Вакцинная композиция, содержащая трансформирующий фактор роста альфа

006240 Область техники Настоящее изобретение относится к области иммунологии и медицины человека, в частности, к вакцинному препарату, способному вызывать реакцию иммунологического подавления против аутологичного TGF. Данная вакцина может применяться для лечения некоторых злокачественных опухолей и других связанных с TGF заболеваний. Предшествующий уровень техники Трансформирующий фактор роста (TGF) представляет собой полипептид из 50 аминокислот,впервые выделенный из кондиционированной среды трансформированных ретровирусов клеток. Вначале он был определен как молекула, способная конкурировать с эпидермальным фактором роста (EGF) за связывание EGF-R. Однако антитела против EGF не распознавали TGF (Todaro et al. (1976), Nature 264,26-31), что привело к выводу, что они представляли собой различные в иммунологическом смысле сущности.TGF принадлежит к семейству EGF. В состав данного семейства входят структурно и функционально родственные белки. Другими членами данного семейства являются EGF, амфирегулин (AR),криптол (CR1), гепаринсвязывающий EGF, бетацеллюлин, эпирегулин. С другой стороны, родственныеEGF белки включает семейство поксвирусов. Среди них наиболее охарактеризованным является фактор роста вируса коровьей оспы (VGF) . Все указанные молекулы связывают и активируют EGF-R, поскольку они известны как лиганды этого рецептора. Данная система играет роль при росте нормальных клеток и клеток неоплазий. EGF-R является гликопротеином массой 170 кДа, ген которого был клонирован, и была определена его последовательность. Внутриклеточный домен этого рецептора ассоциирован с тирозинкиназной белковой активностью. Данные белки характеризовались структурной гомологией по отношению к продукту онкогенаv-erb-B, что является подтверждением взаимоотношений между процессом неопластической трансформации и данными молекулами (Heldin C.H. (1984), Cell 37, 9-20.)TGF синтезируется в виде трансмембранного предшественника (пpo-TGF) длиной 160 аминокислот. Зрелый TGF, растворимый полипептид длиной 50 аминокислот, высвобождается путем протеолитического расщепления. Человеческий TGF (hTGF) характеризуется 43%-ной идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к человеческому EGF (hEGF) и 93%-ной идентичностью в отношении мышиного или крысиного TGF. Кроме того, их биологическое действие не является видоспецифическим. При работе многих лабораторий была задокументирована способность TGF регулировать пролиферацию, миграцию и дифференцировку культивируемых клеток (Carpenter and Wahl. (1990), SpringerVerlag, Berlin, pp.69-171).TGF является наиболее широко распространенным лигандом EGF-R. Он экспрессируется в нормальных тканях во время эмбриогенеза и в нормальных и опухолевых тканях у взрослых. Однако у нокаут-мышей по TGF не было выявлено значимых патологических дефектов, и эти мыши были жизнеспособными и фертильными (Bruce Mann and cols. (1993), Cell, 73, 249-261). В процессе опухолеобразования нарушение регуляции паракринных и аутокринных процессов активации EGF-R происходит вследствие положительной регуляции экспрессии факторов роста или повышенного синтеза или мутации их рецепторов. В эпителиальных опухолях были детектированы высокие уровни EGF-R. Во многих случаях избыточная экспрессия данного рецептора служила индикатором неблагоприятного прогноза. Частым событием при злокачественной трансформации является индукция экспрессии TGF. Фактически в многочисленных исследованиях была выявлена избыточная экспрессия данной молекулы при неоплазиях эпителиального происхождения; как сообщалось, это явление имело место в случае опухолей молочной железы, легких, головного мозга, печени, предстательной железы, мочевого пузыря, желудочно-кишечного тракта, толстой кишки, яичников, вульвы и эндокринных тканей среди прочих. Хотя механизм, по которому TGF индуцирует опухолеобразование, остается неизвестным, имеется несколько сообщений, согласно которым избыточная экспрессия этого фактора роста коррелирует со степенью развития опухоли, выживанием опухоли и другими признаками опухоли. Кроме того, некоторыми исследователями продемонстрирована его взаимосвязь с другими онкогенами, такими как с-mус при гепатокарциномах. TGF также составляет мишень для гена-супрессора опухоли Гиппеля-Линдау(VHL) (суммировано Lee et al. (1996), Growth Factors and Cytokines in Health and Disease, Volume 1B, 277318). Хотя TGF и EGF связывают один и тот же рецептор со сравнимыми значениями аффинности,TGF в общем является более сильнодействующим, чем EGF, и в некоторых контекстах, его эффекты,как описано, являются более мощными и/или более длительными (Barrandon and Green (1987), Cell 50,1131-1137). Сообщалось, что в случае интернализации комплекса TGF/EGF-R, TGF и EGF-R преимущественно возвращались обратно на клеточную поверхность, тогда как при