Способы получения биологически активных молекул

006825 Область изобретения Настоящее изобретение, главным образом, относится к получению биологически активных молекул, которые существуют в виде неактивных предшественников и in vivo расщепляются протеазами с получением зрелых биологически активных молекул. Конкретнее, изобретение относится к получению каспаз и цитокинов, которые продуцируются invivo из соответствующих предшественников саморасщеплением, расщеплением другими каспазами или расщеплением, например, протеазой каспазой-1, также известной как интерлейкин-1-превращающий фермент (ICE). Примерами цитокинов, продуцирующихся подобным образом, служат интерлейкин-1 и интерлейкин-18. Предпосылки изобретения Каспазы представляют собой семейство цистеиновых протеаз, которые расщепляют свои белкимишени за остатком Asp. Из одиннадцати описанных каспаз каспаза-1 и, возможно, каспазы -4, -5 и -11,как предполагается, в первую очередь, вовлечены в процессинг провоспалительных цитокинов, тогда как другие играют решающую роль в инициации и исполнении апоптоза, или запрограммированной клеточной гибели. Каспазы имеют несколько общих черт, в том числе то, что они синтезируются в виде каталитически неактивных зимогенов, активирующихся, главным образом, расщеплением после специфических внутренних остатков Asp, присутствующих в междоменных линкерах, а также способность расщеплять свои субстраты после остатков Asp. В результате, некоторые зрелые активные каспазы, в особенности, полученные из каспаз с длинным продоменом, могут процессировать и активировать самих себя и другие неактивные зимогены каспаз. Основываясь на первичной структуре, проапоптотические каспазы можно разделить на два класса: класс I, включающий каспазы -2, -8, -9 и -10, которые содержат длинныйN-концевой продомен, и класс II, включающий каспазы -3, -6 и -7 с коротким или отсутствующим продоменом. Эксперименты по расщеплению in vitro говорят о том, что каспазы II класса требуют для своего протеолитического процессинга наличия активированных каспаз I класса (12). Другая классификация каспаз разделяет их по специфичности участка расщепления (13). Здесь каспазы I группы содержат консенсусный участок WEHD (каспазы -1, -4 и -5), каспазы II группы - консенсусный участок DexD (каспазы -2, -3 и -7), а каспазы III группы - консенсусный участок (IVL)ExD (каспазы -6, -8 и -9). Оптимальным участком для каспазы-8 является LETD (14). Интерлейкин-18 (IL-18), первоначально описанный как интерферон- (IFN-)-индуцирующий фактор, представляет собой недавно охарактеризованный цитокин, имеющий общие структурные черты с семейством белков IL-1 (1-4). IL-18 первоначально был выделен и впоследствии клонирован из печени мышей, получавших обработанные теплом Propionobacterium acnes (P.acnes), с последующим введением липополисахарида (LPS) (2, 5). Также недавно описано клонирование человеческого IL-18 (3). Как и IL-12, IL-18 продуцируется активированными макрофагами, такими как купферовские клетки печени и другие немигрирующие макрофаги (3). IL-18 является ранним индуктором ответа Th1, костимулирует продукцию IFN-, как и TNF-, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и IL-2 (6). В дополнение, он усиливает пролиферацию Т-клеток, вызванную антителами противCD3, и повышает клеточную цитотоксичность, обусловленную естественными киллерами, путем увеличения экспрессии Fas-лиганда (6, 7). В отличие от большинства других цитокинов, демонстрирующих структуру, свернутую в четыре спирали, IL-18 и IL-1 имеют -складчатую листовую структуру (7). Подобно IL-1, IL-18 синтезируется в виде биологически неактивного предшественника (proIL-18), лишенного сигнального пептида (3). Предшественники IL-1 и IL-18 расщепляются каспазой-1 (IL-1-превращающий фермент или ICE), которая расщепляет после остатка аспарагиновой кислоты в позиции Р 1. Образованные зрелые цитокины легко высвобождаются из клетки (8, 9). Исследования на мышах, дефицитных в отношении каспазы-1,продемонстрировали важную роль зрелого IL-18 как индуктора IFN- и ответов Th1. Инъекция таким мышам Р.acnes и LPS приводила к низким уровням циркулирующего IFN- по сравнению с мышами дикого типа (8, 9). Инъекция IL-18 восстанавливала LPS-индуцированный уровень IFN- у мышей, дефицитных по каспазе-1 (9), что служит дальнейшим подтверждением представления о том, что каспаза-1 вовлечена в продукцию активного IL-18. Другие каспазы, особенно те, что расщепляют внутриклеточные белки, ассоциированные с апоптозом, были по крайней мере в 100 раз менее активны, чем каспаза-1 (9). Подобные исследования с IL-18-дефицитными мышами выявили его роль в активности NK-клеток и индукции цитокинов (10). Рекомбинантный IL-1 и мышиный IL-18, экспрессированный в Е. coli, могут быть подвергнуты рефолдингу с получением полностью активных цитокинов. Попытки экспрессировать зрелую форму человеческого IL-18 в Е. coli или в других хозяевах не привели к получению полностью активного цитокина. По причине его потенциального терапевтического использования, например, при злокачественных новообразованиях или в любых условиях, когда желательна индукция продукции интерферона-, возникает потребность в создании эффективной системы экспрессии для продукции зрелого, биологически активного человеческого IL-18.-1 006825 Сущность изобретения Настоящее изобретение позволяет получать молекулы, которые в процессе их формирования в природе продуцируются в форме биологически неактивного предшественника и становятся активными после расщепления их предшественника. Последнее не может быть легко осуществлено in vitro. Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу продукции биологически активной молекулы из ее биологически неактивного предшественника мутацией ее нативного участка расщепления с получением участка, чувствительного к расщеплению обычной протеазой, и расщеплением мутантной молекулы с получением биологически активной молекулы. Биологически активная молекула представляет собой цитокин, предпочтительно выбранный из IL1 и IL-18. В данных цитокинах предпочтительным нативным участком расщепления является участок расщепления каспазой-1. Обычная протеаза, привлеченная для расщепления, может быть выбрана из тромбина, энтерокиназы, субтилизина, гененазы (genenase; New England Biolabs, Beverly MA, USA), протеазы человеческого риновируса 3 С и протеазы фактора Ха. Когда для расщепления привлекается каспаза, предпочитают каспазу-8. Применяемый в предпочтительном осуществлении настоящего изобретения способ включает трансфекцию клеток-хозяев вектором, содержащим ДНК, кодирующую неактивный предшественник биологически активной молекулы, мутированный в его участке расщепления каспазой-1 с образованием участка, расщепляемого протеазой, культивирование трансфицированных клеток-хозяев, экспрессирующих указанный предшественник, и выделение биологически активной молекулы после обработки протеазой, причем указанная биологически активная молекула представляет собой цитокин. Необязательно способ может быть усовершенствован тем, что осуществляют слияние кДНК в рамку считывания после последовательности, кодирующей глутатион-S-трансферазу (GST), и экспрессированные молекулы слияния перед обработкой протеазой задерживают на гранулах глутатион-агарозы. Настоящее изобретение также описывает кДНК, кодирующую неактивный предшественник биологически активной молекулы, мутированный в нативном участке его расщепления каспазой-1 с образованием участка, расщепляемого протеазой, которую необязательно подвергают слиянию с последовательностью, кодирующей GST. Указанная биологически активная молекула представляет собой цитокин,выбранный из IL-1 и IL-18. Согласно настоящему изобретению может быть также осуществлен способ получения и/или очистки рекомбинантного гибридного полипептида или белка слияния. Точнее, фрагмент ДНК, кодирующий молекулу белка, подлежит слиянию с фрагментом ДНК, кодирующим связывающий белок с использованием в качестве линкерной последовательности ДНК, кодирующей пептидную последовательность, которая распознается и разрезается каспазой. ДНК слияния включают в состав вектора клонирования, который используется для трансформации подходящих клеток. После экспрессии гибридный полипептид очищают посредством контакта с лигандом или субстратом, к которому обладает специфической аффинностью связывающий белок, например аффинной хроматографией. В предпочтительном осуществлении данного способа связывающим белком служит GST, а участок расщепления представляет собой участок расщепления каспазы-8. Изобретение также относится к биологически активным молекулам, полученным вышеописанным способом. Экспрессия зрелого IL-18 в E. coli ведет к возникновению белка, лишенного биологической активности. Дальнейшие попытки провести правильный рефолдинг полипептидного остова IL-18, экспрессированного в E. coli, были безуспешными. Человеческий IL-18 и человеческий IL-1 экспрессируются invivo как их предшественники proIL-18 и proIL-1, которые расщепляются каспазой-1 с получением биологически активных зрелых IL-18 и IL-1, соответственно. Однако каспаза-1 коммерчески недоступна. Настоящее изобретение относится к простому способу получения биологически активных молекул в E.coli, в частности цитокина и, более конкретно, человеческого IL-18. С этой целью конструировали кДНК,кодирующую человеческий proIL-18, в котором участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка расщепления коммерчески доступным белком, например фактором Ха. Для упрощения манипуляций мутантную кДНК proIL-18 подвергали слиянию с последовательностью, кодирующей глутатион-S-трансферазу (GST). Полученный белок слияния GST-proIL-18, содержащий участок расщепления фактором Ха, экспрессировали в E. coli и связывали на гранулах глутатион-агарозы. Зрелый человеческий IL-18, проявляющий высокую биологическую активность, освобождали с гранул обработкой фактором Ха. Сходным образом в последовательности ДНК, кодирующей человеческий IL-1, участок расщепления каспазой-1 мутировали с образованием участка расщепления фактором Ха. Для упрощения манипуляций мутантную кДНК proIL-1 подвергали слиянию в рамку считывания с последовательностью, кодирующей глутатион-S-трансферазу (GST). Полученный белок слияния GST-proIL-1, содержащий уча-2 006825 сток расщепления фактором Ха, экспрессировали в E. coli и связывали на гранулах глутатион-агарозы. Зрелый человеческий IL-1 освобождали с гранул обработкой фактором Ха. Когда для расщепления применяли каспазу-8, выполняли сходную процедуру, с той разницей, что участок расщепления каспазой-1 человеческого IL-18 или человеческого IL-1 мутировали с образованием участка расщепления каспазой-8. Впоследствии, слияние с последовательностью, кодирующей GST, и дальнейшие стадии процедуры проводили, как описано выше. Краткое описание фигур На фиг. 1 проиллюстрировано клонирование кДНК, кодирующей мутантный человеческий proIL-18(proIL-18IEGR). Эту кДНК клонировали в три стадии PCR с использованием метода перекрывающихся праймеров. Дорожки представляют собой: М, маркеры размеров ДНК, отмеченные с левой стороны; 1,ДНК длиной в 498 нп, полученная в первой PCR; 2, ДНК длиной в 551 нп, полученная во второй PCR; 3,ДНК длиной в 600 нп, полученная в третьей PCR и кодирующая человеческий proIL-18IEGR. На фиг. 2 показана структура экспрессирующей плазмиды pGEX-pro-IL-18IEGR. (а) Фланкирующие нуклеотидные последовательности BamH I/EcoR I фрагмента кДНК длиной в 600 нп, кодирующего человеческий proIL-18IEGR. Сайты рестрикции BamH I и EcoR I, а также участок связывания фактора Ха показаны скобками. Незакрашенной стрелкой отмечен участок расщепления