Антинеопластические комбинации

006226 Предпосылки к созданию изобретения Настоящее изобретение относится к применению комбинаций эфира-42 рапамицина и 3-гидрокси 2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислоты (CCI-779) и [4-(3-хлор-4-фторфениламин)-3-циан-7 этоксихинолин-6-ил]амидом 4-диметиламинобут-2-еновой кислоты (ЕКВ-569). Рапамицин представляет собой макроциклический триеновый антибиотик, продуцируемый Streptomyces hygroscopicus, который, как было установлено, обладает противогрибковой активностью, особенно, против Candida albicans, как in vitro, так и in vivo [С. Vezina et al., J. Antibiot. 28, 721 (1975); S.N.Sehgal et.al., J. Antibiot. 28, 727 (1975); H.A. Baker et al., J. Antibiot. 31, 539 (1978); патент США 3929992 и патент США 3993749]. Кроме того, как было показано, рапамицин в отдельности (патент США 4885171) или в комбинации с пицибанилом (патент США 4401653) обладает противоопухолевой активностью. Иммуносупрессивные эффекты рапамицина описаны в FASEB 3, 3411 (1989). Циклоспорин А и FK506, другие макроциклические молекулы, также, как было показано, являются эффективными в качестве иммуносупрессивных агентов, пригодными, таким образом, для предотвращения отторжения трансплантата [FASEB 3, 3411 (1989); FASEB 3, 5256 (1989); R.Y. Calne et al., Lancet 1183 (1978) и патент США 5100899]. R. Martel et al. [Can. J. Physiol. Pharmacol. 55, 48 (1977)] сообщили, что рапамицин является эффективным на экспериментальной модели аллергического энцефаломиелита, модели рассеянного склероза, на вспомогательной модели артрита, модели ревматоидного артрита, и эффективно ингибирует образование IgE-подобных антител. Рапамицин также является пригодным для профилактики или лечения системной красной волчанки[патент США 5078999], воспаления легких [патент США 5080899], инсулинзависимого сахарного диабета [патент США 5321009], кожных болезней, таких как псориаз [патент США 5286730], болезней кишечника [патент США 5286731], пролиферации гладкомышечных клеток и утолщения интимы после повреждения сосуда [патенты США 5288711 и 5516781], Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых [Европейская патентная заявка 525960 A1], воспаления глаз [патент США 5387589], злокачественных карцином [патент США 5206018], воспалительного заболевания сердца[патент США 5496832] и анемии [патент США 5561138]. Эфир-42 рапамицина с 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой (CCI-779) представляет собой сложный эфир рапамицина, который продемонстрировал значительное ингибирующее действие на рост опухолей как на in vitro, так и на in vivo моделях. Получение и применение гидроксиэфиров рапамицина, включая CCI-779, описано в патенте США 5362718.CCI-779 проявляет цитостатические, противопоставленные цитотоксическим, свойства, и может задерживать время, которое проходит до начала прогрессирования опухолей, или время, которое проходит до появления рецидива опухолей. CCI-779, как считают, обладает механизмом действия, который похож на механизм действия sirolimus. CCI-779 связывается с белком цитоплазмы FKBP и образует с ним комплекс, который ингибирует фермент, mTOR (цель рапамицина у млекопитающих, также известный какFKBP 12-рапамицинсвязывающий белок [FRAP]). Ингибирование киназной активности mTOR ингибирует ряд путей преобразования сигналов, включая клеточную пролиферацию, которая стимулируется цитокинами, трансляцию мРНК для нескольких ключевых белков, которые регулируют G1 фазу клеточного цикла, и IL-2-индуцированную транскрипцию, что приводит к ингибированию хода клеточного цикла от G1 до S. Механизм действия CCI-779, который блокирует фазу от G1 до S, является новым для противоопухолевого лекарственного средства.In vitro было установлено, что CCI-779 ингибирует рост ряда гистологически отличающихся опухолевых клеток. Рак центральной нервной системы (ЦНС), лейкоз (Т-клеточный), рак молочной железы,рак предстательной железы и меланомные линии были среди наиболее чувствительных к CCI-779. Данное соединение останавливало клетки в фазе G1 клеточного цикла.In vivo эксперименты на бестимусных мышах показали, что CCI-779 обладает активностью против ксенотрансплантатов опухолей человека различных гистологических типов. Глиомы были особенно чувствительными к CCI-779, и соединение было активным в отношении модели ортотопической глиомы у бестимусных мышей. Стимуляция клеточной линии человеческой глиобластомы, индуцированная фактором роста (полученным из тромбоцитов), in vitro выраженно подавлялась CCI-779. Рост нескольких опухолей поджелудочной железы человека у бестимусных мышей, а также одной из двух линий рака молочной железы, изученных in vivo, также подавлялся CCI-779. Протеинтирозинкиназы представляют собой класс ферментов, которые катализируют перенос фосфатной группы с АТВ или ГТФ на остаток тирозина, расположенный на белковых субстратах. Протеинтирозинкиназы играют роль в нормальном росте клеток. Многие из рецепторных белков фактора роста действуют как тирозинкиназы, и именно с помощью данного процесса они влияют на сигнальные процессы. Взаимодействие факторов роста с данными рецепторами является необходимым для нормальной регуляции роста клеток. Однако в определенных условиях, в результате мутации или чрезмерной экспрессии, данные рецепторы могут становиться разрегулированными, что приводит к неконтролируемой пролиферации клеток, которая может выразиться в опухолевом росте и, в