Вакцинная композиция, содержащая полирибозилрибитолфосфат, и способ ее получения

1 Данное изобретение относится к вакцинным композициям, более подробно, к композициям, содержащим, по крайней мере, один антиген в виде капсульного полисахарида Haemophilus influenzae типа b, полирибозилрибитолфосфата с высоким молекулярным весом, связанного со столбнячным анатоксином. Антиген, который можно применять для вакцинации человека с целью его защиты от инфекций, вызванных Haemophilus influenzae типа b, известен из предшествующего уровня техники и, в частности, из статьи "Количественный и качественный анализ антител сыворотки взрослых людей при использовании капсульных полисахаридных антигеновinfluenzae типа b и пневмококка типа 6A,конъюгированных co столбнячным токсоидом",Rachel Schneerson и др., Infect. Immun., май 1986. Этот антиген образован капсульным полисахаридом бактерий, полирибозилрибитолфосфатом (PRP), который является Тзависимым вследствие связывания с белкомносителем, столбнячным анатоксином. Как сообщается в указанной статье, испытания, проведенные на резусных детях, показали, что иммунная реакция была адекватной и в то же время более сильной и более ранней, если антиген был комбинирован с гидроксидом алюминия. Однако, как указано в другой статье ("Клинические и иммунологические реакции на капсульный полисахарид Haemophilus influenzae типа b или его конъюгат со столбнячным токсоидом у 18-23 месячных детей", Во A.Claesson и др., TheJournal of Pediatrics, май 1988), после хранения данный антиген, адсорбированный на гидроксиде алюминия, является менее иммуногенным,чем антиген, хранившийся в солевом растворе,что может быть следствием расщепления полисахарида. Для разрешения проблемы стабильностиPRP-T в предшествующем уровне техники предлагалось использовать лиофилизацию. Однако, хотя это и позволяет сохранять иммуногенные свойства антигена, данный подход имеет некоторые недостатки, особенно в отношении промышленного производства; лиофилизация и отдельные приемы кондиционирования усложняют способ производства, что повышает его стоимость. Кроме того, во время введения препарата необходимо растворять лиофилизат в соответствующей жидкости; эта процедура создает дополнительные сложности для практикующего врача и как любая манипуляция сопряжена с риском непрофессионального выполнения. Кроме того, определенные жидкие вакцинные композиции включают антигены, абсорбированные на адъюванте на основе алюминия, и должна быть обеспечена возможность добавления к ним антигена в виде PRP-T без потери иммуногенности. Действительно, жидкая композиция, известная из предшествующего 2 уровня техники, содержится в специальном шприце с двумя отделениями (первое отделение наполнено PRP-T в лиофилизованной форме, а второе отделение содержит другие антигены в водной суспензии), содержимое которых смешивают только во время введения препарата. Производство таких композиций дорого, а способ применения трудомок. Таким образом, желательно иметь жидкую вакцинную композицию, включающую антиген в виде PRP-T с сохраняющимися во времени стабильными иммуногенными характеристиками, условия получения которой обеспечивают наименьшую стоимость производства. Для решения указанных задач предложена вакцинная композиция, включающая, по крайней мере,один антиген в виде капсульного полисахаридаHaemophilus influenzae типа b или высокомолекулярного полирибозилрибитолфосфата, связанного со столбнячным анатоксином, а также адъювант на основе алюминия, отличающаяся тем, что адъювант на основе алюминия имеет точку нулевого заряда ниже 7,2. Таким образом, неожиданно было обнаружено, что при этих условиях PRP-T сохраняет с течением времени стабильные иммуногенные свойства в жидкой среде. В соответствии со специфической особенностью данного изобретения адъювант на основе алюминия включает гидроксиды алюминия, к которым добавлены соединения, образующие анионы. В соответствии с другой особенностью данного изобретения, анионы представляют собой фосфаты или цитраты. Таким образом, полученная композиция