Стимулятор роста возбудителя туберкулеза, питательная среда для выделения возбудителя туберкулеза, способ получения питательной среды, способ выделения возбудителя туберкулеза

005527 Изобретение касается медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных лабораториях медицинского и ветеринарного профиля. В медицинской и ветеринарной микробиологии известны способы выделения возбудителя туберкулеза, питательные среды для выделения возбудителя туберкулеза, способы их приготовления и стимуляторы роста для выделения возбудителя туберкулеза. Известен стимулятор роста возбудителя туберкулеза, который содержит химические соединения, в состав которых входят натрии, кислород, водород, углерод [1]. Использование известного стимулятора не обеспечивает достаточного ускорения роста микобактерий туберкулеза. Наиболее близким к заявленному, является известный стимулятор роста возбудителя туберкулеза,который содержит химические соединения, в состав которых входят натрий, кислород, .водород, углерод[2]. Использование такого стимулятора позволяет сократить время роста микобактерий туберкулеза, но также незначительно. Известна питательная среда для выделения возбудителя туберкулеза, которая содержит питательные белковую и полисахаридную составляющие, химические реагенты, растворитель [3]. Наиболее близкой к заявленной питательной среде является питательная среда для выделения возбудителя туберкулеза, которая содержит питательные белковую и полисахаридную составляющие, химические реагенты, растворитель [4]. Известные питательные среды не содержат достаточного набора ингредиентов для обеспечения желаемой скорости выделения возбудителя туберкулеза. Наиболее близким к заявленному способу получения питательной среды является способ, который предусматривает измельчение исходных компонентов (составляющих среды), приготовление смеси из питательной основы и растворителя [4]. Однако начало роста колоний возбудителя туберкулеза на этой среде проявляется только через 20-60 суток, а иногда через 3 месяца. Известен способ выделения возбудителя туберкулеза на питательной среде, который предусматривает приготовление среды, подготовку патологического материала, высев патологического материала на питательную среду с последующим термостатированием [5]. Такой способ позволяет упростить методику исследований, улучшить условия безопасности, но он достаточно длительный. Наиболее близким к заявленному способу выделения возбудителя туберкулеза на питательной среде является способ, который предусматривает приготовление среды, подготовку патологического материала, высев патологического материала на питательную среду с последующим термостатированием [4]. Благодаря такому современному способу через достаточно короткий срок после термостатирования проявляется рост всех культур, но он может быть усовершенствован как по срокам определения роста культур, так и по уменьшению материальных затрат на его осуществление. В основу изобретения поставлена задача создания нового стимулятора роста и новой питательной среды с использованием этого стимулятора, а также разработка способа получения такой питательной среды и разработка способа выделения возбудителя туберкулеза на этой питательной среде, который благодаря снижению продолжительности инкубирования материала до 24-48 ч обеспечит сокращение времени диагностики туберкулеза и бактериологического исследования при одновременном повышении чувствительности метода. Поставленная задача решается тем, что согласно изобретению заявляется стимулятор роста возбудителя туберкулеза, содержащий химические соединения, в состав которых входят элементы: натрий,кислород, водород, углерод, который характеризуется следующим составом ингредиентов, мас.%: Сахароза 2,0-5,0Cпирт ректифицированный 0,1-0,9 Натрий двууглекислый 0,05-0,15 Натрий пироцитрат двузамещенный 0,005-0,9 Растворитель До 1000 мл рН 7,20,2 В качестве растворителя заявляемый стимулятор содержит дистиллированную или бидистиллированную воду. Стимулятор роста может дополнительно содержать 0,1-0,9 мас.