Лечение инфекций, вызываемых грибами р. aspergillus, с помощью тимозина альфа 1

008037 Перекрестная ссылка на родственные заявки Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки 60/457911, поданной 28 марта 2003 г. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к лечению грибных инфекций. В частности настоящее изобретение относится к лечению и предупреждению инфекций, вызываемых грибами р. Aspergillus, таких как инвазивный аспергиллз, связанный с трансплантациями костного мозга. Предпосылки создания изобретения Инвазивный аспергиллз (ИА), характеризующийся инвазией гифов, разрушением легочной ткани и диссеминацией в другие органы, является основной причиной как нозокомиальной (внутрибольничной) пневмонии, так и смерти при аллогенной трансплантации костного мозга (ТКМ), причем установлено,что коэффициент инфекционного заражения составляет 5-10%, а коэффициент связанной с ним смертности составляет 90-100%. Ранее наиболее важным фактором риска для возникновения ИА была нейтропения, при этом на мышиной модели аллогенной ТКМ было установлено, что восстановление миелоидных предшественников может служить защитой от ИА. Однако современные исследования эпидемиологии ИА у реципиентов, подвергнутых ТКМ, свидетельствуют о снижении количества случаев инфекции, связанной с нейтропенией, и об увеличении количества случаев инфекции с "запоздалым началом", сопровождающихся реакцией трансплантат против хозяина. Таким образом, в данной области существует необходимость в разработке способов лечения инфекции, вызываемой грибами р. Asperigillus. Краткое изложение сущности изобретения В настоящем изобретении предложен способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой грибами р. Asperigillus у млекопитающих, заключающийся в том, что млекопитающему вводят фармацевтическую композицию, содержащую количество тимозина альфа 1 (ТА 1), которое обладает эффективным противогрибковым действием. Подробное описание изобретения В клинических и экспериментальных исследованиях установлено, что для контроля ИА важна реактивность Тh1-клеток. Дендритные клетки (ДК) обусловливают примирование Th1-клетками грибами invivo и in vitro. Имеются данные о том, что на способность легочных ДК вызывать соответствующие Тклеточные ответы на грибные антигены могут оказывать влияние локальные иммунорегуляторные каскады, в том числе передача сигнала через Толл-подобные рецепторы (ТПР). ДК могут представлять собой перспективные мишени для воздействия при разработке иммунотерапии и вакцин, и это смещает основное направление фармацевтических разработок в сторону адъюванта. Предпочтительным является адъювант, который обладает как способностью стимулировать соответствующий тип ответа, наиболее пригодный для борьбы с инфекцией, так и эффективностью в условиях иммуносупрессии. Тимозин альфа 1 (ТА 1) представляет собой встречающийся в естественных условиях тимусный пептид. ТА 1 в форме синтетического состоящего из 28 аминокислот пептида применяют во всем мире в клинических условиях для лечения некоторых вирусных инфекций, либо в качестве единственного терапевтического средства, либо в сочетании с интерфероном альфа. ТА 1 находит применение также при лечении иммунодефицитных состояний, злокачественных заболеваний и ВИЧ/СПИДа. Механизм действия синтетического полипептида ТА 1 в настоящее время не полностью изучен, однако существует мнение, что он связан с присущими полипептиду иммуномодуляторными активностями, направленными в основном на усиление функции Т-клеток. Вследствие его иммуномодуляторного действия на клетки природной иммунной системы, включая способность активировать активируемые митогеном протеинкиназы (МАРК) и экспрессию генов на макрофагах, авторы изобретения рассматривали ТА 1 в качестве адъюванта, обладающего способностью активировать ДК для примирования Th1-клеток в отношении грибов р. Aspergillus. В настоящем изобретении предложен способ лечения инфекций, вызываемых грибами р. Aspergillus, заключающийся в том, что ТА 1 путем передачи сигнала через ТПР может активировать ДК для противогрибкового примирования Th1. В настоящем изобретении предложен способ лечения млекопитающего, инфицированного грибами р. Aspergillus, заключающийся в том, что такому млекопитающему вводят количество тимозина альфа 1(ТА 1), которое обладает эффективным противогрибковым действием. