Способы основанного на структуре конструирования лекарственных средств для индентификации ингибиторов d – ala -d – ala – лигазы в качестве антибактериальных лекарств

007612 Перекрестная ссылка на родственную заявку В настоящей заявке заявляется преимущество предварительной заявки США 60/301676, поданной 28 июня 2001 г., которая полностью включена сюда в качестве ссылки. Известный уровень техники Данное изобретение относится к способам открытия новых лекарств, особенно способам открытия новых лекарств, которые ингибируют D-Ala-D-Ala-лигазу, фермент, важный для образования бактериальных клеточных стенок. Соединения, которые ингибируют биосинтез бактериальных клеточных стенок, как в целом доказано, являются эффективными антибиотиками. Например, ингибитор рацемазы фтор-D-аланин, который предотвращает образование D-аланина, и -лактамные антибиотики, которые ингибируют транспептидирование, ингибируют синтез клеточной стенки и бактериальный рост (Parsons et al., J. Med. Chem.,31:1772-1778, 1988). Однако недавно возникшая опасность бактериальных штаммов, устойчивых к лекарствам, предполагает, что существует текущая потребность в новых антибиотиках широкого спектра действия. Среди ферментов, ответственных за биосинтез клеточной стенки, важна D-аланил-D-аланин-лигаза("D-Ala-D-Ala-лигаза"; Е.С. 6.3.2.4), потому что она синтезирует уникальный дипептид D-аланил-Dаланина ("D-Ala-D-Ala"). Дипептид, в конечном счете, включается в отдельные цепи пептидогликанов, в которых он обеспечивает сайт трансацилирования при поперечной сшивке пептидогликанов, конечной стадии синтеза клеточной стенки (Ellsworth et al., ChemistryBiology, 3:37-44, 1996). Ингибиторы, которые предотвращают сборку и включение D-Ala-D-Ala в клеточную стенку, как предполагается, являются эффективными антибиотиками, потому что они могут вызывать лизис бактерий. Ингибиторы D-Ala-D-Ala-лигазы могут быть высокоселективными антибиотиками широкого спектра действия с относительно немногочисленными неблагоприятными побочными эффектами, так как DAla-D-Ala-лигаза является высококонсервативной среди прокариот и отсутствует у человека.D-Ala-D-Ala-лигаза является мультидоменным белком, который содержит два связывающих кармана, один для АТФ и другой для D-Ala-D-Ala. До сих пор не было идентифицировано пригодных ингибиторов, которые связываются с АТФ-связывающим сайтом D-Ala-D-Ala-лигазы. Сущность изобретения Изобретение основано частично на открытии того, что определенные малые молекулы могут связываться с АТФ-связывающим сайтом D-Ala-D-Ala-лигазы даже в отсутствие субстрата фермента и могут вызывать конформационное изменение в структуре фермента, сходное с тем, которое происходит при связывании АТФ и субстрата с ферментом. Не ограничиваясь какой-либо одной теорией, предполагается,что такое конформационное изменение требуется либо для активации, либо для ингибирования фермента. Информация, полученная из данного открытия, позволяет идентифицировать ключевые взаимодействия в активном сайте фермента, а также моделировать и оптимизировать ингибиторы. В одном осуществлении изобретение относится к способу оценки потенциала химического объекта к взаимодействию с молекулой или молекулярным комплексом, содержащим связывающий карман, определенный структурными координатами аминокислот Lys144, Glu180, Lys181, Leu183, Glu187, Asp257 и Glu270 D-Ala-D-Ala-лигазы E. coli, в соответствии с фиг. 8; или с гомологом указанной молекулы или молекулярного комплекса, где указанный гомолог содержит связывающий карман, который имеет среднее квадратичное отклонение от атомов остова указанных аминокислот не более чем 10 . Способ предусматривает одну или несколько и предпочтительно все из стадий (1) применения способа предсказания(например, компьютерной программы или других вычислительных средств) для выполнения операции подгонки между химическим объектом и связывающим карманом, определенным структурными координатами аминокислот Lys144, Glu180, Lys181, Leu183, Glu187, Asp257 и Glu270 D-Ala-D-Ala-лигазы E. coli+/- среднее квадратичное отклонение от атомов остова указанных аминокислот не более чем 10 ; и(2) анализa результатов указанной операции подгонки для количественной оценки связи между химическим объектом и связывающим карманом. В другом осуществлении изобретение относится к способу идентификации потенциального ингибитора D-Ala-D-Ala-лигазы. Способ предусматривает стадии: (1) применение положения или структурыLys144, Glu180, Lys181, Leu183, Glu187, Asp257 и Glu270 D-Ala-D-Ala-лигазы E. coli в соответствии с фиг. 8 (например, применение атомных координат данных аминокислот) +/- среднее квадратичное отклонение от атомов остова указанных аминокислот не более чем 10 , для создания трехмерной структуры связывающего кармана D-Ala-D-Ala-лигазы; (2) применение указанной трехмерной структуры для конструирования или отбора указанного потенциального ингибитора (например, для конструирования или отбора ингибитора, который удовлетворяет требованиям, налагаемым характером физических взаимодействий, определенных указанными выше аминокислотами и/или другими аминокислотами в сайте связывания косубстрата фермента, данные взаимодействия могут быть сходными для предварительно отобранного или контрольного характера взаимодействий, такие как взаимодействия, которые происходят при связывании D-аланина или другого субстрата или косубстрата с ферментом). В предпочтительном осуществлении способ дополнительно включает один или оба пункта из (3) синтеза или получения указанного ингибитора; и (4) взаимодействия указанного ингибитора с D-Ala-D-Ala-лигазой для определения способности указанного потенциального ингибитора ингибировать D-Ala-D-Ala. Необязательно-1 007612 применяемая стадия может включать такое конструирование молекулы, что она при стыковке с указанной трехмерной структурой должна иметь донор водородной связи между 2,4 и 3,5 от одного или обоих атомов кислорода карбоксилата боковой цепи Glu180, донор водородной связи между 2,4 и 3,5 от амидного кислорода остова Lys181, акцептор водородной связи между 2,4 и 3,5 от амидного азота остова Leu183, донор водородной связи между 2,74 и 3,5 от амидного кислорода остова Leu183 и акцептор водородной связи между 2,4 и 3,5 от азота боковой цепи Lys144. Молекула может дополнительно включать гидрофобные взаимодействия на расстоянии 3,5-4,5 от углерода CD1 и атомов серы SD боковых цепей Leu269 и Met154 соответственно. Потенциальный ингибитор может также