% кальция хлористого. Стимулятор роста согласно изобретению может также содержать 0,01-0,4 мас.% крахмала картофельного и 01-0,02 мас.% глюкозы безводной. Предлагается также питательная среда для выделения возбудителя туберкулеза, содержащая питающие белковую и полисахаридную составные, химические соединения, растворитель, которая согласно изобретению в качестве белковой составляющей содержит сухой ферментативный пептон, в качестве полисахаридной составляющей - крахмал картофельный, в качестве химических соединений - натрий углекислый, стимулятор кальцийзависимых ферментов, а также заявляемый стимулятор роста возбудителя туберкулеза, дополнительно в состав питательной среды входит агар-агар, при следующем соотношении компонентов, мас.%: Сухой ферментативный пептон 5-7 Агар-агар 1,4-1,6-1 005527 Крахмал картофельный 1,377-1,577 Стимулятор кальцийзависимых ферментов 0,012-0,014 Натрий углекислый 0,005-0,015 Стимулятор роста возбудителя туберкулеза 10-18 Растворитель Остальное Питательная среда согласно изобретению в качестве стимулятора кальцийзависимых ферментов содержит кальций хлористый, и стимулятор роста возбудителя туберкулеза применяют в виде водного раствора. Содержание аминного азота в готовой питательной среде составляет не менее 1,8%. Предлагается также способ получения питательной среды, который предусматривает приготовление смеси из питательной основы, содержащей питающие белковую и полисахаридную составляющие,химические соединения и растворитель, при этом к питательной основе для культивирования микобактерий согласно изобретению добавляют стимулятор роста возбудителя туберкулеза при массовом соотношении от 1:20 до 1:25 соответственно. Растворимость, прозрачность и окрашенность питательной основы характеризуется раствором прозрачной, желтой окраски, который получают после кипячения полностью растворенной навески питательной основы весом 9 г в 100 мл дистиллированной воды при ее перемешивании и кипячении в течение 2-3 мин. Перемешивание компонентов осуществляют в течение 5-10 мин. Согласно изобретению питательную основу в количестве 9,0 г размешивают в 100 мл очищенной воды, кипятят 2-3 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, после чего стерилизуют при температуре (1211)С в течение 15 мин в паровом стерилизаторе. После стерилизации питательную основу разливают в асептических условиях в стерильные чашки Петри слоем 6-8 мм. Поставленная задача решается также способом выделения возбудителя туберкулеза на питательной среде, который предусматривает приготовление питательной основы, подготовку патологического материала, высев патологического материала на питательную основу, дальнейшее термостатирование, при этом согласно изобретению перед высевом на питательную основу подготовленный посевной материал обрабатывают заявляемым стимулятором роста возбудителя туберкулеза в соотношении от 1:1 до 1:1,5 в течение 24-48 ч при температуре 36-38 С, после чего посевной материал вместе со стимулятором роста,которым его обрабатывали, вносят в чашки Петри в дозе 0,5-1,5 мл на питательную основу, содержащую белковую составляющую в виде сухого ферментативного пептона, полисахаридную составляющую в виде крахмала картофельного, агар-агар, натрий углекислый, стимулятор кальцийзависимых ферментов,при этом питательную основу готовят непосредственно перед высевом патологического материала, а чашки Петри со средой и посевным материалом не переворачивают и размещают в термостате крышками кверху. Лучший вариант осуществления изобретения Способ выделения возбудителя туберкулеза на питательной среде согласно изобретению осуществляют в следующей последовательности: патологический материал (посевной материал - мокрота, кровь, спинномозговая жидкость, части тканей и др.) так же, как и тест-культуры микроорганизмов (Mycobacterium tuberculosis H 37 RV- возбудитель туберкулеза людей, Mycobacterium bobis - возбудитель туберкулеза большого рогатого скота), перед посевом обрабатывают стимулятором роста возбудителя туберкулеза. К подготовленному согласно с общепринятым методом патологическому