Новые способы терапевтической вакцинации

1 Данное изобретение имеет отношение к новым способам борьбы с такими болезнями,как раковые заболевания, характеризующимся наличием ассоциированных с клетками продуктов экспрессии генов, которые не иммуногенны или слабо иммуногенны. В частности, данное изобретение относится к способам индуцирования иммунного ответа, управляемого цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), в силу чего клетки, несущие эпитопы продуктов экспрессии генов, атакуются и убиваются CTL. Изобретение также относится к способу получения иммуногенных, модифицированных полипептидных антигенов, которые получают из слабо иммуногенных антигенов. Изобретение, кроме того, относится к серии заявок по AutoVac (аутовакцинации) технологии заявителей (которая является предметомWO 95/05849) в области терапевтической вакцинации против рака. Идея вакцинации против рака существовала примерно в течение более чем ста лет и периодически претерпевала вспышки активной разработки, особенно с начала этого века. Однако в течение последних 10 лет значительно улучшилось понимание фундаментальных молекулярных механизмов иммунного ответа. Среди наиболее важных ключевых этапов,достигнутых в течение этого периода, было открытие еще продолжающего расти списка цитокинов и факторов роста, понимание механизмов взаимодействия между Т- и В- клетками, а также установление путей процессинга клеточных антигенов, включая роль и структуру молекул МНС классов I и II в представлении антигенов. Важными открытиями в отношении иммунологии рака - хотя еще не полностью понятыми также были выяснения механизмов, лежащих в основе индукции иммунологической толерантности у хозяина. Все эти исследования привели к огромному количеству попыток, предпринятых для того, чтобы разработать новые способы лечения рака человека. В зависимости от того, как пациентом приобретается иммунитет к опухоли, схемы иммунотерапии могут быть классифицированы либо как пассивные, либо как активные. По схеме пассивной иммунотерапии пациент пассивно получает иммунные компоненты, такие как цитокины, антитела, цитотоксические Тклетки или активируемые лимфоцитами клетки киллеры (LAK). В противоположность этому,протоколы активной специфичной иммунотерапии вызывают активно индуцируемый иммунитет к опухоли путем вакцинации опухолевой клеткой или ее антигенными компонентами. Эта последняя форма лечения предпочтительна, поскольку при этом иммунитет является длительным. Пассивные и активные раковые вакцины сосредоточены на индукции либо гуморального,либо клеточного иммунных ответов. Для актив 003634 2 ных вакцин хорошо установлено, что индукцияCD4-позитивных хелперных Т-клеток необходима для того, чтобы вторично индуцировать либо антитела, либо цитотоксические CD8 позитивные Т-клетки. Пассивная вакцинация антителами После открытия в середине семидесятых технологии моноклональных антител было разработано большое количество терапевтических моноклональных антител, направленных против специфичных для опухоли или ассоциированных с опухолью антигенов. Однако терапия моноклинальными антителами вызывает несколько серьезных проблем. Инъекция этих чужеродных веществ индуцирует у пациента иммунный ответ по отношению к инъецированным антителам, который может привести к менее эффективному лечению, а также к серьезным аллергическим побочным эффектам у пациентов. Обычно моноклональные антитела должны вводиться в больших количествах. Это является проблемой, поскольку стоимость получения моноклональных антител огромна. Моноклональные антитела должны вводиться парентеральным путем, и вследствие относительно больших количеств, требуемых при этом, пациенты часто должны быть госпитализированы во время лечения. Инъекции моноклональных антител должны повторяться в довольно короткие интервалы(недели), для того, чтобы поддерживать терапевтическое действие. Моноклональные антитела обычно не способны активировать вторичные эффекторные системы иммунной системы, такие как комплемент, NK-клетки или макрофаги, убивающие опухолевые клетки. Последний недостаток особенно важен в терапии рака, и может быть важной причиной того, почему терапия рака моноклинальными антителами в отдельных случаях не была особенно успешной. Так называемые гуманизированные моноклональные антитела, используемые в настоящее время многими компаниями,менее иммуногенны, но, к сожалению, они даже менее способны к активированию вторичных иммунных эффекторных систем. Кроме того,наблюдались примеры вторичного разрастания опухолей без исходного опухолевого антигена,поскольку эти антитела не индуцируют эффектов доброкачественного свидетеля ("innocentbystander"), влияющих на опухолевые клетки, не несущие опухолевого антигена. Слабая эффекторная способность моноклональных антител привела к разработке моноклональных антител, химически конъюгированных с различными токсинами и радиоизотопами. Например, Pharmacia Upjohn AB разработала конъюгат между специфичным для опухоли моноклональным антителом и токсином АStaphylococcus aureus с целью активации Т кле 3 ток в опухоли. Medarex Inc. разработали биспецифичные моноклональные антитела, содержащие специфичный для опухоли Fab-фрагмент, а также специфичный для Fc-рецептора фрагмент антитела, с целью активации макрофагов, убивающих опухолевые клетки. Обе конструкции более эффективны, чем само моноклональное антитело, но они также дороже и более иммуногенны. Антитела, конъюгированные с радиоизотопами, также являются дорогими, и также иммуногенны, и наблюдаются другие общие токсические побочные эффекты. Появление технологии моноклональных антител было главным шагом вперед, который дал возможность получения вполне определенных молекул, связанных с высокой аффинностью. Однако, являясь моноклональными, эти антитела реагируют только с одним типом эпитопа опухолевого антигена. Это является главной причиной того, почему они обычно не способны активировать систему комплемента или связываться с Fc-рецепторами NK-клеток и макрофагов. Эти очень мощные эффекторные системы обычно требуют совместной локализации множественных Fc-фрагментов антител,выступающих из антигена. Поэтому другие исследователи предприняли попытки использования двух моноклональных антител в комбинации, и это привело к усилению эффекта. Поэтому кажется очень разумным вместо этого атаковать опухолевые клетки высокоспецифичными поликлональными антителами, направленными против специфичных для опухоли,или против(сверхэкспрессируемых) ассоциированных с опухолью антигенов или рецепторов факторов роста. Такие антитела были бы вполне способны активировать вторичные эффекторные системы, указанные выше. Кроме того, вероятно, что локальная воспалительная реакция, индуцированная этими эффекторными системами, могла бы привести к вторичным воздействиям на клетки доброкачественные свидетели, не экспрессирующие опухолевого антигена, о котором идет речь, а также к активации специфичных для опухоли TIL (противоопухолевые эффекторные лимфоциты) в опухолевой ткани. Такие эффекты наблюдались Medarex Inc. с использованием их биспецифичных конъюгатов моноклональных антител. После открытия технологии моноклональных антител потенциальное использование поликлональных антител в терапии рака особенно не рассматривалось (за исключением антигенов,описанных ниже). Главной причиной является то, что вполне определенные специфичные для опухоли или ассоциированные с опухолью поверхностные антигены были охарактеризованы только в последние годы, но - более важно многие из них оказались аутоантигенами и поэтому не иммуногенными. Таким образом, не 003634 4 обходимо было бы использовать экзогенные поликлональные антитела для изучения этих эффектов. Однако такие антитела индуцируют сильный иммунный ответ по отношению к инъецированным чужеродным поликлональным антителам, который быстро элиминирует терапевтическое действие. Активная вакцинация для индукции антител Недавние попытки индуцировать терапевтические поликлональные антитела у пациентов, больных раком, путем активной вакцинации были успешными. Разработаны вакцины против мембраносвязанных углеводных аутоантигенов (таких как 0-связанные аберратно экспрессируемые Тn- и sTn-антигены и липосахариды ганглиозиды GM2 и GD3). Однако эти небольшие углеводные структуры являются очень слабыми антигенами, поэтому должны использоваться конъюгаты этих молекул с молекулами-носителями, такими как гемоцианин морского блюдечка (KLH) или муцины овец(содержащие Тn- и sTn). У пациентов с меланомой индукция анти-GМ 2-антител была ассоциирована с удлиненными промежутками без признаков заболевания и полной выживаемостью в последующие минимум пятьдесят один месяц. Также проведены рандомизированные исследования фазы II на пациентах с раком молочной железы с использованием конъюгата sTn и KLH в адъюванте DETOX-B (BIOMIRA Inc.), показывающие, что пациенты, обладающие иммунитетом к sTn, имели значительно большую среднюю продолжительность жизни по сравнению с контролем. Другим примером активной индукции поликлональных антител при раке является использование идиотипспецифичной вакцинации против В-клеточных лимфом, которая - хотя и была многообещающей - ограничена только этим видом рака. Наконец, компания США Aphton Inc. разработала активные конъюгированные вакцины против гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) и гастрина. Показано, что эта вакцина способна контролировать биологическую активность этих гормонов, которые также могут функционировать как аутокринные факторы роста для некоторых опухолевых клеток. Проведены успешные клинические испытания II фазы на пациентах, больных раком желудочно-кишечного тракта, и проходит III фаза клинических испытаний. Цитотоксические Т-клетки Несколькими группами ясно показано, что специфичные для опухоли цитотоксические Тклетки (CTL) присутствуют во многих опухолях. Эти CTL называются противоопухолевыми эффекторными лимфоцитами (TIL). Однако эти клетки почему-то становятся не реагирующими,или энергическими вследствие нескольких различных возможных механизмов, включая секрецию опухолевыми клетками иммунносупрессирующих цитокинов,отсутствие ко 5 стимулирующих сигналов, подавление молекул МНС класса I и т.д. Было предпринято много попыток выделить специфичные для опухоли, связываемые молекулами HLA класса I пептиды, узнаваемыеTIL, и в некоторых случаях они также были успешными (например, пептиды антигенов, ассоциированных с меланомой). Такие пептиды были использованы для того, чтобы индуцировать специфичный для опухоли иммунный ответ у хозяина, но практическое применение специфичных для опухоли пептидов в вакцинах ограничено определенной частью популяции вследствие узкой специфичности связывания пептидов с молекулами HLA класса I. Кроме того,обычно сравнительно трудно вызвать ответ CTLin vivo, используя синтетические пептиды, из-за небольшого периода биологической полужизни этих веществ, а также трудностей, связанных с экзогенным примированием молекул МНС класса I. Выли предприняты многие другие подходы, чтобы вызвать специфичный для опухолиGM-CSF) или костимулирующих молекул (В 7) либо в растворимой форме, либо экспрессированных трансфицированными опухолевыми клетками. Кроме того, с переменным успехом были использованы иммунизации аллогенными или аутологичными целыми клетками, или опухолевыми антигенами, приготовленными в специальных адъювантах, предназначенных для представления антигена посредством пути представления антигенов МНС класса I, или опухолевыми антигенами, экспрессируемыми, например, в векторах вакцин и т.д. Поэтому все еще общим убеждением специалистов в области иммунологии опухолей является то, что наилучшим способом элиминации опухолей была бы индукция сильного специфичного противоопухолевого CTL-ответа. Кроме того факта, что эти обработки обычно очень дороги и трудны для выполнения,также оказалось, что трудно получить хороший иммунный ответ по отношению к опухоли, так как многие ассоциированные с опухолями антигены являются истинными аутологичными белками, к которым большинство Т - клеток оказывается толерантным. Поэтому, по-видимому,необходимо индуцировать контролируемое клеточное аутоиммунное состояние у пациентов. Целью данного изобретения является предоставление улучшенных способов и агентов индукции иммунных ответов в организме хозяина против нежелательных антигенов, например, опухолевых антигенов. Кроме того, целью является предоставление способа получения аналогов полипептидов таких нежелательных антигенов, аналогов, которые способны индуцировать эффективный иммунный ответ против нежелательного антигена. 6 Безусловно считалось, что представление антигенов осуществляется двумя отдельными путями, экзогенным путем класса II и эндогенным путем класса I. Коротко, чужеродный белок с внешней стороны клетки или с клеточной мембраны захватывается АРС (антиген-представляющей клеткой) в виде эндосомы, которая сливается с внутриклеточным компартментом, который содержит протеолитические ферменты и молекулы МНС класса II. Некоторые из полученных пептидов связываются с молекулами класса II,которые затем перемещаются к клеточной мембране. Эндогенный путь класса I характеризуется преобладающим представлением цитозольных белков. Предположительно это происходит путем опосредованного протеасомой расщепления с последующей транспортировкой пептидов в эндоплазматический ретикулум (ЭР) с помощью ТАР - молекул, локализованных в мембране ЭР. В ЭР пептиды связываются с классом I, после чего транспортируются к плазматической мембране. Однако эти 2 пути не полностью разделены. Например, известно, что дендритные клетки и в некоторой степени макрофаги способны к эндоцитозу (пиноцитозу) внеклеточных белков и последующему их представлению в контексте МНС класса I. Также ранее показано, что при использовании специальных путей введения,например, путем связывания с шариками оксида железа, экзогенные антигены способны вступать в путь класса I (Rock, 1996). Этот механизм, повидимому, основной, вследствие важности сопутствующей экспрессии обоих классов - классаI и класса II - в одной и той же АРС для установления кластера трех клеточных типов. Этот кластер взаимодействия трех типов клеток был предложен Mitchison (1987) и позднее другими авторами. Они показали важность сопутствующего представления эпитопов класса I и классаII на одной и той же АРС. Согласно недавно описанному механизму активации CTL (см.et al., 1998, J. Immunol 161: 2094), профессиональные АРС, представляющие антиген на МНС класса II, узнаются Т-хелперными клетками. Результатом этого является активация АРСCD40L на Т-хелперной клетке и CD40 на АРС). Это дает возможность АРС непосредственно стимулировать CTL, которые при этом активируются. См. также фиг. 2. Ранее было показано, что инсерция чужеродного ограниченного по МНС класса II эпитопа Т-хелперных клеток в аутоантиген придает антигену способность индуцировать сильный 7 гуморальный ответ с образованием перекрестно реагирующих антител, направленных против не модифицированного аутоантигена (смотри заявку заявителей WO 95/05849). Показано, что индукция аутоантител вызывается благодаря специфичной помощи Т-клеток, индуцированной встроенным чужеродным эпитопом. Однако авторы пришли к заключению, что модифицированные аутоантигены - с помощью соответствующих адъювантов - также должны обладать способностью индуцировать сильныеCTL-ответы, направленные против аутоэпитопов, ограниченных по МНС класса I, и поэтому технология, описанная в WO 95/05849, также может быть адаптирована для обеспечения вакцинации против внутриклеточных и других ассоциированных с клетками антигенов, которые имеют эпитопы, представляемые в контексте МНС класса I. Технология аутовакцин, описанная в WO 95/05849, оказывает такое действие, при котором аутореактивным В-клеткам предоставляется специфичная помощь Т-клеток, когда вводится модифицированный аутоантиген для поглощения и введения в путь процессинга антигена МНС класса II (см. фиг. 1 и Dalum I et al., 1996,J. Immunol. 157: 4796-4804, а также Dalum I etal., 1999, Nature Biotechnol. 17: 666-669). Показано, что потенциально аутореактивные Влимфоциты, узнающие аутологичные белки,присутствуют у людей при физиологической норме. Однако чтобы в действительности индуцировать эти В-лимфоциты к продукции антител, реагирующих с соответствующими аутологичными белками, необходима помощь продуцирующих цитокины Т-хелперных лимфоцитов(Тн-клеток или Тн-лимфоцитов). В норме эта помощь не предоставляется, поскольку Тлимфоциты в общем не распознают эпитопы Тклеток, полученные из аутологичных белков, в случае представления антигенпредставляющими клетками (АРС). Однако в результате обеспечения элемента чужеродности в аутологичном белке (т.