Инфекционные клоны вируса ньюкаслской болезни, вакцины и диагностические анализы

1 Настоящее изобретение касается инфекций вируса ньюкаслской болезни домашней птицы. Вирус ньюкаслской болезни (NDV) является одним из наиболее многообразных и смертельно опасных патогенов птиц. Почти одновременное распространение ньюкаслской болезни как явно новый тип заболевания в различных географических регионах и большое число типов разновидности и опасности заболевания вызвало некоторые проблемы в номенклатуре. Эту болезнь называют pseudo fowl pest,pseudo poultry plague, avian pest, avian distemper и avian pneumoencephalitis. Значение этой болезни определяется, главным образом, тем, что в XX веке птицеводство превратилось в интенсивно развивающуюся международную отрасль хозяйства, что сопровождается активными торговыми связями между странами. В целом, считается, что первые вспышки ньюкаслской болезни были зарегистрированы в 1926 г. на острове Ява (Индонезия), а также в г. Ньюкасле-на-Тайне в Англии (Kraneveld,1926; Doyle, 1927). Название ньюкаслская болезнь было дано Дойлом как временное для того, чтобы при описании избежать путаницы по отношению к другим болезням. Позднее стало ясно, что другие менее тяжелые болезни обусловливались вирусами, не отличающимися отNDV. В США относительно легко протекающее респираторное заболевание было названо пневмоэнцефалитом птиц и как было показано, оно вызывалось вирусом NDV (Beach, 1944). В течение нескольких лет многочисленные изолятыNDV, которые у домашних кур вызывали очень слабые симптомы или вообще являлись бессимптомными, были описаны для различных районов мира. Было установлено влияние следующих механизмов на распространение данной болезни: 1) перемещения птиц вообще, диких птиц, дичи,почтовых голубей и одомашненных птиц; 2) перемещение людей и грузов; 3) перемещение продуктов птицеводства; 4) распространение частиц, взвешенных в воздухе; 5) загрязнение кормов для птицеводства; 6) загрязнение воды; 7) не полностью убитые или гетерогенные вакцины. В соответствии с OIE, ньюкаслская болезнь представляет заболевание домашней птицы, вызываемое вирусом серотипа-1 парамиксовирусов птиц (APMV-1), который характеризуется индексом интрацеребральной патогенности(ICPI) у суточных цыплят на уровне 0,7 или выше. Вирулентность вируса также может быть подтверждена на основании наличия множественных основных аминокислот на С-конце белка F2 и присутствия F (фенилаланина) в 117-м положении, являющимся N-концом белка F1. Отсутствие признаков такой аминокислотной последовательности может требовать применения тестов ICPI. Термин домашняя птица обозначает домашних кур, индеек, фазанов, уток,гусей, перепелок, голубей, цесарок, куропаток и 2 нелетающих птиц (страусов и др.), которых выращивают или содержат в неволе для размножения, производства мяса и яиц для потребления или для искусственного воспроизводства природных популяций дичи. В соответствии с Alexander, 1988, три панзоотии ньюкаслской болезни были идентифицированы после первого описания данной болезни. Первая из них вызывала первые вспышки заболевания и, как считается, возникла в ЮгоВосточной Азии. Отдельные вспышки, такие как вспышка заболевания в Англии в 1926 г.,отражали случайные проникновения, опережающие медленно надвигавшиеся через Азию на Европу инфекции. Вторая панзоотия, как считается, появилась в Средней Азии в конце 60-х годов XX века и достигла большинства стран к 1973 г. Наиболее быстрое распространение второй панзоотии,по-видимому, объясняется настоящей революцией в птицеводстве, сопровождающейся интенсивной международной торговлей. Третья панзоотия в основном поразила одомашненных птиц, таких как голуби (VindevogelDuchatel, 1988). Эта вспышка заболевания предположительно возникла на Среднем Востоке в конце 70-х годов. К 1981 г. она достигла Европы и затем быстро распространилась в другие районы мира, в основном в результате контакта между птицами во время выставок и соревнований, а также в результате международной торговли такими птицами. В настоящее время ньюкаслская болезнь весьма широко распространена во многих странах Азии, Африки, обеих Америк и Европы. Только страны Океании относительно свободны от этой болезни (Spradbrow, 1988). Вирус NDV относится к отряду Mononegavirales, семейству парамиксовирусов Paramyxoviridae, подсемейству Paramyxovirinae, родуRubvlavirus. Помимо NDV, обычно называемого парамиксовирусом 1-го типа птиц, восемь других серотипов, обозначенных как парамиксовирусы типов от 2 до 9 птиц, могут быть идентифицированы на основании параметров их антигенного родства, определяемых в тестах на ингибирование гемагглютинации и в тестах на нейтрализацию сыворотки (Alexander, 1993). Несмотря на стабильность серологической дифференцировки, имеется ряд перекрестных родственных отношений между вирусами, относящихся к различным серотипам. Геном NDV представлен молекулой одноцепочечной РНК с отрицательной полярностью,комплементарной информационной мРНК, которая кодирует вирусные белки. РНК-геном состоит приблизительно из 15200 нуклеотидов и кодирует следующие генные продукты (перечислены от 3'-конца к 5'-концу последовательности геномной РНК): нуклеокапсидный белок(NP), фосфопротеин (Р), матричный белок (М),белок слияния (F), гемагглютинин-нейрами 3 нидаза (HN) и крупный белок с полимеразной активностью (L) (Chambers et al., 1986). РНК формирует комплекс с белками NP, P и L с образованием рибонуклеокапсидной частицы (RNP), которая окружена оболочкой, выстланной с внутренней стороны белком М. В состав оболочки входят белки F и HN, которые участвуют в процессах присоединения к клеткехозяину и проникновения в нее. Репликация NDV сходна по своим основным параметрам с таковой у других парамиксовирусов. Исходным этапом является прикрепление вируса к рецепторам клетки-хозяина, в котором участвует вирусный белок HN. Слияние вирусной оболочки с мембраной клетки-хозяина определяется действием как белка HN, так и белка F, в результате чего RNP высвобождается непосредственно в цитоплазму, где происходит репликация вируса. Вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза(входящая в состав RNP) участвует в образовании комплементарных транскриптов, которые выполняют роль мРНК и используются трансляционной системой клетки-хозяина для синтеза вирусных белков. Благодаря накоплению белкаNP, комплекс РНК-полимеразы переключает транскрипцию на репликацию, в результате чего происходит синтез полноразмерных геномных и антигеномных (комплементарных) молекул РНК. Новосинтезированные RNP упаковываются в капсиды на клеточной мембране в результате активности белка М, а также белков F и HN,которые накапливаются на клеточной плазматической мембране. Новообразованные вирусные частицы высвобождаются с инфицированной клетки по механизму почкования. Более подробное описание процессов репликации NDV можно найти у Peeples, 1988. В качестве более поздних обзоров по молекулярной биологии парамиксовирусов см. LambKolakofsky, 1996. Помимо промышленных домашних птиц(т.е. кур, цесарок, фазанов, индеек, уток, гусей,голубей), очень широкий круг содержащихся в неволе, частично одомашненных видов и диких(свободноживущих) птиц, включая мигрирующих водоплавающих птиц, восприимчивы кNDV и могут являться первичными источниками инфекции (KaletaBaldauf, 1988). Патогенность штаммов NDV в значительной степени зависит от вида поражаемого организма. Наиболее устойчивыми видами, повидимому, являются водоплавающие птицы, в то время как наиболее восприимчивыми являются стайные птицы, временами образующие стабильные скопления. Домашние куры характеризуются высоким уровнем восприимчивости,но утки и гуси также могут заражаться, проявляя при этом слабые симптомы болезни или не проявляя их вовсе, даже при заражении штаммами, летальными для кур. 4 Ньюкаслская болезнь осложнена тем, что различные изоляты и штаммы этого вируса могут индуцировать самую широкую изменчивость тяжести болезни. Штаммы и изолятыNDV были классифицированы (BeardHanson,1984) в различные патотипы, характеризующиеся симптомами болезни, которые можно выявить у полностью восприимчивых кур: 1) висцеротропный велогенный NDV, вызывающий острую летальную инфекцию, при которой в кишечнике происходят кровоизлияния; и нейротропный велогенный NDV, который вызывает высокую смертность, обусловливаемую респираторными и нейрологическими симптомами,но без поражения кишечника; 2) мезогенныйNDV, который обусловливает низкий уровень смертности, острую респираторную инфекцию и симптомы в нервной системе у отдельных птиц; 3) лентогенный NDV, который вызывает слабую респираторную инфекцию или не вызывает ее вовсе, или даже бессимптомный кишечный NDV, авирулентный вирус, который в основном воспроизводится в клетках пищеварительного тракта. Сообщалось о некотором перекрывании симптомов у разных групп. Вирус попадает в организм через дыхательные пути или пищеварительный тракт, или через глаза. В трахее вирус распределяется с участием реснитчатого эпителия и по механизму от клетки к клетке. После исходного размножения в месте проникновения вирус в результате периодов виремии переносится в селезенку, печень, почки и легкие. Вирусы некоторых штаммов достигают жизненно важных органов, таких как печень и почки, очень быстро,поэтому птицы могут погибать еще до того, как у них проявятся визуальные симптомы болезни. Большинство вирусов достигает центральной нервной системы через кровь до того момента, как начинает вырабатываться достаточное количество антител. Потенциальную угрозу для птицеводства представляет статус длительного бессимптомного носительства, предположительно характерного для попугаев. Долговременное носительство как лентогенного, так и велогенного вируса также может иметь место у кур (HeuscheleEasterday, 1970). В процессе репликации NDV для того,чтобы он стал инфекционным, необходимо,чтобы гликопротеин-предшественник Fо был расщеплен с образованием F1 и F2 (RottKlenk, 1988). Такое посттрансляционное расщепление происходит с участием протеаз клеткихозяина. Если такое расщепление отсутствует,то образуются инфекционные вирусные частицы, а репликации вирусов не происходит. БелокFo вирулентных вирусов может быть расщеплен с участием широкого круга протеаз, однако,белки Fo вирусов, характеризующихся слабой вирулентностью, ограничены по своей восприимчивости к протеазам, поэтому такие вирусы могут in vivo расти только в некоторых типах 5 клеток-хозяев и в принципе не способны растиin vitro. Лентогенные вирусы реплицируются только в участках, имеющих трипсиноподобные ферменты, таких как дыхательный и пищеварительный тракты, в то время как вирулентные вирусы могут реплицироваться в значительном числе тканей и органов, в результате чего развивается фатальная системная инфекция. Аминокислотное секвенирование предшественника Fo показало, что слабовирулентные вирусы включают единственный остаток аргинина (R) , который соединяет компоненты F1 иF2, в то время как у вирулентных вирусов имеются дополнительные основные аминокислоты,которые в сайте расщепления образуют две пары, такие как K/R-X-K/R-R-F. Кроме того, пептид F2 вирулентных штаммов обычно начинается остатком фенилаланина, в то время как у невирулентных штаммов он обычно начинается с лейцина. У некоторых штаммов NDV белок HN также вырабатывается в виде предшественника,для биологической активации которого требуется расщепление (Garten et al., 1980; Millar et al.,1988). Помимо расщепления белков F и HN, другие вирусные факторы могут участвовать в патогенности. Было показано (MadanskyBratt,1978, 1981 а, 1981b), что изменения в транскрипции и трансляции могут модулировать рост и распространение вируса от клетки к клетке, а также цитопатогенность. Исходный иммунный ответ на заражение вирусом NDV является клеточным и может быть выявлен, по крайней мере, через 2-3 дня после инфицирования живыми вирусными штаммами. Предположительно это объясняет раннюю защиту от заражения, которая была описана у вакцинированных птиц перед тем, как выявляется измеримое количество антител(GoughAlexander, 1973). Примерно через неделю после инъекции циркулирующие антитела могут защищать организм от повторной инфекции. На ранних этапах участвует IgM, а после этого IgG. Титры антител и пики защищенности примерно через 3 недели резко идут на убыль, если отсутствует повторная иммунизация (бустинг). Это означает необходимость повторных вакцинаций более старых птиц. Только живые вакцины, вводимые через дыхательную систему, стимулируют появление антител на всех слизистых поверхностях, а также в сыворотке. Инактивированная вакцина,даже при ее внутримышечном введении, не обусловливает локальной респираторной резистентности, даже несмотря на высокое содержание антител в сыворотке. Это подчеркивает важность живых вакцин,способных доводить вирусный антиген до верхних отделов дыхательного тракта с точки зрения 6 индукции как местного, так и системного иммунитета. Небольшие капли проникают в нижние отделы дыхательной системы, тем самым способствуя в основном выработке гуморального иммунного ответа, в то время как более крупные капли стимулируют местный иммунитет в верхних отделах дыхательного тракта. Следовательно, аэрозоли, содержащие разные по размеру частицы, обусловят наиболее эффективный как местный, так и гуморальный иммунитет. Однако необходимо отметить, что, несмотря на интенсивную вакцинацию уже существующими в настоящее время вакцинами,обеспечивающими выработку высоких титров антител, тем не менее, вирус может быть выделен со слизистых поверхностей. Идентификация ньюкаслской болезни в США привела к применению инактивированных вакцин (Hofstad, 1953). Наблюдения за тем, что некоторые энзоотические вирусы вызывают только слабые симптомы болезни, вначале привели к разработке мезогенной живой вакциныRoakin (Beaudette et al., 1949), а после этого к получению ослабленных штаммов Hitchner B1(HitchnerJohnson, 1948) и LaSota (Goldhaft,1980), которые в настоящее время наиболее широко применяются в качестве живых вакцин. Живые NDV-вакцины могут быть подразделены на две группы, лентогенные и мезогенные. Мезогенные штаммы пригодны только для повторной вакцинации птиц из-за их достаточно существенной вирулентности. Иммунный ответ усиливается наряду с повышением патогенности живой вакцины. Следовательно, для достижения желательного уровня защиты без существенного проявления болезни в существующих программах вакцинации применяется последовательное использование вакцин с постепенно возрастающей вирулентностью или использование живых вакцин после инактивированных вакцин. Одно из преимуществ живых вакцин связано с тем, что они могут быть введены с помощью низкозатратных массовых методов. Обычный метод такого введения основан на использовании питьевой воды. Однако использование питьевой воды должно тщательно контролироваться, потому что вирус может утратить активность в результате нагревания или освещения,или действия вирицидных примесей самой воды. Массовое применение живых вакцин с помощью распылителей или аэрозолей также весьма популярно из-за простоты возможной вакцинации большого числа птиц за короткий период времени. Важным является обеспечение точного размера частиц, для чего применяется контроль условий, при которых эти частицы образуются. У применяемых в настоящее время живых вакцин имеются некоторые недостатки. Вакцина может вызывать симптомы болезни, что зависит 7 от условий внешней среды и присутствия осложняющих инфекций. Следовательно, важно для первичной вакцинации использовать максимально ослабленный вирус, и соответственно,требуется проведение неоднократных вакцинаций. Более того, материнские антитела могут предотвращать успех первичной вакцинации с использованием лентогенных живых вакцин. Инактивированные вакцины обычно получают на материале инфицированной аллантоисной жидкости, которую обрабатывают формалином или -пропиолактоном для того, чтобы убить вирус, и смешивают с подходящим адъювантом. Инактивированные вакцины вводят путем инъекции, либо внутримышечно, либо подкожно. Инактивированные вакцины в связи с их получением и применением весьма дороги. Однако инактивированные масляноэмульсионные вакцины не в такой степени подвержены отрицательному влиянию материнского иммунитета, как это происходит в случае живых вакцин, поэтому их можно применять для суточных цыплят. Преимуществами инактивированных вакцин являются низкий уровень неблагоприятных реакций у вакцинированных птиц, высокий уровень защитных антител и значительная продолжительность защиты. Ни одна из указанных выше вакцин не дифференцируется серологически от вируса NDV дикого типа. Разработка рекомбинантных вирусных вакцин представляла интерес для промышленного птицеводства на протяжении ряда лет. Сутью такого подхода является внесение генов,кодирующих ключевые иммуногенные эпитопы