материалу добавляли стимулятор роста возбудителя туберкулеза в массовом соотношении 1:1, после чего термостатировали 48 ч при температуре 36-38 С и высевали в дозе 1 мл вместе со стимулятором роста, которым обрабатывали этот материал, в чашки Петри на питательную основу, приготовленную непосредственно перед высевом патологического материала. Чашки Петри со средой и посевным материалом, не переворачивая, размещали в термостате крышками вверх. Посев на питательной среде в чашках Петри выдерживали в термостатах при температуре 36 +1 С в течение 5 суток. Отсутствие роста микобактерий после 5 суток считается негативным результатом, что подтверждает отсутствие заболевания. Питательная среда предназначена для эффективного культивирования микобактерий туберкулеза,их ускоренного выявления в инфицированном материале (кровь, мокрота, моча и др.). Одновременно с этим увеличивается выход - "урожайность" микобактерий туберкулеза на питательной среде, что обеспечивает более высокую точность диагностики туберкулеза. Эффективность предложенной питательной среды заключается в ее специфичности, простоте при приготовлении, хранении и транспортировке. В результате сравнительных испытаний установлено, что на известной среде [4] рост микобактерий появился через 20-90 суток всех исследуемых культур. На предлагаемой же среде через 18-24 ч после термостатирования отмечался рост всех культур. Через 72 ч наблюдался газонный рост колоний микобактерий.-2 005527 Таким образом, реализация заявляемого изобретения позволяет сократить продолжительность инкубирования материала, время диагностики туберкулеза, повысить чувствительность метода, сократить бактериологические исследования в 30-90 раз. Для лучшего понимания заявляемого изобретения ниже приведены примеры. Пример 1. Способ выделения возбудителя туберкулеза на питательной среде согласно изобретению осуществляли в следующей последовательности: патологический материал (посевной материал - мокрота, кровь,спинно-мозговая жидкость, части тканей и др.) так же, как и тесткультуры микроорганизмов (Mycobactenum tuberculosis H 37 RV- возбудитель туберкулеза людей, Mycobacterium bobis - возбудитель туберкулеза большого рогатого скота), перед посевом обрабатывали стимулятором роста возбудителя туберкулеза. К подготовленному согласно с общепринятым методом патологическому материалу добавляли стимулятор роста возбудителя туберкулеза в массовом соотношении 1:1, после чего термостатировали 24 ч при температуре 36-38 С и высевали в дозе 0,5 мл вместе со стимулятором роста, которым обрабатывали этот материал, в чашки Петри на питательную основу, приготовленную непосредственно перед высевом патологического материала. Чашки Петри со средой и посевным материалом, не переворачивая, размещали в термостате крышками вверх. Посев на питательной среде в чашках Петри выдерживали в термостатах при температуре 36 +1 С в течение 1-5 суток. Учет результатов проводили визуально в течение 5 суток. В результате эксперимента установлено, что через 48 ч рост культур возбудителя туберкулеза как тест-культур, так и патологического материала наблюдался в виде газонного роста. Для осуществления заявляемого способа был приготовлен стимулятор роста возбудителя туберкулеза следующего состава: Сахароза 3,0 г Спирт ректифицированный 0,4 г Натрий двууглекислый 0,05 г Натрий пироцитрат двузамещенный 0,005 г Вода дистиллированная До 1000 мл рН 7,2 0,2 Полученный стимулятор роста - стерильная, прозрачная, бесцветная жидкость (допускается желтоватый оттенок) должен быть стерильным, рН определяют потенциометрически. Непосредственно перед высевом обработанных стимулятором патологического материала и тесткультур готовят питательную основу следующего состава: Сухой ферментативный пептон 60 г Агар микробиологический 15 г Натрий углекислый 0,1 г Крахмал картофельный 14,77 г Кальций хлористый 0,13 г Стимулятор роста 180 г Растворитель До 1000 мл Массовое соотношение стимулятора роста возбудителя туберкулеза и питательной основы составляет соответственно 1:20. При визуальном определении