Лактобациллы с антиоксидантным действием

(71)(73) Заявитель и патентовладелец: КОМПАНИ ЖЕРВЭ ДАНОН (FR) Область применения Изобретение находится в области композиций, содержащих пробиотические бактерии, для применения в профилактике или лечении окислительного стресса. Предшествующий уровень техники Все живые существа поддерживают восстановительную среду в своих клетках. Однако из-за аэробного метаболизма, обеспечиваемого митохондриями, и других факторов образуются активные формы кислорода, такие как пероксиды и свободные радикалы кислорода. Восстановительная среда поддерживается ферментами, такими как супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионпероксидаза. Если нормальное состояние окисления-восстановления нарушено, активные формы кислорода могут повредить все компоненты клетки, включая белок, липиды и особенно ДНК. Этот дисбаланс между образованием активных форм кислорода и способностью детоксифицировать реактивные интермедиаты или устранить повреждения, вызванные активными формами кислорода, называется окислительным стрессом. У людей окислительный стресс является важным фактором процесса старения и дегенеративных заболеваний, связанных с процессом старения, таких как онкологические заболевания, артрит, диабет,атеросклероз, заболевание Лу Герига, болезнь Паркинсона, сердечная недостаточность, болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона. Свободнорадикальная теория старения утверждает, что организмы стареют вследствие того, что клетки со временем накапливают повреждения, вызванные активными формами кислорода. В данной области известно несколько штаммов молочнокислых бактерий с антиоксидантными свойствами. Например, в US 6884415 описан антиоксидантный пищевой продукт, полученный посредством ферментирования пищевого продукта, содержащего штамм L. Plantarum, обладающий Mnкаталазной активностью в присутствии марганецсодержащего натурального вещества. Антиоксидантные свойства этого штамма зависят от присутствия марганца. В WO 03/002131 описан штамм L.fermentumstrain (ME-3) и его применение в качестве антиоксидантного пробиотика. В WO 00/20013 описано применение штаммов Lactobacillus или Propionibacterium, вызывающих увеличение количества пропионовой кислоты в кишечнике для уменьшения уровня факторов окислительного стресса, таких как ИЛ-6, активные формы кислорода и молекулы адгезии. Предпочтительным штаммом, описанным в этот документе,является Lactobacillus plantarum 299v. Ikeda et al, (2007, AEM 73:6404-6409) сравнивали жизненный цикл и устойчивость к Salmonella червей С. Elegans, вскормленных молочнокислыми бактериями (lactobacilli иbifidobacteria) с червями, вскормленными Escherichia coli OP50 (стандартная пища для С. elegans). Они сообщили, что все протестированные лактобактерии или бифидобактерии оказывают сходный эффект на увеличение срока жизни и устойчивости к Salmonella при сравнении с Е. coli OP50. Однако эффект молочнокислых бактерий на червей, подвергавшихся окислительному стрессу, не оценивался. Сущность изобретения Авторы изобретения протестировали эффект молочнокислых бактерий на С. elegans, подвергавшихся окислительному стрессу, по сравнению с контрольным питанием Е. coli. Они выявили, что в противоположность тому, что наблюдали Ikeda et al. относительно срока жизни только небольшое количество специфических штаммов Lactobacillus избежали повреждающих эффектов этого заданного окислительного стресса. Настоящее изобретение, таким образом, представляет штаммы Lactobacillus, выбранные авторами изобретения на основе их способности смягчать оказываемые на С. elegans эффекты окислительного стресса, вызванного пероксидом водорода (Н 2 О 2), для применения в качестве антиоксиданта при введении in vivo индивидууму, и таким образом для лечения, смягчения или профилактики состояний, связанных с окислительным стрессом, или клинических проявлений. Штаммы Lactobacillus, идентифицированные авторами изобретения, являются особенно подходящими для получения антиоксидантных композиций для введения, особенно в форме пищи или пищевых добавок, млекопитающим, в частности, людям, подвергающимся окислительному стрессу, таким как пожилые люди, сменные рабочие, студенты во время экзаменационных сессий, пожарные, лица, подвергающиеся радиации или загрязнению воздуха. Подходящую