Применение биологически активного тат вич-1, его фрагментов или производных для нацеливания на антигенпредставляющие клетки и/или их активации и/ или для доставки карго-молекул для профилактической или терапевтической вакцинации и/или для лечения других заболеваний

006850 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение основывается на новом и неожиданном открытии, что низкие количества (пикомолярные-наномолярные) нативного, по существу мономерного, биологически активного Tat-белка ВИЧ-1, его фрагментов или производных, (i) специфически связываются, через RGD-домен (домен ряда белков, узнаваемый интегринами), с 51 и интегринами, которые селективно экспрессируются на антигенпредставляющих клетках, таких как дендритные клетки, макрофаги и активированные цитокинами эндотелиальные клетки, (далее называемых АПК), (ii) эффективно входят в АПК, (iii) способствуют созреванию и активации дендритных клеток и эндотелиальных клеток и (iv) имеют доступ к ограниченному главным комплексом гистосовместимости как класса-I, так и класса-II пути представления антигена. Таким образом, данное изобретение предусматривает использование этих новых открытий вышеупомянутых природных и взаимосвязанных свойств биологически активного Tat-белка ВИЧ-1, его фрагментов и производных, в качестве системы доставки как для антигенных, так и для терапевтических (далее совокупно называемых "карго" (груз молекул для лечения определенных заболеваний человека, таких как,но не только, инфекционные заболевания, воспалительные и ангиогенные заболевания и опухоли, и в качестве адъюванта и иммуномодулятора в вакцинах с одним антигеном или множественными антигенами для применений в профилактических и терапевтических вакцинациях, 1) посредством селективного нацеливания, связывания и доставки карго-молекул к АПК, в первом варианте данного изобретения, 2) посредством селективного нацеливания и связывания с дендритными клетками и эндотелиальными клетками, способствующего, следовательно, их созреванию и активации, и посредством индукции иммунных реакций Th-1-типа против них самих и, что важно, других антигенов, во втором варианте данного изобретения. В частности, данное изобретение относится к 1) способу для специфического нацеливания на АПК и доставки карго-молекул к АПК для иммунизации или лечения людей против инфекционных, воспалительных и ангиогенных заболеваний или опухолей, 2) способу для увеличения иммунизирующей активности других антигенов в профилактической и терапевтической иммунизации людей против инфицирования одним или несколькими патогенами. Данное изобретение специфически и однозначно относится к применению нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat-белка ВИЧ-1, его фрагментов или производных, для специфического нацеливания на АПК для доставки карго-молекул через наружную мембрану и ядерные мемебраны клетки, в варианте доставки лекарственного средства или антигена данного изобретения; и для специфического нацеливания на дендритные клетки и эндотелиальные клетки для стимуляции их созревания, активации и индукции иммунных реакций Th-1-типа против других антигенов в варианте адъювантов вакцин и иммуномодуляции данного изобретения. Уровень техникиTat является регуляторным белком вируса типа 1 иммунодефицита человека (ВИЧ-1), продуцируемым рано после инфицирования и существенным для экспрессии, репликации и инфекционности (инвазивной способности) вирусных генов (Аrуа 1985; Fisher 1986; Chang 1995). Во время острой инфекции Тклеток посредством ВИЧ Tat также высвобождается во внеклеточную среду и поглощается соседними клетками (Frankel 1998: Ensoli 1990; Ensoli 1993; Chang 1997), где, в соответствии с концентрацией, может увеличивать инфекционность вируса. Конкретно, после поглощения Tat может усиливать, в инфицированных клетках, экспрессию и репликацию вирусных генов (Frankel 1988; Ensoli 1993; Chang 1997), а,в неинфицированных клетках, экспрессию рецепторов -хемокинов CCR5 и CXCR4, способствующих переносу как макрофаг-, так и Т-лимфоцит-тропных штаммов ВИЧ-1 (Huang 1998; Secchiero 1999). Внеклеточный Tat-белок ВИЧ-1 является также ответственным за увеличенную встречаемость и агрессивность саркомы Капоши (KS), васкулярной опухоли, особенно часто встречающейся в ВИЧинфицированных индивидуумах (Friedman-Kien 1981; Safai 1985). В частности, более раннее исследование группы авторов данного изобретения и других групп показали, что Tat действует совместно с ангиогенными и воспалительными цитокинами, которые в высокой степени экспрессируются в пациентах с саркомой Капоши (KS) (Samaniego 1998; Ensoli 1994), в индукции образования новых кровеносных сосудов (ангиогенеза) и роста и локомоции веретенообразных клеток, происходящих из эндотелиальных клеток (KS-клеток), и активированных эндотелиальных клеток (Barillari 1992; Albini 1995; Ensoli 1994). Кроме того, было показано, что последовательность, содержащаяся между остатками 21 и 40 (центральный домен) в Tat-белке ВИЧ-1, действует как трансактиватор для индукции репликации ВИЧ и для запуска ангиогенеза (WO 00/78969 А 1). В частности, результаты авторов данного изобретения показали,что биологически активный Tat связывается через RGD-район с интегриновыми рецепторами 51 иv3 и что это взаимодействие опосредует адгезию, рост и локомоцию, индуцируемую Tat на клетках KS и эндотелиальных клетках, активированных воспалительными цитокинами (Barillari 1993; Barillari 1999a и 1999b). Кроме того, Tat действует также в качестве хемотактического фактора для этих типов клеток, а также для моноцитов и дендритных клеток (ДК) (Albini 1995; Benelli 1998; Lafrenie 1996; Mitola 1997). Наконец, данные авторов изобретения продемонстрировали, что миграция и инвазия клеток KS и HUVE в направлении Tat-белка опосредована связыванием RGD-домена Tat с интегринами 51 и v3 (Barillari-1 006850 1999b). Согласно этим открытиям, было показано, что иммунная реакция на Tat играет ключевую роль в регуляции прогрессирования СПИДа и СПИД-ассоциированных заболеваний. В самом деле, Tatспецифическая иммунная реакция присутствует в ВИЧ-1-инфицированных субъектах и обезьянах, инфицированных вирусом иммунодефицита обезьян (SIV), и обратно коррелирует с прогрессированием симптоматической стадии этой инфекции (Reiss 1990; Venet 1992; Rodman 1993; Froebel 1994; Re 1995; VanBaalen 1997; Zagaru 1998; Addo 2001). Кроме того, вакцинация биологически активным Tat-белком илиtat-ДНК индуцирует защиту против репликации вируса SHIV89.6P и возникновения заболевания, что коррелирует с присутствием Th-1-реакций, в том числе специфических цитотоксических Т-лимфоцитов(CTL) (Cafaro 1999; Cafaro 2000; Cafaro 2001 и РСТ WO 99/27958). Такие же данные о защите наблюдали ранее с вакциной tat-rev, доставляемой вирусными векторами, на макаках (Osterhaus 2001). В противоположность этому, ограниченное сдерживание этой инфекции наблюдали у обезьян, вакцинированных инактивированными Tat или Tat-пептидами, в которых индуцировались антитела и Т-хелперспецифические реакции, но не CTL- или Th-1-реакции (Goldstein 2000; Pauza 2000). Опять-таки, периодическая интрадермальная (i.d.) инокуляция обезьян одним нативным и активным Tat-белком (в отсутствие какого-либо адъюванта) при низких дозах (5-6 мкг) селективно индуцировала Th-1-реакцию и специфические CTL в ответ на любое значимое продуцирование антител (Cafaro 1999 и РСТ WO99/27958). Эти иммунологические результаты были недавно подтверждены в новом протоколе вакцинации, в котором периодически инокулировали только нативный Tat i.d. в 4 обезьян (неопубликованные данные), и результаты является сравнимыми с результатами, индуцированными i.m. вакцинацией tat-ДНК, в опубликованном (Cafaro 2001 и РСТ WO99/27958) и продолжающемся исследовании. Подобным образом,недавнее исследование, выполняемое на SIV-инфицированных макаках, показывает, что CTL анти-Tat являются ключевым фактором для контроля ранней репликации вируса после первичной инфекции и проявляют иммунное давление на этот вирус, приводя к появлению медленной репликации, менее патогенным ускользнувшим мутантам (Allen 2000). Наконец, Tat представляется антигеном главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I (Моу 1996; Kim 1997), индуцируя, следовательно, CTL против Tat (Cafaro 1999). Было показано, что микромолярные концентрации рекомбинантного Tat-белка (часто неизвестной биологической активности) или пептидов, включающих в себя щелочной (основной) район Tat, входят во многие различные типы клеток (Frankel 1988; Mann 1991; Ensoli 1993; Chang 1997; Fawell 1994; Моу 1996; Kim 1997). Высокий щелочной (основный) заряд остатков 48-57 Tat фактически позволяет этому белку связываться с гепарансульфат-протеогликанами (HSPG), которые присутствуют на мембране всех типов клеток (Chang 1997; Rusnati 1998). После высвобождения из остро инфицированных клеток фракция внеклеточного Tat связывается через его щелочные остатки с HSPG (Chang 1997). Это защищает внеклеточный Tat от протеолитической деградации, как это было обнаружено ранее для некоторых факторов роста (обзор в Raines and Ross, 1992). После связывания его щелочного района с HSPG клеточной поверхности Tat интернализуется через рецептор-независимый путь (Frankel 1988; Rusnati 1998; Tyagi 2001). Действительно, было показано, что остатки Tat 49-57 (в последовательности Tat ВН-10) способны транслоцировать пептид OVA в цитозоль DC (дендритных клеток, ДК) и сенсибилизировать CD8+ Тклетки в отношении этого пептида (Kim 1997). Кроме того, было сделано предположение, что последовательность 47-57 Tat (из варианта ВН-10), слитая с несколькими эффекторными белками, способна доставлять их в клетки (WO 01/19393 А 1). Однако механизм интернализации требует высоких (микромолярных) концентраций Tat, встречается в случае любого клеточного типа и не является последовательность-специфическим. В самом деле, было показано, что мутации этого района, которые не изменяют его щелочного зарада, не влияют на свойства щелочного района Tat (Barillari 1999b). Подобным образом,замена щелочного района Tat районом rev или других генов ВИЧ не изменяет свойства Tat. В этом отношении, было показано, что щелочной район Tat является очень похожим на аргинин-богатый район,имеющийся в членах небольшого семейства белков, известных как пенетратины, которые, все, способны входить во многие типы клеток (Derossi 1998). Фактически, было показано, что гомополимеры аргинина входят в клетки даже более эффективно, чем щелочной район Tat (Derossi 1998). Свойство щелочного района Tat интернализоваться клетками использовали для доставки чужеродных белков в различные типы клеток (Fasel 1994; Wender 2000 и WO 0119393). Для этой цели чужеродные белки конъюгировали или сливали со щелочным районом Tat, который использовали в качестве носителя для трансдуцируемого белка (Fawel 1994; Wender 2000 и WO 0119393). Однако автор данного изобретения считает, что вследствие повсеместной экспрессии HSPG щелочной район Tat не может быть использован для селективного нацеливания, селективной доставки и/или селективного поглощения Tat специфическими первичными типами клеток, в том числе антиген-представляющими клетками (АПК). АПК инициируют и запускают тип иммунной реакции после сталкивания с чужеродными молекулами (Bancherau 1998; Bell 1999). Типичные АПК включают в себя происходящие из моноцитов ДК(дендритные клетки) (MDDC), Т-лимфобласты (пре-Т-клетки) (ТСВ), В-лимфобластоидные клеточные линии (BLCL) и моноциты-макрофаги (Bancherau 1998; Bell 1999). Кроме того, при активации воспалительных цитокинов эндотелиальные клетки приобретают функции АПК (Pober 1988). Среди этих воспа-2 006850 лительных цитокинов интерлейкин (IL)-l, фактор некроза опухолевых клеток (TNF) и интерферон (IFN) являются ключевыми факторами для активации эндотелиальных клеток (Pober 1988). Подвергание действию этих цитокинов увеличивает в эндотелиальных клетках экспрессию 51 и v3, которые входят в группу нескольких рецепторов клеточной поверхности, связывающих Tat (Barillari 1993; Fiorelli 1999;Benelli 1998; Kolson 1993; Sabatier 1991; Vogel 1993; Boylins 1999; Ganju 1998; Milani 1996; Mitola 1997 и 2000; Weeks 1993; Albini 1996 и 1998; Chang 1997; Lafrenie 1996; Morini 2000; Rusnati 1998). Среди всех этих АПК, ДК являются наиболее эффективными АПК и являются ключевыми для индукции иммунных реакций против инфекций и опухолей (Banchereau 1998; Bell 1999). Их функция ассоциирована с высокой экспрессией МНС и костимуляторных молекул (CD40, CD80, CD86) и с продуцированием цитокинов, которые, как известно, активируют Т-лимфоциты и -хемокины. После сталкивания с антигенами,ДК подвергаются процессу созревания, характеризующемуся увеличением экспрессии костимуляторных молекул и уменьшением их фагоцитарной и пиноцитарной способности (Banchereau 1998; Bell 1999). Далее, вследствие повышающей регуляции хоминг-рецептора CCR7 и понижающей регуляции CCR5,зрелые ДК мигрируют в лимфатические узлы, где они представляют антигены Т-лимфоцитам(Banchereau 1998; Bell 1999). В предшествующем уровне техники показано, что добавление Tat-белка к ДК блокирует в этих клетках вхождение внеклеточного кальция, продуцирование интерлейкина-12 и поглощение апоптотических телец (Zocchi 1997; Rubartelli 1997). В результате прогнозируется, что должны иметь место сильное нарушение важных функций ДК, в том числе поглощения, процессинга и презентации антигена, и индукция Th-1-реакций. Кроме того, сообщалось ухудшение фаголизосомного слияния в моноцитах периферической крови после подвергания действию Tat, что предполагает нарушение в этом типе клеток как бактерицидной функции, так и функции процессинга (и презентации) антигена (Pittus 1996). Кроме того,сообщалось, что Tat индуцирует как моноциты/макрофаги, так и лимфоциты к секреции IL-10 (Masood 1994; Badou 2000), ингибируя продуцирование IL-12 в моноцитах (Ito 1998). Наконец, сообщалось, что подвергание АПК действию Tat сильно ухудшает их способность организовывать кластеры клеток и должным образом активировать Т-клетки (Mei 1997). Кроме того, в предшествующем уровне техники сообщалось, что Tat в сильной степени ухудшает также функции Т-клеток, в том числе супрессию реакций на митогены анти-СD3 или специфические антигены (Viscidi 1989; Benjouad 1993; Subramanyam 1993; Chirmule 1995; Wrenger 1996; Wrenger 1997; Zagury 1998), гиперактивацию Т-клеток (Ott 1997; Li 1997) и апоптоз Т-клеток (Westendorp 1995; Li 1995; McCloskey 1997). Далее, сообщалось, что инокуляция биологически активного Tat является иммуносупрессивной in vivo (Cohen 1999). Часть влияний Tat на