Способ повышения содержания сахарозы в сахарной свекле и сахарном тростнике при их сельскохозяйственном выращивании

СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ САХАРОЗЫ В САХАРНОЙ СВЕКЛЕ И САХАРНОМ ТРОСТНИКЕ ПРИ ИХ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОМ ВЫРАЩИВАНИИ Применение нуклеиновой кислоты, предназначенной для снижения в растительной клетке ферментативной активности инвертазы, для формирования запасающего сахарозу органа растения,в котором концентрация сахарозы повышается по сравнению с концентрацией сахарозы в неизмененном контрольном запасающем сахарозу органе одного и того же генотипа в сравнимой стадии развития. При этом повышение концентрации сахарозы на X процентных пунктов может привести к измененному и неизмененному запасающему сахарозу органу, причем в случае уменьшения содержания запасающего сахарозу органа уменьшение составляет максимально 5 Х%. Кроме того, изобретение касается способа повышения содержания сахарозы в сахарной свекле и сахарном тростнике при их сельскохозяйственном выращивании, при котором применяют растения сахарной свеклы и сахарного тростника, генетический материал которых направлен на снижение ферментативной активности инвертазы. Изобретение относится к новому применению нуклеиновой кислоты, предназначенной для снижения ферментативной активности инвертазы в растительной клетке, а также к способу повышения содержания сахарозы в сахарной свекле и сахарном тростнике при их сельскохозяйственном выращивании. Сахарная свекла является двухлетним растением. На первом году развития происходит вегетативный рост, причем растение развивает розетку из листьев и образует главный корень, корнеплод. На втором году, во время генеративной фазы, образуются соцветия и семена. Особенность физиологии формирования качества урожая сахарной свеклы состоит в том, что накопление и хранение сахарозы происходит преимущественно на первом году вегетации. Поэтому для получения сахарозы собирают урожай сахарной свеклы в вегетативной стадии развития. Десятилетние усилия и результаты в селекции сахарной свеклы принесли заслуживающее внимания увеличение урожая корнеплодов сахарной свеклы и содержания сахарозы. Но это увеличение все еще не удовлетворительное, несмотря на то что концентрация сахарозы в корнеплоде сахарной свеклы составляет около 15-20% сырого веса корнеплода сахарной свеклы. Из EP 0956357B1 известно применение нуклеиновой кислоты, которая кодирует способный к снижению ферментативной активности инвертазы полипептид, для получения трансгенного растения с уменьшенными потерями сахарозы, обусловленными хранением. В этом документе не указывается возможность повышения концентрации сахарозы в запасающем сахарозу органе растения с помощью ингибиторов инвертазы. Кроме этого, EP 1346054B1 не выделяет торможение вакуолярной инвертазы. Также этот документ описывает только улучшенную способность сохранять свойства при хранении растений, но не повышение концентрации сахарозы. Поэтому задача данного изобретения заключается в дальнейшем повышении концентрации сахарозы в запасающем сахарозу органе растения. В частности, задачей данного изобретения является способ сельскохозяйственного выращивания сахарной свеклы и сахарного тростника, при котором обеспечивается повышение содержания сахарозы. Согласно изобретению решением поставленной задачи является применение нуклеиновой кислоты,предназначенной для снижения ферментативной активности инвертазы в растительной клетке, для образования запасающего сахарозу органа растения, в котором концентрация сахарозы повышается по сравнению с концентрацией сахарозы неизмененного контрольного запасающего сахарозу органа того же генотипа в сравнимой стадии развития. Однако до сих пор отмечалась отрицательное соотношение между концентрацией сахарозы и урожаем корнеплодов. Это означает, что сорта с высокой концентрацией сахарозы дают незначительный урожай корнеплодов по сравнению с сортами с низкой концентрацией