целевую группу составляют особенно пожилые люди, вследствие того, что подверженные старению кишечник и иммунная система склонны к менее эффективному сопротивлению окислительному стрессу и образованию ROS. Штаммы Lactobacillus по настоящему изобретению, таким образом, особенно являются подходящими для улучшения качества жизни пожилых людей посредством воздействия питанием. Подробное описание изобретения Штаммы Lactobacillus Три конкретных штамма Lactobacillus, выбранных авторами данного изобретения описаны ниже. Первый штамм является Lactobacillus casei DN 114 001, который был зарегистрирован по Будапештскому соглашению в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, 25 Rue du DocteurRoux, Paris) 30 декабря 1994 года под номером I-1518. Подробные характеристики этого штамма описаны в РСТ заявке WO 96/20607. Второй штамм является Lactobacillus rhamnosus DN 116 010, который был зарегистрирован по Будапештскому соглашению в CNCM 19 ноября 2006 года под номером I-3690. Подробные характеристики этого штамма описаны в РСТ заявке WO 2009/122042. Третьим штаммом является Lactobacillus rhamnosus DN 116 063, который был зарегистрирован по Будапештскому соглашению в CNCM 16 декабря 2009 года под номером I-4271. Этот штамм был идентифицирован как принадлежащий к L. rhamnosus на основе как ПЦР типирования, так и биохимической активности набором API 50 CHL (Biomerieux, france). В соответствии с результатами Api 50CHL штаммI-4271 ферментирует следующие сахара и спирты: рибоза, галактоза, D-глюкоза, D-фруктоза, D-манноза,L-сорбоза, рамноза, маннит, сорбит, метил-D глюкозид, N-ацетилглюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлюлоза, мальтоза, лактоза, сахароза, трегалоза, мелицитоза, бета-генциобиоза, Dтураноза, D-тагатоза, глюконат. Настоящее изобретение также относится к применению мутантных штаммов или генетически трансформированных штаммов, полученных из одного из родительских штаммов CNM I-1518, I-3690 и I4271, и все еще обладающих антиоксидантной активностью (т.е. обладающих способностью смягчать оказываемые на С. elegans эффекты окислительного стресса, вызванного Н 2 О 2), для антиоксидантных целей. Эти мутантные или генетически трансформированные штаммы, где был(и) мутирован(ы)один или несколько эндогенный(ых) ген(ов) родительского штамма, например, чтобы модифицировать некоторые из его метаболических свойств (например, его способность ферментировать сахара, его устойчивость к кислоте, его выживаемость в желудочно-кишечном тракте, его последующее окисление или продукцию метаболитов). Кроме того, они могут быть штаммами, полученными в результате генетической трансформации родительского штамма одним или несколькими соответствующим(и) геном(ами), например,чтобы придать указанному штамму дополнительные физиологические свойства, или для создания возможности экспрессировать белки для терпевтических или вакцинальных целей, которые хотят придать указанным штаммам. Кроме того, настоящее изобретение относится к новому штамму I-4271, а также мутированным или генетически трансформированным штаммам, полученным, как описано выше. Предпочтительно, эти мутанты или генетически трансформированные клетки все еще обладают антиоксидантными способностями штамма I-4271. Композиции Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим один или несколько штаммов Lactobacillus CNCM I-1518, I-3690 и I-4271, или мутантные или генетические трансформированные штаммы, полученные из них; для применения в качестве антиоксиданта при введении индивидууму in vivo. В композициях по изобретению, указанные штаммы Lactobacillus можно использовать в форме целых бактерий, которые могут быть живыми или неживыми. Альтернативно, их можно использовать в форме бактериального лизата или в форме бактериальных фракций; бактериальные фракции, подходящие для такого применения, могут быть выбраны, например, посредством тестирования их свойств смягчения оказываемых на С. elegans эффектов окислительного стресса, вызванного пероксидом водорода(Н 2 О 2). Композиции по изобретению могут быть в любой форме, подходящей для введения, в частности,для перорального введения. Это включает, например, твердые вещества, полутвердые вещества, жидкости и порошки. Жидкие композиции главным образом являются предпочтительными для более легкого