Вакцинная композиция против малярии

1 Настоящее изобретение относится к новой вакцинной композиции и к ее применению в медицине, в частности, при предупреждении малярийных инфекций. Малярия, от которой умирает 2-4 миллиона людей в год, представляет собой одну из главных проблем всемирного здравоохранения. Одна из наиболее острых форм заболевания вызывается простейшим паразитом Plasmodiumfalciparum, который ответственен за большинство смертельных исходов, связанных с малярией. Жизненный цикл Р.falciparum представляет собой сложный цикл, для завершения которого необходимы два хозяина, человек и комар. Инфекция у человека инициируется инокуляцией спорозоитов в слюну инфицированного комара. Спорозоиты мигрируют в печень и там инфицируют гепатоциты, где через экзоэритроцитарную внутриклеточную стадию они дифференцируются в стадию мерозоита, который инфицирует красные кровяные клетки (RBC) для инициации циклической репликации в бесполой кровяной стадии. Цикл завершается дифференцировкой ряда мерозоитов в RBC в половую стадию гаметоцитов, которые проглатываются комаром, где они развиваются через серию стадий в его средней кишке с образованием спорозоитов, которые мигрируют в слюнную железу. Стадия спорозоита Р.falciparum идентифицирована как потенциальная мишень для малярийной вакцины. Главный поверхностный белок спорозоита известен как белок, окружающий спорозоит (CS белок). Этот белок из штамма 7G8 клонирован, получена его экспрессия и определена последовательность (Dame et al., Science 225 (1984) р 593). Белок из штамма 7G8 отличается тем, что он имеет центральный иммунодоминантный район повторов, содержащий тетрапептид Asn-Ala-Asn-Pro, повторяющийся 37 раз, но встроенный в промежутки между четырьмя минорными повторами Asn-Val-Asp-Pro. В других штаммах число мажорных и минорных повторов, также как и их относительное расположение, варьирует. Данный центральный участок фланкирован N и С-концевыми участками,состоящими из неповторяющихся аминокислотных последовательностей, обозначенных как участок CS белка, лишенный повторов. Показано, что облученные спорозоиты могут обеспечить значительную защиту против исследуемой малярии у человека (Am. J. Trop.Med. Hyg. 24: 297-402, 1975). Однако трудности производства делают применение облученного спорозоита непрактичным с точки зрения производства вакцины. Несколько групп исследователей предложили субъединичные вакцины на основе белка, окружающего спорозоит. Некоторые из этих вакцин прошли клинические испытания; одна из них представляет собой синтетический пептид, другая представляет собой рекомбинантный белок (Ballou et al. Lancet: i 1277 2 Данные вакцины успешно стимулировали антиспорозоитный ответ. Тем не менее, величина ответа оказалась разочаровывающей, причем,некоторые вакцинированные вовсе не давали ответа. Кроме того, отсутствие "реиммунизации" уровней антител при последовательных инъекциях и результаты анализов пролиферации лимфоцитов in vitro позволили предположить, что Т-клетки большинства из этих добровольцев не распознавали иммунодоминантный повтор. Тем не менее, у одного вакцинированного в каждом исследовании не развивалась паразитемия. В Международной заявке на патентWO 93/10152 (Smithkline Beecham Biologicals) описывается и заявляется гибридный белок, содержащий по существу весь С-концевой участок CS белка, четыре или более чем четыре тандемных повтора иммунодоминантного района и поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg). Предпочтительно гибридный белок включает в себя последовательность, которая содержит, по меньшей мере, 160 аминокислот, которые являются по существу гомологичными С-концевому участку CS белка. CS белок может быть свободен от последних 12 аминокислот С-конца. В частности, описывается белок, который содержит участок CS белка P.falciparum, по существу соответствующий аминокислотам 210398 7G8 P.falciparum, слитый через линейный линкер в одну рамку считывания с N-концомHBsAg. Линкер может содержать участок пpeS2 из HBsAg. Конкретное воплощение, описанное в WO 93/10152, представляет собой гибридный белок,обозначенный RTS. Данный гибрид состоит из- метионинового остатка, кодируемого нуклеотидами с 1059 по 1061, производного от последовательности гена TDH3 Saccharomycescerevisiae (нуклеотиды 1-1058 в данной рамке считывания образуют сам TDH3 промотор)- трех аминокислот, Met Ala Pro, производных от нуклеотидной последовательности(1062-1070), созданной посредством процедуры клонирования, использованной для конструирования гибридного гена;- фрагмента из 189 аминокислот, кодируемых нуклеотидами с 1071 по 1637, представляющих