Иммуногенные липосомные композиции
Номер патента: 4797
Опубликовано: 26.08.2004
Авторы: Эрнст Уильям А., Креймер Доналд В., Адлер-Мур Джилл, Перри Л.Джинн, Фудзии Гэрри
Формула / Реферат
1. Иммуногенная одноламеллярная липосомная композиция, включающая пузырек-образующие липиды и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант и гидрофобную область, при этом гидрофобная область имеет площадь поверхности более 500 ангстрем2 и связана с мембраной данной одноламеллярной липосомной композиции, причем иммуногенная композиция вызывает ответ, связанный с клеточным иммунитетом.
2. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, дополнительно включающая один или несколько адъювантов.
3. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является рекомбинантно продуцированной, химически синтезированной или их комбинацией.
4. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что гидрофобная область является пептидом.
5. Иммуногенная липосомная композиция по п.4, отличающаяся тем, что гидрофобная область содержит от 15 до 500 аминокислотных остатков.
6. Иммуногенная липосомная композиция по п.5, отличающаяся тем, что гидрофобная область включает одну или несколько аминокислот, которые выбирают из группы, состоящей из Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val.
7. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что антигенная детерминанта происходит из антигена, который выбирают из группы, состоящей из HSV gB или gD, HIV gp120, CMV gB, HCV E2, INFV HA или NA, H.influenzae P5 или P6, фимбриального протеина и протеина D.
8. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что антигенная конструкция дополнительно включает линкерную область, соединяющую антигенные детерминанты с гидрофобной областью.
9. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что линкерная область является пептидом.
10. Иммуногенная липосомная композиция по п.9, отличающаяся тем, что пептидная линкерная область содержит от 1 до 200 аминокислотных остатков.
11. Иммуногенная липосомная композиция по п.10, отличающаяся тем, что аминокислотные остатки выбирают из группы, состоящей из Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His,Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val.
12. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является гибридным (слитым) белком.
13. Иммуногенная липосомная композиция по п.9, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является гибридным (слитым) белком.
14. Применение иммуногенно эффективного количества композиции по п.1 для индуцирования иммуногенного ответа у животного-хозяина.
15. Применение иммуногенно эффективного количества композиции по п.2 для индуцирования иммуногенного ответа у животного-хозяина.
16. Применение по п.14, отличающееся тем, что животное-хозяин является млекопитающим.
17. Применение по п.16, отличающееся тем, что млекопитающее является человеком.
18. Применение по п.14, отличающееся тем, что животное является птицей.
19. Применение по п.17, отличающееся тем, что антигенную детерминанту выбирают из группы, состоящей из HSV gB или gD, HIV gp120, CMV gB, HCV E2, INFV HA или NA, H.influenzae P5 или P6, фимбриального протеина и протеина D.
20. Вакцинная композиция, включающая эффективное количество композиции по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
21. Вакцинная композиция по п.20, дополнительно включающая один или несколько адъювантов.
22. Кассета ДНК для вставки в экспрессирующий вектор, включающая последовательности, которые кодируют иммуногенный гибридный (слитый) белок, при этом данный белок включает гидрофобную область с площадью поверхности более 500 ангстрем2 и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант.
23. Кассета ДНК по п.22, отличающаяся тем, что антигенная детерминанта происходит от антигена, который выбирают из группы, состоящей из HSV gB или gD, HIV gp120, CMV gB, HCV E2, INFV HA или NA, H.influenzae P5 или P6, фимбриального протеина и протеина D.
24. Кассета ДНК по п.22, отличающаяся тем, что гидрофобная область является пептидом, состоящим из от 15 до 500 аминокислотных остатков.
25. Кассета ДНК по п.24, отличающаяся тем, что пептид включает одну или несколько аминокислот, которые выбирают из группы, состоящей из Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val.
26. Кассета ДНК по п.22, отличающаяся тем, что гибридный (слитый) белок дополнительно включает линкерную область, соединяющую антигенную детерминанту и гидрофобную область.
27. Кассета ДНК по п.26, отличающаяся тем, что линкерная область содержит 1-200 аминокислотных остатков.
28. Кассета ДНК по п.27, отличающаяся тем, что аминокислотные остатки выбирают из группы, состоящей изAla, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val.
29. Вектор, включающий кассету ДНК по п.22.
30. Способ получения иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции, включающий
экспрессию гена, который кодирует гибридный (слитый) белок, включающий гидрофобную область с площадью поверхности более 500 ангстрем2 и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант,
растворение пузырек-образующих липидов и гибридного (слитого) белка в подходящем органическом растворителе,
образование липидной пленки или высушенного распылением порошка при испарении органического растворителя,
гидратирование липидной пленки или порошка и
диспергирование гидратированной липидной пленки или порошка с образованием
иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции.
31. Способ получения иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции, включающий
экспрессию гена, который кодирует гибридный (слитый) белок, включающий гидрофобную область с площадью поверхности более 500 ангстрем2 и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант,
растворение гибридного (слитого) белка в водном буфере,
гидратирование или липидных порошков или липидных пленок с буфером, содержащим гибридный (слитый) белок, и
диспергирование липидных порошков или пленок с образованием иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции.