введения, например, в виде напитков. Когда бактерии находятся в форме живых бактерий, композиция может, как правило, содержать от 105 до 1013 колониеобразующих единиц (КОЕ), предпочтительно по меньшей мере 106 КОЕ, более предпочтительно по меньшей мере 107 КОЕ, еще более предпочтительно по меньшей мере 108 КОЕ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 109 КОЕ на г сухой массы композиции. В случае жидкой композиции это соответствует, как правило, от 104 до 1012 колониеобразующих единиц (КОЕ), предпочтительно по меньшей мере 105 КОЕ, более предпочтительно по меньшей мере 106 КОЕ, еще более предпочтительно по меньшей мере 107 КОЕ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 109 КОЕ/мл. Примерами композиций по изобретению являются питательные композиции, включающие пищевые продукты и, в частности, молочные продукты. Введение в форме ферментированного молочного продукта придает дополнительное преимущество пищевому продукту, обеспечивая более низкий окислительно-восстановительный потенциал, что не только является преимуществом для роста и выживания штаммов Lactobacillus, но также и для дальнейшего лечения и/или профилактики окислительного стресса у людей, потребляющих этот продукт. Питательные композиции по изобретению также включают пищевые добавки и продукты здорового питания. "Пищевая добавка" дает название продукту, полученному из соединений, как правило, применяемых в продуктах питания, но которые находятся в форме таблеток, порошка, капсул, микстур или в любой другой форме, как правило, не ассоциируемых с продуктами питания, и которые производят положительное воздействие на здоровье. "Продукт здорового питания" является продуктом питания, который также оказывает положительное воздействие на здоровье. В частности, пищевые добавки и продукты здорового питания могут производить физиологический эффект - защитный или лечебный - против заболевания, например, против хронического заболевания. Другими примерами композиций по изобретению являются фармацевтические или косметические композиции. Композиции по изобретению могут также содержать один или несколько других штамм(ов) молочнокислых бактерий, пробиотических или нет, например, один или несколько бактериальный(ые) штамм(ы), выбранный(ые) из рода Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, и Bifidobacteria. В частности,этот (эти) другой(ие) штамм(ы) могут включать один или несколько штамм(ов) Streptococcus thermophilus и/или один или несколько штамм (ов) Lactobacillus bulgaricus. Применение Штаммы Lactobacillus и композиции по настоящему изобретению пригодны для защиты от окислительного стресса и/или для профилактики повреждения, наносимого окислительным стрессом. Таким образом, их можно использовать в качестве антиоксиданта для введения при лечении или профилактике заболеваний, связанных с окислительным стрессом. Они предпочтительно вводятся людям, в частности людям, страдающим от окислительного стресса,более предпочтительно пожилым людям, и сменным рабочим, студентам во время экзаменационных сессий, пожарным и индивидуумам, подвергающимся радиации и/или воздушному загрязнению. Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу лечения, облегчения или предупреждения состояния, связанного с окислительным стрессом у нуждающегося в этом индивидуума, где указанный способ включает введение указанному индивидууму штамма Lactobacillus или композиции по изобретению. Особенно в соответствующей целевой группе находятся пожилые люди ввиду того, что кишечник пожилых людей и стареющая иммунная система склонны к менее эффективной сопротивляемости окислительному стрессу и образованию ROS. Кроме того, окислительный стресс является важным фактором старения: теория свободных радикалов утверждает, что организмы стареют вследствие того, что в клетках со временем накапливаются повреждения, вызванные активными формами кислорода. Таким образом, штаммы Lactobacillus по настоящему изобретению являются особенно подходящими для повышения качества жизни пожилых людей посредством нутритивной терапии. Пожилыми людьми являются люди в возрасте 55 лет или старше, в частности в возрасте 65 лет или старше. У людей окислительный стресс также является важным этиологическим фактором при дегенеративных заболеваниях, таких как онкологическое