интернализации в клетках того же типа комплекса EGF/EGF-R оба его компонента подвергались эффективной деградации (Ebnerand Derynck (1991), Cell Regul.2, 599-612). Эти результаты указывали на то, что различия в биологической активности каждого фактора роста могут иметь место вследствие различий в механизмах внутриклеточного транспорта и обмена. С другой стороны, TGF является более мощным ангиогенным фактором, чем EGF (Schreiber et al. (1986), Science 232, 1250-1253.) Касательно экспрессии в опухолях имеются доказательства присутствия предшественника EGF в мембранах некоторых эпителиальных опухолей, но TGF является наиболее экспрессированным в эпителиальных опухолях, и его действие, в отличие от EGF, находится в аутокринных отношениях с EGF-R. С другой стороны, результаты, полученные в центре, где работают авторы настоящего изобретения, указывают на то, что в некоторых биопсиях эпителиальных опухолей экспрессировался TGF и отсутствовал EGF (карцинома протока молочной железы, карцинома гортани), в то время как в других опухолях присутствовало больше EGF, чем TGF (немелкоклеточный рак легких (NSCLC. Данные результаты указывают на то, что факторы роста могут иметь различный вклад в опухолевую биологию различных неопластических клеток. Все подтверждения взаимосвязей между системой EGF-R/EGF-R-лиганды и злокачественными опухолями, накопленные за эти годы, делают эту систему очень привлекательной мишенью для иммунотерапии злокачественных опухолей. Предыдущие результаты, полученные в группе авторов настоящего изобретения, продемонстрировали возможность разработки активной иммунотерапии злокачественных опухолей вакциной, основанной на EGF. Фактически были получены предклинические и клинические подтверждения иммуногенности и низкой токсичности, вызванной вакцинацией hEGF, связанным с белком-носителем (Gonzalez et al.(1996), Vaccine Research 5(4), 233-243.) Предклинические исследования показали, что иммунизация мышей hEGF в адъюванте повышает выживаемость мышей с асцитной опухолью Эрлиха (EAT) (Gonzalez et al. (1996), Vaccine Research 5(4),233-243.). Продуцировали белок слияния hEGF и P64k. Данный белок содержит последовательность hEGF,вставленную между аминокислотами 45/46 P64k. Данный белок слияния используется для иммунизации мышей, что вызывает специфический гуморальный иммунный ответ против hEGF. Генерируемый иммунный ответ способствует увеличению продолжительности жизни мышей, несущих EAT (Gonzalez andcols (1997), Vaccine Research 6(2), 91-100). В двух пилотных клинических испытаниях пациентов с NSCLC наблюдали тенденцию к увеличению выживания вакцинируемых пациентов по сравнению с историческим контролем. У пациентов с высокой степенью антительного ответа против hEGF наблюдали значительное увеличение выживаемости(Gonzalez et al. (1998), Annals of oncology 9, 1-5). В общем, вакцинация EGF не приводит к образованию специфичного антитела против TGF. Однако были получены доказательства того, что вакцинация иммуногенным препаратом, содержащим TGF,на мышиной модели приводит только у некоторых мышей к образованию низких концентраций антител против EGF. Данный ответ антител в некоторых случаях способен блокировать связывание EGF с его рецептором in vitro. Однако полученных концентраций антител против EGF недостаточно для генерирования эффективной реакции иммунологического подавления EGF с участием в противоопухолевом действии. Вследствие того, что действие каждого из данных факторов роста различно в каждой опухоли и/или между первичной опухолью и ее метастазом, вакцина, сочетающая два основных лиганда EGF-R, TGF и EGF, будет в общем смысле оказывать лучшее противоопухолевое действие. До настоящего изобретения не было разработано какого-либо способа терапии, который предполагал бы применение вакцинного препарата, содержащего hTGF любого происхождения или его комбинацию с другим лигандом EGF-R, EGF, при активной иммунотерапии злокачественных опухолей. Описание изобретения Настоящее изобретение относится к вакцинной композиции, которая содержит hTGF или TGF,происходящий из любого источника, связанный генетически (белок слияния) или объединенный химическими способами с белком-носителем, способный ингибировать рост эпителиальных опухолей без неблагоприятных побочных эффектов. Данное действие осуществляется по механизму иммунологического подавления фактора роста. Оно также относится к вакцинной композиции, которая содержит комбинацию hTGF с hEGF или EGF любого происхождения, вместе с белком-носителем. Данная вакцинная композиция может применяться при лечении эпителиальных опухолей, зависимых от TGF или TGF/EGF, или при любых других заболеваниях, ассоциированных с TGF, таких как псориаз (Карр et al (1993) J Dermatol Sci, June;5(3): 133-42). В определение TGF включен любой фрагмент, происходящий от TGF, который имеет те же иммунологические свойства и/или эффекты, сходные с изначальной молекулой. Происходящие от него фрагменты, среди прочих, включают в себя, не исключая при этом иного, оригинальные замены аминокислот, замену конкретных аминокислот, которая повышает стабильность и/или активность, химические модификации.