представлять собой бисубстратный аналог (например, аналог, который может связываться как с АТФ-связывающим сайтом, так и с D-Ala-связывающим сайтом фермента). Еще в одном осуществлении изобретение относится к способу идентификации потенциального ингибитора D-Ala-D-Ala-лигазы или гомолога D-Ala-D-Ala-лигазы. Способ предусматривает стадии (1) конструирования или отбора молекулы, в которой Ilе 142 в D-Ala-D-Ala-лигазе или его эквивалент в гомологе отстоит на 12 от Met259 в D-Ala-D-Ala-лигазе или его эквивалента в гомологе и Met154 в DAla-D-Ala-лигазе или его эквивалент в гомологе отстоит на 12 от Leu269; (2) синтеза или получения указанного ингибитора; и (3) взаимодействия указанного ингибитора с D-Ala-D-Ala-лигазой для определения способности указанного потенциального ингибитора ингибировать D-Ala-D-Ala. Если не указано иначе, все применяемые в данном описании технические и научные термины имеют то же самое значение, что и обычно применяемое специалистом в области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя могут быть использованы на практике или при тестировании способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в данном описании, подходящие способы и материалы описываются ниже. Все упоминаемые в данном описании публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки включены в данное описание полностью в качестве ссылки. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет определяющим. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не рассматриваются как ограничивающие. Другие черты и преимущества изобретения должны быть ясны из последующего подробного описания и из формулы изобретения. Краткое описание фигур На фиг. 1 представлено гипотетическое изображение структуры фермента D-Ala-D-Ala-лигазы в отсутствие субстратов и/или кофакторов, основанное на данных кристаллографии и показывающее относительные положения АТФ- и D-Ala-D-Ala-связывающих сайтов и четырех доменов белка. На фиг. 2 представлено наложение кристаллических структур D-Ala-D-Ala-лигазы в комплексе либо с одним АТФ, либо с АДФ, фосфатом и D-Ala-D-Ala, как показано красным и желтым цветом соответственно. Стрелка указывает направление вращения домена В при переходе из предыдущей структуры в последующую. На фиг. 3 представлены серии схематического конформационного изменения, которое наступает,как предполагается, в процессе прохождения ферментом взаимодействий при связывании АТФ или ингибитора с АТФ-связывающим сайтом D-Ala-D-Ala-лигазы. Схемы соответствуют несвязанному ферменту (Е), модели первоначального комплекса с ингибитором (EI), и кристаллической структуре фермента после индуцированного ингибитором конформационного изменения (EI). На фиг. 4 представлен рисунок, который иллюстрирует, по меньшей мере, некоторые ключевые электростатические (а) и гидрофобные (b) взаимодействия между остатками активного сайта фермента и ингибитором, который индуцирует конформационное изменение в лигазе. Штриховые линии соответствуют водородным связям, образованным между консервативными остатками белка и ингибитором. Остатки, показанные в (b), участвуют во взаимодействиях Ван-дер-Ваальса с ингибитором. На фиг. 5 представлен график скорости связывания лигазой способом остановленного потока в зависимости от концентрации АТФ. На фиг. 6 представлен график гашения флуоресценции D-Ala-D-Ala-лигазы в зависимости от концентрации АТФ. На фиг. 7 представлена карта взаимодействий нового ингибитора, связанного с D-Ala-D-Ala-лигазой, вытекающая из кристаллической структуры. На фиг. 8 представлен перечень координат атомной структуры для D-Ala-D-Ala-лигазы Е. coli в комплексе с АДФ, ионом фосфата и D-Ala-D-Ala, выведенный из рентгеноструктурного преломления кристалла данного комплекса. На фиг. 9 представлен перечень координат атомной структуры для D-Ala-D-Ala-лигазы Е. coli в комплексе AMPPNP, выведенный из рентгеноструктурного преломления кристалла данного комплекса. На фиг. 10 представлена таблица выровненных данных для 51 последовательности D-Ala-D-Alaлигазы из различных штаммов бактерий. Подробное описание изобретения Характеристика конформационного изменения.D-Ala-D-Ala-лигаза является мультидоменным белком, состоящим из четырех доменов, чьи поверхности формируют D-Ala-D-Ala и АТФ-связывающие карманы (фиг. 1). Конформационное изменение выявляли путем определения кристаллической структуры фермента в комплексе с лигандами, которые-2 007612 являются конкурентными ингибиторами АТФ; биохимических анализов, подтверждающих существование конформационного изменения, с применением двух кинетических тестов. Структурные способы идентификации конформационного изменения. Конформационная гибкость фермента была впервые идентифицирована путем сравнения двух кристаллических структур: таких, когда (1) фермент в комплексе с АТФ (EI) и (2) фермент в комплексе с АДФ, фосфатом и D-Ala-D-Ala (ЕР). Наложение двух структур выявляет слабое вращение домена В в активном сайте, когда фермент находится в комплексе с АДФ, фосфатом и D-Ala-D-Ala (фиг. 2). Данный результат предполагает, что шарнирная точка, связывающая домен В, является довольно гибкой и что домен В, по-видимому, подвергается существенному вращению, когда лиганды связываются между поверхностями доменов В и С. Иллюстрация последовательности событий, которые происходят, когда лиганды первоначально связываются с ферментом, и потенциальная величина индуцируемого конформационного изменения показаны на фиг. 3, где EI представляет собой гипотетический первоначальный комплекс. Исследования остановленного потока с лигазой. Авторы обнаружили значительное гашение флуоресценции при связывании АТФ и АДФ, которое авторы использовали для проверки механистических характеристик лигазы. Авторы выполняли исследования остановленного потока для отслеживания связывания АТФ и АДФ с лигазой. Данные исследования выполнялись при 4 С. Авторы наблюдали простое экспоненциальное гашение флуоресценции, которое завершалось в течение 20 мс. Наблюдаемые константы скорости, отложенные как функция концентрации нуклеотида, давали гиперболический график, указывающий на то, что за исходным связыванием следует конформационное изменение (фиг. 5). Это подтверждает предшествующую гипотезу авторов о лигазе, а именно о том, что фермент претерпевает конформационные изменения, которые являются важной и неотъемлемой частью механизма его ферментативного действия. Данный фермент, очевидно, попадает в категорию "индуцированной подгонки". Как показано на фиг. 5, комплекс при первоначальном столкновении является относительно слабым для образования комплекса ЕА (открытый комплекс). Фермент претерпевает конформационное изменение для образования частично закрытого комплекса ЕА. Для АТФ данное конформационное изменение увеличивает сродство в 3,2 раза до конечной Kd=157 мкМ (суммарное сродство представляет собой продукт двух констант диссоциации Kd1 и Kd2) с результирующей константой скорости диссоциации 126 с-1. АДФ проявляет сходную гиперболическую зависимость, опять указывая на механизм индуцированной подгонки(т.