представляющего интерес возбудителя болезни,в несущественные участки генома вируса, служащего вектором. Следовательно, вакцинация рекомбинантным вирусом приводит к иммунизации как против вируса-вектора, так и против анализируемого болезнетворного агента. Некоторые типы вирусов были оценены в качестве возможных живых вирусных вакцин для птицеводства. Два вируса птиц, которые привлекли наибольшее внимание, представляют вирус куриной оспы (FPV) и герпесвирус индеек (HVT). Вирус куриной оспы является ДНКвирусом,характеризующимся крупным геномом, следовательно, он весьма вместителен с точки зрения включения чужеродных генов. После ослабления вирус FPV не вызывает клинической картины болезни и обычно используется в качестве вакцины для домашних кур. Вирус HVT также является ДНК-вирусом и классифицируется как серотип III семейства вирусов болезни Марека (MDV). HVT непатогенен для кур, обеспечивает перекрестную защиту от MDV и обычно используется для вакцинации кур против болезни Марека. Было показано, что защита против ньюкаслской болезни может быть вызвана путем использования рекомбинантных вакцин HVT 8 или FPV (Morgan et al., 1992, 1993; Heckert et al.,1996; Boursnell et al., 1990; Taylor et al., 1990). Однако проявление защиты против ньюкаслской болезни после вакцинации такими рекомбинантными вакцинами, которые экспрессируют либо белок F вируса NDV, либо оба белка F и HN, в значительной степени задерживалось по сравнению с ситуацией при вакцинации стандартной живой или инактивированной вакциной NDV, что, по-видимому, объясняется тем, что рекомбинантные вакцины либо не обеспечивают достаточной широты спектра антигенно активных эпитопов NDV, помимо тех,которые находятся в составе белка NDV, экспрессируемого рекомбинантной вакциной, либо не претерпевают точного презентирования иммунной системе. Более того, в результате вакцинации птиц рекомбинантыми вакцинами не происходило эффективной индукции местной защиты (для слизистых, дыхательной системы и пищеварительного тракта). Это является серьезным недостатком, так как вакцины, используемые для исходной вакцинации против респираторных заболеваний, должны обеспечивать местный иммунитет для предотвращения инфекции и распространения вирулентных вирусов, которые заражают кур, содержащихся в открытых условиях. Антитела к NDV, которые способны защищать организм-хозяин, могут быть количественно оценены в тестах на нейтрализацию вирусов. Однако поскольку ответ на нейтрализацию развивается параллельно ответу на подавления гемагглютинации (HI-реакция), последний из указанных тестов часто применяют для оценки защитного ответа, особенно после проведения вакцинации. Антитела, специфичные в отношении обоих белков F и HN, могут нейтрализовыватьNDV. Однако антитела к белку F, по-видимому,обусловливают более значительную нейтрализацию по сравнению с таковой в случае с антителами к белку HN в тестах in vivo и in vitro(Meulemans et al., 1986). Присутствие специфичных антител к NDV в сыворотке птицы дает недостаточную информацию об инфекционном штамме NDV, а следовательно, имеет ограниченное диагностическое значение. Распространенность лентогенных штаммовNDV у птиц в большинстве стран и практически повсеместное применение живых вакцин, которые невозможно отличать, по крайней мере, при серологическом сравнении от штаммов NDV дикого типа, означает, что простое выявление инфекции редко оказывается адекватным обоснованием для применения мер по борьбе с ней. Поскольку болезнь в естественных условиях может быть неинформативным маркером реальной вирулентности данного вируса, то необхо 9 димо дополнительно охарактеризовать обнаруженный вирус. В настоящее время единственным способом диагностики ньюкаслской болезни, который бы позволял характеризовать инфекционный штамм, является выделение вируса с последующим его патогенетическим анализом. В настоящее время существуют три таких теста,проводимые in vivo: 1) среднее время гибели яиц (тест MDT); 2) индекс интрацеребральной патогенности (ICPI) у суточных цыплят; 3) индекс внутривенной патогенности (IVPI) у 6 недельных птиц. Этим тестам свойственен ряд недостатков,таких как доступность объектов, плохая воспроизводимость результатов и относительно длительное время анализа. Наконец, хотя это не менее важно, указанные тесты не позволяют достаточно просто разграничивать птиц, вакцинированных вакциной или инфицированных штаммом дикого типа, по серологическим параметрам. В качестве альтернативы тестам in vivo полимеразная цепная реакция (ПЦР) была успешно применена для распознавания вирулентных и невирулентных изолятов (Stauber et al.,1995; Kant et al., 1997), однако, с другой стороны, серологическая дифференцировка была невозможна. Развитие птицеводства и торговли продуктами птицеводства в настоящее время вышло на международный уровень, и часто контролируется транснациональными корпорациями. Угроза ньюкаслской болезни является существенным фактором, ограничивающим развитие такой торговли. Успешный контроль ньюкаслской болезни будет достигнут только тогда, когда все страны будут сообщать о ее вспышках. Однако достижение международных соглашений не так просто из-за значительного варьирования степени контроля над заболеваемостью в различных странах. Некоторые страны не проводят вакцинацию и отказываются от какого бы то ни было внесения NDV в популяции домашних птиц,поскольку вакцинированных птиц не удается отличить от тех, которые были заражены вирусом NDV дикого типа. В других странах допускается использование только конкретных живых вакцин, а другие вакцины рассматриваются как неприемлемые и вирулентные. В ряде стран еще сохраняется присутствие циркулирующего высоковирулентного вируса, что, однако, не удается распознать из-за маскировки настоящей болезни последствиями вакцинации. Во многих странах существуют законодательные акты, позволяющие контролировать вспышки ньюкаслской болезни, которые могут происходить. Государственные мероприятия направлены на предотвращение попадания и распространения возбудителя. В большинстве 10 стран существуют ограничения в торговле продукцией птицеводства, яйцами и живой птицей. В большинстве стран существуют карантинные процедуры для импортной продукции, особенно для попугаев. В некоторых странах проводится политика искоренения инфекции с принудительным уничтожением зараженных птиц, контактировавших с ними птиц и продуктов. В других требуется профилактическая вакцинация птиц даже при отсутствии вспышек, хотя в ряде стран существует политика кольцевой вакцинации,проводимой с целью формирования вокруг района вспышки буферной зоны. Очевидно, что существует насущная потребность в усовершенствованных вакцинах и в усовершенствованных методах диагностики,которые можно применять для контроля ньюкаслской болезни. Обусловленные как значительными различиями в той дозе, которую получают отдельные птицы в случае проведения массовой вакцинации живыми вакцинами, так и изменчивостью в уровнях материнского иммунитета у молодых цыплят, реакции после вакцинации живыми вакцинами оказываются неизбежными. Это является одной из основных причин для недовольства фермеров в тех странах, в которых вакцинация является обязательной. Более того, многие вакцины представлены смесями субпопуляций. После клонирования эти субпопуляции могут в значительной степени отличаться друг от друга по параметрам иммуногенности и патогенности (Hanson, 1988). Однако самым существенным недостатком применяемых в настоящее время живых вакцин и инактивированных вакцин является тот факт,что вакцинированных животных нельзя отличить от зараженных животных, используя современные методы скрининга, такие как тест на подавление гемагглютинации или тест на нейтрализацию вируса. Соответственно, по-прежнему вирулентный полевой вирус может распространяться среди вакцинированных популяций, поскольку симптомы болезни маскируются вакцинацией. Поскольку выделение вируса и характеристика вирулентности методами in vivo в большом масштабе затруднительна, имеется существенная потребность в новых живых и эффективно ослабленных вакцинах, которые можно было бы отличать от полевых вирусов по серологическим параметрам. Такие вакцины,названныеNDVмаркерными вакцинами (и сопровождающие их способы диагностики и наборы реактивов), которые должны представлять наиболее полный возможный иммунологический спектр эпитоповNDV с соответствующими антигенными свойствами и, кроме того, должны по серологическим признакам отличаться от NDV дикого типа, до сих пор не были доступны. 11 Настоящее изобретение представляет способ модификации генома парамиксовируса птиц с помощью генетической модификации, представляет генетически модифицированный парамиксовирус птиц и маркерную по парамиксовирусу птиц вакцину. Развитие современных молекулярногенетических методов позволяет проводить генетическую модификацию многих РНКвирусов, включая вирусы с некодирующими одноцепочечными РНК. Такую стратегию часто называют обратной генетикой. Сначала создают кДНК-копию (полноразмерную) вирусной РНК, после чего транскрибируют эту ДНК в соответствующих клетках с получением инфекционной РНК, которая вновь может реплицироваться с образованием инфекционных вирусных частиц. В целом, путем предварительной модификации кДНК с применением стандартных молекулярно-биологических методов возможным оказывается получить генетически модифицированный РНК-вирус. Однако такой подход ни разу ранее не применяли в отношении NDV или других парамиксовирусов и даже еще не было возможным создать минигеномные фрагменты или плазмиды на материале фрагментов генома парамиксовируса птиц с целью изучения процессов репликации парамиксовирусов птиц, тем самым приходя к пониманию того, как сконструировать инфекционную вирусную копию. Хотя в данном описании теперь полностью установлено, что геном парамиксовируса птиц является самым маленьким среди всех секвенированных к настоящему времени геномов парамиксовирусов, особенно 5'-концевой участок последовательности генома NDV неожиданно оказалась существенно длиннее, чем это ранее было установлено и чего можно было ожидать,исходя из сравнительного анализа других представителей Paramyxoviridae. Настоящее изобретение впервые представляет полную последовательность генома парамиксовируса птиц и представляет полноразмерную или минигеномную кДНК такого вируса. Настоящее изобретение представляет здесь кДНК парамиксовируса птиц, по крайней мере,включающую нуклеотидную последовательность, соответствующую 5'-концевому участку генома парамиксовируса птиц, позволяющему создавать инфекционную копию парамиксовируса птиц, притом, что предпочтительно кДНК включает полноразмерную кДНК. Однако настоящее изобретение также представляет кДНК,по крайней мере, включающую нуклеотидную последовательность, соответствующую 5'-концевому участку генома парамиксовируса птиц,позволяя тем самым образовывать реплицирующийся минигеном парамиксовируса птиц. Такие минигеномы преимущественно можно использовать для транскрипции РНК и/или экспрессии белка с нуклеиновых кислот с модифи 004796 12 цированной последовательностью. Настоящее изобретение представляет кДНК в соответствии с изобретением, которая, по крайней мере отчасти, является производной от вируса ньюкаслской болезни, например, при том, что указанный вирус ньюкаслской болезни представляет лентогенный вирус, предпочтительно являющийся производным от вакцинного штамма,такого как штамм Ласота (LaSota), ATCC VR699. Кроме того, настоящее изобретение представляет кДНК в соответствии с изобретением,дополнительно содержащую модификацию,такую как делеция, вставка, мутация, реверсия или иное изменение в нуклеиновой кислоте. Например, представляется кДНК, в составе которой указанная модификация включает нуклеиновую кислоту, кодирующую модифицированный сайт расщепления протеазой, например,когда указанный сайт расщепления является сайтом расщепления протеазой, характерным для слияния белка (F). Еще в одном варианте настоящее изобретение представляет кДНК в соответствии с изобретением, в составе которой упомянутая модификация включает нуклеиновую кислоту,кодирующую гибридный вирусный белок, такой как гибридный белок гемагглютининнейраминидазы (HN), как описано в экспериментальном разделе настоящего изобретения. Также настоящее изобретение представляет кДНК в соответствии с изобретением, в составе которой упомянутая модификация является делецией в нуклеиновой кислоте, кодирующей вирусный белок, такой как матричный белок М. Кроме того, настоящее изобретение представляет кДНК в соответствии с изобретением,дополнительно включающую нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичный антиген,предпочтительно притом, что указанный антиген является производным от патогена птиц,как, например, описано далее. Также представляются РНК и производный от нее белок, полученные из кДНК в соответствии с настоящим изобретением. Недавно некоторые вирусы с несегментированной некодирующей РНК-цепью были полностью охарактеризованы, а фундаментальные исследования по репликации и экспрессии их геномов обеспечили возможность создания инфекционного вируса полностью с помощью клеток, трансфицируемых клонированной кДНК упомянутого вируса (обзор Conzelmann, 1996). К настоящему времени инфекционные частицы вирусов с несегментированной некодирующей РНК-цепью были получены с использованием клонированной кДНК, например, вируса бешенства (Schnell et al., 1994; Conzelmann,европейская патентная заявка ЕР 0702085 А 1),вируса везикулярного стоматита (Lawson et al.,1995; Whelan et al., 1995), вируса Сендай (GarcinSchneider et al., 1997; европейская патентная заявка ЕР 0780475 А 1), респираторносинцитиального вируса человека (Collins et al.,1995), вируса чумы рогатого скота (BaronBarrett, 1997) и вируса парагриппа человека 3-го типа (HoffmanBanerjee, 1997; Conzelmann,европейская патентная заявка ЕР 0702085 А 1)(Schnell et al., 1994; европейская патентная заявка ЕР 0702085 А 1). Однако все указанные выше инфекционные копии вирусов способны расти как in vivo,так и in vitro в организмах-хозяевах, тканях или клетках различного происхождения, что обеспечивает простую трансфекцию кДНК, ее репликацию и образование инфекционных вирусных частиц в подходящей линии клеток. Такая возможность отсутствует в случае сNDV, используемых в вакцинах. Вирулентность такого штамма NDV опосредована его способностью реплицироваться в широком круге клеток, а это проявляется в том, что вирулентные штаммы могут легко реплицироваться in vitro иin vivo, в то время как вакцинные штаммы могут реплицироваться исключительно in vivo. Таким образом, для NDV характерна парадоксальная ситуация. Хотя попытки создать инфекционную копию вируса, например, с использованием инфекционной кДНК, повидимому, могут дать в результате инфекционный вирус, такой вирус в принципе непригоден для использования в качестве вакцины, поскольку полученный таким образом инфекционный вирус по умолчанию слишком вирулентен, чтобы использоваться в качестве вакцины; тот факт, что он может быть образован и реплицирован после трансфекции кДНК клеточной линии, отражает его легкую расщепляемость по белку Fo на F1 и F2, что обсуждалось выше в связи с критериями вирулентностиNDV. Используя вакцинный штамм в качестве исходного материала для получения кДНК, невозможно решить данную проблему; вакцинный штамм, особенно лентогенного типа, не содержит легко расщепляемого белка Fo, в результате чего невозможно получить вирус первого поколения, который мог бы реплицироваться. Клетка, используемая для трансфекции, не должна быть способной к поддержанию одного или нескольких циклов репликации вируса вакцинного типа, включающего нерасщепленный белок Fo. Настоящее изобретение теперь предлагает изящное решение данной проблемы и тем самым представляет инфекционную копию NDV,например, для использования в вакцине. Настоящее изобретение представляет способ создания инфекционной копии вируса нькаслской болезни, включающий трансфекцию клеток, способных экспрессировать вирусные белки NP, Р и L для образования комплекса с вирусной РНК, с использованием клонирован 004796 14 ной полноразмерной кДНК или кДНК, соответствующей по размеру геному упомянутого вируса, и дополнительно включающий инкубацию упомянутых клеток в питательной среде, проявляющей протеолитическую активность, обеспечивающую расщепление белка Fo упомянутого вируса. В системе, использованной заявителями,котрансфекцией плазмиды, экспрессирующейNP, можно пренебречь. По-видимому, NP экспрессируется с полноразмерной кДНК, так как ген NP является первым по расположению геном после 5'-концевого участка антигеномной последовательности РНК. Поскольку эукариотические мРНК обычно являются моноцистронными, экспрессии дистально расположенных генов не предполагается. Однако возможным является создание полноразмерной кДНК, в которой