-2 006240 Более конкретно, изобретение состоит из вакцинной композиции, способной вызывать иммунное подавление собственного TGF, что может применяться для лечения некоторых злокачественных опухолей и других заболеваний, имеющих отношение к TGF. С другой стороны, данное изобретение включает в себя применение вакцинного препарата, составленного комбинацией TGF и EGF. Данная вакцина может применяться для лечения неоплазий, которые зависят от данных двух факторов роста в процессе патогенеза. 1 - Иммуногенные препараты: Согласно настоящему изобретению применяемый вакцинный препарат включает в себя hTGF,объединенный с белком-носителем либо способами генной инженерии (белок слияния), либо химическими способами конъюгации. hTGF, применяемый в каком-либо из данных иммуногенных препаратов, может быть рекомбинантным, синтетическим или полученным из природного источника. В качестве носителей могут применяться различные белки. В качестве примеров белков-носителей, среди прочего,могут использоваться столбнячный анатоксин, KLH и белок Р 64k из Neisseria meningitidis. Оптимальное количество hTGF в вакцинном препарате колеблется между 5 и 1000 мкг на дозу. С другой стороны, применяется вакцинный препарат, который содержит комбинацию hTGF сhEGF (Office of National Registration of Medications, HEBERMIN Not 1266). В определение TGF или EGF включен любой фрагмент, происходящий из TGF или EGF, который имеет те же иммунологические свойства и/или эффекты, сходные с изначальной молекулой. Происходящие из него фрагменты, среди прочих, включают, не исключая при этом иного, оригинальные замены аминокислот, замену конкретных аминокислот, которая повышает стабильность и/или активность,химические модификации.A) Получение белка слияния TGF-белок-носитель способами генной инженерии Ген, кодирующий hTGF (500 н.п.), амплифицировали путем полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием специфических праймеров. Полученный в результате фрагмент ДНК расщепляли и клонировали в специфический сайт экспрессирующего вектора, содержащего ген, кодирующий белокноситель. Полученный в результате белок включает в себя единичную или множественные копии обеих молекул. Можно использовать экспрессирующий вектор для клеток млекопитающих, бактерий или дрожжей. Вектор также может включать в себя шесть гистидинов на N-конце белка-носителя. Полученная в результате плазмида подтверждается посредством рестрикционного анализа на агарозном геле, определения последовательности ДНК с использованием Sequenase 2.0 (Amersham-USB) и, наконец, анализа экспрессии белка слияния в любом экпрессирующем штамме Е. coli способом вестерн-блота с использованием специфических моноклональных антител против hTGF (RD System). Для получения белка бактериальные клеточные стенки разрушают с использованием способа интенсивного разрыва и затем белок подлежит очистке путем комбинации способов дифференциальной преципитации сульфатом аммония и хроматографических способов. Наконец, белок фильтруют в стерильных условиях и консервируют при -20 С или лиофилизируют и консервируют при 4 С до его последующего применения.B) Получение химического конъюгата, содержащего hTGF. Получают различные препараты, которые содержат hTGF, конъюгированный с различными белками-носителями (такими как P64k). Могут быть использованы любые способы химической конъюгации. В качестве предпочтительного химического способа применяли способ с использованием агента EMCS,описанный в Северо-Американском патенте, патенте США 4302386; Lee et al., 1981. Альтернативно, может использоваться способ конъюгации с глутаровым альдегидом. В кратком изложении, данные две или три молекулы смешивают до концентрации в конечном растворе, равной 1 мг/мл, с глутаровым альдегидом до 0,05% (в общем растворе). Смесь инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре и затем диализируют против раствора PBS 1x/10 мМ МgСl2. Наконец, проводят диализ против PBS 1x в течение ночи при 4 С. Иммуногенный препарат фильтруют в стерильных условиях и хранят при 4 С до его применения.C) Получение вакцины, в которой скомбинированы hTGF и hEGF. Получение вакцины, в которой скомбинированы два основных лиганда EGF-R, можно проводить различными способами. 1 - Смешивание двух вакцин, которые содержат hTGF или hEGF, раздельно связанные с белкомносителем, в соотношении 1:1 непосредственно в момент инъекции. Для данной цели могут использоваться слитые белки или их химические конъюгаты каждого из факторов роста с белком-носителем. Оптимальное количество hTGF и hEGF в вакцинном препарате колеблется от 5 до 1000 мкг на дозу. 2 - Получение генетической конструкции, сходной с описанной в разделе А, содержащей оба фактора роста, hTGF и hEGF или комбинацию любых их производных. 