иммунную систему была связана с повышающей регуляцией Tat рецепторов хемокинов CCR5 иCXCR4 (Huang 1998; Secchiero 1999) или прямым взаимодействием Tat с рецепторами хемокинов CCR2 и CCR3 (Albini 1998a) или с другими рецепторами, в том числе CD26 (Gutheil 1994), Flt-1 (Mitola 1997,KDR (Albini 1996; Morini 2000), которые экспрессируются иммунными клетками, а также эндотелиальными клетками. Таким образом, в соответствии с предыдущим уровнем техники можно было ожидать,что Tat запускает Th-2-тип иммунной реакции и/или препятствует правильному функционированию АПК и активации Т-клеток или уничтожает правильную функцию АПК и активацию Т-клеток. В противоположность этому, новое и неожиданное открытие авторов данного изобретения, подтвержденное экспериментальными данными, представленными в этой заявке на патент, показывает, что:(i) АПК являются специфически нацеливаемыми Tat, который селективно узнает эти клетки и входит в них при пикомолярных-наномолярных концентрациях, но это требует взаимодействия нативного, по существу мономерного, биологически активного Tat с интегринами 51, v3 через RGDпоследовательность Tat; (ii) и что нативный, по существу мономерный, биологически активный Tat активирует, а не ингибирует, функцию АПК и индуцирует, а не подавляет, иммунные реакции Th-1-типа против себя самого и, что наиболее примечательно, других антигенов. Конкретно, данные авторов данного изобретения показывают, что Tat действует не только в качестве антигена, но также в качестве адъюванта с сильными иммуномодуляторными свойствами. Эти свойства Tat, а именно, способность селективно интернализоваться в виде биологически активного белка антигенпредставляющими клетками (АПК) при пикомолярных-наномолярных концентрациях и действовать в качестве адъюванта, строго связаны друг с другом. В частности, авторы обнаружили, что RGD-последовательность Tat является ключевой для интернализации активного Tat этими клетками через интегриновые рецепторы 51 и v3. В самом деле,антитела или конкурентные лиганды, блокирующие эти интегрины, полностью уничтожают или в сильной степени уменьшают поглощение пикомолярных-наномолярных концентраций Tat, соответственно. Это поглощение является очень быстрым, является зависимым от дозы, от созревания/дифференцировки клеток и от времени. Даже еще более неожиданным является то, что авторы не получили подобных результатов с другими АПК, в том числе моноцитами, Т-лимфобластами или В-лимфобластами или неактивированными эндотелиальными клетками. Таким образом, эти открытия является совершенно новыми,поскольку предыдущий уровень знаний показывает, что Tat поглощается только при гораздо более высоких концентрациях (в микромолярном диапазоне) через его щелочной район не опосредованным рецепторами путем (Frankel 1988; Mann 1991; Rusnati 1998; Tyagi 2001). Этот путь интернализации осуществ-3 006850 ляется в любом типе клеток и не является зависимым от созревания/дифференцировки клеток. Далее, авторы данного изобретения обнаружили, что Tat в его нативной, по существу мономерной и биологически активной форме является абсолютно необходимым для наблюдения всех этих новых эффектов, которые не встречаются, когда Tat является окисленным и инактивированным. В самом деле, Tat имеет 7 цистеинов и является чрезвычайно чувствительным к окислению, которое, если оно происходит,вызывает потерю нативной конформации белка и последующую потерю биологической активности(Frankel 1989). Таким образом, Tat, по-видимому, теряет его нативную конформацию и активность при очистке процедурами, которые не предназначены специально для поддержания этого белка в его нативной форме. Хотя установившиеся концепции в данной области утверждают, что биологически активныйTat является токсичным (Gallo 1999; Sabatier 1991; Kolson 1993; Westendrop 1995; Purvis 1995), в противоположность этому, высокоочищенные, биологически активные препараты рекомбинантного Tat, используемые автором данного изобретения, не имеют ни цитотоксического, ни про-апоптотического действий ни на испытанные эндотелиальные клетки, ДК, макрофаги, клетки других типов, ни на мышей или обезьян in vivo (Ensoli 1994; Barillari 1999a; Zauli 1993, 1995a и 1995b; Cafaro 1999, 2000 и 2001). Таким образом, автор данного изобретения считает, что полноразмерный, дикого типа, нативный,по существу мономерный и биологически активный Tat из любого варианта ВИЧ или его фрагменты или производные, содержащие RGD-район, могут быть использованы в качестве высокоэффективной системы для селективного нацеливания и доставки молекул к специфическим типам клеток, экспрессирующим интегрины, узнаваемые RGD-районом Tat (Barillari 1993, 1999 а и 1999b; Ensoli 1994). Автор считает, что при условии очень большого количества и повсеместного распределения ДК, макрофагов и эндотелиальных клеток в теле человека, способность биологически активного Tat или его фрагментов или производных, содержащих RGD-последовательность, нацеливания этих АПК и запуска клеточных реакций Th-1-типа, будет предоставлять уникальную возможность для 1) доставки карго-молекул к клеточным типам, которые представляют специфическую мишень для Tat и рекрутируются и активируются в инфекциях, патологическом ангиогенезе, воспалительных заболеваниях и опухолях, в варианте систем доставки данного изобретения; 2) индукции сильной иммунной реакции не только против Tat, но также и против других антигенов, доставляемых Tat или с Tat, в варианте адъювантов и иммуномодуляторов вакцин данного изобретения. Эта уверенность автора в сильной степени подтверждается успешным предыдущим исследованием автора с биологически активным Tat в качестве вакцины для борьбы с репликацией ВИЧ и для блокирования возникновения заболевания (Cafaro 1999; Cafaro 2000; Cafaro 2001 и РСТ WO99/27958), в отличие от инактивированного Tat-белка (Goldstein 2000; Pauza 2000). Данная заявка на патент является существенно отличающейся и новаторской во многих аспектах в сравнении с предыдущей заявкой на патент WO 99/27958 автора данного изобретения. В самом деле,вышеупомянутая заявка заявляла, что биологически активный Tat или кодирующая Tat ДНК являются эффективными в качестве вакцины против ВИЧ/СПИда. В то время, когда была подана указанная заявка,авторам не было известно, что низкие (пикомолярные-наномолярные) количества биологически активного Tat, или его фрагментов или производных, содержащих RGD-район, (i) специфически нацелены на АПК и, следовательно авторы не могли заявить его применение в качестве носителя для селективной доставки карго-молекул к ним; (ii) вызывают созревание и активацию клеток ЭК и ДК и индуцируют иммунные реакции Th-1-типа против различных антигенов, и, следовательно, авторы не могли заявить его применение в качестве адъюванта и иммуномодулятора. Таким образом, в данном изобретении, биологически активный Tat предложен, в первом варианте, в качестве системы доставки для доставки к АПК (i) различных антигенов или комбинаций антигенов для вакцинации против различных инфекционных заболеваниий (не только ВИЧ/СПИДа) и опухолей или для поливалентной вакцинации против одного или нескольких инфекционных заболеваний и (ii) терапевтических молекул для лечения инфекционных, воспалительных и ангиогенных заболеваний и роста и метастазирования опухолей; и во втором варианте, биологически активный Tat предложен в качестве адъюванта для запуска опосредованных Т-клетками иммунных реакций против различных антигенов и, в частности, для усиления иммуногенности слабоиммуногенных антигенов, таких как антигены, экспрессируемые некоторыми внутриклеточными патогенами, а также опухолевыми клетками, посредством комбинирования или слияния их с биологически активным Tat или его фрагментами или производными, содержащими RGD-район. Таким образом, наиболее важным новаторским аспектом, который создает различие в сравнении с предыдущим уровнем техники, является то, что здесь нативный, по существу, мономерный и биологически активный Tat-белок заявляется в качестве молекулы, которая проявляет отличающиеся функции: т.е. он является носителем для селективной доставки антигенов к АПК или активных соединений к специфическим тканям и адъювантом, стимулирующим иммунные реакции к другим антигенам. Эти неожиданные свойства делают нативный, по существу мономерный и биологически активный Tat пригодным для различных применений в различных инфекционных заболеваниях (не только СПИДе), воспалительных и ангиогенных заболеваниях и опухолях. Таким образом, автор изобретения считает, что нативный, по существу мономерный и биологически активный Tat, его фрагменты или производные, содержащие RGD-последовательность, действуют-4 006850 посредством по меньшей мере одного из следующих действий: в качестве системы доставки к специфическим АПК или в качестве адъюванта, и заявляет, что он может быть использован для профилактической и терапевтической вакцинации и/или доставки лекарственного средства для предупреждения и лечения ВИЧ/СПИДа, других инфекций, воспалительных и ангиогенных заболеваний. Сущность изобретения Целью данного изобретения является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat ВИЧ-1, его фрагментов или производных, для селективного нацеливания на антигенпредставляющие клетки, экспрессирующие интегрины 51 и v3. Другой целью данного изобретения является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat ВИЧ-1, его фрагментов или производных, для селективного нацеливания на интегрины 51 и v3, экспрессируемые антигенпредставляющими клетками, в том числе дендритными клетками, эндотелиальными клетками и макрофагами, для поглощения Tat, его фрагментов или производных, этими клетками. Другой целью данного изобретения является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat, его фрагментов или производных, для селективного нацеливания на антигенпредставляющие клетки, экспрессирующие интегрины 51 и v3, в том числе дендритные клетки,эндотелиальные клетки и макрофаги, для индукции созревания и/или антигенпредставляющих функций этих клеток Tat-белком, его фрагментами или производными. Другой целью является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat, его фрагментов или производных, комбинированных с одним или несколькими антигенами, в том числе, но не только, антигенами из внутриклеточных патогенов (таких как вирусы, Mycobacterium tuberculosis, Candida, Malaria) и из опухолевых клеток (таких как клетки рака легкого, ободочной кишки, молочной железы, предстательной железы), в форме пептидов, белков или кодирующих их ДНК, для селективного нацеливания in vitro и in vivo на антигенпредставляющие клетки, экспрессирующие интегрины 51 и v3, в том числе дендритные клетки, эндотелиальные клетки и макрофаги, для профилактической и терапевтической вакцинации или лечения против инфекционных заболеваний и опухолей. Другой целью является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat, его фрагментов или производных, для селективной доставки in vitro и in vivo одного или нескольких антигенов к антигенпредставляющим клеткам, экспрессирующим интегрины 51 и v3, в том числе дендритным клеткам, эндотелиальным клеткам и макрофагам, для профилактической и терапевтической вакцинации или лечения инфекционных заболеваний, воспалительных и ангиогенных заболеваний и опухолей. Другой целью является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat, его фрагментов или производных, для селективной доставки, внутриклеточно или к клеточной мембране, in vitro и in vivo, к антигенпредставляющим клеткам, экспрессирующим интегрины 51 иv3, в том числе дендритным клеткам, эндотелиальным клеткам и макрофагам, одного или нескольких антигенов или терапевтических соединений (таких как, но не только, антивирусные соединения, противовоспалительные лекарственные средства, антиангиогенные молекулы, цитотоксические противоопухолевые лекарственные средства или иммуномодулирующие молекулы, такие как, например, хемокины и цитокины, или антитела) с присутствием или в отсутствие частиц-носителей (таких как, но не только,микрочастицы, наночастицы, липосомы и другие состоящие из частиц системы доставки, такие как описанные в Speiser 1991 и Takeuchi 2001), для профилактической и терапевтической вакцинации или лечения инфекционных заболеваний, воспалительных и ангиогенных заболеваний и опухолей. Другой целью является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat, его фрагментов или производных, слитых с другими белками или пептидами или частицаминосителями (определенными выше), для селективной доставки in vitro и in vivo антигенов или терапевтических соединений (определенных выше) к антигенпредставляющим клеткам, экспрессирующим интегрины 51 и v3, в том числе дендритным клеткам, эндотелиальным клеткам и макрофагам, для комбинированной профилактической и терапевтической вакцинации или лечения инфекционных заболеваний, воспалительных или ангиогенных заболеваний и опухолей. Другой целью является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat, его фрагментов или производных, для селективного нацеливания in vitro и in vivo на клетки, экспрессирующие RGD-связывающие интегриновые рецепторы, такие как антигенпредставляющие клетки и другие типы клеток, способные поглощать Tat через опосредованный интегринами путь и/или другие пути поглощения после связывания с интегриновыми рецепторами для доставки антигенов или терапевтических молекул (определенных выше) для профилактической и терапевтической вакцинации или лечения инфекционных заболеваний, воспалительных и ангиогенных заболеваний и опухолей. Другой целью является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat, его фрагментов или производных, комбинированных с антигенами, адъювантами (такими как, но не только, квасцы, RIBI, иммуностимулирующие комплексы (ISCOM), CpG-последовательности, липопептиды) или терапевтическими молекулами или частицами-носителями (определенными выше), вводи-5 006850 мыми парентеральным (подкожным, внутримышечным, интрадермальным) или мукозным (вагинальным,ректальным, внутриротовым или назальным) или топическим (местным) способом для профилактической и терапевтической вакцинации или лечения против инфекционных заболеваний, воспалительных и ангиогенных заболеваний и опухолей. Другой целью является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat, его фрагментов или производных, для селективной доставки in vitro и in vivo антигенов или терапевтических молекул (определенных выше) в частицах-носителях или в прикрепленном к частицамносителям виде (как определено выше) к антигенпредставляющим клеткам, экспрессирующим