относительное расположение генов NDV изменено. Если вначале в кДНК расположен такой ген, как ген Р и L, то нет необходимости в экспрессии соответствующего генного продукта с котрансфицируемой плазмиды. В качестве альтернативы использованию полноразмерной кДНК возможным является использование двух или большего числа субгеномных (по размеру) кДНК, на матрице которых образуются компетентные по репликации субгеномные РНК и которые вместе друг с другом экспрессируют полный комплект белков парамиксовируса птиц. Даже если эти РНК упакованы по отдельности, образующиеся в результате вирусоподобные частицы можно использовать для последовательных циклов репликации путем совместной инфекции и комплементации функций разных генов. В предпочтительном варианте настоящее изобретение представляет способ, в котором указанная протеолитическая активность обеспечивается ферментом, таким как трипсиноподобный фермент, или обеспечивается композицией,содержащей указанную протеолитическую активность. В наиболее предпочтительном варианте указанная питательная среда содержит аллантоисную жидкость, обладающую протеолитической активностью. Расщепление белка Fo необходимо для образования инфекционного вируса. Возможным является образование инфекционного вируса на материале лентогенного штамма без добавления внешней протеолитической активности. При инокуляции надосадочным слоем трансфицированных клеток в полость аллантоиса развивающегося яйца протеолитическая активность, характерная для аллантоисной жидкости, будет способна расщеплять белок Fo с образованием компетентного по слиянию комплекса F1/F2. Вирионы с таким активированным белком F способны инфицировать восприимчивые клетки и реплицироваться в клетках, проявляющих желательную протеолитическую активность, с получением инфек 15 ционного потомства. В качестве альтернативы внесения желательной протеолитической активности в надосадочный слой трансфицированных клеток можно, например, использовать клетку,которая пермиссивна по NDV и которая уже проявляет указанную протеолитическую активность. Такую клеточную линию используют для получения инфекционного лентогенного NDV без добавления внешней протеолитической активности. Также такая клеточная линия может быть образована с помощью стабильной трансфекции клеточной линии геном, который обеспечивает упомянутую активность. Более того,возможным является создание стабильно трансфицированной клеточной линии, которая экспрессирует белок F дикого типа в состав вирусной оболочки, тем самым образуя инфекционные частицы (сами они лишены геномной информации, кодирующей белок F дикого типа),способные проникать в клетку. Спасение инфекционного лентогенного вируса также возможно с помощью инфицирования трансфицированных клеток вирусом-помощником NDV. Важным требованием, предъявляемым к такому вирусу-помощнику, должно быть то, чтобы он подлежал отбору, например, с использованием нейтрализующих антител, которые удаляют вирус-помощник, но которые не взаимодействуют с самим лентогенным вирусом. Наконец, можно сконструировать стабильно трансфицированную клеточную линию, которая бы экспрессировала один, два или все три ключевых белка NDV, NP,Р и L. С точки зрения поддержания образования инфекционных копий вируса для таких клеточных линий необходима коэкспрессия только набора из трех ключевых белков или коэкспрессия вообще не нужна. В предпочтительном варианте настоящее изобретение представляет способ, в котором указанные клетки, использующиеся для трансфекции, являются производными от первичных или вторичных клеток или клеточных линий цыпленка. В качестве примера в описании приводятся клетки CER или CEF, которые, как и большинство клеток in vitro, в принципе лишены соответствующих протеаз, необходимых для расщепления белка Fo вируса NDV, например,штамма LaSota. Однако также можно использовать клетки, производные, например, от других птиц. Далее настоящее изобретение представляет способ создания инфекционной копии вируса ньюкаслской болезни, включающий трансфекцию клеток с использованием клонированной полноразмерной кДНК или кДНК геномного размера указанного вируса, например, в соответствии с показанным на фиг. 3, и дополнительно включающий инкубацию указанных клеток в питательной среде, содержащей протеолитическую активность, обеспечивающую расщепление белка Fo указанного вируса, дополнительно включающий выделение инфекционного 16 вируса путем культивирования указанных клеток и инокуляции материала, полученного от указанных культивируемых клеток, в аллантоисную полость развивающегося яйца. Указанный материал, например, содержит клетки (собранные или замороженные-оттаенные) или клеточный дебрис, или надосадочный слой, полученный от указанной клеточной культуры. Например, в данном тексте описывается способ выделения инфекционного вируса, в котором надосадочный слой трансфицированных монослойных культур клеток CEF был инокулирован в аллантоисную полость развивающихся яиц. Через 4 дня собирали аллантоисную жидкость, анализировали ее в гемагглюнатинационном тесте и далее перепрививали в яйца. Кроме того, настоящее изобретение представляет способ, дополнительно включающий перепрививание указанной инфекционной копии вируса ньюкаслской болезни путем сбора аллантоисной жидкости и повторной инокуляции развивающихся яиц. В предпочтительном варианте настоящего изобретения представляется способ, в котором указанный вирус является лентогенным вирусом, например, производным от авирулентного полевого вируса NDV или от вакцинного штамма NDV, такого как штамм NDV LaSota. Более того, представляется способ модификации генома парамиксовируса птиц путем генетического модифицирования, что позволяет вносить одну или несколько мутаций, делеций и/или вставок или иных модификаций. Например,представляется способ ослабления или модифицирования вирулентности парамиксовируса птиц путем модифицирования кДНК, например,кодирующей вирусный белок, такой как белокV, клонирования указанной модифицированной кДНК в состав полноразмерной кДНК и создания инфекционной копии вируса с указанной полноразмерной кДНК, в результате чего получают новые штаммы NDV или новые ослабленные живые вакцины, обладающие улучшенными свойствами. Помимо ослабления в результате модификации генных продуктов также возможным является ослабление парамиксовируса птиц с помощью модифицирования нуклеотидных последовательностей, которые вовлечены в транскрипцию и/или репликацию. Такие модификации обусловливают получение ослабленных штаммов, которые экспрессируют близкие к дикому типу белки F, расщепляемые как in vitro,так и in vivo в широком круге клеток, а в результате обусловливающие более высокий уровень иммуногенности по сравнению с классическими вакцинными штаммами. В предпочтительном варианте настоящее изобретение представляет способ ослабления или модифицирования вирулентности парамиксовируса птиц, такого как вирус ньюкаслской болезни, включающий модификацию сайта 17 расщепления протеазой в вирусном белке путем модифицирования кДНК, кодирующей указанный сайт расщепления, дополнительно включающий клонирование указанной кДНК в состав кДНК геномного размера, например, вируса ньюкаслской болезни, с образованием инфекционной копии вируса ньюкаслской болезни. Например, указанный сайт расщепления является сайтом протеазного расщепления в последовательности белка F или HN вируса ньюкаслской болезни. В целом, ослабление ограничивается снижением вирулентности, однако, сейчас также возможно использовать относительно авирулентный штамм NDV и получать потомство такого штамма, характеризующееся повышенной вирулентностью, например, путем внесения их для репликации в клетки специфического типа. Так, в настоящее время возможно придать вирусу NDV различные уровни вирулентности. Настоящее изобретение представляет способ антигенной модификации парамиксовируса птиц, такого как вирус ньюкаслской болезни,включающий модифицирование кДНК, кодирующей по крайней мере часть вирусного белка,несущего по крайней мере один иммунодоминантный эпитоп, дополнительно включающий клонирование указанной кДНК в состав кДНК геномного размера вируса ньюкаслской болезни и создание инфекционной копии вируса ньюкаслской болезни. Например, настоящее изобретение представляет способ (дополнительного) модифицирования NDV, например, с использованием уже предусмотренного способа создания инфекционной копии NDV (вакцины), т.е. представляется способ получения рекомбинантной NDVмаркерной вакцины, причем маркерная вакцина содержит наиболее полный из возможных или необходимых иммунологический спектр соответствующих антигенных эпитопов NDV, а также серологически отличается от NDV дикого типа за счет того, что с помощью рекомбинантных методов был удален серологически распознаваемый эпитоп или маркер. Настоящее изобретение представляет способ модифицирования антигенного состава парамиксовируса птиц,такого как NDV, тем самым позволяя получить,например, живую NDV-маркерную вакцину,которую серологически можно отличить от полевых штаммов парамиксовирусов птиц. В одном из вариантов настоящее изобретение представляет инфекционную копию NDV,в которой белок HN вируса NDV был модифицирован путем рекомбинирования кДНК, кодирующей часть указанного белка HN, с кДНК,кодирующей часть белка HN, производного от парамиксовируса птиц, например, 2-го типа или 4-го типа. Указанный гибридный белок HN выполняет роль серологического маркера для инфекционной копии штамма NDV, полученного таким образом, или может служить для измене 004796 18 ния тропности парамиксовируса птиц в отношении других клеток и(или) тканей. Эти так называемые маркерные штаммы, представляемые настоящим изобретением, позволяют создавать вакцины, которые являются очень ценным инструментом оценки распространения вирусаNDV в коммерческих популяциях птиц в мире. Кроме того, крупномасштабное применение таких маркерных вакцин будет обеспечивать полное искоренение NDV за счет проведения интенсивного скрининга и изъятия зараженных популяций. Далее, представляется способ создания инфекционной копии штамма NDV, который экспрессирует один или большее число антигенов других патогенов и который можно использовать для вакцинации против нескольких заболеваний. Такая инфекционная копия вируса(AIV) (гемагглютинин Н 5 и Н 7 и нейраминидаза), вирус лейкоза птиц (ALV) (белок env(gp85, вирус малокровия кур (CAV) (VP1 +VP2), вирус болезни Марека (MDV) (гликопротеин-В (gВ), gН), вирус инфекционного ларинготрахеита (ILT) (gВ, gН, gD), вирус инфекционного синовиита (IBDV) (VP2 и VP3), вирус ринотрахеита индеек (TRT) (белок слияния F),парамиксовирусы-2, -3 и -6 птиц (PMV) (белокF, гемагглютининнейраминидаза [HN] или другие), вирус инфекционного бронхита (IBV) (пепломерный или антирецепторный белок, нуклеопротеин), реовирусы (-белок), аденовирусы, пневмовирусы, сальмонеллу Salmonella enteritidis, Campylobacter jejuni, Escherichia coli,Bordatella avium (ранее называемая Alcaligenessynoviae, M. mereagridis, M. iowae) или аспергиллы (Aspergillus flavus, A. fumigatus). Настоящее изобретение представляет здесь парамиксовирус птиц или производные от него штаммы, которые можно использовать в качестве вакцинного вектора для экспрессии антигенов других патогенов домашних птиц. Некоторые свойства делают вирус NDV идеальным вакцинным вектором для вакцинации против респираторных или кишечных заболеваний. 1)NDV можно легко культивировать до очень высоких титров в развивающихся яйцах. 2) Массовая культура NDV в развивающихся яйцах относительно дешева. 3) NDV-вакцины относительно стабильны и могут быть легко введены методами массовой вакцинации, например, с питьевой водой или путем распыления или образования аэрозоля. 4) Естественным путем заражения NDV является респираторный и/или через пищеварительный тракт, что соответствует естественным путям заражения многими дру 19 гими патогенами домашних птиц. 5) NDV может индуцировать местный иммунитет вне зависимости от присутствия циркулирующего материнского антитела. Было показано, что NDV проявляет как сильные противоопухолевые, так и иммуностимуляторные свойстваHagmuller E., 1998, "Immunization with virusmodified tumor cells". Seminars in Oncology., 25,677-696). Хотя вирус NDV, по-видимому, не способен продуктивно реплицироваться в нормальных клетках человека, тем не менее, было отмечено избирательное NDV-опосредованное уничтожение раковых клеток человека. После местной NDV-терапии у бестимусных мышей линии "nude" было отмечено рассасывание опухоли вирусной природы и полная ремиссия ксенотрансплантатов человеческой опухоли. Это обусловило использование NDV для терапии опухолей. Однако проблема состоит в том, что такое применение может быть ограничено местным применением. Заражение NDV индуцирует выработку интерферонов, цитокинов и других потенциально важных генных продуктов и придает плейотропные иммуностимуляторные свойства опухолевым клеткам. Данная концепция была использована для выработки аутологичных вакцин с опухолевыми клетками, содержащих свежие функциональные образцы, которые были инфицированы NDV. Вакцину такого типа называют аутологичной опухолевой NDV-вакциной илиATV-NDV (Schirrmacher et al., 1998). Клетки,инфицированные NDV, инактивируют облучением, что предотвращает клеточные деления, но сохраняет возможность репликацииNDV в цитоплазме инфицированных клеток. После введения пациентам вакцины ATV-NDV с участием NDV-индуцированных цитокинов происходит рекрутирование Т-клеток. Некоторые из этих Т-клеток могут экспрессировать Тклеточный рецептор, который может взаимодействовать с пептидами из группы ассоциированных с опухолями антигенов, образующих комплекс с молекулами класса I главного комплекса гистосовместимости, находящийся на поверхности клеток. Это взаимодействие обусловливает индукцию цитотоксического Тклеточного ответа, который обусловливает специфичное уничтожение аутологичных опухолевых клеток. Настоящее изобретение представляет модулирование репертуара и количества цитокинов и иммуностимуляторных белков, индуцируемых заражением NDV. Настоящее изобретение представляет способ создания рекомбинантного NDV, который модифицирован так,чтобы включать и экспрессировать гетерологичный(ые) ген(ы). Такой рекомбинантныйNDV можно использовать для модифицирова 004796 20 ния репертуара и количества иммуностимуляторных белков в инфицированных клетках. В одном из вариантов настоящее изобретение представляет рекомбинантный вирус NDV, который включает и экспрессирует гены, кодирующие интерфероны, цитокины или другие иммуностимуляторные белки человека. Упомянутый рекомбинантный NDV используют для выработки вакцины ATV-NDV, которая является более сильной по сравнению со стандартнойATV-NDV. Например, цитокины IFN-, IFN-,TNF-, IL-1, IL-6; цитокины (хемокины) RANTES, IP-10; другие гены, такие как HSP, АСТН,эндорфин, iNOS, EPA/TIMP, NFB. Плейотропные иммуностимуляторные свойства NDV также могут быть использованы как свойства адъюванта для вакцинации животных и человека против инфекционных заболеваний. В одном из вариантов настоящего изобретения чужеродные гены, кодирующие соответствующий(ие) антиген(ы) инфекционного(ых) агента(ов), вносят в геном NDV, а одновременная экспрессия в инфицированных клетках антигена(ов) и иммуностимуляторных белков может индуцировать мощный иммунный ответ против инфекционного агента. В другом варианте настоящего изобретения иммуностимуляторные свойства NDV могут быть дополнительно усилены путем использования рекомбинантных NDV, которые одновременно экспрессируют антигены и конкретные иммуностимуляторные белки. В предпочтительном варианте настоящее изобретение представляет создание вакцин против СПИД(синдром приобретенного иммунодефицита) с использованием рекомбинантных NDV, которые экспрессируют соответствующие антигены вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) как сами по себе, так и в сочетании с иммуностимуляторными белками. Вирус NDV также используют в качестве адъюванта при вакцинации животных и человека против инфекционных заболеваний. В одном варианте настоящего изобретения гетерологичные или чужеродные гены, кодирующие соответствующий(ие) антиген(ы) инфекционного(ых) агента(ов), встраивают в геном вирусаNDV, a одновременная экспрессия инфицированными клетками антигена(ов) и иммуностимуляторных белков может индуцировать мощный иммунный ответ против инфекционного агента. В другом варианте настоящего изобретения иммуностимуляторные свойства NDV дополнительно усиливают, используя рекомбинантные NDV, которые одновременно экспрессируют антигены и конкретные иммуностимуляторные белки. В предпочтительном варианте настоящее изобретение представляет создание вакцин против СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) с использованием рекомбинантных NDV, которые экспрессируют соответствующие антигены вируса иммунодефицита 21 