Фармацевтическая комбинация таксотера&r; или его производных с флавопиридолом

007815 Настоящее изобретение относится к комбинациям Таксотера (Taxotere) или его производных и другого соединения, обладающего терапевтической активностью при лечении неопластических заболеваний, в частности флавопиридола. Таксаны и таксоиды относятся к семейству дитерпеновых соединений природного происхождения,включающих мощное противоопухолевое лекарственное средство, паклитаксел. Паклитаксел (Taxol), первоначально выделенный из коры тиса тихоокеанского (Taxus brevifolia),оказался высокоэффективным веществом, используемым в дополнительной и неоадъювантной терапии пациентов с раком молочной железы и яичников. Недавно было установлено, что полусинтетический аналог этого вещества доцетаксел (Taxotere) также эффективен при химиотерапии рака молочной железы, что расширяет число заболеваний, чувствительных к рассматриваемому классу противоопухолевых препаратов, включающих рак легких и рак толстой кишки. Так, Taxotere (доцетаксел), связываясь с тубулином, ингибируют разъединение микротрубочек и ухудшают митоз, вследствие чего блокируется прогрессия через М-фазу клеточного цикла и облегчается апоптоз. Несмотря на несомненный успех применения таксоидов в общей клинической практике, некоторые опухоли обладают устойчивостью к действию таких лекарственных средств. Такая устойчивость к лекарственным средствам может определяться природой опухоли или может развиваться в ней во времени. Описано три основных механизма устойчивости к лекарственным средствам: (i) точечные мутации тубулинового гена, (ii) селекция тубулиновых изоформ с низкой степенью связывания с таксанами, и (iii) экспрессия фенотипа, резистентного ко многим лекарствам (MDR), опосредованная оттоком Р-гликопротеина (Р-gp), кодируемым mdr1 геном. Механизм (iii) может объяснять врожденную резистентность экспрессировать P-gp, например, злокачественных опухолей толстой кишки и почек. Комбинации или ассоциаты настоящего изобретения способствуют исключению или замедлению явления плейотропной резистентности или "устойчивости к действию множества лекарственных средств". Получение Таксотера и его производных является предметом изобретения, например, европейских патентов ЕР 0253738 и ЕР 0253739, а также международной заявки РСТ WO92/09589. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, и это составляет предмет настоящего изобретения, что эффективность Таксотера и его производных может быть существенно повышена при их совместном применении в комбинации, по меньшей мере, с одним веществом, терапевтически эффективным в противоопухолевом лечении, механизм действия которого идентичен или отличен от механизма действия этих таксанов. Среди веществ, которые могут использоваться в ассоциации или в комбинации Таксотером или его производными, может быть упомянута циклинзависимая киназа флавопиридол. Настоящее изобретение, главным образом, относится к комбинациям Таксотера или его производных с циклинзависимой киназой, флавопиридолом. Циклинзависимые киназы (CDKs) являются важными регуляторами, контролирующими тайминг и координацию клеточного цикла. CDKs образуют обратимые комплексы с их обязательными циклиновыми партнерами с целью регуляции перехода через ключевые швы в клеточном цикле. Так, например, активированный СDK4-циклиновый D1 комплекс контролирует движение через фазу G1, тогда как CDK1 циклиновый В 1 комплекс контролирует вход в миотическую фазу клеточного цикла. Известно, что протеины, ингибирующие эндогенные циклинзависимые киназы (CDKls), связывают CDK или циклиновый компонент и ингибируют активность киназы. Во многих опухолях, например меланомах, а также злокачественных опухолях поджелудочной железы и пищевода, такие природные CDKls либо отсутствуют,либо мутированы. Таким образом, селективные ингибиторы CDK могут оказаться эффективными химиотерапевтическими агентами. Флавопиридол (цис-5,7-дигидрокси-2-(2-хлорфенил)-8-[4-(3-гидрокси-1-метил)пиперидинил]-1-бензопиран-4-он) представляет собой синтетический флавон, который, как было показано, обладает противоопухолевой активностью в отношении таких различных линий опухолевых клеток, как карцинома легких человека, карцинома молочной железы, а также ингибирует опухолевый рост в моделях ксенотрансплантантов. Было показано, что это вещество индуцирует задержку клеточного цикла