сахарозы. Причина этому в том,что сорта сахарной свеклы с высокой концентрацией сахарозы образуют больше маленьких корнеплодов. Попытка объяснить отрицательное соотношение между концентрацией сахарозы и урожаем корнеплодов была предпринята уже в 1973 г. Милфордом. После этого был соотнесен вес корнеплодов и размер паренхимной накопительной клетки. Большие клетки паренхимы имеют соответственно меньшую концентрацию сахарозы, чем маленькие клетки паренхимы. Соотношение между концентрацией сахарозы и урожаем корнеплодов остается отрицательным также и в новых сортах, но так тесно связано, как было описано раньше (Campbell und Kern 1983, Hoffmann und Mrlnder 2002). Прогресс выращивания привел, таким образом, к смещению отрицательного соотношения между концентрацией сахарозы и урожаем корнеплодов, однако не к коренному изменению этого соотношения (фиг. 1). Вышеописанное для сахарной свеклы отрицательное соотношение между концентрацией сахарозы и содержанием запасающего сахарозу органа относится также в основном и для сахарного тростника. Неожиданным образом было установлено, что при применении нуклеиновой кислоты, используемой для снижения ферментативной активности инвертазы в растительной клетке, негативное или инверсивное соотношение между концентрацией сахарозы и урожаем запасающего сахарозу органа (урожаем корнеплодов сахарной свеклы или урожаем стеблей сахарного тростника) может быть сокращено или устранено. В частности, заявленное применение нуклеиновой кислоты может привести при повышении концентрации сахарозы на X процентных пунктов к уменьшению содержания запасающего сахарозу органа,причем уменьшение содержания запасающего сахарозу органа составляет максимально 5 Х%. В частном варианте выполнения изобретения при применении нуклеиновой кислоты, предназначенной для снижения ферментативной активности инвертазы в растительной клетке, содержание запасающего сахарозу органа остается неизмененным или повышается. Так, повышение концентрации сахарозы приблизительно на 2 процентных пункта в случае уменьшения содержания запасающего сахарозу органа приводит к уменьшению максимально на 10%. Однако повышение концентрации сахарозы также приводит к повышению содержания запасающего сахарозу органа, так что концентрация сахарозы запасающего сахарозу органа не соотносится отрицательно с содержанием запасающего сахарозу органа. В случае с сахарной свеклой концентрация сахарозы указывает на количество сахарозы в сыром ве-1 022713 се корнеплода. Под урожаем корнеплодов сахарной свеклы подразумевают сырой вес очищенных от земли с оптимально обрезанной ботвой корнеплодов. Из урожая корнеплодов, умноженного на концентрацию сахарозы, рассчитывают содержание сахарозы. Также на примере сахарной свеклы раскрывают преимущество заявленного изобретения посредством приведенных ниже примеров расчетов. В качестве особенно подходящей нуклеиновой кислоты для снижения ферментативной активности инвертазы применяют нуклеиновую кислоту, которая кодирует ингибитор инвертазы. Ингибиторы инвертазы впервые были описаны в картофеле (Schwimmer et al. 1961). Они известны из сахарной свеклы,томатов и табака (Pressey 1968, Pressey 1994, Weil et al. 1994, Rausch und Greiner 2004). Хотя, однако, ингибиторы инвертазы относятся к уровню техники, до сих пор не было установлено, что посредством этого полипептида можно повысить концентрацию сахарозы в корнеплоде сахарной свеклы. В частности,было неизвестно, что таким образом это приведет к отрицательному соотношению между концентрацией сахарозы и содержанием запасающего сахарозу органа. С другой стороны, доступность разных ингибиторов инвертазы представляет собой также предпосылку новому применению. Так, нуклеиновая кислота, которая кодирует способный к снижению ферментативной активности инвертазы полипептид, может быть без проблем идентифицирована и соответственно получена и применена в сахарной свекле и сахарном тростнике, и в способе их выращивания посредством