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ТА 1 обладает эффективностью в отношении инвазивного аспергиллза(ИА). Эффективная доза ТА 1 является достаточной для активации дендритных клеток для продуцирования стимулирующих Th1-клетки цитокинов. Предпочтительная доза для лечения грибковой инфекции составляет от 200 до 400 мкг/кг веса тела в день. В предпочтительном варианте осуществления изобретения млекопитающее представляет собой хозяина с ослабленным иммунитетом, прежде всего человека. Способ применим, прежде всего, для лечения пациентов с ослабленным иммунитетом, прежде всего пациентов, которые являются реципиентами трансплантатов костного мозга. В настоящем изобретении предложен также способ предупреждения инфекции, вызываемой грибами р. Aspergillus, у млекопитающего, заключающийся в том, что такому млекопитающему вводят количество ТА 1, обладающее эффективным противогрибковым действием. Изобретение предпочтительно-1 008037 применяют для предупреждения ИА у хозяина с ослабленным иммунитетом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ предупреждает такие инфекции у пациентов с ослабленным иммунитетом, прежде всего у пациентов, которые являются реципиентами трансплантатов костного мозга. Эффективная доза ТА 1 является достаточной для активации дендритных клеток для продуцирования стимулирующих Th1-клетки цитокинов. Предпочтительная доза для предупреждения грибковой инфекции составляет от 200 до 400 мкг/кг веса тела в день. Не вдаваясь в какую-либо конкретную теорию можно считать, что настоящее изобретение основано на открытии новой иммунорегуляторной активности ТА 1, позволяющей лечить или предупреждать инфекцию, вызываемую грибами р. Aspergillus. По-видимому, ТА 1 усиливает производство стимулирующих Th1 цитокинов IL-12 p70, IL-10 и IFN-альфа различными типами ДК посредством зависящего отMyD88 пути. В трансфектированных ТПР клетках ТА 1, по-видимому, непосредственно активирует сигналы,продуцируемые TLR9, но не TLR2, последний активируется в ответ на соответствующие лиганды. Таким образом, ТА 1, по-видимому, активирует продуцируемые TLR сигналы либо непосредственно, либо косвенным образом. Имеющиеся данные позволяют предположить, что ТА 1 может использовать зависящий от TLR2 каскад для производства IL-12 p70 на миелоидных дендритных клетках (МДК) и зависящий отTLR9 каскад для производства IFN-альфа и IL-10 на плазмацитоидных дендритных клетках (ПДК). Поскольку производство IL-10 дендритными клетками (ДК) может представлять собой компонент иммунологической памяти, обеспечивающий защиту от грибков, то баланс производства IL-12/IL-10 на ДК и/или других поднаборах ДК может обусловливать очень большую роль адъювантности ТА 1 при аспергиллзе. На мышиной модели ТКМ обработка ТА 1 после заражения грибами р. Aspergillus приводила к увеличению количества CD4+- и CD8+-клеток, а также к увеличению общего количества нейтрофилов. После обработки ТА 1 количество Th1-клеток (продуцирующих IFN-гамма) увеличивалось, в то время как количество Тh2-клеток (продуцирующих IL-4) снижалось. Важно отметить, что лечение мышей с ТКМ, инфицированных грибами р. Aspergillus, с помощью ТА 1 приводило к зависящему от дозы уменьшению роста грибов в легких, а при использовании более высоких доз оказывалось возможным достигать полного излечения инфекции. ТА 1 обладал также способностью повышать