конечном итоге, в заболевании,известном как рак [Wilks A.F., Adv. Cancer Res., 60, 43 (1993) и Parsons, J.T.; Parsons, S.J., Important Ad-1 006226vances in Oncology, DeVita V.T. Ed., J.B. Lippincott Co., Phila., 3 (1993)]. Среди рецептор-киназ фактора роста и их протоонкогенов, которые были идентифицированы и которые являются мишенями для соединений по настоящему изобретению, находятся рецептор-киназа эпидермального фактора роста (EGF-Rкиназа, белковый продукт онкогена erbВ) и продукт, вырабатываемый erbВ-2 (также называемым neu или HER2) онкогеном. Поскольку фосфорилирование является необходимым для начала деления клеток сигналом, и поскольку чрезмерно экспрессированные или мутировавшие киназы связаны со злокачественной опухолью, ингибитор данного процесса, ингибитор протеинтирозинкиназы, будет иметь терапевтическую ценность для лечения злокачественной опухоли и других заболеваний, характеризующихся неконтролируемым или патологическим ростом клеток. Например, чрезмерная экспрессия продукта рецептор-киназы онкогена erbВ-2 связана с раком молочной железы и яичника у человека [Slamon, D.J., et[Macias A., et al., Anticancer Res., 7, 459 (1987)] и опухолями, поражающими другие основные органы[Gullick, W.J., Brit. Med. Bull., 47, 87 (1991)]. В силу важности роли, которую играют разрегулированные рецептор-киназы в патогенезе злокачественной опухоли, многие недавние исследования касаются разработки специфичных ингибиторов РТК как потенциальных противораковых терапевтических агентов [некоторые недавно вышедшие обзоры: Burke, T.R., Drugs Future, 17, 119 (1992) и Chang, C.J.; Geahlen, R.L.,J. Nat. Prod., 55, 1529 (1992)].[4-(3-хлор-4-фторфениламин)-3-циан-7-этоксихинолин-6-ил]амид 4-диметиламинобут-2-еновой кислоты (ЕКВ-569) представляет собой ингибитор EGFR-киназы, который обладает значительным ингибирующим действием на рост опухолей, как на моделях in vitro, так и in vivo. Получение и применение ингибиторов EGFR-киназы, таких как ЕКВ-569, описано в патенте США 6002008. Краткое описание чертежей Фиг. 1 показывает кривые цитотоксичности ЕКВ-569, CCI-779 и комбинаций ЕКВ-569 + CCI-779 в отношении клеток НСТ 116; фиг. 2 - изоболограммы (при 50% уровне эффекта) комбинации ЕКВ-569 + CCI-779; фиг. 3 - изоболограммы для комбинаций ЕКВ-569 + CCI-779, полученные из различных конечных параметров, варьирующих от 50 до 65%; фиг. 4 - 3-мерный пространственный анализ синергического взаимодействия комбинации ЕКВ-569+ CCI-779; Фиг. 5 показывает контурную диаграмму пространственного графика синергизма комбинации ЕКВ-569 + CCI-779. Описание изобретения Настоящее изобретение относится к применению комбинаций CCI-779 и ЕКВ-569 в качестве антинеопластической комбинированной химиотерапии. В частности, данные комбинации являются подходящими для лечения рака почки, рака мягких тканей, рака молочной железы, нейроэндокринной опухоли легкого, рака шейки матки, рака матки, рака головы и шеи, глиомы, немелкоклеточного рака легкого,рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, лимфомы, меланомы, мелкоклеточного рака легкого, рака яичника, рака толстого кишечника, рака пищевода, рака желудка, лейкоза, колоректального рака и неизвестного первичного рака. Данное изобретение относится к комбинациям CCI-779 и ЕКВ-569 для применения в качестве антинеопластической комбинированной химиотерапии, в которых дозировкаCCI-779 или ЕКВ-569 или обоих применяется в субтерапевтических эффективных дозировках. Используемый в настоящем изобретении термин лечение означает лечение млекопитающего,имеющего неопластическое заболевание, посредством обеспечения указанного млекопитающего эффективным количеством комбинации CCI-779 и ЕКВ-569 с целью ингибирования роста неоплазмы у указанного млекопитающего, ликвидации неоплазмы или облегчения состояния млекопитающего. Используемый в настоящем изобретении термин обеспечение, в том, что касается обеспечения комбинацией, означает прямое введение комбинации или введение пролекарства, производного или аналога одного или обоих компонентов комбинации, которые будут образовывать эффективное количество комбинации в организме. Получение CCI-779 описано в патенте США 5 362 718, который включен в настоящий документ в качестве ссылки. Улучшенное получение CCI-779 описано в патентной заявке СШАSN 09/670 358,которая включена в настоящий документ в качестве ссылки. В случае, когда CCI-779 применяют в качестве антинеопластического агента, предполагают, что дозы первоначальной в/в инфузии составят приблизительно от 0,1 до 100 мг/м 2 при схеме введения один раз в день (ежедневно, в течение 5 дней, каждые 2-3 недели) и приблизительно от 0,1 до 1000 мг/м 2 при схеме введения один раз в неделю. Пероральный путь или внутривенная инфузия являются предпочтительными путями введения, более предпочтительным является внутривенный путь. ЕКВ-569 можно получить в соответствии с методами, описанными в патенте США 6 002 008, который включен в настоящий документ в качестве ссылки. Предпочтительные методы получения ЕКВ 569 представлены в настоящем документе. В случае, когда ЕКВ-569 применяют в качестве антинеопластического агента, предполагают, что первоначальная пероральная доза составит приблизительно от 1 до-2 006226 100 мг в день. В зависимости от толерантности пациента ЕКВ-569 можно вводить ежедневно в течение периода лечения, такого как 14 дней, с последующим периодом отдыха (когда лекарственное средство не