е. в результате введения иммунологически значимой модификации) Т-клетки, узнающие чужеродный элемент, активируются при узнавании чужеродного эпитопа на АРС(такой, как мононуклеарная клетка первоначально). Поликлональные В-лимфоциты (которые представляют эпитопы Т-клеток), способные узнавать аутоэпитопы на модифицированном аутологичном белке, также усваивают антиген и затем представляют его чужеродный Тклеточный эпитоп(пы), и затем активированные Т-лимфоциты предоставляют помощь в виде цитокинов этим аутореактивным поликлональным В-лимфоцитам. Так как антитела, продуцируемые этими поликлональными Влимфоцитами, реагируют с различными эпитопами на модифицированном полипептиде,включая и те, которые также имеются в нативном полипептиде, индуцируется антитело, пере 003634 8 крестно реагирующее с немодифицированным аутологичным белком. В заключение, Тлимфоциты могут быть приведены к такому действию, как будто популяция поликлональных В-лимфоцитов узнала полностью чужеродный антиген, тогда как в действительности только встроенный эпитоп(пы) является/являются чужеродным(и) по отношению к хозяину. Таким образом, индуцируются антитела, способные перекрестно реагировать с немодифицированными аутоантигенами. Как указано выше, CTL также требуют специфичной Т-клеточной помощи, хотя механизм этой помощи еще не выяснен. Данное изобретение основано на новой теории авторов о том, что аутологичные белки,содержащие чужеродные эпитопы МНС классаII, после экзогенного поглощения, могут получить доступ в путь процессинга антигена МНС класса I, например, макрофагов или дендритных клеток. Таким образом, может быть индуцирован сильный CTL-ответ, направленный против субдоминантных эпитопов в аутологичном белке. В альтернативном случае гены, кодирующие модифицированные опухолевые антигены, могут быть введены в виде вакцин на основе нуклеиновых кислот, в конечном счете, также приводящим к иммунным ответам, опосредуемым молекулами МНС класса II, а также МНС классаI. Опухолевые клетки являются очень слабыми антиген-представляющими клетками вследствие недостаточной экспрессии МНС класса I, отсутствия костимулирующих молекул или секреции иммуносупрессирующих цитокинов и т.д. Используя конструкции аутовакцин и протокол вакцинации, указанный выше, модифицированный опухолевый антиген может быть представлен молекулами МНС класса I, а также молекулами МНС класса II на профессиональных антигенпредставляющих клетках. Совместное представление субдоминантных аутоэпитопов на молекулах МНС класса I и иммунодоминантных чужеродных эпитопов на молекулах МНС класса II будет опосредовать прямую помощь цитокинами активированных Тхелперных клеток, ограниченных по молекулам МНС класса II, CTL-клеткам, ограниченным по МНС класса I (фиг. 2). По мнению авторов, это приведет к специфичному нарушению Тклеточной аутотолерантности к опухолевому антигену, а это именно то, что необходимо при иммунотерапии рака. В заключение, вакцина, созданная с применением технологии, схематично указанной выше, будет индуцировать гуморальный ответ на основе выработки аутоантител со вторичной активацией комплемента и зависимой от антител клеточной цитотоксической (ADCC) активности. Также ожидается, что она будет индуцировать цитотоксический Т-клеточный ответ, 9 направленный, например, против специфичного для опухоли мембранного антигена. Поэтому в наиболее широких и наиболее общих рамках данное изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа против полипептидного антигена у животного,включая человека, при этом указанный полипептидный антиген является слабо иммуногенным или не иммуногенным у животных, способу, включающему в себя осуществление одновременного представления антиген-представляющими клетками (АРС) иммунной системы животного иммуногенно эффективного количества 1) по меньшей мере, одного CTL-эпитопа,полученного из полипептидного антигена,и/или, по меньшей мере, одного В-клеточного эпитопа, полученного из ассоциированного с клетками полипептидного антигена, и 2) по меньшей мере, одного первого эпитопа Т-хелперных клеток (Тн-эпитоп), который является чужеродным по отношению к животному. В более конкретном варианте способа изобретения, изобретение относится к способу подавления ассоциированного с клетками полипептидного антигена у животных, включая человека, при этом указанный полипептидный антиген является слабо иммуногенным или не иммуногенным у животного, путем индуцирования специфичного ответа цитотоксических Тлимфоцитов (CTL), направленного против клеток, несущих на своей поверхности ассоциированный с клетками полипептидный антиген, или скрывающих ассоциированный с клетками полипептидный антиген во внутриклеточном компартменте, способу, включающему в себя осуществление у животного одновременного представления соответствующими антигенпредставляющими клетками (АРС) 1) по меньшей мере, одного CTL-эпитопа,полученного из ассоциированного с клетками полипептидного антигена, и 2) по меньшей мере, одного первого эпитопа Т-хелперных лимфоцитов (Тн), который является чужеродным по отношению к животному. Также частью изобретения является новая стратегия получения иммуногенного агента. Эта новая стратегия охватывает селекцию и получение аналогов слабых ассоциированных с клетками антигенов, причем целью является сохранение существенной фракции известных и предсказанных CTL-эпитопов, несмотря на то, что в то же самое время вводится, по меньшей мере,один чужеродный Тн-эпитоп. Кроме того, изобретение относится к определенным специфичным иммуногенным конструкциям, основанным на известных ассоциированных с опухолями антигенах, а также к композициям, содержащим эти конструкции. 10 Наконец, изобретение относится к фрагментам нуклеиновых кислот, векторам, трансформированным клеткам и другим средствам,используемым в молекулярно-биологических методах, для получения аналогов ассоциированных с опухолями антигенов. Подписи к фигурам Фиг. 1. Концепция традиционной технологии аутовакцинации (AutoVac). А: толеродоминантные аутоэпитопы, представленные на МНС класса II на антигенпредставляющей клетке(АРС), игнорируются вследствие уменьшения репертуара Т-хелперных клеток (Тh) (Тхелперная клетка показана пунктирной линией). Встроенные чужеродные иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы, представленные на МНС класса II, активируют Т-хелперные клетки, и благодаря помощи цитокинов, представляемых Т-хелперной клеткой, активируются В-клетки,специфичные для нативных частей аутологичного белка, представляющего чужеродные иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы на МНС класса II. Фиг. 2. Концепция AutoVac индукцииCTL-ответа. Встроенные чужеродные иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы, представленные на МНС класса II, активируют Тхелперные клетки. CTL, узнающие субдоминантные аутоэпитопы, представленные на МНС класса I, активируются расположенной рядом Тхелперной клеткой. Фиг. 3. Схематичное представление полипептида Неr2 с указаниями районов эпитопов и сайтов N-гликозилирования. Показаны 4 внеклеточных домена, трансмембранный (ТМ) домен и 2 внутриклеточных домена с указаниями сайтов с варьирующей степенью гомологии и сайтов, содержащих предполагаемые/определенные эпитопы CTL. Фиг. 4. Схематичное представление полипептида PSM человека с указаниями районов инсерций эпитопов Р 2 и Р 30. Фиг. 5. FGF-гены и белки. А: экзонинтронная структура генов GFG8 человека и мыши. Ниже показаны восемь различных форм сплайсинга (из Gemel 1996). В: Аминокислотная последовательность различных изоформ FGF8. Полипептидные участки, уникальные дляFGF8b, FGF8f и FGF8e, указаны жирным шрифтом и курсивом или подчеркнуты. FGF8a является самым коротким вариантом, не содержащим ни одной из этих выделенных последовательностей. Сигнальный пептид предположительно расщепляется с С-концевой стороны Аlа 22. Два цистеиновых остатка, обнаруженные в зрелом FGF8 (все изоформы), указаны жирной чертой. Два потенциальных сайта N-гликозилирования FGF8b указаны . Нумерация согласноFGF8b. Фиг. 6. Иллюстрации четырех различных вариантов FGF8b, предназначенных для вакцинации. Верхняя панель: Теоретические модели 11 точек встраивания эпитопов с использованием в качестве матрицы кристаллической структурыFGF2. Нижняя панель: Аминокислотные последовательности FGF8b дикого типа (ДТ) и четырех вариантов F30N, F2I, F30I и F2C. Сигнальный пептид отмечен подчеркиванием одной чертой. Встроенные пептиды отмечены подчеркиванием двойной чертой. N-концевая последовательность (MetAla) всех вариантов обусловлена созданием последовательности Козака(Kozak 1991) для лучшей трансляции в эукариотических системах. Далее будет дано определение и детальное объяснение некоторых терминов, используемых в данном описании и формуле изобретения,чтобы разъяснить границы и пределы изобретения. Термин ассоциированный с клеткой полипептидный антиген в данном описании и формуле изобретения предназначен для обозначения полипептида, который ограничивается клеткой, которая имеет какое-либо отношение к патологическому процессу. Кроме того, клетка представляет на своей поверхности CTLэпитопы полипептидного антигена, связанного с молекулами МНС класса I. Поэтому ассоциированные с клетками полипептидные антигены могут быть настоящими внутриклеточными антигенами (и в связи с этим недостижимы для гуморального иммунного ответа) или антигенами, связанными с поверхностью клеток. Ассоциированный с клеткой антиген может быть продуктом собственной генной экспрессии клетки, внутриклеточного паразита, вируса или другой клетки. В последнем случае полипептидный антиген позже связывается с клеткой,которая вовлечена в патологический процесс. Термины Т-лимфоцит и Т-клетка будут взаимозаменяемо использоваться для лимфоцитов тимусного происхождения, которые ответственны за различные опосредуемые клетками иммунные ответы, а также за эффекторные функции, такие как хелперная активность в гуморальном иммунном ответе. Подобным образом термины В-лимфоцит и В-клетка будут взаимозаменяемо использоваться в отношении лимфоцитов, продуцирующих антитела. Антигенпредставляющей клеткой (АРС) является клетка, которая представляет эпитопы Т-клеткам. Типичными антиген-представляющими клетками являются макрофаги, дендритные клетки и другие фагоцитирующие и пиноцитирующие клетки. Следует отметить, что Вклетки также функционируют как АРС посредством представления Тн-клеткам эпитопов Тн,связанных с молекулами МНС класса II, но когда термин АРС используется в общем смысле в данной спецификации и формуле изобретения,подразумевается, что он относится к указанным выше фагоцитирующим и пиноцитирующим клеткам. 12 Хелперные Т-лимфоциты или Тнклетки означают CD4-позитивные Т-клетки,которые обеспечивают помощь В-клеткам и цитотоксическим Т-клеткам посредством узнавания Тн-эпитопов, связанных с молекулами МНС класса II на антигенпредставляющих клетках. Термин цитотоксические Т-лимфоциты(CTL) будет использоваться для CD8 позитивных Т-клеток, которые нуждаются в помощи Тн-клеток, чтобы стать активированными. Специфичный иммунный ответ в данном контексте предназначен для обозначения поликлонального иммунного ответа, преимущественно направленного против молекулы или группы квазиидентичных молекул, или - в альтернативном случае, против клеток, которые представляют CTL-эпитопы молекулы или группы квазиидентичных молекул. Термин слабый или не иммуногенный полипептидный антиген предназначен здесь для обозначения полипептидов, имеющих аминокислотную последовательность слабых ассоциированных с клетками белковых антигенов,полученных от данного животного (например,человека), а также этот термин охватывает полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, идентичную аналогам таких белков, выделенным из других видов. В границы этого термина также включены формы полипептидов, обладающих различным характером гликозилирования из-за того, что они продуцируются в гетерологичных системах (например, в дрожжевых или других, отличных от млекопитающих эукариотических системах экспрессии или даже в прокариотических системах). Однако следует отметить, что в случае использования этого термина подразумевается,что полипептид, о котором идет речь, обычно является не иммуногенным или только слабо иммуногенным при его естественной локализации в животном, которое подвергается лечению. Подразумевается, что термин полипептид в данном контексте означает как короткие пептиды от 2 до 10 аминокислотных остатков,олигопептиды от 11 до 100 аминокислотных остатков, так и полипептиды длиной более чем 100 аминокислотных остатков. Кроме того, также подразумевается, что термин включает в себя белки, т.е. функциональные биомолекулы,содержащие, по меньшей мере, один полипептид; в случае, когда они содержат, по меньшей мере, два полипептида, эти полипептиды могут формировать комплексы, быть ковалентно связанными или могут быть нековалентно связаны. Полипептид(ды) в белке может быть гликозилирован и/или связан с липидом и/или содержать простетические группы. Термин последовательность означает любой последовательный участок, по меньшей мере, из 3 аминокислот или, в соответствующем 13 случае, по меньшей мере, из 3 нуклеотидов, полученный непосредственно из аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты природного происхождения, соответственно. Термин животное в данном контексте в общем предназначен для обозначения вида животного (предпочтительно млекопитающего),такого как Homo sapiens, Canis domesticus, и т.д.,а не только к одному единственному животному. Однако термин также означает популяцию такого вида животного, так как важно, чтобы все индивидуумы, иммунизированные в соответствии со способом изобретения, в основном имели один и тот же слабый, ассоциированный с клетками полипептидный антиген, давая возможность иммунизировать животных одним и тем же иммуногеном(нами). Если, например, в различных популяциях человека существуют генетические варианты полипептидов, может потребоваться использование различных иммуногенов в этих различных популяциях для того,чтобы можно было нарушить аутотолерантность к слабому, ассоциированному с клетками полипептидному антигену в каждой популяции. Под термином подавление ассоциированного с клетками полипептидного антигена здесь подразумевается уменьшение в живом организме количества и/или активности данного антигена. Подавление может быть достигнуто посредством нескольких механизмов: среди них наиболее простым является простое вмешательство в активный сайт антигена путем связывания с антителом. Однако в рамки данного изобретения также включено и то, что связывание с антителами в результате приводит к удалению полипептида поглощающими клетками (такими как макрофаги и другие фагоцитирующие клетки), и даже более важно, что у животного клетки, несущие или содержащие внутри антиген,убиваются CTL. Выражение эффективное одновременное представление соответствующими АРС предназначено для того, чтобы показать, что иммунная система животного контролируемым образом подвергается иммуногенной стимуляции,которая приводит к одновременному представлению рассматриваемых эпитопов клетками АРС. Как будет ясно из приведенного ниже сообщения, такая стимуляция иммунной системы может осуществляться несколькими способами,из которых наиболее важными являются вакцинация содержащими полипептиды фармакцинами (т.е., вакцина, которая вводится для лечения или улучшения состояния при текущем заболевании) или вакцинация фармакциной на основе нуклеиновой кислоты. Важным достигаемым при этом результатом является то, что иммунокомпетентные клетки у животного встречаются с АРС, представляющими соответствующие эпитопы иммунологически эффективным образом. 14 Термин иммуногенно эффективное количество имеет свое обычное в данной области значение, т.е. количество иммуногена, которое способно индуцировать иммунный ответ, который в значительной степени затрагивает патогенные агенты, которые обладают общими с иммуногеном иммунологическими свойствами. В том случае, когда здесь используется выражение, что слабый ассоциированный с клетками полипептидный антиген подвергали модификации, это означает химическую модификацию полипептида, которая создает основу данного полипептида. Такой модификацией может быть, например, дериватизация (например, алкилирование) определенных аминокислотных остатков в последовательности аминокислот, но, как будет понятно из приведенного ниже изложения, предпочтительные модификации охватывают изменения первичной структуры аминокислотной последовательности. При обсуждении толерантности и аутотолерантности имеется в виду, что, так как полипептиды, являющиеся мишенями способа данного изобретения, представляют собой аутологичные белки в вакцинируемой популяции,или белки, которые не приводят к индукции эффективного иммунного ответа, у нормальных представителей популяции не вырабатывается иммунный ответ против полипептида. Однако нельзя исключать, что редкие представители в популяции животных могут быть способны продуцировать антитела против нативного полипептидного антигена, например, как часть процесса аутоиммунного заболевания. Во всяком случае, в норме животное будет аутотолерантным только к своему собственному полипептидному антигену, но нельзя исключать, что к аналогам, полученным из других видов животных, или из популяции, имеющей другой фенотип, указанное животное будет также толерантным. Чужеродным Т-клеточным эпитопом является пептид, который способен связываться с молекулой МНС и стимулирует Т-клетки у данного вида животных. Предпочтительными чужеродными эпитопами являются неразборчивые ("promiscuous") эпитопы, т.