е. на следующее за связыванием конформационное изменение). Для АДФ конформационное изменение увеличивает сродство нуклеотида в 7 раз для частично закрытого комплекса по отношению к комплексу при первоначальном столкновении, что ведет к результирующей Kd 50 мкМ. Авторы высказывают гипотезу о том, что создание большего количества взаимодействий может увеличить сродство и, следовательно,стабилизировать данную частично закрытую форму. Для диссоциации лиганда фермент должен вновь релаксировать в открытую форму. Следовательно, сродство данных ингибиторов, очевидно, коррелирует со снижением результирующей константы скорости диссоциации (т.е. k2). Например, АДФ имеет в 3 раза более высокое сродство к D-Ala-D-Ala-лигазе по сравнению с АТФ и имеет более медленную k2=72 с-1. В некоторых случаях для ингибитора может быть выгоден запуск дополнительного конформационного изменения, вероятно, закрывающий петлю омега домена D, что ведет к полностью закрытой форме фермента. Исследования остановленного потока дополнили понимание механизма, с помощью которого лигаза связывает лиганды, и подтвердили предшествующие предположения о механизме "индуцированной подгонки". Определение сродства высокоаффинных ингибиторов (низкие нМ) трудно провести при помощи способов оценки равновесного связывания или стационарной ферментативной кинетики. Только исследования остановленного потока могут быть хорошим путем, с помощью которого может быть определено сродство высокоаффинных ингибиторов с любой степенью достоверности. Исследования могут быть выполнены, например,с применением способов, описанных Eccleston, J.F. "Stopped-flow Spectrophotometric Techniques" in Spectrophotometry and Spectrofluorimetry a Practical Approach, Ed. D.A. HarrisC.L. Bashford, IRL Press, 1987, p. 137-164. Эксперименты титрования по флуоресценции. В дополнение к исследованию остановленного потока для определения сродства новых соединений к D-Ala-D-Ala-лигазе могут быть использованы исследования титрования по флуоресценции в устойчивом состоянии. В данных экспериментах также используется гашение флуоресценции, присущей триптофану, которое наступает при связывании нуклеотида. Авторы определяли сродство АТФ к лигазе при 25 С (фиг. 6). Интересно, что Kd связывания АТФ ниже, чем Km, что неожиданно указывает на то, что лимитирующая скорость стадия в механизме связывания лигазой наступает после образования продуктов. Данная методология может быть использована для характеристики потенциальных ингибиторов лигазы. Эксперименты по титрованию могут быть выполнены, например, с применением способов, описанных Lohman, T.M.Mascotti, D.P. (1992) "Nonspecific Ligand-DNA Equilibrium Binding ParametersDetermined by Fluorescence Methods" in Methods in Enzymology, vol. 212, p. 425-458. Эксперименты по протеолизу. Авторы разработали тест in vitro для наблюдения за закрытием петли омега (т.е. домена D). Закрытие петли омега зондировалось с помощью протеолиза. В отсутствие лигандов трипсин расщепляет фермент на два более мелких фрагмента. Присутствие АТФ и фосфината ведет к защите данного фермента-3 007612 от протеолиза. Данная смесь, как известно, стабилизирует закрытие петли омега, как показано с помощью кристаллографических исследований. АТФ или АТФ-связывающие молекулы одни не могут закрыть петлю омега. Однако в присутствии молекулы, связывающейся с сайтом D-Ala, такой как фосфинат, дипептид D-Ala-D-Ala или циклосерин, совместно с АТФ, АДФ или ATPgS стабилизируют закрытие петли омега. Неожиданно оказалось, что негидролизуемый аналог АТФ AMPPNP не способствует закрытию петли омега, возможно, указывая на слабое взаимодействие в фосфатсвязывающей области в отношении закрытия петли омега. Авторы синтезировали аналог аденозина, в котором фосфатная группа замещена небольшой цепью с аминогруппой на конце. Данная молекула представляет интерес по двум причинам: она поддерживает закрытие петли омега в присутствии фосфината или циклосерина и она размещает в фосфатсвязывающей области группу, которая увеличивает сродство молекулы. Данная молекула имеет в 20 раз большее сродство по сравнению с АТФ (Kd=300 мкМ). Наличие молекулы, которая может поддерживать закрытие петли омега, может привести к ингибитору со значительно большим сродством. Данные исследования важны также для определения условий кристаллизации при рН 7. При рН 7 кристаллизуется, очевидно, только форма фермента с закрытой петлей омега. Характеристика конформационного изменения. Кристаллические структуры фермента в комплексе с ингибиторами авторов легко выявляют хорошо определяемый связывающий карман. Определенные ключевые взаимодействия между белком и ингибитором, которые индуцируют конформационное изменение, представлены на фиг. 4. Представленные там остатки являются ключевыми остатками активного сайта, с которыми ингибиторы должны взаимодействовать для того, чтобы инициировать сильное вращение домена В по направлению к активному сайту, как проиллюстрировано на фиг. 3. Данное изменение может также описываться в терминах движений индивидуальных остатков, как представлено в табл. 1. Таблица 1 Изменение межмолекулярных расстояний в процессе конформационных изменений: расстояние между остатками Ilе 142 и Met259, и Met154 и Leu269 в гипотетической модели EI и кристаллических структурах EI и ЕР (закрытая)EI 7,9 8,9 ЕР 7,0 8,5 Другие остатки в активном сайте, которые интересовали авторов в процессе оптимизации ингибиторов, перечислены ниже. Данные остатки потенциально могут взаимодействовать прямо с ингибиторами с помощью сил Ван-дер-Ваальса и/или водородных связей. Потенциальные гидрофобные взаимодействия с боковыми цепями:Phe209 Потенциальные электростатические взаимодействия со следующими боковыми цепями (или атомами остова, когда указано): Партнеры по взаимодействию с боковой цепью Доноры hb Доноры hb Акцепторы hb, ароматические кольца Акцепторы