вводят), или можно вводить на постоянной основе в течение более длительного периода лечения (например, 6 месяцев или более). Антинеопластическая активность комбинации CCI-779 плюс ЕКВ-569 была подтверждена в стандартном фармакологическом исследовании in vitro; далее кратко описана использованная методика и полученные результаты. Методика с использованием клеточной пролиферации - клетки аденокарциномы толстого кишечника НСТ 116 выращивали на среде RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS, Life Technologies) и 50 мкг/мл гентамицина (Life Technologies), в атмосфере 7% СO2 при 37 С. Клетки помещали в 96-луночные микротитрационные планшеты (6000 клеток на лунку) в 200 мкл среды RPMI 1640, содержавшей 5% FBS и 50 мкг/мл гентамицина, и инкубировали в течение ночи при 37 С. Изготавливали разведения соединения в той же среде, с конечной концентрацией 5 Х, и 50 мкл разведенного лекарственного средства добавляли в лунки, содержавшие клетки. Для изучения комбинаций двух лекарственных средств серийные разведения одного соединения изготавливали в присутствии фиксированной дозы второго соединения. Альтернативно, использовали контрольные серии разведений. Клетки культивировали в течение трех дней в присутствии лекарственных средств. Клетки, на которые не воздействовали лекарственными средствами, включали в эксперимент в качестве контролей. Процентную долю выживших клеток определяли с использованием сульфородамина В (SRB, Sigma-Aldrich, St. Louis, МО), краски, связывающей белки. Клеточный белок осаждали в каждой лунке добавлением 50 мкл 50% холодного раствора трихлоруксусной кислоты. Через 1 ч планшеты обильно промывали водой и высушивали. Добавляли в качестве реагента краску SRB (0,4% SRB в 1% уксусной кислоте, 80 мкл на лунку), и планшеты держали при комнатной температуре в течение десяти минут. Затем планшеты тщательно промывали 1% уксусной кислотой и высушивали. Краску, связанную с клетками, растворяли в 10 мМ Tris (150 мкл) и считывали поглощение на 540 нм на микротитрационном планшет-ридере. Концентрацию соединения, которая вызывала фиксированную процентную долю ингибирования роста, определяли построением графика зависимости выживания клеток (относительно клеток, не подвергавшихся воздействию) от дозы соединения. Оценка синергизма Для изучения взаимодействия двух фармакологических агентов использовали изоболограммы. В данном случае, концентрацию каждого лекарственного средства в отдельности, которая вызывала определенный конечный параметр (например, 50% ингибирование роста клеток, IС 50), наносили на две графические оси. Прямая линия, соединяющая две точки, представляет равно эффективные концентрации всех комбинаций двух лекарственных средств, если взаимодействие является чисто суммарным. Сдвиг изоболограммы влево от прогнозируемой цитотоксичности (кривая вогнутой стороной вверх) представляет синергическое взаимодействие. Наоборот, сдвиг вправо от (кривая выпуклой стороной вверх) представляет антагонистическое взаимодействие. В случае, когда изоболограммы для различных конечных точек помещали на один и тот же график, концентрацию каждого лекарственного средства выражали как часть концентрации каждого лекарственного средства в отдельности, которая давала тот же эффект. Это дает симметричную изоболограмму с мерами, не имеющими единиц, на каждой оси, и позволяет проводить прямое сравнение различных конечных точек. Вторую модель изучения лекарственных взаимодействий предложили Prichard и Shipman [AntiviralResearch, 14: 181-206 (1990)]. Это 3-мерная модель по одной для каждого лекарственного средства и третья - для биологического эффекта. Теоретические суммарные взаимодействия рассчитывают по отдельным кривым доза-ответ, на основе модели суммарного действия с использованием несходных участков(независимость Bliss). Рассчитанную суммарную поверхность, представляющую прогнозируемую цитотоксичность, вычитают из экспериментальной поверхности, для выявления площадей усиленной токсичности (синергизм) или уменьшенной токсичности (антагонизм). Полученная поверхность выглядит как горизонтальная плоскость при 0% ингибирования над рассчитанной суммарной поверхностью, если взаимодействие является суммарным. Пики и впадины, отклоняющиеся от данной плоскости, указывают на синергизм и антагонизм, соответственно. Для автоматизации всех расчетов использовали компьютерную программу MacSynergy11 на основе Microsoft Excel. Данная программа рассчитывает теоретические суммарные взаимодействия и локализует и количественно определяет синергические или антагонистические взаимодействия, которые являются достоверными при 95% доверительных уровнях. Результаты наносили на 3-мерный график или контурный график. Результаты Были выбраны клетки НСТ 116, так как они экспрессируют низкие, но поддающиеся обнаружению уровни EGFR и являются чувствительными к ингибированию ингибиторами EGFR. Данные клетки обладают некоторой резистентностью к CCI-779, но высокими дозами данного лекарственного средства (5-10 мкг/мл) ингибируются. Клетки НСТ-116 культивировали в присутствии ЕКВ-569 в отдельности, CCI-779 в отдельности или серии разведений ЕКВ-569 с фиксированными дозами CCI-779. После роста в течение 3 дней выживание клеток определяли с помощью тест-процедуры SRB. Кривые цитотоксичности пока-3 006226 заны на фиг. 1. На клетках НСТ 116 ЕКВ-569 давал величину IC50 0,31 мкг/мл. Когда данное соединение комбинировали с 2,08 мкг/мл CCI-779 (который вызывал 41% ингибирование роста при отдельном использовании), величина IC50 уменьшалась до 0,03 мкг/мл, т.