фактором Ха. (b) Схематическое представление pGEX-2TK. Также показаны сайты рестрикции. Закрашенной стрелкой обозначен участок лигирования ВаmН I/EcoR I во вставке. На фиг. 3 показан SDS-PAGE грубых белковых экстрактов E. coli, экспрессирующей белок слиянияpGEX-2TK без индукции; 2 клетки, трансформированные исходной плазмидой pGEX-2TK и индуцированные 0,1 мМ изопропилтиогалактозида (IPTG). Ожидаемая полоса (26 кДа) глутатионтио-редуктазыpGEX-proIL-18IEGR и неиндуцированные (дорожка 3) или индуцированные IPTG в течение обозначенного времени. Полоса (43 кДа), помеченная стрелкой справа, соответствует размеру белка слияния GST-proIL18IEGR. На фиг. 4 показан SDS-PAGE (10% акриламид) белка слияния GST-proIL-18IEGR после очистки на глутатион-агарозе. Супернатант обработанных ультразвуком бактерий (см. фиг. 3, дорожку 7) подвергали аффинной очистке на глутатион-агарозе. Дорожки представляют собой: 1 маркеры молекулярной массы (отмеченные в кДа с левой стороны); 2 aффинно очищенный GST-proIL-18IEGR. Гель окрашивали кумасси голубым. На фиг. 5 показан SDS-PAGE (12% акриламид) очищенного человеческого IL-18. Белок слиянияGST-proIL-18IEGR задерживали на гранулах глутатион-агарозы и инкубировали с фактором Ха в качестве протеазы в соотношении с субстратом 1:50 (маc./маc.); супернатант анализировали через 6 ч. Дорожка 1,маркеры молекулярной массы, помеченной в кДа с левой стороны; дорожка 2. Человеческий IL-18 в супернатанте от гранул глутатион-агарозы. Гель окрашивали кумасси голубым. На фиг. 6 показано исследование биологической активности человеческого IL-18. Человеческий IL18 в обозначенных дозах добавляли к культурам не прилипающих к пластику мышиных спленоцитов(5 х 106 клеток/лунка) в присутствии конканавалина А (0,125 мкг/мл) и полимиксина В (1 мкг/мл). Супернатант исследовали на предмет наличия интерферона-гамма посредством ELISA. Уровень интерферонагамма, индуцированный IL-18 (100 нг/мл) в отсутствии Con А, составлял 160 пг/мл. На фиг. 7 показана в схематичной форме процедура очистки hIL-18 с использованием каспазы-8. На фиг. 8 показана последовательность GST-pro-hIL-18LETD. Рамкой отмечен участок расщепления каспазой-8. Подчеркнутая последовательность представляет зрелый hIL-18. На фиг. 9 показан окрашенный кумасси голубым SDS-PAGE (10% акриламидный гель), отражающий очистку белка слияния GST-pro-hIL-18LETD на глутатион-агарозе. Супернатант разрушенных клеток рекомбинантной E. coli JM109, экспрессирующей GST-pro-hIL-18LETD, аффинно очищали на глутатионагарозе и обрабатывали каспазой-8 на твердой фазе. Супернатант, полученный после обработки, концентрировали и разделяли по размерам молекул на Superdex-75. Дорожки представляют собой: 1 маркеры молекулярной массы (обозначена в кДа с левой стороны); 2 супернатант разрушенных клеток; 3 аффинно очищенный GST-pro-hIL-18LETD; 4 глутатион-агарозная смола после твердофазной обработки каспазой-8 в течение 4 ч; 5 концентрированный результат обработки каспазой-8 в течение 4 ч; 6 фракция чистогоhIL-18 с Superdex-75. Подробное описание изобретения Согласно настоящему изобретению получена кДНК, кодирующая человеческий proIL-18, в котором участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка фактора Ха. Можно использовать другие мутации с образованием участков, подходящих для других протеаз. Примеры возможных участков расщепления и подходящих протеаз включаютLeu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (SEQ ID NO:1), последовательность, расщепляемую между аминокислотами Arg и Gly протеазой тромбином;Ile-Glu-Gly-Arg- (SEQ ID NО:2), последовательность, расщепляемую после остатка Arg протеазой фактором Ха;Asp-Asp-Asp-Lys- (SEQ ID NО:3), последовательность, расщепляемую после остатка Lys протеазой энтерокиназой;His-Tyr- (SEQ ID NО:4), последовательность, расщепляемую после остатка Туr протеазой субтилизином в его варианте Genenase (New England Biolabs);Tyr-His- (SEQ ID NО:5), последовательность, расщепляемую после остатка Туr протеазой субтилизином в его варианте Genenase (New England Biolabs);Gln протеазой человеческого риновируса 3 С. Подобным образом, получена кДНК, кодирующая человеческий proIL-1, в котором участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка фактора Ха. Можно использовать другие мутации с образованием участков, подходящих для других протеаз. Примеры возможных участков расщепления и подходящих протеаз включаютIle-Glu-Gly-Arg- (SEQ ID NO:2), последовательность, расщепляемую после остатка Arg протеазой фактором Ха;Asp-Asp-Asp-Lys- (SEQ ID NО:3), последовательность, расщепляемую после остатка Lys протеазой энтерокиназой;Gln протеазой человеческого риновируса 3 С. Выбор мутации зависит от следующих параметров: участок расщепления, образованный мутацией,должен быть очень специфичным, чтобы избежать нежелательного расщепления в других участках полипептидного остова proIL-18 или proIL-1; протеаза должна проявлять высокий уровень специфичности в отношении сконструированного участка расщепления; протеаза должна быть легко доступна, например, из коммерческих источников; и мутация не должна вызывать большие изменения во вторичной или третичной структуре proIL-18 или proIL-1. Использование фактора Ха, энтерокиназы или субтилизина является предпочтительным перед другими протеазами, поскольку полученные в результате IL-18 илиIL-1 не имеют мутированных аминокислот. Использование фактора Ха наиболее предпочтительно, поскольку оно требует наиболее консервативных мутаций, таким образом понижая риск изменения вторичной или третичной структуры proIL-18 или proIL-1 и риск того, что расщепление не будет иметь место. Использование фактора Ха или энтерокиназы является предпочтительным перед другими протеазами, поскольку полученные в результате IL-18 или IL-1 не имеют мутированных аминокислот. Для того чтобы сконструировать кДНК, кодирующую человеческий мутантный proIL-18 (proIL18IEGR), в котором участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка расщепления фактором Ха, в кДНК человеческого proIL-18 вводили следующие мутации: L33I; S35G и D36R. Эти мутации составили последовательность IEGR, распознаваемую фактором Ха. Вектор, экспрессирующий человеческий proIL-18IEGR, конструировали следующим образом. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) здорового донора стимулировали бактериальным липополисахаридом (LPS). Из клеток выделяли общую РНК. РНК подвергали обратной транскрипции и полученную ДНК использовали в качестве шаблона в полимеразной цепной реакции (PCR). Мутацию вводили в последовательность с использованием перекрывающихся праймеров в три стадии PCR (фиг. 1). Полученный продукт PCR длиной в 600 нп, кодирующий мутантный человеческий proIL-18, клонировали в клонирующий вектор ТА (pGEM-T easy, Promega) и последовательность его ДНК подтверждали ДНК-секвенированием. Полученную плазмиду pGEM-T-proIL-18IEGR расщепляли EcoR I и ВаmН I и фрагмент длиной 600 нп, кодирующий человеческий proIL-18IEGR, субклонировали в прокариотическом экспрессирующем векторе pGEX-2TK, содержащем последовательность гена GST (Pharmacia). Полученный экспрессирующий вектор, содержащий последовательность гена человеческого proIL-18IEGR, подвергали слиянию в рамку считывания к 3'-концу гена GST (фиг. 2). Затем проводили экспрессию и очистку GST-proIL-18IEGR. Свежую единичную колонию E. coliJM109, трансформированную плазмидой pGEM-T-proIL-18IEGR, выращивали при встряхивании при 37 С до достижения оптической плотности 0,6 при 600 нм. Затем экспрессию белка индуцировали изопропилтиогалактозидом (IPTG) и культивировали далее при 37 С в течение 3 ч. С помощью SDS-PAGE общего бактериального белка была выявлена индукция белка массой 43 кДа, по размерам соответствующегоGST-proIL-18IEGR (фиг. 3). Все последующие стадии выделения GST-proIL-18IEGR проводили при 4 С. Бактерии собирали центрифугированием, ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем ингибиторы протеаз. Бактерии лизировали обработкой ультразвуком, добавляли Triton X-100 до конечной концентрации 1% и смешивали очищенный лизат с гранулами глутатион-агарозы (Pharmacia). Гранулы отмывали и анализировали их аликвоту с помощью SDS-PAGE. При этом была обнаружена единственная полоса на 43 кДа, соответствующая белку слияния GST-proIL-18IEGR (фиг. 4). Гранулы затем обрабатывали фактором Ха и собирали супернатант. SDS-PAGE супернатанта характеризовался большой полосой примерно на 18 кДа, что согласовывалось с ожидаемой массой зрелого человеческогоIL-18. Кроме того, наблюдалась дополнительная, более слабая полоса на 19,5 кДа (фиг. 5). Анализ белковой последовательности полос на 18 и 19,5 кДа в обоих случаях показал наличие ожидаемой N-концевой последовательности зрелого человеческого IL-18. Полоса на 43 кДа, соответствующая белку слиянияGST-proIL-18IEGR, еще присутствовала на SDS-PAGE гранул глутатион-агарозы после их обработки протеазой, что отражало неполное расщепления (не показано). Рекомбинантный человеческий IL-18 тестировали в отношении биологической активности на мышиных спленоцитах на основании их способности индуцировать экспрессию интерферона-гамма. Инкубация не связанных с поверхностью мышиных спленоцитов только с человеческим IL-18 выявила малую продукцию IFN-гамма, что наводило на мысль о необходимости костимулятора. Только Con A при 0,125 мкг/мл не вызывал индукции IFN- на значимом уровне. Когда не связанные с поверхностью спленоциты инкубировали с Con А и IL-18, полученным согласно настоящему изобретению, достигали индукцииIFN-, зависимой от дозы (фиг. 6). Для того чтобы сконструировать кДНК, кодирующую человеческий мутантный proIL-1 (proIL1EGR), в котором участок расщепления каспазой-1 мутирован с образованием участка расщепления фактором Ха, в кДНК человеческого proIL-1 вводят следующие мутации: Y113I, V114G, H115R и D116R. Эти мутации составляют последовательность IEGR, распознаваемую фактором Ха. Чтобы сконструировать вектор, экспрессирующий человеческий proIL-1IEGR, осуществляют следующие стадии. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) здорового донора стимулируют бактериальным липополисахаридом (LPS). Из клеток выделяют общую РНК. РНК подвергают обратной транскрипции и полученную ДНК используют в качестве шаблона в полимеразной цепной реакции(PCR) с праймерами, соответствующими кодирующей последовательности человеческого IL-1. Полученный продукт PCR клонируют в клонирующий вектор ТА, например pGEM-T easy от Promega, и затем подвергают сайт-специфическому мутагенезу подходящими олигонуклеотидами. Последовательность полученного вектора подтверждают ДНК-секвенированием. Полученную плазмиду pGEM-T-proIL1IEGR расщепляют надлежащими ферментами рестрикции и фрагмент длиной примерно 820 нп, кодирующий человеческий proIL-1IEGR, субклонируют в прокариотическом экспрессирующем вектореpGEX-2TK, содержащем последовательность гена GST (Pharmacia). Полученный экспрессирующий вектор содержит последовательность гена человеческого proIL-1IEGR, подвергнутого слиянию в рамку считывания с 3'-концом гена GST. Экспрессию и очистку GST-proIL-1IEGR проводят сходным образом. Свежую единичную колониюE. coli JM109, трансформированную плазмидой pGEM-T-proIL-1IEGR, выращивают при встряхивании при 37 С до достижения оптической плотности 0,6 при 600 нм. Затем экспрессию белка индуцируют изопропилтиогалактозидом (IPTG) и культивируют далее при 37 С в течение 3 ч. С помощью SDS-PAGE общего бактериального белка выявляют индукцию белка массой 52 кДа по размерам соответствующегоGST-proIL-1IEGR. Все последующие стадии выделения GST-proIL-1IEGR проводят при 4 С. Бактерии собирают центрифугированием, ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем ингибиторы протеаз. Бактерии лизируют обработкой ультразвуком, добавляют Triton X-100 до конечной концентрации 1% и смешивают очищенный лизат с гранулами глутатион-агарозы (Pharmacia). Гранулы отмывают и анализируют их аликвоту с помощью SDS-PAGE на присутствие белка слияния GST-proIL1IEGR массой 52 кДа. Затем гранулы обрабатывают фактором Ха и собирают супернатант, содержащий зрелый человеческий IL-1. В другом осуществлении настоящего изобретения экспрессию и очистку полипептида проводят посредством продукции белка слияния, содержащего участок расщепления каспазой. Плазмиду, экспрессирующую связывающий пептид в слиянии с интересующим белком, можно мутировать так, что участок расщепления каспазой будет введен в позиции, удобной для очистки активного полипептида. Участки распознавания каспазы составляют 4 аминокислоты, последней из которых является аспарагиновая кислота. В целом, каспазы проявляют более высокую и отличную от обычно используемых протеаз специфичность участков расщепления и имеют значительные преимущества перед ранее описанными протеазами, будучи удобными для расщепления пептидов слияния. Пример процедуры очистки приведен на фиг. 7. Предпочтительные участки расщепления для каждой каспазы описаны в литературе (Ann. Rev. Biochem.,1999, 68:383-424). Все они обычно содержат остаток Asp в позиции P1. Описанную выше плазмиду pGEM-T-proIL-18IEGR модифицировали с получением другого мутантного человеческого proIL-18 (proIL-18LETD, см. фиг. 8), в котором участок расщепления фактором Ха мутируют с образованием участка расщепления каспазой-8. Это позволяет использовать для расщепления каспазу-8. Другим преимуществом использования каспазы является ее высокая эффективность в отношении выхода и времени расщепления. Было обнаружено, что при сравнении количества белка IL-18, полученного от pGEM-T-proIL-18IEGR и pGEM-T-proIL-18LETD, количество фермента и время, необходимые для получения 1 мг hIL-18, уменьшаются. Процедура приводит к продукции белка с ожидаемым размером-5 006825 Каспаза-8 не является единственной применимой каспазой, и, в зависимости от наличия или отсутствия участка расщепления специфической каспазой в интересующем в плане очистки белке или от любых других критериев, можно использовать мутации, соответствующие участкам расщепления любой другой каспазой. Каспазу можно отделить от интересующего белка с использованием стандартных способов очистки,таких как, например, гель-фильтрация или ионообменная хроматография. В заключение, описанный здесь способ позволяет получать из E. coli очищенные, биологически активные человеческие белки, такие как IL-18 и IL-1. Оказывается, что для правильного фолдинга этих цитокинов требуется их экспрессия вначале в форме предшественников и затем расщепление до их зрелой формы. Человеческий IL-18 в этом отношении отличается от мышиного IL-18, который может экспрессироваться в бактериальных клетках в виде зрелого, биологически активного цитокина. Теперь изобретение будет проиллюстрировано следующими, не ограничивающими его, примерами. Пример 1. Конструирование плазмиды, кодирующей человеческий proIL-18 с участком фактора Ха. РМВС получали из периферической крови здорового добровольца разделением на градиенте плотности Ficoll-Paque PLUS (Pharmacia). Затем РМВС дважды отмывали ледяным PBS, содержащим 2%FBS, и ресуспендировали до 2,5 х 106 клеток/мл в среде RPMI-1640, дополненной фетальной бычьей сывороткой (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина (RPMI-10). Культуру стимулировали LPS (1 мкг/мл, 3 ч, 37 С). Общую РНК экстрагировали из клеток с помощьюTriPure Isolation Reagent (Boehringer Mannheim) согласно инструкции производителя. кДНК proIL-18IEGR конструировали путем трехстадийной PCR с использование метода перекрывающихся праймеров. Различные праймеры создавали на основе кДНК человеческого proIL-18 (GenBank accession no. D49950, (3. Для первой PCR прямым праймером являлся следующий: 5'-AACATCGAAGGTCGTTACTTTGGCAAGCTTGAATC-3' (SEQ ID NO:7), a обратным праймером был 5'-CGCGAATTCCTAGTCTTCGTTTTGAACAGT-3' (SEQ ID NO:8). Сайт Eco RI входил в состав обратного праймера. Шаблоном служила подвергнутая обратной транскрипции общая клеточная РНК, выделенная из РВМС, стимулированных LPS. Условия термоцикла были следующими: 10 циклов (94 С, 30 с; 55 С, 30 с и 68 С, 2 мин), после чего следовали 25 циклов (94 С, 30 с; 55 С, 30 с и 68 С, 125 с/цикл). Полученный продукт PCR длиной 498 нп амплифицировали на следующей стадии PCR, используя перекрывающийся прямой праймер 5'-TGGCAATGAAATTTATTGACAATACGCTTTACTTTATAGCTGAAGATGATGAAAACATCGAAGGTCGTTACTTTG-3' (SEQ ID NO:9) и тот же, что на предыдущей стадии, обратный праймер. Условия термоцикла были следующими: 30 циклов (94 С, 30 с; 56 С, 30 с и 72 С, 1 мин). Полученный продукт длиной 551 нп амплифицировали на третьей стадии PCR, используя перекрывающийся прямой праймер 5'-CGTGGATCCATGGCTCTGAACCAGTAGAAGACAATTGCATCAACTTTGTGGCAATGAAATTTATTGAC-3' (SEQ ID NO:10) и тот же, что на предыдущей стадии, обратный праймер. В состав прямого праймера входил сайт ВаmН I. Условия термоцикла были теми же, что и на предыдущей стадии. Полученный продукт PCR длиной 0,6 тыс.нп (фиг. 1) очищали посредством набора High Pure для очистки продуктов PCR (Boehringer Mannheim) и лигировали в состав вектора pGEM-T Easy с получением плазмиды pGEM-proIL-18IEGR. Продуктами лигирования трансформировали компетентные клетки JM109(Promega Corporation). На всем протяжении работы использовали стандартные протоколы клонирования (11). Плазмиду pGEM-proIL-18IEGR проверяли на наличие правильной вставки путем обработки ферментами рестрикции и ДНК-секвенирования. Плазмиду обрабатывали ВаmН I и EcoR I. Полученную ВаmНI/EcoR I ДНК, кодирующую человеческий proIL-18IEGR, подвергали электрофорезу в 1,0% агарозе и выделяли из геля полосу, соответствующую 0,6 тыс.