генетических методик. Но другую возможность снижения ферментативной активности инвертазы также можно достичь в результате того, что ферментативную активность инвертазы снижают не ингибируемым полипептидом,а, к примеру, посредством антисмысловой РНК или РНК-интерференцией. Оба способа относятся между тем к стандартным общеизвестным методикам. В случае антисмысловой РНК применяют однонитчатую РНК, которая является дополнительной к m-РНК инвертазы. Последующая конъюгация дополнительной РНК приводит к ингибированию трансляции m-РНК и при этом к предотвращению экспрессии гена инвертазы в клетке. При РНК-интерференции используют по сравнению с этим инвертированный повтор сДНК-фрагмента, который после транскрипции образует двунитчатую молекулу РНК, которая расщепляется от свойственных растениям ферментов на фрагменты с длиной приблизительно в 21-23 нуклеотида, которые приводят к блокаде трансляции м-РНК. Известны также инвертазы из сахарной свеклы (Rosenkranz et al., 2001, Gonzales et al., 2005), и соответственно могут быть изолированы посредством известных инвертаз (Sturm und Chrispeels, 1990; Sturm,1999) из сахарной свеклы и сахарного тростника без особых сложностей, так что также сразу получают соответствующие конструкции антисмысловых РНК или конструкции для РНК-интерференции. Посредством общеизвестных способов трансформации растений можно такие конструкции хорошо перенести в растения и там экспрессировать. Согласно другому варианту осуществления изобретения применяемой нуклеиновой кислотой является гетерологичная нуклеиновая кислота, которая происходит из Nicotiana tabacum. Термин "гетерологичная" означает, что упомянутая нуклеиновая кислота имеет другое происхождение относительно клетки хозяина или, по меньшей мере, представлена не в естественном состоянии. Если клетка хозяина трансформируется нуклеиновой кислотой, которая происходит из чужеродного организма, последовательность нуклеиновой кислоты является гетерологичной к клетке хозяина и к потомкам клетки хозяина, которые несут эту последовательность нуклеиновой кислоты. Неожиданным образом было установлено, что в трансгенных начальных условиях повышенная концентрация сахарозы может быть обнаружена только в корнеплодах трансгенных потомков первичных трансформантов, выросших из семян. Вес корнеплода оставался неизменным по сравнению с нетрансгенным контрольным, что привело к повышению общего количества сахарозы. В придаточных корнях это означает подобные корнеплоду образования, которые были образованы непосредственно первичными трансформантами, не было установлено изменение концентрации сахарозы. Согласно другому варианту осуществления изобретения гетерологичная нуклеиновая кислота имеет последовательность согласно SEQ ID NO: 1 или последовательность нуклеиновой кислоты, которая может гибридизоваться с дополнительной последовательностью в последовательность согласно SEQ IDNO: 1 или участки от этого. Применяемый здесь термин "гибридизоваться" означает гибридизацию при принятых условиях, как описано в Sambrook et al. (1989), предпочтительно при обязательных условиях. Обязательные условия гибридизации, к примеру: гибридизация в 4SSC при 65 С и последующая многократная промывка в 0,1SSC при 65 С в целом приблизительно в течение часа. Необязательные условия гибридизации, к примеру: гибридизация 4SSC при 37 С и последующая многократная промывка в 1SSC при комнатной температуре. "Обязательные условия гибридизации" могут также означать: гибридизация при 68 С в 0,25 М фосфата натрия, рН 7,2, 7 % SDS, 1 мМ EDTA и 1 % BSA в течение 16 ч и последующая двукратная промывка с 2SSC и 0,1 % SDS при 68 С. Кодированный нуклеиновой кислотой полипептид, ингибитор инвертазы, согласно осуществленной трансформации в клетках сахарной свеклы или сахарного тростника предпочтительно локализован ва-2 022713 куолярно, в цитозоле или в стенке клетки. Согласно другому варианту осуществления изобретения нуклеиновая кислота является гомологичной