32. Способ получения иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции, включающий
экспрессию гена, который кодирует гибридный (слитый) белок, включающий гидрофобную область с площадью поверхности более 500 ангстрем2 и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант,
растворение гибридного (слитого) белка в водном буфере и
прибавление гибридного (слитого) белка к предварительно образованным одноламеллярным липосомам с получением иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции.
33. Иммуногенная одноламеллярная композиция, включающая антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант и гидрофобную область с площадью поверхности более 500 ангстрем2, и фармацевтически приемлемый носитель.
34. Иммуногенная композиция по п.33, отличающаяся тем, что антигенная конструкция дополнительно включает линкерную область, соединяющую антигенные детерминанты с гидрофобной областью.
35. Иммуногенная композиция по п.33, дополнительно включающая один или несколько адъювантов.
36. Иммуногенная липидная композиция в виде эмульсии, включающая масло, пузырек-образующие липиды и антигенную конструкцию, содержащую одну или несколько антигенных детерминант и гидрофобную область, которая имеет площадь поверхности более 500 ангстрем2.
37. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что антигенная конструкция представляет собой гибридный (слитый) белок.
38. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что ответ, связанный с клеточным иммунитетом, включает ответ аллергической реакции замедленного типа.
39. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что липиды, содержащие липосому, находятся в жидкой фазе при температуре тела.
40. Иммуногенэря липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что липиды содержат не более 10% холестерина.
41. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что липиды, содержащие липосому, находятся в жидкой фазе при температуре тела.
42. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что липиды содержат не более 10% холестерина.
43. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является рекомбинантно продуцированной, химически синтезированной или их комбинацией.
44. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что гидрофобная область является пептидом.
45. Вакцинная композиция по п.44, отличающаяся тем, что гидрофобная область содержит от 15 до 500 аминокислотных остатков.
46. Вакцинная композиция по п.44, отличающаяся тем, что гидрофобная область включает одну или несколько аминокислот, которые выбирают из группы, состоящей из Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val.
47. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что антигенная детерминанта происходит из антигена, который выбирают из группы, состоящей из HSV gB или gD, HIV gp120, CMV gB, HCV E2, INFV HA или NA, H.influenzae P5 или P6, фимбриального протеина и протеина D.
48. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что антигенная конструкция дополнительно включает пептидную линкерную область, соединяющую антигенные детерминанты с гидрофобной областью.
49. Вакцинная композиция по п.48, отличающаяся тем, что пептидная линкерная область содержит от 1 до 200 аминокислотных остатков.
50. Вакцинная композиция по п.49, отличающаяся тем, что аминокислотные остатки выбирают из группы, состоящей из Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val.
51. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что липиды находятся в жидкой фазе при температуре тела.
52. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что липиды содержат не более 10% холестерина.
53. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является рекомбинантно продуцированной, химически синтезированной или их комбинацией.
54. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что гидрофобная область является пептидом.
55. Композиция по п.54, отличающаяся тем, что гидрофобная область содержит от 15 до 500 аминокислотных остатков.
56. Композиция по п.55, отличающаяся тем, что гидрофобная область включает одну или несколько аминокислот, которые выбирают из группы, состоящей из Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val.
57. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что антигенная детерминанта происходит из антигена, который выбирают из группы, состоящей из HSV gB или gD, HIV gp120, CMV gB, HCV E2, INFV HA или NA, H.influenzae P5 или P6, фимбриального протеина и протеина D.
58. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что антигенная конструкция дополнительно включает пептидную линкерную область, соединяющую антигенные детерминанты с гидрофобной областью.
59. Композиция по п.58, отличающаяся тем, что пептидная линкерная область содержит от 1 до 200 аминокислотных остатков.
60. Композиция по п.59, отличающаяся тем, что аминокислотные остатки выбирают из группы, состоящей из Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, lle, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val.