терапевтическую эффективность амфотерицина В. Воздействия ТА 1 на ДК согласуются с его антиапоптозной активностью. Поскольку ДК играют основную роль в обеспечении баланса между иммунопатологией, иммунитетом и аутоиммунитетом, и в тимусе имеет место передача сигнала к ПДК через TLR9, то способность ТА 1 осуществлять модуляцию функции ДК является эндогенным регулятором природной и адаптивной иммунных систем, действующих посредством использования ТПР. Это обеспечивает рациональную основу для терапевтического предписания ТА 1 при некоторых вирусных инфекциях, для которых считается, что ПДК, продуцирующие IFN-альфа, играют основную роль. Для производства IFN-альфа в этих ПДК необходимым является присутствие TLR9. Кроме того, по-видимому, ПДК участвуют в иммунных ответах после трансплантации гематопоэтических клеток, что может объяснить среди прочего причину благоприятного влияния ТА 1 на восстановление иммунитета у млекопитающих, подвергнутых ТКМ. ТПР, по-видимому, активируют природную иммунную систему, не только помогая адаптивной иммунной системе, но и обеспечивая непосредственную антимикробную эффекторную активность. Поскольку ТА 1, по-видимому, активируют ДК для примирования Th1 в отношении грибов р. Aspergillus и также противогрибковый статус эффекторных нейтрофилов, то это служит дополнительным доказательством благоприятного действия ТА 1 при лечении грибковых инфекций. Гриб р. Aspergillus имеет уникальную природу, заключающуюся в том, что он представляет собой сапрофитный гриб, колонизирующий хозяев с ослабленным иммунитетом. В настоящем изобретении предложено целенаправленное воздействие на клетки и пути опосредуемого клетками иммунитета, позволяющее повышать устойчивость к грибам р. Aspergillus, при котором ТА 1 является адъювантом, программирующим соответствующую реактивность Тh1 в отношении гриба посредством использования ТПР-пути. Ниже изобретение более подробно проиллюстрировано на примере, не ограничивающем его объем. Пример 1. Животные Самок мышей линий BALB/c и C57BL6 возрастом 8-10 недель получали от фирмы Charles River. Мышей линии NOD/SCID получали от фирмы The Jackson. Из линии C57BL6 выводили путем попарного скрещивания гомозиготных мышей с дефицитом TLR2, TLR9 и MyD88, а из линии BALB/c выводили гомозиготных мышей с дефицитом IFN-гамма и IL-4, которых содержали в свободных от конкретного патогена условиях. Заражения микроорганизмами и обработки Для заражения грибом р. A. fumigatus мышам в течение 3 последовательных дней вводили путем интраназальной инъекции суспензию, содержащую 2 х 107 конидий/20 мкл физиологического раствора. Для количественной оценки роста гриба в легких применяли анализ хитина. Содержание хитина выражали в микрограммах глюкозамина на орган. В качестве отрицательного контроля использовали содер-2 008037 жание глюкозамина в легких неинфицированных мышей, которое составляло от 0,80 до 2,25 мкг глюкозамина/орган. Для гистологического анализа легкие вырезали и сразу же фиксировали в формалине. Срезы (толщиной 3-4 мкм) тканей, погруженных в парафин, окрашивали методом Шиффа с использованием перйодной кислоты. Тимозин альфа 1 (ТА 1) и скрэмблер-полипептид (модифицированный полипептид) представляли собой очищенные стерильные лиофилизированные ацетилированные полипептиды с уровнями эндотоксина менее 0,03 пкг/мл по данным стандартного лимулус-анализа лизата. Они имели следующие последовательности: Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-IIe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-LysGlu-Lys-Lys-Glu-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-O (тимозин альфа 1) и Ac-Ala-Lys-Ser-Asp-Val-Lys-Ala-GluThr-Ser-Ser-Glu-Ile-Asp-Thr-Thr-Glu-Leu-Asp-Glu-Lys-Val-Glu-Val-Lys-Ala-Asn-Glu-ОН (тимозин альфа 1). Их лиофилизированные порошки восстанавливали в стерильной воде. Обработки проводили следующим