нуклеиновой кислотой. Термин "гомологичная" означает здесь, что соответствующая нуклеиновая кислота в отношении клетки хозяина имеет то же самое природное происхождение. Термин "гомологичная" относится также к последовательности нуклеиновой кислоты, которая внесена в тот же природный первоначальный тип клетки, от которого она происходит, но, к примеру, под контролем другого, в этом типе клетки или в этой комбинации не природного происхождения, регулирующего элемента. При этом регулирующие элементы являются последовательностями, которые дополнительно участвуют в экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты. Они включают, к примеру, промоторы и терминаторные последовательности. Так, клетка хозяина может быть, к примеру, трансформирована нуклеиновой кислотой из гомогенного организма, чтобы, к примеру, достигнуть сверхэкспрессии нуклеиновой кислоты. С другой стороны, возможно посредством известных мероприятий по выращиванию повысить экспрессию нуклеиновой кислоты в клетках, соответственно обеспечить повышение активности кодированного ею полипептида в клетках. Так, к примеру, можно проанализировать аллельные изменения локуса ингибитора инвертазы из сахарной свеклы и сахарного тростника и затем продолжить работу по выращиванию с лучшими аллелями. Основанием этому может быть в сахарной свекле последовательность ингибитора инвертазы BvC/VIF1 (клеточная оболочка Beta vulgaris или вакуолярный ингибитор бетафруктозидазы) согласно SEQ ID NO: 2, а также последовательность нуклеиновой кислоты, которая может гибридизоваться с дополнительной последовательностью в последовательность согласно SEQ IDNO: 2 или участки этого. Анализ аллельных изменений происходит таким образом, что сначала в результате сравнительного секвенирования локуса ингибитора инвертазы идентифицируются имеющиеся в популяции аллели. Затем разные аллели откладываются через повторяющиеся возвратные скрещивания в всегда подобном генетическом фоне. Возникшие таким образом близкие изогенные линии анализируют относительно экспрессии ингибитора инвертазы. Анализ происходит посредством нозерн-блотинга или RT-PCR. Сравнение эффективности разных аллелей ингибитора инвертазы можно определить, кроме того,косвенно через ферментативную активность инвертазы. Близкие изогенные линии сахарной свеклы выращивают в полевых экспериментах. После сбора урожая определяют выход корнеплодов и концентрацию сахарозы. Это позволяет сравнить аллели относительно заданного признака содержания сахарозы. Аллель с лучшим эффектом относительно содержания сахарозы затем скрещивают в актуальном селекционном материале и применяют для развития сортов. Данное изобретение касается также способа повышения содержания сахарозы в сахарной свекле и сахарном тростнике при их сельскохозяйственном выращивании. При этом применяют растения сахарной свеклы или сахарного тростника, генетический материал которых направлен на снижение ферментативной активности инвертазы. Генетический материал растений сахарной свеклы и сахарного тростника можно получить в свою очередь посредством генетических методик или общепринятых методик селекции растений. В этом отношении указывается на вышеназванные возможности нового применения нуклеиновой кислоты. Предпочтительный вариант заявленного способа предусматривает, что генетический материал содействует образованию запасающего сахарозу органа, в котором концентрация сахарозы не соотносится отрицательно с содержанием запасающего сахарозу органа. Следующие вычисления наглядно поясняют на примере сахарной свеклы, как новый способ может в целом отразиться на содержании сахарозы. Содержание сахарозы стандартных сортов сахарной свеклы составляет при урожае корнеплодов свеклы 60 т/га и концентрации сахарозы в корнеплоде 17% в целом 10,2 т/га. При помощи заявленного способа можно достичь по сравнению с этим концентрацию сахарозы в 18% и более. При одинаковом урожае корнеплодов свеклы повышение концентрации на 1% уже дает в