е. была в 10 раз меньше. При комбинировании с 0,026 мкг/мл CCI-779 (который ингибирует пролиферацию клеток при отдельном использовании на 36%), величина IC50 падала до 0,051 мкг/мл, т.е. была в 6 раз меньше. Сходные результаты наблюдались, когда кривые доза-ответ получали с использованием CCI-779 в присутствии фиксированных доз ЕКВ-569. Для того, чтобы идентифицировать природу данного лекарственного взаимодействия, получали изоболограммы (при уровне эффекта 50%) комбинации ЕКВ-569 и CCI-779 (фиг. 2). Изоболограмма имела глубокую извилину вогнутой стороной вверх, что указывает на значительное синергическое взаимодействие двух лекарственных средств. В наиболее синергической точке 0,03 мкг/мл ЕКВ-569, объединенный с 0,077 мкг/мл CCI-779, имел изоэффективность с 0,31 мкг/мл ЕКВ-569 в отдельности или 4,3 мкг/мл CCI-779 в отдельности (IC50 для каждого лекарственного средства в отдельности). Таким образом,10-кратное уменьшение дозы ЕКВ-569 и 50-кратное уменьшение дозы CCI-779 требовалось для ингибирования пролиферации клеток на 50%, когда лекарственные средства были объединены, по сравнению с каждым из лекарственных средств в отдельности. Также изучали изоболограммы, полученные из различных конечных точек, варьирующих от 50 до 65%. Как показано на фиг. 3, полученные изоболограммы почти полностью накладывались друг на друга, что указывает на синергизм на всех испытанных уровнях эффекта. Взаимодействие между ЕКВ-569 и CCI-779 оценивали также с использованием пространственного анализа. В данном случае фармакологические взаимодействия представлены на пространственной диаграмме с плоскостью на 0%, представляющей суммарное взаимодействие, с пиками и впадинами, представляющими площади синергизма или антагонизма, соответственно, между двумя лекарственными средствами. На фиг. 4 комбинация ЕКВ-569 и CCI-779 дала обширную площадь синергического взаимодействия, согласующуюся с результатами, показанными при изучении изоболограмм. Контурный график пространственной синергической диаграммы облегчает идентификацию концентраций лекарственных средств, при которых наблюдается наибольшая синергическая токсичность (фиг. 5). Обширная площадь синергизма наблюдалась при концентрации от 0,0005 до 3 мкг/мл CCI-779 и от 0,16 до 0,4 мкг/мл ЕКВ 569. В пределах указанной площади наблюдалось два пика максимального синергизма при концентрации от 0,0005 до 0,003 мкг/мл и от 0,05 до 0,3 мкг/мл CCI-779 и от 0,25 до 0,37 мкг/мл ЕКВ-569. На основе результатов описанных стандартных методик фармакологических испытаний комбинации CCI-779 плюс ЕКВ-569 действовали синергически и являются пригодными в качестве антинеопластической терапии. Более конкретно, данные комбинации являются пригодными для лечения рака почки,рака мягких тканей, рака молочной железы, нейроэндокринной опухоли легкого, рака шейки матки, рака матки, рака головы и шеи, глиомы, немелкоклеточного рака легкого, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, лимфомы, меланомы, мелкоклеточного рака легкого, рака яичника, рака толстого кишечника, рака пищевода, рака желудка, лейкоза, колоректального рака и неизвестного первичного рака. Поскольку данные комбинации содержат по меньшей мере два активных антинеопластических агента, применение данных комбинаций также обеспечивает применение комбинаций каждого из агентов, в которых один или оба агента применяют в субтерапевтически эффективных дозировках, уменьшая,таким образом, токсичность, связанную с отдельным химиотерапевтическим агентом. При проведении химиотерапии множество агентов, имеющих различные механизмы действия,обычно используют как часть химиотерапевтического коктейля. Можно предвидеть, что комбинации по настоящему изобретению будут использоваться как часть химиотерапевтического коктейля, который может содержать один или более дополнительных антинеопластических агентов, в зависимости от природы новообразования, по поводу которого будет проводиться лечение. Например, настоящее изобретение также относится к применению комбинации CCI-779/EKB-569, применяемой в сочетании с другими химиотерапевтическими агентами, такими как антиметаболиты (т.е., 5-фторурацил, флоксурадин, тиогуанин, цитарабин, флударабин, 6-меркаптопурин, метотрексат, гемцитабин, капецитабин, пентостатин, триметрексат или кладрибин); агенты сшивания ДНК и алкилирующие агенты (т.е., цисплатин,карбоплатин, стрептазоин, мелфалан, хлорамбуцил, кармустин, метклоретамин, ломустин, бисульфан,тиотепа, ифофамид или циклофосфамид); гормональные агенты (т.е., тамоксифен, ролоксифен, торемифен, анастрозол или летрозол); антибиотики (т.е., пликамицин, блеомицин, митоксантрон, идарубицин,дактиномицин, митомицин, доксорубицин или даунорубицин); иммуномодуляторы (т.е., интерфероны,IL-2 или BCG); антимитотические агенты (т.е., эстрамустин, паклитаксел, доцетаксел, винбластин, винкристин или винорелбин); ингибиторы топоизомеразы (т.е., топотекан, иринотекан, этопозид или тенипозид) и другие агенты (т.