образом: подвергнутым ТКМ мышам (ТКМ-мышам) вводили ежедневно, начиная с дня осуществления инфузии КМ, одновременно с заражением, ТА 1 в различных дозах, интраперитонеально, тимозин альфа 1, 400 мкг/кг, интраперитонеально, или человеческий рекомбинантный G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), 250 мкг/кг, внутривенно, и продолжали вводить еще в течение 3 дней. Амфотерицин В вводили ежедневно в течение 3 дней одновременно с заражением, в дозе 4000 мкг/кг, интраперитонеально. Эта доза предназначалась для лечения ИА у обработанных циклофосфамидом мышей. Циклофосфамид, 150 мг/кг, интраперитонеально, вводили за день до осуществления заражения. Обработанным циклофосфамидом мышам в течение 5 последовательных дней, начиная со дня заражения, вводили интраперитонеально 400 мкг/кг ТА 1. Истощение нейтрофилов получали путем внутривенного введения 1 мг нейтрализующего Gr-1 антитела RB6-8C5 за день до и через день после осуществления заражения. Обработка существенно снижала количество нейтрофилов в легком, но не снижала количество ДК (5-6 х 105 CD11 с+, ГКГ класса II+,F480 клеток до и после обработки). Контрольным мышам вводили эквивалентное количество очищенного крысиного IgG2b. FACS-анализ (анализ с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) клеток легкого через день после обработки циклофосфамидом позволил выявить выраженную и долговременную (вплоть до 5 дней) лейкопению. Обработка не влияла на процент F480+-клеток(примерно 20%) и процент CD11 с+, ГКГ класса II+, F480 ДК (3%). Лиганды ТПР Зимозан получали из Saccharomyces cerevisiae, липотеихоевую кислоту (ЛТК) получали из Staphylococcus aureus и липополисахарид (ЛПС) из штамма Re 595 Salmonella minnesota. CpG-олигонуклеотиды 1826 и 2006 представляли собой проверенные иммуностимуляторные последовательности. Выведение ТКМ-мышей Мышей линии C57BL6 обрабатывали летальной дозой 9 Гр и им вводили путем инфузии донорские клетки, характеризующиеся истощением Т-клеток, полученные от мышей линии BALB/c. У более чем 95% выживших мышей был обнаружен стабильный гематопоэтический химеризм донорского типа, что подтверждалось экспрессией антигена ГКГ класса I донорского типа на клетках селезенки. Выделение и культивирование дендритных клеток Миелоидные ДК (МДК) крови линии CD11 с+ получали (выводили) из мононуклеарных клеток линии CD14+ путем магнитной сортировки клеток и культивирования в течение 5 дней в среде Дульбекко,модифицированной по способу Исков, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 50 мкМ 2 меркаптоэтанол, пируват натрия (1 мМ), 2 мМ L-глутамин, HEPES (1 мМ) и 50 мкг/мл гентамицина в присутствии 50 нг/мл рекомбинантного человеческого GM-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов) и 200 ед/мл рекомбинантного человеческого IL-4. Для получения зрелых ДК незрелые МДК культивировали в течение 24 ч с 1000 нг/мл слитого протеина: тримерный лиганд человеческого СD40-лейциновая застежка. Плазмоцитоидные ДК (ПДК) линии CD 123 выделяли с помощью набора для выделения BDCA-4. Чистота CD123+-клеток составляла 96%. Для получения зрелых ПДК незрелые ДК культивировали с тримерным лигандом человеческогоCD40 согласно описанному выше методу в присутствии 10 нг/мл IL-3. FACS-анализ позволил установить, что ПДК представляли собой CD123bright, CD4+, CD45RA+ и CD11 с- в отличие от МДК, представляющих собой CD1a+, CD11c+, CD11b+, CD4+, CD14low и CD8-. Уровень экспрессии главного комплекса гистосовместимости человека (ЧГКГ) класса II, CD80 и CD86 был высоким как в незрелых, так и в зрелых ДК. ДК линии CD11 с легкого мыши (от 5 до 7% позитивных в отношении CD8alpha и от 30 до 35% позитивных в отношении Gr-1) выделяли с помощью магнитной сортировки клеток. Для исследования фагоцитоза ДК подвергали предварительной обработке 100 нг/мл ТА 1 в течение 60 мин и затем инкубировали в течение еще 60 мин при 37 С с конидиями Aspergillus. Рассчитывали процент интернализации и делали фотоснимки. Для оценки функционального созревания и определения цитокинов очищенные ДК ресуспендировали в среде Исков (не содержащей сыворотку, но с добавлением полимиксина В для избежания неспецифической активации компонентами сыворотки и эндотоксином) и вводили путем впрыскивания 100 нг/мл ТА 1 в течение 24 ч либо индивидуально, либо в сочетании с лигандами ТПР или неопсонированными конидиями Aspergillus.