е. эпитопы, которые связываются с большой фракцией молекул МНС класса II у какого-либо вида животного или популяции. Известно только очень ограниченное количество таких неразборчивых Тклеточных эпитопов, и они будут детально обсуждаться ниже. Следует отметить, что для того, чтобы иммуногены, которые используются согласно данному изобретению, были эффективными в как можно большей части популяции животных, может быть необходимо 1) встроить несколько чужеродных Т-клеточных эпитопов в один и тот же аналог, или 2) получить несколько аналогов, среди которых каждый аналог имеет отличный от других неразборчивый встроенный эпитоп. Следует отметить, что концепция 15 чужеродных Т-клеточных эпитопов также охватывает применение криптических Т-клеточных эпитопов, т.е. эпитопов, которые получены из аутологичного белка и которые проявляют иммуногенные свойства только когда существуют в изолированной форме, а не как часть аутологичного белка, о котором идет речь. Чужеродным эпитопом Т-хелперных лимфоцитов (чужеродный Тн-эпитоп) является чужеродный Т-клеточный эпитоп, который связывается с молекулой МНС класса II и может быть представлен на поверхности антигенпредставляющей клетки (АРС) связанным с молекулой класса II МНС. СТL-эпитопом является пептид, который способен связываться с молекулой класса I МНС. Термин функциональная часть(био)молекулы в данном контексте предназначен для обозначения части молекулы, которая ответственна, по меньшей мере, за один биохимический или физиологический эффект, вызываемый молекулой. В данной области хорошо известно, что многие ферменты и другие эффекторные молекулы имеют активный сайт, который отвечает за эффекты, вызываемые данной молекулой. Другие части молекулы могут служить для целей стабильности или увеличения растворимости, и поэтому могут быть исключены, если эти цели не существенны в контексте определенного варианта данного изобретения. Например, можно использовать некоторые цитокины в качестве модифицирующего фрагмента в аналоге (см. детальное обсуждение ниже), и в таком случае проблема стабильности может быть несущественной, так как связь с аналогом обеспечивает необходимую стабильность. Термин адъювант имеет свое обычное в области технологии вакцин значение, т.е. вещество или композиция вещества, которое 1) само по себе не способно служить основанием для специфичного иммунного ответа против иммуногена вакцины, но которое 2) тем не менее,способно усиливать иммунный ответ против иммуногена. Или, другими словами, вакцинация одним адъювантом не обеспечивает иммунный ответ против иммуногена, вакцинация иммуногеном может давать или может не давать выработку иммунного ответа против иммуногена, а комбинированная вакцинация иммуногеном и адъювантом индуцирует иммунный ответ против иммуногена, который является более сильным, чем иммунный ответ, индуцированный одним иммуногеном. Термин таргетирование молекулы в данном контексте предназначен для обозначения ситуации, когда молекула при введении в животное предпочтительно будет появляться в определенной ткани(нях) или предпочтительно будет связана с определенными клетками или типами клеток. Этот эффект может достигаться несколькими путями, включая введение моле 003634 16 кулы в состав композиции, способствующей направлению в мишень (таргетированию), или путем введения в молекулу групп, которые способствуют направлению в мишень (таргетированию). Эти вопросы будут детально обсуждаться ниже. Стимуляция иммунного ответа означает,что вещество или композиция веществ проявляет общий неспецифичный иммуностимулирующий эффект. Ряд адъювантов и предполагаемых адъювантов (таких как некоторые цитокины) обладают способностью совместно стимулировать иммунную систему. Результатом применения иммуностимулирующего агента является увеличенная готовность иммунной системы,означающая, что одновременная или последовательная иммунизация иммуногеном индуцирует значительно более эффективный иммунный ответ по сравнению с отдельным применением иммуногена. Предпочтительные варианты Чтобы индуцировать ответ CTL против клетки, которая представляет на своей поверхности эпитопы, полученные из полипептидного антигена, обычно необходимо, чтобы в случае представления, по меньшей мере, один CTLэпитоп ассоциировался с молекулой класса I МНС на поверхности АРС. Кроме того, предпочтительно, чтобы в случае представления, по меньшей мере, один первый чужеродный эпитоп Тн ассоциировался с молекулой класса II МНС на поверхности АРС. Предпочтительными АРС, представляющими эпитопы, являются дендритные клетки и макрофаги, но любая пино- и фагоцитирующая АРС-клетка, которая способна к одновременному представлению 1) CTL-эпитопов, связанных с молекулами класса I МНС, и 2) Тн-эпитопов,связанных молекулами класса II МНС, является согласно данному изобретению предпочтительной АРС. Согласно изобретению ассоциированный с клеткой полипептидный антиген предпочтительно выбирается из ассоциированных с опухолями антигенов и других аутологичных белков, которые связаны с патологическими процессами, а также вирусных антигенов и антигенов, полученных из внутриклеточных паразитов или бактерий. В данной области хорошо известно, что такие ассоциированные с патогенами антигены часто оказываются относительно слабыми иммуногенами (например, антигены таких микобактерий, как Mycobacterium tuberculosis иMycobacterium leprae, а также таких простейших как Plasmodium spp.). Предполагается, что способ изобретения кроме предоставления возможности продукции антител и CTL-ответов против антигенов настоящих аутологичных белков, способен усиливать часто недостаточный иммунный ответ, вырабатываемый организмом против таких внутриклеточных антигенов. 17 Обычно преимуществами будет обладать предоставление иммунной системе большей части аминокислотной последовательности полипептидного антигена, который является мишенью вакцины. Поэтому в предпочтительном варианте представление АРС-клеткой CTLэпитопа и первого чужеродного Тн-эпитопа осуществляется путем представления иммунной системе животного, по меньшей мере, одного первого аналога ассоциированного с клетками полипептидного антигена, при этом указанный первый аналог содержит вариант аминокислотной последовательности ассоциированного с клетками полипептидного антигена, указанный вариант содержит, по меньшей мере, CTLэпитоп и первый чужеродный Тн-эпитоп. Это противоположно, например, стратегии вакцинации ДНК, при которой CTL- и Тн-эпитопы экспрессируются в одной и той же клетке, но как части отдельных полипептидов; такая стратегия ДНК вакцинации также является вариантом изобретения, но предполагается, что наличие двух эпитопов в виде части одного и того же полипептида, как правило, будет усиливать иммунный ответ, и, по крайней мере, будет необходимо предоставление только одного продукта экспрессии. Чтобы максимально увеличить изменения выработки эффективного иммунного ответа,предпочтительно, чтобы указанный выше первый аналог содержал большую часть известных и предполагаемых CTL-эпитопов ассоциированного с клетками полипептидного антигена,т.е. часть известных и предполагаемых CTLэпитопов, которые связываются с достаточно большим количеством фракций молекул классаI МНС в популяции. Например, предпочтительно, чтобы большая часть известных и предполагаемых CTL-эпитопов в аминокислотной последовательности аналога узнавались, по меньшей мере, 50% гаплотипов МНС-I, узнающих все известные и предполагаемые CTL-эпитопы в ассоциированном с клетками полипептидном антигене, но предпочтительными являются большие проценты, такие как, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80 и по меньшей мере 90%. Особенно предпочтительным является применение аналогов, когда в аналоге сохраняются, по существу, все известные CTL-эпитопы ассоциированного с клетками полипептидного антигена, т.е. близко к 100% известных CTL-эпитопов. Соответственно, также особенно предпочтительно, чтобы в основном все предсказанные CTL-эпитопы ассоциированного с клетками полипептидного антигена присутствовали, по меньшей мере, в первом аналоге. Способы предсказания присутствия CTLэпитопов хорошо известны в данной области,см, например, Rothbard et al., EMBO J. 7: 93-100 18 Как будет ясно из данной спецификации и формулы изобретения, ожидается, что описанный здесь способ изобретения предоставит возможность для эффективной индукции CTLответов против ассоциированных с клетками полипептидных антигенов. В случае, когда ассоциированный с клетками полипептидный антиген является действительно внутриклеточным, индукция CTL-ответа против клеток, содержащих антиген внутри клеток, является только способом достичь его подавления специфичными иммунологическими способами. Однако в случае мембраносвязанных антигенов преимуществами обладает индукция гуморального ответа против слабого ассоциированного с клетками полипептидного антигена. Однако когда вырабатывается гуморальный иммунный ответ против слабого ассоциированного с клетками антигена, предпочтительно в значительной степени ограничить гуморальный ответ взаимодействием с частями антигена, которые обычно подвергаются возможному взаимодействию с антителами. В противном случае наиболее вероятным результатом будет индукция гуморального ответа против частей антигена, которые обычно не затрагиваются гуморальной иммунной системой, и это в свою очередь увеличит риск индукции перекрестной реакции с антигенами, не связанными с какой-либо патологией. Одним из прекрасных способов получения такого ограничения является выполнение вакцинации на основе нуклеиновых кислот аналогом слабого ассоциированного с клетками антигена, при которой его внеклеточная часть либо не изменена, либо включает в себя Тн-эпитоп, который незначительно изменяет трехмерную структуру внеклеточной части антигена. В качестве возможной альтернативы может быть выполнена иммунизация обоими иммуногенами иммуногеном, направленным наCTL, и иммуногеном, направленным на Вклетки, причем иммуноген, направленный на Вклетки, реально не способен осуществлять иммунизацию против внутриклеточной части антигена мишени (в иммуногене, направленном на В-клетку, мог бы, например, отсутствовать какой-либо невнеклеточный материал антигена). Индукция гуморальных ответов может быть достигнута рядом способов, известных специалисту в данной области. Например, по меньшей мере, один первый аналог может содержать часть, состоящую из модификации структуры ассоциированного с клетками полипептидного антигена, при этом результатом указанной модификации является то, что иммунизация животного первым аналогом индуцирует у животного продукцию антител против ассоциированного с клетками полипептидного антигена - этот вариант, как указано выше, является наиболее пригоден для вакцинации на основе нуклеиновой кислоты. В альтернативном случае способ изобретения может затрагивать осуще 19 ствление представления иммунной системе животного иммуногенно эффективного количества, по меньшей мере, одного второго аналога ассоциированного с клетками полипептидного антигена, который содержит такую модификацию. Подходящим способом достижения того,чтобы модификация оказывала требуемое действие на индукцию антител, является включение, по меньшей мере, одного второго чужеродного Тн-эпитопа во второй аналог, т.е. стратегия,подобная стратегии, используемой для первого аналога. В том случае, когда также желательно вызвать эффективный гуморальный иммунный ответ, предпочтительно, чтобы первый и/или второй аналог(ги) содержал(ли) значительную часть В-клеточных эпитопов ассоциированного с клетками полипептидного антигена, особенно значительную часть таких В-клеточных эпитопов, которые являются внеклеточными в форме антигена природного происхождения в подходящем животном. Обсуждавшиеся выше варианты и модификации слабого ассоциированного с клетками полипептидного антигена могут принимать различные формы. Предпочтительно, чтобы вариант и/или модификация включала в себя аминокислотную замену, и/или делецию, и/или инсерцию, и/или присоединение. Эти основные операции, имеющие отношение к манипулированию аминокислотной последовательностью,предназначены для того, чтобы охватить единичные изменения аминокислот, а также операции, затрагивающие участки аминокислот (т.е. перестановка аминокислотных участков в пределах полипептидного антигена; это представляет особый интерес, когда антиген является настоящим внутриклеточным антигеном, так как существенны только вопросы, касающиеся сохранения CTL-эпитопов). Будет понятно, что введение, например, одной инсерции или делеции единственной аминокислоты может вызывать появление чужеродного Тн-эпитопа в последовательности аналога, т.е. появление последовательности связывающей молекулу класса II МНС. Однако в большинстве случаев предпочтительно (и даже необходимо) вводить известный чужеродный Тн-эпитоп, и такая операция будет требовать замены кислоты и/или инсерции (или иногда присоединения, либо в виде конъюгации с белком носителем, либо в виде предоставления гибридного полипептида посредством методов молекулярной биологии). Предпочтительно, чтобы количество аминокислотных инсерции, делеции, замен или присоединений было, по меньшей мере, 2, а именно 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20 и 25 инсерции, замен, присоединений или делеции. Кроме того, предпочтительно, чтобы количество аминокислотных замен не превышало 150, а именно самое большое 100, самое большое 90, самое большое 80 и самое большое 20 70. Особенно предпочтительно, чтобы количество замен, инсерции, делеции или присоединений не превышало 60, и в частности количество не должно превышать 50 или даже 40. Наиболее предпочтительным является количество не более чем 30. Предпочтительные варианты изобретения включают в себя модификацию путем введения,по меньшей мере, одного чужеродного иммунодоминантного Тн-эпитопа. Будет понятно, что вопрос иммунного доминирования Т-клеточного эпитопа зависит от вида животного, о котором идет речь. В используемом здесь смысле термин иммунодоминирование относится только к эпитопам, которые вызывают у вакцинируемого представителя/популяции значительный иммунный ответ, но хорошо известным фактом является то, что Т-клеточный эпитоп,который является иммунодоминантным у одного представителя, не обязательно является иммунодоминантным у другого представителя этого же вида, даже несмотря на то, что у последнего представителя он может быть способен к связыванию с молекулами MHC-II. Настоящими иммунодоминантными Тн-эпитопами являются эпитопы, которые, независимо от полипептида, в котором они формируют субпоследовательность, вызывают активацию Тнклеток - другими словами, некоторые Тнэпитопы обладают, в качестве существенной особенности, свойством, почти никогда не быть криптическими, так как они почти всегда процессируются АРС и представляются в контексте молекулы МНС II на поверхности АРС. Другим важным вопросом является проблема МНС ограничения Т-клеточных эпитопов. В общем, Т-клеточные эпитопы природного происхождения ограничены по МНС, т.е. определенные пептиды, составляющие Тклеточный эпитоп, будут эффективно связываться только с подгруппой молекул МНС класса II. Это, в свою очередь, оказывает действие,результатом которого в большинстве случаев применения одного специфичного Т-клеточного эпитопа будет компонент вакцины, который эффективен только в части популяции, и, в зависимости от размера этой части, может быть необходимо включение дополнительных Тклеточных эпитопов в ту же самую молекулу,или в альтернативном случае приготовление мультикомпонентной вакцины, в которой компонентами являются варианты антигена, которые отличаются друг от друга природой введенного Т-клеточного эпитопа. Если ограничение по МНС используемых Т-клеток совсем не известно (например, в ситуации, когда вакцинируемое животное имеет недостаточно определенную композицию МНС), часть популяции, на которую распространяется действие композиции вакцины, может быть определена с помощью следующей формулы где pi означает частоту встречаемости в популяции организмов, отвечающих на iый чужеродный Т-клеточный эпитоп, представленный в композиции вакцины, и n означает общее количество чужеродных Т-клеточных эпитопов в композиции вакцины. Таким образом, композиция вакцины, содержащая 3 чужеродных Т-клеточных эпитопа, дающих частоты ответов в популяции 0,8; 0,7 и 0,6, соответственно, будет давать 1 - 0,2 х 0,3 х 0,4 = 0,976 т.