человека (ВИЧ) как сами по себе, так и в сочетании с иммуностимуляторными белками. Также представляется способ создания условно-летального делеционного мутанта NDV,который можно использовать в качестве самоограничивающейся нетрансмиссивной вакциныносителя. Делеционный мутант NDV создают таким образом, чтобы он не был способен экспрессировать матричный белок М, участвующий в почковании NDV на внутренней поверхности клеточной мембраны. Например, настоящее изобретение представляет фенотипически комплементированный штамм NDV, который не способен экспрессировать белок M, но который тем не менее способен инфицировать клетки и распространяться по механизму передачи от клетки к клетке. Однако мутантный вирус не способен создавать инфекционное потомство в некомплементированных клетках. Это показывает, что фенотипически комплементированные делеционные мутанты NDV можно использовать в качестве безопасных самоограничивающихся вакцин, которые не способны распространяться в окружающую среду. Такая нетрансмиссивная вакцина объединяет наиболее важное свойство живых вакцин, а именно эффективность, и самое важное преимущество убитых вакцин, а именно, безопасность. Настоящее изобретение представляет вирус ньюкаслской болезни или производные от него штаммы, например, получаемые путем пассирования или дополнительного культивирования развивающихся яиц или подходящих клеток, которые являются производными от инфекционной копии вируса, получаемой с помощью способа, представляемого настоящим изобретением. Например, представляется NDV, который был модифицирован, по крайней мере, какимлибо одним путем с целью создания инфекционной копии вируса ныокаслской болезни, который ослаблен, модифицирован по уровню вирулентности, модифицирован по антигенным свойствам, экспрессирует гетерологичный антиген или является нетрансмиссивным, или их сочетания. Настоящее изобретение представляет здесьNDV-вакцины, например, характеризующиеся наличием отличающихся факторов вирулентности или отличающимися антигенными параметрами, предназначенные для целей получения маркерных вакцин и/или для экспрессии гетерологичных антигенов, производных от других патогенов, находящиеся в трансмиссивной и/или нетрансмиссивной форме. Такая вакцина может быть убитой или живой вакциной. Предпочтительно такая вакцина является живой вакциной, однако, убитые вакцины, представляемые настоящим изобретением, имеют преимущества в тех вариантах, в которых живые вакцины неприменимы или при 004796 22 менимы лишь в слабой степени, например, при ограничениях в торговле или при других условиях, определяемых подходами в борьбе с соответствующим заболеванием. Также настоящее изобретение представляет способ диагностики и соответствующий тестнабор, предназначенные для выявления антител,специфичных в отношении указанных соответствующих иммунодоминантных эпитопа или маркера, тем самым предусматривая способы и подходы в осуществлении способа контроля и/или искоренения NDV и/или других заболеваний домашних птиц. Настоящее изобретение представляет новые эффективные вакцины, которые по серологическим критериям можно отличить от полевых вирусов и уже существующих вакцин. Такие новые вакцины, называемые маркерными NDV-вакцинами, обеспечивают наиболее полный из возможного иммунологический спектр соответствующих антигенных эпитопов NDV, а также серологически отличаются от NDV дикого типа при применении прилагающихся диагностических способов и наборов. Настоящее изобретение представляет способ идентификации невакцинированных животных или животных, вакцинированных NDVвакциной по настоящему изобретению, по сравнению с животными, инфицированными NDV дикого типа или вакцинированных немодифицированным мезогенным или лентогенным вакцинным штаммом NDV, включающий взятие у указанного животного по крайней мере одного минимального образца (такого как сыворотка,кровь, яйца или глазная жидкость) и определение в указанном образце присутствия антител,специфичных в отношении иммунодоминантного эпитопа или маркера, экспрессируемого указанным дикого типа или немодифицированным вирусом NDV, но не вакциной по настоящему изобретению. Настоящее изобретение представляет способ, в котором указанные антитела специфичны в отношении белка HN или белка F вирусаNDV, например, гибридного белка, как описано в экспериментальном разделе настоящей заявки. Например, настоящее изобретение представляет способ диагностики, в котором указанное животное выбирают из группы, которая включает домашних птиц, предпочтительно домашних кур. Также настоящее изобретение представляет диагностический набор для использования в способе серологической идентификации животных. В одном варианте настоящего изобретения простой и быстрый тест на подавление гемагглютинации (HI) используют для разграничения вакцинированных животных и инфицированных животных. Животные, вакцинированные маркерной вакциной, в которой глобулярная головка белка HN вируса NDV полностью заменена соответствующей частью белка HN вируса 23 другого серотипа, не вырабатывают антитела кHN NDV, а следовательно, не подавляют агглютинацию эритроцитов с участием вирионовNDV. С использованием вирионов маркерной вакцины в тесте HI детектируют антитела, специфичные в отношении гибридного белка HN,которые можно использовать в качестве меры эффективности вакцинации. В качестве альтернативы, для определения эффективности вакцинации используют метод ELISA, в котором детектируют антитела к белку F вируса NDV. Помимо теста HI метод ELISA может быть использован для определения присутствия антител к HN NDV. Антигеном, предназначенным для использования в таком тесте, является, например, белок HN вируса NDV, который экспрессирован с помощью методов рекомбинантной ДНК, или консервативный пептид из HNNDV. Также может быть использован метод блокирующего ELISA. В этом случае одно или большее число моноклональных антител, специфичных в отношении консервативных эпитопов HN NDV, используют для определения присутствия в образце, взятом у вакцинированного животного, конкурирующих антител. ТестыELISA преимущественно могут быть использованы в том случае, когда маркерная вакцина содержит только гибридный белок HN или когда несколько эпитопов в последовательностиHN NDV заменены. Далее настоящее изобретение поясняется в экспериментальном разделе данного описания,который ничем не ограничивает настоящее изобретение. Экспериментальный раздел Материалы и методы. Стандартные процедуры клонирования были осуществлены в соответствии с руководством Sambrook et al. (1989), за исключением специально оговариваемых случаев. Все конструкции, включающие фрагменты ДНК, полученные посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), проверяли путем прямого секвенирования. В последовательностях праймеров,приводимых ниже, подчеркнуты нуклеотиды,соответствующие последовательностям NDV, а также определены положения в геноме NDV. Нуклеотидная последовательность рестрикционных сайтов, которые использовали для клонирования, выделена полужирным шрифтом. Клетки и вирусы. Клетки CER (Smith et al., 1976) культивировали в среде GMEM/EMEM (1:1), содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 2% смеси антибиотиков, включая 1000 ед./мл пенициллина, 1000 мкг/мл стрептомицина, 20 мкг/мл фунгизона, 500 мкг/мл полимиксина-В и 10 мг/мл канамицина. Клетки QT35 (Moscovici etQM5 (AntinOrdahl, 1991) культивировали в среде М 199, дополненной 10% триптовофосфатного бульона, 10% FCS и 2% смеси антибиотиков. Штамм Ласота (LaSota) вируса NDV получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС VR-699) и пассировали дважды через развивающиеся куриные эмбрионы. Перед началом конструирования и клонирования кДНК вирус очищали в бляшках в трех циклах очистки в бляшках в линии первичных фибробластов куриного эмбриона (CEF). С этой целью вирус титровали на клетках CEF, культивируемых в среде GMEM/EMEM (1:1), содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки, 2% смеси антибиотиков, 5% аллантоисной жидкости, 30 мМ МgCl2, 200 мкг/мл DEAE-декстрана (Sigma) и 0,8% агара Nobel (Difco). Вирус из третьего цикла очистки в бляшках (обозначенный как клон Е 13-1) культивировали в развивающихся яйцах и через 4 дня после инокуляции аллантоисную жидкость собирали и хранили при -70 С в виде аликвот. Рекомбинантный вирус куриной оспы fpEFLT7pol (Britton et al., 1996; здесь и далее обозначаемый FPV-T7), который экспрессирует РНК-полимеразу фага Т 7, был любезно предоставлен д-ром Михаэлем Скиннером (М.Skinner) и этот вирус культивировали на клеткахQT35. Выделение вирусной РНК. Все манипуляции осуществляли в свободной от РНКаз стеклянной или пластиковой посуде, а все растворы приготавливали с использованием свободной от РНКаз воды, которую обрабатывали 1%-ным диэтилпирокарбонатом(DEPC) и стерилизовали автоклавированием. Вирус осаждали центрифугированием из аллантоисной жидкости при 21000 об./мин в течение 70 мин в бекмановской центрифуге SW40 при 4 С. Осадок ресуспендировали в гомогенизаторном буфере (50 мМ Трис-HCl, рН=7,5, 50 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 0,5% SDS) и обрабатывали протеиназой-К (200 мкг/мл) в течение 90 мин при 37 С при постоянном перемешивании. Полученный лизат дважды экстрагировали равными объемами смеси фенол/хлороформ (1:1),рН=5,4, и один раз равным объемом хлороформа. Вирусную РНК осаждали из водной фракции добавлением 0,1 объема 3 М NaOAc(pH=5,3) и 2,5 объемов 100%-ного этанола. Преципитат собирали центрифугированием, 1 раз промывали 70%-ным этанолом, ресуспендировали в воде и хранили в аликвотах при -70 С. Обратная транскрипция. Вирусную РНК (1,5 мкг) смешивали с 500 нг праймера в объеме 12 мкл и инкубировали в течение 10 мин при 70 С. Добавляли 4 мкл обратнотранскриптазного буфера 5 х (250 мМ Трис-HCl, рН=8,3, 375 мМ KСl, 15 мМ MgCl2;GibcoBRL/Life Technologies), 2 мкл 0,1 М дитиотреитола (DTT) и 2 мкл 10 мМ dNTP (2,5 мМ каждого дезоксирибонуклеотида) и полученную смесь инкубировали в течение 2 мин при 42 С. Обратную транскрипцию осуществляли в конечном объеме 20 мкл добавлением 200 ед. обратной транскриптазы (Superscript II; GibcoBRL/Life Technologies) с последующей инкубацией в течение 60 мин при 42 С. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Все реакции ПЦР, которые использовали для определения 3'- и 5'-концов генома вирусаNDV (см. ниже), проводили с использованием ДНК-полимеразы Taq (Perkin Elmer). Для клонирования отдельных генов NDV или крупных субгеномных кДНК использовали либо корректирующую ДНК-полимеразу Pwo, либо смеси полимераз Taq и Pwo (Expand High Fidelity Kit или Expand Long Template Kit) в соответствии с инструкциями поставщика (Boehringer Mannheim). Все образцы инкубировали в течение 2 мин при 94 С перед началом указанного числа циклов ПЦР. После проведения указанного числа циклов ПЦР образцы инкубировали при температуре достройки цепи в течение времени по крайней мере втрое более длительного по сравнению со временем достройки в самом цикле ПЦР. ПЦР-фрагменты очищали непосредственно с использованием набора High Pure PCRProduct Purification Kit (Boehringer Mannheim) или после проведения электрофореза в агарозном геле с использованием набора для экстракции QiaexII (Qiagen) по существу, как описано у поставщиков. Секвенирование. Все последовательности были определены с использованием набора реактивов PRISM(5 мкл) включали в 25 циклов линейной амплификации (10 с при 94 С, 5 с при 50 С и 4 мин при 60 С) с использованием амплификатораGeneAmp 2400. После этого реакционные смеси осаждали этанолом, 1 раз промывали 70%-ным этанолом, ресуспендировали в 15 мкл буфераTSR (Perkin Elmer) и нагревали в течение 2 мин при 94 С перед загрузкой в автоматический секвенатор модели АВ 310 (Applied Biosystems). Нуклеотидные последовательности праймеров, которые были использованы для секвенирования полноразмерного генома вирусаNDV штамма LaSota, являлись либо производными от опубликованных последовательностей,либо от последовательностей, установленных в ходе осуществления описываемого здесь секвенирования. Праймеры показаны в табл. 1. Клонирование и секвенирование 3'- и 5'концов генома NDV штамма LaSota. Нуклеотидную последовательность 3'- и 5'концов генома NDV определяли с использованием процедур RACE (метод быстрой амплификации концов кДНК). РНК NDV использовали в 26 реакции обратной транскрипции в конечном объеме 20 мкл с праймером р 360 (5'GGCGATGTAATCAGCCTAGTGCTT-3'; нуклеотиды 14756-14779), который является производным от опубликованной последовательности гена L вируса NDV (Yusoff et al., 1987). Одноцепочечную кДНК (2,5 мкл обратнотранскриптазной смеси) добавляли к 8 пкмоль якорного праймера ALG3 (5'-CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC-3') и лигировали в течение ночи при комнатной температуре в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl,рН=8,0, 10 мМ МgСl2, 10 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 25% полиэтиленгликоля 1 мМ НСС, 20 мкМ АТФ и 10 ед. РНКлигазы фага Т 4 (New England Biolabs), как описано у Tessier et al., 1986. По 1 мкл лигационной реакции использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР с праймерами р 375 (5'CAATGAATTCAAAGGATATTACAGTAACT3'; нуклеотиды 14964-14983) и ALG4 (5'GAAGGATCCAGAATCGATAG-3'). Последний из этих праймеров комплементарен якорному праймеру ALG3. Условия ПЦР (40 циклов) были следующими: 1 мин при 94 С, 1 мин при 55 С и 2 мин при 72 С. Полученные ПЦРпродукты очищали и клонировали в Т-векторpBluescriptII-TSK (IchiharaKurosawa, 1993). С другой стороны, очищенные ПЦР-продукты обрабатывали фрагментом Кленова ДНКполимеразы I с получением тупых концов и клонировали по HindI-сайту в плазмидуpGEM4Z (Promega). Тринадцать независимых клонов (8 в pBluescriptII-TSK и 5 в pGEM4Z) секвенировали для установления нуклеотидной последовательности 5'-конца генома NDV штамма LaSota. Нуклеотидную последовательность 3'-конца определяли двумя независимыми методами. В методе I праймер ALG3 лигировали на 3'-конец вирусной РНК с использованием РНК-лигазы Т 4, как описано у Schtze et al.,1995. Реакционная смесь (при конечном объеме 10 мкл) содержала 2,5 мкг РНК NDV, 100 пкмоль ALG3, 1 мкл 10 х РНК-лигазного Т 4 буфера (500 мМ Трис-НСl, рН=7,8, 100 мМ МgCl2,100 мM DTT, 10 мМ АТФ), 1 мкл ДМСО, 1 мкл 10 мкМ гексаминкобальтхлорида, 1 мкл RNasinBiolabs). Смесь инкубировали в течение ночи при комнатной температуре и 5 мкл реакционной смеси лигирования использовали в качестве матрицы в обратнотранскриптазной (ОТ) реакции, в которой ALG4 использовали в качестве праймера. По 1 мкл обратнотранскриптазной реакции использовали в реакции ПЦР с праймерами ALG4 и р 376 (5'-GAGCCTTAAGGAGCTGCTCGTACTGATC-3'; нуклеотиды 137-164), которые являются производными от опубликованной последовательности 3'-конца NDV (Ishida etal., 1986). Условия ПЦР были такими же, как описано выше для 5'-RACE. В методе II 3'- и 5'концы РНК вируса NDV лигировали друг на 27 друга с использованием РНК-лигазы Т 4 в тех же условиях, которые были описаны выше для метода I. По 5 мкл лигационной смеси использовали в качестве матрицы для реакции обратной транскрипции с праймером р 360. По 1 мкл обратнотранскриптазной реакции использовали в реакции ПЦР с праймерами р 375 и р 376 и в условиях ПЦР, описанных выше для 5'-RACE. Полученные ПЦР-продукты обрабатывали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I с получением тупых концов и клонировали по HincIIсайту плазмиды pGEM4Z (Promega). Десять независимых клонов (4 по способу I и 6 по способу II) секвенировали для определения нуклеотидной последовательности 3'-конца геномаNDV штамма LaSota. Конструирование транскрипционного вектора. Низкокопийный транскрипционный вектор конструировали, используя плазмиду рОК 12(VieiraMessing, 1991) в качестве исходного репликона. Плазмиду рОК 12 расщепляли рестриктазой PvuII и выделяли ДНК-фрагмент, содержащий источник репликации и ген резистентности к канамицину. Этот ДНК-фрагмент лигировали на Есо 47III/АflII-фрагмент (сайт расщепления AflII затупляли по концам фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I) из состава транскрипционного вектора 2.0 (любезно предоставлен д-ром Эндрю Боллом; Pattnaik et al.,1992). Из состава полученной в результате плазмиды удаляли XbaI/NheI-фрагмент с целью удаления как можно большего числа уникальных рестрикционных сайтов. Полученную в результате плазмиду обозначили pOLTV5 (фиг. 1). Транскрипционный вектор pOLTV5 включает промотор ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т 7, после которого находятся уникальные рестрикционные StuI- и SmaI-сайты, автокаталитический рибозим вируса D-гепатита (HDV) и сигнал терминации транскрипции нечетного фага Т 7. ДНК-фрагменты, клонированные между рестрикционными StuI- и SmaI-сайтами, могут быть транскрибированы либо in vitro, либоin vivo с использованием