е., гидроксимочевина, трастузумаб, алтретамин, ретуксимаб, L-аспарагиназа или гемтузумаб озогамицин). При использовании по настоящему изобретению режим введения комбинации может быть одновременным или ступенчатым; при этом CCI-779 вводят в разное с ЕКВ-569 время в течение курса химиотерапии. Эта разница во времени между введениями двух агентов может варьировать от нескольких минут, часов, дней, недель или более. Следовательно, термин комбинация не обязательно означает введение в одно и то же время или в виде единой дозы, но что каждый из компонентов вводят в течение же-4 006226 лательного периода лечения. Агенты также можно вводить различными путями. Например, в случае комбинации CCI-779 плюс ЕКВ-569 можно ожидать, что CCI-779 будут вводить перорально или парентерально, предпочтительно парентерально, в то время как ЕКВ-569 можно вводить парентерально, перорально или другими приемлемыми способами. Данную комбинацию можно вводить один раз в день,один раз в неделю и даже один раз в месяц. Обычным для схем химиотерапии является то, что курс химиотерапии могут повторять несколькими неделями позже, и могут придерживаться тех же временных рамок для введения двух агентов, или могут производить модификации, основываясь на реакции пациента на лечение. Обычным для химиотерапии является то, что схемы введения лекарственных средств тщательно контролирует лечащий врач, основываясь на многочисленных факторах, включая тяжесть заболевания,реакцию на заболевание, любую связанную с лечением токсичность, возраст, состояние здоровья пациента и другие сопутствующие заболевания или виды лечения. На основании результатов, полученных при использовании комбинаций CCI-779 плюс ЕКВ-569,можно прогнозировать, что первоначальная доза при в/в инфузии CCI-779 будет составлять приблизительно от 0,1 до 100 мг/м 2, предпочтительно приблизительно от 2,5 до 70 мг/м 2. Также предпочтительно вводить CCI-779 в/в, обычно в течение периода времени более 30 мин, и приблизительно один раз в неделю. Первоначальные суточные дозы ЕКВ-569 будут составлять приблизительно от 1 до 100 мг, предпочтительно от 5 до 75 мг. После одного или более курсов лечения дозировки могут быть изменены в стороны увеличения или уменьшения, в зависимости от полученных результатов и наблюдающихся побочных эффектов. Препараты для перорального введения, содержащие активные соединения по настоящему изобретению, могут включать любые обычные пероральные формы, включая таблетки, капсулы, буккальные формы, облатки, пастилки и жидкости, суспензии или растворы для перорального введения. Капсулы могут содержать смеси активного соединения (соединений) с инертными наполнителями и/или разбавителями, такими как фармацевтически приемлемые крахмалы (например, кукурузный, картофельный крахмал или крахмал из тапиоки), сахара, искусственные подсластители, порошкообразные целлюлозы,такие как кристаллическая и микрокристаллическая целлюлозы, корригенты, желатины, камеди и т.п. Подходящие таблетированные препаратные формы можно изготавливать обычными способами прессования, влажного гранулирования или сухого гранулирования и использовать фармацевтически приемлемые разбавители, связывающие агенты, смазывающие агенты, разрыхлители, агенты, модифицирующие свойства поверхностей (включая сурфактанты), суспендирующие или стабилизирующие агенты, включая, без ограничения, стеарат магния, стеариновую кислоту, тальк, лаурилсульфат натрия, микрокристаллическую целлюлозу, кальций-карбоксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, желатин, альгиновую кислоту, аравийскую камедь, ксантановую камедь, цитрат натрия, сложные силикаты, карбонат кальция, глицин, декстрин, сахарозу, сорбит, двухкальциевый фосфат, сульфат кальция, лактозу, каолин,маннит, хлорид натрия, тальк, сухие крахмалы и порошкообразный сахар. Предпочтительные агенты,модифицирующие свойства поверхностей, включают неионогенные и анионогенные агенты, модифицирующие свойства поверхностей. Примеры агентов, изменяющих свойства поверхностей, включают, без ограничения, полоксамер 188, хлорид бензалкония, стеарат кальция, цетостеариловый спирт, эмульгирующий воск цетомакрогол, сложные эфиры сорбитана, коллоидный диоксид кремния, фосфаты, додецилсульфат натрия, алюмосиликат магния и триэтаноламин. Препараты для перорального введения по настоящему изобретению могут использовать обычные препараты с замедленным или отсроченным высвобождением для изменения всасывания активного соединения (соединений). Препарат для перорального введения может также состоять из активного ингредиента в воде или фруктовом соке, содержащим подходящие солюбилизирующие или эмульгирующие агенты, если это необходимо. В некоторых случаях может быть желательным введение соединения непосредственно в дыхательные пути в форме аэрозоля. Соединения можно также вводить парентерально или интраперитонеально. Растворы или суспензии данных активных соединений в виде свободного основания или фармакологически приемлемой соли можно изготавливать в воде, должным образом смешанной с сурфактантом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии также можно изготавливать в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях в маслах. В обычных условиях хранения и использования данный препарат содержит консервант для предотвращения роста микроорганизмов. Фармацевтические формы, подходящие для инъекций, включают стерильные водные растворы или стерильные порошки для изготовления непосредственно перед употреблением стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Во всех случаях лекарственная форма должна быть стерильной и достаточно жидкой, чтобы ее можно было вводить с помощью шприца. Она должна быть стабильной при условиях производства и хранения и должна быть предохранена от контаминирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или диспергирующую среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол(например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль), подходящие смеси данных агентов и растительные масла.