как в фазе G1, так и в фазе G2. Флавопиридол является мощным и селективным ингибитором CDKs, и его противоопухолевая активность связана со способностью ингибировать CDK. Как показали исследования, ингибирующая активность этого вещества в отношении роста опухолевых клеток проявляется в клеточном цикле особым образом. См. Bioorg.Med. Chem. Letters 10:1037-1041 (2000). Таксотер и флавопиридол обладают различными механизмами действия, которые способны повышать эффективность каждого из препаратов. Улучшенная эффективность комбинации настоящего изобретения может быть продемонстрирована определением терапевтической синергии. Такая комбинация проявляет терапевтический синергизм, если ее терапевтическое действие превосходит действие каждого из компонентов, используемых в оптимальной дозировке. (Т.Н. Corbett et al., Cancer Treatment Reports,66: 1187 (1982.-1 007815 Для демонстрации эффективности комбинации может оказаться необходимым сравнение максимальной переносимой дозы комбинации с максимальной переносимой дозой каждого из исследуемых компонентов в отдельности. Такая эффективность может быть количественно определена, например, какlog10 лизиса клеток, который определяют в соответствии со следующей формулой:Log10 лизиса клеток = Т - С (дни)/3,32 х Td где Т - С представляет собой время, пошедшее на рост клеток, являющееся средним числом дней роста опухолей в группе (Т), получавшей лечение, и опухолей в группе (С), получавшей лечение, до заранее определенной массы (например, 1 г), Td представляет собой число дней, требующееся для удвоения объема опухоли у контрольных животных (Т.Н. Corbett et al., Cancer, 40, 2660-2680 (1977); F.M. Schabel et al.,Cancer Drug Development, Part B, Methods in Cancer Research, 17, 3-51, New York, Academic Press Inc.(1979. Продукт считается активным, если log10 клеточного лизиса выше или равен 0,7. Очень активный продукт имеет значение lоg10 лизиса клеток более 2,8. Комбинация, применяемая с собственной максимально переносимой дозой, в которой каждый из компонентов присутствует в дозе, обычно не превосходящей его максимальную переносимую дозу, будет проявлять терапевтическую синергию, когда log10 клеточного лизиса выше значения log10 клеточного лизиса наилучшего компонента при его отдельном применении. Эффективность комбинаций на твердых опухолях может быть определена экспериментально следующим образом. В нулевой день животным, подвергаемым эксперименту, обычно мышам, подкожно билатерально трансплантируют 30-60 мг опухолевого фрагмента. Животных с опухолями перемешивают перед проведением различных лечебных и контрольных мероприятий. В случае лечения запущенных опухолей новообразованиям дают развиваться до желаемого размера, причем животных с недостаточно развитыми опухолями устраняют. Отобранных животных распределяли случайным образом и отбирали в группу,которую подвергали лечебным процедурам, и в контрольную группу. Животные, не имеющие опухолей,также могут подвергаться лечению, аналогичному используемому для животных с опухолями, с целью раздельного определения токсического действия и специфического влияния на опухоль. Химиотерапевтические процедуры обычно начинали через 3-22 дня после трансплантации в зависимости от типа опухоли и животных подвергали ежедневному обследованию. Различные группы животных взвешивали 3 или 4 раза в неделю до достижения максимальной потери веса и затем эти группы взвешивали, по меньшей мере, раз в неделю до окончания опыта. Опухоли взвешивали 2 или 3 раза в неделю до достижения опухоли весом примерно в 2 г или до момента смерти животного, если это случалось до образования опухоли весом в 2 г. После смерти животных подвергали аутопсии. Противоопухолевую активность определяли в соответствии с различными параметрами, указанными в табл. 1 и 2. В целях изучения влияния комбинаций на лейкемии животным трансплантировали ряд клеток и противоопухолевую активность определяли по увеличению времени выживания обработанных мышей по сравнению с контрольной группой. Продукт считался активным, если увеличение времени выживания составляло 27%, и считался очень активным, если время выживания увеличивалось на 75% в случае лейкемий Р 388. В следующих ниже примерах мышам трансплантировали аденокарциному молочной железы МА 13/С и обрабатывали комбинациями Таксотера и флавопиридола, используя различные схемы и способы