РНК-полимеразы Т 7. После транскрипции 5'-конец получаемых в результате транскриптов включает два остатка G,кодируемых плазмидой. Благодаря автокаталитической активности рибозима HDV, 3'-конец этих транскриптов соответствует точному концевому нуклеотиду клонированного ДНКфрагмента (Pattnaik et al., 1992). Конструирование минигеномных плазмид. С целью установления факторов, необходимых для репликации и транскрипции NDV,были сконструированы минигеномные плазмиды, которые включают 3'- и 5'-концевые участки генома NDV, фланкирующие ген-репортер, которым замещали все гены самого NDV (фиг. 2). ДНК-фрагменты, соответствующие 3'- и 5'концевым участкам генома NDV, формировали с помощью ПЦР с использованием ДНК 004796AGATTTGGTGAATGACGA-3'; нуклеотиды 15158-15186). Два ДНК-фрагмента соединяли методом ПЦР с перекрывающимися праймерами (участки перекрывания показаны курсивом в приведенных выше последовательностях праймеров) с использованием праймеров 3UIT и 5NDV. Полученный в результате ДНКфрагмент, представляющий собой химеру 3'- и 5'-концов NDV, разделенных 20 нуклеотидами,фосфорилировали путем обработки полинуклеотидкиназой Т 4 и клонировали в обеих ориентациях в состав транскрипционной плазмидыpOLTV5 (фиг. 1), которую расщепляли рестриктазами StuI и SmaI и дефосфорилировали с использованием кишечной фосфатазы теленка(Boehringer Mannheim). Наконец, ген SEAP (кодирует секретируемую щелочную фосфатазу) выделяли из состава плазмиды pSEAP-BasicNDV. Полученные в результате плазмиды обозначили pOLTV535 и pOLTV553 соответственно. В результате транскрипции in vivo или invitro с использованием РНК-полимеразы Т 7 с плазмиды pOLTV535 получают антигеномную РНК ([+]-РНК), в то время как в результате транскрипции плазмиды pOLTV553 получают геномную РНК ([-]-РНК). Плазмиды pOLTV535N0 до pOLTV535N5 и плазмиды pOLTV553N0 до pOLTV553N5 получали путем встраивания самокомплементарных олигонуклеотидов в ClaI-сайте, находящемся между геном SEAP и 5'-концом генома вируса NDV в составе pOLTV535 и pOLTV553 соответственно (см. фиг. 2). Были использованы такие олигонуклеотиды: N0, 5'-CGCGAGCTCG-3';pOLTV535 и pOLTV553. Для получения транскриптов in vitro или inPOLTV535 и pOLTV553 модифицировали таким образом, чтобы транскрипция начиналась с пер 29 вого нуклеотида 3'- и 5'-концевых участковNDV. Праймеры конструировали так, чтобы они включали 1) рестрикционный BglI-сайт, 2) последовательность промотора Т 7 (показана курсивом), который модифицировали таким образом, чтобы два нуклеотида G на конце промотора Т 7 были заменены нуклеотидами А, и 3) 3'(нуклеотиды 1-21) или 5'-конец (нуклеотиды 15164-15186) вируса NDV. Праймеры BGL3F2TCACTATAACCAAACAGAGAATCCGTGAG3') и SEAP3 (см. выше) использовали для получения ДНК-фрагмента, включающего модифицированный промотор Т 7 и полноразмерный 3'концевой участок NDV вплоть до начала генаSEAP в составе POLTV535. Аналогичным образом получали ДНК-фрагмент, который включал модифицированный промотор Т 7 и полноразмерный 3'-концевой участок NDV вплоть до начала гена SEAP в составе POLTV553 с использованием праймеров BGL5F2 (5'-GATSEAP5. Полученные в результате фрагменты расщепляли рестриктазами BglI и SphI (3'конец) или рестриктазами BglI и ClaI (5'-конец),соответственно, и использовали для замещенияPOLTV735 и pOLTV753 соответственно. Плазмиды pOLTV735N3 и pOLTV753N3 получали путем встраивания самокомплементарного олигонуклеотида (5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; W = А или Т) по ClaI-сайту, находящемуся между геном SEAP и 5'-концом генома NDV в составе плазмид pOLTV735 и pOLTV753 соответственно. КонструированиеSEAP-репортерных плазмид. Плазмиду pCIneoSEAP конструировали путем клонирования XhoI/ClaI-фрагмента (ClaIсайт затупляли с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I), включающего генSEAP, производный от плазмиды pSEAP-Basic(Clontech), между XhoI- и SmaI-сайтами эукариотического экспрессионного вектора pCIneo(Promega). Последняя из указанных плазмид включает промотор цитомегаловируса человекаSEAP по транскриптам, контролируемым только промотором Т 7, была сконструирована другая плазмида, в которой промотор hCMV отсутствовал. Для этой цели промотор hCMV делетировали из состава pCIneo путем частичного расщепления рестриктазой HindIII с последующим полным расщеплением рестриктазой BglII. ДНК-фрагмент (нуклеотиды 756-5469 в соответствии с нумерацией Clontech), из состава которого делетировали промотор hCMV, был выде 004796 30 лен и обработан ДНК-полимеразой Т 4 с целью затупления концов и вновь замкнут в кольцо с помощью ДНК-лигазы Т 4. Полученную в результате плазмиду обозначили pCIneoD. Наконец, ген SEAP выделяли из состава плазмидыpSEAP-Basic в виде MluI/AccI-фрагмента и клонировали в состав pCIneoD между MluI- и ClaIсайтами. Полученную в результате плазмиду обозначили pCIneoD-SEAP. Трансфекция. Клетки высевали в 24-луночные планшеты для культивирования, выращивали в течение ночи до стадии 60-80%-ного слияния и инфицировали при МOI=1 с FPV-T7 в течение 1 ч при 37 С. Клетки трансфицировали 0,5 мкг минигеномной ДНК-плазмиды с использованием 3 мкл липофектамина и OptiMem, по существу, как описано у производителя (GibcoBRL/Life Technologies). После инкубации в течение 4 ч (клетки CER) или 16 ч (клетки QM5) при 37 С клетки либо инфицировали NDV (голландский вирулентный изолят, близкий к 152608; 200 мкл на 1 лунку) в течение 1 ч при МOI=5, либо оставляли неинфицированными. Инокулят отсасывали и заменяли 1 мл полной культуральной среды,после чего клетки далее инкубировали при 37 С. Для котрансфекции клетки культивировали в 6-луночных культуральных чашках и инфицировали FPV-T7, как описано выше. Клетки котрансфицировали 0,25 мкг минигеномной ДНК-плазмидой, 0,4 мкг pCIneoNP, 0,2 мкгpCIneoP и 0,2 мкг pCIneoL(c) или pCIneo путем использования либо 8 мкл липофектамина или 9 мкл FuGene6 (Boehringer Mannheim). С целью получения инфекционного вируса минигеномную плазмиду заменяли транскрипционной плазмидой, которая включала полноразмерную кДНК вируса NDV. Количественный анализ активности SEAP. Количество SEAP, которое секретировалось в культуральную среду трансфицированными клетками, измеряли на свободных 96 луночных планшетах с использованием теста на хемолюминесценцию репортеровPhosphaLight с набором реактивов для выявления секретируемой щелочной фосфатазы (Tropix), по существу, как описано у производителя. Количественный анализ хемолюминесценции проводили с использованием счетчика сцинтилляций в жидкости (Wallac 1450 microbeta PLUS). Клонирование и секвестрование кДНК, охватывающих полный геном NDV штамма LaSota. Для клонирования и секвенирования полноразмерного генома NDV штамма LaSota крупные субгеномные клоны кДНК образовывали с помощью ПЦР с ревертированием и клонировали в состав плазмиды pGEM-T. Синтез первой цепи кДНК осуществляли с использованием праймера 3UIT, как описано выше, и 1 мкл обратнотранскриптазной реакции использовали в реакции ПЦР с набором Expand Long TemplatePCR kit (Boehringer Mannheim). ПЦР включала 5 циклов по 10 с при 94 С, 30 с при 58 С и 6 мин при 68 С с последующими 10 циклами по 10 с при 94 С, 30 с при 58 С и 6 мин при 68 С, в которых время достройки цепи при 68 С увеличивалось на 20 с в каждом последующем цикле. Полученные ПЦР-фрагменты клонировали в состав pGEM-T с использованием набораpGEM-T Cloning kit (Promega), по существу, как описано у производителя. Лигационные смеси использовали для трансформации клеток Е. coli штамма SURE II (Stratagene). Проводили две независимые ПЦР с ревертированием (А и В) и в каждой из них получали аналогичный набор клонов кДНК. Нуклеотидную последовательность субгеномных клонов кДНК определяли с использованием NDV-специфичных праймеров(табл. 1) и праймеров, фланкирующих данные вставки. После сравнения нуклеотидных последовательностей групп А и В полученных клонов оставшиеся неопределенности разрешали путем секвенирования соответствующих участков в третьей независимой группе кДНК (серия С). Нуклеотидная последовательность вируса NDV штамма LaSota показана на фиг. 3. Конструирование полноразмерного геномного клона кДНК вируса NDV. Полноразмерную кДНК NDV встраивали в состав транскрипционной плазмиды pOLTV5,используя в качестве исходной плазмидуpOLTV535. ДНК-фрагменты соединяли по участкам перекрывания с использованием обычных рестриктаз, что подробно отображено на фиг. 4 В. В ряду этапов клонирования конструировали плазмиду (обозначенную p535-DI), включающую нуклеотиды 1-3521 и 12355-15186, разделенные рестрикционным ClaI-сайтом, которая была образована путем соединения ClaI-сайтов по положениям 3521-го и 12355-го нуклеотидов. В другом ряду этапов клонирования была сконструирована плазмида (обозначенная pGEM-B),которая охватывает часть генома NDV, включая нуклеотиды 3521-12355 (ClaI-фрагмент). Для облегчения клонирования последний из названных ClaI-фрагмент помечали геном резистентности к хлорамфениколу (Cm), производным от плазмиды pACYC184 (ChangCohen, 1978). Для этой цели ген Cm выделяли из плазмидыBsiWI-сайту в состав pGEM-B с получением плазмиды pGEM-B(CAT). ClaI-фрагмент из состава pGEM-В (CAT) клонировали по уникальному ClaI-сайту h535-DI с получением плазмиды pNDFL(CAT). Наконец, ген Cm удаляли из 32 этой плазмиды путем расщепления рестриктазой BsiWI с последующим религированием и трансформированием клеток Е. coli штаммаDH5a. Полученную в результате плазмиду обозначили pNDFL+: она включала полноразмерную последовательность кДНК NDV, клонированную между промотором Т 7 и рибозимомpOLTV5. Клонирование и экспрессия отдельных генов NDV. ДНК-фрагменты, включающие каждый из генов NDV штамма LaSota, были получены с помощью ПЦР с ревертированием и клонированы в состав pCIneo. После клонирования все фрагменты секвенировали с использованием праймеров, фланкирующих вставки, и генспецифичных праймеров. Для гена NP: праймер 386 (5'-GAGCAATCGAAGTCGTACGGGTAGAAGGTG-3': нуклеотиды 40-69) использовали для обратной транскрипции. Праймеры 365 (5'GTGTGAATTCCGAGTGCGAGCCCGAAG-3': нуклеотиды 77-94) и 892 (5'-TTGCATGCCTGCAGGTCAGTACCCCCAGTC-3': нуклеотиды 1577-1593) использовали для ПЦР с ДНКполимеразой Pwo. Были использованы следующие условия ПЦР (30 циклов): 30 с при 95 С, 40 с при 65 С и 45 с при 72 С. Полученный в результате ДНК-фрагмент расщепляли рестриктазой EcoRI и клонировали в состав pCIneo междуEcoRI- и SmaI-сайтами. Экспрессию NP проверяли с помощью теста иммунопероксидазного монослоя (IPMA), как описано у Peeters et al.,1992 с использованием моноклонального антитела 38 (Russell et al., 1983). Для гена Р: праймер pRTl (5'-CAAAGAATTCAGAAAAAAGTACGGGTAG АА-3': нуклеотиды 1794-1814) использовали для обратной транскрипции. Праймеры pRT1 и р 2 (5'GCAGTCTAGATTAGCCATTCACTGCAAGGCGC-3': нуклеотиды 3053-3071) использовали для ПЦР с ДНК-полимеразой Pwo. Использовали следующие условия ПЦР (30 циклов): 30 с при 95 С, 40 с при 65 С и 60 с при 72 С. Полученный в результате ДНК-фрагмент расщепляли рестриктазами EcoRI и XbaI и клонировали в состав pCIneo между EcoRI- и XbaI-сайтами. Экспрессию Р проверяли с помощью тестаIPMA с использованием моноклонального антитела 688 (Russell et al., 1983). Для гена М: праймер 3UIT (5'ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3',нуклеотиды 1-27) использовали для обратной транскрипции. Праймеры NDV5M (5'-GGGCCCCGGGGCAGCTTATTTCTTAAAAGGAT3', нуклеотиды 4368-4389) использовали для ПЦР с набором реактивов Expand High Fidelitykit. ПЦР проводили на протяжении 10 циклов по 15 с при 95 С, 30 с при 55 С и 2 мин при 68 С с последующими 15 циклами, в которых время 33 достройки цепи при 68 С увеличивали на 20 с за каждый цикл. Полученный в результате ДНКфрагмент обрабатывали ДНК-полимеразой Т 4 для затупления концов, расщепляли рестриктазой NheI и клонировали в состав pCIneo междуNheI- и SmaI-сайтами. Экспрессию белка М проверяли в тесте IPMA с использованием моноклонального антитела 424 (Russell et al.,1983). Для гена F: праймер 3UIT (см. выше) использовали для обратной транскрипции. Праймеры NDV5F (5'-ACGGGCTAGCGATTCTGGCCTCAT-3': нуклеотиды 6212-6231) использовали для ПЦР с набором реактивов Expand HighFidelity kit с использованием тех же условий,которые описаны выше для гена М. Полученный в результате ДНК-фрагмент обрабатывали ДНК-полимеразой Т 4 для затупления концов,расщепляли рестриктазой NheI и клонировали в состав pCIneo между NheI- и SmaI-сайтами. Экспрессию белка F проверяли в тесте IPMA с использованием моноклонального антитела 8 Е 12 А 8 С 3 (ID-DLO, Dept. Avian Virol.). Для гена HN: праймер 3UIT использовали для обратной транскрипции. ПраймерыCGGTTTGATTCTTG-3'; нуклеотиды 8205-8227) использовали для ПЦР с набором реактивовExpand High Fidelity kit при тех же условиях,которые описаны выше для гена М. Полученный в результате фрагмент ДНК обрабатывали ДНК-полимеразой Т 4 для затупления концов и после расщепления рестриктазой XmaI его клонировали в состав pCIneo между затупленным (с помощью фрагмента Кленова) NheI-сайтом иXmaI-сайтом. Экспрессию белка HN проверяли в тесте IPMA с использованием моноклонального антитела 86 (Russell et al., 1983). Для гена L: ген L был выделен из кДНК клона pGEM-L7a (фиг. 4 А) путем расщепления рестриктазами SacII и SalI. Перед расщеплением рестриктазой SalI SacII-сайт затупляли путем обработки ДНК-полимеразой Т 4. Полученный в результате фрагмент клонировали в pCIneo между затупленным (с помощью фрагмента Кленова) NheI-сайтом и SalI-сайтом. 5'-Нетранслируемый участок между промотором Т 7 и старткодоном ATG в последовательности гена L включает два внерамочных кодона ATG, которые могут помешать нормальной экспрессии белка L. Следовательно, была сконструирована новая плазмида, в которой первый кодон ATG был пропущен и в которой второй кодон ATG был изменен на AAG путем ПЦР-мутагенеза в соответствии со следующим. Праймеры 5LE(E)BsiWI/SalI-фрагмент из состава pGEM-L7a, который включает оставшуюся часть гена L (нуклеотиды 8852-15046),клонировали вpCIneoL(N) между BsiWI- и SalI-сайтами, получая в результате плазмиду pCIneoL(c). Поскольку антитела, специфичные в отношении белка L пока недоступны, проверить экспрессию L иммуноцитохимическими методами нельзя. Внесение генетической метки в ген F. Для того чтобы недвусмысленно показать,что инфекционный вирус может быть получен из клонированной полноразмерной кДНК, генетическую метку вносили в состав гена F посредством ПЦР-опосредованного мутагенеза. Для этой цели ген F клонировали с использованием двух перекрывающихся ПЦР-фрагментов. Первый ПЦР-фрагмент получали с использованием праймера NDV5F (см. выше) и праймера F5RTGTAGTCAC-3': нуклеотиды 4859-4894). Выделенные полужирным шрифтом нуклеотиды соответствуют изменениям, которые были внесены в этот праймер с целью изменения аминокислотной последовательности сайта протеолитического расщепления между последовательностями F1 и F2, чтобы перейти от NDV штамма LaSota (GGRQGRL) К консенсусному сайту расщепления, характерному для вирулентных штаммов NDV (GRRQRRF). Второй ПЦР-фрагмент был получен с использованием праймеров F3F (5'-GGAGGAGACAGCGGCGCTCTACCAGAACTTTCAC-3'; нуклеотиды 62466266). ПЦР проводили с ДНК-полимеразой Pwo в 25 циклах по 15 с при 94 С, 30 с при 55 С и 2 мин при 72 С. Два перекрывающихся ПЦРфрагмента (перекрывание в последовательностях праймеров выделено курсивом) соединяли во второй реакции ПЦР с использованием праймеров NDV5F и IV09 и в тех же условиях проведения реакции. Полученный в результате фрагмент, который включает полную кодирующую рамку гена F и который кодирует вирулентный консенсусный сайт расщепления, обрабатывали рестриктазами NheI и SalI и клонировали в состав pCIneo между NheI- и SalIсайтами, получая плазмиду pCIneoFwt, StuI-NotIфрагмент (нуклеотиды 4646-4952) из составаpCIneoFwt использовали для замещения соответствующего фрагмента в плазмиде p535-S, кото 35 рая была сконструирована путем встраиванияSeaI-сайтами (см. фиг. 4 С). Полученную в результате плазмиду обозначили p535-S[Fwtc]. ПЦР-фрагмент, включающий ген резистентности Cm из состава pACYC184 (см. выше), клонировали в виде XbaI-фрагмента по уникальному XbaI-сайту (6172-й нуклеотид последовательности генома NDV) плазмиды p535-S[Fwtc],получив плазмиду р 535-S[Fwtc]Cm. После этогоCm-помеченный ApaI-SpeI-фрагмент (нуклеотиды 2285-8094) из этой плазмиды использовали для замещения соответствующего фрагмента полноразмерной кДНК в плазмиде pNDFL+. Наконец, ген Cm удаляли из этой плазмиды путем расщепления рестриктазой XbaI с последующим восстановлением кольцевой структуры с помощью ДНК-лигазы Т 4. Полученную в результате плазмиду, которая включает генетически помеченную полноразмерную кДНК NDV,обозначили pNDFL+ [Fwt]. Образование линий стабильно трансформированных клеток, которые экспрессируют отдельные гены NDV. Плазмиды pCIneoNP, pCIneoP, pCIneoM,pCIneoF, pCIneoFwt и pCIneoHN использовали для образования линий стабильно трансформированных клеток, которые экспрессируют эти белки по отдельности. За день до проведения трансфекции клетки CER высевали на 6-см культуральные чашки и инкубировали в течение ночи до достижения уровня слияния 60-80%. Клетки трансфицировали 2 мкг плазмидной ДНК с использованием 12 мкл липофектамина иOptiMem, по существу, как описано у производителя (GibcoBRL/Life Technologies). Через 48 ч клетки обрабатывали трипсином и разведения высевали на 10-см культуральные чашки в среду, содержащую 500 мкг/мл антибиотика G418(Boehringer Mannheim). Каждые 3 дня культуральную среду заменяли свежей средой, содержащей возрастающее количество (при шаге в 100 мкг/мл) G418 до достижения концентрации 800 мкг/мл. Клетки выдерживали в среде, содержащей 800 мкг/мл G418, и через 3 недели после трансфекции отдельные колонии вырезали и переносили на 96-луночные культуральные чашки. Клонированные клеточные линии тестировали по экспрессии соответствующего генаNDV с использованием теста IPMA, как описано выше для анализа непостоянной экспрессии. Клеточные линии, которые постоянно экспрессировали белок NP, Р, М или F, были идентифицированы и выделены. Однако не удалось образовать клеточные линии, которые бы экспрессировали белок HN. Предположительно конститутивная экспрессия HN является токсичной для клеток. Образование линий стабильно трансформированных клеток, которые экспрессируют РНК-полимеразу Т 7. 