соответствует всем требованиям безопасности,предъявляемым к вакцинам. В соответствии с конкретным способом осуществления изобретения вакцинная композиция дополнительно содержит один или более вакцинных антигенов, представляющих собой дифтерийный, столбнячный, коклюшный антиген, или антиген вируса гепатита B, или антиген вируса полиомиелита. Таким образом, можно получить жидкие стабильные вакцинные композиции, в которых каждый антиген сохраняет свою иммуногенность, что позволяет практикующему врачу проводить вакцинацию одновременно против нескольких болезней без дополнительных манипуляций; это позволяет снизить стоимость препарата, сэкономить входящие в его состав компоненты и сократить количество визитов к врачу. Заявленное изобретение также относится к способу получения вакцинной композиции,включающей, по крайней мере, один антиген в виде капсульного полисахарида Haemophilusinfluenzae типа b или высокомолекулярного полирибозилрибитолфосфата,связанного со столбнячным анатоксином, который заключает 3 ся в том, что смешивают препарат антигена с адъювантом на основе алюминия с точкой нулевого заряда ниже 7,2. Настоящее изобретение более подробно раскрывается ниже. Антиген в виде капсульного полисахаридаHaemophilus influenzae типа b является линейным полимером, состоящим из рибозы, рибитола и фосфорной кислоты, и имеет следующую структуру мономерного звена: Количество мономеров такого типа велико(более 100), в результате чего полисахарид имеет молекулярный вес порядка от 500 000 до 1 000 000. Для того чтобы вызвать иммунную реакцию Т клеток у маленьких детей, указанный антиген конъюгируют с белком-носителем,представляющим собой столбнячный анатоксин. Такой антиген можно, например, получить согласно способу, описанному в работе "Количественный и качественный анализ антител сыворотки взрослых людей при использовании капсульных полисахаридных антигеновHaemophilus influenzae типа b и пневмококка типа 6 А, конъюгированных со столбнячным токсоидом", Rachel Schneerson и др., Infect. Immun. 52:519 (1986). Большое количество мономеров полисахарида, природа белка-носителя, природа связи между полисахаридом и белком-носителем придают ему особые свойства и высокую иммуногенность. Для сохранения указанных свойств в жидкой среде с течением времени, как обнаружено,можно использовать комплексы алюминия, точка нулевого заряда которых ниже 7,2. Действительно, неожиданно обнаружено,что, когда PRP-T связан с такими комплексами алюминия, его иммуногенные свойства долго сохраняются в жидкой среде при любой степени иммобилизации на комплексах алюминия. Точка нулевого заряда комплексов алюминия эквивалентна изоэлектрической точке белков; это такое значение pH, при котором заряд на поверхности комплексов алюминия равен нулю. Фактически, точка нулевого заряда определяется при измерениях зета-потенциала, которые можно выполнять разными способами,при этом основным способом является электрофорез. Измерения можно осуществлять при помощи такого прибора как DELSA 440 (Coulter 4 Способы измерений и приборы могут быть разными, соответственно и полученные результаты могут различаться. Подходящими для целей данного изобретения комплексами алюминия могут быть такие комплексы, для которых точка нулевого заряда ниже 7,2 (значение 7,2 является приблизительной величиной), или такие комплексы, которые можно модифицировать с целью снижения их точки нулевого заряда. Среди комплексов алюминия, имеющих точку нулевого заряда ниже 7,2, можно указать комплексы, известные в качестве вакцинных адъювантов как фосфаты алюминия, даже если с химической точки зрения они содержат соли,отличные от фосфатов алюминия. Такими комплексами являются, например, ADJUFOS фосфат алюминия, производимый SUPERFOS BIOSECTOR a/s. Указанные комплексы алюмния могут быть получены посредством реакции карбоната натрия в PBS-буфере на сульфатах калия и алюминия. Иммуногенность PRP-Т, полностью или частично связанного с комплексом алюминия,сохраняется в течение длительного периода времени. С другой стороны, согласно