RGDсвязывающие интегриновые рецепторы, в том числе дендритным клеткам, эндотелиальным клеткам и макрофагам, для комбинированной профилактической и терапевтической вакцинации или лечения против инфекционных заболеваний, воспалительных или ангиогенных заболеваний и опухолей. Другой целью является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat, его фрагментов или производных, для селективной доставки in vitro и in vivo экспрессирующих векторов, в том числе плазмидной ДНК и бактериальных или вирусных векторов, экспрессирующих один или несколько антигенов, в присутствии или в отсутствие частиц-носителей (определнных выше), к антигенпредставляющим клеткам, экспрессирующим RGD-связывающие интегриновые рецепторы, в том числе дендритным клеткам, эндотелиальным клеткам и макрофагам, для профилактической и терапевтической вакцинации или лечения против инфекционных заболеваний, воспалительных или ангиогенных заболеваний и опухолей. Другой целью является применение tat-ДНК или нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat-белка, их фрагментов или производных, слитых или комбинированных с ДНК, кодирующей антигены, с частицами-носителями или без частиц-носителей (как определено выше) для комбинированной профилактической и терапевтической вакцинации против инфекционных заболеваний,воспалительных и ангиогенных заболеваний и опухолей. Другой целью является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat ВИЧ или tat-ДНК, их фрагментов или производных, комбинированных или слитых с антигенами,терапевтическими молекулами (определенными выше), адъювантами (определенными выше) или частицами-носителями (определенными выше), причем такая комбинация или такое слияние определяются как ассоциация посредством химических или физических взаимодействий или посредством любых других взаимодействий, в любой комбинации, такой как, например, но не только, абсорбция Tat и ДНКплазмиды на наночастицах; включение Tat и синтетического лекарственного средства в одном и том же фармацевтическом препарате; ассоциация Tat или его фрагмента или производного с пептидом химическим сшиванием или другими средствами; слияние Tat, его фрагмента или производного, с другим белком или другим пептидом после их экспрессии в бактериях или эукариотических клетках через химерную ДНК, где ДНК-последовательности, кодирующие вышеуказанные полипептиды, были слиты вместе с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Другой целью является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat ВИЧ-1, его фрагментов или производных, в качестве адъюванта для активации или усиления invitro и in vivo антигенпредставляющей функции клеток, экспрессирующих RGD-связывающие интегриновые рецепторы, в том числе дендритных клеток, эндотелиальных клеток и макрофагов, и для индукции иммунных реакций Th-1-типа против ВИЧ/СПИДа, других инфекционных заболеваниий и опухолей. Другой целью является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat-белка или tat-ДНК, их фрагментов или производных, описанных выше, для вакцинации или терапевтического лечения парентеральным (интрадермальным, внутримышечным, подкожным), мукозным(внутриротовым, назальным, вагинальным, ректальным) или топическим (местным) способом. Другой целью являются фрагменты нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat, определенные как Tat-пептиды из любого варианта ВИЧ (ВИЧ-1, ВИЧ-2 и других типов и подтипов), содержащие, отдельно или в связанном виде, RGD-домен (аминокислоты (аа) 73-86 в HTLV-IIIB,клоне ВН-10; аминокислоты 74-84; аминокислоты 75-83; аминокислоты 76-82; аминокислоты 77-81; аминокислоты 77-82; аминокислоты 77-83; аминокислоты 76-83; богатый цистеином домен (аминокислоты 22-37 в HTLV-IIIB, клоне ВН-10); щелочной домен (аминокислоты 48-61 в HTLV-IIIB, клоне ВН 10); комбинированные или некомбинированные с другими Tat-пептидами ВИЧ-1, в том числе доменом центральной (коровой) части (аминокислоты 38-47 в HTLV-IIIB, клоне ВН-10) и/или амино-концевым районом (аминокислоты 1-20 в HTLV-IIIB, клоне ВН-10). Другой целью являются фрагменты нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat, определенные как нуклеотидные последовательности из любого варианта ВИЧ (ВИЧ-1, ВИЧ-2 и других типов и подтипов), содержащие, отдельно или в связанном виде, RGD-домен (последовательность, кодирующую аминокислоты (аа) 73-86 в HTLV-IIIB, клоне ВН-10; последовательность, кодирующую аминокислоты 74-84; последовательность, кодирующую аминокислоты 75-83; последовательность,кодирующую аминокислоты 76-82; последовательность, кодирующую аминокислоты 77-81; последовательность, кодирующую аминокислоты 77-82; последовательность, кодирующую аминокислоты 77-83; последовательность, кодирующую аминокислоты 76-83; богатый цистеином домен (последователь-6 006850 ность, кодирующую аминокислоты 22-37 в HTLV-IIIB, клоне ВН-10); щелочной домен (последовательность, кодирующую аминокислоты 48-61 в HTLV-IIIB, клоне ВН-10); комбинированные или некомбинированные с другими Tat-пептидами ВИЧ-1, в том числе доменом центральной части (последовательностью, кодирующей аминокислоты 38-47 в HTLV-IIIB, клоне ВН-10) и/или амино-концевым районом (последовательностью, кодирующей аминокислоты 1-20 в HTLV-IIIB, клоне ВН-10). Другой целью являются фрагменты Tat из любого варианта ВИЧ (ВИЧ-1, ВИЧ-2 и других типов и подтипов), которые содержат один или несколько Т-клеточных эпитопов в их аминокислотных последовательностях (HTLV-IIIB, клоне ВН-10 или 89.6). Другой целью являются фрагменты Tat из любого варианта ВИЧ (ВИЧ-1, ВИЧ-2 и других типов и подтипов), которые содержат один или несколько Т-клеточных эпитопов в их нуклеотидных последовательностях (HTLV-IIIB, клона ВН-10 или 89.6). Другой целью являются производные Tat, которые содержат мутанты Tat HTLV-IIIB, клона ВН-10,варианта, выбранного из вариантов, имеющих следующие нуклеотидные последовательности или их часть: нуклеотидную последовательность cys22-мутанта и нуклеотидную последовательность lys41 мутанта. Другой целью являются производные Tat, которые содержат мутанты Tat HTLV-IIIB, клона ВН-10,варианта, выбранного среди вариантов, имеющих следующие аминокислотные последовательности или их часть: аминокислотную последовательность суs22-мутанта и аминокислотную последовательностьlys41-мутанта. Другой целью данного изобретения является применение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat-белка, действующего и комбинированного, как описано выше, для получения лекарственных средств для лечения заболеваний в группе инфекционных, воспалительных и ангиогенных заболеваний и опухолей. Дополнительные цели будут очевидными из подробного описания данного изобретения. Описание фигур Фиг. 1. Нативный, по существу, мономерный и биологически активный Tat эффективно и селективно поглощается зависимым от дозы и от времени образом MDDC (происходящими из моноцитов ДК), но не BLCL (В-лимфобластоидными клеточными линиями) или ТСВ (Т-лимфобластами), как иллюстрируется на фиг. 1 А, 1 В, 1 С и 1 С". Фиг. 2. Поглощение нативного, по существу, мономерного и биологически активного Tat MDDC увеличивается при созревании клеток и элиминируется окислением/инактивацией этого белка, как иллюстрируется на фиг. 2 А и 2 В. Фиг. 3. Анти-51- и анти-v3-антитела блокируют поглощение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat MDDC, как иллюстрируется на фиг. 3 А и 3 В. Фиг. 4. Фибронектин и витронектин блокируют поглощение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat MDDC, как иллюстрируется на фиг. 4 А и 4 В. Фиг. 5. Нативный, по существу, мономерный и биологически активный Tat эффективно поглощается зависимым от дозы и от времени образом макрофагами, но не моноцитами, как иллюстрируется на фиг. 5 А, 5 В и 5 С. Фиг. 6. Схематическое представление Tat-белка ВИЧ-1, его функциональных доменов и последовательностей используемых Tat-пептидов, как иллюстрируется на фиг. 6 А, 6 В и. 6 С. Фиг. 7. На поглощение нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat различным образом действуют Tat-пептиды, несущие RGD- или щелочной район, как иллюстрируется на фиг. 7 А, 7 В, 7 С и 7D. Фиг. 8. Родаминированный Tat поглощается зависимым от дозы образом активированными цитокинами эндотелиальными клетками, но не неактивированными клетками, как иллюстрируется на фиг. 8 А,8 В, 8 С и 8D. Фиг. 9. Временной ход поглощения 100 нг/мл родаминированного Tat активированными цитокинами эндотелиальными клетками, как иллюстрируется на фиг. 9 А, 9 В, 9 С и 9D. Фиг. 10. Временной ход поглощения 1 мкг/мл родаминированного Tat активированными цитокинами эндотелиальными клетками, как иллюстрируется на фиг. 10 А, 10 В, 10 С и 10D. Фиг. 11. Анализ реакции на дозу (доза-ответ) поглощения нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat активированными цитокинами эндотелиальными клетками в сравнении с неактивированными клетками. Фиг. 12. Анализ зависимости от дозы и временного хода поглощения нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat активированными цитокинами эндотелиальными клетками. Фиг. 13. Ингибирование поглощения 10 нг/мл родаминированного Tat активированными цитокинами эндотелиальными клетками немеченым Tat-белком, как иллюстрируется на фиг. 13 А, 13 В и 13 С. Фиг. 14. Ингибирование поглощения 10 нг/мл родаминированного Tat активированными цитокинами эндотелиальными клетками антителами к интегриновым рецепторам 51 и v3, как иллюстрируется на фиг. 14 А, 14 В, 14 С, 14D и 14 Е.-7 006850 Фиг. 15. Ингибирование поглощения 100 нг/мл родаминированного Tat активированными цитокинами эндотелиальными клетками антителами к рецепторам-интегринам 51 и v3, как иллюстрируется на фиг. 15 А, 15 В, 15 С, 15D и 15 Е. Фиг. 16. Поглощение 1 мкг/мл родаминированного Tat частично ингибируется анти-51-v3 антителами при инкубировании клеток с Tat в течение 15 мин, как иллюстрируется на фиг. 16 А, 16 В, 16 С и 16D. Фиг. 17. Поглощение 1 мкг/мл родаминированного Tat не ингибируется антителами против интегрина при инкубировании клеток с Tat в течение 60 мин, как иллюстрируется на фиг. 17 А, 17 В и 17 С. Фиг. 18. Нативный, по существу мономерный и биологически активный Tat усиливает продуцирование цитокинов IL-12 и TNF- и -хемокинов MIP-1, MIP-1 и RANTES клетками MDDC, как иллюстрируется на фиг. 18 А, 18 В, 18 С и 18D. Фиг. 19. Нативный, по существу мономерный и биологически активный Tat усиливает представление аллогенного антигена клетками MDDC. Фиг. 20. Нативный, по существу мономерный и биологически активный Tat усиливает увеличивает специфическое для столбнячного токсоида (ТТ) представление клетками MDDC праймированным PBL,усиливая специфические Т-клеточные реакции, как иллюстрируется на фиг. 20 А, 20 В и 20 С. Фиг. 21. Схема протокола вакцинации с праймированием-бустингом для оценки роли в качестве адъюванта нативного, по существу мономерного и биологически активного Tat. Фиг. 22. Вакцинация мышей Gag и Tat индуцирует более высокую реакцию в виде продуцирования антител против Gag в сравнении с мышами, вакцинированными только gag. Фиг. 23. Вакцинация мышей Gag и Tat индуцирует более высокую анти-Gag-цитолитическую активность в сравнении с мышами, вакцинированными только gag. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения В соответствии с WO 99/27958 биологически активный Tat ВИЧ-1 определяется как белок, способный 1) входить в ядра активированных эндотелиальных клеток или дендритных клеток (ДК) и локализоваться в них, 2) активировать пролиферацию, миграцию и инвазию клеток KS (саркомы Капоши) и активированных цитокином эндотелиальных клеток, 3) активировать репликацию вируса при добавлении к инфицированным клеткам, как измерено а) спасением Tat-дефектных провирусов в клетках HLM-1 после добавления экзогенного белка и b) трансактивацией экспрессии генов ВИЧ-1 в клетках, трансфицированных промотор-репортерной плазмидой ВИЧ-1, и 4) индуцировать в мышах развитие KS-подобных повреждений в присутствии ангиогенных факторов или воспалительных цитокинов. Термин нативный, используемый здесь, специфически идентифицирует Tat в его нативной, т.е. неденатурированной конформации и относится к выделенному белку Tat, полученному общепринятыми способами рекомбинантных ДНК, очищенному при неденатурирующих условиях способами, которые используют преимущество способности Tat связывать гепарин (известными в предыдущем уровне техники и широко обсуждаемыми в этом описании). Термин по существу мономерный, используемый здесь, относится к тому факту, что Tat-белок,полученный, как описано выше, находится главным образом (95%) в мономерной, в противоположность агрегированной, форме, как определено ВЖХ-анализом. Термин биологически активный, используемый здесь, относится к Tat-белку, полученному, как описано выше, который способен 1) входить в ядра активированных эндотелиальных клеток или дендритных клеток при концентрациях до 10 нМ и 2) выполнять по меньшей мере одно из следующих действий: (i) активировать пролиферацию, миграцию и инвазию клеток KS (саркомы Капоши) и активированных цитокинами эндотелиальных клеток, (ii) активировать репликацию вируса при добавлении к инфицированным клеткам, как измерено а) спасением Tat-дефектных провирусов в клетках HLM-1 после добавления экзогенного белка и b) трансактивацией экспрессии генов ВИЧ-1 в клетках, трансфицированных промотор-репортерной плазмидой ВИЧ-1, и (iii) индуцировать в мышах развитие KS-подобных повреждений в присутствии ангиогенных факторов или воспалительных цитокинов. Термин созревание ДК, используемый здесь, относится к процессу, приводящему к прогрессирующему уменьшению пино/фагоцитарной активности ДК и поглощения антигена и к сопутствующему усилению способности ДК процессировать и представлять антигены, причем такой процесс ассоциирован с экспрессией маркеров созревания ДК [(HLA)-ABC, HLA-DR, CD40, CD80, CD86 и CD83] и продуцированием цитокинов и хемокинов (IL-12 и TNF-, RANTES, MIP-1, MIP-1). Термин активация антигенпредставляющих клеток относится к индукции или увеличению способности поглощения, процессинга и/или представления антигенов, приводящей к усилению праймирования и бустинга иммунных реакций, причем такой процесс ассоциирован с экспрессией костимуляторных молекул [(HLA)-ABC, HLA-DR, CD40, CD80, CD86 и CD83, ICAM-1] и продуцированием цитокинов и хемокинов (IL-12 и TNF-, RANTES, MIP-1, MIP-1). Термин адъювант, используемый здесь, относится к любому веществу, которое при введении в хозяина вместе с антигеном усиливает иммунные реакции против этого антигена с использованием нескольких механизмов, в том