нп, посредством QIAquick Gel Extraction Kit (DIAGEN,Germany). Эту ДНК лигировали в состав экспрессирующего вектора pGEX-2TK (Pharmacia), который был линеаризован с помощью ВаmН I и EcoR I. Полученной рекомбинантной плазмидой pGEX-proIL18IEGR (фиг. 2) трансформировали штамм E. coli JM109 и подтверждали последовательность полученного вектора обработкой ферментами рестрикции и ДНК-секвенированием. Пример 2. Экспрессия и очистка белка слияния GST-proIL-18IEGR. 50 мл инкубировавшейся в течение ночи культуры из свежей единичной колонии E. coli JM109,трансформированной плазмидой pGEX-proIL-18IEGR, растворяли в 450 мл среды LB, содержащей 100 Ед/мл ампициллина и выращивали при встряхивании при 37 С до достижения оптической плотности при 600 нм, равной 0,6. Затем экспрессию белка индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации 0,1 мМ и дальнейшим культивированием в течение 3 ч при 37 С. Бактерии осаждали путем центрифугирования (5000 хg, 5 мин, 4 С) и быстро ресуспендировали в 1:100 от первоначального объема ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS; 150 мМ NaCl, 16 мМ Na2HPO4, 4 мМ NaH2PO4, рН 7,3), содержащего ингибиторы протеаз (лейпептин 1 мкг/мл, пепстатин А 1 мкг/мл, апротинин 2 мкг/мл, PMSF 0,2 мМ иEDTA 5 мМ). Клетки лизировали на льду мягкой обработкой ультразвуком (4 импульсами по 15 с). Добавляли Triton X-100 до конечной концентрации 1% и смесь держали на льду в течение 5 мин. Очищенный от осадка лизат (14000 хg, 15 мин, 4 С) смешивали с 50% суспензией гранул глутатион-агарозы (2 мл,-6 006825Pharmacia) и инкубировали смесь при мягком встряхивании при 4 С в течение 3 ч. Гранулы осаждали центрифугированием (500 хg, 5 мин), дважды отмывали 10 объемами буфера для лизиса (1% Triton X-100 в PBS), дважды - 10 объемами 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl и дважды - 10 объемами 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 2,0 мМ CaCl2 (буфер расщепления) . Все стадии выполняли при 4 С. Пример 3. Расщепление белка слияния и очистка зрелого человеческого IL-18. Гранулы глутатион-агарозы со связанным белком слияния GST-proIL-18IEGR инкубировали (6 ч,23 С) с фактором Ха (New England Biolabs) в 1 мл буфера расщепления, используя протеазу в соотношении к субстрату 1:50 (маc./маc.), при постоянном перемешивании на ротаторе. На этой стадии освобождается зрелый человеческий IL-18. Гранулы осаждали центрифугированием при 500 хg в течение 5 мин при 4 С и отмывали 5 раз 2 мл ледяного PBS. Супернатант и все объемы отмывки объединяли, очищали от осадка центрифугированием (14000 хg, 15 мин, 4 С) и концентрировали путем ультрафильтрации(Centricon-10, Amicon). Аликвоты белка, так же как и гранулы до и после обработки, подвергали электрофорезу в 0,1% SDS-12% полиакриламидном геле с последующей окраской кумасси голубым. При электрофорезе супернатанта получили большую полосу примерно на 18 кДа, что согласовывалось с ожидаемой массой зрелого человеческого IL-18. Кроме того, наблюдалась малая полоса на 19,5 кДа (фиг. 5). При анализе N-концевой последовательности белка из двух полос получили последовательностьYFGK, что согласовывалось с таковой зрелого человеческого IL-18. Очищенный белок стерилизовали,пропуская через фильтр 0,2 мкм, и хранили при -70 С. Пример 4. Исследование биологической активности человеческого IL-18. Активность человеческого IL-18 выявляли, как описано в (2). В кратком изложении, селезенки нормальных мышей линии С 3 Н/HeJ выделяли, измельчали и помещали в буфер Джея (Gey buffer; 0,144 МNH4Cl в 0,017 М трис-HCl, рН 7,2) для разрушения эритроцитов. Лейкоциты дважды отмывали RPMI-5 и затем ресуспендировали в RPMI-10. Для получения не прилипающих к пластику клеток клеточные суспензии инкубировали (60 мин, 37 С) в 100 мм пластиковых чашках (Becton Dickinson Ltd., UK). He сорбировавшиеся клетки аккуратно отбирали, центрифугировали и ресуспендировали в RPMI-10. Жизнеспособные клетки подсчитывали при помощи исключающего мертвые клетки теста - окраски трипановым синим - и концентрацию клеток доводили до 5 х 106 клеток/мл. При помощи этой процедуры избавлялись от большей части неспецифических эстераза-положительных клеток. Суспензию не прилипающих к пластику клеток (0,15 мл) помещали в 96-луночный плоскодонный культуральный планшет для микротитрования (NUNCLON, Дания). IL-18 в различных концентрациях, полимиксин (1 мкг/мл) иCon A (0,125 мкг/мл) добавляли в лунки в 50 мкл RPMI-10. Планшеты инкубировали в течение 24 или 48 ч при 37 С в 5% CO2. После инкубации супернатанты собирали и определяли титры мышиного IFN- посредством ELISA. При инкубации не прилипающих к пластику мышиных клеток селезенки только с человеческим IL-18 выявляли малую продукцию IFN-, что указывало на необходимость костимуляции. Добавления одного Con А в концентрации 0,125 мкг/мл не индуцировало значительного уровня IFN-. Когда не прилипающие спленоциты инкубировали с Con А и человеческим IL-18, полученным в настоящем изобретении, получали зависимую от дозы индукцию IFN- (фиг. 6). Пример 5. Конструирование плазмиды, кодирующей человеческий proIL-1 с участком фактора Ха. РМВС получали из периферической крови здорового добровольца разделением на градиенте плотностиFicoll-Paque PLUS (Pharmacia). Затем РМВС дважды отмывали ледяным PBS, содержащим 2% FBS, и ресуспендировали до 2,5 х 106 клеток/мл в среде RPMI-1640, дополненной фетальной бычьей сывороткой (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина (RPMI-10). Культуру стимулировалиLPS (1 мкг/мл, 3 ч, 37 С). Общую РНК экстрагировали из клеток с помощью TriPure Isolation Reagent (Boehringer Mannheim). 