3 - Химическое получение химического конъюгата, содержащего hTGF и hEGF или комбинацию любых их производных и белка-носителя с использованием методологии, описанной в разделе В.D) Получение иммуногенного препарата. Для получения требуемого иммуногенного эффекта вакцинной композиции пригодным является-3 006240 применение подходящего адъюванта и выбор пути введения, при котором вакцинный препарат будет проявлять высокую иммуногенность. Вакцинные препараты согласно изобретению получают двумя различными способами: 1) Применение в качестве адъюванта Аl(ОН)3 с получением водных растворов вакцинного препарата, адсорбированных на данном веществе. Для этой цели применяют от 5 до 1000 мкг эквивалента TGF,в разных препаратах связывающегося с Аl(ОН)3 в количестве от 2 до 5 мг. Полученный препарат оставляют при помешивании на 1 ч. Конечный раствор консервируют при 4 С до его последующего применения. 2) Применение неполного адъюванта Фрейнда, который способствует образованию эмульсий масло/вода или вода/масло. Количество белка слияния или химического конъюгата и адъюванта в конечном препарате заключено в интервале от 40/60 до 60/40 (объем/объем). Объемы зависят от того, какая требуется конечная эмульсия. Адъювант добавляют перед иммунизацией и встряхивают препарат в течение 10-30 мин при комнатной температуре. Конечные объемы каждого иммуногенного препарата покрывают подходящий интервал объемов для соответствующего пути введения. В случае комбинированных вакцин, полученных непосредственно в момент инъекции, как было описано в разделе С, две вакцины, смешанные с подходящим адъювантом, как это было описано ранее,могут смешиваться при помешивании и затем инъецироваться или же инъецироваться раздельно. Введение вакцинных композиций может быть осуществлено различными путями: внутримышечным, подкожным, интраназальным или внутрикожным. Примеры Пример 1. Получение сегмента ДНК, кодирующего зрелый TGF, путем полимеразной цепной реакции (PCR) Ген, кодирующий hTGF, амплифицировали путем PCR с использованием в качестве матрицы вектора PSK/TGF (CIGB, Куба). Данная плазмида содержит комплементарную ДНК (кДНК) hTGF, клонированную в сайт EcoR V коммерческого вектора pBluescript KS - (Stragene). Последовательность, кодирующую зрелый TGF (длиной 50 аминокислот (фиг. 1, амплифицировали с использованием описанных выше специфических праймеров:(подчеркнут сайт рестрикции EcoRI) В кратком изложении, 200 нг PSKTGF применяли в 75 мкл смеси, которая содержит 500 нг каждого из специфических праймеров, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов до концентрации 200 мМ каждого,25 мМ МgСl2 и 100 единиц фермента Taq-полимеразы (Promega) в буферном растворе, предоставленномPromega. Следовали протоколу 30 циклов денатурации (1 мин при 94 С), отжига (1 мин при 60 С) и наращивания (30 с при 72 С). Перед первым циклом ДНК денатурировали в течение 4 мин и осуществляли это после последнего цикла; проводили конечное наращивание длительностью 2 мин. Продукт PCR электрофоретически разделяли на агарозных гелях с низкой температурой гелеобразования (LGT) и амплифицированный генный сегмент очищали согласно общепринятым процедурам экстракции фенолом и расщепляли ферментативно с использованием ферментов Хbа I и EcoR I (NEB,USES). Следуя данному протоколу, получали генный сегмент, кодирующий зрелый TGF. Пример 2. Получение экспрессирующего вектора для белка слияния TGF-P64K. Применяли экспрессирующий вектор рМ 92 (CIGB, Куба). Данная плазмида содержит ген IpdA, кодирующий белок P64k из Neisseria meningitidis (штамм В 385) под контролем промотора триптофанового оперона E.coli (ptrp) и транскрипционного терминатора фага Т 4 (tT4). рМ 92 кодирует резистентность к антибиотикам ампициллину и канамицину. Штамм Dam-E.Coli (GC-366) трансформировали рМ 92, и плазмиду очищали с использованием коммерческого набора (Quiagen) по протоколу производителя. Вектор РМ 92 расщепляли и очищали в агарозных гелях LGT. Впоследствии вектор РМ 92 лигировали с ранее полученной кДНК зрелого hTGF с использованием фермента лигазы Т 4 (Gibco BRL). Полученная в результате плазмида pMTGF кодирует белок слияния, который содержит hTGF, вставленный между аминокислотами 45/46 Р 64 к. Данную рекомбинантную плазмиду подтверждали путем рестрикционного анализа в агарозных гелях, определения последовательности ДНК с использованием Sequenase 2.0 (Amersham-USB) и, наконец, путем анализа экспрессии белка слияния в штамме Е. coli MM299 способом вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела, специфичного в отношении hTGF (RDSystem). На фиг. 2 показано схематичное представление способа получения экспрессирующего вектораpMTGF. Данный вектор кодирует белок слияния TGF-P64K. Пример 3. Получение экспрессирующего вектора белка слияния TGF-P64K с