е. статистически 97,6 процентов популяции будет вырабатывать ответ на вакцину, опосредованный MHC-II. Указанная выше формула не применяется в ситуации, когда известен более или менее точный характер ограничения используемых пептидов по МНС. Например, если определенный пептид связывается только с молекуламиMHC-II человека, кодируемыми HLA-DRаллелями DR1, DR3, DR5 и DR7, то применение этого пептида вместе с другим пептидом, который связывается с оставшимися молекуламиMHC-II, кодируемыми HLA-DR-аллелями, позволит достичь 100% охвата данной популяции. Также если второй пептид связывает толькоDR3 и DR5, то добавление этого пептида совсем не увеличит сферу действия. Если основывать расчет ответа популяции только на ограничении по МНС Т-клеточных эпитопов в вакцине, то часть популяции, охватываемая специфичной композицией вакцины, может быть определена с помощью следующей формулы: где j означает сумму частот в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС, которые связывают какой-нибудь один из Т-клеточных эпитопов в вакцине и которые относятся к jому из 3 известных HLA-локусов (DP,DR и DQ); на практике сначала определяется,какие молекулы МНС будут узнавать каждый из Т-клеточных эпитопов в вакцине, и после этого они вносятся в список по типам (DP, DR и DQ) затем индивидуальные частоты различных вошедших в список аллельных гаплотипов суммируются для каждого типа, давая 1, 2 и 3. Может случиться так, что значение pi в формуле II превысит соответствующее теоретическое значение i: где j означает сумму частот в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих молекулы МНС, которые связывают iый T-клеточный эпитоп в вакцине и которые относятся к jому из 3 известных HLA локусов (DP, DR и DQ). Это означает, что в 1 -i популяции частота отвечающих организмов fостаткаi = (pi -i)/(1 - i). Поэтому формула III может быть скорректирована так, чтобы получить формулу V: где член 1 - fостаткаi принимается за ноль, если он отрицателен. Следует отметить, что формула V требует, чтобы все эпитопы были картированы по гаплотипу против идентичных наборов гаплотипов. Поэтому при отборе Т-клеточных эпитопов для введения в аналог важно учитывать все сведения об эпитопах, которые являются доступными: 1) частоту в популяции организмов,отвечающих на каждый эпитоп, 2) данные об ограничении по МНС, и 3) частоту в популяции соответствующих гаплотипов. Существует некоторое количество неразборчивых Т-клеточных эпитопов природного происхождения, которые активны у большой части представителей вида животного или популяции животных, и они предпочтительно вводятся в вакцину, уменьшая при этом необходимость в большом количестве различных аналогов в одной и той же вакцине. Неразборчивым эпитопом согласно изобретению может быть Т-клеточный эпитоп человека природного происхождения, такой как эпитопы токсоида столбняка (например, эпитопы Р 2 и Р 30), токсоида дифтерии, гемагглютинина вируса гриппа, и антигена CS P.falciparum. За несколько лет был идентифицирован ряд других неразборчивых Т-клеточных эпитопов. Главным образом идентифицированы пептиды, способные к связыванию большой части молекул HLA-DR, кодируемых различнымиHLA-DR аллелями, и все они являются возможными Т-клеточными эпитопами для введения в аналоги, используемые согласно данному изобретению. См. также эпитопы, которые обсуждаются в следующих ссылках, которые все, таким образом, включены здесь в виде ссылки:WO 98/23635 (Frazer IH et al., права переданы Университету Квинсленда); Southwood S et. al,1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F. etet al., 1993, Cell 74: 197-203; и Falk К et al., 1994,Immunogenetics 39: 230-242. Последняя ссылка также связана HLA-DQ и -DP лигандами. Все эпитопы перечисленные в этих 5 ссылках являются подходящими кандидатами природных эпитопов для использования в данном изобретении, так как являются эпитопами, которые обладают общими мотивами с данными эпитопами. В альтернативном случае эпитопом может быть любой искусственный Т-клеточный эпитоп, который способен к связыванию большой части гаплотипов. В этом контексте пептидыDR-эпитопов, используемые при сортировке клеток (пэннинге) ("PADRE"), описанные в WO 95/07707 и в соответствующей статье AlexanderJ et al., 1994, Immunity 1: 751-761 (обе публика 23 ции включены здесь в виде ссылки), являются интересными кандидатами на эпитопы, используемые согласно данному изобретению. Следует отметить, что наиболее эффективные PADREпептиды, заявленные в этих документах, несутD-аминокислоты на С- и N-концах, для того,чтобы повысить стабильность при введении. Однако данное изобретение в основном направлено на включение соответствующих эпитопов в виде части модифицированного антигена, который к тому же должен быть впоследствии разрушен ферментами внутри лизосомного компартмента АРС, чтобы предоставить возможность для последующего представления в контексте молекулы MHC-II, и поэтому нецелесообразно включать D-аминокислоты в эпитопы, используемые в данном изобретении. Одним особенно предпочтительным PADRE пептидом является пептид, имеющий аминокислотную последовательность AKFVAAWTLKAAA,или ее иммунологически эффективная субпоследовательность. Этот и другие эпитопы, которые также не ограничены по МНС, являются предпочтительными Т-клеточными эпитопами,которые должны присутствовать в аналогах,используемых в способе изобретения. Такие супернеразборчивые эпитопы предоставят возможность для осуществления наиболее простых вариантов изобретения, в которых иммунной системе вакцинируемого животного представляется только один единственный аналог. Сущность обсуждаемого выше варианта/модификации предпочтительно состоит в том, что- по меньшей мере, один первый фрагмент включен в первый и/или второй аналог(ги), при этом указанный первый фрагмент осуществляет таргетирование аналога на антигенпредставляющую клетку (АРС), и/или- по меньшей мере, один второй фрагмент включен в первый и/или второй аналог(ги), при этом указанный второй фрагмент стимулирует иммунную систему, и/или- по меньшей мере, один третий фрагмент включен в первый и/или второй аналог(ги), при этом указанный третий фрагмент оптимизирует представление аналога иммунной системе. Функциональные и структурные особенности, касающиеся этих первого, второго и третьего фрагментов, будут обсуждаться в нижеследующем разделе. Они могут быть представлены в виде боковых групп, соединенных ковалентно или нековалентно с соответствующими химическими группами в аминокислотной последовательности ассоциированного с клетками полипептидного антигена, или в ее субпоследовательности. Это означает, что участки из аминокислотных остатков, полученные из полипептидного антигена, дериватизированы без изменения первичной аминокислотной последовательности или,по меньшей мере, без введения изменений в 24 пептидные связи между индивидуальными аминокислотами в цепи. Фрагменты также могут быть в виде партнеров в слиянии с аминокислотной последовательностью, полученной из ассоциированного с клетками полипептидного антигена. В этой связи следует отметить, что обе возможности включают в себя вариант конъюгирования аминокислотной последовательности с носителем,см. обсуждение этих возможностей ниже. Другими словами, в данном контексте термин слитый белок не ограничен только слитой конструкцией, полученной посредством экспрессии фрагмента ДНК, кодирующего конструкцию, но также относится к конъюгату между двумя белками, которые соединены посредством пептидной связи в ходе последующей химической реакции. Как указано выше, аналог также может включать в себя введение первого фрагмента,который таргетирует аналог на АРС или Влимфоцит. Например, первый фрагмент может быть специфичным партнером при связывании со специфичным поверхностным антигеном Влимфоцита или специфичным поверхностным антигеном АРС. В данной области известно много таких специфичных поверхностных антигенов. Например, фрагмент может быть углеводородом, для которого имеется рецептор на Влимфоците или АРС (например, маннан или манноза). В альтернативном случае второй фрагмент может быть гаптеном. Также в качестве первого фрагмента может быть использован фрагмент антитела, который специфично узнает поверхностную молекулу на АРС или лимфоцитах (поверхностной молекулой может быть, например, FC-рецептор макрофагов и моноцитов,такой как FCRI или, в альтернативном случае,любой другой специфичный поверхностный маркер, такой как CD40 или CTLA-4). Следует отметить, что все эти приведенные в качестве примеров таргетирующие молекулы могут использоваться как часть адъюванта, см. ниже.CD40 лиганд, антитела против CD40 или их варианты, которые связывают CD40, будут таргетировать аналог на дендритные клетки. В то же время недавние результаты показали, что взаимодействие с молекулой CD40 делает Тн-клетки несущественными для получения CTL-ответа. Поэтому предполагается, что общее применение молекул, связывающих CD40, в виде первого фрагмента (или в виде адъюванта, см. ниже) будет значительно усиливать CTL-ответ; по сути, применение таких СВ 40-связывающих молекул в качестве адъювантов и первых фрагментов в значении данного изобретения по праву считается изобретением. В качестве альтернативы или дополнения к таргетированию аналога на определенный тип клеток, для того, чтобы достичь усиленного иммунного ответа, можно увеличить уровень реак 25 тивности иммунной системы за счет включения указанного выше второго фрагмента, который стимулирует иммунную систему. Типичными примерами таких вторых фрагментов являются цитокины, белки теплового шока и гормоны, а также их эффективные части. Пригодными для применения согласно изобретению цитокинами являются цитокины,которые в норме будут функционировать в композиции вакцины так же, как адъюванты, например, интерферон(INF-), лиганд Flt3(IL-2), интерлейкин 4 (IL-4), интерлейкин 6 (IL6), интерлейкин 12 (IL-12), интерлейкин 13 (IL13), интерлейкин 15 (IL-15) и колониестимулирующий фактор гранулоцитов - макрофагов(GM-CSF); в альтернативном случае достаточной в качестве второго фрагмента может быть функциональная часть молекулы цитокина. Что касается применения таких цитокинов как адъювантных веществ, см. обсуждение ниже. В альтернативном случае вторым фрагментом может быть токсин, такой как листериолицин (LLO), липид А и термолабильный энтеротоксин. Также интересными возможными вариантами являются несколько микобактериальных производных, таких как MDP (мурамилдипептид), CFA (полный адъювант Фрейнда) и сложные диэфиры трегалозы TDM и TDE. Согласно изобретению, пригодными белками теплового шока, используемыми в качестве второго фрагмента, могут быть HSP70,HSP90, HSC70, GRP94 и калретикулин (CRT). Также важным вариантом изобретения является возможный вариант введения третьего фрагмента, который усиливает представление аналога иммунной системе. В данной области было показано несколько примеров такого принципа. Например, известно, что липидизированный пальмитоилом якорь в белке OspABorrelia burgdorferi может быть использован для того, чтобы предоставить самоадъювантные полипептиды (см., например, WO 96/40718). Повидимому, липидизированные белки распределяются в мицелло-подобные структуры с центром, состоящим из липидизированных якорных частей полипептидов, и оставшимися частями молекулы, выступающими из него, приводя к множественным представлениям антигенных детерминант. Поэтому применение этого и близких подходов, использующих различные липидизированные якори (например, группа миристила, группа фарнезила, группа геранилгеранила, GPI-якорь и N-ацилдиглицеридная группа) являются предпочтительными вариантами изобретения, особенно потому, что приготовление такого липидизированного якоря в белке, полученном рекомбинантным путем, довольно просто и требует только применения,например, сигнальной последовательности природного происхождения в качестве партнера при слиянии с аналогом. Другим возможным 26 вариантом является применение C3d фрагмента С 3- фактора комплемента или самого С 3 (см.Dempsey et al., 1996, Science 271, 348-350 и LouKohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458462). Важно отметить, что в том случае, когда предпринимаются попытки применения способа изобретения против, например, мембраносвязанных полипептидных антигенов, которые выведены во внеклеточный компартмент, наиболее предпочтительно, чтобы первый и/или второй аналог(ги) в основном имел/имели полную третичную структуру ассоциированного с клетками полипептидного антигена. В данном описании и формуле изобретения это означает, что сохраняется полная третичная структура части полипептидного антигена, которая располагается открыто с наружной стороны клетки, поскольку,как указано выше, третичная структура строго внутриклеточных полипептидов не затрагивает гуморальную иммунную систему. Действительно, частью стратегии вакцинации часто является необходимость избежать экспонирования во внеклеточном компартменте предполагаемых Вклеточных эпитопов, полученных из внутриклеточной части полипептидных антигенов; таким образом, можно минимизировать потенциально вредные эффекты, вызываемые перекрестной реактивностью с другими антигенами. Однако в целях данного изобретения достаточно, если вариант/модификация (будь то инсерция, присоединение, делеция или замена) дает начало чужеродному клеточному эпитопу,и в то же время сохраняет значительное количество CTL-эпитопов в полипептидном антигене(и иногда также значительное количество Вклеточных эпитопов). Следующая формула описывает конструкции, в основном охватываемые изобретением:(MOD1)s1(PAGe1)n1(MOD2)s2(PAGe2)n2(MODx)sx(PAGex)nx (I), где PAGe1 - PAGex являются х CTL и/или В-клеточным эпитопом, содержащим субпоследовательности соответствующего полипептидного антигена, которые независимо являются идентичными или неидентичными и которые могут содержать или не содержать чужеродные боковые группы, х является целым числом 3,n1 - nx являются х целыми числами 0 (по меньшей мере,1), MOD1 - MODX являются х модификациями, введенными между сохраненными эпитопами, и s1 - sx являются х целыми числами 0 (по меньшей мере, 1, если в последовательности не введены боковые группы). Таким образом, давая общие функциональные ограничения иммуногенности конструкций,изобретение предоставляет возможность для всех видов изменений исходной антигенной последовательности и всех видов ее модификаций. Таким образом, в данное изобретение включены аналоги, полученные в результате пропуска частей последовательности полипептидного антигена, которые, например, проявля 27 ют неблагоприятные действия in vivo, или пропуска частей, которые в норме являются внутриклеточными и поэтому могут вызывать нежелательные иммунологические реакции, см. детальное обсуждение ниже. Дальнейшая разработка указанного выше принципа включает в себя применение CTLи/или В-клеточных эпитопов более чем одного связанного с патологией антигена. Например,имеется несколько связанных с раком антигенов, которые оказывают свои онкогенные воздействия только тогда, когда они присутствуют в мутантной форме - примерами являются мутантные K-ras и Р 53, и оба они являются ключевыми белками в регуляции нормального клеточного цикла, и оба являются продуктами экспрессии в большинстве нормальных клеток. В некоторых случаях показано, что CTL узнают мутантные пептиды этих антигенов. Поэтому важно, что иммунная система отвечает только на мутантный пептид и не отвечает на немутантные части, если начата антигеноспецифичная иммунотерапия. Авторы разработали стратегию, посредством которой 8-25 аминокислот таких связанных с болезнями белков могут быть использованы в качестве дополнительных эпитопов в AutoVac конструкции - в предпочтительных вариантах введенные эпитопы будут одновременно обеспечивать появление Тн-эпитопов в конечной конструкции, см. обсуждение выше. Эпитопами,используемыми для этой цели, могут быть такие эпитопы, которые включают в себя мутантный район связанного с болезнью белка. Используя такой подход, можно создать CTL (и возможно,антитела, где это необходимо для применения) только против мутантной формы связанного с болезнью белка. В тех случаях, когда связанный с болезнью антиген обеспечивает появление Тнэпитопа, применение настоящего чужеродного Тн-эпитопа может быть полностью исключено. Вариантом этого принципа может быть, например, вакцинация вакциной на основе нуклеиновой кислоты, которая кодирует аналог полипептидного антигена (например, Неr2 или PSM), в который введен, по меньшей мере, один Тнэпитоп и, по меньшей мере, один пептид, полученный из другого связанного с болезнью антигена (например, пептид из мутантной части онкогенного белка). В предпочтительном варианте, по меньшей мере, один Тн-эпитоп вводится в результате введения пептида. Кроме того, предпочтительно, чтобы вариант и/или модификация включала при необходимости применения дупликацию, по меньшей мере, одного В-клеточного эпитопа или, по меньшей мере, одного CTL-эпитопа, ассоциированного с клетками полипептидного антигена. Эта стратегия будет в результате приводить к тому, что множественные копии предпочтительных эпитопных районов будут представлены иммунной системе, и таким образом, будет 28 максимально увеличена возможность эффективного иммунного ответа. Следовательно, этот вариант изобретения использует множественные представления эпитопов, полученных из полипептидного антигена (т.е. формула I, где,по меньшей мере, В-клеточный эпитоп представлен в двух положениях). Этот эффект может быть достигнут различными способами, например, путем простого приготовления слитых полипептидов, содержащих структуру (PAG)m, где m является целым числом 2, и затем введения обсуждаемых здесь модификаций, по меньшей мере, в одну последовательность полипептидного антигена. Альтернативным вариантом изобретения,который также приводит к предпочтительному представлению иммунной системе множественных (например, по меньшей мере, 2) копий важных эпитопных районов антигена, является ковалентное связывание антигена, его субпоследовательности или вариантов с определенными молекулами. Например, могут быть использованы полимеры, например, углеводы, такие как декстран, см., например, Lees A et al., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A et al., 1990, JImmunol. 