-3 008037 Фенотипический анализ Фенотип клеточной поверхности оценивали, подвергая образцы взаимодействию с конъюгированными с ФИТЦ (флуоресцеин-изотиоцианат) или ФЭ (фосфатидилэтаноламин) крысиными антимышиными антителами. В качестве контроля использовали антитела, соответствующие неродственному человеческому изотипу. Противогрибковая эффекторная активность При оценке фагоцитоза бронхоальвеолярные макрофаги и периферические нейтрофилы подвергали предварительной обработке 100 нг/мл ТА 1 в течение 60 мин и инкубировали при 37 С с неопсонированными конидиями Aspergillus в течение 60 мин. Кроме того, оценивали конидиоцидную активность путем определения количества колониеобразующих единиц и в качестве меры конидиоцидной активности принимали процент ингибирования колониеобразующих единиц (среднее значение C.K.O.). Анализ с использованием трансфектированных клеток линии НЕК 293 Человеческие эмбриональные клетки почки линии НЕК 293 дикого типа или стабильно трансфектированные человеческими TLR2, TLR9 и TLR4/CD1427 культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки(ФТС), HEPES (10 нМ), L-глутамином (2 мкг/мл) и гентамицином (50 мкг/мл). Кроме того, среду для трансфектантов дополняли пуромицином (100 мкг/мл). Для экспериментов по стимуляции клетки культивировали в течение ночи при плотности 3-5 х 105 клеток/лунку в 12-луночных планшетах для культур тканей. Клетки промывали и стимулировали 100 нг/мл ТА 1 либо индивидуально, либо вместе с лигандами ТПР, за 5 ч до осуществления оценки производства IL-8 в супернатантах. Анализ цитокинов и твердофазный иммуноферментный спот-анализ (ELISPOT) Уровни TNF-альфа, IL-10, IL-12 р 70, IFN-альфа и IL-8 в супернатантах культур определяли с помощью набора для ELISA. Пределы обнаружения (пг/мл) анализа составляли: для TNF-альфа: 3 (человеческий) и 32 (мышиный), для IL-10: 12 (мышиный) и 5 (человеческий), для IL-12 р 70: 16 (мышиный) и 3 (человеческий) и для IL-8: 25 (человеческий). Для человеческого IFN-альфа предел обнаружения составлял 3 нг/мл. Для подсчета продуцирующих цитокины клеток проводили анализ ELISPOT на очищенных CD4+-Т-клетках и ДК из легких. Анализ пролиферации методом проточной цитометрии Пролиферацию легочных CD4+-Т-лимфоцитов, стимулированных 10 мкг/мл конкавалина A (Con А), или инактивированными нагреванием конидиями в присутствии легочных ДК оценивали путем мечения с использованием CFSE (сукцинимидилового эфира 5(6)-карбоксифлуоресцеиндиацетата). ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) Общую РНК экстрагировали из незрелых ДК, которые предварительно обрабатывали в течение 60 мин 100 нг/мл ТА 1, а затем подвергали воздействию неопсонизированных конидий Aspergillus в течение 60 мин, процедура была выбрана на основе предварительных экспериментов. Синтез и ПЦР кДНК проводили с использованием прямого и обратного праймеров для ПЦР и циклов, применяемых для мышиных и человеческих ТПР и HPRT. Синтезированные ПЦР-продукты разделяли с помощью электрофореза на 2%-ном агарозном геле и визуализировали путем окрашивания этидийбромидом. Анализ активации р 38 и NF-kB р 38 и NF-kB активировали на ДК легкого путем воздействия в течение 20 мин при 37 С конидиямиAspergillus и/или 100 нг/мл ТА 1. Блоты клеточных лизатов инкубировали с кроличьими поликлональными Ат, распознающими либо нефосфорилированную форму МАРК р 38, либо