данному изобретению можно использовать комплексы алюминия, которые по своей природе имеют точку нулевого заряда выше 7,2 и которые модифицированы для снижения этой точки заряда. Это, главным образом, комплексы алюминия, известные в качестве вакцинных адъювантов как гидроксиды алюминия, даже если с химической точки зрения они образованы не только гидроксидами алюминия. Такими комплексами являются, главным образом, ALHYDROGEL гидроксид алюминия, производимыйSUPERFOS BIOSECTOR a/s, используемый в качестве адъюванта в вакцинах D.T. Coq фирмы PASTEUR MERIEUX SV или Recombivax фирмы МЕRСК. В соответствии с данным изобретением модификация указанных комплексов заключается в добавлении соединений, образующих анионы. Анионы могут быть различной природы при условии, что все они соответствуют требованиям безопасности, предъявляемым к препаратам для вакцинирования. Показано, что добавление цитрат-ионов или фосфат-ионов особенно эффективно для решения задач данного изобретения. Фосфат-ионы могут быть добавлены в виде раствора, содержащего монокальцийфосфат, динатрийфосфат и хлорид натрия. Можно также применять комбинацию различных анионов, например комбинацию фосфат-ионов и карбонат-ионов. Соединения, образующие анионы, можно добавлять к суспензии комплексов алюминия до добавления PRP-T или к PRP-T до его связывания с комплексами алю 5 миния. Для удобства предпочтительно суспендировать PRP-T в растворе, содержащем выбранные анионы, до их контакта с адъювантом. Количество добавляемых анионов рассчитывают с целью снижения точки нулевого заряда используемых комплексов алюминия до величины менее 7,2. Таким образом, это количество меняется в зависимости от природы используемых комплексов алюминия, а также от количества анионов, которые могут быть внесены при использовании буферных соединений. Определение этого количества не выходит за пределы знаний специалиста в данной области техники. Таким образом, получают вакцинную композицию, стабильную в жидком состоянии, при том, что PRP-T сохраняет свои высокоиммуногенные свойства. Кроме того, обнаружено, что благодаря добавлению анионов, снижается иммобилизация PRP-T на комплексах алюминия, что может вносить свой вклад в сохранение его целостности и, следовательно, иммуногенности. Хотя это не является предпочтительным в соответствии с данным изобретением, можно добавлять анионы к комплексам алюминия, уже имеющим по своей природе точку нулевого заряда ниже 7,2. В этом случае точка нулевого заряда снижается, а иммобилизация PRP-T на комплексах алюминия уменьшается. Под термином иммобилизация понимают, что любая форма связи делает PRP-T неподдающимся дозировке, когда после центрифугирования собирают супернатант. Вакцинные композиции в соответствии с данным изобретением содержат вакцинный антиген PRP-T, но могут также включать и другие вакцинные антигены, в особенности предназначенные для защиты против дифтерии, столбняка, коклюша (клеточного или бесклеточного),полиомиелитов, гепатита А, гепатита В и др. заболеваний. Фактически, в соответствии с данным изобретением в вакцинную композицию можно вводить любой вакцинный антиген, совместимый с PRP-T и комплексами алюминия. Таким образом, можно получить жидкую вакцинную композицию, позволяющую одним введением произвести вакцинацию против нескольких заболеваний. В частности, вакцинные композиции в соответствии с данным изобретением пригодны для введения маленьким детям. Кроме того, показано, что использование такой жидкой вакцинной композиции при активной вакцинации 12-ти месячных детей, которым делали инъекции в 2-, 4- и 6-ти месячном возрасте, должно особенно сильно увеличивать выработку анти-PRP-T антител по сравнению с активной вакцинацией, проводимой при тех же условиях с использованием TETRAct-HIB вакцины от PASTEUR MERIEUX Srums et Vaccins.