применения. Таксол и таксотер, как и флавопиридол, могут применяться перорально, а также внутривенно. В некоторых из применяемых схем наблюдалась отчетливая терапевтическая синергия. Дополнительные цели и преимущества настоящего изобретения частично изложены в следующем ниже описании и частично вытекают из него или могут быть проиллюстрированы практической реализацией настоящего изобретения. Цели и преимущества изобретения могут быть реализованы и достигнуты с помощью элементов и комбинаций, указанных в прилагаемой формуле изобретения. Следует иметь в виду, что приведенное выше общее описание и следующее подробное описание носят лишь иллюстративный и разъяснительный характер и не ограничивают заявленное изобретение. Пример 1. С целью определения активности каждого компонента комбинации Таксотер и флавопиридол применялись по отдельности на мышах с опухолью MA 13/C. Таксотер применяли внутривенно на 15 и 21 день; дозировка, применяемая в каждый из указанных дней, составляла 30 мг/кг при общей дозировке 60 мг/кг. При раздельном применении используемая дозировка обеспечивала значение lоg10 лизиса клеток, равное 4,7, и полную реакцию всех 5 мышей, подвергнутых указанной обработке. Применение одного флавопиридола на 15 и 21 день испытания с ежедневной дозировкой 6 мг/кг, при общей дозе 12 мг/кг, не обеспечивало полной ответной реакции у 5 испытуемых мышей. Затем соединения объединяли двумя способами и испытывали по периодической схеме. При использовании первой комбинации флавопиридол применяли первым на 15 и 20 дни (общая дозировка составляла 9 мг/кг), а Таксотер применяли в следующие за указанными 16 и 21 дни (общая дозировка со-2 007815 ставляла 45 мг/кг). При такой схеме применения lоg10 лизиса клеток составил 5,5, и обеспечивалось 5 из 5 полных ответных реакций у мышей, подвергнутых обработке. При использовании такой периодической схемы применения было достигнуто значение lоg10 лизиса клеток, лучшее, чем при применении одного Таксотера, и обеспечивалось 5 из 5 полных ответных реакций, несмотря на тот факт, что в этой комбинации применяли на 25% меньше Таксотера и на 25% меньше флавопиридола, чем в контрольной группе. В том случае, когда компоненты комбинации меняли местами и Таксотерприменяли первым на 15 и 20 день, а флавопиридол применяли в тех же количествах на 16 и 21 дни испытания, lоg10 лизиса клеток имел несколько меньшее значение, чем при применении одного Таксотера, однако, и в этом случае отмечалось 5 из 5 полных ответных реакций. В табл. 1 проиллюстрированы полученные результаты и показано, что комбинация флавопиридола и Таксотера, применяемых в меньших на 25% количествах, обладает эффективностью, аналогичной эффективности одного Таксотера. Таблица 1 Действие комбинации флавопиридол-Таксотер на мышей с опухолью MA 13/C: через 24 чTd = 2,2 дня; контрольное время достижения опухоли весом 1 г = 20,3 дня; средний вес в начале лечения = 130-160 мгCR = полная ответная реакция; IV - внутривенно; bwl = потеря веса тела при максимальной циркулирующей дозе; (DT) = общая доза; HNTD = наивысшая нетоксичная доза; lck = lоg10 лизиса клеток Пример 2. При увеличении числа дней введения флавопиридола было установлено, что при использовании на мышах с опухолью MA 13/C аналогичных доз флавопиридола, вводимого в течение 8 дней в ходе 10 дневного цикла, при введении Таксотера в первый и последний день десятидневного цикла, отмечался явный синергетический эффект. В следующей ниже табл. 2 приведены наивысшие нетоксичные общие дозы каждого компонента в отдельности - 96,8 мг/кг для Таксотера и 23,2 мг/кг для флавопиридола. При введении указанных компонентов в комбинации, когда Таксотер применяли на 14 и 23 день, а флавопиридол в течение 14-17 дня и 20-23 дня, было установлено, что три комбинации обладают выраженным синергическим действием, а эффективность четвертой комбинации равна эффективности действия одного Таксотера. Все четыре комбинации обеспечивали 6 из 6 полных ответных реакций, т.