шестью гистидинами на N-конце (pMHisTGF). Экспрессирующий вектор pMHisTGF получали, следуя тому же протоколу, что описан в предыдущем примере, с использованием исходного вектора рМ 224, который включает в себя сегмент, коди-4 006240 рующий шесть гистидинов на N-конце P64k. Наличие метки из шести гистидинов дает преимущество при очистке белка по причине усиления связывания с хелатирующей сефарозой, заряженной Сu2+ или другими металлами. Пример 4. Очистка белка слияния (TGF-P64K). Бактерии E.coli (штамм ММ 299), экспрессирующие белок слияния TGF-P64K, выращивали на среде LBA (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl и 50 мг/л ампициллина) в течение 10 ч при 37 С. После сбора клеток все стадии проводили при 0-4 С. Разрушение бактерий достигалось на френч-прессе (French press) при 1500 кг/см 2, и нерастворимую фракцию удаляли путем высокоскоростного центрифугирования в течение 30 мин при 11000 g. На первой стадии очистки проводили преципитацию 40%-ным сульфатом аммония для удаления части белков E.coli. Полученный в результате осадок удаляли путем дальнейшего центрифугирования при 4 С в течение 30 мин при 11000 g. Надосадочную жидкость фракционировали путем хроматографии, основанной на гидрофобных взаимодействиях (TSKбутил, Pharmacia, Швеция), с нисходящим градиентом сульфата аммония от 40 до 0% в буфере Tris-Cl,рН = 7,2, содержащим 0,15 М NaCl. Впоследствии полученный в результате образец разделяли путем гель-фильтрации на колонке G200 (Pharmacia), уравновешенной PBS 1x, с достижением конечной чистоты более 95%. Концентрацию белка определяли с использованием колориметрического способа, описанного Lowry et al. (1951) J. Biol. Chem. 191, 495-498. Идентификацию белка слияния проводили по способу вестерн-блоттинга с использованием специфических антител против P64k и TGF. Пример 5. Очистка белка слияния (HisTGF-P64k). Бактерии E.coli (штамм ММ 299), экспрессирующие белок слияния TGF-P64K, выращивали на среде LBA (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl и 50 мг/л ампициллина) в течение 10 ч при 37 С. После сбора клеток все стадии проводили при 0-4 С. Разрушение бактерий достигалось на френч-прессе (French press) при 1500 кг/см 2, и нерастворимую фракцию удаляли путем высокоскоростного центрифугирования в течение 30 мин при 11000 g. На первой стадии очистки проводили преципитацию 40%-ным сульфатом аммония для удаления части белков E.coli. Полученный в результате осадок удаляли путем дальнейшего центрифугирования при 4 С в течение 30 мин при 11000 g. Надосадочную жидкость фракционировали путем хелатирующей аффинной хроматографии (хелатирующая сефароза для быстрого потока [Chelating Sepharose Fast Flow], Pharmacia, Швеция), основываясь на наличии в белке шести гистидинов, в восходящем градиенте имидазола от 25 до 500 мМ в буфере Tris-Cl, рН = 5,5,содержащем 0,5 М NaCl. Впоследствии полученный в результате образец пропускали через колонку G25 для гель-фильтрации (Pharmacia), уравновешенную PBS 1x для удаления солей, достижения степени чистоты, равной 95%. Концентрацию белков определяли с использованием колориметрического способа,описанного Lowry et al. (1951) J. Biol. Chem. 191, 495-498. Идентификацию белка слияния проводили по способу вестерн-блоттинга с использованием специфических антител против P64k и TGF. Пример 6. Распознавание рекомбинантного белка TGF-P64K моноклональным антителом (Маb),специфичным в отношении hTGF. Для определения того, распознается ли TGF анти-hTGF-Mab (Calbiochem) в системе белка слияния, осуществляли способ вестерн-блоттинга. Электрофоретически разделяли 25 мкг EGF-P64K, TGFP64K или Р 64K в двух полиакриламидных гелях и затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану 0,45-мкм по общепринятым процедурам. После переноса мембраны инкубировали с блокирующим раствором TBS 1x с 5% сухого молока в течение ночи при 4 С. После краткой отмывки TBS 1x - Tween 20(0,05%) мембраны инкубировали следующим образом: одну реплику с антителом против Р 64K (1/500)(фиг. 3 А) и другую с анти-TGF-Mab (1/100) (фиг. 3 В) в течение 2 ч при комнатной температуре. Впоследствии проводили 3 отмывки тем же раствором и мембраны инкубировали меченными щелочной фосфатазой козьими иммуноглобулинами против мышиных антител (1/1000) в течение 1 ч в тех же условиях. В конце добавляли 0,004 г ферментного субстрата Fast Net (Sigma) в буфере, содержащем 0,1 МTris-Cl, pH=8,2, 0,004 г нафтол-АСЕ-МХ-фосфата (Sigma) и 400 мкг N,N'-диметилформамида в 20 мл. Реакцию останавливали сходными промывками. Наблюдали специфическое распознавание TGF-P64k моноклональным антителом анти-hTGF-Mab (фиг. 3). Этот результат демонстрирует, что TGF в белке слияния остается структурой, способной быть распознанной специфическим антителом. Пример 7. Получение химически конъюгированного hTGF-P64k. Миллилитр TGF в концентрации 2 мг/мл в PBS/10 мМ МgСl2 смешивали с миллилитром P64k в концентрации 2 мг/мл в том же растворителе. Затем добавляли 0,2 мл 0,5% раствора глутаральдегида до конечного процентного содержания, равного 0,05%. Смесь инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, и диализовали против PBS 1x/10 мМ раствор МgСl2. В конце проводили диализ против PBS 1x в течение ночи при 4 С. Иммуногенный препарат фильтровали в стерильных условиях и хранили при 4 С до его применения. Пример 8. Получение белка слияния между hTGF, hEGF и P64k. Ген, кодирующий hEGF (150 н.