145: 3594-3600, а также пригодными альтернативными вариантами являются манноза и маннан. Интегральные мембранные белки,например, Е. coli и других бактерий, также являются пригодными партнерами для конъюгации. Также предпочтительными и пригодными для конъюгации партнерами являются традиционные молекулы-носители, такие как гемоцианин морского блюдечка (KLH), токсоид столбняка, токсоид дифтерии и бычий сывороточный альбумин (БСА). Сохранение обладающей в ряде случаев преимуществами значительной фракции Вклеточных эпитопов или даже полной третичной структуры белка, который подвергается описанной здесь модификации, может быть достигнуто несколькими способами. Один из способов - просто приготовить поликлональную антисыворотку, направленную против полипептидного антигена (например, антисыворотку,полученную в организме кролика), и затем использовать эту антисыворотку в качестве тестреактива (например, при конкурентном ELISA) против получаемых модифицированных белков. Модифицированные версии (аналоги), которые реагируют в такой же степени с антисывороткой, как и полипептидный антиген, должны считаться версиями, которые имеют такую же полную третичную структуру, как и полипептидный антиген, тогда как аналоги, проявляющие ограниченную (но еще значительную и специфичную) реактивность с такой антисывороткой, считаются аналогами, в которых сохранилась значительная часть исходных Вклеточных эпитопов. В альтернативном случае может быть приготовлен и использован в виде панели для тес 29 тирования набор моноклональных антител, реагирующих с отдельными эпитопами в полипептидном антигене. Этот подход имеет преимущества, позволяющие 1) картировать эпитопы данного полипептидного антигена и 2) картировать эпитопы, которые сохраняются в полученных аналогах. Конечно, третьим подходом было бы разрешение 3-мерной структуры полипептидного антигена или биологически активной укороченной формы этого антигена (см. выше) и ее сравнение с разрешенной трехмерной структурой полученных аналогов. Трехмерная структура может быть решена с помощью исследований дифракции рентгеновских лучей и ЯМРспектроскопии. Дополнительная информация,имеющая отношение к третичной структуре, в некоторой степени может быть получена на основе исследований кругового дихроизма, которые обладают тем преимуществом, что для того,чтобы обеспечить получение полезной информации о третичной структуре данной молекулы,требуется только полипептид в чистом виде (тогда как дифракция рентгеновских лучей требует наличия кристаллизованного пептида, а ЯМР требует наличия изотопных вариантов полипептида). Однако в конечном счете дифракция рентгеновских лучей и/или ЯМР необходимы для того, чтобы получить окончательные данные, так как круговой дихроизм может предоставить только косвенные данные о 3-мерной структуре посредством информации об элементах вторичной структуры. По существу, в настоящее время имеется три возможных способа получения представления иммунной системе соответствующих эпитопов: традиционная субъединичная вакцинация полипептидными антигенами, введение генетически модифицированной живой вакцины и вакцинация на основе нуклеиновых кислот. Эти три возможных варианта будут обсуждаться отдельно в дальнейшем. Вакцинация полипептидами Она вызывается введением животному иммунологически эффективного количества, по меньшей мере, одного первого аналога и, когда это необходимо, введением иммунологически эффективного количества, по меньшей мере,одного второго аналога. Предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, один первый и/или второй аналог(ги) был(и) введен(ны) в композицию вместе с фармацевтически и иммунологически приемлемым носителем и/или наполнителем, и необязательно - адъювантом. Осуществляя представление аналога иммунной системе животного посредством его введения животному, при составлении композиции полипептида придерживаются принципов, в общем, известных в данной области. Приготовление вакцин, которые в качестве активных ингредиентов содержат последовательности пептидов, в общем, хорошо известны 30 в данной области, и в качестве примеров приведены в патентах США 4 608 251, 4 601 903, 4 599 231, 4 599 230, 4 596 792 и 4 578 770, все они включены здесь в виде ссылок. Обычно такие вакцины готовятся как инъекционные либо в виде жидких растворов, либо суспензий; также могут быть приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препарат также может быть эмульгирован. Активный иммуногенный ингредиент часто смешивают с наполнителями, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Приемлемыми наполнителями являются, например, вода, раствор соли, декстроза, глицерин, этанол и им подобные, и их комбинации. Кроме того, при желании вакцина может содержать минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие средства, агенты для получения буфера с определенным рН, или адъюванты,которые усиливают эффективность вакцин; см. детальное обсуждение адъювантов ниже. Вакцины обычно вводятся парентерально,например, с помощью инъекции, либо подкожно, интрадермально, субдермально либо внутримышечно. Дополнительные композиции, которые пригодны для других способов введения,включают в себя суппозитории и, в некоторых случаях, пероральные, трансбуккальные, подъязычные,интраперитонеальные,интравагинальные, анальные и внутричерепные композиции. Для суппозиториев традиционные связывающие вещества и носители могут включать в себя, например, полиалкаленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть образованы из смесей, содержащих активный ингредиент в пределах от 0,5 до 10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные композиции включают в себя такие обычно применяемые наполнители как, например, очищенный для фармацевтического применения маннит, лактоза,крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и им подобные. Эти композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, композиций замедленного высвобождения или порошков и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%. Для пероральных композиций представляющим интерес партнером в композиции (а также возможным партнером при конъюгации) является токсин холеры. Полипептиды могут быть введены в композицию вакцины в нейтральной форме, или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя соли присоединения кислоты (образованные со свободными аминогруппами пептида), и которые образованы с неорганическими кислотами, такими, например, как соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и им подобные. Также 31 могут быть получены соли, образованные со свободными карбоксильными группами неорганическими основаниями, такими, например, как гидроокиси натрия, калия, аммония, кальция,или железа и такими органическими основаниями как изопропиламин, триметиламин, 2 этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и им подобные. Вакцины вводятся способом, совместимым с композицией дозы, и в таком количестве, которое будет терапевтически эффективным и иммуногенным. Вводимое количество зависит от объекта обработки, включая, например, способность иммунной системы индивидуума вырабатывать иммунный ответ и степени требуемой защиты. Подходящими пределами доз являются дозы порядка нескольких сотен микрограмм активного ингредиента на вакцинацию, с предпочтительными пределами примерно от 0,1 до 2000 мкг (хотя предполагаются даже большие количества в пределах 1-10 мг), а именно в пределах примерно от 0,5 до 1000 мкг, предпочтительно в пределах от 1 до 500 мкг, и особенно предпочтительно в пределах примерно от 10 до 100 мкг. Пригодные схемы начального введения и реиммунизаций также варьируют, но обычно сводятся к начальному введению с последующими прививками или другими введениями. Способ применения может широко варьировать. Пригоден любой из традиционных способов введения вакцины. Эти способы включают в себя пероральное применение на твердой физиологически приемлемой основе или в виде физиологически приемлемой дисперсии, парентеральное путем инъекции или им подобные. Доза вакцины будет зависеть от пути введения и будет варьировать в соответствии с возрастом вакцинируемого пациента и композицией антигена. Некоторые полипептиды вакцины достаточно иммуногенны в вакцине, но для некоторых других иммунный ответ будет усилен, если вакцина, кроме того, будет содержать адъювантные вещества. Особенно предпочтительно применение адъюванта, который, как может быть показано, способствует нарушению аутотолерантности к аутоантигенам. Известны различные способы достижения адъювантного действия вакцины. Общие принципы и способы детально описаны в "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995,Duncan E.S. Stewart-Tull (ed.), John WileySonsYork, ISBN 0-306-45283-9, обе работы тем самым включены здесь в виде ссылки. Предпочтительные адъюванты способствуют захвату молекул вакцины АРС, такими как дендритные клетки, и активируют их. Неограничивающими примерами являются адъюванты,выбранные из группы, состоящей из таргети 003634 32 рующего адъюванта; иммуномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин и микобактериальное производное; масляной композиции; полимера; мицеллообразующего адъюванта; сапонина; иммуностимулирующего комплексного матрикса (ISCOM матрикс); частицы;DDA; алюминиевых адъювантов; ДНКадъювантов; -инулина; и инкапсулирующего адъюванта. В общем следует отметить, что сведения, приведенные выше, которые имеют отношение к соединениям и агентам, пригодным в качестве первых, вторых и третьих фрагментов в аналогах, также с соответствующими изменениями относятся к их применению в адъювантах вакцин согласно изобретению. Применение адъювантов включает в себя использование таких агентов как гидроокись алюминия или фосфат алюминия (алюм), обычно используемых в виде от 0,05 до 0,1 процентного раствора в солевом буфере, смеси с синтетическими полимерами сахаров (например, Carbopol), используемыми в виде 0,25 процентного раствора, возможна агрегация белка в вакцине путем тепловой обработки при температурах в пределах от 70 до 101 С в течение периодов от 30 с до 2 мин, соответственно, и также агрегация с помощью перекрестно сшивающих агентов. Также может быть применена агрегация путем реактивации антителами (Fab - фрагментами) к альбумину, обработанными пепсином,смесь с бактериальными клетками, такими как С. parvum, или эндотоксинами или липополисахаридными компонентами грамотрицательных бактерий, эмульсия в физиологически приемлемых масляных наполнителях, таких как маннид моноолеат (Aracel A) или эмульсия с 20 процентным раствором перфторуглерода (FluosolDA),используемым в качестве блокзаместителя. Также предпочтительно добавление масел, таких как сквален и IFA. Согласно изобретению, DDA (бромид диметилдиоктадециламмония) является кандидатом, представляющим интерес в качестве адъюванта, как ДНК и -инулин, а также представляют интерес полный и неполный адъюванты Фрейнда, также как сапонины килайи, такие какQuila и QS21. Другими возможными вариантами являются монофосфорил липид A (MPL) и указанные выше С 3 и C3d. Также известно, что композиции на основе липосом придают адъювантные эффекты, и поэтому липосомные адъюванты являются предпочтительными согласно изобретению. Также предпочтительным выбором согласно изобретению являются адъюванты типа иммуностимулирующего комплексного матрикса (ISCOM матрикс), главным образом потому,что было показано, что адъюванты этого типа способны повышать экспрессию МНС класса II клетками АРС. ISCOM матрикс состоит из (необязательно фракционированных) сапонинов(тритерпеноидов) Quillaja saponaria, холестерина и фосфолипида. При добавлении иммуногенного белка полученная в результате композиция частицы представляет собой частицу, известную под названием ISCOM-частица, в которой сапонин составляет 60-70% вес/вес, холестерин и фосфолипид - 10-15% вес/вес, и белок -10-15% вес/вес. Детали, касающиеся композиции и применения иммуностимулирующих комплексов, можно, например, найти в указанных выше учебных пособиях, где обсуждаются адъюванты, а также Morein В et al., 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475, a также Barr IG and Mitchell GF,1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25 (обе работы включены здесь в виде ссылки) предоставляют полезные инструкции для получения полных иммуностимулирующих комплексов. Другим представляющим большой интерес(и поэтому предпочтительным) возможным вариантом достижения адъювантного эффекта является применение технологии, описанной в работе Gosselin et al., 1992 (которая включена здесь в виде ссылки). Коротко, представление соответствующего антигена, такого как антиген данного изобретения, может быть усилено путем конъюгации антигена с антителами (или антигенсвязывающими фрагментами антител) против рецепторов Fc на моноцитах/макрофагах. Было показано, что особенно конъюгаты между антигеном и анти-FС усиливают иммуногенность в целях вакцинации. Другие возможные варианты включают в себя применение таргетирующих и иммуномодулирующих веществ (например, цитокинов),указанных выше, в качестве кандидатов для первого и второго фрагментов в модифицированных аналогах. В этой связи возможными вариантами также являются синтетические индукторы цитокинов, подобные поли I:С. Пригодные микобактериальные производные выбираются из группы, состоящей из мурамилдипептида, полного адъюванта Фрейнда,RIBI и сложного диэфира трегалозы, такого какTDM и TDE. Приемлемые иммунотаргетирующие адъюванты выбираются из группы, состоящей изCD40-лиганда и CD40-антител или их специфично связывающих фрагментов (см. обсуждение выше), маннозы, Fab-фрагмента и CTLA-4. Пригодные полимерные адъюванты выбираются из группы, состоящей из углевода, такого как декстран, ПЭГ, крахмал, маннан и манноза; синтетического полимера; и латекса, как например, латексных шариков. Еще одним способом модулирования иммунного ответа, представляющим интерес, является включение иммуногена (необязательно вместе с адъювантами и фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями) в виртуальный лимфатический узел (VLN) (запатентованное медицинское устройство, разра 003634Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (тонкое трубчатое устройство) имитирует структуру и функцию лимфатического узла. Введение VLN под кожу создает место стерильного воспаления с повышением цитокинов и хемокинов. Т- и В-клетки, а также АРС быстро реагируют на опасные сигналы, направляются к цели - месту воспаления, и накапливаются внутри пористого матрикса VLN. Показано, что необходимая доза антигена, требуемая для установления иммунного ответа на антиген,при использовании VLN снижена, и что иммунная защита, приобретаемая при вакцинации с использованием VLN, превосходит традиционную иммунизацию с использованием Ribi в качестве адъюванта. Технология, наряду с другими публикациями, коротко описана у Gelber С etLaboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12th - 15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California". Недавно полученные данные показали, что совместное введение Н 2-агонистов усиливает выживаемость внутри опухоли клеток естественных киллеров и CTL. Поэтому в способах данного изобретения также предполагается включение Н 2-агонистов в качестве адъювантов. Предполагается, что вакцина должна вводиться, по меньшей мере, один раз в год, а именно, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 12 раз в год. Более конкретно, предполагается вводить индивидууму, который в этом нуждается, 1-12 раз в год, а именно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12 раз в год. Ранее было показано, что иммунная память, индуцированная применением предпочтительных аутовакцин согласно изобретению,не является долговременной, и из-за этого иммунная система нуждается в периодическом антигенном стимулировании аналогами. Вследствие наследственной изменчивости различные индивидуумы могут реагировать на один и тот же полипептид с развитием иммунных ответов разной силы. Поэтому вакцина согласно изобретению может содержать несколько различных полипептидов, для того, чтобы усилить иммунный ответ, см. также приведенное выше обсуждение, касающееся выбора введения чужеродного Т-клеточного эпитопа. Вакцина может содержать два или более полипептидов,где все полипептиды представляют собой полипептиды, определенные выше. Следовательно, вакцина может содержать 3-20 различных модифицированных или немодифицированных полипептидов, например 3-10 полипептидов. Однако обычно будут стремиться сохранять минимальное количество пептидов, а именно 1 или 2 пептида. 