дважды фосфорилированную форму (Thr-180/Tyr-182) МАРК р 38, или с Ат, обладающими специфичностью к Rel А, представляющей собой связывающую ДНК субъединицу с молекулярной массой 65 кДа человеческого NF-kB, а затем с конъюгированным с пероксидазой из хрена козьим IgG к антителу кролика согласно инструкциям производителя. Блоты проявляли с использованием набора для обнаружения типа Enhanced Chemiluminescence. Полосы визуализировали после экспозиции блотов на пленке Kodak RX. Для того, чтобы гарантировать одинаковую загрузку белка в каждой дорожке, вырезали полоски фосфорилированных блотов и мембраны подвергали вспомогательному зондированию с использованием Ат к р 38 и NF-kB. Тимозин альфа 1 (TA1) активирует дендритные клетки (ДК) В предыдущих исследованиях было установлено, что мышиные ДК могут осуществлять фагоцитоз грибов р. Aspergillus in vitro и в месте инфекции. Установлено, что ТА 1 в отличие от модифицированного пептида активирует легочные ДК в отношении фагоцитоза неопсонизированных конидий (в большей степени, чем гифов), экспрессии костимулирующего антигена и производства цитокинов. В отличие от этого конидии Aspergillus индивидуально не представляют собой достаточный стимул для индукции активации ДК, однако их воздействие совместно с ТА 1 приводит к значительному повышению экспрессии антигенов ГКГ класса II, молекул CD86 и CD40 и количества ДК, продуцирующих IL-12 р 70. Важно отметить, что количество ДК, продуцирующих IL-12 р 70, увеличивается также при воздействии только одного тимозина. ТА 1 активирует также поднаборы человеческих МДК и ПДК. Поднаборы как незрелых, так и зрелых ДК, обладают способностью к фагоцитозу конидий. TA1 повышает фагоцитарную активность незрелых ДК, оказывает влияние на морфологию ДК (в незрелых МДК можно выявить большее-4 008037 количество цитоплазматических проекций) и осуществляет повышающую регуляцию антигенов ЧГКГ класса II и приводит к экспрессии костимулирующих молекул в ответ на присутствие конидий. TA1 приводит к существенному увеличению высвобождения IL-12 р 70 незрелыми МДК в ответ на конидии и зимозан и высвобождения IL-10 незрелыми ПДК в ответ на обработку конидиями. РДК могут продуцировать IFN-альфа в ответ на обработку лигандом CpG TLR9, производство которого существенно усиливается под действием TA1. В отличие от этого модифицированный пептид не обладает способностью осуществлять повышающую регуляцию экспрессии антигенов класса II и костимулирующих молекул и индуцировать производство цитокинов ДК в ответ на обработку конидиями. В совокупности эти данные свидетельствуют о новой ранее неизвестной иммунорегуляторной ролиTA1 активирует зависящий от МуD88 каскад посредством зависящего от ТПР сигнала В присутствии конидий Aspergillus возникает зависящий от ТПР сигнал, который опосредует функциональные ответы на гриб. TA1 вызывает сильную активацию экспрессии TLR2, TLR5 и TLR9 на мышиных ДК, причем TLR2 и TLR9 могут также активироваться при совместном воздействии конидий иTA1, в то время как экспрессия TLR5 при этом ингибируется. И в этом случае модифицированный пептид не обладает способностью активировать экспрессию TLR2 и TLR9 ни индивидуально, ни в сочетании с обработкой конидиями. Способность ТА 1 активировать зависящий от ТПР сигнал подтверждается результатами исследований на клетках линии НЕК 293, трансфектированных TLR2, TLR9 и TLR4/CD14, в которых оценивали производство IL-8 в ответ на обработку только ТА 1 или на обработку в сочетании с соответствующими ТПР-лигандами. В опытах на таких клетках линии НЕК 293 ТА 1 существенно повышал производство IL8 клетками, трансфектированными TLR9, как при его применении индивидуально, так и при применении совместно с лигандом TLR9 CpG. При этом ТА 1 не стимулировал производство IL-8 трансфектированными TLR2 клетками при его применении индивидуально, но несколько