п.), амплифицируют путем PCR с использованием плазмиды pBEF 10 в качестве шаблона. Данная плазмида содержит полноразмерный hEGF, клонированный в сайт EcoRV коммерческого вектора pBluescript SK II (Stragene). Полученную ДНК связывают с плазмидойpMHisTGFa в сайте Ваm HI, находящемся на С-конце P64k, с использованием методологии, описанной в примере 2. Таким образом, получают вектор pMTGF-EGF, который кодирует белок слияния ТЕ-Р 64k. Пример 9. Получение химически конъюгированного hTGF-hEGF-P64k. Миллилитр TGF в концентрации 3 мг/мл в PBS/10 мМ МgСl2 смешивают с миллилитром hEGF в концентрации 3 мг/мл и P64k в концентрации 3 мг/мл в том же растворителе. Затем добавляли 0,6 мл 0,5% раствора глутаральдегида до конечного процентного содержания, равного 0,05%. Смесь инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и диализовали против PBS 1x/10 мМ раствор МgСl2. В конце проводили диализ против PBS 1x в течение ночи при 4 С. Иммуногенный препарат фильтровали в стерильных условиях и хранили при 4 С до его применения. Пример 10. Получение препаратов, которые содержат hTGF. Различные иммуногенные препараты, описанные в примерах 2, 3, 7, 8 и 9, смешивают с Аl(ОН)3 или Montanide ISA 51, как это было описано в подробном описании изобретения. Использованные количества составляют 50 мкг hTGF во всех препаратах и 50 мкг hTGF и hEGF в случае комбинированных вакцин, описанных в примерах 8 и 9. 2 мг Аl(ОН)3 использовали в каждом препарате белка слияния или химического конъюгата, содержащего, соответственно, 50 мкг эквивалента hTGF или hEGF. Пример 11. Получение комбинированной вакцины, содержащей белок TGF-P64K и белок EGFP64K. Пятьдесят микрограммов каждого фактора роста в 0,6 мг рекомбинанта смешивают в общем объеме, равном 0,5 мл, с тем же объемом Montanide ISA 51 и встряхивают в течение 10 мин при комнатной температуре перед инъекцией. В случае применения в качестве адъюванта Аl(ОН)3 два препарата, содержащих 0,6 мг каждого белка в 2 мг Аl(ОН)3, смешивают перед инъекцией. Пример 12. Получение комбинированной вакцины, содержащей химически конъюгированныйTGF/P64K и EGF/P64K. Иммуногенный препарат, содержащий 50 мкг hTGF, связанного с P64k, как описано в примере 7, в объеме 0,25 мл смешивают с 0,25 мл равных иммуногенных препаратов, которые содержат hEGF, и смешивают с 0,5 мл Montanide ISA 51, как описано в примере 10, с использованием шприца, в течение периода времени, равного 10 мин, при комнатной температуре. В случае применения Аl(ОН)3 в качестве адъюванта смешивают 0,5 мл каждого из тех химических конъюгатов, что описаны выше, которые содержат 50 мкг hTGF или hEGF, соответственно, адсорбированных на 2 мг Аl(ОН)3. Пример 13. Иммуногенность ТGР-Р 64 К/неполный адъювант Фрейнда (Montanide ISA 51) на мышах в качестве экспериментальных животных. Для демонстрации иммуногенности вакцины мышей Balb/c самок в возрасте от 6 до 8 недель, подвергали подкожной инъекции 58 мг (5 мкг эквивалента TGF), 116 мг (10 мкг) или 0,6 мг (50 мкг) TGFP64k с Montanide ISA 51 в соотношении 1:1. Иммуноген получали, как описано в подробном описании изобретения, и встряхивали в течение 10 мин перед иммунизацией. Каждое животное получало 4 дозы. Кровь отбирали перед иммунизацией через одну неделю, и с этого момента - раз в две недели. От полученной у животных крови отделяли сыворотку и определяли титр специфических антител против hTGF по способу непрямого ELISA. В кратком изложении, планшеты ELISA для микротитрования (COSTAR) покрывали 50 мкл/лунку раствора hTGF в концентрации 2,5 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере с рН=7,2 и инкубировали в течение ночи при 4 С. После трех промывок PBS lx - Tween 20 (0,05%) планшеты блокировали раствором PBS 1x - Tween 20 (0,05%) - SFT (5%) в течение 1 ч при 37 С. Непосредственно после этого добавляли сыворотки иммунизируемых мышей и инкубировали их в течение 2 ч при 37 С. После промывки планшеты инкубировали с меченными щелочной фосфатазой козьими иммуноглобулинами против мышиных антител (Sigma), разведенными (1/1000) в PBS 1x - Tween 20 (0,05%) - SFT (5%) (50 мкл/лунку) в течение 1 ч при той же температуре. Наконец, после промывки добавляли субстрат фермента (паранитрофенилфосфат (Sigma до конечной концентрации, равной 1 мг/мл в буфере диэтаноламина, рН = 9,8 (50 мкл/лунку). Измеряли поглощение образованного фермент-субстратного комплекса