Текст
1 Применение вакцин исторически обеспечило надежный и эффективный способ защиты всего населения от широкого разнообразия инфекционных болезней. Иммунизация от вирусных и других микробных организмов в целом надежна и эффективна и была причиной значительного увеличения продолжительности жизни людей в развивающихся государствах. Однако может иметь место ряд нежелательных побочных эффектов в зависимости от природы вакцины и специфического иммуногена. Неадекватная инактивация интактного вируса в прошлом привела к неожиданной инфекции вместо защиты после вакцинации (Tigertt, 1959, MilitaryMed. 124:342). Иногда иммунизация интактными организмами, как например, грипп, может ускорить развитие аутоаллергических болезней,направленных против нормальных тканей, как например, синдром Гийена-Барре (Langmuir etal., 1984, J. Epidemiol., 119:841). Кроме того,сами агенты, присутствие веществ внутри клеток или сложной среды могут допустить появление тяжелых аллергических реакций к чужеродным белкам (Yamane, Uemura, 1988, Epidem.Inf. 100:291). Поскольку эффективные процедуры вакцинации часто требуют многократной иммунизации, эти нежелательные моменты могут уменьшить эффективность вакцины и могут снизить общественное признание процедуры вакцинации. Современные молекулярные биологические методики недавно проверены с целью обеспечить повышенную безопасность и эффективность новых препаратов вакцин. Исследуемые в настоящее время потенциальные стратегии включают: вакцины, основанные на методе рекомбинантных ДНК (Conry et al., 1994Cancer. Res. 54: 1164; Hu et al., 1988, J. Virol. 62:176), генерирование простых синтетических пептидов в качестве антигенов (Nardelli et al.,1992, Vaccines 8:1405; Watari et al., 1987, J. Exp.Med. 165:459) и прямое введение генетического материала в ткани для стимулирования защитных реакций (Ulmer et al., 1993, Science 259:1745). В частности, в центре внимания многих исследований находится применение простых пептидных антигенов для индуцирования специфических иммунизационных реакций. Данная стратегия является привлекательной,поскольку она обладает потенциалом для обеспечения иммунологической специфичности,более тесного контроля производственных процессов и исключения большинства второстепенных источников материалов или контаминантов, связанных с продуцированием иммуногена. Однако применение очищенных белков или пептидных фрагментов пептидов для вакцинации зависит от доставки материала к месту иммунизации с помощью эффективного антигенного носителя. Возможно, одними из самых надежных носителей были липид/липосомные вакцинные комплексы. Липосомы давно при 004797 2 знаны в качестве коммерчески жизнеспособной технологии, поскольку они могут уменьшать токсичность лекарственных препаратов, пролонгировать циркуляцию в токе крови и изменять биораспределение и фармакокинетику молекул лекарственных препаратов (Fujii, 1996;Rosoff, Marcel Dekker, New York NY, p. 649). Способность липосом направлять характер антигенного распределения наводит на мысль, что липосомный иммуноген будет максимально подвергаться действию иммунной системы. До сих пор исследованы несколько систем на основе липидов, включая пептиды конъюгированные с липидами (Nardelli et al., 1992, Vaccines 8:1405; Watari et al., 1987, J. Exp. Med. 165:459),перестроение всех белковых субъединиц в присутствии липидов (Morein, Simons, 1985, Vaccines 4: 166; Gregoriadis, 1995, Tibtech 13: 527) и связывание (ассоциация) белков с предварительно образованными липосомами (Therien,Shahum, 1989, Immunol. Lett. 22:253; Alving etal., 1985, Vaccines 4:166). Хотя показано, что данные стратегии иммунологически активны,технические трудности, связанные с крупномасштабным продуцированием белков и их липидных носителей, а также ограничения в стоимости, делают их менее привлекательными в качестве коммерческой технологии. Таким образом, требуется улучшенная система или подход для получения белковых антигенов с тем,чтобы воспользоваться потенциалом предлагаемого липосомами в разработке вакцин. Сущность изобретения Данное изобретение относится к иммуногенной липосомной композиции, включающей пузырек-образующие липиды и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант и гидрофобную область. Предпочтительно, если гидрофобная область связана с мембраной липосомной композиции. Предпочтительно, если гидрофобная область является пептидом и согласно предпочтительному варианту содержит от 15 до 500 аминокислотных остатков, еще предпочтительнее менее 300 и наиболее предпочтительно - менее 50 остатков, где по крайней мере одну или несколько аминокислот выбирают из группы, состоящей из Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu,Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Туr и Val. Согласно одному варианту данного изобретения иммуногенная липосомная композиция дополнительно включает один или несколько адъювантов. Примеры подходящих адъювантов включают липофильные молекулы, как например, липид А и другие липополисахариды,Quil A, QS21, MF59, P3CSS, MTP-PE, а также 3 водорастворимые молекулы, включающие цитокины, как, например, IL-2, IL-4, IL-12, интерфероны и тому подобные. Другие примеры цитокинов приведены ниже в табл.1. Согласно другому варианту изобретения антигенная конструкция дополнительно включает линкерную область, соединяющую антигенную(ые) детерминанту(ы) с гидрофобной областью. В предпочтительном варианте линкерная область является пептидом, содержащим от 1 