(РТА) Очищенный дифте 1 ед. дозы вакцирийный анатоксин нирования(приведено количество Al) соответствует количеству в препа 0,3 мг рате D.T.CoqТМ Фосфаты 30 микромолей 10 мМолярный Трис 0,125 мл буфер, содержащий 8,5% сахарозы Вода для инъекций До 0,5 мл Фосфат-ионы добавляют, используя раствор, содержащий монокалийфосфат, динатрийфосфат и хлорид натрия. Пример 2. Иммуногенность вакцинной композиции, полученной как указано в примере 1, исследовали на маленьких детях при сравнении с иммуногенностью известной вакциныTETRAct-HIB, которая имеет такой же состав,но лиофилизованный PRP-T непосредственно перед инъекцией смешивают с вакцинной композицией, содержащей дифтерийный и столбнячный анатоксины, а также коклюшную клеточную смесь. Данное исследование проводили на группе из 262 детей, 130 из которых получали препарат, приготовленный в соответствии с примером 1, и 132 получали коммерческую вакцину TETRAct-HIB. Введение вакцин проводили внутримышечно в 2, 6 и 12-ти месячном возрасте. Перед иммунизацией GMT-титр анти-PRP антител в двух группах был равен 0,2 мкг/мл; после второй инъекции он составлял 1,9 и 1,4 мкг и после третьей инъекции 5,9 и 5,8, соответственно для заявленной вакцины и вакцины,известной из уровня техники. После воторой инъекции 98% детей (вакцинированных согласно данному изобретению) и 93% детей (вакцинированных в соответствии с предшествующим уровнем техники) имели уровень анти-PRP антител более 0,15 мкг/мл; этот уровень достигался у 100% детей после третьей инъекции заявленной вакцины и у 99% детей,вакцинированных в соответствии с предшествующим уровнем техники. После третьей инъекции количество антител, направленных против каждого вакцинного антигена, в среднем составляло следующие величины: Предшествующая вакцина Дифтерийный ан 1,35 тиген, UI/мл Столбнячный ан 5,1 тиген, UI/мл Коклюшный анти 597 ген, GMT- агглютинация После активной иммунизации в 12-ти месячном возрасте количество антител составляло: Предшест- Заявленная вакцина вующая вакцина Дифтерийный 3,2 4,5 антиген, UI/мл Столбнячный ан 12,0 11,5 тиген, UI/мл Коклюшный антиген, GMT- агглю 2447 2560 тинацияPRP, мкг/мл 19,4 32,6 Приведенные результаты показывают, что полученная в соответствии с настоящим изобретением вакцинная комбинация стабильна; фактически активная инъекция детям 12-ти месячного возраста проводилась с использованием вакцины, которую получили 18 месяцев тому назад; однако, полученные данные свидетельствуют о том, что иммуногенность каждого антигена композиции сохраняется. Кроме того, эффект активной иммунизации при использовании вакцинной композиции, полученной в соответствии с данным изобретением, заметно сильнее по сравнению с эффектом активной иммунизации при использовании известной вакцины,имеющей тот же самый состав. Пример 3. Дозированную вакцинную композицию, описанную в примере 1, хранят при+4 С в течение 18-24 месяцев и затем используют в клинических испытаниях на группе из 104 детей. Ниже приведены титры антител, направленных против каждого вакцинного антигена: До вакцини- После вакцирования нирования Дифтерийный ан 0,013 0,736 тиген, GMT Столбнячный ан 0,181 3,831 тиген, GMTPRP, GMT мкг/мл 0,22 6,40 Таким образом, можно видеть, что даже после хранения в течение длительного периода времени при +4 С заявленная вакцинная компо 8 зиция сохраняет свои иммуногенные свойства,это касается и PRP-T, и других вакцинных антигенов. Пример 4. Вакцинные композиции, каждая из которых содержит PRP-Т в концентрации, по крайней мере, 20 мкг PRP/мл, получают при использовании комплексов алюминия разного типа, имеющих различные точки нулевого заряда (PZC). Количество комплексов алюминия таково, что концентрация алюминия в композиции равна 0,6 г/л. Композиция 1: Комплекс алюминия, образованный гидроксидом алюминия, таким как в составе вакцины D. Т. Coq от PMsv. PZC = 11,3. Композиция 2: Комплекс алюминия, образованный гидроксидом алюминия, таким как в составе вакцины Recombivax от Merck. PZC=7,4. Композиция 3: Комплекс алюминия, образованный фосфатом алюминия, полученным при смешивании хлорида натрия и тринатрийфосфата. PZC = 6,2. Композиция 4: Комплекс алюминия, образованный продуктом, который называется Alum,и получен по реакции карбоната натрия в PBSбуфере с сульфатами калия и алюминия. PZC = 5,4. Вакцинную композицию получают посредством простого смешивания суспензий,содержащих комплексы алюминия и PRP-T. Пример 5. Иммуногенность полученных композиций проверяют на мышах. С целью изучения иммуногенной стабильности полученные композиции выдерживают в условиях ускоренного старения, то есть хранят их при +37 С в течение 2 недель. Исследование иммуногенности осуществляют на мышах весом 22-24 г, которым подкожно вводят дозы 0,5 мл, каждая из которых содержит 2,5 мкг PRP. Введение производят в день 0 и на 14 день. На 14 и 21 день у мышей берут кровь и определяют содержание антител радиоиммунологическим способом. Количество мышей, иммунизированных каждой вакциной,составляет 8. Результаты считаются удовлетворительными, если:по крайней мере, 75% мышей на 21 день имеют титр антител 0,5;имеет место существенная разница между результатами, полученными на 14 и 21 дни. Считают, что заявленная вакцинная композиция является стабильной, если результаты,полученные после ускоренного старения, удовлетворительны. Результаты, полученные для исследованных композиций, суммированы в таблице ниже: С 1 9 С 2 7,4 Неудовлетворительно С 3 6,2 Удовлетворительно С 4 5,4 Удовлетворительно Таким образом видно, что когда точка нулевого заряда комплексов алюминия соответствует кислому значению рН, полученная вакцинная композиция является стабильной. Пример 6. Для каждой композиции, полученной в соответствии с примером 4, изменяют процентное содержание PRP-T, иммобилизованного на комплексах алюминия. Для этого каждую композицию центрифугируют, собирают супернатант, в котором определяют количество неиммобилизованного PRPT путм ELISA или RIA. Разница между концентрацией PRP-T в исходной композиции и количеством,определенным в супернатанте, позволяет определить процент иммобилизованного PRP-T. Ниже приведены полученные результаты: С 1 : 100% С 2 : 100% С 3 : 100% С 4 : 70% Пример 7. Композицию 1 модифицируют,добавляя к ней соединения, образующие фосфат-ионы, с получением концентрации ионов 50 мМолей/л. Исследование иммуногенности, проводимое на мышах после ускоренного старения раствора, дает удовлетворительный результат. Определение процента иммобилизацииPRP-T на комплексах алюминия показывает, что в таких условиях иммобилизовано только 20%PRP-T. Пример 8. На этот раз композицию 1 модифицируют, добавляя к ней соединения, образующие цитрат-ионы, для получения концентрации ионов 200 мМолей/л. Исследование иммуногенности, проводимое на мышах после ускоренного старения раствора, дает удовлетворительный результат. Определение процента иммобилизацииPRP-T на комплексах алюминия показывает, что в таких условиях PRP-T вообще не иммобилизован. Пример 9. Композицию 2 модифицируют,добавляя к ней соединения, образующие фосфат-ионы, для получения концентрации ионов 20 мМолей/л. Исследование иммуногенности, проводимое на мышах после ускоренного старения раствора, дает удовлетворительный результат. Определение процента иммобилизации PRP-T на комплексах алюминия показывает, что в таких условиях PRP-T вообще не иммобилизован. Пример 10. Композицию 3 модифицируют,добавляя к ней соединения, образующие фосфат-ионы, в разных количествах и определяют процент иммобилизации PRP-Т на комплексах алюминия. 10 Если количество добавленных фосфатионов таково, что концентрация фосфатов в композиции составляет 2 мМоля/л, процент иммобилизованного PRP-T снижается до 10%. Если количество добавленных фосфатионов таково, что концентрация фосфатов в композиции составляет 4 ммоля/л, то PRP-T вообще не иммобилизован. Исследование иммуногенности, проводимое на мышах после ускоренного старения раствора, дает удовлетворительный результат. Пример 11. Композицию 4 модифицируют,добавляя к ней соединения, образующие фосфат-ионы, для получения концентрациии ионов 60 мМолей/л. Определение процента иммобилизацииPRP-T на комплексах алюминия показывает, что в таких условиях иммобилизовано только 30%PRP-T. Исследование иммуногенности, проводимое на мышах после ускоренного старения раствора, дает удовлетворительный результат. Пример 12. Получают вакцинную композицию, используя следующие компоненты: Гидроксид алюминияPDA 1 ед.