-5 006226 Для целей настоящего описания под чрескожным введением понимают все способы введения через поверхность тела и внутренние выстилки путей организма, включая эпителиальные ткани и ткани слизистых оболочек. Указанное введение можно осуществлять с использованием настоящих соединений или их фармацевтически приемлемых солей, в лосьонах, кремах, пенках, пластырях, суспензиях, растворах и суппозиториях (ректальных и вагинальных). Чрескожное введение можно осуществлять с использованием чрескожного пластыря, содержащего активное соединение и носитель, который является инертным по отношению к активному соединению,нетоксичным по отношению к коже и позволяет доставлять агент для системного всасывания в кровоток через кожу. Носитель может принимать любое количество форм, таких как кремы и мази, пасты, гели и закрытые устройства. Кремы и мази могут представлять собой вязкие жидкие или полутвердые эмульсии типа масло в воде или вода в масле. Пасты, составленные из абсорбирующих порошков, диспергированных в нефти или гидрофильной нефти, содержащие активный ингредиент, также могут быть подходящими. Ряд закрытых устройств можно использовать для высвобождения активного ингредиента в кровоток, таких как полупроницаемая мембрана, покрывающая резервуар, содержащий активный ингредиент с носителем или без носителя, или матрикс, содержащий активный ингредиент. Другие закрытые устройства известны специалистам. Препараты в форме суппозиториев можно изготавливать из традиционных материалов, включая масло какао с добавлением или без добавления восков для изменения температуры плавления суппозитория, и глицерин. Также можно использовать водорастворимые основы для суппозиториев, такие как полиэтиленгликоли с различными молекулярными массами. Следующая информация обеспечивает получение ЕКВ-569 из коммерчески доступных исходных материалов или исходных материалов, которые можно получить, опираясь на описанные в научной литературе процедуры. Получение 4-диметиламинокротоновой кислоты из TMS-4-бромкротоната: 211 мл диметиламина (2 М в ТГФ, 0,422 моль) по каплям добавляли к раствору 50 г TMS-4 бромкротоната (0,211 моль, 75,9% по ГХ-МС) в 250 мл ТГФ при 0-50 С в атмосфере N2. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Белый твердый побочный продукт отфильтровывали. К фильтрату добавляли 2 мл воды с последующим внесением затравки. Образованные кристаллы отфильтровывали и промывали, с получением 18,3 г (из двух сборов) твердого продукта не совсем белого цвета. Выход составил 67,2% (98% чистота по ГХ-МС, ЯМР соответствовал структуре). Получение метил 4-диметиламинокротоната из метил-4-бромкротоната: 120 мл диметиламина (2 М в ТГФ, 0,24 моль) по каплям добавляли к раствору 20 г метил 4 бромкротоната (85% чистоты, 0,095 моль) в 150 мл ТГФ при 0-50 С в атмосфере N2. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. ТСХ (9:1 СН 2 Сl2: МеОН с несколькими каплями Et3N) показала остаточный метил 4-бромкротонат. Реакционную смесь перемешивали при 4045 С в течение 15 мин. Белый твердый побочный продукт отфильтровывали. Фильтрат выпаривали с получением желтого масла (14 г). Желтое масло растворяли в 100 мл СН 2 Сl2 и промывали два раза Н 2 О. Водный слой вновь экстрагировали 100 мл CH2Cl2. Слои СН 2 Сl2 объединяли, высушивали над MgSO4 и фильтровали. Фильтрат выпаривали с получением масла (12 г). Выход составил 88%. ЯМР показала желаемый продукт со следовыми количествами метил 4-бромкротоната. Получение гидрохлорида метил 4-N,N-диметиламинокротоната в большом количестве: В 3 л колбу помещали тетрагидрофуран (0,71 кг, 0,80 л). Добавляли метил 4-бромкротонат (0,20 кг,0,13 л, пл. = 1,522 г/мл) и промывали тетрагидрофураном (0,18 кг, 0,20 л). Раствор перемешивали и охлаждали до 0-10 С. Дополнительную воронку загружали раствором диметиламина в тетрагидрофуране и добавляли поверх (1 ч 15 мин), сохраняя температуру 0-10 С. Смесь перемешивали минимум в течение 30 мин и проверяли на завершение реакции посредством ТСХ. Реакция была завершена, когда оставалось-6 0062262% выявляемого исходного материала (метил 4-бромкротоната). Смесь в холодном состоянии фильтровали через воронку Бюхнера в 3 л колбу с несколькими горлами, промывали предварительно охлажденным (0-10 С) тетрагидрофураном (2 х 0,18 кг, 2 х 0,20 л) и сохраняли разрежение до прекращения подачи раствора по каплям. Колба была снабжена мешалкой, термометром и устройством для вакуумной дистилляции. Раствор концентрировали дистилляцией при пониженном давлении (125-200 мм рт.ст.) и при максимальной температуре резервуара (40 С) до объема (200 мл). Добавляли изопропанол (0,22 кг,0,28 л) и смесь охлаждали до 0-10 С. Головку перегонного устройства заменяли дополнительной воронкой, загруженной раствором НСl в изопропаноле, который добавляли более 45 мин до достижения рН 2,0-3,0, при поддержании температуры 0-10 С. Смесь оставляли в покое минимум на 30 мин и помещали ее в холодном состоянии на воронку Бюхнера, промывали изопропанолом (2 х 0,12 кг, 2 х 0,15 л). Осадок на фильтре заливали и сохраняли разрежение до прекращения подачи раствора по каплям. Продукт высушивали в вакуумной печи при 50 С и 10 мм рт.