до 200 аминокислотных остатков. Аминокислотными остатками предпочтительно являются встречающиеся в природе аминокислоты,как, например, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln,Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr,Trp, Туr и/или Val. Кроме того, данное изобретение относится к способу индуцирования иммуногенной реакции в животном-хозяине, включающему введение иммунологически эффективного количества липосомной композиции, описанной выше. Хотя хозяин может быть любым животным, включая домашнюю птицу, предпочтительно, если животное-хозяин является млекопитающим и более предпочтительно - человеком. В некоторых предпочтительных вариантах иммуногенная липосомная композиция дополнительно включает один или несколько пригодных адъювантов. Данное изобретение, кроме того, предлагает кассету ДНК для вставки в вектор, включающую последовательности, которые кодируют иммуногенный гибридный белок, где гибридный белок включает гидрофобную белковую область и одну или несколько антигенных детерминант. Данное изобретение также предлагает способ получения иммуногенной липосомной композиции, включающий: экспрессию гена, который кодирует гибридный белок, включающий антигенную детерминанту и гидрофобную область; растворение липидов и гибридного белка в соответствующем органическом растворителе или смеси органических растворителей; образование липидной пленки испарением органического растворителя; гидратирование липидной пленки; диспергирование гидратной липидной пленки с образованием иммуногенной липосомной композиции. Данное изобретение, кроме того, предлагает способ получения иммуногенной липосомной композиции, включающий: экспрессию гена,который кодирует гибридный белок, включающий антигенную детерминанту и гидрофобную область; растворение гибридного белка в водном буфере; гидратирование или липидных порошков, или липидных пленок с буфером, содержащим гибридный белок; диспергирование липидных порошков или пленок с образованием иммуногенной липосомной композиции. В другом варианте данное изобретение предлагает способ получения иммуногенной 4 липосомной композиции, включающий: экспрессию гена, который кодирует гибридный белок, включающий антигенную детерминанту и гидрофобную область; растворение гибридного белка в водном буфере и прибавление гибридного белка к предварительно образованным липосомам с получением иммуногенной липосомной композиции. В другом варианте данное изобретение предлагает способ получения иммуногенной липидной композиции в виде эмульсии, включающий: экспрессию гена, который кодирует гибридный белок, включающий антигенную детерминанту и гидрофобную область; получение иммуногенной липидной композиции в виде эмульсии любыми способами, описанными выше, с применением липидного диспергирования(например, масла, такого как соевое масло) вместо липосом. Еще в другом варианте данное изобретение предлагает способ получения иммуногенной липосомной или липидной композиции в виде эмульсии, включающий: химически синтезированный гибридный белок, включающий антигенную детерминанту и гидрофобную область, и получение иммуногенной липосомной или липидной композиции в виде эмульсии любыми способами, описанными выше. В данном изобретении связанный (ассоциированный) с мембраной означает, что гидрофобная область, по крайней мере, частично внедряется (вставляется) в липосомную мембрану и предпочтительно не связывается ковалентно с пузырек-образующими липидами. Гидрофобная область может также связываться с жирной кислотой липида хвостом, который сам внедряется (вставляется) в мембрану. Краткое описание чертежей На фиг. 1 иллюстрируется эффективность липосомной композиции, описанной в данном изобретении, в защите от HSV2. На фиг. 2 изображено сравнение эффективности липосомной композиции, описанной в данном изобретении, с другими композициями вакцины. На фиг. 3 изображена кривая выживания мышей, демонстрирующая способность липосомной HSV2g (l-23)-HD, для установления защитной иммунной реакции. Подробное описание изобретения Данное изобретение предлагает способ доставки антигена, предназначенный для улучшения эффективности и надежности иммунизации от целого ряда микробных агентов и злокачественных опухолей. Иммуноген может кодироваться кассетой гена, которая состоит из гидрофобной области (HD), слитой с последовательностью специфического антигена. Плазмиду, содержащую последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие HD и антигенный эпитоп, получают и экспрессируют в соответствующий хозяин, например, Е. coli, P. pastoris, 5 клетки насекомых COS-1 клетки или СНО клетки (Genetic Engineering News, 18:17 (1998. Если белки экспрессированы и очищены, они используются в липосомной композиции. В присутствии мембраны белок связывается с двойным слоем липида с образованием стабильной структуры с гидрофобной частью, связанной с мембраной, и антигенным эпитопом, ориентированным к водной среде. Плазмида может создаваться рестрикционными сайтами на основных участках с тем, чтобы различные антигенные эпитопы могли бы легко замещаться, таким образом, обеспечивая способность утилизировать различные антигенные эпитопы для обеспечения максимальной защиты после иммунизации. Одно из уникальных свойств этой кассеты заключается в том, что белковый компонент может продуцироваться в клетках хозяина в больших количествах, легко очищаться и далее внедряться в липосомы. Это обеспечивает максимальную гибкость для определения наиболее подходящего эпитопа, который вызывает защиту от микробных агентов или от злокачественных опухолей, при сохранении конечной цели крупномасштабного приготовления и коммерческого распространения вакцины. Таким образом, данное изобретение обладает несколькими преимуществами: 1) эпитопы могут легко изменяться, обеспечивая максимальную гибкость в дизайне вакцины; 2) многочисленные эпитопы могут вставляться в молекулу носителя; 3) последовательности больших антигенов(т.