35 Живые вакцины Вторым альтернативным вариантом эффективного представления иммунной системе является применение технологии живых вакцин. При вакцинации живой вакциной представление иммунной системе осуществляется путем введения животному непатогенного микроорганизма, который предварительно был трансформирован фрагментом нуклеиновой кислоты, кодирующим необходимые районы эпитопов или полный 1 ый и/или 2 ой аналог. В альтернативном случае микроорганизм трансформирован вектором, включающим в себя такой фрагмент нуклеиновой кислоты. Непатогенным микроорганизмом может быть любой приемлемый аттенуированный штамм бактерий (аттенуированный посредством пассажей или посредством удаления патогенных продуктов экспрессии с помощью технологии рекомбинантных ДНК),например, Mycobacterium bovis БЦЖ, непатогенные Streptococcus spp., E. coli, Salmonellaspp., Vibrio cholerae, Shigella, и т.д. Обзоры, рассматривающие приготовление внедренных живых вакцин, можно найти в работах Saliou P,1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 и Walker PD, 1992,Vaccine 10: 977-990, обе из которых включены здесь в виде ссылки. Подробное описание фрагментов нуклеиновых кислот и векторов, используемых в таких живых вакцинах, см. в обсуждении ниже. Что касается полипептидной вакцины, Тн эпитоп и/или первый, и/или второй, и/или третий фрагменты могут, в случае, если они присутствуют, быть в виде партнеров в слиянии с аминокислотной последовательностью, полученной из ассоциированного с клетками полипептидного антигена. В качестве альтернативы бактериальным живым вакцинам в вектор невирулентной вирусной вакцины может быть включен фрагмент нуклеиновой кислоты согласно изобретению,обсуждаемый ниже. Одним из возможных вариантов является покс-вирус, такой как вирус осповакцины, MVA (модифицированный вирус осповакцины), вирус оспы канареек, вирус оспы птиц и вирус оспы цыплят и т.д. В альтернативном случае может быть использован вариант вируса герпеса. Обычно непатогенные микроорганизмы или вирусы вводятся животному только один раз, но в некоторых случаях необходимым может быть введение микроорганизма более одного раза в течение жизни. Микроорганизм также может быть трансформирован нуклеиновой кислотой(ами), содержащей районы, кодирующие 1 ый, 2 ой и/или 3 ий фрагменты, например, в виде иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсуждавшиеся как пригодные адъюванты. Предпочтительная версия этого варианта охватывает наличие района, кодирующего аналог, и района, кодирующего иммуномодуля 003634 36 тор, в различных открытых рамках считывания или, по меньшей мере, под контролем различных промоторов. Таким образом, исключается,чтобы аналог или эпитопы продуцировались в виде партнеров в слиянии с иммуномодулятором. В альтернативном случае в качестве трансформирующих агентов могут быть использованы два различных нуклеотидных фрагмента. Вакцинация на основе нуклеиновых кислот В качестве альтернативы классическому введению основанной на пептидах вакцины,технология вакцинации на основе нуклеиновых кислот (известная также как иммунизация нуклеиновыми кислотами, генетическая иммунизация, генная иммунизация и ДНКвакцинация) предлагает ряд привлекательных деталей. Прежде всего, в противоположность традиционному подходу к вакцинации, вакцинация нуклеиновыми кислотами не нуждается в потреблении ресурса крупномасштабного производства иммуногенного агента (например, в виде ферментации в промышленном масштабе микроорганизмов, продуцирующих аналоги,необходимые для вакцинации полипептидами). Кроме того, нет необходимости в способе очистки и схемах рефолдинга иммуногена. И, наконец, поскольку вакцинация нуклеиновыми кислотами рассчитана на биохимический аппарат вакцинируемого индивидуума, с тем, чтобы получить продукт экспрессии введенной нуклеиновой кислоты, ожидается, что будет происходить оптимальный посттрансляционный процессинг продукта экспрессии; это особенно важно в случае аутовакцинации, поскольку, как указано выше, значительная часть исходных Вклеточных эпитопов должна быть сохранена в аналогах, полученных из экспонированных вне клетки полипептидных последовательностей, и поскольку В-клеточные эпитопы в принципе могут быть составлены из частей любых(био)молекул (например, углевода, липида, белка и т.д.). Поэтому вполне возможно, что естественный характер гликозилирования и липидизации иммуногена очень важен для общей иммуногенности, и это лучше всего обеспечивается продуцированием иммуногена в хозяине. Поэтому важный вариант способа изобретения включает в себя представление, осуществляемое введением in vivo в АРС, по меньшей мере, одного фрагмента нуклеиновой кислоты,который кодирует и экспрессирует, по меньшей мере, один CTL-эпитоп и/или, по меньшей мере,один В-клеточный эпитоп и, по меньшей мере,один первый чужеродный Тн-эпитоп (альтернативный вариант охватывает введение, по меньшей мере, 2 различных фрагментов нуклеиновой кислоты, причем один кодирует, по меньшей мере, один CTL-эпитоп, а другой кодирует,по меньшей мере, один чужеродный Тн-эпитоп). Предпочтительно, это делается с использовани 37 ем фрагмента нуклеиновой кислоты, который кодирует и экспрессирует обсуждаемый выше первый аналог. Если первый аналог обладает Тнэпитопами, детально описанными выше, и/или первым, и/или вторым, и/или третьим фрагментами, то они затем представляются в виде партеров в слиянии с аминокислотной последовательностью полученной из ассоциированного с клетками полипептидного антигена, при этом гибридная конструкция кодируется фрагментом нуклеиновой кислоты. Как и при традиционном походе к вакцинации, вакцинацию нуклеиновыми кислотами можно комбинировать с введением in vivo в АРС, по меньшей мере, одного фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего и экспрессирующего второй аналог. Рассуждения относительно 1, 2 и 3 фрагментов и Тн-эпитопов здесь также применимы. В этом варианте вводимой нуклеиновой кислотой предпочтительно является ДНК, которая может быть в виде голой ДНК, ДНК в композиции с заряженными или незаряженными липидами, ДНК в композиции с липосомами,ДНК, включенной в вирусной вектор, ДНК в композиции с белком или полипептидом, облегчающим трансфекцию, ДНК в композиции с таргетирующим белком или полипептидом,ДНК в композиции с кальцийпреципитирующими агентами, ДНК, связанная с инертной молекулой-носителем и ДНК в композиции с адъювантом. В данном контексте отмечено, что практически все соображения относительно применения адъювантов в традиционной композиции вакцины применимы к композиции ДНК вакцин. Поэтому вся приведенная здесь информация, которая связана с применением адъювантов в случае вакцин, основанных на полипептидах, применима, с соответствующими изменениями, к их применению в технологии вакцинации на основе нуклеиновых кислот. То же самое верно для других соображений, связанных с композицией и способом и путем введения, и, следовательно, эти соображения, обсуждавшиеся выше в связи с традиционной вакциной, также применимы с соответствующими изменениями к их использованию в технологии вакцинации на основе нуклеиновых кислот. Одним особенно предпочтительным видом композиции вакцин на основе нуклеиновых кислот являются микрочастицы, содержащие ДНК. Пригодными микрочастицами являются,например, микрочастицы, описанные в WO 98/31398. Кроме того, нуклеиновая кислота(ты), используемая в качестве иммунизирующего агента, может содержать районы, кодирующие 1 ый,2 ой и/или 3 ий фрагменты, например, в виде иммуномодулирующих веществ, описанных выше,таких как цитокины, обсуждавшиеся как приемлемые адъюванты. Предпочтительная версия этого варианта охватывает случаи, когда имеет 003634 38 ся район, кодирующий аналог, и район, кодирующий иммуномодулятор, в разных открытых рамках считывания, или, по меньшей мере, они находятся под контролем разных промоторов. Таким образом, избегают того, чтобы аналог или эпитоп продуцировались в качестве партнера в слиянии с иммуномодулятором. В альтернативном случае могут быть использованы два отдельных нуклеотидных фрагмента, но это менее предпочтительно из-за преимущества совместной экспрессии, обеспечиваемой в случае,когда имеются оба кодирующих района, включенных в одну и ту же молекулу. В обычных случаях нуклеиновая кислота вакцины вводится в виде вектора, в котором экспрессия контролируется вирусным промотором. В целях более детального рассмотрения векторов согласно изобретению см. обсуждение ниже. Также имеется детальное описание,имеющее отношение к композиции и применению вакцин на основе нуклеиновых кислот, см.Donnelly JJ et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 и Donnelly JJ et al., 1997, Life Sciences 60: 163-172. Обе эти публикации включены здесь в виде ссылки. Важная часть изобретения имеет отношение к новому способу отбора подходящего иммуногенного аналога ассоциированного с клетками полипептидного антигена, который является слабо иммуногенным или неиммуногенным у животного, при этом указанный иммуногенный аналог способен индуцировать у животногоCTL-ответ против клеток, у которых выявляется молекула класса I МНС, связанная с эпитопом,полученным из ассоциированного с клетками полипептидного антигена. Этот способ включает в себя следующие этапы:a) идентификацию, по меньшей мере, одной субпоследовательности аминокислотной последовательности ассоциированного с клетками полипептидного антигена, причем указанная субпоследовательность не содержит известных или предполагаемых CTL-эпитопов,b) получение, по меньшей мере, одного предполагаемого иммуногенного аналога ассоциированного с клетками полипептидного антигена путем введения в аминокислотную последовательность ассоциированного с клетками полипептидного антигена, по меньшей мере,одного Тн-эпитопа, чужеродного по отношению к животному, в положении в пределах, по меньшей мере, одной субпоследовательности,идентифицированной на этапе а), и с) отбор этого/этих аналогов, полученных на этапе b), которые при проверке способны индуцировать CTL-ответ у животного. В альтернативном случае указанный выше способ отбора включает в себя получение фрагмента нуклеиновой кислоты в целях вакцинации нуклеиновой кислотой. В этом случае необходимо, чтобы кодируемый пептид включал в себя, по меньшей мере, один Тн-эпитоп. 39 В том случае, когда аналог получен из антигена, который экспонируется во внеклеточную фазу, предпочтительно, чтобы субпоследовательность, идентифицированная на этапе а),кроме того, не содержала остатков цистеина или- альтернативно - чтобы Тн-эпитоп, введенный на этапе b), не изменял бы существенно структуру распределения остатков цистеина. Этот подход способствует представлению пространственных В-клеточных эпитопов в полученной в результате конструкции, которые сходны с Вклеточными эпитопами в слабом ассоциированном с клетками полипептидном антигене. По этим же причинам предпочтительно,чтобы субпоследовательность, идентифицированная на этапе а), кроме того, не содержала известных или предсказанных сайтов гликозилирования, или - альтернативно- чтобы Тнэпитоп, введенный на этапе b), существенно не изменял бы характер гликозилирования. Некоторые слабые, ассоциированные с клетками полипептидные антигены вызывают нежелательные эффекты, играя роль в патофизиологических процессах. Желательно, чтобы конструкции для вакцинации не вызывали такие эффекты, и поэтому предпочтительно, чтобы субпоследовательность, идентифицированная на этапе а), существенным образом способствовала патофизиологическому действию, вызываемому ассоциированным с клетками полипептидным антигеном, и чтобы введение на этапе b) чужеродного Тн-эпитопа снижало или ликвидировало указанное патофизиологическое действие. Примером такого подхода является удаление активного сайта из фермента, гормона или цитокина,и его замена на чужеродный Тн-эпитоп. Другой важный предмет обсуждения имеет отношение к вопросу иммунологической перекрестной реактивности полипептидного продукта вакцины с другими аутологичными белками,которые не связаны с патологией. Предпочтительно такую перекрестную реактивность следует избегать, и поэтому важным вариантом данного способа изобретения является способ,при котором субпоследовательность, идентифицированная на этапе а), является гомологичной аминокислотной последовательностью другого белкового антигена животного, и введение Тнэпитопа на этапе b) в значительной степени устраняет гомологию. С этим вариантом связан вариант, в котором любые аминокислотные последовательности, которые 1) обычно не экспонируются во внеклеточную фазу и 2) которые могут составлять В-клеточные эпитопы слабого, ассоциированного с клетками полипептидного антигена,не сохраняются в аналоге. Этого можно достичь путем обмена таких аминокислотных последовательностей на Тн-эпитопы, которые не составляют В-клеточные эпитопы, путем их полного удаления или путем их частичного удаления. 40 С другой стороны, предпочтительно, чтобы любые истинные В-клеточные эпитопы слабого ассоциированного с клетками полипептидного антигена в большой степени сохранялись, и поэтому важный вариант способа отбора согласно изобретению включает в себя условие,что ведение на этапе b) чужеродного Тн-эпитопа приводит к сохранению значительной части Вклеточных эпитопов ассоциированного с клетками полипептидного антигена. Особенно предпочтительно, чтобы аналог сохранял полную третичную структуру ассоциированного с клетками полипептидного антигена. Приготовление на этапе b) предпочтительно выполняется молекулярно-биологическими способами или способами твердофазного пептидного синтеза или пептидного синтеза в жидкой фазе. Более короткие пептиды предпочтительно готовятся с помощью хорошо известной технологии твердофазного синтеза пептидов или синтеза пептидов в жидкой фазе. Однако недавние успехи в этой технологии представили возможность получения этими способами полноразмерных полипептидов или белков, и поэтому получение длинных конструкций синтетическими способами также находится в рамках данного изобретения. После получения идентифицированных пригодных, в соответствии с обсуждавшимся выше способом, аналогов необходимо получить аналоги в большом масштабе. Полипептиды получают в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Это может быть сделано молекулярнобиологическими способами, включающими в себя первый этап приготовления трансформированной клетки путем введения в вектор последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аналог, который предварительно выбирается в соответствии со способом, и трансформирования вектором приемлемой клетки-хозяина. Следующим этапом является культивирование трансформированной клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего аналог ассоциированного с клетками антигена, и затем извлечение аналога из культурального надосадка или непосредственно из клеток (например, в виде лизата). В альтернативном случае аналог может быть получен крупномасштабным твердофазным пептидным синтезом или пептидным синтезом в жидкой фазе, см. выше. Наконец, в зависимости от клетки, выбранной в качестве клетки-хозяина, или используемого способа синтеза, продукт может быть подвергнут искусственным посттрансляционным модификациям. Это могут быть схемы рефолдинга, известные в данной области, обработка ферментами (для того, чтобы получить гликозилирование или удаление нежелательных партнеров в слияниях), химические модификации (снова возможно гликозилирование) или 41 конъюгация, например, с традиционными молекулами носителями. Следует отметить, что предпочтительные аналоги согласно изобретению (а также соответствующие аналоги, используемые в способах данного изобретения) содержат модификации,результатом которых является полипептид,имеющий идентичность последовательности, по меньшей мере, 70% с полипептидным антигеном или с его субпоследовательностью, длиной,по меньшей мере, 10 аминокислот. Более высокая идентичность последовательностей является предпочтительной, например, по меньшей мере,75%, или даже, по меньшей мере, 80% или 85%. Идентичность последовательностей белков и нуклеиновых кислот может быть рассчитана как(Nref - Ndif)100/Nref, где Ndif означает общее число не идентичных остатков в двух последовательностях при выравнивании, и где Nref означает количество остатков в одной из последовательностей. Следовательно, последовательность ДНК AGTCAGTC будет иметь идентичность последовательностей с последовательностью ААТСААТС, равную 75% (Ndif = 2 и Nref = 8). Конкретные примеры мишеней для способа согласно изобретению Как обсуждалось выше, предпочтительными слабыми, ассоциированными с клетками антигенами являются антигены, ассоциированные с опухолями. Не ограничивающий список этих антигенов приведен в следующей таблице. Далее некоторые конкретные ассоциированные с опухолями антигены будут обсуждены детально. Специфичный для простаты мембранный антиген, PSM В США рак простаты является второй лидирующей причиной смерти от рака (примерно 40 000 в год) и 200 000 пациентам в год ставят такой диагноз (Boring 1993). Примерно у 1 из 11 мужчин в конечном итоге разовьется рак простаты. Кроме того, примерно у 40 - 60% пациентов с раком простаты со временем заболевание распространяется за пределы простаты (Babaian 1994). Главной стратегией в данном изобретении является применение терапевтической вакцины в качестве дополнительной терапии при эктомии простаты, для того, чтобы элиминировать оставшуюся опухолевую ткань и метастазы. Несколько патологических состояний локализованы на предстательной железе, включая(простатит) и неоплазию (рак простаты). Биологическая агрессивность