числе, например, индукцией созревания ДК и/или активацией АПК, как опи-8 006850 сано выше. На основании новых данных, вкратце описанных ниже, которые рассматриваются как новые и неожиданные в сравнении с предыдущим уровнем техники, авторы данного изобретения заявляют применение биологически активного Tat, его фрагментов или производных, в качестве системы, которая,вследствие ее природных и взаимосвязанных новых свойств может представлять по меньшей мере один или оба из следующих свойств: система доставки и адъювант. Если Tat-белок окисляется и/или инактивируется, он является непригодным для целей данного изобретения. В самом деле, только биологически активный, но не окисленный или инактивированный, Tatбелок поглощается очень эффективно, быстро и селективно клетками MDDC, макрофагами и активированными цитокинами эндотелиальными клетками зависимым от дозы, от времени и от созревания/дифференцировки образом. Поглощение Tat происходит по меньшей мере двумя путями в зависимости от концентрации этого белка. При пикомолярных-наномолярных концентрациях Tat (0,01-1000 нг/мл) поглощение Tat обычно опосредовано рецепторами 51 и v3 через взаимодействие с RGDпоследовательностью этого белка, тогда как при более высоких концентрациях Tat преимущественным является интегрин-независимый путь, опосредуемый связыванием щелочного района Tat с HSPG. Эффективное поглощение Tat наблюдается только этими АПК, а не ТСВ, BLCL, моноцитами или неактивированными эндотелиальными клетками. После поглощения Tat индуцирует созревание и активациюMDDC, в том числе увеличение экспрессии МНС и костимуляторных молекул, и продуцирование Th-1 цитокинов (TNF-, IL-12) и -хемокинов [Rantes, воспалительного белка макрофагов (MIP)-1, MIP-1]. Все эти эффекты утрачиваются при окислении и инактивации Tat. Кроме того, активный Tat, но не его окисленная копия, усиливает как аллогенное, так и антиген-специфическое представление клеткамиMDDC, увеличивая специфические для Т-клеток иммунные реакции против гетерологичных антигенов. Таким образом, благодаря его способности нацеливаться на специфические антигенпредставляющие клетки и эффективно входить в них для усиления их функций и запуска Th-1-специфических иммунных реакций, активный Tat способствует его собственному представлению и представлению других антигенов и индукции специфических иммунных реакций и может также быть использован для селективной доставки активных молекул к этим клеткам. На основании этих новых данных и на основании способности Tat выполнять активности, указанные далее как (i)-(vi), авторы данного изобретения заявляют, что активный Tat функционирует в качестве системы доставки, способной селективно доставлять к антигенпредставляющим клеткам, в том числе дендритным клеткам, эндотелиальным клеткам и макрофагам, антигены или другие активные молекулы,и в качестве адъюванта, способного индуцировать Th-1-иммунные реакции против антигенов специфическим нацеливанием на наиболее эффективные антигенпредставляющие клетки и запуском специфических иммунных реакций. Таким образом, биологически активный Tat может быть использован не только в качестве антигена, но также в качестве адъюванта Th-1-типа для других антигенов для индукции иммунных реакций против патогенов или опухолей и в качестве системы доставки для ДК, макрофагов и активированных эндотелиальных клеток для терапевтического вмешательства против инфекций, ангиогенеза, воспалительных заболеваний и опухолей. Согласно данному изобретению, Tat применяют в качестве системы доставки для селективной доставки антигенов и других активных молекул к специфическим антигенпредставляющим клеткам, в том числе ДК, макрофагам и активированным цитокином эндотелиальным клеткам для индукции иммунных реакций на антигены, для содействия иммунным реакциям на антигены для профилактической или терапевтической вакцинации или лечения инфекционных заболеваний, воспалительных и ангиогенных заболеваний и опухолей. Для облегчения представления эти несколько аспектов данного изобретения будут описаны раздельно следующим образом. Сначала автор изобретения нашел, что MDDC (происходящие из моноцитов ДК) имеют специфическую способность поглощать очень эффективно растворимый активный Tat при пикомолярныхнаномолярных концентрациях и обнаружил, что это поглощение является очень быстрым процессом с максимумом после 5-10 мин, в зависимости от концентрации Tat, предоставляемой клеткам. В противоположность этому, поглощение активного Tat TCB (Т-лимфобластами) или BLCL (Влимфобластоидными клеточными линиями) является очень слабым, требуя микромолярных концентраций Tat (10 мкг/мл) и гораздо более продолжительных периодов времени инкубации, и даже при этих условиях большая часть Tat оставалась связанной с клеточной поверхностью и не входила в клетки. Далее, активный Tat также быстро процессируется MDDC, как показано уменьшением внутриклеточного окрашивания после 30 мин инкубации. Зрелые MDDC способны поглощать Tat в 10-100 раз более эффективно, чем незрелые клетки, как показано величинами внутриклеточного окрашивания, наблюдаемого с низкими концентрациями Tat(100 нг/мл), в сравнении с величинами, наблюдаемыми с 1 или 10 мкг/мл Tat, с незрелыми клетками. Кроме того, поглощение Tat требует нативной конформации и полной биологической активности этого белка. Действительно, окисление и инактивация Tat подверганием действию света и воздуха уничтожает или заметно снижает (приблизительно в 100 раз) поглощение, наблюдаемое с активным Tat клеткамиMDDC. Интересно, что тип поглощения MDDC, наблюдаемый с окисленным Tat, является сходным или идентичным с поглощением нативного Tat TCB и BLCL. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что Tat нацелен на MDDC и что селективное и эффективное поглощение Tat клетками MDDC не опосредовано высокой пино/фагоцитарной активностью этих клеток, а требует специализированных путей поглощения, которые селективно представлены незрелыми MDDC и при более высоких уровнях Tat зрелыми MDDC. Кроме того, различное поглощение, наблюдаемое при низких концентрациях в сравнении с высокими концентрациями Tat с клеткамиMDDC, указывает на присутствие по меньшей мере 2 различных путей, причем первый путь осуществляется очень эффективно при пикомолярных-наномолярных концентрациях Tat, а другой при более высоких (микромолярных) концентрациях Tat. Действительно, автор изобретения нашел, что поглощение низких концентраций Tat опосредовано связыванием специфических интегринов (51, v3) с RGDрайоном Tat посредством опосредованного рецептором пути интернализации, тогда как при более высоких концентрациях поглощение опосредовано связыванием щелочного района Tat гепарансульфатпротеогликанами (HSPG). Моноциты являются неэфективными в поглощении Tat, тогда как макрофаги поглощают Tat более эффективно с кинетикой дозы и времени, более близкой к кинетике ДК, что свидетельствует о том, что дифференцировка моноцитов до ДК или макрофагов индуцирует селективные и эффективные механизмы поглощения Tat. Подобным образом, автор данного изобретения нашел, что эндотелиальные клетки, активированные IFN, IL- и TNF-, но не неактивированные клетки, связывают и поглощают нативный Tat очень эффективно и сходно с MDDC. Поглощение Tat активированными эндотелиальными клетками также осуществляется через RGD-домен Tat, который связывает интегрины 51 и v3 [классические рецепторы для витронектина (VN) и фибронектина (FN)], а при высоких концентрациях Tat через щелочной район Tat, который связывает HSPG клеточной поверхности и внеклеточного матрикса. Также для эндотелиальных клеток, антагонисты интегринов блокируют поглощение пикомолярных/наномолярных концентраций, но не более высоких концентраций Tat. Подобным образом, поглощение пикомолярных/наномолярных концентраций Tat ингибируется Tat-пептидом, содержащим RGD-последовательность, тогда как поглощение более высоких концентраций Tat ингибируется пептидом, включающим в себя щелочной район этого белка. Таким образом, существуют по меньшей мере два пути поглощения Tat: первый представляет собой путь поглощения через связывание RGD-района с интегринами, который использует пико/наномолярными концентрации активного Tat и блокируется конкурентами интегринов, тогда как второй путь поглощения является путем относительно более низкой аффинности, не блокируется антагонистами интегринов, становится преимущественным только в том случае, когда концентрации экзогенногоTat являются высокими и/или время инкубации клеток с Tat является пролонгированным, блокируется щелочным пептидом Tat и осуществляется со всеми типами клеток. Этот второй путь может быть идентичным рецептор-независимому пути, наблюдаемому ранее (Allen 2000; Barillari 1999b), через связывание с сайтом низкой аффинности, например, взаимодействие щелочного района Tat с HSPG клеточной поверхности. Таким образом, RGD-район селективно нацеливается на клетки, экспрессирующие RGDсвязывающие интегриновые рецепторы, такие как ДК, эндотелиальные клетки и макрофаги. Далее активный Tat очень эффективно поглощается через этот специализированный путь. Под этим специализированным путем автор изобретения подразумевает путь, который требует 1) по меньшей мере одного (RGD) или двух доменов Tat (щелочного и RGD), 2) биологической активности этого белка, 3) нативной конформации этого белка, по существу в мономерной форме и 4) мембранных интегриновых рецепторов. В противоположность этому, небольшое поглощение или отсутствие поглощения наблюдается с ТСВ, BLCL и моноцитами или неактивированными эндотелиальными клетками,что указывает на то, что Tat может нацеливать и селективно доставлять антигены или карго (груз) к специфическим типам клеток, которые являются ключевыми для иммунной реакции против патогенов и опухолей, или лечить воспалительные и ангиогенные заболевания или опухоли. Автор данного изобретения подчеркивает, что биологически активный Tat, но не окисленный Tat,после связывания со специфическими интегриновыми рецепторами, входит в ДК, эндотелиальные клетки и макрофаги и, что даже более важно, способствует созреванию и функционированию происходящих из моноцитов ДК (MDDC). Фактически активный Tat индуцирует зависимое от дозы усиление экспрессии на поверхности антигенов лейкоцитов человека (HLA)-ABC, HLA-DR, CD40, CD80, CD86 и CD83 наMDDC. Этот эффект наблюдается с нативным, но не с окисленным или инактивированным Tat. Кроме того, активный Tat индуцирует зависимое от дозы увеличение продуцирования как IL-12, так и TNF-,цитокинов, существенных для запуска реакции Th-1-типа (Romagnani 1997), и -хемокинов RANTES,МIP-1 и MIP-1, которые являются ключевыми участниками в эффекторной фазе реакции лимфоцитов(Moser 2001). Важно, что в обоих случаях эти уровни сравнимы с уровнями, индуцируемыми известным активатором LPS. Окисленный и инактивированный Tat и в этом случае не индуцирует эти эффекты. Активный Tat усиливает также антигенпредставляющую функцию MDDC, увеличивая пролиферативную реакцию Т-клеток на аллогенные и воскресшие антигены. В совокупности эти свойства указывают на то, что активный Tat является не только антигеном, но также сильным адъювантом Т-клеток и системой- 10006850 доставки к специфическим клеткам. Автор изобретения считает, что этот признак имеет фундаментальное значение в индукции иммунной реакции специфического типа (Th-1) и в увеличении этой реакции против гетерологичных антигенов. Это объясняет также причины того, почему вакцинация неактивированным Tat индуцирует различные реакции in vivo, которые не являются защитными. Поскольку индукция Th-1-реакций и CTL контролирует инфекции внутриклеточными патогенами, а также рост опухолей,данные, представленные здесь, свидетельствуют о том, что нативный Tat-белок или tat-ДНК могут быть использованы для запуска или увеличения Th-1-иммунных реакций и активности CTL также и против других антигенов ВИЧ или антигенов не ВИЧ для поддержания эффективного и долгосрочного иммунитета для профилактической или терапевтическиой вакцинации, а также для селективной доставки активных молекул к ДК, активированным эндотелиальным клеткам и макрофагам для лечения инфекционных заболеваний, воспалительных и ангиогенных заболеваний или опухолей. Действительно, активированные эндотелиальные клетки, а также макрофаги и ДК присутствуют в воспалительных и ангиопролиферативных заболеваниях, опухолях и инфекционных заболеваниях, представляя специфическую мишень для Tat, который может селективно доставлять к ним антигены, ингибиторные соединения или любую молекулу, полезную для профилактической или терапевтической вакцинации или для лечения или для диагностических целей. Таким образом, согласно автору изобретения, биологически активный Tat ВИЧ-1, его производные или фрагменты, комбинированные с другими молекулами, в том числе белками, пептидами, нуклеиновыми кислотами или частицами-носителями, могут быть использованы:для селективной доставки in vitro и in vivo антигенов или активных соединений к антигенпредставляющим клеткам, экспрессирующим интегрины 51 и v3, в том числе ДК, эндотелиальным клеткам и макрофагам, для индукции иммунных реакций для профилактической и терапевтической вакцинации или лечения инфекционных заболеваний, воспалительных и ангиогенных заболеваний и опухолей.в качестве адъюванта для активации или для усиления in vitro и in vivo антигенпредставляющей функции клеток, экспрессирующих интегрины 51 и v3, в том числе ДК, эндотелиальных клеток и макрофагов, и для индукции иммунных реакций Th-1-типа против ВИЧ/СПИДа, других инфекционных заболеваний и опухолей. Согласно данному изобретению, Tat-белок ВИЧ-1 в его биологически активной форме имеет следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:2): и Tat-белок ВИЧ-2 в его биологически активной форме имеет следующую аминокислотную последовательность, в которую была встроена RGD-последовательность, например, но не только, в положении между аминокислотой 92 и аминокислотой 93 исходной последовательности (SEQ ID NO:100): и любой другой вариант Tat любого подтипа ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с гомологией последовательности, большей, чем 50%, относительно SEQ ID NO:2, 100 или 102; предпочтительно большей, чем 60%, более предпочтительно большей, чем 70%, еще более предпочтительно большей, чем 80%, более предпочтительно большей, чем 90%, и по существу в мономерной форме, способен удовлетворять при пикомолярных-наномолярных концентрациях (от 0,01 нг/мл до 1 мкг/мл, предпочтительно 0,1 нг/мл - 100 нг/мл) по меньшей мере одному из следующих критериев:(i) способности селективно и эффективно поглощаться антигенпредставляющими клетками, в том числе ДК, эндотелиальными клетками и макрофагами при пикомолярных-наномолярных концентрациях(0,01-1000 нг/мл) и в пределах 5-10 мин экспонирования этим клеткам.