итоге повышение содержания сахарозы в 600 кг на гектар посевной площади. Из-за отрицательного соотношения между концентрацией сахарозы и урожаем корнеплодов предшествующие повышения концентрации сахарозы, к примеру, с 17 до 18 % привели к непропорционально уменьшенному урожая корнеплодов, в связи с чем повышение концентрации сахарозы было только очень условно целесообразным. Изобретение поясняется более подробно в дальнейшем с помощью рисунков и предпочтительного примера выполнения. Фиг. 1 показывает прогресс в выращивании сахарной свеклы и концентрации сахарозы в сортах сахарной свеклы по Hoffmann 2006. Как показано на графиках, высокую концентрацию сахарозы достигают только при сравнительно низком урожае корнеплодов. Высокий урожай корнеплодов сопровождается сравнительно низкой концентрацией сахарозы. В результате прогрессивной селекции уменьшается даже повышение прямых регрессии далее, но соотношение между урожаем корнеплодов сахарной свеклы и концентрацией сахарозы также в новых сортах отрицательное. Фиг. 2 показывает вектор, в котором ингибитор инвертазы интегрирован из Nicotiana tabacum (SEQ Фиг. 3 показывает относительное содержание сахарозы в трансгенных линиях Т (n=25) по сравнению с нетрансгенньми контрольными Ко (n=40). Все растения были выращены в теплице в емкостях и были собраны через 204 дня после высаживания семян. Трансгенные линии существенно отличаются повышенным содержанием сахарозы в 24% от нетрансгенных контрольных. Фиг. 4 показывает относительный вес корнеплодов растений по фиг. 3. Вес корнеплодов трансгенных линий не отличается в этом случае от контрольной свеклы. При этом трансгенные линии обнаруживают по сравнению с нетрансгенными контрольными повышенное содержание сахарозы при несущественно измененном весе корнеплода. Отрицательное соотношение между содержанием сахарозы и урожаем корнеплодов сахарной свеклы в этом случае преодолено. Пример применения гетерологичной нуклеиновой кислоты. При помощи сайтов рестрикции BamVW (1194) и Xbal (2031) выбранная для инвертазы ингибитора из Nicotiana tabacum, кодированная cDNA с длиной 811 bp (SEQ ID NO: 1), интегрирована в вектор pBINAR, в результате этого получают плазмиду pBINAR-NtVIF. Трансформация сахарной свеклы осуществлена по Lindsey et al. (1991). Трансгенез проверен методом ПЦР. После регенерации трансформанты были применены для получения семенного материала в теплице и самоопылены. Полученный в результате самоопыления семенной материал выбранной трансгенной линии и нетрансгенной контрольной был высажен в начале марта, и проростки были прорежены в середине марта. Выращивание происходило в емкости (19100 см) при температуре в 16 С и силе света в 6 Klux и длительности освещения 18 ч. Емкости содержали почву для горшечных культур FE Тур 340(субстрат Fruhsdorfer), землю для пикирования рассады LAT Terra P8 и 5 g Triabon. Еженедельно растения удобряли удобрением 3-4% Kamasol и обрабатывали против мучнистой росы и мух. Через 204 дня после высаживания корнеплоды были собраны, очищены от ботвы, помыты, взвешены и направлены в измельчающую машину-свеклорезку. Мезгу непосредственно заморозили при -20C. Определение сахарозы. 26 г мезги из сахарной свеклы экстрагировали 177 мл экстрактного раствора (3 г сульфата алюминия в 1000 мл воды высшей степени очистки) в течение 5 мин при комнатной температуре, помешивая. Смесь отфильтровали через круглый фильтр с диаметром 240 мм и затем разбавили водой высшей степени очистки 1:10. Через шприцевой фильтр направили 1,5 мл разбавленного фильтрата в стеклянные пробирки для анализа с помощью высокопроизводительной жидкостной хроматографии. 