е. протеины оболочек или рецепторные области) или субъединицы могут включаться, если требуется; 4) экспрессированный белок-носитель является водорастворимым и может легко очищаться с использованием стандартных методов приготовления белков. Синтез антигенной конструкции в виде водорастворимого гибридного продукта сводит к минимуму возможные проблемы крупномасштабного продуцирования, вызванные гидрофобной областью белка. Таким образом, конструкция белка, обладающая гидрофобной областью для инсерции липосомной мембраны и к тому же еще водорастворимая, будет являться основным преимуществом. При некоторых обстоятельствах, незначительные количества солюбилизирующего агента, как например, гуанидина, мочевины, додецилсульфата натрия, октилгликозида или деоксихолата, могут использоваться во время способа очистки. Данное изобретение также предлагает конструкции, включающие два или несколько антигенов. Такие конструкции можно представить в виде: Н 2N-сайт I антигена-HD- сайт II антигена-СООН Изобретение также предполагает использование встречающихся в природе или синтетических отдельных трансмембранных спиралей 6 или спиральных пучков (2-12). Сайты антигенов могут располагаться на N- или С-конце или между петлями, образованными между индивидуальными цепями пучков. Термин антиген, применяемый в данном изобретении, относится к любой субстанции(включая белок или белок-полисахарид, липополисахарид, микробную субъединицу, целый патоген или маркеры злокачественной опухоли),которая, если чужеродна к животному-хозяину и при достижении доступа к ткани такого животного стимулирует макрофаги, антиген присутствующих клеток и образование антигенспецифических антител и реагирует специфично invivo или in vitro с такими антителами. Кроме того, антиген стимулирует пролиферацию и/или активацию Т-лимфоцитов рецепторами антигена и перекрестно реагирующими антигенамиkiller, NK), клетки с цитотоксической Тфункцией и Т-клетки-хелперы) и могут реагировать с лимфоцитами для инициирования серии реакций (ответов), названных клеточным иммунитетом. В иммуногенных композициях,описанных в данном изобретении, предпочтительно, чтобы присутствующий антиген находился в количестве 0,1-20 мг/мл антигена-HD. Более предпочтительно, если антиген присутствует в количестве 0,5-5 мг/мл антигена-HD. Антигенная детерминанта представляет ту часть антигена или антигенной конструкции,которая определяет его иммунологическую специфичность. Обычно антигенная детерминанта или гаптен представляет собой пептид, белок или полисахарид, существующие в природных антигенах. В искусственных антигенах это могут быть низкомолекулярные вещества, как например, производное арсаниловой кислоты. Антигенная детерминанта будет специфично реагировать in vivo или in vitro с антителом или Тлимфоцитами, индуцируемыми антигенной формой антигенной детерминанты (например,антигенная детерминанта, присоединенная к иммуногенному веществу). Антигенные детерминанты, описанные в данном изобретении, которые могут использоваться на практике, только в качестве примеров и могут быть получены из антигенов, представленных ниже: Дополнительные примеры антигенов и патогенов, которые могут применяться, можно найти в работах Milich, 1989 (Adv. Immunol. 45:195); Hoshino, Kaplan, 1994 (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 185:179) или Venugopal. Gould,1994 (Vaccine 12:966). Согласно одному варианту применяют gp120 субъединицу env гена и р 27gag гена из вируса иммунодефицита человека(human immunodeficiency virus, HIV). В другом варианте антигенную детерминанту можно получить из антигена, который выбирают из HSV 9 Как используют в данном изобретении,термин гидрофобная область (HD) означает любой белок, пептид, липид или молекулу с гидрофобной областью или структурой с площадью поверхности, большей 500 2. Примеры потенциальных HDs включают любой сегмент трансмембраны (transmembrane, TM) (например,гликофорин A; Tomita, Marchesi, 1975, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 72:2964), гидрофобную область цитохрома b5 (Taylor, Roseman, 1995, BBA 1278:35), T области токсина дифтерии (Choe etA Pseudomonas (Allured et al., 1986, PNAS 83:1320), 4-спиральный пучок пенициллинсенсорной клеткой - трансдуктора (Hardt et al.,1997, Mol. Microbiol., 23:935), 7-спиральный пучок бактериородопсина (Henderson, Unwin,1975, Nature 257:28), 12-спирального пучка lac пермеазы (Kaback et al., 1997, Curr. Op. Struct.Biol. 7:537) и поруобразующую область колицина (Parker et al., 1989, Nature 357:93). Термин вектор относится к нуклеиновой кислоте (например, ДНК), полученной из плазмиды, космиды, фагмиды или бактериофага или полученной синтетически, в которой фрагменты нуклеиновой кислоты могут вставляться и клонироваться. Для этих целей вектор может содержать один или несколько уникальных сайтов рестрикции и может быть способен автономно реплицироваться в определенном хозяине или организме так, чтобы репродуцировалась клонируемая последовательность. Молекула