раствор питательной среды должен быть прозрачным, желтой окраски. Ее растворимость, прозрачность и цвет определяют следующим образом: навеска в количестве 9 г должна полностью растворяться в 100 мл воды, очищенной при перемешивании и кипячении в течение 2-3 мин. Допускается опалесценция - не больше 5 единиц по стандартному образцу мутности (СОМ) для визуального определения мутности бактерийных суспензий. Для определения используют 7,5 мл раствора, залитого в пробирку из комплекта СОМ, рН составляет 7,20,2. Питательную среду получают следующим образом. Навеску препарата в количества 9 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, добавляют 100 мл воды очищенной, размешивают, выдерживают в термостате при температуре (322)С в течение 1 ч, раствор отфильтровывают, кипятят 2-3 мин, охлаждают в (252)С и определяют рН потенциометрически. Остаточная влажность - не большее 7,0%. Содержание аминного азота в готовой питательной среде составляет 1,87%. Метод определения основан на блокировании формальдегидом с рН 7,0 свободных аминогрупп и титровании щелочью эквивалентного количества карбоксильных групп. Начало и конец титрования определяют потенциометрически. Пример 2. Выделение возбудителя туберкулеза осуществляли аналогично примеру 1, однако стимулятор роста возбудителя туберкулеза был приготовлен следующего состава: Сахароза 2,0 г Спирт ректифицированный 0,9 г-3 005527 Натрий двууглекислый 0,15 г Натрий пироцитрат двузамещенный 0,9 г Глюкоза безводная 0,02 г Крахмал картофельный 0,4 г Бидистиллированная вода До 1000 мл рН 7,20,2 Для выделения возбудителя туберкулеза на питательной среде в подготовленный согласно с общепринятым методом патологический материал добавляют стимулятор роста в массовом соотношении 1:1,5, после чего термостатируют 36 ч при температуре 36-380 и высевают в чашки Петри на питательную основу в дозе 1,0 мл вместе со стимулятором роста, которым обрабатывали этот материал. В состав питательной среды входят Сухой ферментативный пептон 50 г Агар-агар 16 г Натрий углекислый 0,15 г Крахмал картофельный 13,77 г Стимулятор кальцийнезависимых ферментов (кальций хлористый) 0,12 г Стимулятор роста возбудителя туберкулеза 100 мл Дистилированная вода До 1000 мл При этом массовое соотношение стимулятора роста и питательной основы составляет соответственно 1:25. Содержание аминного азота в готовой питательной среде составляет 1,85%. Пример 3. Осуществляют аналогично примеру 1 с той разницей, что подготовленный согласно общепринятому методу патологический материал обрабатывали стимулятором роста возбудителя туберкулеза при соотношении 1:1,4 и осуществляли высев на питательную среду патологического материала в дозе 1,1 мл вместе со стимулятором роста возбудителя туберкулеза следующего состава: Сахароза 5,0 г Спирт ректифицированный 0,1 г Натрий двууглекислый 0,1 г Натрий пироцитрат двузамещенный 0,01 г Кальций хлористый 0,5 г Бидистиллированная вода До 1000 мл рН 7,20,2 Была приготовлена питательная среда следующего состава: Сухой ферментативный пептон 70 г Агар микробиологический 14 г Натрий углекислый 0,07 г Крахмал картофельный 15,77 г Кальций хлористый 0,14 г Стимулятор роста возбудителя туберкулеза 150 мл Растворитель До 1000 мл При этом массовое соотношение стимулятора роста и питательной основы составляет 1:21. Содержание аминного азота в готовой питательной среде составляет 1,85%. Источники информации: 1. Патент UA17869 А, МПК 6 12Q 1/24, 31.10.97,2. Патент UA8069 А, МПК 6 12 N 1/02, 25.12.97,3. Патент UA18613, МПК 6 С 12Q 1/02, 25.12.97,4. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. М.О. Биргера. - 3-е изд., переработанное и дополненное. М., Медицина, 1982, с.79-80,5. Патент UA12554, МПК 6 12Q 1/02, 28.02.97. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Стимулятор роста возбудителя туберкулеза, содержащий химические соединения, в состав которых входят элементы натрий, кислород, водород, углерод, отличающийся тем, что характеризуется следующим составом ингредиентов, мас.