собой аминокислоты с 210 по 398 белка, окружающего спорозиот (CS белка), штамма 7G8 Plasmodium falciparum (Dame et al., см. выше);- аминокислоты (Аrg), кодируемой нуклеотидами с 1638 по 1640, созданными посредством процедуры клонирования, использованной для конструирования гибридного гена;- четырех аминокислот, Pro Val Thr Asn,кодируемых нуклеотидами с 1641 по 1652 и представляющих собой четыре карбоксилтерминальных остатка преS2 белка (9) вируса гепатита В (серотип adw);- фрагмента из 226 аминокислот, кодируемых нуклеотидами с 1653 по 2330 и точно определяющих S белок вируса гепатита В (серотипadw). Кроме того, в WO 93/10152 описывается экспрессия гибридного белка в штаммереципиенте дрожжей, который уже несет в своем геноме несколько интегрированных копий полигенного экспрессирующего кластера S гепатита В. Полученный в результате штамм синтезирует два полипептида, S и RTS (или другой гибридный белок по изобретению), которые спонтанно собираются вместе в смешанные (например RTS, S) липопротеиновые частицы. На поверхности данных частиц преимущественно представлена последовательность CS белка этого гибрида. Задачей именно настоящего изобретения является обеспечение иммунитета против инвазии P.falciparum и/или P.vivax посредством иммунизации с использованием композиции, содержащей множество антигенов в комбинации с адъювантом, который является предпочтительным стимулятором ТН 1 клеточного ответа. Соответственно, в настоящем изобретении предлагается вакцинная композиция, содержащая, по меньшей мере, два антигена в комбинации с адъювантом, который является предпочтительным стимулятором ТН 1 клеточного ответа, отличающаяся тем, что, по меньшей мере,два антигена выбраны из группы, включающей в себя(а) гибридный белок, содержащий, по существу, весь С-концевой участок CS белка, четыре или более чем четыре тандемных повтора иммунодоминантного района CS белка и поверхностный антиген вируса гепатита В(НВsАg), где CS белок представляет собой белок, окружающий спорозоит, являющийся главным поверхностным белком спорозоита Р.falciparum;(б) родственный тромбоспондину безымянный белок (TRAP) клонированного изолята(в) главный поверхностный белок 1 (MSP1) P.falciparum или P.vivax, и белки, обладающие, по меньшей мере, 80% гомологией к нему,и их иммуногенные производные, включая фрагменты. Предпочтительно, по меньшей мере, один из антигенов представляет собой гибридный белок, как определено выше, такой как RTS,более предпочтительно в форме смешанных частиц, как определено выше, таких как RTS, S. Количество антигена, присутствующего в каждой дозе вакцины, выбрано как количество,которое индуцирует иммунозащитный ответ без значительных неблагоприятных побочных эффектов, характерных при применении типичных 4 вакцин. Такое количество должно варьировать в зависимости от того, какие конкретные иммуногены используются. Как правило, ожидается,что каждая доза будет содержать в целом от 1 до 1000 мкг белка, предпочтительно от 1 до 200 мкг, наиболее предпочтительно от 10 до 100 мкг. Оптимальное количество для конкретной вакцины можно установить посредством стандартных исследований, которые включают в себя наблюдение за иммунными ответами у субъектов. После первичной вакцинации субъекты предпочтительно должны получать реиммунизацию в течение примерно 4 недель с последующей многократной иммунизацией каждые 6 месяцев в течение того времени, пока существует риск инфекции. Адъюванты, которые способны к предпочтительной стимуляции ТН 1 клеточного ответа,описаны в Международных заявках на патентWO 94/00153 и WO 95/17209. Конкретный предпочтительный адъювант содержит QS21, очищенную ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией) нетоксичную фракцию, полученную из коры QuillajaSaponaria Molina, и 3 Де-O-ацилированный монофосфорил липид A (3D-MPL), возможно вместе с эмульсией типа масло в воде. Таким образом, в еще одном аспекте данного изобретения предложена вакцинная композиция, отличающаяся тем, что адьювант содержит 3 Де-O-ацилированный монофосфорил липид A (MPL). 