1 мг общей РНК использовали для RT-PCR с помощью однопробирочного теста Titan дляRT-PCR (Boehringer Mannheim) согласно инструкции производителя. кДНК proIL-1 клонировали путем PCR со смысловым и обратным праймерами, созданными на основе кДНК человеческого proIL-1 (GenBank accession no. M15330). Смысловой праймер соответствовал нуклеотидам 87-107 последовательности M15330, предшествующим участку расщепления BamH I. Обратный праймер соответствовал нуклеотидам 896-876 последовательности M15330, предшествующим участку EcoR I. Шаблоном служила подвергнутая обратной транскрипции общая клеточная РНК, выделенная из РВМС, стимулированных LPS. Условия термоцикла были следующими: 10 циклов (94 С, 30 с; 55 С, 30 с и 68 С, 2 мин), после чего следовали 25 циклов (94 С, 30 с; 55 С, 30 с и 68 С, 125 с/цикл). Полученный продукт PCR длиной 830 нп очищали посредством набора High Pure для очистки продуктов PCR (Boehringer Mannheim) и лигировали в состав вектора pGEM-T Easy с получением плазмиды pGEM-proIL-l. Плазмиду подвергали сайт-специфическому мутагенезу с применением олигонуклеотида ACATGGGATAACGACGCTATTGAAGGCCGGGCACCTGTACGA (SEQ ID NO:11), соответствующего нуклеотидам 405-452 мРНК человеческого IL-1 и несущего мутации Y113I, V114E, H115G иD116R. Полученную плазмиду pGEM-proIL-1IEGR из единичной колонии проверяли на наличие правильной вставки путем обработки ферментами рестрикции и ДНК-секвенирования. Плазмиду обрабатывали ВаmН I и EcoR I. Полученную BamH I/EcoR I ДНК, кодирующую человеческий proIL-1IEGR, подвергали-7 006825 электрофорезу в 1,0% агарозе и выделяли из геля полосу, соответствующую 0,82 тыс.нп, посредствомQIAquick Gel Extraction Kit (DIAGEN, Germany). Эту ДНК лигировали в состав экспрессирующего вектора pGEX-2TK (Pharmacia), который был линеаризован с помощью BamH I и EcoR I. Полученной рекомбинантной плазмидой pGEX-proIL-1IEGR трансформировали штамм E. coli JM109 и подтверждали последовательность полученного вектора обработкой ферментами рестрикции и ДНК-секвенированием. Пример 6. Экспрессия и очистка белка слияния GST-proIL-1IEGR. 50 мл инкубировавшейся в течение ночи культуры из свежей единичной колонии E. coli JM109,трансформированной плазмидой pGEX-proIL-1IEGR, растворяли в 450 мл среды LB, содержащей 100 Ед/мл ампициллина, и выращивали при встряхивании при 37 С до достижения оптической плотности при 600 нм,равной 0,6. Затем экспрессию белка индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации 0,1 мМ и дальнейшим культивированием в течение 3 ч при 37 С. Бактерии осаждали путем центрифугирования(5000 хg, 5 мин, 4 С) и быстро ресуспендировали в 1:100 от первоначального объема ледяного фосфатносолевого буфера (PBS; 150 мМ NaCl, 16 мМ Na2HPO4, 4 мМ NaH2PO4, pH 7,3), содержащего ингибиторы протеаз (лейпептин 1 мкг/мл, пепстатин А 1 мкг/мл, апротинин 2 мкг/мл, PMSF 0,2 мМ и EDTA 5 мМ). Клетки лизировали на льду мягкой обработкой ультразвуком (4 импульсами по 15 с). Добавляли TritonX-100 до конечной концентрации 1% и смесь держали на льду в течение 5 мин. Очищенный от осадка лизат (14000 хg, 15 мин, 4 С) смешивали с 50% суспензией гранул глутатион-агарозы (2 мл, Pharmacia) и инкубировали смесь при мягком встряхивании при 4 С в течение 3 ч. Гранулы осаждали центрифугированием (500 хg, 5 мин), дважды отмывали 10 объемами буфера для лизиса (1% Triton Х-100 в PBS), дважды - 10 объемами 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl и дважды - 10 объемами 20 мМ трис-HCl, рН 8,0,150 мМ NaCl, 2,0 мМ CaCl2 (буфер расщепления). Все стадии выполняли при 4 С. Пример 7. Расщепление белка слияния и очистка зрелого человеческого IL-1. Гранулы глутатион-агарозы со связанным белком слияния GST-proIL-1IEGR инкубировали (6 ч,23 С) с фактором Ха (New England Biolabs) в 1 мл буфера расщепления, используя протеазу в соотношении к субстрату 1:50 (маc./маc.), при постоянном перемешивании на ротаторе. На этой стадии освобождается зрелый человеческий IL-1. Гранулы осаждали центрифугированием при 500 хg в течение 5 мин при 4 С и отмывали 5 раз 2 мл ледяного PBS. Супернатант и все объемы отмывки объединяли, очищали от осадка центрифугированием (14000 хg, 15 мин, 4 С) и концентрировали путем ультрафильтрации(Centricon-10, Amicon). Аликвоты белка, так же как и гранулы до и после обработки, подвергали электрофорезу в 0,1% SDS-12% полиакриламидном геле с последующей окраской кумасси голубым. При электрофорезе супернатанта получили большую полосу примерно на 17 кДа, что согласовывалось с ожидаемой массой зрелого человеческого IL-1. Очищенный белок стерилизовали, пропуская через фильтр 0,2 мкм, и хранили при -70 С. Пример 8. Конструирование плазмиды кодирующей человеческий proIL-18 с участком расщепления каспазой-8. Рекомбинантную плазмиду pGEX-pro-IL-18IEGR из примера 1 модифицировали вставкой амплифицированного путем PCR фрагмента ДНК с участком расщепления каспазой-8 (LETD). В кратком изложении, pGEX-pro-IL-18IEGR обрабатывали ферментами рестрикции ВАМ HI в позиции 951 и Hind III в позиции 1074, отрезая порцию ДНК, содержащую Pro-домен, участок расщепления фактором Ха (IEGR) и три аминокислоты от N-конца hIL-18. Ту же плазмиду использовали как шаблон для амплификации в PCR путем введения мутированного участка LETD в состав располагающегося ниже праймера atgcAAG CTT GCC ААА GTA GTC GGT ТТСCAG GTT ТТС АТС АТС ТТС AGC ТАТ АА (SEQ ID NO:12). Фрагмент PCR очищали с использованием набора для получения высокоочищенного продукта ("high pure product purification"; Boehringer Mannheim),после чего сходным образом нарезали посредством ВАМ HI и Hind III с получением вставки длиной 123 нп. Открытый вектор и вставку разделяли на агарозном геле и экстрагировали с использованием коммерческого набора Jet Sorb (Genomed). Лигирование проводили в течение ночи, используя лигазу Т 4 (NewEngland Biolabs, Beverly MA, США), и трансформировали продуктами лигирования компетентные клеткиE. coli DH5a. Выделяли и субкультивировали несколько колоний и получали препараты Miniprep посредством набора Qiagen. Чтобы секвенировать существенную часть рекомбинантной плазмиды, все препараты Miniprep подвергали амплификации путем PCR (Perkin Elmer Gene Amp- AmpiTaq DNA polymeraze). Окончательную трансформацию проводили на компетентных бактериях E. coli JM109, следуя способуTSS (Chung, С.