при 405 нм на планшетном спектрофотометре для ELISA. На фиг. 4 показана кинетика ответа поливалентных антител против hTGF, полученного у мышей,иммунизированных TGF-P64K. Вследствие высокой гомологии между hTGF и его крысиным или мышиным аналогом (93%) можно считать данный иммунный ответ против hTGF ответом против собственного TGF (мышиного). Пример 14. Иммуногенность TGF-P64K/Al(ОН)3 на мышах в качестве экспериментальных животных. Протокол иммунизации осуществили, как это было описано в предыдущем примере, с использованием 2 мг Аl(ОН)3 в качестве адъюванта. Иммуногенный препарат был подготовлен, как описано в под-6 006240 робном описании изобретения. Для TGF получали титры антител вплоть до 1/10000. Способом, использованным для определения титров антител, являлся непрямой ELISA, описанный в примере 13. Пример 15. Распределение субклассов IgG у мышей, иммунизированных белком ТGРР 64 к/неполным адъювантом Фрейнда (Montanide ISA 51) с использованием мышей в качестве экспериментальных животных. Распределение субклассов IgG определяли способом непрямого ELISA, описанным в примере 13, с использованием специфической антисыворотки против различных субклассов IgG, конъюгированных с биотином (Jackson), разведенной до (1/1000), и затем с использованием комплекса стрептавидинфосфатазы (1/1000). Долю каждого подкласса IgG определяли по отношению к общему IgG в сыворотке иммунизированных животных. Животных иммунизировали 50 мкг TGF в белке слияния с использованием подкожного (группа 1) или внутримышечного (группа 2) пути, следуя протоколу иммунизации, описанному в примере 13. На фиг. 5 можно видеть полученное распределение субклассов. Большая доля IgGl была получена в обоих группах мышей, использованных в данном исследовании. Пример 16. Определение способности сывороток животных, иммунизированных белком ТGРР 64k/неполным адъювантом Фрейнда (Montanide ISA 51), ингибировать связывание I125-TGF способом радиорецепторного анализа (RRA). Для определения того, способны ли антитела, полученные согласно протоколу иммунизации, описанному ранее, ингибировать связывание TGF с его рецептором, in vitro осуществляли способ, называемый RRA. В кратком изложении, сыворотки иммунизированных мышей, полученные, как это описано в примере 13, инкубировали со смесью, которая содержала 100 мл человеческой плацентарной мембраны и 20 мл I125-TGF (100000 импульсов/мин) и 330 мл буфера: 10 мМ Tris-Cl, 10 мМ МgС 12 и BSA до 1%,рН=7,4. TGF связывали с 125I-радиоизотопом с использованием способа хлорамина Т (Hunter andGreenwood, 1962, Nature, 358:495-498). Смесь инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и реакцию останавливали 1 мл указанного ранее буфера. Наконец, пробирки центрифугировали при 1000 об./мин в течение 30 мин. Осадки промывали и давали им высохнуть. Радиоактивность измеряли счетчиком гамма-излучения (Wallac, Финляндия). Снижение измеренных значений радиоактивности означает ингибирование связывания между TGF и его рецептором за счет действия тестируемых сывороток. Среди всех тестируемых сывороток был получен интервал 50-80% ингибирования. Пример 17. Определение гуморального ответа против человеческого EGF (hEGF), полученного путем иммунизации белком TGF-P64k. Наличие антител против EGF определяли в сыворотках мышей, которые характеризовались высокими титрами антител против TGF с использованием описанного способа непрямого ELISA. Разведения сывороток 1/100, 1/1000 1/10000 добавляли в планшеты, покрытые hEGF (CIGB). На фиг. 6 показаны титры антител против EGF, полученные в сыворотке мышей, иммунизированных белком TGF-P64k. Положительные реакции против EGF были получены только в группе иммунизированных мышей. Однако мыши, иммунизированные только одним химическим конъюгатом EGF-P64K, не характеризовались каким-либо уровнем антител против TGF. Пример 18. Распознавание человеческих опухолей in vitro поликлональной антисывороткой противhTGF, полученной путем иммунизации белком ТGF-Р 64k/неполным адъювантом Фрейнда (MontanideISA 51). Поликлональные антисыворотки против hTGF, полученные при иммунизации мышей белкомTGF-P64k в Montanide ISA 51, использовали для определения экспрессии TGF в биопсиях опухолей,включенных в парафин. Данные биопсии получали от пациентов, вакцинированных вакциной, основанной на EGF. У пациента с высоким ответом антител против hEGF наблюдали регрессию опухоли NSCLC. Однако позже детектировали вторую опухоль в гортани. Анализировали биопсии данных двух опухолей,и наблюдали различную экспрессию EGF и TGF в каждой из них. На фиг. 7 показаны значения реактивности, полученные с различными антителами. Данные результаты подтверждают тот факт, что иммунизация вакцинным препаратом, содержащим TGF-P64k, вызывает образование специфических антител против hTGF, способных распознавать данную молекулу в опухолях человека. Пример 19. Экспрессия мРНК EGF, TGF и EGF-R в