повышал производство IL-8 в этих клетках в ответ на стимуляцию зимозаном. Кроме того, ТА 1 не индуцировал производство IL-8 в клетках, трансфектированных TLR4/CD14, как при его применении индивидуально, так и в ответ на обработку лигандом TLR4 ЛПС (липополисахаридом). ТА 1 оказывал также влияние на способность мышиных ДК продуцировать IL-12 р 70 и IL-10 в ответ на указанные лиганды микробных ТПР. ТА 1 не оказывал влияния на производство цитокинов в ответ на Poly(I:C) или ЛПС (TLR4), ТА 1 вызывал существенное увеличение производства IL-12 р 70 и снижал производство IL-10 р 70 после стимуляции зимозаном и LTA (TLR2) и CpG (TLR9). Следовательно, ТА 1, по-видимому, обладает способностью передавать сигнал непосредственно через TLR9 и усиливать TLR2-сигнал, стимулированный соответствующим лигандом. Активация как NF, так и МАРК р 38, представляет собой первые события в стимуляции, индуцируемой ТПР генной экспрессии, причем в предыдущих исследованиях было установлено, что ТА 1 активирует пути трансдукции МАРК. Для усиления своего участия в индуцируемых ТПР каскадах ТА 1 индуцирует ядерную транслокацию NF-kB, а также фосфорилирование р 38 (оба процесса не стимулировали ни конидии индивидуально, ни модифицированный пептид, ни модифицированный пептид плюс конидии). Кроме того, ингибиторы ядерной транслокации NF-kB (SN50) или МАРК р 38 (SB202190) устраняли воздействие ТА 1 на ДК. Фактор миелоидной дифференцировки 88 (MyD88) представляет собой один из адаптерных белков,необходимый для активации NF-kB и МАРК и производства IL-12 р 70 после возникновения ТПРсигнала. Влияние ТА 1 и конидий на производство IL-12 р 70 и влияние ТАI1 на производство IL-10 в значительной степени устраняется у мышей с дефицитом MyD88. Таким образом, зависящий от MyD88 каскад, по-видимому, играет существенную роль в механизме действия ТА 1 in vitro. Для оценки того,играет ли зависящий от MyD88 каскад существенную роль также и в механизме действия ТА 1 in vivo,производили оценку местного роста грибов после заражения грибами р. Aspergillus мышей дикого типа и мышей с дефицитом TLR2, TRL9 или MyD88. Рост гриба у мышей с дефицитом TLR2 и TLR9 был сравним с ростом гриба у мышей дикого типа и на него оказывала аналогичное влияние обработка тимозином. Рост гриба был сравним также с ростом гриба у мышей с дефицитом MyD88, однако у этих мышей на него не оказывала влияние обработка ТА 1. Таким образом, несмотря на то, что употребление ТПР до некоторой степени является излишним, зависящий от MyD88 каскад сигнала, по-видимому, является необходимым для проявления активности ТА 1 как in vitro, так и in vivo. ТА 1 защищает ТКМ-мышей от ИА Обработка ТА 1, в отличие от обработки модифицированным пептидом, по-видимому, позволяет лечить ТКМ-мышей с ИА, о чем свидетельствует повышение выживаемости и соответствующее уменьшение роста гриба в легких. Критерием защитного действия является зависящая от дозы полная защита(выживаемость в течение 60 дней), которая достигается у мышей, обработанных 200 и 400 мкг/кг ТА 1,и оно превосходит защитное действие амфотерицина В. Кроме того, ТА 1 повышает терапевтическую эффективность амфотерицина В, о чем свидетельствует повышение выживаемости и уменьшение роста гриба у мышей, обработанных обоими агентами. Кроме того, ТА 1 уменьшает также легочную патологию. На срезах легкого инфицированных мышей видно наличие многочисленных гифов Aspergillus, ин-5 008037 фильтрующихся в паренхиму легкого, сопровождающееся выраженными признаками повреждения бронхиальной стенки и некрозом и недостаточным рекрутментом воспалительных клеток. В противоположность этому указанные особенности не наблюдаются у мышей, обработанных ТА 1, легкие которых характеризуются заживляющими инфильтратами воспалительных клеток, при этом отсутствуют рост гриба и разрушения бронхиальной стенки. Таким образом, ТА 1 может