36 Ген, кодирующий РНК-полимеразу Т 7,был выделен из плазмиды pRT7NT (Rene vanGennip, ID-DLO, Department of Mammalian Virology) путем обработки рестриктазами EcoRI иSalI. Полученный в результате фрагмент включает ген РНК-полимеразы T7, находящийся позади бакуловирусного промотора р 10. ДНКфрагмент клонировали в состав плазмидыpCIneoO между EcoRI- и SalI-сайтами, получив плазмиду рСInео 107. Плазмида pCIneo0 лишена промотора T7 и была получена из pCIneo путем расщепления рестриктазой NheI с последующим частичным расщеплением ScaI, заполнением липких концов с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы и восстановления кольцевой структуры с помощью ДНК-лигазы Т 4. Бакуловирусные последовательности удаляли из рСInео 107 путем обработки рестриктазамиEcoRI и PacI с последующим затуплением концов с помощью обработки ДНК-полимеразой Т 4 и восстановлением кольцевой структуры. Полученную в результате плазмиду обозначили рСInео 007. Экспрессию РНК-полимеразы Т 7 проверяли путем котрансфекции клеток плазмидами рСInео 007 и pPRh01. Последняя из них включает ген белка Е 2 вируса классической лихорадки свиней, клонированный за промотором Т 7 и включающий внутренний сайт связывания на рибосоме (Rene van Gennip, персональное сообщение). Экспрессию Е 2 тестировали вIPMA с использованием моноклонального антитела V4 (Wensvoort et al., 1986). Линии стабильно трансформированных клеток CER, экспрессирующих РНК-полимеразу T7, образовывали и выделяли, как описано выше, за исключением того, что использовали 10-см культуральные чашки и клетки трансфицировали 5 мкг плазмиды рСInео 007 и 25 мкл липофектамина. Для анализа отдельных клеточных линий на экспрессию РНК-полимеразы T7 их трансфицировали плазмидой pPRh01 и экспрессию Е 2 (которая зависит от РНК-полимеразы Т 7) определяли в тесте IPMA с использованием моноклонального антитела V4. Было идентифицировано несколько клеточных линий, которые экспрессировали РНК-полимеразу Т 4. Для последующих экспериментов использовали одну из этих клеточных линий, обозначенную CER-C9. Клонирование и экспрессия генов HN и гибридных генов HN. Праймер 3UIT использовали для синтеза одноцепочечной кДНК NDV и серотипов 2 и 4 парамиксовируса птиц (APMV2 и APMV4), как описано выше. Все последующие ПЦР проводили в 25 циклах по 15 с при 94 С, 30 с при 55 С и 2 мин при 72 С. Полноразмерный кодирующий участок гена HN серотипа APMV2 выделяли с помощью ПЦР с использованием праймеров IV03 (5'GGGGGAATTCCCCATTCAATGAAGGGTCAACCAGGCTTCGCAATG-3'), которые являют 37 ся производными от последовательности генаD14030). Полноразмерный кодирующий участок гена HN серотипа APMV4 выделяли с помощью ПЦР с использованием праймеров IV06 (5'GGGGGAATTCTGGTAGGGTGGGGAAGGTACTAATCAGGATCTCAG-3'), которые являются производными от последовательности генаD14031). Полученные в результате ПЦРфрагменты расщепляли (либо сразу, либо после клонирования в pGEM-T) рестриктазами EcoRI и XmaI и клонировали в pCIneo между EcoRI- иXmaI-сайтами. Полученные в результате плазмиды обозначили pCIneoHN2 и pCIneoHN4 соответственно. Химеры между геном HN NDV штаммаLaSota и генами HN штаммов APMV2 и APMV4 были сконструированы с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами следующим образом. N-концевой участок (кодирующий аминокислоты 1-141) гена HN NDV штамма LaSota амплифицировали с использованием ДНКполимеразы Pwo с праймерами IV01B (5'GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAPMV2 (кодирует аминокислоты 142-580) амплифицировали с использованием ДНКполимеразы Pwo с праймерами IV11B (5'GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTCAAGGAGATGCATCTGCAGGC-3') и IV05. Полученные ПЦР-фрагменты соединяли методом ПЦР с перекрывающимися праймерами (участки перекрывания выделены курсивом) с использованием праймеров IV01B и IV05 и набора ферментовATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3') и IV08. Этот фрагмент соединяли с N-концевой частью гена HN NDV (см. выше) методом ПЦР с перекрывающимися праймерами с использованием праймеров IV01B и IV08. Полученный в результате ПЦР-фрагмент расщепляли (либо сразу,либо после субклонирования в pGEM-T) рестриктазами EcoRI и XmaI и клонировали в составpCIneoHNl/4141. Аналогично конструкциям, описанным выше, были образованы гибридные гены HN,кодирующие аминокислоты 1-143 NDV и аминокислоты 144-580 APMV2 или кодирующие аминокислоты 1-143 NDV и аминокислоты 145569 APMV4. Для получения этих конструкций ПЦР-фрагменты получали с использованием следующих пар праймеров: аминокислоты 1-143AAACAGCTGACTACACAGCAG-3') и IV08. Полученные ПЦР-фрагменты расщепляли (либо сразу, либо после субклонирования в pGEM-T) рестриктазами EcoRI и XmaI и клонировали в состав pCIneo между EcoRI- и XmaI-сайтами. Полученные в результате плазмиды обозначилиpCIneol/2143 и pCIneol/4143 соответственно. Для анализа экспрессии белков HN клетки CER или клетки QM5 инфицировали FPV-T7 в течение 1 ч при МОI=1, трансфицировали плазмидамиpCIneoHN,pCIneoHN2,pCIneoHN4,pCIneoHNl/2141, pCIneoHNl/2143, pCIneoHNl/4141 и pCIneoHNl/4143 и через 24 ч после трансфекции монослойные культуры покрывали 1%-ной суспензией куриных эритроцитов в ФСБ в течение 45 мин при комнатной температуре. После этого монослои тщательно промывали 3 раза ФСБ и прилипание эритроцитов к трансфицированным клеткам анализировали под микроскопом. Для анализа индукции слияния клеток после одновременной экспрессии белков HN и F клетки CER или клетки QM5 котрансфицировали плазмидой pCIneoFwt вместе с одной из плазмид pCIneoHN1, pCIneoHN2, pCIneoHN4,pCIneoHNl/2141, pCIneoHNl/4141, pCIneoHNl/2143 и pCIneoHNl/4143. После инкубации в течение 23 дней монослойные культуры промывали в ФСБ, окрашивали в течение 15 мин раствором Гимза (1:30 разведение в воде) и анализировали под микроскопом. Клонирование гибридных генов HN в полноразмерную кДНК генома NDV. Синтетический линкер, обозначенныйHN12, был встроен между NotI- и SpeI-сайтами плазмиды pGEM-T (Promega) с использованием олигонуклеотидных праймеров HN12a (5'GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGACTTA-3') и HN12b (5'-CTAGTAAGTCGTTAACTCTAGHN14, был встроен между NotI-и SpeI-сайтами плазмиды pGEM-T с использованием олигонуклеотидных праймеров HN14a (5'-GGCCGCpGEM-HN12 и pGEM-HN14 соответственно. Эти плазмиды расщепляли рестриктазами NotI иNotI/SpeI-фрагмента (нуклеотиды 3390-7488) из состава плазмиды p535-S[Fwtc]Cm. Полученные в результате плазмиды обозначили pGEMHNl/2NS и pGEM-HN1/4NS соответственно. Гены HN из этих плазмид заменяли гибридными генами HN из плазмид pCIneoHNl/2143 иpCIneoHNl/4143 соответственно (см. раздел Клонирование и экспрессия генов HN и гибридных генов HN). Для этой цели плазмидыpGEM+HN14 соответственно. Последние плазмиды использовали для внесения гибридных генов HN в полноразмерную геномную кДНК вируса NDV. Для этого плазмиды pGEM+HN12 и pGEM+HN14 расщепляли рестриктазами NotI и SpeI и полученный фрагмент, включающий либо ген HN12, либо ген HN14, использовали для замещения соответствующего фрагмента в составе pNDFL+, получая тем самымpNDFL+HNl/2143Cm и pNDFL+NHl/4143Cm соответственно. Ген Cm удаляли из состава этих плазмид путем обработки рестриктазой восстановлением кольцевой структуры с помощью ДНК-лигазы Т 4. С целью соответствия правилу шести линкер встраивали по уникальномуSpeI-сайту в составе этих плазмид с использованием самокомплементарных олигонуклеотидов. Линкер Н 2 (5'-CTAGCGAGCGCTCG-3') был встроен в плазмиду pNDFL+HNl/2143, a линкер Н 3 (5'-CTAGCGAGCWGCTCG-3') был встроен в плазмиду pNDFL+NHl/4143, в результате чего получали плазмиды pNDFL+HNl/2143 (H2) иpNDFL+NHl/4143 (Н 3) соответственно. Удаление специфичного эпитопа из белкаHN NDV штамма LaSota. Специфичный эпитоп, т.е. аминокислоты 346-354 (PDEQDYQIR) в последовательности белка HN вируса NDV штамма LaSota, который распознается моноклональным антителом 4D6(Long et al., 1986; Meulemans et al., 1986), удаляли путем замещения этой последовательности на соответствующую последовательность белков HN либо APMV2 (NRTDIQQTI), либоpCIneoHN (см. раздел Клонирование и экспрессия отдельных генов NDV) использовали в качестве матрицы для создания перекрывающихся ПЦР-фрагментов. Для последовательности APMV2 первый ПЦР-фрагмент получали с использованием праймера IV01 (5'-GTAGACCGGTTTGATTCTTG-3'). Полученные в результате фрагменты объединяли и использовали в качестве матрицы для третьей ПЦР с праймерами IV01B (5'GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3') и NDV3-HN. Полученные в результате фрагменты объединяли и использовали в качестве матрицы для третьей ПЦР с использованием праймеровIV01B и NDV3-HN. Праймеры 3HN2/5HN2 и 3HN4/5HN4 отчасти комплементарны и включают генетические коды для последовательности HN2 (NRTDIQQTI) и для последовательности HN4 (PDPLQDQIL) соответственно. Реакции ПЦР проводили с использованием набора реактивов Expand Long Template PCR kit (Boehringer Mannheim). ПЦР включала 30 циклов по 10 с при 94 С, 30 с при 58 С и 2 мин при 68 С с последующим 1 циклом в течение 4 мин при 68 С. ПЦР-фрагменты расщепляли рестриктазами EcoRI и Bsu36I и клонировали междуpCIneoHN1(HN2e) и pCIneoHN1(HN4e) соответственно. Анализ перемежающейся экспрессии показал, что модифицированные белки HN точно экспрессируются и переносятся на поверхность клетки, на что указывает анализ гемоадсорбции на материале куриных эритроцитов. Более того, моноклональное антитело 6D4, которое специфично в отношении линейного эпитопа HN NDV, который состоит из аминокислот 346-354 (или, по крайней мере, включает их), не реагирует с модифицированными белками HN. ПлазмидыNarI и SpeI и фрагменты, включающие модифицированные гены HN, клонировали между NarIи SpeI-сайтами плазмид pGEM-HNl/2NS иpGEM-HNl/4NS соответственно. Полученные в результате плазмиды, обозначенные pGEMHNl(HN2e) и pGEM-HNl(HN4e), расщепляли рестриктазами NotI и SpeI и использовали для замещения NotI/SpeI-фрагмента в составеpNDFL+. Полученные в результате плазмиды обозначили pNDFL-HN(HN2e)Cm и pNDFLHN(HN4e)Cm соответственно. Ген Cm удаляли из этих плазмид расщеплением рестриктазойXbaIс последующим религированием. Полученные в результате плазмиды обозначили pNDFLHN(HN2e) и pNDFL-HN(HN4e) соответственно. Результаты Нуклеотидная последовательность 3'- и 5'концевых участков генома NDV штамма LaSota. Нуклеотидная последовательность предполагаемого 3'-конца генома NDV опубликована (Ishida et al., 1986), хотя и на материале иного штамма NDV (D26), чем тот, который использовался в данной работе (LaSota). Опубликована(Yusoff et al., 1987) последовательность гена L и относительно крупного некодирующего участка за геном L вируса NDV штамма Beaudette-C. Однако, как здесь показано, данная последовательность не включает полную 5'-концевую часть вирусного генома, что делает невозможным создание инфекционной копии NDV. 3'- и 5'-Концевые участки генома вирусов с некодирующими одноцепочечными РНК играют ключевую роль в репликации и транскрипции (LambKolakofsky, 1996). Таким образом, с целью получения полноразмерной кДНК генома NDV,которую можно было бы использовать для получения инфекционного вируса методами обратной генетики (Conzelmann, 1996), совершенно необходимо включить в вирусный геном точные 3'- и 5'-концевые участки. Следовательно, авторами была определена точная нуклеотидная последовательность обоих 3'- и 5'-концов геномной РНК вируса NDV штамма LaSota с использованием метода 3'- и 5'-RACE (быстрая амплификация концов кДНК). 5'-Концевой участок был выделен с помощью ПЦР после лигирования одноцепочечного якорного праймера(ALG3) на одноцепочечную кДНК, которую получали путем обратной транскрипции 5'концевого сегмента геномной РНК. С использованием праймера ALG4, комплементарного якорному праймеру, и NDV-специфичного праймера были получены ПЦР-продукты, которые включали 5'-концевой участок. Для клонирования 3'-участка NDV одноцепочечный якорный праймер ALG3 лигировали на 3'-конец вирусной РНК с использованием РНК-лигазы Т 4 и амплифицировали методом ПЦР с праймером ALG4 и NDV-специфичным праймером (способ I). С другой стороны, 3'- и 5'-концевые участки РНК NDV лигировали друг на друга с использованием РНК-лигазы Т 4 и полученный в результате РНК-конкатенат использовали в ПЦР с ревертированием с NDVспецифичными праймерами, которые фланкируют точку лигирования (способ II). Продукты реакций 3'- и 5'-RACE клонировали в Т-векторpBluescriptII-TSK (IchiharaKurosawa, 1993) или в pGEM4Z с последующим выделением и секвенированием нескольких независимых клонов. Полученные результаты обобщены в табл. 2. Для проведения прямого сравнения 3'- и 5'концевых участков нуклеотидные последовательности показаны в виде ДНК, а 3'-конец ге 004796 42 номной цепи представлен как 5'-конец антигеномной цепи. На уровне геномной РНК последовательность 3'-конца читается как 3'-UGGUUUGUCUCUUAG-5', в то время как последовательность 5'-конца читается как 3'-UUUAGAAACAAACCA-5'. Последовательность 3'конца почти полностью совпадает с опубликованной 3'-концевой последовательностью NDV штамма D26 (Ishida et al., 1986). Однако последовательность 5'-конца указывает на то, чтоNDV штамма LaSota включает 64 дополнительных нуклеотида по сравнению с опубликованной последовательностью гена L NDV штаммаBeaudette-C (Yusoff et al., 1987) (фиг. 6). Репликация минигеномов NDV с участием вируса-помощника. Для установления того, функциональны ли 3'- и 5'-концевые участки NDV по репликации и транскрипции, были сконструированы минигеномы, которые включали 3'-участок NDV (нуклеотиды 1-119), ген-репортер, кодирующий секретируемую щелочную фосфатазу (SEAP), и 5'конец NDV (нуклеотиды 14973-15186) (фиг. 2). Указанные минигеномы клонировали в обеих ориентациях в транскрипционный вектор(фиг. 1) промотор РНК-полимеразы Т 7 с нижерасположенными уникальными рестрикционными StuI- и SmaI-сайтами, автокаталитический рибозим вируса гепатита-D (HDV) и сигнал терминации транскрипции нечетного фага Т 7in vivo или in vitro плазмиды pOLTV535 с использованием РНК-полимеразы Т 7 образуется антигеномная РНК (т.е. [+]-РНК), в то время как при транскрипции плазмиды pOLTV553 образуется геномная РНК (т.