заболевание, артрит, диабет, атеросклероз, болезнь Лу Герига, болезнь Паркинсона, сердечная недостаточность, болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона. Таким образом, штаммы и композиции по настоящему изобретению предпочтительно вводятся людям,страдающим от и/или подвергающимся риску заболевания, выбранного из группы, состоящей из онкологического заболевания, артрита, диабета, атеросклероза, болезни Лу Герига, болезни Паркинсона, сердечной недостаточности, болезни Альцгеймера и болезни Хантингтона. Пример 1. Действие молочнокислых бактерий на выживаемость C. elegans с или без окислительного стресса в жидких средах. Проводили эксперименты с мутированным штаммом С. Elegans (ВА 17 fem-l(hc17), который не является фертильным при 25 С, но сохраняет характеристики продолжительности жизни дикого типа. Червей ВА 17 синхронизировали посредством выделения яиц беременных взрослых особей при 20 С, инкубирования яиц в течение ночи в среде М 9 (10 об% MRS, фтордезоксиуридин 110 мкг/мл) плюс 5 мкг/мл холестерина и посредством помещения червей на этапе L1 в лунки планшета для микротитрования. Червей выращивали без стимуляции в течение трех суток при 25 С и относительной влажности 80-85%. Эти личинки переносили в чашку, содержащую среду М 9 плюс холестерин, и инкубировали в течение 3 суток при 25 С и влажности 80-85% пока проводили контроль или экспериментальное вскармливание. В лунке по меньшей мере было 50 червей. Через 3 суток, когда черви достигли стадии взрослого насекомого, применили окислительный стресс посредством добавления пероксида водорода (H2O2) в концентрации 5 мМ. В качестве контроля применяли отсутствие Н 2 О 2. Антиоксидантной устойчивостью считалась жизнеспособность, оцененная после 5 ч посредством микроскопии. Червей инкубировали в этих условиях в течение 5 ч. Для оценки антиоксидантной способности червей считали мертвыми (подверженными стрессу), если они были парализованы. Червей вскармливали 4106 КОЕ/мл стандартного корма Е. coli OP50, или других штаммов молочнокислых бактерий, принадлежащих к роду Bifidobacterium, Lactobacillus или Streptococcus. Канамицин,30 мг/мл, добавляли для предотвращения роста Е. coli OP50 или протестированных молочнокислых бактерий во время анализа. Выживаемость в отсутствие окислительного стресса В отсутствие окислительного стресса во время инкубации жизнеспособность червей, вскармливаемых Е. Coli, варьировала от 100 до приблизительно 90%. Молочнокислые бактерии давали сходные или лучшие коэффициенты выживаемости, что является показателем сходной или повышенной продолжительности жизни, как представлено в таблице 1 для некоторых протестированных штаммов. Таблица 1. Эффект вскармливания молочнокислыми бактериями на продолжительность жизни С. elegance Эти данные находятся в соответствии с данными Ikeda et al. (2007, цитировано выше). Выживаемость в условиях окислительного стресса Эффект 99 штаммов молочнокислых бактерий на выживаемость в условиях окислительного стресса тестировали с 2, 3 и 5 мМ Н 2 О 2. В присутствии 5 мМ Н 2 О 2 жизнеспособность в присутствии Е. coli ОР 50 составляла приблизительно 93% по сравнению с отсутствием стресса. Это является показателем 93% защиты от окислительного стресса. В таблице 2 ниже представлен эффект выбранных молочнокислых бактерий на защиту от окислительного стресса, с защитным эффектом, оказанным контролем Е. coli OP50, принятым в качестве контрольного уровня за 100%. Таблица 2. Уровень защиты от оказываемого 5 мМ H2O2 окислительного стресса,придаваемой молочнокислыми бактериями по сравнению с Е. coli OP50 Из таблицы 2, представленной выше, можно заключить, что штаммы Bifidobacterium не придавали устойчивость к окислительному стрессу, и, что удивительно, только несколько штаммов Streptococcus иLactobacillus были способны придавать устойчивость к окислительному стрессу на уровне выше контрольного штамма. Штаммы, повышающие жизнеспособность в отсутствие окислительного стресса, необязательно являлись штаммами, также придававшими наилучшую защиту от окислительного стресса. Это указывает на то, что улучшенный эффект кисломолочных бактерий на жизнеспособность, как оказывается, не коррелирует с воздействием на окислительный стресс. Эти результаты также показывают, что антиоксидативный эффект является весьма специфическим, и что