биоптатах карциномы молочной железы. Матричную рибонуклеиновую кислоту (мРНК) выделяли из биоптатов опухоли карциномы молочной железы с использованием реагента TRIZOL (Life technologies) и преобразовывали в кДНК посредством фермента обратной транскриптазы. Общую кДНК подвергали 30 циклам PCR с использованием специфических праймеров для каждой из этих молекул. В качестве внутреннего контроля использовали ген домашнего хозяйства (GAPDH). Полученные продукты PCR разделяли электрофоретически на 1,5% агарозном геле и визуализировали этидий-бромидом. На фиг. 8 показаны результаты, полученные с использованием специфических праймеров для EGF,TGF, EGF-R и GAPDH (внутренний контроль) в 22 карциномах молочной железы. мРНК EGF наблюдали только в 1/22 биоптатах, однако в большинстве образцов наблюдали высокий уровень экспрессии мРНК TGF и EGF-R. Высокая корреляция между экспрессией двух этих молекул указывает на значимость аутокринной связи TGF/EGF-R в разрастании опухолей данного типа (фиг. 9). Краткое описание фигур Фиг. 1 - генная и аминокислотная последовательность (буквы выделены жирным шрифтом) зрелогоhTGF. Фиг. 2 - схематичное представление способа получения экспрессирующего вектора pMTGF. Фиг. 3 - распознавание белка слияния TGF-P64K Mab против Р 64 К (А) и Маb против hTGF (В) по способу вестерн-блоттинга. 10% SDS-PAGE проводили для Р 64K (1), EGF-P64K (2) и TGF-P64K (3). Затем белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали со специфическими антителами против Р 64K (А) или TGF (В) с целью идентификации белка слияния между TGF и Р 64K. Фиг. 4 - кинетика ответа антител против hTGF. Титры специфических антител против hTGF измеряли способом непрямого ELISA. Мышей иммунизировали 5 мкг (А), 10 мкг (В) и 50 мкг (С) эквивалента hTGF в белке TGF-P64K, смешанном с Montanide ISA 51. На оси X обозначены сутки, когда собирали образцы у каждой мыши, а на оси Y - соответствующий достигнутый титр антител. Сутки иммунизации обозначены стрелками на графике А (сутки 0, 14, 28 и 42). Фиг. 5 - распределение субклассов IgG, индуцированное иммунизацией 50 мкг эквивалента TGF в белке слияния. Сравнение доли субклассов IgG при ответе антител, индуцированном иммунизацией белком TGF-P64k подкожно (1) или внутримышечно (2). Значения стандартного отклонения показаны на фигуре для каждой из групп, включающей в себя 5 иммунизированных животных. Фиг. 6 - ответ специфических антител против EGF у мышей, иммунизированных белком слиянияTGF-P64K. На диаграмме показаны титры антител против hTGF и против EGF, которые были достигнуты у мышей, иммунизированных TGF-P64K. Фиг. 7 - определение экспрессии EGF-R, EGF и TGF путем иммуногистохимии в опухолевых биоптатах вакцинированных пациентов, включенных в пилотное клиническое испытание II стадии вакциныEGF. Различная реактивность данных трех молекул в первичной опухоли легких и во второй первичной опухоли гортани, которая появилась после первой, показаны на фигуре в виде положительных знаков. Фиг. 8 - экспрессия мРНК EGF, hTGF и EGF-R в 22 карциномах молочной железы. На данной фигуре показаны продукты 30 циклов PCR, полученных с использованием специфических для каждой молекулы праймеров и визуализированных этидий-бромидом после того, как были разделены на 1,5% агарозных гелях. Также наблюдали экспрессию мРНК GAPDH, использованную в качестве внутреннего контроля. Фиг. 9 - корреляция между уровнями мРНК hTGF и EGF-R в биоптатах карциномы молочной железы. Интенсивность полос, полученную с помощью этидий-бромида, анализировали посредством программы для расчетов (ImagQuant, Amersham). По оси X показано отношение между значениями интенсивности для продуктов PCR с использованием специфических праймеров для EGF-R и тех, что были получены для GAPDH, для каждого образца (относительная интенсивность), а по оси Y - та же относительная интенсивность для hTGF. Наблюдали положительную корреляцию между значениями экспрессии двух этих молекул (R2=0,657, p=0,00121). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Вакцинная композиция для индукции иммунного ответа против аутологичного TGF, которая содержит в качестве активного начала белок слияния между белком-носителем и человеческимTGF или любым его пептидным производным, отдельно или в комбинации с любым лигандом EGF-R, и дополнительно содержащая адъювант, где указанный белок слияиния способен вызвать указанный иммунный ответ против TGF. 2. Вакцинная композиция по п.1, где белок-носитель представляет собой белок Р 64K из комплекса белков наружной мембраны Neisseria meningitidis. 3. Вакцинная композиция по п.2, где белок-носитель содержит участок из шести гистидинов на Nконце. 4. Вакцинная композиция по п.1, где лиганд EGF-R представляет собой EGF. 5. Вакцинная композиция по п.1, где адъювант представляет собой неполный адъювант Фрейнда. 6. Вакцинная композиция по п.1, где адъювант представляет собой Аl(ОН)3.