10 мл разбавленного фильтрата проанализировали в HP 1100 HPLC-установке Agilent Technologies с Rl-детектором черезMerck LichroCart 250-3 колонну (Lichrospher 100 NH2 (5 мкм) Cat.No. 1.50834), в растворителе в 70%-ном ацетонитриле (v/v ацетонитрил 70, вода 30) и со скоростью жидкости в 0,8 мл/мин. Полученное HPLCзначение показывает сахарозу в мг/мл, которое пересчитали с включением коэффициента разбавления в% сахарозы относительно сырого веса корнеплодов. Для калибровки применили стандартные растворы 100 мг сахарозы/мл воды, 500 мг сахарозы/ мг воды, 5000 мг сахарозы/ мл воды. Источники информации 1. Campbell, L.G. und Kern, J.J. (1983). Relationship among components of yield and quality of sugarbeets. J. Am. Soc. Sugar Beet Technol. 22, 135-145. 2. Gonzales, M.-C, Roitsch, Т., Cejudo, F. (2005). Circadian and developmental regulation of vacuolar invertase expression in petioles of sugar beet plants. Planta 222 (2) 386-395. 3. Hoffmann, С. (2006). Zuckerrben als Rohstoff - Die technische Qualitt als Voraussetzung fr eine effiziente Verarbeitung. ISBN 978-3-93033-87-5. 4. Hoffmann, C. und Mrlnder, B. (2002). Zchterischer Fortschritt in Ertrag und Qualitt von Zuckerrben. Zuckerind. 127, 425-429. 5. Lindsey, K., Gallois, P., Eady, C. (1991). Regeneration and transformation of sugar beet by Agrobacterium tumefaciens. Plant Tissue Culture Manual B7: 1-13; Kluwer Academic Publisher. 6. Milford, G. FJ. (1973). The growth and development of the storage root of sugar beet. Ann. Appl. Biol. 75, 427-438. 7. Pressey, R. (1968). Invertase inhibitor from red beet, sugar beet and sweet potato roots. Plant Physiol.,43, 1430-1434. 8. Pressey, R. (1994). Invertase inhibitor in tomato fruit. Phytochemistry, 36, 543- 546. 9. Rausch Т., Greiner, S. (2004). Plant protein inhibitors of invertases. Biochimica et Biophysica Acta,1696,253-261. 10. Rosenkranz, H., Vogel, M., Greiner, S., Rausch, T. (2001). In wounded sugar beet (Beta vulgaris L.) ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, снижающий ферментативную активность инвертазы в растительной клетке, для повышения концентрации сахарозы в запасающих сахарозу органах растения по сравнению с концентрацией сахарозы неизмененного контрольного запасающего сахарозу органа в сравнимой стадии развития, где запасающим сахарозу органом является корнеплод сахарной свеклы или стебель сахарного тростника; последовательность нуклеиновой кислоты представлена в виде SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или последовательности нуклеиновой кислоты, которая может гибридизироваться с последовательностью, комплементарной SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, при жестких условиях гибридизации в 4SSC при 65 С и последующим многократным промыванием в 0,1SSC при 65 С в целом приблизительно в течение часа. 2. Применение по п.1, отличающееся тем, что последовательность SEQ ID NO:1 происходит из Nicotiana tabacum. 3. Применение по п.1, отличающееся тем, что полипептид локализован в клетках сахарной свеклы или сахарного тростника вакуолярно, в цитозоле или в стенке клетки. 4. Способ повышения концентрации сахарозы в запасающих сахарозу органах сахарной свеклы или сахарного тростника, включающий следующие стадии: а) введение в клетку сахарной свеклы или сахарного тростника нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, снижающий ферментативную активность инвертазы в растительной клетке, и б) регенерацию растения сахарной свеклы или сахарного тростника из клетки, где сахарная свекла или сахарный тростник образуют запасающий сахарозу орган, в котором концентрация сахарозы повышается по сравнению с концентрацией сахарозы неизмененного контрольного запасающего сахарозу органа в сравнимой стадии развития, и где последовательность нуклеиновой кислоты представлена в виде SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или последовательности нуклеиновой кислоты, которая может гибридизироваться с последовательностью, комплементарной SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, при жестких условиях гибридизации в 4SSC при 65 С и последующим многократным промыванием в 0,1SSC при 65 С в целом приблизительно в течение часа. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что последовательность SEQ ID NO:1 происходит из Nicotiana