(ii) способности способствовать миграции (рекрутингу), инвазии и росту активированных цитокином эндотелиальных клеток при пикомолярных-наномолярных концентрациях.(iii) способности трансактивировать экспрессию генов ВИЧ или спасать Tat-дефектные провирусы ВИЧ при наномолярных концентрациях.(iv) способности активировать созревание и антигенпредставляющую функцию ДК.(v) способности увеличивать опосредованные Т-клетками иммунные реакции, в том числе Тхелперную и/или цитотоксическую активность против самого себя или гетерологичных антигенов после(vi) способности увеличивать опосредованные Т-клетками иммунные реакции, в том числе Тхелперную и/или цитотоксическую активность против самого себя или гетерологичных антигенов посредством добавления к эффекторным клеткам. Предпочтительно, должны удовлетворяться критерии (i) или (ii), предпочтительно оба, более предпочтительно критерий (i) или (ii) или оба в комбинации с критерием (iii) а) и/или должен удовлетворяться критерий (III) b). Наилучшие результаты будут получены при удовлетворении всем критериям (i)-(vi). Согласно данному изобретению, tat-ДНК ВИЧ-1 имеет следующую нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:1): и tat-ДНК ВИЧ-2 имеет следующую нуклеотидную последовательность, в которой вставлена последовательность, кодирующая RGD, например, но не только, между нуклеотидами 276 и 277 исходной последовательности (SEQ ID NO:99): или последовательность АСС в положении 322-324, кодирующая треонин была делетирована (SEQ ID и любой другой вариант любого типа и подтипа ВИЧ с гомологией последовательности, большей, чем 40%, относительно SEQ ID NO:1, 99 или 101; предпочтительно большей, чем 50%, предпочтительно большей, чем 60%, более предпочтительно большей, чем 70%, еще более предпочтительно большей, чем 80%, более предпочтительно большей, чем 90%. Согласно данному изобретению, фрагменты биологически активного Tat определяются как Tatпептиды, которые соответствуют этой последовательности ДНК, из любого варианта ВИЧ (ВИЧ-1, ВИЧ 2 и других типов и подтипов), содержат только RGD-домен или RGD-домен вместе с цистеин-богатым доменом и/или щелочным доменом и/или другими Tat-пептидами ВИЧ-1, в том числе доменом центральной части и/или амино-концевым районом, где RGD-домен соответствует последовательности, кодирующей аминокислоты (аа) 73-86 в HTLV-IIIB, клоне ВН-10, в качестве ссылки, SEQ ID NO:3 и соответствующей аминокислотной последовательности, в качестве ссылки, SEQ ID NO:4; последовательности, кодирующей аминокислоты 74-84, SEQ ID NO:5 и соответствующей аминокислотной последовательности, в качестве ссылки, SEQ ID NO:6; последовательности, кодирующей аминокислоты 75-83, SEQID NO:12; последовательности, кодирующей аминокислоты 77-82, SEQ ID NO:13 и соответствующей аминокислотной последовательности, в качестве ссылки, SEQ ID NO:14; последовательности, кодирующей аминокислоты 77-83, SEQ ID NO: 15 и соответствующей аминокислотной последовательности, в качестве ссылки, SEQ ID NO:16; последовательности, кодирующей аминокислоты 76-83, SEQ ID NO:17 и соответствующей аминокислотной последовательности, в качестве ссылки, SEQ ID NO:18; цистеинбогатый домен соответствует последовательности, кодирующей аминокислоты 22-37 в HTLV-IIIB, клоне ВН-10, в качестве ссылки, SEQ ID NO:19 и соответствующей аминокислотной последовательности, в качестве ссылки, SEQ ID NO:20; щелочной домен соответствует последовательности, кодирующей аминокислоты 48-61 в HTLV-IIIB, клоне ВН-10, в качестве ссылки, SEQ ID NO:21 и соответствующей аминокислотной последовательности, в качестве ссылки, SEQ ID NO:22, домен центральной части соответствует последовательности, кодирующей аминокислоты 38-47 в HTLV-IIIB, клоне ВН-10, в качестве ссылки, SEQ ID NO:23 и соответствующей аминокислотной последовательности, в качестве ссылки, SEQ Т-клеточные эпитопы, согласно данному изобретению, являются предпочтительно следующими, в их нуклеотидной и соответствующей аминокислотной последовательностях (HTLV-IIIB, клона ВН-10 или 89.6, в качестве ссылки): Эпитоп 1 (aa1-20): Согласно данному изобретению, производные Tat включают в себя мутанты Tat варианта HTLVIIIB, клона ВН-10, выбранные из мутантов, имеющих следующие нуклеотидные последовательности: Нуклеотидная последовательность мутанта cys22 (SEQ ID NO:95): Аминокислотная последовательность мутанта cys22 (SEQ ID NO:96): Нуклеотидная последовательность мутанта lys41 (SEQ ID NO:97): Аминокислотная последовательность мутанта lys41 (SEQ ID NO:98): В данном изобретении рассматриваются: ДНК-последовательности, имеющие гомологию по меньшей мере 60% с ДНКпоследовательностями, описанными выше, предпочтительно с гомологией по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%; аминокислотные последовательности, имеющие гомологию по меньшей мере 40% с аминокислотными последовательностями, описанными выше, предпочтительно с гомологией по меньшей мере 50%,предпочтительно с гомологией по меньшей мере 60%, предпочтительно с гомологией по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%. Согласно данному изобретению, инфекционные заболевания включают в себя заболевания, вызываемые герпесвирусами человека или животного, вирусами гепатита, Mycobacterium tuberculosis, Malaria plasmodia, Candida, Lysteria, вирусом гриппа, и другие инфекции, вызываемые в людях и животных другими внутриклеточными или внеклеточными патогенами, в том числе, но не только, инфекционные заболевания половой системы, эндокардит, инфекции мочевых путей, остеомиелит, кожные инфекции,или стрептококковые и стафилококковые инфекции, пневмококковые инфекции, столбняк, менингококковые инфекции, туберкулз, малярию, кандидоз, инфекции Helicobacter, сальмонеллы, сифилис, герпетические инфекции (в том числе ветряную оспу, мононуклеоз и вызываемые вирусом Эпштейна-Барра инфекции, инфекцию герпесвируса-8 человека, цитомегаловирус, герпес на губах и генитальных органов), инфекцию вирусом гепатита (А, В, С, D, G), вызываемые папилломавирусом инфекции, грипп, листериоз, инфекцию холерным вибрионом. Согласно данному изобретению, воспалительные заболевания определяются как аллергия или воспаление, связанные или не связанные с вирусной, бактериальной или паразитарной инфекцией, в том числе, но не только, иммуноопосредованные кожные болезни, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, системный склероз, дерматомиозит, синдром Шегрена, синдром Гудпасчера, васкулит, язвенный ректоколит, тиреоидит, склеродермия, аллергические заболевания. Согласно настоящему изобретению термин ангиогенные заболевания означают ненеопластические ангиопролиферативные заболевания, включающие диабетическую ретинопатию, ретролентальную фиброплазию, трахому, васкулярную глаукому, псориаз, иммунное воспаление, неиммунное воспаление,атеросклероз, избыточную репарацию раны, ангиодерматит, ангиодисплазию ободочной клетки, ангиодему и ангиофиброму. Согласно данному изобретению, опухоли определяются как доброкачественные и злокачественные опухоли, в том числе опухоли мягких тканей, костей, хрящей и крови, такие как, но не только, саркома Капоши и другие неоплазии кожи, легкого, молочной железы, желудка, печени, поджелудочной железы, эндокринной системы, матки, яичника, саркомы, острый и хронический лейкоз и неоплазия лимфатических клеток. Согласно данному изобретению, терапевтические соединения обозначают другие антигены (бел- 18006850 ки, пептиды или ДНК) или активные молекулы. Согласно данному изобретению, частицы-носители обозначают, но не только, микрочастицы, наночастицы, липосомы и другие состоящие из частиц системы доставки. Согласно данному изобретению, антигены не-ВИЧ или другие антигены включают в себя любую молекулу или часть молекулы, узнаваемые иммунными клетками, за исключением ВИЧ-антигенов Tat,Rev, Nef, Gag ВИЧ-l.Tat в соответствии с данным изобретением может быть использован для лечения: инфекционных заболеваний, воспалительных заболеваний, ангиогенных заболеваний и опухолей. Комбинации Tat, описанные выше, могут быть смешаны с адъювантами, разбавителями, эксципиентами, носителями и другими веществами, известными в данной области, для приготовления лекарственного средства для описанных заболеваний. Такие лекарственные средства могут быть приготовлены в форме таблеток, пилюль, спреев, инъекционных растворов, суспензий, порошков, кремов, мазей, для парентерального (подкожного, внутримышечного, интрадермального), мукозного (вагинального, ректального, внутриротового, назального) введения или топического (местного) применения, причем способы введения зависят от вида заболевания и типа готовой лекарственнной формы. Описание фигур Фиг. 1. Биологически активный Tat эффективно и селективно поглощается зависимым от дозы и от времени образом MDDC (происходящими из моноцитов ДК), но не BLCL (В-лимфобластоидными клеточными линиями) или ТСВ (Т-лимфобластами).A) MDDC получали из моноцитов периферической крови 14 различных здоровых доноров-людей в соответствии с установленными способами (Fanales Belasio 1997). Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли разделением в градиенте плотности (Ficoll-Paque Research Grade, PharmaciaBiotech, Uppsala, Sweden). Моноциты дополнительно очищали инкубированием с покрытыми aнти-CD14 микрогранулами (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) с последующим сортингом с использованием магнитного устройства (MiniMacs Separation Unit, Miltenyi) в соответствии с инструкциями изготовителя. Чистота моноцитов всегда была 95%, как оценено проточной цитометрией (FACScan, BectonDickinson, S. Jose, CA). Моноциты индуцировали для дифференцировки до ДК (MDDC) культивированием в течение 6 дней в полной среде в присутствии GM-CSF (200 нг/мл) (Leucomax, Novartis, Origgio,Italy) и IL-4 (100 нг/мл) (Peprotech, London, UK). Дифференцировку до ДК оценивали морфологическим наблюдением и детектированием специфических маркеров поверхности (HLA-DR, CD86, CD83, CD40,CD80) с использованием проточной цитометрии. Затем MDDC культивировали при плотности 2x105 на мл в полной среде в присутствии серийных концентраций (0,1-10000 нг/мл) активного Tat ВИЧ-1 или только с буфером для восстановления или только со средой (отрицательные контроли) в течение 5, 10, 30 или 60 мин при 37 С в темноте. Tat-белок экспрессировали в Е. coli и очищали, как описано ранее (Ensoli 1993; Chang 1997; Ensoli 1994), и тестировали перед использованием при помощи анализов роста клеток и HIV-LTR-трансактивации, как описано (Ensoli 1993; Chang 1997; Ensoli 1994). Tat-белок ресуспендировали в дегазированном забуференном фосфатом солевом растворе, 0,1% бычьем сывороточном альбумине (ЗФР-БСА). Предпринимали меры для предотвращения окисления и потери активности Tat, как описано в другом месте (Ensoli 1993; Chang 1997; Ensoli 1994). Затем клетки промывали холодной средой и обрабатывали в течение 10 мин при 37 С смесью трипсин-ЭДТА (Life Technologies, Paisley, UK) для удаления любого наружно связанного белка. После фиксации и обработки для усиления проницаемостиMDDC окрашивали аффинно очищенными кроличьими поликлональными анти-Tat IgG-антителами (Ensoli 1993; Chang 1997; Ensoli 1994) или кроличьими контрольными IgG-антителами (ICN Biomedicals,Opera, Italy), а затем FITC-конъюгированным антителом против кроличьего Ig (Pierce, Rockford, IL). Флуоресценцию анализировали проточной цитометрией и результаты выражали в виде процента положительных клеток в сравнении с окрашенными на изотип образцами. Для демонстрации специфической локализации внутри цитоплазмы этого белка окрашивание анти-Таt-антителами всегда выполняли также с не обработанными для увеличения проницаемости MDDC. Процент положительных клеток (в сравнении с окрашенными на изотип образцами) приведен внутри блоков (прямоугольников). Показанные данные являются данными от одного реперезентативного донора из 14 тестированных, у которого уровни поглощения Tat были наиболее близкими к медиане величин, наблюдаемых у всех тестированных доноров как при 10 мин (49, 52, 49, 70, 94, 98% положительных клеток для 0,1, 1, 10, 100, 1000 и 10000 нг/мл),так и при 30 мин (49, 45, 54, 65, 95, 98% положительных клеток для 0,1, 1, 10, 100, 1000 и 10000 нг/мл),соответственно.B) MDDC инкубировали с активным Tat-белком (10-1000 нг/мл) в течение 10 или 30 мин, как указано выше, и как обработанные для увеличения проницаемости, так и не обработанные для увеличения проницаемости клетки анализировали при помощи FACS для демонстрации специфического поглощенияC) BLCL (кружки) получали культивированием РВМС человека от 2 здоровых доноров в течение 2 ч в присутствии супернатантов из продуцента вируса Эпштейна-Барр линии клеток игрунок В 95-8 и дополнительным размножением в течение по меньшей мере 4 недель, как описано ранее (Micheletti 1999). ТСВ (треугольники) получали стимуляцией РВМС человека от 4 здоровых доноров фитогемагглютини- 19006850 ном (ФГА) 1 мкг/мл (Murex Diagnostics, Chatillon, France) в течение 3 дней и дополнительного размножения в течение 2 недель в полной среде, дополненной rIL-2 10 МЕ/мл (Becton Dickinson, Labware, Bedford,MA), как описано ранее (Micheletti 1999). BLCL и ТСВ культивировали при 5 х 105 на мл в полной среде в присутствии активного Tat при концентрациях в диапазоне от 100 до 10000 нг/мл, только с буфером для восстановления или только со средой в течение 30 или 60 мин при 37 С в темноте и окрашивали для детектирования внутриклеточного Tat, как сообщалось выше. Данные сравнивали с данными MDDC (квадраты), культивируемыми в течение таких же периодов времени и с теми же дозами белка, и выбирали в качестве репрезентативного примера потому, что уровни поглощения Tat с этим донором были очень близкими к медиане из 11 различных тестированных доноров (54%, диапазон 17-91%, 65%, диапазон 2791% и 95%, диапазон 83-99%, положительных клеток, при 10, 100 и 1000 нг/мл Tat, после 30 мин культивирования, соответственно). Фиг. 2. Поглощение биологически активного Tat клетками MDDC увеличивается с созреванием клеток и элиминируется окислением/инактивацией этого белка.A) MDDC индуцировали или не индуцировали к созреванию при помощи LPS в течение 18 ч и затем инкубировали в течение 10 и 30 мин в присутствии активного белка Tat (1-1000 нг/мл), как сообщалось выше. Показанные данные является данными от донора, который имел более низкие уровни поглощения, чем величины медианы всех тестированных доноров, и были выбраны потому, что они хорошо иллюстрируют увеличение поглощения Tat, индуцируемое созреванием клеток.B) MDDC инкубировали в течение 10 мин в присутствии активного или оксиленного (экспонированием свету и воздуху в течение 18 ч) Tat-белка (10-1000 нг/мл) и обрабатывали, как сообщалось выше. Биологическая активность нативного Tat в сравнении с окисленным Tat, используемым в этих экспериментах, приведена в табл. I. Фиг. 3. Анти-51 - и анти-v3-антитела блокируют поглощение активного Tat клетками MDDC.