hb, ароматические кольца Доноры hb, акцепторы hb, ароматические кольца, положительно заряженные группы Гидрофобные группы (алифатические, ароматические) Гидрофобные группы (алифатические, ароматические) Гидрофобные группы (алифатические, ароматические) Гидрофобные группы (алифатические, ароматические) Гидрофобные группы (алифатические, ароматические) Гидрофобные группы (алифатические, ароматические), положительно заряженные группы Доноры hb, акцепторы hb Доноры hb, акцепторы hb Доноры hb, акцепторы hb Доноры hb, акцепторы hb Доноры hb, акцепторы hb, гидрофобные группы (алифатические, ароматические), положительно заряженные группы Гидрофобные группы (алифатические, ароматические), положительно заряженные группы Процессы оптимизации эффективности ингибиторов. Авторы разработали интерактивный способ повышения силы соединений, которые индуцируют конформационное изменение, описанное выше. Процесс последовательно использует информацию, полученную из кристаллографии белка, молекулярного моделирования, химии и биохимии. Кристаллография белка. Первой стадией данного процесса является кристаллизация и выяснение структуры белка в комплексе с лигандом, который индуцирует желаемое конформационное изменение. Анализировали связывающий карман в районе ингибитора, и структурная информация могла затем использоваться для конструирования производных, подогнанных для достижения специфических взаимодействий с остаткамимишенями в каталитическом кармане. Данный подход наилучшим образом иллюстрируется с помощью двумерного изображения ориентации кристаллической структуры ингибитора, раскрытого авторами,связанного в активном сайте D-Ala-D-Ala-лигазы, как показано на фиг. 7. Данная структура идентифицирует положение 6 пуринового кольца как наилучшую точку закрепления для эффективного преобразования, в то время как положения 2, 3 и 9 вовлечены в ключевые взаимодействия с остатками белка. Следовательно, производное по положению 6 может взаимодействовать с остатками Glu270 и 187, Asp157, Lys144 и 97 и другими, как описано в следующем разделе. Молекулярное моделирование. Структурная информация о связывающем кармане может быть также использована для конструирования оптимизированных аналогов с помощью создания виртуальных библиотек соединений и их стыковки, которые содержат желаемый остов. Например, на основе кристаллографической информации фиг. 1 созданы виртуальные библиотеки 6-замещенных 2-аминопуринов, сочетающих пуриновый остов с коммерчески доступными строительными блоками. Полученные структуры затем вводят в активный сайт DAla-D-Ala-лигазы и отбирают набор многообещающих соединений на основе результатов стыковки. Как указывалось выше, кристаллическая структура также дает возможность идентифицировать серии остатков в связывающем кармане, которые могут быть потенциальными мишенями для специфических взаимодействий: Glu270 и 187, Asp157, Lys144 и 97 и другие. Конструирование новых лигандов создают с помощью преобразования пуриновой основы фрагментами, подходящими по размеру и химическим характеристикам, для специфического взаимодействия с некоторыми из данных остатков. Конструирование затем подтверждают с помощью введения полученных производных в каталитический карман DDL. Стадии, вовлеченные в создание и стыковку 6-замещенных пуринов виртуальной библиотеки,описаны в примере 7. Данные способы моделирования являются более предпочтительными, чем попытки синтеза, в связи с селекцией наиболее многообещающих кандидатов для синтеза, что таким образом увеличивает эффективность процесса оптимизации лидеров. Химия. Третьей стадией данного процесса является синтез приоритетных соединений. Описанные выше аналоги, которые вводили в активный сайт и которые были выбраны как приоритетные для синтеза на основе результатов стыковки, затем получали с применением либо собственных способов, либо известных химических реакций, описанных в литературе. Библиотека виртуальных соединений, описанная в разделе "Молекулярное моделирование", может быть создана с применением коммерчески доступных-5 007612 исходных веществ или исходных веществ, описанных в литературе. В том случае, когда исходные вещества коммерчески доступны, вещества покупают и затем применяют для синтеза соединений, которые,как было предсказано с помощью стыковки, являются сильными ингибиторами фермента. В том случае,когда исходные вещества коммерчески недоступны, но были синтезированы, как описано в литературе,данные исходные вещества сначала синтезируют с применением либо известных из литературы способов, либо собственных способов и затем, в свою очередь, используют для синтеза химических структур,которые были выбраны как приоритетные с помощью стыковки соединений виртуальных библиотек. Биохимия. Конечной стадией является определение того, будут ли вновь синтезированные соединения ингибировать фермент, и затем определение того, будут ли они индуцировать желаемое конформационное изменение. Активные соединения могут быть, например, одновременно протестированы на активность в тестеin vitro и проанализированы путем кристаллографии белка для начала следующего уровня оптимизации. Ферментные исследования применяли для деконволюции или идентификации важных компонентов АТФ-связывающего сайта. Авторы раскрыли, что большая часть аффинности определяется адениновой частью молекулы АТФ и что фосфаты фактически снижают аффинность, особенно альфа-фосфат. Анализ может быть,например, осуществлен с применением АТФ-азного теста Duncan et al. (Biochemistry, 27:3709-3714, 1988). Тесты ингибирования D-Ala-D-Ala-лигазы. Ингибирование D-Ala-D-Ala-лигазы может быть определено с помощью применения теста с пируваткиназой/лактатдегидрогеназой (PK/LDH), описанного в примере 2. В процессе синтеза бактериальной клеточной стенки лигаза катализирует превращение АТФ в АДФ одновременно с лигированием двух остатков D-аланина. РК затем заново генерирует АТФ из АДФ, тем самым вызывая одновременное превращение фосфопирувата в пируват. LDH катализирует восстановление пирувата до лактата путем превращения НАДН в НАД+. Активность D-Ala-D-Ala-лигазы может быть установлена с помощью мониторинга скорости продукции НАД+. Бисубстратные аналоги. Рассматриваются также бисубстратные аналоги, которые не только связываются с ATФ-связывающим сайтом D-Ala-D-Ala-лигазы, но также связываются с D-Ala-связывающим сайтом. Такие аналоги должны включать АТФ- и D-Ala-подобные части, связанные через гибкую или ригидную вставку (например, алкил, алкенил, алкинил или полиароматическую связывающую группу, или производное, или гибрид одной или нескольких из таких групп). Бисубстратные аналоги могут характеризоваться увеличенной силой и/или специфичностью для D-Ala-D-Ala-лигазных ферментов. Тестирование антибактериальной активности. Может быть проведен скрининг соединений на антибактериальную активность с применением стандартных способов. В качестве одного примера, проиллюстрированного в примере 5, способы микроразведения бульона применяют для измерения in vitro активности соединений против данной культуры бактерий с получением данных о минимальной ингибиторной концентрации (MIC). При типичном способе может быть осуществлен скрининг соединений на антибактериальную активность в отношении множества различных бактериальных штаммов. Соединения тестируются на силу активности и широту охвата для того, чтобы идентифицировать потенциальные лидирующие соединения. Может быть осуществлен скрининг соединений на бактериостатическую активность (т.е. предотвращение бактериального роста) и/или бактерицидную активность (т.е. уничтожение бактерий). Лидирующие соединения могут быть дополнительно оптимизированы, например, с помощью варьирования заместителей с получением производных соединений. Производные могут быть получены одновременно, или они могут быть получены с применением параллельных или сочетанных способов синтеза. В любом случае, производные могут быть протестированы для получения данных о взаимоотношениях структуры и активности (SAR), которые могут быть затем использованы для дальнейшей оптимизации лидеров. Способы оптимизации ингибиторной активности в отношении фермента. Как только идентифицирован ингибитор (например, путем сравнения активности соединения в ферментном анализе с активностью стандарта, такого как AMP-PNP), могут быть использованы способы конструирования на основе структуры для оптимизации ингибитора. Применение подобных лекарствам молекул, скрининг которых предварительно проведен in silico с помощью компьютерного моделирования активного сайта, может увеличить пропускную способность скрининга лидирующих соединений. Например, ингибитор и фермент могут быть кристаллизованы в виде комплекса, и может быть определена кристаллическая структура комплекса. Структурная информация, полученная из кристаллической структуры, может быть затем использована для формулирования гипотез фармакофора. Например, если кристаллическая структура указывает, например, на то, что существует неиспользуемый акцептор водородной связи (например, карбонильная группа глутаматного остатка) в активном сайте фермента на определенном расстоянии (например, 3 ) от донора водородной связи (например, протонированной аминной части) молекулы ингибитора, может быть сконструирован новый потенциальный ингибитор, в котором группа-донор водородной связи находится на подходящем расстоянии. Данный процесс может быть повторен для обеспечения возрастания силы и специфичности ингибиторов фермента.-6 007612 Компьютеризированный поиск фармакофоров может осуществляться с применением информации рентгеноструктурного кристаллографического анализа для создания компьютерной модели. Имеющиеся в продаже соединения могут быть подогнаны и отобраны для скрининга с применением основы стыковки как один, но необязательно только один, элемент для рассмотрения. Дополнительные аналоги могут быть куплены или синтезированы, и затем проведен их скрининг. Эксперименты с данными аналогами могут быть использованы для подтверждения гипотезы, вытекающей из предшествующих экспериментов по скринингу, или для создания новых гипотез, которые могут сходно проверяться с помощью повторения процесса. В некоторых случаях могут быть идентифицированы альтернативные матрицы, и соединения, основанные на данных матрицах, могут быть куплены или синтезированы для проверки новых гипотез. Может быть желательной идентификация фармацевтически значимых матриц и/или матриц, с помощью которых наилучшим образом проверяются гипотезы комплементарного связывания. В каждом случае обычно проводят скрининг соединений в отношении фермента-мишени и тестируют также антибактериальную активность in vitro. Более того, способы молекулярного моделирования известны в данной области техники, включая применение подходящих как аппаратных средств моделирования, так и компьютерных программ для создания и использования моделей конформаций рецепторов и ферментов. Многочисленные компьютерные программы доступны и подходят для рационального конструирования лекарств и процессов компьютерного моделирования, построения моделей и компьютерной идентификации, выбора и оценки потенциальных антимикробных соединений в описанных в данном описании способах. Они включают, например, GRID (имеющуюся в распоряжении Oxford University, UK),MCSS (имеющуюся в распоряжении Accelrys, Inc., San Diego, CA), AUTODOCK (имеющуюся в распоряжении Oxford Molecular Group), FLEX X (имеющуюся в распоряжении Tripos, St. Louis, MO), DOCK(имеющуюся в распоряжении University of California, San Francisco), CAVEAT (имеющуюся в распоряжении University of California, Berkeley), HOOK (имеющуюся в распоряжении Accelrys, Inc., San Diego, CA) и системы трехмерных баз данных, такие как MACCS-3D (имеющуюся в распоряжении MDL Information(имеющуюся в распоряжении Accelrys, Inc., San Diego, CA). Потенциальные антимикробные соединения могут быть также созданы с помощью компьютерного конструирования "de novo" с применением таких пакетов компьютерных программ, как LUDI (имеющуюся в распоряжении Biosym Technologies, San Diego,CA), LEGEND (имеющуюся в распоряжении Accelrys, Inc., San Diego, CA) и LEAPFROG (Tripos Associates,St. Louis, MO). Энергия деформации соединения и электростатическое отталкивание могут быть оценены с применением программ, таких как GAUSSIAN 92, AMBER, QUANTA/CHARMM и INSIGHT II/DISCOVER. Данная компьютерная оценка и способы моделирования могут быть выполнены на любом подходящем аппаратном средстве моделирования, включая, например, рабочие станции, имеющиеся в распоряженииSilicon Graphics, Sun Microsystems, и другие. Данные способы, методы, аппаратные средства моделирования и пакеты компьютерных программ являются показательными и не рассматриваются как исчерпывающее перечисление. Другие способы моделирования, известные в данной области техники, могут быть также применены в соответствии с данным изобретением. Смотри, например, N.C. Cohen, MolecularModeling in Drug Design, Academic Press (1996) (и имеющиеся там ссылки), и компьютерные программы,идентифицированные на различных сайтах Интернета. Оптимизация ингибиторной активности в отношении D-Ala-D-Ala-лигазы может быть независимой от оптимизации антибактериальной активности. Различные активности могут быть распознаны путем применения бактериального штамма, сконструированного так, что он сверхэкспрессирует D-Ala-D-Alaлигазу (т.