вектора может наделяться некоторым вполне определенным фенотипом на организме хозяина, который является выбираемым или легко детектируемым. Некоторые компоненты вектора могут быть молекулой ДНК, включающей регуляторные элементы для транскрипции, трансляции,стабильности и репликации РНК и других последовательностей ДНК. Термин кассета ДНК относится к генетическим последовательностям внутри (в пределах) вектора, которые могут экпрессировать гибридный (слитый) белок, описанный в данном изобретении. Кассета нуклеиновой кислоты позиционно и последовательно ориентирована внутри вектора так, что нуклеиновая кислота в кассете может считываться в РНК и когда необходимо, транслироваться в продукт гибридного(слитого) белка. Предпочтительно, если кассета имеет 3' и 5' концы, приспособленные для быстрой (легкой) вставки в вектор, например, она имеет сайты рестрикционной эндонуклеазы на каждом конце. Хотя предпочтительно, когда антигенные конструкции продуцируют с применением методов генной инженерии, понятно, что конструкции могут синтезироваться любыми известными способами, такими как, например, химические способы. Это может быть особенно полезным там, где должны использоваться пептидные линкеры или где гидрофобная область 10 включает остатки не встречающихся в природе аминокислот или им подобные. Таким образом,хотя предпочтительный вариант использует рекомбинантные способы (способы генной инженерии) для продуцирования антигенного гибридного белка, данное изобретение также предлагает способ, включающий: получение антигенных конструкций с помощью химических синтетических способов или с помощью рекомбинантных и химических способов и получение иммуногенной жидкой композиции, как описано выше. Кроме предпочтительного пептидного линкера могут применяться и другие известные линкеры для присоединения антигена к гидрофобной области. Примеры таких линкеров включают, но не ограничиваются, полиэтиленгликолем, полисахаридами, полисиаловыми кислотами, янтарной кислотой, бутандионовой кислотой, адипиновой кислотой и стандартными поперечно-сшивающими агентами, как например, SMPT (4-сукцинимидилоксикарбонил-метил(2-пиридилдитио)толуолом), DSP (дитиобиссукцинимидилпропионатом), EGS (этиленгликоль бис (сукцинимидилсукцинатом),SMCCChemical Co., Rockford, IL). Согласно данному изобретению липосомы играют важную роль в доставке антигена, поскольку антигенлипосомный комплекс непосредственно присутствует в иммунной системе после удаления из циркуляции (кровообращения) клетками иммунной системы. Кроме того,выбор иммуностимуляторных путей может изменяться при изменении липидной композиции липосомы. Например, различные иммуностимуляторные молекулы, такие как Липид A (Asano,Kleinerman, 1993, J. Immunother. 14:286), P3CSS(Lex et al,. 1986, J. Immunol. 137:2676), мурамилдипептид и трипептид-РЕ (Fidler et al., 1981,PNAS 78:1680; Alving et al., 1985, Vaccines 4:166) и катионные липиды (Walker et al., 1992,PNAS 89:7915) могут включаться в липосому для стимулирования различных иммунологических путей. Другие адъюванты, такие как, например, MF59, Quil A, Q521 или квасцы могут использоваться в сочетании с антигенлипосомным комплексом. Кроме того, иммунорегуляторные молекулы, такие как цитокины,могут добавляться для того, чтобы добиться иммунной реакции (ответа). Липосомы, практически применяемые в данном изобретении, можно получить из широкого разнообразия пузырек-образующих липидов, включая фосфатидиловые эфиры (простые и сложные), такие как фосфатидилэтаноламин(phosphatidylethanolamine, РЕ), фосфатидилсерин (phosphatidylserine, PS), фосфатидилглице 11 рин (phosphatidylglycerol, PG) и фосфатидилхолин (phosphatidylcholine, PC); глицериды, такие как диолеоилглицеросукцинат; цереброзиды; ганглиозиды; сфингомиелин; стероиды, такие как холестерин; и другие липиды, а также другие наполнители, такие как пальмитат витамина Е или витамина С (см. также U.S. Pat. Nos. 4235871; 4762720; 4737323; 4789633; 4861597; и 4873089). Примеры РС-липидов включают, но не ограничиваются, (С-18)дистеароилфосфатидилхолином(dioleylphosphatidylcholine, DOPC). Предпочтительно, если липиды находятся в жидкой фазе при температуре тела (приблизительно 3839 С). Поэтому липиды с Тпл, выше температуры тела, такие как DSPC и DPPC менее предпочтительны (но, тем не менее, могут еще быть пригодными). Липиды с Тпл ниже температуры тела, такие как DMPC или DOPC более предпочтительны. Кроме того, предпочтительно,если липидная композиция содержит не более 10% холестерина. Особенно предпочтительные жидкие композиции включают около 0-10% холестерина, около 0-15% PG и около 0-100%PC. В некоторых предпочтительных вариантах композиция может дополнительно включать около 1-10% адъюванта(ов); предпочтительно,если адъювант присутствует в количестве менее 5%. Приготовление липосом хорошо известно. Обычно липосомы получают с помощью ряда различных способов, включая инъекцию этанола (Batzri et al., 1973, Biochem. Biophys. Acta 298:1015); вливание эфира (Deamer et al., 1976,Biochem. Biophys. Acta 443:629; Schieren et al.,1978, Biochem. Biophys. Acta 542:137); удаление детергента (Razin, 1972, Biochem. Biophys. Acta 265:291); упаривание растворителя (Matsumatoet al., 1977, J. Colloid Interface Sci. 62:149); упаривание органических растворителей из эмульсий, содержащих хлороформ и воду (REV's)al., 1979, Biochem. Biophys. Acta, 557:9); замораживание и размораживание смесей фосфолипидов (Pick, 1981, Archives of