(ФТС)] в присутствии моноклональных антител, направленных против интегринов 51 и v3 (10 нг/мл, Chemicon, Temecula, CA), по отдельности или в комбинации, в течение 2 ч при 4 С. Затем добавляли активный Tat-белок в дозах в диапазоне от 0,1 до 1000 нг/мл и выдерживали в течение 10 мин при 37 С в темноте. После промывания холодной полной средой клетки прецессировали и окрашивали, как описано на фиг. 1. Приведены данные для репрезентативного донора из трех.A) проточный цитометрический анализ MDDC, окрашенных aнти-Tat-антителами. Процент положительных клеток (в сравнении с окрашенными на изотип образцами) приведен в блоках (прямоугольниках). Поглощение Tat детектируется при всех дозах белка (до 99% при 1000 нг/мл), тогда как оно ингибируется прединкубацией этих клеток с анти-51 - или анти-v3-антителами. Присутствие обоих антител полностью элиминирует поглощение пикомолярных концентраций Tat и в сильной степени уменьшает его вплоть до наивысшей испытанной дозы (21%).B) Те же самые данные, представленные в виде графика по точкам, для лучшего понимания ингибирующих действий антител к интегринам 51 или v3 на поглощение Tat MDDC. Фиг. 4. Фибронектин и витронектин блокируют поглощение активного Tat клетками MDDC.MDDC инкубировали (5x105 на мл) в полной среде (RPMI 1640-15% ФТС) в присутствии полученных из плазмы человека FN или VN (25 нг/мл, Sigma-Aldrich, Stenheim, Germany), в течение 2 ч при 4 С. Затем добавляли Tat-белок при дозах в диапазоне от 10 до 1000 нг/мл и выдерживали в течение 10 мин при 37 С в темноте. После промывания холодной полной средой клетки обрабатывали и окрашивали, как описано на фиг. 1. Приведены данные для репрезентативного донора из трех.A) Проточный цитометрический анализ MDDC, окрашенных aнти-Tat-антителами. Процент положительных клеток (в сравнении с окрашенными на изотип образцами) приведен в блоках (прямоугольниках). Поглощение Tat детектируется при всех дозах белка (до 99% при 1000 нг/мл). При прединкубации клеток с FN или VN поглощение в сильной степени уменьшается и полностью элиминируется при самых низких дозах Tat (1 и 2%, соответственно, при 10 нг/мл).B) Те же самые данные, представленные в виде графика по точкам, для лучшего понимания ингибирующих действий FN и VN на поглощение Tat MDDC. Фиг. 5. Активный Tat эффективно поглощается зависимым от дозы и от времени образом макрофагами, но не моноцитами. А) Моноциты периферической крови, обогащенные из РВМС, после 2 ч прикрепления на лунках пластикового планшета, инкубировали с Tat при дозах в диапазоне от 0,1 до 10000 нг/мл в течение 60 мин при 37 С в темноте и обрабатывали и окрашивали, как описано для MDDC на фиг. 1.B) Показан проточный цитометрический анализ клеток, окрашенных анти-Tat-антителами. Процент положительных клеток (в сравнении с окрашенными на изотип пробами) приведен в блоках (прямоугольниках). Значимое поглощение Tat детектируется только при самых высоких дозах (45 и 67% при 1000 и 10000 нг/мл, соответственно) с некоторыми уровнями белка, прикрепленного к клеточной поверхности (19 и 33% при 1000 и 10000 нг/мл на не обработанных для увеличения проницаемости клетках,соответственно).B) Шестидневные полученные из моноцитов макрофаги (MDM) инкубировали с Tat при дозах в диапазоне от 0,1 до 10000 нг/мл в течение 60 мин при 37 С в темноте и процессировали и окрашивали,как описано для MDDC на фиг. 1. Поглощение Tat детектируется в диапазоне от 10 до 10000 нг/мл с долей положительных клеток в диапазоне от 32 до 72%, соответственно. Однако при наивысшей дозе(10000 нг/мл) существенное количество Tat-белка локализовано при поверхности клеток, как показано 30% окрашиванием не обработанных для увеличения проницаемости MDM.C) Шестидневные MDDC из того же самого донора инкубировали с Tat при дозах в диапазоне от 0,1 до 1000 нг/мл в течение 10 и 30 мин при 37 С в темноте и процессировали и окрашивали, как описано на фиг. 1. Поглощение Tat детектируется при всех концентрациях белка при уровнях, более высоких, чем уровни из моноцитов и макрофагов из того же самого донора (80 и 73% при дозе 1000 нг/мл после 10 и 30 мин, соответственно), без какого-либо детектируемого связывания с клеточной мембраной. Фиг. 6. Tat-белок ВИЧ-1, его функциональные домены и Tat-пептиды. Схематическое представление Tat-белка ВИЧ-1, обоих природно встречающихся вариантов длиной 86 аминокислот и 102 аминокислоты, с его функциональными доменами (А) и последовательностей (на основании консенсусной последовательности В) использованных пептидов длиной 15 и 38 аминокислот (показанных в виде 15 меров и 38-меров на панели В и С, соответственно). Фиг. 7. На поглощение Tat различным образом действуют Tat-пептиды, несущие RGD-район или щелочной район.A) MDDC, инкубированные в течение 2 ч при 4 С в присутствии пар 15-мерных Tat-пептидов (определенных на фиг. 6, панель В), охватывающих различные районы этого белка: N-концевой (1-15 плюс 6-20), богатый цистеином (21-35 плюс 26-40), щелочной (46-60 плюс 51-60) или RGDпоследовательность (66-80 плюс 71-85), перед добавлением Tat (0,1 - 1000 нг/мл) в течение 30 мин при 37 С.B) и С) MDDC предобрабатывали 15-мерными Tat-пептидами 46-60 и 66-80 отдельно или в комбинации при дозах в диапазоне от 400 до 50000 нг/мл перед добавлением Tat при 10 (В) или 1000 нг/мл (С) в течение 10 мин при 37 С.D) MDDC инкубировали в течение 2 ч при 4 С в присутствии 38/46-мерных Tat-пептидов (1-38, 2158, 47-86, 57-102), охватывающих различные районы этого белка (определенные на фиг. 6, панель С),перед добавлением Tat-белка (0,1-1000 нг/мл) в течение 10 мин при 37 С. Затем во всех этих случаях выполняли внутриклеточное окрашивание на Tat, как описано выше. Данные выражены в виде средних значений (и SEM) процентов Tat-положительных клеток из трех разных доноров. Фиг. 8. Родаминированный активный Tat поглощается зависимым от дозы образом активированными цитокинами эндотелиальными клетками. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) активировали культивированием их в течение 5-6 дней в присутствии кондиционированных сред от CD4+ клеток, трансформированных Тлимфотропным вирусом типа II человека (HTLV-II) или стимулированных РНА, как описано ранее (Ensoli 1990; Barillari 1992 b 1993; Fiorelli 1999). Эти кондиционированные среды содержат те же самые воспалительные цитокины (IС), в том числе IL-1, TNF и интерферон(IFN), которые активируют эндотелиальные клетки во время воспаления или процессов репарации. В частности, IL-1, TNF и/или IFN индуцируют в эндотелиальных клетках экспрессию интегриновых рецепторов 51 и v3 (Barillari 1993;Fiorelli 1999). После 5-6 дней культивирования HUVEC суспендировали трипсинизацией, промывали ингибиторами трипсина, высевали на предметные стекла с 8 лунками (Nunc Inc. Naperville, II) при 5x104 клеток на лунку и культивировали в среде RPMI (Life Technologies, Eragny, France), содержащей 15% ФТС, в отсутствие кондиционированных сред в течение 18 ч. После этого периода времени клетки промывали бессывороточной RPMI и затем культивировали при 37 С в СО 2-термостате в течение 15 мин в бессывороточной RPMI, содержащей серийные разведения биологически активного Tat-белка, который был родаминирован по остаткам лизина, по существу как описано (Mann 1991). Вкратце, 50 мкг рекомбинантногоTat (2 мг/мл) доводили до рН 9,0 добавлением 2,5 мкл 1 М Nа 2 СО 3. Затем добавляли 2,5 мкл 1 мг/мл изотиоцианата тетраметилродамина (TRITC, Chemical Co., St. Louis, МО) в диметилсульфоксиде (ДМСО) и реакции давали протекать в течение 8 ч при 4 С. Непрореагировавший TRITC гасили добавлением 2,5 мкл 0,5 М NH4Cl, рН снижали до 7,0 при помощи 1 М НСl и родаминированный Tat диализовали против двух смен 50 нМ Трис-HCl, рН 7,0, 1 мМ дитиотреитола (ДТТ) для удаления погашенного TRITC. БСА или ЗФР, родаминированные таким же образом, использовали в качестве отрицательных контролей. Родаминированный Tat испытывали на активность в отношении роста клеток KS, как описано (Ensoli 1990),для гарантии того, что биологическая активность была сохранена. Буфер для ресуспендирования Tat(ЗФР-0,1% БСА) родаминировали таким же образом и использовали в качестве отрицательного контроля. Затем HUVEC фиксировали охлажденной на льду смесью ацетон-метанол (1:1). Поглощение и внутриклеточное распределение Tat наблюдали и фотографировали с использованием флуоресцентной микроскопии. Результаты оценивали сравнением флуоресценции пробы и отрицательным контролем и выражали в виде оценок от - (отрицательная) до(высоко положительная) для количества поглощения- 21006850 без знания заранее кода проб. Инкубации были с: буфером (ЗФР-0,1% БСА), панель A; Tat 10 нг/мл, панель В; Tat 100 нг/мл, панель С; Tat 1 мкг/мл, панель D. Фиг. 9. Анализ временного хода поглощения 100 нг/мл родаминированного Tat активированными цитокинами эндотелиальными клетками.HUVEC активировали и высевали на предметные стекла с 8 лунками, как описано в подписи к фиг. 8. Затем клетки подвергали действию родаминированного Tat в течение периодов времени, указанных ниже. БСА (фракцию V, Sigma) родаминировали таким же образом, как для Tat, и использовали в качестве отрицательного контроля. Инкубации были с: Tat 100 нг/мл, 15-минутная экспозиция, панель А; БСА,15-минутная экспозиция, панель В; Tat 100 нг/мл, 60-минутная экспозиция, панель С; БСА, 60-минутная экспозиция, панель D. Фиг. 10. Анализ временного хода поглощения 1 нг/мл родаминированного Tat активированными цитокинами эндотелиальными клетками. Активированные цитокинами HUVEC обрабатывали, как описано на фиг. 8, затем инкубировали с 1 мкг/мл родаминированного Tat в течение 15 мин, панель А; 30 мин, панель В; 60 мин, панель С; 120 мин,панель D. Фиг. 11. Анализ реакции на дозу (доза-ответ) поглощения активного Tat активированными цитокинами эндотелиальными клетками в сравнении с неактивированными клетками.HUVEC (7x104 клеток на лунку в 6-луночных желатинированных чашках) выращивали в полной среде, как описано выше (подпись к фиг. 8) и инкубировали в течение 5 дней в присутствии (IС-ЕС) или в отсутствие (ЕС) комбинированных рекомбинантных воспалительных цитокинов (IFN 10 Е/мл, IL-1 5 нг/мл, TNF- 2 нг/мл). Затем клетки промывали дважды и инкубировали в 1 мл RPMI 1640, содержащей 15% ФТС, в присутствии или в отсутствие серийных разведений активного Tat-белка (0,01-1000 нг/мл) или буфера для разведения Tat (ЗФР, содержащего 0,1% БСА) в течение 10 мин при 37 С в темноте. Затем клетки промывали холодной средой RPMI 1640, трипсинизировали, фиксировали в течение 10 мин при 4 С с использованием лизирующего раствора FACS (Becton Dickinson), подвергали в течение 30 мин при 4 С действию увеличивающего проницаемость раствора (Becton Dickinson), окрашивали кроличьими анти-Таt-антителами или кроличьими контрольными IgG-антителами и анализировали при помощиFACS, как описано для MDDC (подпись к фиг. 1). Поглощение нативного Tat увеличивается в активированных цитокинами клетках в сравнении с неактивированными клетками. Показан процент положительных клеток после 10-минутного инкубирования с увеличивающейся концентрацией нативного Tat-белка в репрезентативном эксперименте из выполненных трех экспериментов. Фиг. 12. Анализ зависимости от дозы и временного хода поглощения активного Tat активированными цитокинами эндотелиальными клетками. Клетки активировали и эксперименты по поглощению проводили, как описано на фиг. 11. Инкубации были в течение 5, 10, 30 или 60 мин. Кроме того, для демонстрации специфической внутрицитоплазматической локализации этого белка окрашивание анти-Tat-антителами выполняли также с не обработанными для увеличения проницаемости HUVEC. Поглощение нативного Tat активированными эндотелиальными клетками зависит от времени и от дозы и детектируется уже при таких низких концентрациях, как 0,01 нг/мл. Процент положительных клеток (в сравнении с пробами, окрашенными на изотип антител) приведен внутри блоков (прямоугольников). Данные являются результатами одного репрезентативного эксперимента из выполненных четырех экспериментов. Фиг. 13. Ингибирование поглощения 10 нг/мл родаминированного Tat активированными цитокинами эндотелиальными клетками немеченым Tat-белком. Активированные цитокинами HUVEC обрабатывали, как описано на фиг. 8, прединкубировали в бессывороточной среде, содержащей буфер или 1 мкг/мл немеченого Tat, и затем инкубировали в течение 15 мин при 37 С с 10 нг/мл родаминированного Tat или родаминированного БСА. Панель А, прединкубированные с буфером, инкубированные с БСА. Панель В, прединкубированные с буфером, инкубированные с Tat. Панель С, прединкубированные с 1 мкг/мл немеченого Tat, инкубированные с Tat. Фиг. 14. Ингибирование поглощения 10 нг/мл роламинированного Tat активированными цитокинами эндотелиальными клетками анти-51 - и анти-v3-антителами.HUVEC активировали кондиционированными средами от РНА-стимулированных и HTLV-IIтрансформированных Т-клеток (IC-HUVEC) и высевали на предметные стекла с 8 лунками, как описано в подписи к фиг. 8. Затем IC-HUVEC инкубировали в бессывороточной среде на ротационном устройстве в течение 2 ч при 4 С с моноклональными антителами, направленными против -цепи рецептора 51(анти-CD49wE, Chemicon Inc. Temecula, CA) и -цепи рецептора 51 (анти-СD29, Chemicon) или цепи рецептора v3 (aнти-CD51, Chemicon) и -цепи рецептора v3 (aнти-CD61, Chemicon). В качестве контроля специфичности использовали моноклональные антитела, направленные против антигена,родственного маркерному фактору VIII эндотелиальных клеток (анти-FVIIIRA, Chemicon). Все антитела использовали в концентрации 5 мкг/мл. Буфер для разведения антител (ЗФР, содержащий 0,1% БСА)- 22006850 использовали в качестве отрицательного контроля. После прединкубации с антителами к клеткам добавляли 10 нг/мл родаминированного Tat. Родаминированный БСА использовали в качестве отрицательного контроля. IC-HUVEC выдерживали в течение 15 мин при 37 С в СО 2-термостате и затем фиксировали в охлажденной на льду смеси ацетон-метанол (1:1). Поглощение и внутриклеточное распределение Tat наблюдали и фотографировали с использованием