е. создает штамм бактерий, которые устойчивы к ингибиторам D-Ala-D-Ala-лигазы) и затем показывает, что антибактериальная активность конкретного лидирующего соединения не пострадала в результате такой сверхэкспрессии. Изобретение будет дополнительно описано в последующих примерах, которые не ограничивают объем изобретения, описанный в формуле изобретения. Примеры Пример 1. Способы кристаллизации, сбора данных и определения структуры. Информацию о структуре получали либо путем совместной кристаллизации D-Ala-D-Ala-лигазы в присутствии лигандов или лигандов пропитки преформированных кристаллов белка. Первый подход давал кристаллы (шестиугольные стержни; 0,1 мм x 0,1 мм x 0,2 мм) лигазы, комплексированной с ингибиторами, дифракционного качества через 5 дней при 18 С путем диффузии паров в 4-мкл каплях, содержащих 5 мг/мл белка, 35 мМ ацетатный буфер (рН 4,5), 2,75% (маc./об.) полиэтиленгликоль 6000, 4% ДМСО и 15-100-кратный молярный избыток ингибитора по отношению к его величине Ki. Во втором подходе кристаллы лигазы в комплексе с АТФ инкубировали в стабилизирующем растворе, который содержал 70 мМ ацетатный буфер (рН 4,5), 5% (маc./об.) полиэтиленгликоль 6000 и 15-100-кратный молярный избыток ингибитора по отношению к его величине Ki. Данные дифракции получали при -180 С на регистрирующей пластине (RAXIS IV), помещенной на вращающемся анодном генераторе Rigaku RuH3R, снабженном медным анодом, 0,5 мм катодом и осмиевыми отражателями. Параметры единичной ячейки определяли по одиночному 1 осцилляционному-7 007612 отображению с помощью программы обработки DENZO (Z. Otwinowski and W. Minor, "Processing of X-rayDiffraction Data Collected in Oscillation Mode", Methods in Enzymology, Vol. 276: Macromolecular Crystallography,part A, p. 307-326, 1997, C.W. Carter, Jr.R.M. Sweet, Eds., Academic Press). Полные наборы данных получали на одиночном кристалле путем сбора 100-180 осцилляционных отображений с интервалами 1 в течение 15 мин при расстоянии от детектора 100 мм. И совместные кристаллы, и пропитанные кристаллы комплексов лигаза-ингибитор относятся к пространственной группе P212121 с двумя молекулами в асимметричном звене и следующими размерами ячейки: а=69,6 , b=82,6 , с=97,6 . Типичные данные на 98% являются полными до 2,0 при Rsym 4-9%. Опубликованные атомные координаты лигазы, комплексированной с фосфинатным ингибитором(Fan et al., Science, 266(1584):439-443, Oct. 21, 1994), были использованы в качестве поисковой модели для разрешения кристаллической структуры лигазы: AMPPNP путем молекулярного замещения с применением программы XPLOR (Brunger et al., Science, 235:458-460, 1987), и уточненную структуру AMPPNP затем использовали в качестве исходной модели для уточнения последующих комплексов. Установленную с помощью описанных в данном описании способов структуру лигазы, комплексированной с молекулой, уточняли путем проведения нескольких циклов модельной закалки с последующими позиционными и ограничивающими В-факторными уточнениями с помощью XPLOR. Пример 2. Определение IС 50 D-Аlа-D-Аlа-лигазы. Пуриновые производные примера 1 растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 100 мМ в день скрининга с применением вихревого смесителя, если это необходимо для растворения. Растворы хранили при комнатной температуре до завершения скрининга. В день скрининга готовили свежий исходный раствор 10 мМ НАДН (Sigma) путем растворения 32 мкмоль НАДН в 3,2 мл дважды дистиллированной воды. Раствор НАДН хранили на льду. Также готовили и хранили на льду исходные растворы, содержащие 50 мМ фосфоенолпируват (PEP; Sigma) 500 мкМHERMES, 30 мМ аденозинтрифосфат (АТФ; Sigma), 200 мМ D-аланин (Sigma) и 4-базовый буфер (т.е. 100 мМ hepes, 40 мМ хлорид магния и 40 мМ хлорид калия). От Sigma был также получен исходный раствор пируваткиназы/лактатдегидрогеназы (PK/LDH). Для каждого набора из семи тестируемых пуриновых соединений использовали два 96-луночных планшета: планшет ингибитора и планшет фермента. Тестируемые соединения соответствовали рядам A-G планшет. D-циклосерин (Sigma), использовавшийся в качестве контроля, соответствовал ряду Н каждого планшета. Раствору фермента давали нагреться до 25 С. Разведения получали следующим образом. В каждую лунку колонок 1-11, ряды A-G, планшета ингибитора добавляли 50 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). В каждую лунку колонок 1-11, ряд Н, добавляли 50 мкл 1x базового буфера или ДМСО (в зависимости от того, в каком растворителе растворяли циклосериновый контроль). В лунки колонки 12, ряды A-G, добавляли 100 мкл 100 мМ растворов пурина(т.е. первое соединение в ряд А, второе соединение в ряд В и т.д.). В колонку 12, ряд Н, добавляли 100 мкл 100 мМ раствора циклосерина. Из каждого ряда колонки 12 переносили 50 мкл раствора в тот же ряд колонки 11, смешивая раствор с ДМСО. Затем 50 мкл раствора переносили из каждого ряда колонки 11 в тот же ряд колонки 10, 50 мкл из колонки 10 переносили в колонку 9 и т.д. вплоть до колонки 2. В колонку 1 раствор не переносили. Отмечали время начала и окончания. В каждую лунку планшета фермента добавляли 120 мкл раствора фермента. Температуру растворов субстратов доводили до 25 С. Затем инкубировали пурины и ферменты. Поскольку реакции инициировались в колонках, пурины также добавляли от колонки к колонке для сведения к минимуму различий по времени реакции между лунками. При t=0 мин из каждой лунки колонок 1-4 планшета ингибитора переносили 5 мкл пурина в соответствующую лунку планшета фермента. При t=4 мин из каждой лунки колонок 5-8 планшета ингибитора переносили 5 мкл пурина в соответствующую лунку планшета фермента. При t=8 мин из каждой лунки колонок 9-12 планшета ингибитора переносили 5 мкл пурина в соответствующую лунку планшета фермента. После этого планшет ингибитора замораживали. При t=18-19 мин раствор субстрата с температурой 25 С помещали в УФ-визуальный спектрофотометр Spectromax. При t=20 мин в пределах 30-секундного интервала в каждую лунку колонок 1-4 добавляли 125 мкл раствора субстрата и считывали поглощение при 340 нм. При t=24 мин и t=28 мин, соответственно, процесс повторяли для колонок 5-8 и 9-12. Таким образом, концентрации соединений в колонках 1-12 в каждом ряду равнялись 0, 1,9, 3,9, 7,8,15,6, 31,2, 62,5, 125, 250, 500 мкМ, 1 мМ и 2 мМ соответственно. Величины восстановления умножали на -4,06 для перевода единиц мОП/мин в нМ/с (OП=LМ;=6220 1/Мсм; L=0,66 см; мОП/с=6220x0,66x(мМ/с)x60; (мОП/с)x4,06=нМ/с); умножали на -1, поскольку поглощение НАДН снижается при увеличении образующегося продукта). Строили графики скорости реакции против концентрации ингибитора с применением Kaleidograph и определяли величины IС 50 и Ki после подгонки данных под уравнения. Для % ингибирования за 100% активность принимали активность фермента в присутствии ДМСО.