%: Сахароза 2,0-5,0 Спирт ректифицированный 0,1-0,9 Натрий двууглекислый 0,05-0,15 Натрий пироцитрат двузамещенный 0,005-0,9 Растворитель До 1000 мл рН 7,20,2-4 005527 2. Стимулятор роста по п.1, отличающийся тем, что в качестве растворителя он содержит дистиллированную или бидистиллированную воду. 3. Стимулятор роста по п.1 или 2, отличающийся тем, что он дополнительно содержит 0,1-0,9 мас.% кальция хлористого. 4. Стимулятор роста по пп.1-3, отличающийся тем, что он дополнительно содержит 0,01-0,4 мас.% крахмала картофельного и 0,01-0,02 мас.% глюкозы безводной. 5. Питательная среда для выделения возбудителя туберкулеза, содержащая питающие белковую и полисахаридную составные, химические соединения, растворитель, отличающаяся тем, что в качестве белковой составной она содержит сухой ферментативный пептон, в качестве полисахаридной составной крахмал картофельный, в качестве химических соединений - натрий углекислый, стимулятор кальцийзависимых ферментов, а также стимулятор роста возбудителя туберкулеза по любому из пп.1-4, дополнительно в состав питательной среды входит агар-агар, при следующем соотношении компонентов, мас.%: Сухой ферментативный пептон 5-7 Агар-агар 1,4-1,6 Крахмал картофельный 1,377-1,577 Стимулятор кальцийзависимых ферментов 0,012-0,014 Натрий углекислый 0,005-0,015 Стимулятор роста возбудителя туберкулеза 10-18 Растворитель Остальное 6. Питательная среда по п.5, отличающаяся тем, что в качестве стимулятора кальцийзависимых ферментов она содержит кальций хлористый. 7. Питательная среда по п.5 или 6, отличающаяся тем, что стимулятор роста возбудителя туберкулеза применяют в виде водного раствора. 8. Питательная среда по п.5, отличающаяся тем, что содержание аминного азота в готовой питательной среде составляет не менее 1,8%. 9. Способ получения питательной среды, который предусматривает приготовление смеси из питательной основы, содержащей питающие белковую и полисахаридную составные, химические соединения и растворитель, отличающийся тем, что к питательной основе для культивирования микобактерий добавляют стимулятор роста возбудителя туберкулеза по любому из пп.1-4 при массовом соотношении от 1:20 до 1:25 соответственно. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что питательную основу в количестве 9,0 г размешивают в 100 мл очищенной воды, кипятят 2-3 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватномарлевый фильтр, после чего стерилизуют при температуре (1211)С в течение 15 мин в паровом стерилизаторе. 11. Способ по п.9, отличающийся тем, что после стерилизации питательную основу разливают в асептических условиях в стерильные чашки Петри слоем 6-8 мм. 12. Способ по п.9, отличающийся тем, что растворимость, прозрачность и окрашенность питательной основы характеризуют прозрачным, желтой окраски раствором, который получают после кипячения полностью растворенной навески питательной основы весом 9 г в 100 мл дистиллированной воды при ее перемешивании и кипячении в течение 2-3 мин. 13. Способ по п.9, отличающийся тем, что перемешивание компонентов осуществляют в течение 510 мин. 14. Способ выделения возбудителя туберкулеза на питательной среде, который предусматривает приготовление питательной основы, подготовку патологического материала, высев патологического материала на питательную основу, дальнейшее термостатирование, отличающийся тем, что перед высевом на питательную основу подготовленный посевной материал обрабатывают стимулятором роста возбудителя туберкулеза по любому из пп.1-4 в соотношении от 1:1 до 1:1,5 в течение 24-48 ч при температуре 36-38 С, после чего посевной материал вместе со стимулятором роста, которым его обрабатывали, вносят в чашки Петри в дозе 0,5-1,5 мл на питательную основу, содержащую белковую составную в виде сухого ферментативного пептона, полисахаридную составную в виде крахмала картофельного, агар-агар,натрий углекислый, стимулятор кальцийзависимых ферментов, при этом питательную основу готовят непосредственно перед высевом патологического материала, а чашки Петри со средой и посевным материалом не переворачивают и размещают в термостате крышками кверху.