флуоресцентной микроскопии. Результаты оценивали сравнением флуоресценции пробы и отрицательным контролем и выражали в виде оценок от (отрицательная) до(высоко положительная) для количества поглощения без знания заранее кода проб. Панель А, прединкубированные с буфером, инкубированные с БСА. Панель В, прединкубированные с буфером, инкубированные с Tat. Панель С, прединкубированные с моноклональными анти-5- и анти-1-антителами, инкубированные с Tat. Панель D, прединкубированные с моноклональными анти-v- и анти-3-антителами, инкубированные с Tat. Панель Е, прединкубированные с aнти-FVIII-aнтитeлми (контрольными антителами), инкубированные с Tat. Фиг. 15. Ингибирование поглощения 100 нг/мл родаминированного Tat активированными цитокинами эндотелиальными клетками анти-51- и анти-v3-антителами.IC-HUVEC обрабатывали, как описано на фиг. 8, затем прединкубировали в бессывороточной среде, содержащей буфер или антитела, затем инкубировали в течение 15 мин при 37 С с 100 нг/мл родаминированного Tat или родаминированного БСА. Панель А, прединкубированные с буфером, инкубированные с БСА. Панель В, прединкубированные с буфером, инкубированные с Tat. Панель С, прединкубированные с моноклональными антителами против - и -цепей интегрина 51 и инкубированные с Tat. Панель D, прединкубированные с моноклональными антителами против - и -цепей интегринаv3 и инкубированные с Tat. Панель Е, прединкубированные с антителами против фактора VIII человека (контрольными антителами), инкубированные с Tat. Фиг. 16. Поглощение 1 мкг/мл родаминированного активного Tat частично ингибируется анти 51- и v3-антителами при инкубировании клеток с Tat в течение 15 мин.HUVEC активировали, как описано на фиг. 8, прединкубировали с моноклональными анти-5- и анти-1- или анти-v- и анти-3-антителами, или буфером, и затем инкубировали с 1 мкг/мл родаминированного Tat или родаминированного БСА в течение 15 мин при 37 С. Панель А, прединкубированные с буфером, инкубированные с БСА. Панель В, прединкубированные с буфером, инкубированные с Tat. Панель С, прединкубированные с моноклональными анти-5- и анти-1-антителами, инкубированные с Tat. Панель D, прединкубированные с моноклональными анти-v- и анти-3-антителами, инкубированные с Tat. Фиг. 17. Поглощение 1 мкг/мл родаминированного активного Tat не ингибируется антителами против интегринов при инкубировании клеток с Tat в течение 60 мин.HUVEC активировали, как описано на фиг. 8, прединкубировали с моноклональными анти-5- и анти-1 или анти-v и анти-3-антителами, или буфером, и затем инкубировали с 1 мкг/мл родаминированного Tat в течение 60 мин при 37 С. Панель А, прединкубированные с буфером, инкубированные с Tat. Панель В, прединкубированные с моноклональными анти-5- и анти-1-антителами, инкубированные с Tat. Панель С, прединкубированные с моноклональными анти-v- и анти-3-антителами, инкубированные с Tat. Фиг. 18. Активный Tat усиливает продуцирование цитокинов IL-12 и TNF- и -хемокинов MIP-1,МIР-1 и RANTES клетками MDDC.MDDC от 8 доноров культивировали при плотности 2x105 на мл в течение 18 ч в полной среде в отсутствие или в присутствии серийных концентраций (20-20000 нг/мл) нативного или окисленного Tat. В качестве отрицательного контроля использовали буфер для восстановления суспензии Tat. В качестве положительного контроля использовали LPS из Е. coli, серотип 055: В 5 (10 мкг/мл Sigma-Aldrich, Milano,Italy). Спустя 18 ч клеточные супернатанты собирали и анализировали на присутствие TNF-, IL-12,RANTES, MIP-1, МIР-1 с использованием коммерчески доступных наборов в соответствии с инструкциями изготовителя (наборы Cytoscreen TNF- и IL-12 ELISA, Biosource Europe, Nivelle, Belgium; Quantikine RANTES, MIP-1 и МIР-1 RD Systems Europe, Abingdon, UK). Серые, пустые и черные символы представляют величины для клеток, обработанных Tat, буфером или LPS, соответственно. Представлен- 23006850 ные данные являются средними значениями ( SEM) восьми разных доноров и выражены в пг/мл. Очень слабое продуцирование цитокинов или -хемокинов индуцировалось оксиленным-инактивированнымTat-белком. Фиг. 19. Активный Tat усиливает представление аллогенного антигена клетками MDDC.MDDC (2x105 клеток на мл) инкубировали в течение 18 ч с LPS (положительный контроль) (заполненные кружки), активным Tat-белком (10 мкг/мл) (заполненные треугольники), буфером для восстановления суспензии (пустые треугольники) или культуральной средой (пустые кружки). Затем их промывали и культивировали в среде (содержащей 5% ФТС) в 96-луночных планшетах вместе с лишенными моноцитов аллогенными PBL (2x105 на лунку) при соотношениях от 1:10 до 1:640. Для оценки пролиферации лимфоцитов спустя 6 дней в лунки добавляли Н-тимидин, выдерживали в течение дополнительных 16 ч и пробы собирали на стекловолоконные филльтры (Printed Filtermat A, Wallac, Turku, Finland), считали при помощи Betaplate (Wallac) и величины выражали в имп/мин. Приведены данные из репрезентативного эксперимента, и они воспроизводились с 3 другими донорами. Представлены средние значения иMDDC (2x105 клеток на мл) от 3 здоровых доноров, двух чувствительных (В 16 и В 42) и одного нечувствительного (В 45) к ТТ в анализах пролиферации, инкубировали в течение 18 ч с активным Tatбелком (10 мкг/мл), буфером для восстановления суспензии или культуральной средой и затем культивировали в полной среде (содержащей 5% ФТС), вместе с аутологичными PBL (2x105 на лунку) при соотвношении 1:20 в отсутствие (пустые столбцы) или в присутствии (серые столбцы) 5 мкг/мл ТТ (Connaught, Willowdale, Canada). Для оценки пролиферации лимфоцитов спустя 6 дней добавляли 3 Н-тимидин и выдерживали в течение дополнительных 16 ч, пробы собирали и считали имп/мин, как описано выше. Данные представлены в виде индексов стимуляции (S.I.), которые указывают отношения между счетом из DC-PBL сокультур против счета культур только PBL. Фиг. 21. Протокол вакцины с праймированием-бустингом для оценки адъювантной активности биологически активного Tat-белка. Использовали две группы мышей Balb/c. Первую группу (сторона 1) иммунизировали дважды интрадермально одним Gag (праймирование) и затем дважды интраназально с использованием Gag вместе с мукозным адъювантом Маlр-2 (бустинг). Вторую группу (сторона 2) иммунизировали дважды интрадермально Gag и Tat, смешанными вместе (праймирование), и затем дважды интраназально Gag, смешанным с Tat, и связанным с мукозным адъювантом Ма 1 р-2 (бустинг). Вакцинации выполняли в указанное время. Фиг. 22. Реакция в виде антител против Gag.Aнти-Gag-антитела измеряли в сыворотке из мышей обеих сторон с использованием коммерческогоELISA (ELAVIA AB HIV2, BIO-RAD Laboratories Srl, Ml, Italy) в соответствии с инструкциями изготовителя. Сыворотки разводили 1:100 перед тестированием. Предельной величиной была оптическая плотность 0,3. Фиг. 23. Цитолитическая анти-Gag-aктивность. Спленоциты мышей из обеих сторон стимулировали in vitro Gag-пептидами в течение 6 дней в присутствии IL-2 (эффекторы) и после этого инкубировали с клетками р 815, кратковременно обработанными Gag-пептидами и меченными 51 Сr (мишени), при указанных соотношениях. Специфический лизис определяли стандартными способами. Самопроизвольное высвобождение 51 Сr не превышало 10% максимального высвобождения. Специфическое высвобождение 51 Сr более 10% рассматривали как положительное. Следующие примеры приведены для лучшей иллюстрации данного изобретения, и они не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Пример 1. Активный Tat эффективно поглощается MDDC, но не ТСВ и BLCL Поглощение активного Tat клетками MDDC, ТСВ и BLCL оценивали внутриклеточной иммунофлуоресценцией в проточной цитометрии с использованием специфического аффинно очищенного поликлонального антитела на обработанных для увеличения проницаемости клетках. Фиг. 1 показывает результаты репрезентативного донора, уровни поглощения Tat которого представляли медиану величин,полученных у 14 тестируемых доноров. Поглощение Tat MDDC было очень эффективным и происходило зависимым от дозы и от времени образом (фиг. 1 А). Поглощение было уже очевидным с самой низкой используемой дозой Tat (0,1 нг/мл). Независимо от испытываемой концентрации Tat, уровень окрашивания всегда имел максимум после 5 мин инкубации и уменьшался после 60 мин, вероятно, вследствие процессинга этого белка. Однако, поглощение Tat оставалось высоким (98%) вплоть до 60 мин инкубации при наивысшей используемой дозе Tat (10 мкг/мл). Окрашивания не наблюдали с клетками, инкубированными только в среде или буфере для восстановления суспензии (фиг. 1 А). Кроме того, детектированный Tat всегда был полностью внутриклеточным, так как не наблюдали окрашивания после 10 или 30- 24006850 мин инкубации Tat с не обработанными для увеличения проницаемости клетками (фиг. 1 В). Сходную кинетику в зависимости от дозы и времени поглощения Tat клетками MDDC воспроизводимо наблюдали с разными партиями белка. В противоположность MDDC, поглощение Tat клетками ТСВ и BLCL было гораздо менее эффективным. В самом деле, наблюдали небольшое специфическое внутриклеточное окрашивание или отсутствие этого окрашивания с обоими типами клеток при концентрациях Tat до 10 мкг/мл после 30 или 60 мин инкубирования с величинами, при наивысшей дозе Tat, гораздо более низкими, чем величины, полученные с MDDC (0-15% и 3-10% для BLCL и ТСВ, соответственно, против 98%) (фиг. 1 С). Таким образом, эффективное поглощение активного Tat является селективным признаком MDDC. Пример 2. Поглощение активного Tat MDDC увеличивается с созреванием клеток и элиминируется окислением и инактивацией этого белка Незрелые MDDC поглощают антигены посредством фагоцитоза и пиноцитоза (Bankereau 1998; Bell 1999). Зрелые дендритные клетки (ДК) теряют эти активности при приобретении сильной антигенпредставляющей способности. Для проверки, влияет ли созревание клеток на поглощение нативного Tat,MDDC индуцировали для созревания при помощи LPS. В сравнении с незрелыми MDDC зрелые MDDC экспрессировали более высокие уровни маркеров клеточной поверхности HLA-DR, CD83 и CD86. Затем как незрелые, так и зрелые клетки использовали для экспериментов по поглощению. Поглощение Tat в высокой степени увеличивалось зрелыми MDDC при всех испытанных концентрациях белка (фиг. 2 А). Фактически, инкубирование зрелых MDDC с низкими концентрациями Tat давало уровни внутриклеточного окрашивания, сходные с уровнями, наблюдаемыми в незрелых клетках с наивысшими дозами TatTat содержит 7 цистеинов и является крайне чувствительным к окислению, которое вызывает конформационные изменения и потерю биологической активности. Для проверки роли конформации и биологической активности Tat в процессе поглощения клетками MDDC этот белок подвергали действию воздуха и света, тестировали потерю биологической активности (табл. 1) и затем сравнивали активный и неактивный Tat-белок в экспериментах по поглощению. Как показано на фиг. 2 В, окрашивания не наблюдали с окисленным Tat до 1 мкг/мл этого белка, и, при этой концентрации, только очень низкое специфическое окрашивание Tat детектировали в сравнении с нативным Tat. Таким образом, Tat должен иметь нативную конформацию и биологическую активность для эффективного поглощения клеткамиMDDC. Поскольку созревание MDDC, которое связано с уменьшенной активностью пино/фагоцитоза, увеличивает поглощение Tat, тогда как окисление и инактивация этого белка сильно уменьшает поглощениеTat клетками MDDC опосредовано специфическими рецепторами и механизмами вхождения в клетку,которые не относятся к пино/фагоцитарной активности этих клеток, но увеличиваются после созреванияMDDC. Таблица 1. Окисление Tat уничтожает его биологическкую активность Тат окисляли действием воздуха и света в течение 18 ч. Затем тестировали биологическую активность нативного и окисленного белка (в дозах от 500 до 10000 нг/мл) измерением способности спасать репликацию Tat-дефектного провируса ВИЧ в клеточной линии HLM-1 (Ensoli 1993; Chang 1997) или индукцией САТ-активности в клеточной линии HL3T1, содержащей конструкцию LTR-CAT (Felber 1988). Приведены величины р 24 (пг/мл) из культуральных супернатантов клеток HLM-1 и САТактивности из экстрактов клеток HL3T1 (% ацетилирования/100 мкг белка). Пример 3. Блокирование поглощения активного Tat MDDC моноклональными анти-51- и анти-v3 антителами или их природными лигандами фибронектином (FN) и витронектином (VN) Для выяснения, происходит ли поглощение нативного Tat клетками MDDC посредством опосредованного специфическим рецептором пути эндоцитоза, проводили эксперименты со специфическими моноклональными антителами или конкурирующими лигандами, направленными против интегриновых рецепторов 51 и v3. Эти рецепторы были выбраны среди нескольких рецепторов, связывающих Tat на различных типах клеток, так как они в высокой степени экспрессируются активированными эндотелиальными клетками и клетками саркомы Капоши (KS), которые пролиферируют, мигрируют и прикрепляются в присутствии Tat, и это опосредовано связыванием RGD-района Tat с интегринами 51 и v3.