Biochem. and Biophysics, 212:186), а также разрушение ультразвуком и гомогенизацию. Липосомы принято распределять по размерам, и для обозначения типа обсуждаемой липосомы используют 3-х буквенный акроним. Мультиламеллярные пузырьки обычно обозначают как "MLV" (multilamellar vesicle). Мелколамеллярные пузырьки обозначают как "SUV"(small unilamellar vesicle) и крупноламеллярные пузырьки обозначают как "LUV" (large uni 004797lamellar vesicle). Эти обозначения иногда следуют за химическим составом липосомы. По обсуждению номенклатуры и краткому описанию известных типов липосом см. Storm et al.,1998, PSIT, 1:19-31. Данное изобретение предполагает применение липосомных композиций с соответствующим адъювантом. Однако данное изобретение также предполагает использование антигенной конструкции, которая не связана с липосомой, вместе с соответствующим адъювантом. Таким образом, вакцина или иммуногенная композиция содержит два компонента: антиген,соединенный с гидрофобной областью, и соответствующую адъювантную систему. Примеры потенциальных фармацевтически приемлемых систем носителей, которые могут использоваться, включают, но не ограничиваются липосомами, эмульсиями, адъювантом Фрейнда (полным или неполным), квасцами, ISCOMS и оболочечными вирусами (enveloped viruses). Способы, описанные в изобретении, предусматривают применять иммунологически эффективное количество липосомной композиции,т.е. количество композиции должно быть таково, чтобы вместе с любыми добавленными наполнителями или носителями она приводила бы к заметному иммунологическому ответу (реакции) в хозяине. Если композиция будет использоваться в качестве вакцинной композиции, эффективное количество будет количеством, которое вместе с любыми добавленными наполнителями или носителями будет заставлять хозяина продуцировать специфический и достаточный иммунологический ответ (реакцию) с тем, чтобы защитить хозяина от последующего воздействия микроорганизма (профилактическая вакцинация) или защитить уже заболевшего хозяина (терапевтическая вакцинация). Итак, в общем виде описанное изобретение будет лучше понято после детального описания примеров, которые приводятся в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретения, если это не указано особо. Примеры Пример I - HSV2. Получение HSV2gD(123)-TM.gD протеина HSV2 соединяли с сегментом трансмембраны (ТМ) химическим синтезом на автоматическом синтезаторе пептидов. Синтезированный пептид расщепляли стандартными методами расщепления с помощью HF и очищали препаративной HPLC, используя Waters C18 колонку и 100% ацетонитрил с 0,1% TFA в качестве подвижной фазе. С помощью массспектрометрии и капиллярного электрофореза показано, что чистота пептида составила по крайней мере 95%. Получение липосомы. Липосомы получали разрушением ультразвуком пробы (зонда) по ранее описанным методикам (Fujii et al., 1997, 13Biochemistry 36:4959). Вкратце, липиды (с белком или без него) растворяют в органическом растворителе, например, хлороформе/метаноле. Тонкие липидные пленки создают при отборе пипеткой аликвот липидных растворов в круглодонные стеклянные трубки и упариванием растворителя при 65 С в токе азота. Пленки помещают в вакуум по крайней мере на 8 ч для удаления остаточного органического растворителя. Получение липосом достигается гидратированием липидных пленок буфером и инкубированием суспензии при 65 С в течени 5-10 мин перед разрушением пробы (зонда) ультразвуком. Далее для получения стерильного препарата липосомы фильтруют через 0,22 мкм фильтр. Липосомы разделяют по размерам с помощью динамического рассеяния света и образование агрегатов продолжается по крайней мере четыре недели. Особенно предпочтительная липосомнаяHSV2gD(l-23)-TM композиция имеет молярное соотношение 15:2:3 DMPC:Chol:DMPG (димиристоилфосфатидилхолин : холестерин : димиристоилфосфатидилглицерин) с 2,5% (вес.) липида А. Методики вакцинации и проверка индукции иммунного отклика (реакции) к вирусному антигену. BALB/c или C57BL/6 самкам мышей(6-8-недельным) подкожно вводят один раз в неделю, в 2 течение 2-х, 3-х и 4-х недель препарат проверяемой вакцины или буфер. Места инъекции контролируют на побочные реакции,такие как развитие гранулем и/или образование струпа. Если животных подвергают иммунизации вакциной интраназально, им дают наркоз галотаном и композицию (10-20 мкл) вводят в ноздри при вдыхании с применением стерильного наконечника на микропипетторе (Gallichanet al., 1993, J. Inf. Dis. 168:622). Через постоянные промежутки времени во время процедуры вакцинации и после контрольного вирусного заражения измеряют иммунный отклик (реакцию) мышей к вирусному антигену. Тест вирусной нейтрализации антитела проводят с использованием 24-луночного планшета, содержащего 1x105 BHK клеток, к которым добавлены в различных разбавлениях мышиная сыворотка, смешанная с вирусом. После 48-72 ч инкубации при 37 С в СО 2 инкубаторе проверяют цитотоксичность клеточных монослоев и анализируют (определяют) титр нейтрализирующих антител. Осаждение антител на вирусе измеряют инкубацией в различных разбавлениях сыворотки с 5-10 мкг вирусного антигена или 25-50 мкл HSV2 штамма(биомассы) (1x105 PFU). Липосомы, содержащие антигенную детерминанту, также используют в качестве мишеней для проверки антител/ELISA, как описано ранее (Tuso et al., 1993,Transplantation 55:1375). Результаты последней проверки будут использоваться для измерения 14 уровня свызывания и конфигураций изотипа