е. [-]-РНК) (фиг. 5). Для анализа того, может ли минигеномная РНК, образованная плазмидами pOLTV535 иCER, которые экспрессируют РНК-полимеразу Т 7 либо по конститутивному типу (клетки CERC9: см Материалы и методы), либо после инфицирования рекомбинантным вирусом куриной оспы fpEFLT7pol (Britton et al., 1995; здесь и далее обозначается как FPV-T7), который экспрессирует РНК-полимеразу Т 7. Клетки CERC9 и клетки CER, инфицированные FPV-T7,трансфицировали минигеномными плазмидамиpOLTV535 или pOLTV553 и после инкубации в течение 3 ч при 37 С клетки либо инфицировали NDV в течение 1 ч, либо оставляли неинфицированными. Приблизительно через 24 ч после трансфекции образец отбирали из культуральной среды и оценивали активность SEAP. Полученные результаты показали, что экспрессияSEAP была очень высокой в клетках, инфици 43 рованных FPV-T7 и трансфицированных плазмидой pOLTV535. Это неудивительно потому,что транскрипция под контролем РНКполимеразы Т 7 образует антигеномную [+]РНК, кэпируемую ферментами куриной оспы,которая эффективно транслируется в клеткехозяине. В клетках, трансфицированныхSEAP, должна предварительно конвертироваться в [+]-РНК с участием вируса-помощника(сравн. с фиг. 5). В обоих случаях в клетках,инфицированных NDV, по сравнению с неинфицированными клетками, не обнаруживается увеличение экспрессии SEAP. С другой стороны, экспрессия SEAP в NDV-инфицированных клетках была стабильно примерно вдвое ниже по сравнению с неинфицированными клетками(данные не включены). В случае с клетками,трансфицированными pOLTV535, это можно объяснить уже имеющимся очень высоким уровнем экспрессии SEAP с транскриптов, образованных с участием РНК-полимеразы Т 7. Однако в клетках,трансфицированныхpOLTV553, в которых эффективная экспрессия зависит от конверсии геномной [-]-РНК в антигеномную [+]-РНК или мРНК с участием полимеразного комплекса, можно было бы ожидать увеличения экспрессии SEAP после инфицирования NDV. Авторы предположили существование двух причин, по которым минигеномы не способны экспрессировать и реплицироваться с участием NDV. Во-первых, размер минигеномных РНК не удовлетворяет так называемому правилу шести (CalainRoux, 1993; Kolakofsky et al., 1998). Согласно этому правилу, геномы парамиксовирусов эффективно реплицируются только тогда, когда их длина кратна 6 нуклеотидам. Во-вторых, два дополнительных нуклеотида G, которые располагаются на 5'-конце минигеномных РНК, могут мешать точной репликации и/или транскрипции с участием вирусного полимеразного комплекса. Для оценки того, действительно ли репликация геномов зависит от правила шести, авторы внесли по уникальному ClaI-сайту плазмид pOLTV535 иPOLTV553 серию коротких самокомплементарных олигонуклеотидов, которые увеличивали длину на 1 нуклеотид (фиг. 2). Полученные в результате плазмиды (pOLTV535 от N0 до N5 иpOLTV553 от N0 до N5) различаются по размеру на 1-6 нуклеотидов, следовательно, один из них должен образовать минигеномную РНК,которая удовлетворит правилу шести. Эти плазмиды использовали для трансфекции клетокpOLTV535N3 и pOLTV553N3 обусловливали усиление активности SEAP после NDV 004796 44 инфицирования. Длина минигеномных РНК, полученных с этих плазмид с участием РНК-полимеразы Т 7, была определена как 6n+2. Поскольку на 5'-конце указанных минигеномных РНК присутствуют два лишних нуклеотида G, то эти данные подтверждают, что только размер последовательности РНК, расположенной между аутентичными 3'- и 5'-концами минигеномных РНК, является существенным для правила шести. Это проверяли путем конструирования минигеномных плазмид, в составе которых старт-сайт транскрипции РНКполимеразы Т 7 изменяли так, что первый нуклеотид, который встраивается в РНК, был первым нуклеотидом 3'- или 5'-конца NDV (см. Материалы и методы). Трансфекция этими плазмидами показала, что только те минигеномные РНК, которые происходили от плазмидpOLTV535N3 и POLTV553N3, реплицируются с участием вируса-помощника (данные не включены). Установление данного факта дополнительно указывает на то, что репликация NDV жестко ограничена правилом шести. Более того, эти данные указывают на то, что присутствие двух лишних нуклеотидов G на 5'-конце минигеномных РНК не мешает точной репликации. Аналогичные результаты были получены на материале минигеномных плазмид (или плазмид DI) других парамиксовирусов (Pattnaiket al., 1992; HartyPalese, 1995). Упаковка минигеномов NDV с участием вируса-помощника. Для установления того, могут ли минигеномные РНК быть упакованы с участием вируса-помощника NDV, культуральную среду трансфицированных клеток переносили на свежие монослои и после часовой адсорбции монослойные культуры трижды промывали ФСБ и дополнительно инкубировали в полной среде. После инкубации в течение 24 ч измеряли активность SEAP в культуральной среде. Полученные результаты показали, что активностьSEAP присутствовала только в клетках, которые были обработаны культуральной средой, взятой от клеток, трансфицированных минигеномной плазмидой pOLTV553N3 (табл. 4). Эти данные указывают на то, что минигеномные РНК могут быть упакованы в оболочки NDV и что полученные вирусные частицы способны инфицировать клетки. Более того, эти данные показывают, что упаковка зависит от репликации, а это говорит о том, что только те молекулы РНК,которые образуют комплекс с вирусными белками NP, Р и L, упаковываются в вирусоподобные частицы. Репликация минигеномов NDV с участием плазмид, экспрессирующих белки NP, P и L. Для определения того, могут ли минигеномные РНК также реплицироваться с участием плазмид, кодирующих ключевые белки NP, P иL, были проведены эксперименты по котрансфекции клеток, инфицированных FPV-T7. Клет 45 ки трансфицировали путем сочетания плазмид,включающих минигеномную плазмиду и плазмиды pCIneoNP, pCIneoP и pCIneoL(c) соответственно. В качестве негативного контроля плазмиду pCIneoL(c), которая кодирует ключевой белок L, заменяли векторной плазмидой pCIneo. Полученные результаты (табл. 5) показали, что действительно плазмиды, кодирующие белкиNP, P и L, способны обеспечивать репликацию минигеномных РНК. Также эти результаты показывают, что аналогичным образом с репликацией минигеномов с участием вирусапомощника, репликация с участием белков NP,P и L также является зависимой от правила шести. Нуклеотидная последовательность полного генома NDV штамма LaSota. Субгеномные фрагменты кДНК, охватывающие полный геном NDV, были сконструированы с применением ПЦР с ревертированием(фиг. 4). Для минимизации ошибок при ПЦР смесь ферментов, обладающих корректирующей активностью (Expand Long Template kit: Boehringer Mannheim), использовали в сочетании с ограниченным числом циклов ПЦР (15 циклов). Праймер 3UIT, комплементарный 3'-концу РНКNDV, использовали для обратной транскрипции, а ген-специфичные праймеры использовали для ПЦР. Для идентификации возможных ошибок при ПЦР были проведены три независимые реакции ПЦР, в результате которых получали три независимых набора субгеномных кДНК. Эти кДНК, размер которых варьировался от 4 до 7 тысяч пар нуклеотидов, клонировали вpGEM-T. Нуклеотидную последовательность двух наборов кДНК определяли с использованием праймеров, которые были либо установлены по параметрам опубликованных последовательностей NDV, либо являются производными от последовательности NDV, определенной в ходе данного исследования (табл. 1). Остававшиеся неопределенности разрешали путем секвенирования соответствующих участков на материале третьего набора клонов кДНК. ГеномNDV штамма LaSota состоит из 15186 пар нуклеотидов (фиг. 3), что делает его наименьшим среди геномов всех парамиксовирусов, для которых к настоящему времени установлена полная геномная последовательность (Kolakofsky etal., 1998). Конструирование клона полноразмерной кДНК NDV в транскрипционной плазмидеpOLTV5. Для конструирования полноразмерного клона кДНК вируса NDV штамма LaSota перекрывающиеся клоны кДНК, охватывающие полный геном NDV, соединяли друг с другом по общим рестрикционным сайтам в соответствии с подходом, отображенным на фиг. 4. Полную кДНК NDV собирали в минигеномной плазмидеpOLTV535 (см. выше), которая является произ 004796 46 водной от транскрипционной плазмидыPOLTV5. Как можно видеть на фиг. 4 В, последним этапом данной сборки полной кДНК NDV было клонирование ClaI-фрагмента длиной примерно 8,8 тысяч пар нуклеотидов (нуклеотиды 352112355) из состава pGEM-B в плазмиду p535-DI,которая включает последовательности NDV,фланкирующие ClaI-сайт по обеим сторонам от него (т.е. нуклеотиды 1-3521 и 12355-15186 соответственно). Этот этап, как оказалось, является весьма трудным, т.к. заявителям в течение нескольких раз не удавалось образовать точные клоны. Следовательно, ClaI-фрагмент плазмидыpGEM-B был помечен геном резистентности к хлорамфениколу (Cm) из плазмиды pACYC184. Включающий ген Cm ClaI-фрагмент был выделен и клонирован по ClaI-сайту p535-DI, а полученные трансформанты отбирали по резистентности к Сm. Поскольку трансформанты характеризовались слабым ростом, отбор с антибиотиками проводили при снижении концентрации до 15 мкг/мл Cm и 10 мкг/мл канамицина, а температуру инкубации снижали с 37 до 32 С. Наконец, ген Cm удаляли из данной плазмиды путем обработки рестриктазой BsiWI с последующим восстановлением кольцевой структуры с помощью ДНК-лигазы Т 4. После трансформации клеток Е. coli клетки, несущие желательную плазмиду, идентифицировали по их фенотипу с помощью скрининга на резистентность к Km и на чувствительность к Сm. Полученную в результате плазмиду, которая включает полноразмерную кДНК NDV, клонированную междуSmaI- и StuI-сайтами транскрипционной плазмиды, обозначили pNDFL+. Создание инфекционного NDV на материале полноразмерной кДНК. Для создания инфекционного NDV полностью из клонированной кДНК плазмидуpNDFL+ использовали в экспериментах по котрансфекции с плазмидами pCIneoNP,pCIneoP и pCIneoL(c), как описано выше для минигеномных плазмид. Трансфекцию клетокCER и CEF контролировали с использованием минигеномной плазмиды pOLTV553N3 и путем измерения уровня экспрессии SEAP. В качестве негативного контроля использовали заменуpCIneoL(c) на pCIneo. После котрансфекции клетки инкубировали в течение 3-6 дней в среде, содержащей 5% аллантоисной жидкости. Добавление аллантоисной жидкости необходимо потому, что клетки CER или CEF лишены подходящих протеаз, которые обеспечивают расщепление белка F вируса NDV штамма LaSota. Расщепление белка F является абсолютно необходимым для распространения от клетки к клетке генерации инфекционного вируса. После инкубации в течение 3 дней проводили иммунологическое окрашивание фиксированных монослойных культур с использованием моноклонального антитела, специфичного в отношении 47 белка F. Полученные результаты показали, что клетки, которые окрашивались этим антителом,присутствуют только в тех монослоях, которые были котрансфицированы плазмидамиpNDFL(+), pCIneoNP, pCIneoP и pCIneoL(c). Эти результаты указывают на то, что в этих клетках происходит репликация генома и экспрессия. Не было выявлено окрашенных клеток тогда, когда в экспериментах по котрансфекции pCIneoL(c) заменяли плазмидой pCIneo. Для выделения инфекционного вируса надосадочный слой трансфицированных монослоев CEF инъецировали в аллантоисную полость развивающихся куриных яиц. Через 4 дня аллантоисную жидкость собирали, анализировали в гемагглютинационном тесте и вновь пассировали в яйца. Полученные результаты показали,что только надосадочный слой клеток, трансфицированных сочетанием плазмид pNDFL(+),pCIneoNP, pCIneoP и pCIneoL(c), обусловливал положительную реакцию в тесте на гемагглютинацию. Аллантоисную жидкость, которая характеризовалась положительной реакцией гемагглютинации, после этого анализировали в тесте на подавление гемагглютинации с использованием моноклональных антител 7 В 7, 8 С 11,5 А 1, 7D4 и 4D6 (Long et al., 1986), которые можно использовать для дифференцировки разных штаммов NDV. Результаты данного теста показали, что штамм NDV, который был выделен из инокулированных яиц, характеризовался тем же уровнем реактивности, что и исходный штамм LaSota. Вирус, который выделили из инокулированных яиц, обозначили NDFL, чтобы обособить его от исходного штамма LaSota. Создание генетически модифицированногоNDV на материале полноразмерной кДНК. Для того чтобы недвусмысленно показать,что котрансфекцию можно использовать для выделения инфекционного вируса на материале клонированной полноразмерной кДНК NDV, в плазмиду pNDFL(+) вносили генетическую метку. Для этой цели аминокислотную последовательность сайта расщепления протеазой в последовательности белка Fo изменяли от таковой штамма LaSota (GGRQGRL) на консенсусную последовательность вирулентных штаммовNDV (GRRQRRF) с применением ПЦРмутагенеза (подробности см. раздел Материал и методы). Полученную в результате плазмиду,pNDFL+ [Fwt], использовали для создания вируса с использованием котрансфекционной системы, описанной выше. Инфекционный вирус,обозначенный NDFL [Fwt], выделяли из аллантоисной жидкости развивающихся яиц, которые были инокулированы культуральной средой от котрансфицированных клеток CEF. В тесте на подавление гемагглютинации все моноклональные антитела, включая 7D4, которое специфично для штамма LaSota, проявляли такую же реактивность в отношении новообразованногоLaSota. Нуклеотидную последовательность участка, кодирующего сайт расщепления протеазой белка F, определяли с помощью ПЦР с ревертированием. Полученные результаты показали,что нуклеотидная последовательность включает точные нуклеотидные изменения, которые были внесены в мутагенный праймер, использовавшийся для модифицирования исходной последовательности LaSota. Эти данные показывают,что вирус происходил от плазмидыpNDFL+[Fwt], и показывают, что генетически модифицированный NDV может быть создан полностью на материале клонированной полноразмерной кДНК NDV. Сайт расщепления протеазой белка Fo вируса NDV является ключевым детерминантом вирулентности. В целом считается, что аминокислотная последовательность сайта расщепления протеазой в белке Fo является ключевым детерминантом вирулентности у различных штаммов NDV. Создание генетически модифицированного штамма LaSota, у которого аминокислотная последовательность сайта расщепления протеазой была заменена с лентогенной (невирулентной) на таковую от велогенного (вирулентного) штамма NDV, предоставляет уникальную возможность проверить данное предположение. Следовательно, определяли индекс интрацеребральной патогенности (ICPI) новообразованного вируса NDFL [Fwt] и сравнивали его с индексами штамма NDFL и исходного штамма LaSota(клон Е 13-1). Полученные результаты показали,что ICPI штамма NDFL[Fwt] составил 1,3, что существенно превосходит значение для штаммов NDFL (ICPI = 0,0) и клона Е 13-1 (ICPI = 0,3). Эти данные показывают, что, как и ожидалось, вирулентность NDV в значительной степени определяется аминокислотной последовательностью сайта расщепления протеазой в белке Fo. Внесение серологического маркера. Оболочечные гликопротеины F и HN NDV являются наиболее сильными иммуногенными белками данного вируса. После заражения как белок F, так и белок HN вызывают мощный ответ в виде выработки нейтрализующих антител. Индукция такого ответа по нейтрализующим антителам является основой для успешной вакцинации с использованием невирулентных штаммов NDV (таких как широко применяемый штамм LaSota). Однако ответ по выработке антител на вакцинные штаммы NDV не может быть распознан по сравнению с ответом по выработке антител на вирулентные полевые штаммы NDV. Следовательно, инфекции вирулентным полевым вирусом не могут быть прослежены с помощью серологических методов. Такая ситуация нежелательна потому, что заражение полевым вирусом маскируется вакцинацией, а клинические признаки, вызываемые по 49 левыми штаммами, могут просматриваться или даже приписываться данной вакцине. Поскольку успешная дифференцировка между вакцинацией и инфекцией существенна для искорененияNDV, авторы имели намерение разработать генетически модифицированные штаммы NDV,которые можно было использовать для вакцинации и которые были бы серологически отличимы от полевых штаммов NDV (так называемые маркерные вакцины). С целью разработки маркерных NDV-вакцин вирус должен быть генетически модифицирован таким образом,чтобы один или несколько иммунодоминантных эпитопов одного из (основных) антигенов был либо делетирован, либо модифицирован. Делеция части(ей) ключевого белка может приводить к утрате биологической функции данного белка. Следовательно, один из иммунодоминантных белков оболочки NDV заявители выбрали для модифицирования таким образом,чтобы биологическая функция этого белка сохранялась, в то время как репертуар антител,специфичных в отношении модифицированного белка, отличался от такового, специфичного в отношении исходного белка. С точки зрения резонов, о которых говорится ниже, в одном варианте настоящего изобретения заявители выбрали для модифицирования белок HN вируса NDV. Инфекция NDV инициируется слиянием оболочки вириона с плазматической мембраной клетки-хозяина. Для этой цели необходимы как белок F, так и белок HN. Было показано, что белки F и HN физически взаимодействуют, и это взаимодействие необходимо для слияния мембран (Deng et al., 1995). Более того, было показано, что такое взаимодействие является типоспецифичным, т.