- 25006850 Как показано на фиг. 3 А, В, поглощение Tat MDDC ингибируется моноклональными как анти-51-, так и анти-v3-антителами, и это блокирование является полным в присутствии обоих антител (фиг. 3 А,В). Природные лиганды для этих рецепторов, а именно FN и VN, блокируют поглощение Tat сходным образом (фиг. 4 А, В). Таким образом, интегрины 51 и v3 опосредуют вхождение Tat в MDDC. Этот путь поглощения является преимущественным при пикомолярных-наномолярных концентрациях этого белка, тогда как при более высоких концентрациях Tat блокирование вхождения Tat в клетку является все еще явным, но не полным (фиг. 4 А и В). Это свидетельствует о том, что MDDC используют по меньшей мере два пути для поглощения Tat, причем первый путь, имеющий место при низких концентрациях Tat (пикомолярных/наномолярных), является опосредованным интегринами эндоцитозом, тогда как при более высокой концентрации Tat присутствует также взаимодействие с низкой аффинностью с клеточной поверхностью. Пример 4. Активный Tat эффективно поглощается зависимым от дозы и от времени образом как клеткамиMDM, так и клетками MDDC, но не моноцитами Поскольку MDDC происходят из моноцитов и поскольку известно, что моноциты и MDM эффективно представляют антигены лимфоцитам, поглощение активного Tat из этих клеток анализировали и сравнивали с поглощением MDDC из тех же самых доноров. Моноциты очищали из периферической крови и индуцировали к дифференцировке до MDDC илиMDM (как описано на фиг. 1 и 5). Как показано на фиг. 5, моноциты поглощают активный Tat только при высочайших дозах (45 и 67% при 1000 и 10000 нг/мл, соответственно) на не обработанных для увеличения проницаемости клетках). MDM поглощали Tat более эффективно, чем моноциты, причем окрашивание является детектируемым при относительно низких дозах (32 и 43% при 10 нг/мл и 100 нг/мл, соответственно) вплоть до наивысшей испытанной дозы Tat (72% при 10000 нг/мл), когда наблюдали поверхностное связывание этого белка (30% на не обработанных для увеличения проницаемости клетках).MDDC того же самого донора поглощали Tat более эффективно со специфическим окрашиванием, детектируемым уже при самой низкой испытанной дозе (0,1 нг/мл), чем моноциты и MDM, как при 10 минутах, так и при 30 мин (22 и 13%, соответственно). При наивысшей дозе (1000 нг/мл) 80 и 73% MDDC были положительными после 10 и 30 мин экспонирования Tat, соответственно. При всех этих дозах белка MDDC и MDM поглощали Tat явно более эффективно, чем моноциты. Поскольку как MDDC, так иMDM дифференцируются из моноцитов, эти данные свидетельствуют о том, что клеточная дифференцировка обеспечивает клетки специфическими механизмами нацеливания и поглощения Tat-белка. Пример 5. Ингибирование поглощения активного Tat пептидами, содержащими щелочной район иRGD-домен Tat-белка ВИЧ-1 Для выяснения, какой домен Tat является ответственным за поглощение биологически активного белка, эксперименты по блокированию проводили прединкубированием MDDC с Tat-пептидами (15 мерами), охватывающими N-концевой (1-15 плюс 6-20), богатый цистеином (21-35 плюс 26-40), щелочной (46-60 плюс 51-60) или RGD-район (66-80 плюс 71-85) (фиг. 6, панели А и В). Пептиды, охватывающие N-концевой и богатый цистеином район, не влияли на поглощение Tat при любой из испытанных доз (0,1-1000 нг/мл) (фиг. 7, панель А). Пептиды, охватывающие щелочной район, заметно уменьшали поглощение Tat при высоких дозах (100 и 1000 нг/мл), но не влияли на поглощение при более низких концентрациях (0,1 - 10 нг/мл) биологически активного Tat-белка. Напротив, пептиды, охватывающиеRGD-район, элиминировали поглощение Tat при дозах до 10 нг/мл и заметно уменьшали поглощение при 100 и 1000 нг/мл. Следует отметить, что комбинация Tat-пептидов 46-60 и 66-80 элиминировала поглощение биологически активного Tat как при дозе 10, так и при дозе 1000 нг/мл (фиг. 7, панели В и С). В тех же самых экспериментальных услових, более длинный Tat-пептид, охватывающий как N-концевой,так и богатые цистеином районы (1-38) (фиг. 6, панель С), не влиял на поглощение биологически активного Tat, тогда как Tat-пептид 21-58, охватывающий как богатый цистеином район, так и щелочной район, явно уменьшал поглощение Tat при 100 и 1000 нг/мл, а Tat-пептид 57-102, охватывающий RGDрайон, элиминировал поглощение Tat при дозах ниже 100 нг/мл (фиг. 7, панель D). Tat-пептид 47-86, охватывающий как щелочной район, так и RGD-район, элиминирует поглощение Tat при дозах ниже 100 нг/мл и сильно уменьшает поглощение Tat при 1000 нг/мл (фиг. 7, панель D). Таким образом, блокирование интегринов 51 и v3 пептидами, включающими в себя RGD-мотив, устраняет поглощение пикомолярных-наномолярных (0,1-10 нг/мл) концентраций биологически активного Tat, тогда как поглощение более высоких (наномикромолярных, 10-1000 нг/мл) концентраций Tat опосредовано щелочным районом Tat через взаимодействие со связанными с гепарином протеогликанами. Важно, что комбинация пептидов, охватывающих как щелочной район, так и RGD-район, определяет полную элиминацию поглощения Tat при любой из испытанных доз, нарушая как пути связывания, так и интернализацию биологически активного Tat-белка. Таким образом, хотя эти данные демонстрируют, что оба домена являются необходимыми для оптимального поглощения Tat, они также указывают на то, что RGD-район является ключевым для эффективного (т.е. при низких концентрациях) и селективного (т.е. типов клеток, экспрессирующих интегрины 51 и v3, таких как MDDC и активированные эндотелиальные клетки (ЕС)(см. ниже) поглощения Tat, тогда как щелочной район участвует в поглощении только при высоких концентрациях Tat и не имеет специфичности нацеливания, так как это поглощение встречается в любом типе клеток. Пример 6. Поглощение активного Tat первичными эндотелиальными клетками до и после активации клеток воспалительными цитокинами Для анализа поглощения активного Tat эндотелиальными клетками HUVEC активировали или не активировали воспалительными цитокинами и использовали в исследованиях поглощения с родаминированным Tat-белком. После родаминирования Tat был активным, так как он все еще мог способствовать пролиферации клеток KS при том же самом диапазоне концентраций, что и немеченый Tat. Это указывает на то, что присоединение флуоресцентной метки не ухудшало его биологическую функцию. Клетки подвергали действию широкого диапазона концентраций Tat. Кроме того, для того чтобы согласовать результаты с экспериментами по ингибированию поглощения (см. ниже), клетки прединкубировали при 4 С в течение 2 ч со средой без фетальной телячьей сыворотки. Эта прединкубация не влияет на последующее поглощение родаминированного Tat. С родаминированным Tat поглощение и транслокация этого белка в ядро или ядрышко активированных HUVEC (IC-HUVEC) становились детектируемыми в пределах 15 мин инкубирования с 10 нг/мл родаминированного Tat (фиг. 8). Внутриклеточная активностьTat увеличивалась зависимым от дозы (фиг. 8) и зависимым от времени образом (фиг. 9 и 10). Родаминированный БСА или буфер (отрицательные контроли) обнаруживали небольшое поглощение или отсутствие поглощения (фиг. 8, 9, 10). Для подтверждения этих данных с холодным (немеченым) активным Tat эти эксперименты повторяли с использованием внутриклеточного окрашивания и FACS-анализа (фиг. 11, 12). Поглощение нативного Tat было гораздо более эффективным клетками IC-HUVEC в сравнении с неактивированными клетками (фиг. 11), и такие низкие дозы, как 0,01 нг/мл, Tat поглощались очень быстро этими клетками зависимым от дозы и зависимым от времени образом с кинетикой, сходной или идентичной с кинетикой в случае MDDC (фиг. 12). Окрашивания не наблюдали с не обработанными для увеличения проницаемости клетками, что указывает на то, что весь или большая часть Tat поглощалась этими клетками. Таким образом, MDDC, IC-HUVEC и MDM обладают специфическими механизмами для очень эффективного поглощения Tat. Пример 7. Ингибирование поглощения активного Tat немеченым белком Для выяснения, происходит ли поглощение родаминированного Tat-белка клетками IC-HUVEC через специфический и насыщаемый путь (пути), IC-HUVEC инкубировали с 1 мкг/мл немеченого Tat перед инкубированием с родаминированным Tat при концентрациях в диапазоне от 10 нг/мл до 1 мкг/мл. Эта процедура почти полностью ингибировала поглощение родаминированного Tat (фиг. 13 и табл. 2),причем уровни флуоресценции были сравнимы с уровнями негативного контроля (БСА). Это свидетельствует о том, что поглощение Tat-белка IC-HUVEC является специфическим и насыщаемым, что предполагает участие в это процессе рецептора (рецепторов). Таблица 2. Ингибирование поглощения 100 нг/мл и 1 мкг/мл родаминированного активного Tat клетками IC-HUVEC после прединкубации этих клеток с 1 мкг/мл немеченого TatIC-HUVEC прединкубировали в течение 2 ч с бессывороточной средой в отсутствие или в присутствии 1 мкг/мл немеченого активного Tat и затем инкубировали с 100 нг/мл или 1 мкг/мл родаминированного Tat в течение 60 мин. Поглощение Tat визуализировали флуоресцентной микроскопией, как описано в подписи к фиг. 6. Отрицательными контролями (+/- поглощение) были прединкубация и бессывороточная среда с последующим инкубированием с родаминированным БСА. Пример 8. Ингибирование поглощения пикомолярных концентраций (10-100 нг/мл) активного Tat моноклональными антителами, направленными против интегринов 51 и v3, или их лигандами FN и VN Для определения, опосредовано ли поглощение Tat IC-HUVEC теми же самыми интегринами, идентифицированными с MDDC, выполняли эксперименты по ингибированию прединкубированием ICHUVEC с физиологическими лигандами для этих рецепторов, FN или VN, или прединкубированием этих- 27006850 клеток с моноклональными антителами, направленными против RGD-связывающих районов рецепторов 51 и v3. Затем эти клетки инкубировали с родаминированным Tat при концентрациях в диапазоне от 10 нг/мл до 1 мкг/мл. Поглощение и ядерная локализация 10 нг/мл родаминированного Tat ингибировались предшествующей обработкой этих клеток FN или VN, используемыми при 100 нг/мл каждого (таблица 3). Подобным образом, поглощение 10-100 нг/мл Tat ингибировалось предшествующей обработкой этих клеток моноклональными антителами, направленными против RGD-связывающих районов как рецептора FN,51, так и рецептора VN, v3 (фиг. 14, 15). Интенсивность клеточной флуоресценции уменьшалась до уровней, наблюдаемых с отрицательными контролями (фиг. 12, 13). Эти результаты указывают на то, что поглощение пикомолярных концентраций Tat опосредуется теми же самыми интегринами, узнаваемымиMDDC. В противоположность этому, не наблюдали ингибирования при предшествующем инкубировании IC-HUVEC с моноклональными антителами, направленными против фактора VIII, используемыми в качестве отрицательного контроля (фиг. 14, 15), что, следовательно, указывает на то, что ингибирование поглощения Tat антителами против интегринов было специфическим. Таблица 3. Ингибирование поглощения 10 нг/мл активного Tat IC-HUVEC прединкубированием этих клеток с избытком FN или VNIC-HUVEC прединкубировали в течение 2 ч с бессывороточной средой в отсутствие или в присутствии FN или VN человека (Roche, Monza, Italy) и затем инкубировали с 10 нг/мл родаминированного Tat в течение 60 мин. Поглощение Tat визуализировали флуоресцентной микроскопией, как описано в подписи к фиг. 8. Отрицательными контролями (+/- поглощение) были прединкубация и бессывороточная среда с последующим инкубированием с родаминированным БСА. Пример 9. Поглощение 1 мкг/мл активного Tat только частично опосредовано интегриновыми рецепторами Для определения участия интегринов в поглощении более высоких концентраций активного Tat, ICHUVEC инкубировали с 1 мкг/мл родаминированного Tat. Очень интенсивный сигнал флуоресценции наблюдали с этими клетками в пределах 15 минут (панель D фиг. 8, панель А фиг. 10 и панель В фиг. 16). В этот момент инкубирования предшествующая обработка этих клеток моноклональными антителами против 51 (панель С фиг. 16) или v3 (панель D фиг. 16) показала некоторое ингибирование поглощения Tat, но более низкое, чем поглощение Tat, наблюдаемое с 10 или 100 нг/мл Tat. При инкубировании IC-HUVEC с 1 мкг/мл родаминированного Tat в течение более продолжительных периодов времени(60 минут) предшествующая обработка этих клеток моноклональными антителами против 51 или против v3 не ингибировала поглощение Tat (фиг. 17). Эти результаты показывают, что, при этой концентрации и при этих периодах инкубирования Tat интегрин-зависимое поглощение является насыщенным и другой путь поглощения Tat является преимущественным. Пример 10. Домены Tat, опосредующие поглощение активного Tat Для выяснения, какой домен Tat является ответственным за поглощение пикомолярныхнаномолярных versus микромолярных концентраций этого белка, выполняли эксперименты по блокированию прединкубацией IC-HUVEC с Tat-пептидами, охватывающими RGD-район (Tat 65-80) и щелочной район (Tat 46-60) (таблица 4). В качестве отрицательного контроля использовали Tat-пептид 11-24. При добавлении родаминированного Tat к этим клеткам поглощение пикомолярных концентраций Tat ингибировалось Tat-пептидом 65-80, но не Tat 46-60 или 11-24 (табл. 4). В противоположность этому, при высоких концентрациях внеклеточного Tat (1 мкг/мл) поглощение не ингибировалось Tat 65-80, тогда как Tat 46-60 оказывал некоторые ингибирующие действия. Это подтверждает, что поглощение пикомолярных-наномолярных концентраций Tat опосредуется RGD-районом Tat, взаимодействующим с интегринами 51 и v3. В противоположность этому, поглощение высоких (наномолярных до микромолярных) концентраций Tat опосредовано щелочным районом Tat через взаимодействие со связанными с гепарином протеогликанами. Таким образом, RGD-район является ключевым для эффективного поглощения Tat, тогда как щелочной район участвует в поглощении высоких концентраций Tat, однако он не имеет специфичности нацеливания, так как он встречается у любых клеточных типов.- 28006850 Таблица 4. Домены Tat, опосредующие поглощение активного TatIC-HUVEC инкубировали на ротационном устройстве в течение 2 ч при 4 С с избытком (10 мкг/мл)(ll-24)Tat, (46-60)Tat или (65-80)Tat в бессывороточной среде. Буфер для ресуспендирования пептидов(ЗФР-0,1% БСА) использовали в качестве отрицательного контроля. После прединкубации с конкурентными пептидами, к клеткам добавляли родаминированный Tat при 10, 100 и 1000 нг/мл и клетки выдерживали в течение 15 мин при 37 С в СО 2-термостате. Затем клетки фиксировали в охлажденной на льду смеси ацетон-метанол (1:1). Поглощение и клеточное распределение Tat наблюдали и фотографировали с использованием флуоресцентной микроскопии, как описано в подписи к фиг. 8. Пример 11. Активный, но не окисленный и инактивированный, Tat индуцирует активацию и созревание MDDC Для оценки действия активного Tat-белка на активацию и созревание MDDC поверхностную экспрессию МНС, HLA-ABC и HLA-DR и костимуляторных молекул CD40, CD80, CD86 и CD83 анализировали проточной цитометрией на клетках, культивируемых в течение 18 ч в присутствии этого белка,полной среды, буфера для восстановления суспензии или LPS (положительного контроля). Экспериментальные данные, полученные с 10 разными донорами, показали, что Tat индуцирует зависимое от дозы усиление экспрессии МНС и костимуляторных молекул в отсутствие любой клеточной токсичности(табл. 5, панель А). Явное увеличение средней интенсивности флуоресценции (MFI) наблюдали дляHLA-ABC (3/6 доноров, среднее 37%), для HLA-DR (10/10, среднее 49%), для CD40 (6/10, среднее 35%),для CD80 (8/8, среднее 60%), для CD83 (9/10, среднее 164%) и для CD86 (10/10, среднее 140%). Буфер для восстановления суспензии или только среда не изменяли уровней экспрессии анализируемых молекул. Примечательно, что окисление и инактивация Tat (табл. 1) заметно снижали способность этого белка повышающим образом регулировать МНС и костимуляторные молекулы (табл. 5, панель В). Таким образом, только активный Tat способствует активации и созреванию MDDC.- 29006850 Таблица 5. Активный (А), но не окисленный и инактивированный (В), Tat усиливает экспрессиюHLA и костимуляторных молекул на MDDC