обладать терапевтической эффективностью в отношении ИА и может оказывать благоприятное действие в сочетании с противогрибковыми лекарственными средствами, в отношении которых известно, что они обладают пониженной активностью при ТКМ.TA1 ускоряет восстановление миелоидов и Тh1-клеток у мышей с ИА После обработки TA1 существенно увеличивается абсолютное количество лимфоцитов и нейтрофилов в кровотоке. Важно отметить, что уровни нейтрофилов в крови не позволяют предсказать наличие чувствительности к аспергиллзу. Однако по данным цитофлуорометрического анализа количество CD4- и CD8 -клеток и нейтрофилов в легких существенно возрастало после обработки ТКМ-мышей TA1. Указанные легочные CD4 -Т-лимфоциты обладают функциональной активностью, которая проявляется в антигенспецифической пролиферации и производстве IFN-гамма. Концентрация Th1-клетокпродуцентов (которые продуцируют IFN-гамма) является более высоким, a Th2-клеток-продуцентов(продуцирующих IL-4) более низким у мышей, обработанных TA1. Кроме того, с точки зрения противогрибковой активности эффекторных фагоцитов конидиоцидная активность как макрофагов, так и нейтрофилов является более высокой у мышей, обработанных TA1. Таким образом, по-видимому, TA1 не только стимулирует созревание ДК, но также активирует местные эффекторные клетки в отношении немедленного фагоцитоза и уничтожения гриба. Восстановление после нейтропении, например, с помощью обработки только дозой G-CSF, который, как известно, ускоряет восстановление нейтрофилов у мышей, недостаточно для обеспечения степени противогрибковой устойчивости, сравнимой с той, которая достигается с помощью TA1. Аналогично этому, несмотря на значительное восстановление нейтрофилов, терапевтическая эффективность TA1 у мышей, лишенных Т-клеток или Thi-клеток, продуцирующих IFN-гамма, является не столь высокой. Кроме того, повышение терапевтической эффективности TA1 достигается в присутствии увеличенного количества Th1-клеток, которое имеет место у мышей с дефицитом IL-4. Таким образом, хотя нейтрофилы играют существенную роль в обеспечении противогрибковой устойчивости с помощью лекарственной терапии в отсутствие адаптивного Th1-зависимого иммунитета, достижение состояния полной защиты от гриба, которое, по-видимому, может быть получено путем обработки TA1, может быть обусловлено скоординированным действием природных эффекторных фагоцитов и защитных Th1-клеток. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой грибом р. Aspergillus, у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят фармацевтическую композицию, содержащую количество тимозина альфа 1 (ТА 1), которое обладает эффективным противогрибковым действием. 2. Способ по п.1, в котором ТА 1 вводят в дозе, достаточной для активации дендритных клеток для продуцирования стимулирующих Th1-клетки цитокинов. 3. Способ по п.1, в котором ТА 1 вводят в дозе, составляющей от 200 до 400 мкг/кг веса тела/день. 4. Способ по п.1, в котором млекопитающее представляет собой хозяина с ослабленным иммунитетом. 5. Способ по п.4, в котором млекопитающее представляет собой человека. 6. Способ по п.5, в котором человек является реципиентом трансплантата костного мозга. 7. Способ по п.5, в котором ТА 1 вводят для активации дендритных клеток для продуцирования стимулирующих Th1-клетки цитокинов. 8. Способ по п.5, в котором ТА 1 вводят в дозе, составляющей от 200 до 400 мкг/кг веса тела/день. 9. Способ по п.1, который дополнительно заключается в том, что пациенту вводят по меньшей мере один дополнительный противогрибковый агент. 10. Способ по п.9, в котором дополнительный противогрибковый агент представляет собой амфотерицин В. 11. Способ по п.10, в котором амфотерицин В вводят в дозе 4000 мкг/кг веса тела/день. 12. Способ по п.1, в котором инфекция, вызываемая грибами р. Aspergillus представляет собой инвазивный аспергиллз.