е. белки F и HN должны происходить от одного и того же вируса для того, чтобы проявить активность по слиянию. Взаимодействующий домен белка HN вирусаNDV был картирован в так называемом стеблевом или стволовом сегменте данного белка, состоящем из первых 92 аминокислотных остатков в составе эктодомена белка HN (Denget al., 1995). Гибридные белки HN, включающие аминокислоты 1-141 NDV и аминокислоты 141572 вируса парагриппа человека 3-го типа(hPIV3), как было показано, сохраняют активность по слиянию в случае коэкспрессии с белком F NDV. Эти данные подтверждают, что жизнеспособными могут быть генетически модифицированные штаммы NDV, которые несут гибридный белок HN, включающий стеблевой участок NDV с последующим глобулярным сегментом (головкой) белка HN отличающегося серотипа парамиксовируса птиц. Более того, такие штаммы будут вызывать ответ в виде антител к HN, который отличается от таковых,специфичных для NDV. Поскольку ответ по нейтрализующим антителам на белок F достаточен для достижения эффективной защиты против исходной вирусной инфекции, то такие 50 генетически модифицированные штаммы NDV объединяют в себе два ключевых свойства маркерной вакцины, а именно защиту от заболевания и серологическую дифференцировку. Были сконструированы гибридные геныHN, составленные слиянием либо аминокислот 1-141 NDV и аминокислот 142-580 парамиксовируса птиц 2-го типа (APMV2) (обозначенаHN1/2143). Аналогичным образом были сконструированы гибридные гены HN, составленные слиянием либо аминокислот 1-141 NDV и аминокислот 143-569HN1/4143). Эти гибридные гены были клонированы в эукариотический экспрессирующий вектор pCIneo и их использовали в экспериментах по котрансфекции наряду с плазмидой, несущей белок F NDV. Для этого белок F модифицировали таким образом, чтобы аминокислотная последовательность сайта расщепления протеазой между F2 и F1 изменялась с последовательности, характерной для LaSota, на ту, которая является консенсусной последовательностью вирулентных штаммов NDV (Fwt: см. раздел Материалы и методы). Эксперименты по котрансфекции клеток CER и клеток QM5 показали, что как HN1/2141 и HN1/2143, так и HN1/4141 и HN1/4143 индуцировали слияние клеток в варианте коэкспрессии с белком Fwt. Полученные данные показали, что комплексы между гибридными белками HN и белком F биологически активны. Гибридные белки HN1/2143 и HN1/4143 использовали для замещения исходного генаHN в составе полноразмерного клона кДНКpNDFL+, получая тем самым плазмиды pNDFLHN1/2143 и pNDFL-HN1/4143. Последние две плазмиды были после этого использованы для получения инфекционных вирусов с использованием описанной выше котрансфекционной системы. Жизнеспособные рекомбинантные вирусы (обозначенные NDFL-HN1/2143 и NDFLHN1/4143) могут быть выделены из аллантоисной жидкости развивающихся яиц, которые были инокулированы надосадочной фракцией трансфицированных монослоев. Присутствие гибридного гена HN в каждом из двух рекомбинантов проверяли с помощью ПЦР с ревертированием. Тесты на подавление гемагглютинации показали, что моноклональные антитела и поливалентные антисыворотки против NDV были неспособны подавлять агглютинацию куриных эритроцитов рекомбинантными вирусами NDFL-HN1/2143 и NDFLHN1/4143. Эти данные показывают, что штаммыNDFL-HN1/2143 и NDFL-HN1/4143 можно использовать в качестве таких вакцин, которые по серологическим признакам отличаются от стандартных вакцин против NDV. 51 Экспрессия гетерологичного белка рекомбинантным NDV. Для анализа того, могут ли чужеродные гены встраиваться в геном NDV, заявители сконструировали рекомбинантный вирус, который несет репортерный ген SEAP. Ген SEAP происходил от плазмиды pOLTV535 и его модифицировали так, чтобы он включал типичные сайты инициации и остановки транскрипции изNDV. ДНК-фрагмент, включающий ген SEAP с последующими транскрипционными стоп- и старт-сайтами, встраивали по XmnI-сайту (109-й нуклеотид) плазмиды pNDFL+[Fwt]. Инфекционный вирус, обозначенный NDFL-AP, был получен с использованием котрансфекционной системы, а присутствие гена SEAP проверяли с помощью ПЦР с ревертированием. Клетки, инфицированные штаммом NDFL-AP, экспрессировали очень высокие уровни белка SEAP. Используя специфическую активность белкаNDFL-AP, приходится на белок SEAP. Эти данные показывают, что гетерологичные гены могут быть экспрессированы рекомбинантнымиNDV на очень высоких уровнях. Образование делеционного мутанта NDV в транс-комплементирующей клеточной линии. С целью исключения экспрессии белка МNDV большую часть гена М делетировали путем расщепления плазмиды pNDFL+[Fwt] рестриктазой BsaAI (3087-й нуклеотид) с последующим частичным расщеплением рестриктазой HindIII (4252-й нуклеотид). После заполнения HindIII-образованных концов с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы полученный фрагмент рециркулизовали с использованием ДНК-лигазы Т 4 и использовали для трансформации клеток Е. coli. Полученную в результате плазмиду, обозначенную pNDFL+[Fwt] dM, использовали для получения вируса с применением котрансфекционной системы в транс-комплементирующих клетках CER-М,которые экспрессируют белок М NDV. Надосадочную фракцию трансфицированных монослоев трижды пассировали через клетки CER-М и анализировали на присутствие вируса. Получение вируса подтверждается тем фактом, что культуральная надосадочная фракция после третьего пересева давала положительные результаты в тестах на гемагглютинацию (НА) и на подавление гемагглютинации (HI). Вирус обозначили NDFL-dM. Когда NDFL-dM использовали для инфицирования монослоев клетокCEF, вирус был способен к распространению по механизму от клетки к клетке, на что указывают данные теста IPMA при использовании моноклонального антитела к белку F. Как ожидалось,экспрессия белка М не может быть выявлена в тесте IPMA при использовании моноклональных антител, специфичных в отношении белка М. Когда надосадочную фракцию использовали 52 для инфицирования либо клеток CEF, либо клеток CER-M, в тесте IPMA не удавалось продемонстрировать присутствие реплицирующегося вируса в этих монослойных культурах. Эти данные указывают на то, что инфекционный вирус не может быть получен в некомплементирующих клетках CEF. Эти результаты были подтверждены обнаружением того, что инокуляция развивающихся яиц надосадочной фракцией от инфицированных клеток CEF не приводит к образованию вирусного потомства при анализе в тестах НА и HI. Необходимость в улучшенных NDVвакцинах и особенно нужда в маркерных вакцинах против NDV побудили заявителей разработать обратно-генетическую систему, которая бы позволила генетически модифицировать NDV. В настоящей заявке описано создание инфекционного NDV полностью из клонированной полноразмерной кДНК. Заявители показали, что вирулентность NDV может быть резко изменена путем модифицирования только трех нуклеотидов, которые определяют специфичность сайта расщепления протеазой белка F. В этом случае сайт расщепления протеазой изменяли из характерного для штамма LaSota на консенсусный сайт расщепления у вирулентных штаммовNDV. Путем создания такого генетически модифицированного штамма NDV заявители получили доказательство того, что расщепляемость белка F является ключевым детерминантом (хотя и не единственным детерминантом) вирулентности NDV. Путем использования того же обратно-генетического подхода сайт расщепления может быть модифицирован по желанию в любую иную аминокислотную последовательность. В результате может быть создана серия штаммов NDV, которая образует диапазон уровней вирулентности.In vivo. Как уже отмечалось выше, было показано,что помимо расщепляемости белков F и HN в патогенности могут играть роль и другие вирусные факторы. Изменения в транскрипции и трансляции могут модулировать рост и распространение по механизму от клетки к клетке вируса и/или цитопатогенность. Доступность инфекционной кДНК NDV позволяет проводить систематическую модификацию последовательностей, которые вовлечены в транскрипцию и репликацию. Это может приводить к созданию новых NDV-вакцин, которые придают оптимальный уровень иммуногенности виртуально несуществующей вирулентности. Безопасность является одним из наиболее важных свойств живых вакцин. Однако для многих живых вакцин, включая NDV, иммуногенность часто отрицательно коррелирует с вирулентностью. Следовательно, дальнейшее ослабление живых вакцин без потерь в иммуногенности является одним из наиболее желательных изменений, для достижения которых может 53 быть применена генетическая модификация. В этой связи стоит отметить, что, как было показано, исключение экспрессии белка V вируса Сендай обусловливало существенно сниженную патогенность in vivo в отношении мышей (Katoet al., 1997). Как и в случае с вирусом Сендай,NDV также образует белок V по механизму,известному как редактирование РНК (Stewardet al., 1993). Можно предсказать, что результатом исключения экспрессии белка V NDV также может быть ослабленный фенотип in vivo. Помимо изменения вирулентности NDV,заявителями показано, что возможной является модификация антигенной системы NDV таким образом, что могут быть образованы штаммы,которые будут отличаться от полевых штаммовNDV по серологическим признакам. Эти так называемые маркерные вакцины являются очень ценным инструментом для оценки встречаемости NDV в промышленных популяциях в мире. Более того, крупномасштабное применение таких маркерных вакцин может, в конечном счете, привести к полному искоренению NDV путем интенсивного скрининга и изъятия зараженных популяций. В настоящей заявке показано, что чужеродные гены могут быть встроены в геном NDV. Эти чужеродные гены можно экспрессировать в инфицированных клетках на очень высоких уровнях. Это показывает, чтоNDV можно использовать в качестве вакцинного вектора для экспрессии антигенов других патогенов (домашних птиц). Некоторые свойства делают NDV идеальным вакцинным вектором для вакцинации против респираторных или кишечных заболеваний. 1) NDV можно легко культивировать до очень высоких титров в развивающихся яйцах. 2) Массовая культура NDV в развивающихся яйцах является относительно дешевой. 3) NDV-вакцины относительно стабильны и могут быть просто введены методами массового применения, такими как добавление в питьевую воду или путем распыления или образования аэрозоля. 4) Естественное заражениеNDV происходит через дыхательный и/или пищеварительный тракт, что также представляет основные естественные пути заражения многими другими патогенами домашних птиц. 5)NDV может индуцировать местный иммунитет,независимо от присутствия циркулирующих материнских антител. Наконец, заявителями показано, что жизнеспособные делеционные мутанты NDV могут быть образованы с использованием транскомплементирующих клеточных линий. Делеционный мутант NDV был образован так, чтобы он не мог экспрессировать матричный белок(М), который участвует в почковании NDV на внутренней поверхности клеточной мембраны. Заявителями показано, что фенотипически комплементированный щтамм NDV, который не способен экспрессировать белок М, тем не менее способен инфицировать клетки и распро 004796 54 страняться по механизму передачи от клетки к клетке. Однако мутантный вирус не способен образовывать инфекционное потомство в некомплементирующих клетках. Эти данные показывают, что фенотипически комплементированные делеционные мутанты NDV могут быть использованы в качестве безопасных самоограничивающих вакцин, которые не могут распространяться в окружающую среду. Такая непередаваемая вакцина объединяет самое важное преимущество живых вакцин, а именно эффективность, и самое важное достоинство убитых вакцин, а именно безопасность. Описание чертежей Фиг. 1 - транскрипционный векторpOLTV5 является производным от транскрипционного вектора, описанного у Pattnaik et al.,1992: см. подробное описание конструкции в тексте. Эта плазмида включает промотор ДНКзависимой РНК-полимеразы Т 7 (показан полужирным шрифтом), за которым находятся уникальные рестрикционные StuI- и SmaI-сайты и автокаталитический рибозим вируса гепатита-D(HDV). ДНК-фрагменты могут быть клонированы между StuI- и SmaI-сайтами и могут быть транскрибированы либо in vitro, либо in vivo с использованием ДНК-полимеразы Т 7. 5'-Конец полученных в результате транскриптов включает два дополнительных остатка G, которые не кодируются данной вставкой. Благодаря активности рибозима 3'-конец транскриптов точно соответствует последнему нуклеотиду данной вставки. Фиг. 2 - структура минигеномных плазмидpOLTV535 (фиг. 2 А) и pOLTV553 (фиг. 2 В). Минигеномные плазмиды основываются на транскрипционной плазмиде pOLTV5 (сравн. с фиг. 1) и включают 3'-участок (нуклеотиды 1119) и 5'-участок (нуклеотиды 14970-15186) генома NDV штамма LaSota, фланкирующие ген,кодирующий секретируемую щелочную фосфатазу (SEAP). Транскрипция pOLTV535 с участием РНК-полимеразы Т 7 приводит к образованию антигеномной РНК (или [+]-РНК), в то время как транскрипция pOLTV553 образует геномную РНК (или [-]-РНК). Отмечены сайты начала (S) и окончания (Е) транскрипции, соответствующие вирусным сигналам инициации и терминации транскрипции. Старт-кодон генаSEAP подчеркнут. Также показаны последовательности вставок (N0-N5) по ClaI-сайту, которые образуют минигеномные плазмиды, каждая из которых отличается в длину на 1 нуклеотидpOLTV553N0-N5). Фиг. 3 - нуклеотидная последовательность генома NDV штамма LaSota и расшифрованная аминокислотная последовательность геновNDV. Показанная последовательность соответствует антигеномной цепи и показана в направлении от 5' к 3' в виде одноцепочечной ДНК. Последовательность, показанная на данной фи 55 гуре, является консенсусной последовательностью, которая была определена путем прямого секвенирования двух независимых наборов перекрывающихся субгеномных кДНК, которые охватывают весь геном вируса NDV. Остающиеся неопределенности (по-видимому, являющиеся результатом ошибок при ПЦР) разрешали путем секвенирования соответствующих участков в третьем независимом наборе клонов. Последовательность полноразмерного кДНК-клона pNDFL+, которая была получена из перекрывающихся субгеномных клонов кДНК(см. фиг. 4), отличается от консенсусной последовательности NDV по следующим положениям(нуклеотиды консенсусной последовательности в скобках): нуклеотид 1755, G (А); нуклеотид 3766, A (G); нуклеотид 5109, G (А); нуклеотид 6999, Т (С); нуклеотид 7056, G (А); нуклеотид 9337, G (А); нуклеотид 9486, А (Т); нуклеотид 10195, Т (С); нуклеотид 13075, A (G). Эти различия обусловливают три аминокислотные замены (аминокислоты консенсусной последовательности в скобках): белок F, R189 (Q); белокHN, S200 (Р); белок L, N369 (I). Фиг. 4. (A) Базовая стратегия, использовавшаяся для получения полноразмерной кДНКNDV на материале перекрывающихся клонов кДНК. кДНК формировали в плазмидеpOLTV535, которая уже включала 3'- и 5'-концыpNDFL+, использовали для получения инфекционного NDV.(B) Подробная процедура клонирования в процессе получения полноразмерной кДНКNDV на материале перекрывающихся субгеномных клонов кДНК. Cm обозначает ген резистентности к хлорамфениколу, который был временно внесен в качестве фенотипической метки (подробности см. в тексте).(C) Подробная процедура клонирования при получении генетически модифицированной полноразмерной кДНК NDV. Модификацией является замена трех нуклеотидов, которые были внесены в последовательность гена F и которые приводят к модификации аминокислотной последовательности в сайте расщепления протеазой белка F (подробности см. в тексте). Фиг. 5. (A) Серия pOLTV535. Транскрипция с участием РНК-полимеразы Т 7 приводит к образованию антигеномной РНК (или [+]-РНК),которая может быть непосредственно транслирована клеткой в белок SEAP. После инфицирования клеток вирусом-помощником (или после котрансфекции плазмид, кодирующих белкиNP, Р и L), антигеномную РНК используют для синтеза геномной РНК (или [-]-РНК) с участием вирусного полимеразного комплекса. Затем геномную РНК используют для синтеза и мРНК (с использованием специфичных стартового [S] и 56 конечного [Е] блоков), и антигеномной РНК с участием вирусного полимеразного комплекса.(B) Серия pOLTV553. Транскрипция с участием РНК-полимеразы Т 7 с получением геномной РНК (или [-]-PHK), которая не может быть транслирована в белок SEAP. После инфицирования клеток вирусом-помощником (или после котрансфекции плазмид, кодирующих белки NP, Р и L) геномную РНК используют для синтеза как мРНК (с использованием специфических стартовых [S] и конечных [Е] блоков),так и антигеномной РНК с участием вирусного полимеразного комплекса. Фиг. 6. Сопоставление последовательностей нуклеиновых кислот 5'-концевых участковNDV штамма LaSota и других парамиксовирусов проведено как сравнение последовательностей NDV и четырех представителей родаRubulavirus, трех представителей рода Paramyxovirus и трех представителей рода Morbillivirus. Последовательности представлены от конечного блока гена L до 5'-конца (кДНК в направлении 3'-5').NDV представляет вирус ньюкаслской болезни; hPIV2 представляет вирус парагриппа человека 2-го типа; MuV представляет вирус свинки; SV5 и SV41 представляют вирусы 5 и 41 обезьян, соответственно; SeV представляет вирус Сендай; bPIV3 И hPIV3 представляют вирусы парагриппа быка и человека, соответственно; CDV представляет вирус собачьей чумы;MeV представляет вирус кори; RPV представляет вирус чумы рогатого скота. Нуклеотидные последовательности полных геномов были получены из следующих источников (депозитарные ): NDV (AF077761); hPIV2 (X57559);