ст. в течение 18-20 ч. Получение гидрохлорида 4-диметиламинокротоновой кислоты из метил 4-диметиламинокротоната: Раствор NaOH (3,35 г в 25 мл Н 20, 0,084 моль) по каплям добавляли к раствору 12 г метил 4 диметиламинокротоната (0,084 моль) в 100 мл МеОН при комнатной температуре. Реакционную смесь нагревали до 40-45 С в течение 1 ч, затем охлаждали до комнатной температуры. рН доводили до 12 с помощью 5 Н НСl. Смесь концентрировали до состояния густого масла, которое растирали в обезвоженном спирте до образования твердого вещества. Твердый побочный продукт отфильтровывали. Фильтрат выпаривали до состояния масла, которое растирали в IPA. Получали семь (7,0) г белого твердого продукта. Выход составил 50%, чистота по ГХ-МС 86,3%. Получение гидрохлорида 4-N,N-диметиламинокротоновой кислоты в большом количестве: 2 л колба с несколькими горлами была снабжена мешалкой, термометром, дополнительной воронкой и азотной защитой. В колбу загружали этанол (0,39 кг, 0,50 л). Добавляли гидрохлорид метил 4-N,Nдиметиламинокротоната (0,125 кг) и промывали этанолом (0,10 кг, 0,125 л). Суспензию перемешивали и охлаждали до 0-10 С. Дополнительную воронку загружали гидроксидом натрия (50%) (0,11 кг, 0,072 л,пл. = 1,53 г/мл) и добавляли в течение более 20 мин, поддерживая температуру 0-10 С. Наблюдалось выделение небольшого количества тепла, и смесь приобретала желтый цвет. Смесь перемешивали в течение минимум 15 мин, а затем подогревали до 18-22 С и оставляли в покое минимум на 4 ч. Реакцию проверяли на завершение посредством ТСХ. Реакция была завершена, когда оставалось 2% выявляемого исходного материала (гидрохлорида метил 4-N,N-диметиламинокротоната). Смесь охлаждали до 0-10 С. Дополнительную воронку загружали раствором НСl в изопропаноле и добавляли более 40 мин до достижения рН 2,0-3,0, при поддержании температуры резервуара 0-10 С. Смесь перемешивали в течение минимум 30 мин и в холодном состоянии фильтровали через воронку Бюхнера в 2 л колбу с несколькими горлами, промывали холодным этанолом (0-10 С) (2 х 0,05 кг, 2 х 0,063 л), сохраняя разрежение до прекращения подачи раствора по каплям. Колба была снабжена мешалкой, термометром и устройством для вакуумной дистилляции. Растворитель удаляли при пониженном давлении 50-100 мм рт.ст. и при максимальной температуре резервуара (40 С) до объема 160-180 мл. Добавляли изопропанол (0,049 кг, 0,063 л) и смесь подогревали до 35-40 С в течение более 10 мин. Добавляли ацетон (0,10 кг, 0,13 л) в течение более 20 мин, поддерживая температуру 35-40 С. В смесь помещали затравку и охлаждали до комнатной температуры 20-25 С и оставляли в указанном состоянии минимум на 12-18 ч. Смесь охлаждали до 010 С и оставляли в указанном состоянии минимум на 1 ч. Готовили смесь изопропанола (0,049 кг, 0,063 л) и ацетона (0,10 кг, 0,13 л), перемешивали до однородности и охлаждали до 0-10 С. Смесь фильтровали в холодном состоянии на воронку Бюхнера, промывали смесью изопропанол/ацетон (2 х 0,074 кг, 2 х-7 006226 0,096 л), а осадок на фильтре заливали, сохраняя разрежение до прекращения подачи раствора по каплям. Продукт высушивали в вакуумной печи при 50 С и 10 мм рт.ст. в течение 18-20 ч. Получение 4-диметиламинокротониланилида из гидрохлорида 4-диметиламинокротоновой кислоты: Тионилхлорид (0,36 мл, 0,005 моль) по каплям добавляли к раствору 0,33 г гидрохлорида 4 диметиламинокротоновой кислоты (0,002 моль) в 15 мл СН 2 Сl2, содержащих 2 капли ДМФА при 0 С в атмосфере N2. Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 30 мин. Затем к реакционной смеси по каплям добавляли 0,72 мл анилина (0,008 моль) при 0 С и перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Твердый побочный продукт отфильтровывали. Фильтрат выпаривали, с получением масла (0,6 г). Данные ГХ-МС показали, что масло содержало 11,7% гидрохлорида 4 диметиламинокротоновой кислоты и 85% желаемого продукта. Получение и выделение гидрохлорида 4-N,N-диметиламинокротоноилхлорида Хорошо перемешанную суспензию гидрохлорида 4-диметиламинокротоновой кислоты (5,0 г, 30 ммоль) в холодном (0 С) ТГФ (40 мл) и ДМФА (2 капли из пипетки) обрабатывали оксалилхлоридом(3,15 мл, 36 ммоль). Смесь перемешивали при 20-25 С в течение 3 ч, затем охлаждали до 0 С и оставляли в указанном состоянии на 30 мин. Твердые вещества собирали на воронку Бюхнера (под слоем азота) и промывали холодным (0 С) ТГФ (3 х 5 мл). Продукт высушивали в условиях вакуума ( 1 торр) при 4050 С в течение 3 ч, с получением 4,0 г гидрохлорида 4-диметиламинокротоноилхлорида. Данный материал характеризуется как его метиловый эфир при обработке твердого вещества метанолом. Альтернативно, указанное в заголовке соединение можно получать в СН 3 СN и использовать непосредственно на стадии связывания. Получение ЕКВ-569 3 л колба с несколькими горлами была снабжена мешалкой, термометром, погруженной трубкой и азотной защитой. В колбу загружали N-метилпирролидинон (0,77 кг, 0,75 л, пл. = 1,033 г/мл). При комнатной температуре добавляли 4-[3-хлор-4-фторфенил]амин-6-амино-3-циан-7-этоксихинолин (0,0748 кг)[см. патент США 6 002 008] и смесь перемешивали при нагревании до 40-45 С и оставляли в указанном состоянии на 15 мин. Колбу охлаждали до 0-10 С. Смесь, содержавшую гидрохлорида 4-N,Nдиметиламинокротоноилхлорида, переносили посредством погруженной трубки и при положительном давлении азота в 3 л колбу в течение более 30-45 мин, поддерживая температуру 0-10 С. Смесь оставляли в покое при 0-10 С минимум на 2 ч. Реакцию проверяли на завершение посредством ВЭЖХ. Реакция была завершена, когда оставалось 2% исходного материала (4-[3-хлор-4-фторфенил]амин-6-амино-3 циан-7-этоксихинолина). 