дозы вакци-нирования РТА 1 ед.дозы вакци-нирования Фосфаты 15 микромолей Антигены полиовируса тип I 40 Ед. тип II 8 Ед. тип III 32 Ед. Коклюшный анатоксин 25 мкг Коклюшный F-HA 25 мкг 50 мМолярный Трис 0,125 мл буфер, содержащий 42,5% сахарозы Вода для инъекций До 0,5 мл Исследования иммуногенности PRP-T проводят на мышах, используя раствор, полученный в соответствии с данным способом, а также раствор, хранившийся в течение 1 месяца при 37 С; раствор, хранившийся в течение 2 месяцев при 25 С, и раствор, хранившийся в течение 6 месяцев при 4 С. Все эксперименты приводят к удовлетворительным результатам,что подтверждает стабильность PRP-T при названных условиях. Пример 13. Получают вакцинную композицию, используя следующие компоненты: Гидроксид алюминия (при 0,3 мг ведено количество Al)GenHevae В PASTEUR ) Антигены полиовируса тип I 40 Ед. тип II 8 Ед. тип III 32 Ед. Фосфаты 20 микромолей Карбонаты 5 микромолей 50 мМолярный Трис-буфер,0,125 мл содержащий 42,5% сахарозы Вода для инъекций До 0,5 мл Стабильность полученного таким образом раствора изменяют, выдерживая его в течение 2 недель при 37 С, и затем проводят на мышах исследование иммуногенности PRP-T, как описано в примере 5. Полученные результаты удовлетворительны. Проводят исследование иммуногенностиHbs протеина на мышах, оно заключается в определении анти-Hbs антител путм ELISА, и затем в определении 50%-ной эффективной дозы, которая может составлять менее 0,970 мкгHbs протеина, до тех пор, пока тест считается удовлетворительным. Результаты исследований при использовании раствора, приготовленного как указано выше и хранившегося до этого в течение 2 недель при 37 С, являются удовлетворительными. Пример 14. Получают вакцинную композицию, используя следующие компоненты: Гидроксид алюминияPDA 1 ед.дозы вакцинирования РТА 1 ед.дозы вакцинирования Коклюшный анатоксин 10 мкгPASTEUR) Антигены полиовируса тип I 40 Ед. тип II 8 Ед. тип III 32 Ед. Фосфаты 20 микромолей 12 Карбонаты МgСl2 50 мМолярный Трисбуфер, содержащий 42,5% сахарозы Вода для инъекций Исследования иммуногенности PRP-T, как описано в примере 5, и исследования иммуногенности Hbs протеина, как описано в примере 13, дают удовлетворительные результаты, что свидетельствует о стабильности вакцинной композиции, полученной в соответствии с данным изобретением. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Вакцинная композиция, содержащая капсульный полисахаридный антигенHaemophilus influenzae типа b, а именно высокомолекулярный полирибозилрибитолфосфат,связанный со столбнячным анатоксином, и адъювант на основе алюминия, отличающаяся тем, что адъювант на основе алюминия имеет точку нулевого заряда ниже 7,2. 2. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что адъювант на основе алюминия представляет собой гидроксиды алюминия,к которым добавлены соединения, образующие анионы. 3. Вакцинная композиция по п.2, отличающаяся тем, что указанные соединения представляют собой фосфаты и цитраты. 4. Вакцинная композиция по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что адъювант на основе алюминия представляет собой фосфаты алюминия. 5. Вакцинная композиция по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что адъювант на основе алюминия представляет собой сульфаты алюминия и калия. 6. Вакцинная композиция по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что дополнительно содержит один или более антигенов, представляющих собой дифтерийный, столбнячный,коклюшный антиген, или антиген вируса гепатита В, или антиген вируса полиомиелита. 7. Способ получения вакцинной композиции по п.1, заключающийся в том, что смешивают препарат антигена с адъювантом на основе алюминия, имеющим точку нулевого заряда ниже 7,2. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что к адъюванту на основе алюминия дополнительно добавляют соединение, образующее анионы,причем указанные соединения представляют собой фосфаты и цитраты.