Т. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2172-2175). Пример 9. Экспрессия и очистка белка слияния GST-proIL-18LETD. Используя плазмиду, сконструированную согласно приведенному выше примеру 8, экспрессию белка GST-proIL-18LETD проводили в флаконах при встряхивании и 5-литровых ферментерах, по существу, так же, как описано выше в примере 2. Пример 10. Расщепление белка слияния с использованием каспазы-8 и очистка зрелого человеческого IL-18. Гранулы глутатион-агарозы со связанным белком слияния GST-proIL-18LETD инкубировали (6 ч,23 С) с каспазой-8 (calbiochem) в 1 мл буфера расщепления (описанном в примере 6), используя соотно-8 006825 шение протеаза:субстрат 1:1200 (маc./маc.), при постоянном перемешивании на ротаторе или роллере. Гранулы осаждали центрифугированием при 500 хg в течение 5 мин при 4 С и отмывали 5 раз 2 мл ледяного PBS. Супернатант и все объемы отмывки объединяли, очищали от осадка центрифугированием(14000 хg, 15 мин, 4 С) и концентрировали путем ультрафильтрации (Centricon-10, Amicon). Концентрированную после обработки смесь разделяли по размерам молекул на Superdex-75 (Pharmacia), чтобы отделить hIL-18 (18 кДа) от высокомолекулярных продуктов расщепления и оставшегося протеолитического фермента (гетеродимер каспазы-8, 29 кДа, и гетеротетрамеры, 58 кДа). В различных фракциях Superdex-75 анализировали ферментную активность каспазы-8 с использованием набора для анализа каспазы-8 и флуорогенного субстрата Ac-IETD-AMC (BIOMOL), и эта активность наблюдалась в фракциях, соответствующих молекулярной массе 55 кДа (соответствующих гетеротетрамеру каспазы-8); так было показано, что каспаза-8 очень хорошо отделилась от фракций, содержащих hIL-18 (18 кДа). Фракции после гель-фильтрации, содержащие высокоочищенный hIL-18 массой 18 кДа, объединяли, концентрировали на Centricon-10 (Amicon), в конце стерилизовали, пропуская через 0,22 мкм фильтр,и хранили при -80 С. Аликвоты белка, так же как и гранулы до и после обработки, подвергали электрофорезу в 0,1%SDS-12% полиакриламидном геле с последующей окраской кумасси голубым (фиг. 9). При электрофорезе фракции супернатанта наблюдали полосу на 18 кДа, что согласовывалось с ожидаемой массой зрелого человеческого IL-18. Анализ фракции гранул показал, что не происходит полного расщепления, поскольку на гранулах остался связанный белок-предшественник. Более того, во фракции гранул осталось некоторое количество расщепленного IL-18. Пример 11. Исследование биологической активности человеческого IL-18, полученного путем расщепления каспазой-8. Активность человеческого IL-18 оценивали, как описано (10). В кратком изложении, клетки KG-1 культивировали в DMEM, содержащей 20% FBS. Для анализа IL-18 клетки KG-1 ресуспендировали в концентрации 1,2 х 106 клеток/мл (250 мкл/лунку, 48-луночный планшет) и стимулировали mTNF (Innogenetics) вместе с hIL-18 в различных концентрациях (несколько разведений, начиная с 80 нг/мл). Планшет инкубировали в течение 24 ч при 37 С в 5% СO2. После инкубации супернатанты собирали и определяли содержание мышиного IFN- посредством ELISA (rec. hIFN- и анти-hIFN- от RD Systems). Человеческий IL-18 индуцировал зависимую от дозы продукцию IFN- с активностью, идентичной таковой у hIL-18, полученного путем конструирования участка расщепления фактором Ха. Ссылки 1. Nakamura, K., Okamura, H., Nagata, K., Komatsu, Т., and Tamura, Т. (1993) Infect. Immun. 61, 64-70. 2. Okamura, H., Tsutsui, H., Komatsu, Т., Yutsudo, M., Hakura, A., Tanimoto, Т., Torigoe, K., Okura, Т.,Nukada, Y., Hattori, K., Akita, K., Namba, M., Tanabe, F., Konishi, K., Fukuda, S., and Kurimoto, M. (1995) ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения биологически активной молекулы из ее биологически неактивного предшественника, включающий обеспечение мутирования его нативного участка расщепления каспазой-1 с образованием участка, расщепляемого протеазой, и расщепление мутированной молекулы с получением биологически активной молекулы, причем указанная биологически активная молекула представляет собой цитокин. 2. Способ по п.1, где цитокин выбран из IL-1 и IL-18. 3. Способ по любому из предшествующих пунктов, где протеаза выбрана из тромбина, энтерокиназы, субтилизина, гененазы (genenase), протеазы человеческого риновируса 3 С, протеазы фактора Ха и каспазы, предпочтительно каспазы-8. 4. кДНК, кодирующая предшественник биологически активной молекулы, мутированный в нативном участке его расщепления каспазой-1 с образованием участка, расщепляемого протеазой, необязательно подвергнутый слиянию с последовательностью, кодирующей GST, причем указанная биологически активная молекула представляет собой цитокин, выбранный из IL-1 и IL-18. 5. Способ получения биологически активной молекулы, включающий трансфекцию клеток-хозяев вектором, содержащим кДНК, кодирующую неактивный предшественник биологически активной молекулы, мутированный в нативном участке его расщепления каспазой-1 с образованием участка, расщепляемого протеазой, культивирование трансфицированных клеток-хозяев и выделение биологически активной молекулы после обработки протеазой, причем указанная биологически активная молекула представляет собой цитокин. 6. Способ по п.5, где кДНК подвергают слиянию в рамке считывания с последовательностью, кодирующей глутатион-S-трансферазу (GST), и экспрессированную молекулу слияния задерживают на гранулах глутатион-агарозы перед обработкой протеазой.