рака простаты варьирует. У некоторых пациентов обнаруженная опухоль остается латентной гистологической опухолью и никогда не становится клинически значимой. У других пациентов опухоль быстро прогрессирует, метастазирует и приводит к гибели пациента в относительно короткий период (2-5 лет). В настоящее время основным лечением рака простаты является простатэктомия. Однако вследствие широкого распространения раковых клеток простаты большинство пациентов с раком простаты не излечиваются в результате локальной хирургии. Пациенты с нелокализованным заболеванием со временем систематически получают андроген-удаляющую терапию, но ежегодная смертность от рака простаты не снизилась в течение всех 50 лет, хотя удаление андрогенов стало стандартным лечением при метастазирующем заболевании.PSM является мембранным белком, который высоко специфичен для тканей простаты,доброкачественных, а также злокачественных,хотя экспрессия PSM также наблюдалась в других тканях, таких как ткань почки и опухоль почки, тонкий кишечник, мозг и новообразованная сосудистая сеть в опухоли. Поэтому если хирургическая операция была успешной, раковые пациенты после простатэктомии теоретически должны экспрессировать PSM в оставшейся злокачественной ткани опухоли простаты или в метастазах, возникших из опухоли. Предполагается, что путем индуцирования сильного CTLответа и/или сильного гуморального ответа с выработкой поликлональных антител к PSM,оставшаяся опухолевая ткань может быть элиминирована. Интересно, что вслед за удаляющей андрогены терапией у пациентов с раком простаты наблюдается стимуляция экспрессии PSM(Wright 1996). Это может сделать направленную на PSM обработку весьма пригодной вслед за традиционной андроген-удаляющей терапией.PSM впервые был идентифицирован в 1987 г. в результате создания моноклинального антитела, 7 Е 11-С 5.3, выработанного против изолированной клетки рака простаты человека,LNCaP (Horoszewicz 1987). Антитело узнавало как нормальный, так и злокачественный эпителий простаты, и в 1993 г. было использовано для очистки и определения аминокислотной последовательности белка PSM, и со временем для клонирования гена (Israeli 1993).PSM является трансмембранным гликопротеином типа II с молекулярной массой 84 кД, как предсказано на основе последовательности нуклеиновой кислоты, хотя гликозилированная версия имеет измеряемую молекулярную массу 100 - 120 кД. Секвенирование гена, кодирующего PSM, выявило предполагаемый транс 003634 48 мембранный район, связанный с тремя цитозольными аргининовыми якорными остатками. Внеклеточная часть PSM составлена 707 аминокислотами из общего количества 750 аминокислот белка, в то время как рассчитано, что цитоплазматический домен имеет длину 19 аминокислот (Israeli 1993). PSM-специфичная мРНК была выявлена в ткани опухоли простаты (Israeli 1994), что свидетельствует о том, что опухолевый антиген не является неправильно гликозилированным белком, как, например, в случае с Тn- или sTN-опухолевыми антигенами. Полноразмерная кДНК PSM была трансфицирована и экспрессирована в PSMнегативной линии клеток рака простаты человека, РС-3 (Капп 1994). Кроме того, полноразмерная (2,65 тысяч пар нуклеотидов) кДНК была транскрибирована и транслирована in vitro(Kahn 1994). Недавно было показано, что PSM обладает гидролитической активностью, аналогичной активности кислой дипептидазы(NAALADase) действительно было показано,что эти два белка идентичны. NAALADase является мембраносвязанной гидролазой нервной системы, которая катаболизирует нейропептидN-ацетиласпартилглутамат (NAAG), с тем, чтобы воздействовать на глутамергические сигнальные процессы. Еще не известно, имеет ли эта активность PSM какие-либо существенные биологические функции. Определенное значение имеет предсказание того, можно ли ожидать нежелательной перекрестной реактивности с другими белками,доступными для CTL или антител после лечения аутовакциной,индуцирующейPSMспецифичные иммунные ответы. Было показано,что часть кодирующего района гена PSM (положения аминокислот 418-567) имеет 54% гомологии с рецептором трансферрина человека(Israeli 1993). Также была обнаружена полная идентичность с ферментом NAALADase, см. выше. Не идентифицировано функционально значимое сходство с другими известными пептидазами. Гомология с рецептором трансферрина очень низкая, и будет предпочтительно нарушена в некоторых конструкциях согласно изобретению. Не ожидается, что наблюдаемая идентичность последовательностей с NAALADазой человека будет препятствием для PSM-вакцины частично вследствие низкой способности антител и CTL проникать через гематоэнцефалический барьер. В целом даже с наиболее близкой кPSM конструкцией не ожидается препятствующей испытаниям перекрестной реактивности с другими белками у пациентов. Из более ранних исследований очевидно,что PSM экспрессируется в большинстве тестированных клеток рака простаты и образовавшихся в простате метастазов. Кроме того, для 49 большинства других тестированных раков, таких как карциномы, саркомы и меланомы различных тканей, а также большой группы линий раковых клеток человека, не относящихся к простате, доказано, что они PSM-негативны. В дополнение к этому обнаружено, что очень большое количество других тканей PSMнегативны. К ним относятся толстая кишка, молочная железа, легкие, яичники, печень, мочевой пузырь, матка, бронхи, селезенка, поджелудочная железа, язык, пищевод, желудок, щитовидная железа, паращитовидная железа, надпочечник, лимфатический узел, аорта, полая вена,кожа, молочная железа и плацента. Однако ОТПЦР показала наличие PSM мРНК в некоторых из этих тканей. Хотя PSM преимущественно обнаружен в виде мембраносвязанной молекулы в ткани простаты, небольшие количества PSM также могут быть обнаружены в сыворотке нормальных индивидуумов и на повышенном уровне у больных раком простаты (Rochon 1994, Murphy 1995). Поэтому уровень циркулирующего PSM у этих пациентов предоставляет возможность серологического мониторинга эффективности PSMвакцины. В заключение, на основании всех данных,имеющихся в настоящее время, PSM является антигеном, высокоспецифичным для ткани простаты человека и возникающих в ней опухолей. Это значит, что у пациентов, которые подвергались простатэктомии, PSM является квазиспецифичным для опухоли аутоантигеном. Поэтому вероятно, что мишенью эффективной PSMвакцины, главным образом, является ткань простаты или ткань возникающих в простате метастазов. Из примера 1 будет ясно, что способ согласно изобретению предпочтительно связан с тем, что чужеродный Тн-клеточный эпитоп вводится в часть аминокислотной последовательности PSM, определяемую в SEQ ID NO: 2 положениями 1652, и/или 87 -108, и/или 210 230, и/или 269 - 289, и/или 298 - 324, и/или 442 465, и/или 488 - 514, и/или 598 - 630, и/или 643 662, и/или 672 -699. Кроме того, частью изобретения также является модифицированная PSMмолекула, которая имеет чужеродный Тнэпитоп, введенный в эти положения. Соответственно, изобретение также имеет отношение к аналогу PSM человека, который является иммуногенным у человека, при этом указанный аналог содержит значительную часть всех известных и предсказанных CTL- и Вклеточных эпитопов PSM, и включает в себя, по меньшей мере, один чужеродный Тн-эпитоп,который здесь обсуждается. Предпочтительными аналогами PSM являются аналоги, в которых, по меньшей мере, один чужеродный Тнэпитоп присутствует в виде инсерции в аминокислотную последовательность PSM, или как результат делеции части аминокислотной по 003634 50 следовательности PSM, и наиболее предпочтительными аналогами являются аналоги, в которых чужеродный Тн-клеточный эпитоп введен в часть аминокислотной последовательности(HCG). Взаимосвязь эмбриональных маркеров и злокачественных фенотипов обсуждается в течение многих десятилетий. Увеличивающаяся масса данных свидетельствует о том, что, по меньшей мере, один такой маркер, хорионический гонадотропин бета человека (hCG), постоянно выявляется в раковых клетках из многих различных гистологических источников, и что экспрессия этого белка часто коррелирует с повышенной способностью образовывать метастазы. Гуморальный иммунный ответ, направленный против этого растворимого белка, может снижать возможность распространения опухоли и/или может ингибировать рецидив нового первичного роста после хирургической операции. Хорионический гонадотропин человека относится к семейству гликопротеидных гормонов, включающему в себя фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреостимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH), все они являются важными регуляторами репродуктивной экспрессии и выживаемости плода. Представители этого семейства гормонов являются гетеродимерами, которые имеют общую -цепь. -цепь уникальна для каждого гормона и придает специфичность, при этом -цепь LH имеет наибольшую гомологию последовательности с hCG (примерно 80%). Вероятная молекулярная масса hCG-голо составляет 37 кД, одна треть из которых является вкладом углевода. Посттрансляционные модификации сахарами включают в себя как Nсвязанный, так и О-связанный углевод. В изобилии присутствуют остатки сиаловой кислоты,и они придают белку большой отрицательный заряд. Решена кристаллическая структура hCGголо (Lapthorn et al., 1994). На основании кристаллической структуры обнаружено, что hCG проявляет гомологию с семейством факторов роста, включая PDGF иTGF (Lapthorn et al., 1994). Это свидетельствует о том, что экспрессия hCG может содействовать регуляции роста раковых клеток. Хорионический гонадотропин человека является гликопротеидным гормоном, который продуцируется синцитиотрофобластами плаценты вскоре после зачатия, и это необходимо для успешного протекания беременности у беременных женщин. 51 Патофизиологическая роль эмбриональных маркеров в развитии или сохранении раковой массы не известна. Однако интересно отметить, что трофобласты (в которых в норме продуцируются эти белки) обладают как ангиогенными, так и инвазивными свойствами, которые также являются необходимыми свойствами раковых клеток. Более того, получены свидетельства о том, что hCG (или его субъединицы) может ингибировать материнские клеточные иммунные ответы на ткань плода. Например, исследования показали, что hCG непосредственно супрессирует Т-клеточные ответы (Jacoby et al.,1984), и было сделано предположение, что поскольку лимфатические узлы, фильтрующие (в этом случае) первичную меланомную опухоль,иммуносупрессированы, результатом может быть установление самими метастатическими опухолями более благоприятного для себя окружения. Вследствие этого экспрессия hCG может способствовать распространению раковых клеток во вторичные лимфоидные органы. Наконец, как указано выше, показана структурная гомология между hCG и рядом факторов роста. Поэтому другой возможностью является то, что секреция hCG раковыми клетками может предоставлять опухоли преимущества для роста. Экспрессия hCG показана при многих различных типах рака, например: а) аденокарцинома простаты: позитивность в отношенииhCG на тканевых срезах показана для пациентов с плохим прогнозом, независимо от гистологически выявленной степени опухоли (Sheaffet al., 1996), b) различные виды карциномы легкого; сквамозная клетка (SQCC), аденокарцинома (АС) и крупная клетка (LCC) - все они демонстрируют высокий процент реактивности сhCG (Boucher et al., 1995), с) аденокарцинома поджелудочной железы (Syrigos et al., 1998), d) нейробластомы, раковые заболевания мозга,ретинобластомы (Acevedo et al., 1997), е) злокачественная меланома (Doi et al., 1996), f) карциномы мочевого пузыря (Lazar et al., 1995). В недавно вышедшей статье описан подход на основе ДНК, при котором мышей иммунизировали конструкцией, экспрессирующей hCG(Geissler et al., 1997). В этой модели in vivo ингибирование опухолевого роста было строго связано с CTL-активностью, однако, также выявлены высокие титры антител (которые нейтрализовали биологическое действие интактного hCG на его клеточные рецепторы). Применение hCG в качестве иммуногена описано в нескольких публикациях, в которых внимание обращается на его применение в качестве контрацептивной вакцины (Talwar et al.,1976 и Talwar et al., 1994). Очень высокая степень эффективности и безопасности наблюдалась при клинических испытаниях с использованием вакцины против hCG-голо в качестве 52 противозачаточного средства (Talwar et al.,1994). Также были проведены клинически испытания I фазы на больных раком с использованием вакцины против синтетического пептида карбоксильного конца hCG, конъюгированного с токсоидом дифтерии (Triozzi et al., 1994), и проводятся испытания II фазы. Несмотря на тот факт, что идея применения hCG в качестве мишени раковой вакцины популярна в течение определенного времени, она не рассматривалась в связи с технологией аутовакцинации(AutoVac). Известно, что клетки неэмбриональной ткани или доброкачественных опухолей не экспрессируют hCG. Поэтому не будет возможных побочных эффектов при вакцинации против этой молекулы (за исключением влияния на беременность). Поскольку эта молекула экспрессируется при таком большом количестве различных видов рака, предполагают, что она является характерным биомаркером рака (Acevedoet al., 1995 и Regelson W., 1995), и как таковая может быть привлекательной искомой мишенью. Приемлемые модели на животных для дальнейших исследований эффективности вакцины, основанной на hCG, можно найти уHer2 и EGFr играют ключевую роль в злокачественной трансформации нормальных клеток и в непрерывном росте раковых клеток. Сверхэкспрессия обычно связана с очень плохим прогнозом. В течение последних нескольких лет было много сообщений, касающихся применения антител против этих рецепторов в качестве способа лечения раков, которые сверхэкспрессируют либо один из двух, либо оба рецептора.Genentech Inc. закончила несколько успешных клинический испытаний на пациентах с раком молочной железы с использованием моноклонального антитела против Неr2, и недавно получила разрешение FDA (Управление по контролю за продуктами и лекарствами) на торговлю препаратом анти-Неr2 моноклональных антител,Herceptin. Заявленная здесь технология аутовакцинации с применением молекулы Неr2 будет вызывать образование поликлональных антител, которые будут преимущественно реагировать с Неr2. Ожидается, что такие антитела будут атаковать и элиминировать опухолевые клетки, а также предотвращать развитие метастатических клеток в метастазы. Эффекторный механизм такого противоопухолевого действия будет опосредован комплементом и зависимой от антител клеточной цитотоксичностью. 53 В зависимости от выбора конструкций,индуцированные антитела также могут ингибировать рост раковых клеток благодаря ингибированию зависимой от факторов роста олигодимеризации и интернализации рецепторов. И,что наиболее важно, ожидается, что аналоги Неr2 будут способны индуцировать CTLответы, направленные против известных и/или предсказанных Неr2-эпитопов, представляемых опухолевыми клетками. Неr2 является представителем семейства рецепторов эпидермального фактора роста (сerbB), которое в настоящее время состоит из четырех различных рецепторов: с-еrbВ-1(EGFr), c-erbB-2 (Her2, c-Neu), c-erbB-3 и cerbB-4 (Salomon et al., 1995). C-erbB-3 и c-erbB-4 охарактеризованы хуже, чем EGFr и Неr2. Неr2 является интегральным гликопротеидом. Зрелый белок имеет молекулярную массу 185 кД со структурными особенностями, которые имеют близкое сходство с рецептором EGFr (Prigent etal., 1992). EGFr также является интегральным мембранным рецептором, состоящим из одной субъединицы. Он имеет вероятную молекулярную массу 170 кД и состоит из домена, связывающего поверхностный лиганд из 621 аминокислоты, единственного гидрофобного трансмембранного домена из 23 аминокислот и высоко консервативного цитоплазматического тирозинкиназного домена из 542 аминокислот. БелокN-гликозилирован (Prigent et al., 1994). Все белки этого семейства являются тирозинкиназами. Взаимодействие с лигандом приводит к димеризации рецептора, которая усиливает каталитическое действие тирозинкиназы(Bernard, 1995, Chantry 1995). Белки в пределах семейства способны к гомо- и гетеродимеризации, которая важна для их активности. EGFr передает стимулирующие рост эффекты и стимулирует поглощение клетками глюкозы и аминокислот (Prigent et al., 1992). Неr2 также передает стимулирующие рост сигналы. ТолькоEGFr связывает EGF и TGF-альфа. Эти лиганды не связываются с другими рецепторами семейства (Prigent et al., 1992). Лиганды Неr2 полностью не определены. Однако было показано, что херегулин индуцирует фосфорилирование путем активирования Неr2. По-видимому, это не является следствием прямого связывания с рецептором, но предполагается, что херегулин является лигандом erbВ-3 и erbВ-4, которые затем активируют Неr2 путем олигодимеризации (Solomon et al., 1995). Гомология между белками семейства EGF рецепторов наиболее выражена в тирозинкиназном домене в цитоплазматической части молекул (82% между EGFr и Неr2). Меньше гомология во внеклеточной части - от 41 до 46% в различных доменах (Prigent et al., 1992). Рецептор эпидермального фактора роста экспрессируется в нормальных тканях в небольших количествах, но он