фактически только очень небольшое количество штаммов Streptococcus и Lactobacillus обладает способностью снижать воздействие окислительного стресса in vivo. Пример 2. Эффект выбранных штаммов молочнокислых бактерий на устойчивость к окислительному стрессу C. elegans дикого типа, выращенных на чашках с агаром. С. elegans дикого типа (N2) выращивали на чашках с агаром NG в течение 5 суток с линиями Е. coliOP50 или с линиями штаммов молочнокислых бактерий из примера 1, и инкубировали с 3 мМ Н 2 О 2 в течение 5 часов. Жизнеспособность оценивали непосредственно до и после 5-часового инкубирования и% выживаемости в условиях окислительного стресса определяли посредством определения % червей,которые умерли во время инкубации. Результаты представлены в таблице 3. Кроме того, при анализе чашек с агаром вместо лунок специфические штаммы молочнокислых бактерий представлены для проявления защитного эффекта от окислительного стресса, но все штаммы, протестированные в примере 3,оказались эффективными. Из 99 штаммов эффективными были 3 штамма Lactobacillus,10C, 11D и 3 Е. Штамм 10 С является Lactobacillus rhamnosus DN 116 063 (CNCM I-4271), штамм 11D является Lactobacillus rhamnosus DN 116 010 (CNCM I 3690) и штамм ЗЕ является Lactoabcillus casei DN 114 001 (CNCM1518). Ни один из протестированных штаммов Streptococcus (S2B, S1E и SID) не был способен к защите от окислительного стресса на уровне выше Е. coli OP50. Таблица 3. Уровень защиты от 5 мМ Н 2 О 2 окислительного стресса, придаваемой молочнокислыми бактериями, относительно защиты, придаваемой Е. coli OP50, на чашках с агаром Пример 3. Ферментированный молочный продукт. Концентрированный лиофилизированный препарат Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4271 получали,как известно в данной области. Питьевой йогурт получали, как известно в данной области, посредством ферментирования молока. В конце процесса производства питьевого йогурта L. rhamnosus CNCM I-4271 добавляли до конечной концентрации приблизительно 5108 КОЕ/мл. Продукт хранили при приблизительно 7 С. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение штамма Lactobacillus, способного снижать оказываемое на Caenorhabditis elegans воздействие окислительного стресса, вызванного пероксидом водорода, где указанный штамм представляет собой штамм Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690, в качестве антиоксиданта для лечения, профилактики или смягчения состояния, связанного с окислительным стрессом у нуждающегося в этом индивидуума. 2. Применение штамма Lactobacillus, способного снижать оказываемое на Caenorhabditis elegans воздействие окислительного стресса, вызванного пероксидом водорода, где указанный штамм представляет собой штамм Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4271, в качестве антиоксиданта для лечения, профилактики или смягчения состояния, связанного с окислительным стрессом у нуждающегося в этом индивидуума. 3. Применение композиции, содержащей штамм Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690, или штаммLactobacillus rhamnosus CNCM I-4271, или оба указанных штамма, в качестве антиоксиданта для лечения,-6 024911 профилактики или облегчения состояния окислительного стресса у нуждающегося в этом индивидуума. 4. Применение по п.1, 2 или 3, где индивидуум выбран из пожилых людей, сменных рабочих, студентов во время экзаменационных сессий, пожарных, индивидуумов, подвергнувшихся радиации и/или воздушному загрязнению. 5. Применение по любому из пп.1-4, где состояние, связанное с окислительным стрессом, выбрано из злокачественного новообразования, артрита, диабета, атеросклероза, болезни Лу Герига, болезни Паркинсона, сердечной недостаточности, болезни Альцгеймера и болезни Хантингтона. 6. Применение по любому из пп.3-5, где композиция является жидким продуктом. 7. Применение по любому из пп.3-6, где композиция является молочным продуктом. 8. Применение по любому из пп.3-7, где композиция является ферментированным продуктом. 9. Применение по любому из пп.3-8, где композиция содержит от 105 до 1013 КОЕ/г сухой массы указанного штамма Lactobacillus rhamnosus. 10. Штамм Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4271, используемый в качестве антиоксиданта. 11. Композиция, содержащая штамм по п.10, используемая в качестве антиоксиданта.