3 Де-O-ацилированный монофосфорил липид А известен из GB 2220211 (Ribi). Химически он представляет собой смесь 3 Де-Oацилированного монофосфорил липида А с 4, 5 или 6 ацилированными цепями и производитсяRibi Immunochem Montana. Предпочтительная форма 3 Де-O-ацилированного монофосфорил липида А описана в Международной заявке на патент 92/116556. Согласно следующему аспекту изобретения предложена вакцинная композиция, отличающаяся тем, что адъювант содержит очищенную высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) нетоксичную фракцию сапонина из коры Quillaria Saponaria Molina (QS21). Способ производства QS21 описан (какQA21) в патенте США 5057540. Предпочтительной является вакцинная композиция, отличающаяся тем, что адъювант содержит эмульсию типа "масло в воде". Предпочтительная эмульсия типа масло в воде содержит масло, преобразующееся в ходе обмена веществ, такое как сквален, альфатокоферол и твин 80. Дополнительно эмульсия типа масло в воде может содержать спан 85 и/или лецитин. СоотношениеQS21:3D-MPL типично должно быть порядка от 1:10 до 10:1; предпочтительно от 1:5 до 5:1 и часто по существу 1:1. Предпочтительный диапазон для оптимальной 5 синергии составляет от 2,5:1 до 1:1 3DMPL:QS21. Типично для введения человекуQS21 и 3D-MPL должны быть представлены в вакцине в пределах от 1 до 200 мкг, как, например, от 1 до 100 мкг, предпочтительно от 10 до 50 мкг на дозу. Типично эмульсия типа масло в воде должна содержать от 2 до 10% сквалена,от 2 до 10% альфа-токоферола и от 0,3 до 3% твина 80. Предпочтительно соотношение сквален: альфа-токоферол является равным 1 или менее чем 1, поскольку это обеспечивает более стабильную эмульсию. Спан 85 может также быть представлен на уровне 1%. В некоторых случаях может быть преимуществом, чтобы вакцины по настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор. Получение вакцин в общих чертах описано в New Trends and Developments in Vaccines, изданном Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. Инкапсулирование внутрь липосом описано, например, Fullerton(патент США 4372945) и Armor et al. (патент США 4474757). Антигены, подходящие для включения в вакцины по изобретению, могут быть выбраны из следующего: 1. Гибридный белок, как определено выше,такой как RTS, более предпочтительно в форме смешанных частиц, как определено выше, таких как RTS,S. 2.P.falciparum из Таиланда, известного как Т/9/96,и белки, обладающие, по меньшей мере, 80% гомологией к нему, и их иммуногенные производные, включая фрагменты (описаны в публикациях международных заявок на патентLimited) и WO 92/11868 (US Navy. 3. Белок 16 кД, описанный в публикации международной заявки WO 91/18922, и белки,обладающие, по меньшей мере, 80% гомологией к нему, и их иммуногенные производные, включая фрагменты. 4. Апикальный мембранный антиген-1 6 7. Другие белки экзоэритроцитарной стадии и их иммуногенные производные, включая фрагменты. 8. Возможно, белки кровяной стадии и их иммуногенные производные, включая фрагменты. Термин "иммуногенное производное" относится к любой молекуле, как например усеченной, или другому производному белка, которое сохраняет способность индуцировать иммунный ответ на белок после внутреннего введения человеку. Такие другие производные можно получить посредством добавления, делеции, замены или перестройки аминокислот либо посредством их химических модификаций. Иммуногенные фрагменты белка, которые могут быть пригодны при получении субъединичных вакцин, можно получить посредством экспрессии подходящих фрагментов гена или посредством пептидного синтеза, например, с использованием синтеза по Меррифилду (Merrifield) (The Peptides, Vol. 2, Academic Press, NY,page 3). Иммуногенное производное может представлять собой гибрид, который является полипептидом слияния, содержащим дополнительные последовательности, которые могут нести один или более чем один эпитоп для других иммуногенов Plasmodium, либо для других иммуногенов не Plasmodium. Альтернативно иммуногенное производное по изобретению может быть слито с полипептидом-носителем, таким как поверхностный или коровый антиген вируса гепатита В, либо с другим носителем, который обладает иммуностимулирующими свойствами,как в случае адъюванта, или который иным путем усиливает иммунный ответ на белок или его производное, или является пригодным для экспрессии, очистки или изготовления препарата белка или его производного. Белки или их иммуногенные производные,которые являются пригодными по изобретению,могут быть химически соединены с макромолекулой с использованием стандартного связывающего агента, такого как глутаральдегид(Geerlings et al. (1988) J. Immunol. Methods, 106,239-244). Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение вакцинной композиции, как она определена выше, для лечения или предупреждения малярии. В соответствии со следующим аспектом изобретения предложено применение вакцинной композиции, как она определена выше, в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики малярии. Также, в соответствии с дальнейшим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или предупреждения малярии, отличающийся тем, что пациенту, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество вакцинной композиции, как она определена выше. 7 Следующий пример иллюстрирует изобретение. Пример. Конструирование и экспрессия рекомбинантного TRAP Данную конструкцию получали, как описано в WO 90/01496. Конструирование и экспрессия RTS,S. Данную конструкцию получали, как описано в WO 93/10152. Адъювантация Готовили два препарата адъюванта, каждый из которых содержал следующие компоненты эмульсии типа масло в воде.SB 26: 5% сквалена 5% токоферола 0,4% твин 80; размер частиц составлял 500 нмSB 62: 5% сквалена 5% токоферола 2,0% твин 80; размер частиц составлял 180 нм Изготовление эмульсии SB 62 (2-кратный концентрат) Твин 80 растворяли в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (ФСБ), с получением 2% раствора в ФСБ. Чтобы получить 100 мл эмульсии двукратной концентрации, 5 гDL альфа-токоферола и 5 мл сквалена тщательно перемешивали на вортексе. Добавляли 90 мл раствора ФСБ/Твин и тщательно перемешивали. Полученную в результате эмульсию затем пропускали через шприц и, наконец, микрофлюидизировали с использованием аппарата для микрофлюидизации М 110S. Размер полученных в результате капелек масла составлял примерно 180 нм. Получение эмульсии SB26 Данную эмульсию получали аналогичным способом с использованием 0,4% твин 80. Другие эмульсии, как показано в таблице,получали аналогичным способом. К каждым 100 мл эмульсии добавляли два антигена (10 мг каждого антигена, эквивалентные 50 мкг на дозу) и смешивали. Данную смесь объединяли со 100 мкг/мл 3D-MPL и 100 мкг/млQS21 с получением конечного препарата. Буфер составляли в соответствии с содержанием соли и рН. Таблица. Носители двукратной концентрации Эмуль Токофе- Сква- Твин Спан ЛециРазмер сии SB рол % лен % 80 % 85 % тин % 26 5 5 0,4 0 0 500 нм 90-100% 800 нм 10-0% 26.1 5 5 0,4 0 0,1 500 нм 63 5 5 0,6 0 0 500 нм 64 5 5 0,8 0 0 500 нм 61 5 5 1 0 0 250-300 нм 62 5 5 2 0 0 180 нм 40 5 5 0,4 1 0 500 нм 80-100% 800 нм 20-0% 40,1 5 5 0,4 1 0,1 500 нм 60 5 5 1 1 0 300 нм 65 5 5 0,4 1,5 0 500 нм 66 5 5 0,4 2 0 500 нмRTS,S описан в Международной заявке на патентWO 93/10152, и препарат был изготовлен для вакцинации мышей balb/c. В каждой группе находилось пять животных. 7 групп животных получали следующие препараты: Группа 1(RTS,S - 5 мкг/доза, 3D-MPL 5 мкг/доза,QS21 5 мкг/доза). Животных заражали и брали у них кровь на 15-й день после первой иммунизации и на 7-й день и на 15-й день после второй иммунизации и анализировали на анти-HBSAg подтип антител. Эмульсия SB62 при изготовлении препарата с использованием QS21 и 3D-MPL предпочтительно повышала в синергичной форме ответ антител lgG2a по сравнению с одной эмульсиейSB62. Повышенный ответ антител lgG2a у мышей является мерой способности системы адъювантов стимулировать ответ ТН 1 типа. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Вакцинная композиция, содержащая, по меньшей мере, два антигена в комбинации с адъювантом, который является предпочтительным стимулятором ТН 1 клеточного ответа, отличающаяся тем, что, по меньшей мере, два антигена выбраны из группы, включающей в себя:(а) гибридный белок, содержащий, по существу, весь С-концевой участок CS белка, четыре или более чем четыре тандемных повтора иммунодоминантного района CS белка и поверхностный антиген вируса гепатита В(HBsAg), где CS белок представляет собой белок, окружающий спорозоит, являющийся главным поверхностным белком спорозоита Р.falciparum;(б) родственный тромбоспондину безымянный белок (TRAP) клонированного изолята(в) главный поверхностный белок 1 (MSP1) P.falciparum или P.vivax и белки, обладающие, по меньшей мере, 80% гомологией к нему,и их иммуногенные производные, включая фрагменты. 2. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что адъювант содержит 3 Де-Oацилированный монофосфорил липид A (MPL). 3. Вакцинная композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что адъювант содержит очищенную высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) нетоксичную фракцию сапонина из коры Quillaria Saponaria Molina(QS21). 4. Вакцинная композиция по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что адъювант содержит эмульсию типа масло в воде. 5. Применение вакцинной композиции по любому из пп.1-4 для лечения или предупреждения малярии. 10 6. Применение вакцинной композиции по любому из пп.1-4 в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики малярии. 7. Способ лечения или предупреждения малярии, отличающийся тем, что пациенту, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество вакцинной композиции по любому из пп.1-4.