е. давали 100% ответную реакцию. Исследование зависимости доза-реакция (3-arm dose-response study) проводили на мышах С 3 Н/HeN с измеримыми опухолями в начале лечения (230 мг). В качестве модели использовалась аденокарцинома молочной железы мышей МА 13/С, выбор которой был обусловлен химиотерапевтической чувствительностью к доцетакселу. Мышей обрабатывали флавопиридолом (например, раз в день в период с 14 по 17 день и на 20-23 дни после имплантации опухоли), или доцетакселом (например, на 14 и 23 дни), или их комбинацией. Результаты: при наивысшей нетоксичной дозе (HNTD, 2,9 мг/кг/доза, общая доза 23,2 мг/кг) флавопиридол, применяемый IV (внутривенно) в качестве единственного агента, оказался неактивным со значением log лизиса клеток нетто -0,4 (log лизиса клеток нетто = замедление роста опухоли - длительность обработки/3,32 х время удвоения объема опухоли), без полной регрессии (CR). HNTD доцетаксела,применяемого отдельно (48,1 мг/кг/инъекция, общая доза 96,8 мг/кг), оказалась очень активной (log лизиса клеток нетто, равный 3, 6/6 CR). Отчетливый синергетический эффект наблюдался при наивысшей-3 007815 нетоксичной комбинации (флавопиридол в количестве 1,93 мг/кг/доза и доцетаксел в количестве 53,2 мг/кг/инъекция) при log лизиса клеток нетто 7,6 и 6/6 CR. Такая комбинация оказалась хорошо переносимой, и при ее использовании максимальная потеря веса тела в 13% происходила через 6 дней после последней обработки. Синергетический эффект сохранялся при использовании 2 дополнительных более низких уровней дозировки по сравнению с HNTD доцетаксела. Аналогичный синергетический эффект наблюдался при пероральном применении флавопиридола. Таблица 2 Комбинация флавопиридол-Таксотер Аденокарцинома молочной железы МА 13/С "повторное воздействие"Td = 2,2 дня; контрольное время достижения опухоли весом 1 г = 17,8 дня; средний вес в начале лечения = 210-260 мг; CR = полная ответная реакция; IV - внутривенно; bwl = потеря веса тела при максимально циркулирующей дозе; (DT) = общая доза; HNTD = наивысшая нетоксичная доза; lck = lоg10 лизиса клеток Пример 3. Внутривенные инъекции Таксотера производили на 14 и 25 дни после имплантации опухоли. Флавопиридол применяли перорально 1 раз в день, в период с 14 по 18 день и с 21 до 25 день. Флавопиридол (перорально) - додетаксел (внутривенно) Пролонгированное воздействие на MA 13/C 320 мг - вес опухоли на 14 день(ВСМ-1252) -эксперимента Как и в примере 2, было обнаружено, что комбинация приема доцетаксела с повторным ежедневным приемом флавопиридола более активна, чем любой из компонентов в отдельности при эквитоксичных дозировках. Синергетический эффект иллюстрируется 4-кратным увеличением log лизиса клеток. Другие воплощения настоящего изобретения станут очевидными для специалиста при рассмотрении приведенного описания и раскрытых в нем практических аспектов изобретения. Описание и примеры представлены лишь в целях иллюстрации изобретения, а истинная область и сущность изобретения указаны в следующей ниже формуле изобретения.-4 007815 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Фармацевтическая комбинация, содержащая по меньшей мере два компонента, один из которых представляет собой Таксотер (доцетаксел) или его производные, а второй компонент представляет собой флавопиридол. 2. Фармацевтическая комбинация, обладающая терапевтический синергией при лечении неопластического заболевания, включающая Таксотер и флавопиридол. 3. Фармацевтическая комбинация по п.2, компоненты которой вводят раздельно и через промежутки времени. 4. Фармацевтическая комбинация по п.2, в которой Таксотер вводят в первый и последний дни десятидневного цикла лечения, а флавопиридол вводят в первые 4 дня и последние 4 дня указанного десятидневного цикла. 5. Фармацевтическая комбинация по п.2, в которой Таксотер вводят на 14 и 23 день, а флавопиридол вводят в периоды с 14 по 17 день и с 20 по 23 день. 6. Фармацевтическая комбинация по п.2, в которой неопластическим заболеванием является рак молочной железы. 7. Способ лечения рака молочной железы, включающий введение комбинации по п.1, в котором введение указанных компонентов комбинации осуществляют раздельно и при этом флавопиридол вводят перорально. 8. Способ лечения рака молочной железы, включающий введение комбинации по п.1, в котором указанные компоненты комбинации вводят раздельно и через промежутки времени и при этом флавопиридол вводят перорально. 9. Способ по п.8, в котором Таксотер вводят в первый и последний дни десятидневного цикла лечения, а флавопиридол вводят в первые 4 дня и последние 4 дня указанного десятидневного цикла. 10. Способ по п.8, в которой Таксотер вводят на 14 и 23 день, а флавопиридол вводят в периоды с 14 по 17 день и с 20 по 23 день.