-8 007612 Циклосерин в 1x базовом буфере находился в концентрации приблизительно 150 мкМ. Данный способ анализа зависит от допущения, что пуриновые соединения являются неконкурентными ингибиторами. Пример 3. Определение % ингибирования D-Аlа-D-Аlа-лигазы. Повторяли процедуру анализа, описанную в примере 2, за исключением того, что планшеты ингибитора готовили с 5 мМ растворами ингибиторов в планшетах (а не с помощью последовательных разведений) с получением конечной концентрации ингибитора 100 мкМ. Пример 4.Определение Ki и типа ингибирования. Повторяли процедуру анализа, описанную в примере 2, с применением трех различных растворов субстрата, каждый в отдельном планшете фермента. Конечные концентрации в реакционных смесях составляли: (А) 2 мМ АТФ и 1 мМ D-аланин; (В) 2 мМ АТФ и 32 мМ D-аланин; и (С) 50 мкМ АТФ и 32 мМD-аланин. Со всеми тремя планшетами фермента использовали один и тот же планшет ингибитора. В качестве контролей применяли аденозин (Sigma) и циклосерин (Sigma). Пример 5. Анализ антимикробной восприимчивости микроразведением. Готовили исходные растворы тестируемых соединений в ДМФ в концентрации 5 мг/мл. Затем из исходных растворов готовили рабочие растворы тестируемых соединений в бульоне Мюллера-Хинтона(МНВ) с исходной концентрацией 64 мкг/мл (т.е. 25,6 мкл исходного раствора в 974,4 мкл МНВ=128 мкг/мл,которые разводили равным объемом бактериального инокулята в ходе нижеследующей процедуры). Бактериальные инокуляты получали из ночной культуры (т.е. одна свежая колония из агаровой чашки в 5 мл МНВ; Н. influenzae выращивали в МНВ с добавлением дрожжевого экстракта, гематина и НАД),центрифугировали 2x5 мин/3000 об./мин (для S. pneumoniae и Н. influenzae, 2x10 мин/3000 об./мин) и каждый раз разносили в 5 мл свежего МНВ, так что бактериальную суспензию разводили для получения 100 колониеобразующих единиц (к.о.е.) в лунке микропланшета (суммарный объем 100 мкл). Лунки микропланшета затем наполняли двукратными разведениями тестируемого соединения(50 мкл), начиная с 64 мкг/мл. Колонки 2-12 наполняли 50 мкл бактериального инокулята (конечный объем: 100 мкл/лунка). Планшеты инкубировали при 37 С в течение 18-24 ч (S. pneumoniae выращивали в обогащенной СО 2 атмосфере). Затем измеряли оптическую плотность каждой лунки при 590 нм (ОП 590) с помощью TECANSpectroFluor Plus и определяли минимальную ингибиторную концентрацию (MIC) как концентрацию,которая вызывала 90% ингибирование роста. Пример 6. Определение MIC с применением сверхэкспрессирующей Е. coli. Повторяли процедуру примера 5 со следующими модификациями. Для выращивания бактерий применяли бульон luria (LB) с добавками антибиотиков (20 мг/л хлорамфеникола для векторов pBAD, 100 мг/л ампициллина для векторов рТАС для селекции плазмид) или минимальную среду М 9 с D-маннитом в качестве источника углерода. Бактерии, примененные для инокуляции в LB, получали следующим образом. Ночную культуру разводили 1:50 свежей средой LB и инкубировали при 37 С на шейкере при 250 об./мин. После достижения среднелогарифмической стадии (ОП 600=0,5-1,0, приблизительно 3 ч) добавляли регулятор оперона(глюкозу, арабинозу или IPTG) и бактерии дополнительно инкубировали в течение 3 ч. Через 3 ч вновь измеряли ОП 600 для определения количества бактерий и культуру разводили средой LB (антибиотики хлорамфеникол или ампициллин и регуляторы добавляли в удвоенных концентрациях). Конечный бактериальный инокулят содержал около 10000 к.о.е./лунка. Бактерии, примененные для инокуляции минимальной среды М 9, получали следующим образом. Ночную культуру в LB центрифугировали 2x5 мин/3000 об./мин, промывали средой М 9, разводили 1:50 минимальной средой М 9, оставляли при 37 С в течение 14 ч (ОП 600 0,5), добавляли регулятор оперона и бактерии дополнительно инкубировали в течение 3 ч. Через 3 ч измеряли ОП 600 для определения количества бактерий и культуру разводили минимальной средой М 9 (антибиотики хлорамфеникол или ампициллин и регуляторы добавляли в удвоенных концентрациях). Конечный бактериальный инокулят содержал около 10000 к.о.е./лункa. Оптическую плотность считывали через 24 и 48 ч из-за более медленного бактериального роста в минимальной среде. Пример 7. Стыковка виртуальной библиотеки из 700 пуриновых производных. Из справочника доступных химических препаратов (ACD, MDL Information Systems, San Leandro,CA) был отобран набор из 700 первичных алифатических аминов с молекулярной массой 300, не содержащих реакционноспособных или токсичных функциональных групп и доступных от Aldrich. Библиотеку из 700 пуринов, замещенных в положении 6 отобранными аминами, создавали с помощью модуля Analog Builder программы Cerius2 (MSI, Accelrys, Inc., San Diego, CA).-9 007612 Конформационный поиск проводили на 700 аналогах с применением программы Catalyst (Accelrys,Inc., San Diego, CA). Таким путем был создан репрезентативный набор конформеров для каждого соединения. Затем проводили кластерный анализ для исключения дубликатов. Два конформера одной и той же молекулы рассматривались как дубликаты, если корень среднего квадратичного отклонения между соответствующими координатами после наложения составлял менее 1,0 . В таких случаях оставляли лишь один из двух конформеров. Отобранные конформеры размещали в активном центре D-Ala-D-Ala-лигазы с помощью программы EUDOC (предоставленной Dr. Yuan-Ping Pang, Mayo Clinic). В следующей таблице представлены типичные вводные массивы данных, применявшиеся при расчете стыковки. Таблица типичного вводного файла для расчета стыковки Модуль поиска (1=прогноз для лиганда; 2=виртуальный скрининг): 2 Количество различных лигандов: 14258 Начало рамки на оси х: -44,5 Начало рамки на оси у: -11,5 