примерно 1 10-4 г, а указанный альфа-тимозиновый пептид содержится в комбинации в количестве примерно от 0,5-10 мг. 13. Способ по п.12, в котором указанным альфа-тимозиновым пептидом является ТА 1, который вводят в организм в количестве примерно 1,6-3,2 мг. 14. Способ по п.13, в котором указанный пептид ТА 1 вводят в организм одновременно с введением указанной вакцины. 15. Способ по п.13, в котором указанную вакцину и указанный пептид ТА 1 вводят в организм инъекцией. 16. Способ по п.9, в котором указанную комбинацию вводят указанному субъекту многократно. 17. Способ по п.16, в котором указанную вакцину вводят указанному субъекту 4-10 раз на протяжении курса введения. 18. Способ по п.17, в котором указанную вакцину вводят указанному субъекту раз в три недели на протяжении указанного курса введения. 19. Способ по п.18, в котором указанным альфа-тимозиновым пептидом является ТА 1, причем указанный пептид ТА 1 вводят дважды в неделю на протяжении указанного курса введения. 20. Способ по п.19, в котором указанный курс введения составляет примерно шесть месяцев. 21. Способ по п.9, в котором раковое заболевание выбрано из группы, включающей первичную меланому, метастатическую меланому, аденокарциному, плоскоклеточную карциному, железистоплоскоклеточную карциному, тимому, лимфому, саркому, рак легкого, рак печени, не-ходжкинскую лимфому, ходжкинскую лимфому, лейкозы, рак матки, рак простаты, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, множественную миелому, рак носоглотки, рак мочевого пузыря, рак шейки матки, рак почки, рак мозга, рак костей, рак желудка и рак прямой кишки.