сверхэкспрессиру 003634 54 ется при многих типах рака. EGFr сверхэкспрессируется при раке молочной железы (Earp et al.,1993, Eppenberger 1994), в глиомах (Schlegel etHer2 также экспрессируется в немногих нормальных тканях человека в небольшом количестве, наиболее типичен для секретирующего эпителия. Сверхэкспрессия Неr2 происходит примерно в 30% случаев рака молочной железы,желудка, поджелудочной железы, мочевого пузыря и яичника. Экспрессия этих рецепторов варьирует в зависимости от степени дифференцировки опухолей и типа рака, например, при раке молочной железы первичные опухоли сверхэкспрессируют оба рецептора; тогда как при раке желудка сверхэкспрессия происходит на последней стадии в метастатических опухолях (Salomon et al.,1995). Количество сверхэкспрессированных рецепторов на клетках карциномы составляет более чем 106/клетку для отдельных видов рака головы и шеи, раковых линий вульвы, молочной железы и яичника, выделенных из организма пациентов (Dean et al., 1994). Существует несколько причин того, почему семейство рецепторов EGFr составляют пригодные мишени для иммунотерапии опухолей. Во-первых, они сверхэкспрессируются во многих типах рака, и это должно направлять иммунный ответ на опухоль. Во-вторых, опухоли часто экспрессируют или сверхэкспрессируют лиганды для этого семейства рецепторов, и некоторые являются гиперчувствительными к пролиферативному действию, опосредованному лигандами. В третьих, пациенты с опухолями,которые сверхэкспрессируют рецепторы факторов роста часто, имеют плохой прогноз. Сверхэкспрессия была тесно связана с плохим прогнозом, особенно при раке молочной железы,раке легкого и раке мочевого пузыря (2) и, повидимому, ассоциирована с инвазивным/метастатическим фенотипом, который довольно нечувствителен к традиционному лечению (Eccleset al., 1994). Сверхэкспрессия Неr2 в некоторых случаях является результатом амплификации гена, а в других случаях увеличенной транскрипции и трансляции. Сверхэкспрессия Нег 2 ассоциирована с плохим прогнозом при раке молочной железы, яичника, раке желудка, раке мочевого пузыря и, возможно, при немелкоклеточных раках легкого (Solomon et al., 1995). Была выполнена фаза I клинических испытаний с биспецифичным антителом на пациентах с запущенным раком молочной железы и раком яичника. Антитело было биспецифичным против Неr2 и FcRI (Weiner et al, 1995). Наблюдался эффективный лизис опухолевых клеток, сверхэкспрессирующих Неr2, с биспеци 55 фичным антителом против Неr2 и CD3 (Zhu etal., 1995). Обработка мышей scid, которым пересаживали ксенотрансплантат рака желудка человека, анти-Неr2 моноклональным антителом удлиняло продолжительность жизни мышей(Ohniski et al, 1995). Антиопухолевые активности моноклональных антител против Her2 invitro и in vivo не являются результатом действия одного и того же механизма; они могут действовать как частичные агонисты лигандов, изменять круговорот рецептора Неr2 и фосфорилирование, или могут влиять на димеризацию(Lupu et al., 1995). Сходным образом было показано, что антитела к EGFr также могут препятствовать взаимодействию с фактором роста. (Baselga etal, 1994, Bier et al, 1995, Modjahedi et al, 1996,Valone 1995). Поэтому важным вариантом способов согласно изобретению является вариант, в котором чужеродный Т-клеточный эпитоп вводится в часть аминокислотной последовательности Неr2, определяемую путем нумерации аминокислот в SEQ ID NO: 3 положениями 5-25, и/или 59 - 73, и/или 103 - 117, и/или 149 -163, и/или 210 - 224, и/или 250 - 264, и/или 325 - 339, и/или 369 - 383, и/или 465 - 479, и/или 579 - 593, и/или 632 - 652, и/или 653 - 667, и/или 661 - 675, и/или 695 - 709, и/или 710 -730, см. примеры. Соответственно, изобретение также относится к аналогу Her2 человека, который является иммуногенным для человека, при этом указанный аналог содержит значительную часть всех известных и предсказанных CTL- и Вклеточных эпитопов Неr2, и включает в себя, по меньшей мере, один чужеродный Тн, который здесь обсуждается. Предпочтительно, что, по меньшей мере, один чужеродный Тн-эпитоп присутствует в виде инсерции в аминокислотной последовательности Неr2, или в виде замены части аминокислотной последовательности Неr2, или как результат делеции части аминокислотной последовательности Неr2. Наиболее предпочтительными аналогами являются аналоги, определяемые выше, т.е. такие, в которых чужеродный Тн-клеточный эпитоп введен в часть аминокислотной последовательности Неr2, определяемую положениями SEQ ID NO: 3: 5 - 25, и/или 59 - 73, и/или 103 - 117, и/или 149 - 163, и/или 210 - 224, и/или 250 -264, и/или 325 - 339, и/или 369 - 383, и/или 465 - 479, и/или 579 - 593, и/или 632 - 652, и/или 653 - 667, и/или 661 - 675, и/или 695 - 709, и/или 710 - 730.FGF8b Несколькими исследователями показано,что FGF8b может индуцировать пролиферацию,трансформацию, дифференцировку и в некоторых случаях значительно увеличивать онкогенность клеток и тканей млекопитающих (Tanaka 56 1992, Kouhara 1994, Lorenzi 1995, MacArthur 1995a, Crossley 1996a, 1996b, Ghosh 1996, Ohuchi 1997a, Rudra-Ganguly 1998). Эти эффекты главным образом опосредованы связываниемFGF8b с представителями рецепторов фактора роста фибробластов FGFR2, FGFR3 и FGFR4(MacArthur 1995b, Blunt 1997, Tanaka 1998). Таким образом, было показано, что клетки, экспрессирующие один из этих рецепторов иFGF8(b), обеспечивают каскад передачи аутокринных сигналов роста, приводящий к пролиферации. Наиболее вероятно, что биологическое действие FGF8b частично опосредовано путемJAK/STAT3, так как авторы данного изобретения и другие исследователи обнаружили, что добавление FGF8b к среде роста некоторых клеток стимулирует фосфорилирование STAT3 особенность, которая предположительно придает клеткам устойчивость к апоптозу (CatlettFalcone 1999). Дополнительно к наблюдениям in vitro,упоминавшимся выше, недавно было показано,что экспрессия FGF8(b) в значительной степени неконтролируема как при раке простаты, так и при раке молочной железы (Marsh 1999, Dorkin 1999). Поэтому авторы предполагают, что аутовакцина против FGF8(b) будет очень эффективным средством лечения ряда FGF8-экспрессирующих опухолей или, возможно, увеличит их чувствительность к агентам, индуцирующим апоптоз. Рак простаты Биологическая агрессивность рака простаты варьирует. У некоторых пациентов обнаруженная опухоль остается латентной гистологической опухолью и никогда не становится клинически значимой. У других пациентов опухоль быстро прогрессирует, метастазирует и приводит к гибели пациента в относительно короткий период времени (2-5 лет). В целях диагностики, и для того, чтобы проследить за ответом на терапию рака простаты, главным образом, использовали определение уровней двух циркулирующих белков: кислой фосфатазы простаты (РАР) и специфичного антигена простаты (PSA) (Nguyen 1990, Henttu 1989). Вследствие нарушения нормальной структуры предстательной железы в ответ на развитие рака эти растворимые белки высвобождаются в русло циркуляции, где они могут быть выявлены как маркеры, например, распространения метастазов. В настоящее время основным лечением рака простаты является простатэктомия. Однако вследствие широкого распространения раковых клеток простаты большинство пациентов с раком простаты не излечиваются в результате локальной хирургии. Пациенты с нелокализованным заболеванием систематически получают андрогенудаляющую терапию, но процент ежегодной смертности от рака простаты не снизилась в течение всех 50 лет, хотя удаление андро 57 генов стало стандартным способом лечения при заболевании с метастазами. ОТ-ПЦР анализ показал, что FGF8 мРНК продуцируется линиями опухолевых клеток эпителия простаты человека LNCaP, Р 03,ALVA-31 и DU145, соответственно, при этомFGF8b является наиболее заметной изоформой(Tanaka 1995, Ghosh 1996). Рост отвечающих на андроген LNCaP клеток стимулируется добавлением рекомбинантного FGF8b (Tanaka 1995),в то время как рост клеток DU145 можно было ингибировать в результате трансфекции вирусом, экспрессирующим антисмысловой FGF8b(Rudra-Ganguly 1998). Это вместе с данными исследований в ходе развития, обсуждаемых ниже, свидетельствует о роли FGF8b в поддержании злокачественного состояния этих линий клеток. Используя FGF8a - кДНК в экспериментах по in situ гибридизации Leung и соавторы показали, что большая доля (80% (n=106), и 71%(n=31 рака простаты продуцирует FGF8-мPHK и что количество FGF8-мРНК коррелирует с тяжестью опухолевого заболевания (Р 0,0016,и Р 0,05, соответственно) (Leung 1996, Dorkin 1999). С использованием моноклонального анти-FGF8b-антитела было показано, что эта изоформа ответственна за сверхэкспрессию FGF8b(Dorkin 1999). Кроме того, мужчины с опухолями, которые экспрессировали высокие уровниFGF8, имели меньшую продолжительность жизни (Р = 0,034), и эта экспрессия FGF8 сохранялась при андрогеннезависимом раке простаты(Dorkin 1999). Согласно данным, представленным Dorkin и соавторами, по экспрессии FGF8b при раке простаты можно предсказать продолжительность жизни пациентов. Иммуногистохимический анализ с использованием моноклонального антитела противFGF8 выявил белок в 93% (n=43) случаев рака простаты (Tanaka 1998). Нормальная ткань простаты или доброкачественная гиперплазия простаты продуцируют низкие уровни FGF8-MPHK и не содержат выявляемых количеств FGF8b белка (Leung 1996, Yoshimura 1996, Ghosh 1996,Tanaka 1998, Dorkin 1999). Эти результаты свидетельствуют о том,что аутовакцина против FGF8(b) была бы реактивной против опухолевой ткани простаты, а поэтому крайне полезной при лечении рака простаты. Рак молочной железы В настоящее время способом лечения рака молочной железы является хирургическая операция. Однако вследствие широкого распространения клеток рака молочной железы большая часть пациентов не излечивается в результате локальной хирургической операции. Пациенты с нелокализованным заболеванием в итоге получают андрогенудаляющую терапию, химиотерапию и/или радиационную терапию. Од 003634 58 нако процент ежегодной смертности от рака молочной железы еще остается высоким. Исходно FGF8 был выделен из линии клеток карциномы молочной железы мышей (SC-3),экспрессию в которых можно было индуцировать добавлением андрогена в среду (Nonomura 1990). Также известно, что белок индуцирует пролиферацию этих, а также других клеток млекопитающих. Недавно было показано, чтоFGF8b- мРНК присутствует в восьми (n=8) линиях клеток рака молочной железы человека(MDA-MB-231, MDA-MB-415, ZR 75-1, Т-47-D,SK-BR-III, РМС-42, HBL-100 и MCF-7) (Tanaka 1995, Payson 1996, Wu 1997, Marsh 1998). У трансгенных мышей Wnt-1, инфицированных вирусом опухоли молочной железы мышей (MMTV), развивались опухоли молочной железы. Транскрипция FGF8 активируется в 50% этих опухолей (MacArthur 1995 с, Kapoun 1997). Показано, что у трансгенных мышей, которые несут FGF8b-кДНК под контролем очень специфичного промотора вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), спонтанно развиваются опухоли молочной железы, экспрессирующие FGF8b (Coombes, личное сообщение). Совсем недавно полученные данные свидетельствуют, что экспрессия FGF8b повышена при раке молочной железы (Tanaka 1998, Marsh 1999). Tanaka и соавторы в иммуногистохимических исследованиях использовали новое моноклональное FGF8-антитело. Они показали,что FGF8 присутствовал в 67% (n=12) случаев рака молочной железы, и что рецепторы андрогена присутствовали в 89% случаев заболеваний молочной железы, позитивных в отношенииFGF8 (гиперплазия, фиброаденома, внутрипротоковая папиллома и рак), что может предоставлять возможность для вовлечения аутокринной петли стимуляции роста в прогрессию рака молочной железы (Tanaka 1998). С использованием полуколичественного ОТ-ПЦР метода было показано, что повышенные уровни FGF8b-мРНК были обнаружены в злокачественных тканях молочной железы при сравнении с незлокачественными тканями. Значительно более злокачественные ткани экспрессировали(р=0,019) на значительно более высоких уровнях (р=0,031) (68 тканей рака молочной железы и 24 незлокачественных ткани молочной железы) (Marsh 1999). Окончательно еще не установлено, чтоFGF8(b) функционирует как аутокринный фактор роста. Однако тот факт, что большая часть опухолей сверхэкспрессируют FGF8b служит строгим доказательством того, что аутовакцина против FGF8b может быть эффективна против большой части раков молочной железы и простаты. Данные, сообщенные Marsh, Dorkin и 59 против FGF8(b) может быть использована как для лечения рака молочной железы, так и рака простаты, и несколько неопределенные данные,представленные Dorkin et al., являются дальнейшим подтверждением мнения о том, чтоFGF8 вовлечен в пролиферацию раковых клеток человека. Описание FGF8bFGF8b относится к семейству факторов роста фибробластов (FGF). Эти белки, регулирующие рост, являются небольшими белками из 200 аминокислотных остатков, и все они вовлечены в индукцию пролиферации и дифференцировки широкого круга клеток. Для обзора последних данных об участии факторов роста фибробластов в развитии конечностей позвоночных, см. Johnson 1997. Представители семейства FGF эволюционно близки и обладают 20-50% идентичности аминокислотных последовательностей.FGF8, исходно названным индуцируемым андрогеном фактором роста (AIGF). AIGF был первым идентифицированным белком, секретируемым линией клеток карциномы молочной железы мышей (SC-3) при стимуляции андрогеном(Nonomura 1990). Ген FGF8 мышей содержит 6 экзонов, потенциально кодирующих восемь различных изоформ FGF8 (FGF8a-h), отличающихся только в N-концевой части молекулы(Crossley 1995, MacArthur 1995b). FGF8 человека имеет такую же структуру гена, как и ген мышей. Однако из-за наличия стоп-кодона в экзоне 1B FGF8b человека, вероятно, может существовать в четырех различных изоформах,названных FGF8a, FGF8b, FGF8e и FGF8f (Gemel 1996). Структуры генов и аминокислотные последовательности четырех изоформ человека изображены на фиг. 5. Зрелый FGF8b содержит 193 аминокислотных остатка, имеет рассчитанную молекулярную массу 22,5 кД. Сильно основной белок содержит 21 остаток аргинина и 14 остатков лизина, что в результате приводит к рассчитанной изоэлектрической точке 10,84, и рассчитанному положительному заряду 19,8 при рН 7,0. Он содержит два остатка цистеина и имеет два потенциальных сайта N-гликозилирования. Вследствие характера проведенных исследований с привлечением FGF8b очень мало известно о белковом компоненте FGF8b. Однако он был экспрессирован в гетерологичной бактериальной системе, очищен с использованием Сконцевой метки гекса-гистидином, и подвержен рефолдингу in vitro до растворимого и биологически активного состояния (MacArthur 1995a,Blunt 1997). Биологическая активность FGF8b Как указано выше, FGF8(b) был первым выделенным фактором, который высвобождается из андрогензависимой линии клеток опухоли молочной железы мышей, и было показано, что 60 этот белок может индуцировать пролиферацию этих клеток. Морфологические изменения имитируют изменения, индуцированные тестостероном, который, как известно, также индуцирует синтез FGF8(b)-мРНК (Tanaka 1992). Пролиферация может быть ингибирована антисмысловыми олигомерами FGF8(b) (Nonomura 1990,Tanaka 1992 и Yamanishi 1994). Действительно,рост линии клеток рака простаты человекаDU145 может быть ингибирован путем трансфекции вирусом, экспрессирующим антисмысловой FGF8b (Rudra-Ganguly 1998). Недавно полученные данные показали, что FGF8b индуцирует фосфорилирование STAT3 - белка, который предположительно вовлечен в устойчивость к апоптозу (Catlett-Falcone 1999, Johnston,C.L., неопубликованные результаты). Несколькими исследователями показано,что FGF8b очень эффективен в индукции трансформации клеток NIH3T3 или SC115 (Miyashita 1994, Kouhara 1994, Lorenzi 1995,MacArthur 1995a). С использованием рекомбинантно экспрессируемых белков также было показано, что эта индукция морфологических изменений гораздо более эффективна с FGF8b,чем при использовании FGF8a или FGF8c(MacArthur 1995a, Ghosh 1996). Интересно было показано, что одна N-концевая половина молекулы FGF8b достаточна для трансформации клеток NIH3T3, и даже небольшой специфичный пептид FGF8b (QVTVQSSPNFT) мог обеспечить клеткам возможность расти в 2-3 раза дольше, чем в норме в 0,1% сыворотке (RudraGanguly 1998). Кроме того, сообщалось, что клетки NIH3T3, стабильно трансфицированные экспрессирующим вектором, кодирующимFGF8b, очень онкогенны в случае внутриглазной инъекции мышам nude (Kouhara 1994,Ghosh 1996). Известно, что in vivo FGF8b экспрессируется на определенных стадиях развития позвоночных. Суммарная информация о биологической роли, которая отводится FGF8(b), показана в табл. 1. Для обзора участия FGF8b в развитии позвоночных смотри Goldfarb 1999 и Johnson 1997. Таблица. Различные места/ткани, которые, как известно,продуцируют FGF8, и предполагаемая биологическая роль(ли) Действие/механизм/наличие (вид) Ссылка Присутствует в развивающихся зачатках конечностей (мышь)Kuwana 1997,Xu 1998 Индукция формирования эктопической конечности из мезодермы (цыпленок)Crossley 1996b Индукция формирования среднего мозга из каудальней части промежуточного мозгаCrossley 1996b Инициация выроста крыла у бескрылого мутанта