Начало рамки на оси z: 9 Размер рамки по оси х: 9,0 Размер рамки по оси у: 3,5 Вращательный инкремент (10, 20 или 30 дуговых градусов): 30 Поступательный инкремент (от 0 до 6,0 ): 0,5 Граница отсечения энергии межмолекулярного взаимодействия (от 0 до -60 ккал/моль): 1000,0 Основание (1=МРР; 2=гомологичный кластер; 3=гетерологичный кластер): 1 Количество доступных процессоров: 10 Ориентацию каждого соединения с наименьшей вычисленной энергией связывания повторно оценивали с помощью набора из 5 дополнительных функций оценки, обеспечиваемых программой CSCORE(Tripos, Inc., St. Louis, МО), и с помощью функции SCORE (университет Beijing). Соединения ранжировали на основе консенсусной оценки, и в соответствии с этим был отобран набор из 100 кандидатов для синтеза. Пример 8. Сравнение последовательности D-Аlа-D-Аlа-лигазы. Авторы создали таблицу выравнивания белковой последовательности для следующего 51 фермента бактериальной D-Ala-D-Ala-лигазы. Результаты выравнивания показаны на фиг. 10. Cущественные структурные элементы показаны на фиг. 10 (см. контактные коды).- 10007612 Другие осуществления Следует понимать, что хотя изобретение было описано в связи с его подробным описанием, предшествующее описание предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. В объем следующей формулы изобретения включаются другие аспекты, преимущества и модификации. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ оценки потенциала химического объекта к взаимодействию с молекулой или молекулярным комплексом, включающим связывающий карман, определенный структурными координатами аминокислот Lys144, Glu180, Lys181, Leu183, Glu187, Asp257 и Glu270 D-Ala-D-Ala-лигазы E. coli, в соответствии с фиг. 8; или с гомологом указанной молекулы или молекулярного комплекса, где указанный гомолог содержит связывающий карман, который имеет среднее квадратичное отклонение от атомов остова указанных аминокислот не более чем 10 , включающий стадии применения вычислительных средств для выполнения операции подгонки между химическим объектом и связывающим карманом, определенным структурными координатами аминокислот Lys144,Glu180, Lys181, Leu183, Glu187, Asp257 и Glu270 D-Ala-D-Ala-лигазы Е. coli +/- среднее квадратичное отклонение от атомов остова указанных аминокислот не более чем 10 ; и анализа результатов указанной операции подгонки для количественной оценки связи между химическим объектом и связывающим карманом. 2. Способ идентификации потенциального ингибитора D-Ala-D-Ala-лигазы, причем способ предусматривает применение атомных координат Lys144, Glu180, Lys181, Leu183, Glu187, Asp257 и Glu270 D-Ala-DAla-лигазы E. coli в соответствии с фиг. 8 +/- среднее квадратичное отклонение от атомов остова указанных аминокислот не более чем 10 для создания трехмерной структуры связывающего кармана D-AlaD-Ala-лигазы; применение указанной трехмерной структуры для конструирования или отбора указанного потенциального ингибитора; синтез или получение указанного ингибитора; и взаимодействие указанного ингибитора с D-Ala-D-Ala-лигазой для определения способности указанного потенциального ингибитора ингибировать D-Ala-D-Ala. 3. Способ по п.2, где указанная применяемая стадия включает такое конструирование молекулы,что она при стыковке с указанной трехмерной структурой имеет донор водородной связи между 2,4 и 3,5 от одного или обоих атомов кислорода карбоксилата боковой цепи Glu180, донор водородной связи между 2,4 и 3,5 от амидного кислорода остова Lys181, акцептор водородной связи между 2,4 и 3,5 от амидного азота остова Leu183, донор водородной связи между 2,74 и 3,5 от амидного кислорода остоваLeu183 и акцептор водородной связи между 2,4 и 3,5 от азота боковой цепи Lys144. 4. Способ по п.3, где молекула дополнительно включает гидрофобные взаимодействия на расстоянии 3,5-4,5 от углерода CD1 и атомов серы SD боковых цепей Leu269 и Met154 соответственно. 5. Способ по п.2, где потенциальный ингибитор представляет собой бисубстратный аналог. 6. Способ по п.2, дополнительно включающий определение Ki потенциального ингибитора в отношении лигазы с применением ферментного анализа. 7. Способ по п.2, дополнительно включающий определение взаимодействий между потенциальным ингибитором и лигазой с применением исследований остановленного потока. 8. Способ по п.2, дополнительно включающий определение взаимодействий между потенциальным ингибитором и лигазой путем измерения гашения флуоресценции, присущей триптофану лигазы. 9. Способ по п.2, дополнительно включающий определение взаимодействий между потенциальным ингибитором и лигазой путем измерения предотвращения протеолиза лигазы, причем указанное предотвращение коррелирует со стабилизацией лигазы потенциальным ингибитором. 10. Способ по п.2, дополнительно включающий определение эффекта потенциального ингибитора на рост бактерий дикого типа по сравнению со штаммами, сверхэкспрессирующими D-Ala-D-Ala-лигазу. 11. Способ идентификации потенциального ингибитора D-Ala-D-Ala-лигазы или ее гомолога, причем способ предусматривает конструирование или отбор молекулы, в которой Ilе 142 в D-Ala-D-Ala-лигазе или его эквивалент в гомологе отстоит на 12 от Met259 в D-Ala-D-Ala-лигазе или его эквиваленте в гомологе и Met154 вD-Ala-D-Ala-лигазе или его эквивалент в гомологе отстоит на 12 от Leu269; синтез или получение указанного ингибитора; и взаимодействие указанного ингибитора с D-Ala-D-Ala-лигазой для определения способности указанного потенциального ингибитора ингибировать D-Ala-D-Ala. 12. Способ по п.11, дополнительно включающий определение Ki потенциального ингибитора в отношении лигазы с применением ферментного анализа. 13. Способ по п.11, дополнительно включающий определение взаимодействий между потенциаль- 11007612 ным ингибитором и лигазой с применением исследований остановленного потока. 14. Способ по п.11, дополнительно включающий определение взаимодействий между потенциальным ингибитором и лигазой путем измерения гашения флуоресценции, присущей триптофану лигазы. 15. Способ по п.11, дополнительно включающий определение взаимодействий между потенциальным ингибитором и лигазой путем измерения предотвращения протеолиза лигазы, причем указанное предотвращение коррелирует со стабилизацией лигазы потенциальным ингибитором. 16. Способ по п.11, дополнительно включающий определение эффекта потенциального ингибитора на рост бактерий дикого типа по сравнению со штаммами, сверхэкспрессирующими D-Ala-D-Ala-лигазу.