12 л колбу с несколькими горлами, снабженную мешалкой, термометром, погруженной трубкой и азотной защитой, загружали водой (2,61 кг, 2,61 л). Добавляли бикарбонат натрия(0,209 кг) и перемешивали до получения раствора. Раствор охлаждали до 20-24 С. Смесь NMP-CH3CN переносили посредством погруженной трубки и при положительном давлении азота в 12 л колбу в течение более 45-60 мин, поддерживая температуру 20-24 С. Смесь поддерживали при 20-24 С в течение минимум 1 ч и фильтровали на воронку Бюхнера, промывали водой (3 х 0,40 кг, 3 х 0,40 л), сохраняя разрежение до прекращения подачи раствора по каплям. Продукт высушивали в вакуумной печи при 50 С и 10 мм рт.ст. в течение 28-30 ч, с получением 78,5 г (выход 86%) продукта. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения новообразования у млекопитающего, нуждающегося в указанном лечении, который включает введение указанному млекопитающему эффективного количества комбинации, включающей CCI-779 и ЕКВ-569. 2. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой рак почки. 3. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой саркому мягких тканей. 4. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой рак молочной железы. 5. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой нейроэндокринную опухоль легкого. 6. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой рак шейки матки. 7. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой рак матки. 8. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой рак головы и шеи. 9. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой глиому.-8 006226 10. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой немелкоклеточный рак легкого. 11. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой рак предстательной железы. 12. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой рак поджелудочной железы. 13. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой лимфому. 14. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой меланому. 15. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой мелкоклеточный рак легкого. 16. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой рак яичника. 17. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой рак толстого кишечника. 18. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой рак пищевода. 19. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой рак желудка. 20. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой лейкоз. 21. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой колоректальный рак. 22. Способ по п.1, в котором новообразование представляет собой неизвестный первичный рак. 23. Способ по любому из пп.1-22, который включает введение указанному млекопитающему эффективного количества комбинации, включающей CCI-779 и ЕКВ-569, в котором CCI-779, ЕКВ-569 или оба вводят в субтерапевтически эффективных количествах. 24. Способ по п.23, в котором CCI-779 вводят в субтерапевтически эффективном количестве. 25. Способ по п.23, в котором ЕКВ-569 вводят в субтерапевтически эффективном количестве. 26. Способ по п.23, в котором CCI-779 и ЕКВ-569 вводят в субтерапевтически эффективных количествах. 27. Антинеопластическая комбинация, которая включает антинеопластическое эффективное количество комбинации CCI-779 и ЕКВ-569. 28. Композиция по п.27, в которой CCI-779 содержится в субтерапевтически эффективном количестве. 29. Композиция по п.27, в которой ЕКВ-569 содержится в субтерапевтически эффективном количестве. 30. Композиция по п.27, в которой CCI-779 и ЕКВ-569 содержатся в субтерапевтически эффективных количествах. 31. Продукт, включающий CCI-779 и ЕКВ-569, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного и последовательного применения для лечения новообразования у млекопитающего. 32. Продукт по п.31, в котором новообразование представляет собой одно из следующих заболеваний: рак почки, саркому мягких тканей, рак молочной железы, нейроэндокринную опухоль легкого, рак шейки матки, рак матки, рак головы и шеи, глиому, немелкоклеточный рак легкого, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, лимфому, меланому, мелкоклеточный рак легкого, рак яичника, рак толстого кишечника, рак пищевода, рак желудка, лейкоз, колоректальный рак или неизвестный первичный рак. 33. Применение CCI-779 и ЕКВ-569 для изготовления лекарственного средства для лечения новообразования у млекопитающего. 34. Применение по п.33, при котором новообразование представляет собой одно из следующих заболеваний: рак почки, саркому мягких тканей, рак молочной железы, нейроэндокринную опухоль легкого, рак шейки матки, рак матки, рак головы и шеи, глиому, немелкоклеточный рак легкого, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, лимфому, меланому, мелкоклеточный рак легкого, рак яичника, рак толстого кишечника, рак пищевода, рак желудка, лейкоз, колоректальный рак или неизвестный первичный рак. 35. Применение по п.33 или 34, при котором CCI-779 вводят в субтерапевтически эффективном количестве. 36. Применение по п.33 или 34, при котором ЕКВ-569 вводят в субтерапевтически эффективном количестве. 37. Применение по п.33 или 34, при котором CCI-779 и ЕКВ-569 вводят в субтерапевтически эффективных количествах.