антител. Реакцию гиперчувствительности замедленного типа к вирусному антигену у вакцинированных мышей проверяют с помощью теста на припухлость стопы. Вакцинированным животным дают наркоз галотана и вводят 50 мкл инактивированных ультрафиолетом HSV2 в одну заднюю стопу и 50 мкл лизированных незараженных клеток в другую заднюю стопу. Через 24, 48 и 72 ч измеряют степень припухлости стопы мышей с помощью штанген-циркуляVernier и сравнивают с измерениями фона. Активность Т-клеток данных животных также измеряют продуцированием цитокинов в ответ на инкубацию Т-клеток селезенки с вирусным антигеном. Селезенки удаляют из вакцинированных животных и гомогенаты селезенки получают осторожным разрушением селезенок стерильным пружинным штифтом и проталкиванием клеток через нейлоновое сито. Клеточные суспензии промывают и помещают на планшет при 1x106 клеток/лунке в 96-луночном титрационном микропланшете. После инкубации клеток при 37 С в течение 3-4 дней с различными количествами вирусного антигена собирают супернатанты из лунок и проверяют на присутствие цитокинов. Для определения профиля цитокина (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-, актин и TNF- из PharMingen, Inc. (San Diego,CA используют коммерчески доступныеELISA наборы цитокина. Определение белка цитокина в тканях культуры супернатантов с помощью сэндвич-ELISA проводят моноклональными антителами (mAb) специфичными для отдельных цитокинов. Вкратце, ELISA планшеты сенсибилизируют в течение ночиmAb крыс против цитокина мышей. Планшеты блокируют 3% сывороткой эмбрионального теленка в PBS в течение 2 ч, далее аликвоты каждого проверяемого образца прибавляют к каждой лунке. Цитокинспецифические биотинилированные mAb крыс против мышей прибавляют к каждой лунке, за которым следует авидинпероксидаза. Цветную реакцию достигают добавлением колориметрических субстратов. Планшеты прочитывают в ELISA спектрофотометре и вычисляют концентрации цитокина с помощью стандартной кривой, полученной из контрольных рекомбинантных цитокинов. Модель энцефалита HSV2 мышей для проверки липосомных преператов вакцины. Вакцинированных и невакцинированных (контрольных) BALB/c самок мышей (10-12 недельных) контрольно внутриперитонеально заражают летальной дозой (1x105 PFU) пассированныхHSV2 головного мозга. Данные мыши контрольно зараженные интравагинально летальной дозой HSV2 вначале предварительно обрабатывают подкожным эстрогеном одну неделю до контрольного заражения и день (-1) до кон 15 трольного заражения. Им далее дают наркоз внутриперитонеальным введением ацепромазина и кетамина. HSV2 (10-30 мкл) затем вводят интравагинально с использованием стерильного наконечника на микропипетторе после первого влагалищного мазка сухим Calgiswab (McDermott et al., 1984, J. Virol. 51:747). Животных контролируют в течение 80 дней после контрольного заражения на выживание (ежедневно), потерю веса (через день в течение первых двух недель и далее раз в неделю), появление налета на языке и нейрологических симптомов (уменьшенный уровень активности, задержка движения или паралич конечностей). Пролиферация антиген-индуцированных Т-клеток. Сенсибилизацию клеток хозяина к gB антигену измеряют с помощью анализа с использованием пролиферации антиген-индуцированных Т-клеток. Гомогенаты селезенки получают осторожным разрушением селезенок стерильным пружинным штифтом и проталкиванием клеток через нейлоновое сито. Клетки суспендируют в RPMI 1640 среде, содержащей 10% сыворотку эмбрионального теленка (fetalcalf serum, FCS), 10 mM Hepes буфер, Lглутамин (2 mM), пенициллин (25 IU/мл) и стрептомицин (25 мкг/мл). Клетки культивируют при концентрации 1 х 106 клеток/мл без или сgD (5-20 мкг/мл) в 96-луночных планшетах с Uобразными лунками в течение 4 дней в 5% СО 2. Культуры подвергают действию импульсов с 20 мкл ресазуринового красителя в течение 3 ч и далее измеряют флуоресценцию на Cytofluor II(Perspective Biosystems, Inc., Farmington, MA). Цитокин-специфический мРНК анализ. Тклетки иммунизированных и неиммунизированных животных исследуют на цитокинспецифические мРНК уровни основных цитокинов, которые могут осуществлять рефлекторную реакцию сенсибилизации, связанную с иммунизацией, включающую IL-2, INF-, IL-4, IL-5, IL6, IL-10. Т-клетки получают из селезенки, как описано ранее. Полную РНК выделяют с помощью модификации (Cosenza et al., 1995, LiverChomczynsky и Sacchi (Chomczynsky et al., 1987,Analyt. Biochem. 162:156). Свежие или замороженные клетки (2x106) разрушают в 1 мл денатурированного раствора (4 mM тиоцианата гуанидина, 25 mM цитрата натрия (рН 7,0), 0,5% саркозила и 0,1 mM 2-меркаптоэтанола). РНК осаждают инкубацией с одним объемом изопропилового спирта в течение ночи при -20 С. Концентрацию полной РНК доводят до 260 нМ и образцы хранят при -80 С до тех пор, пока их анализируют. Анализ цитокина проводят, используя модификацию метода, описанного Cosenza et al.(Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16). Одноцепочечную кДНК получают транскрипцией 2 мкг полной РНК в 20 мкл полной реакционной смеси, используя птичий вирус миело 004797 16 идного лейкоза обратной транскриптазы (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Последовательность специфических олигонуклеотидных праймеров цитокинов мышей (табл. 1) используют для амплификации ДНК-фрагментов заранее определенного размера для каждого из представляющих интерес генов цитокина.PCR 10 х буфер, 1 мкл каждого из 5' и 3' праймеров, 2,5 мкл 10xdNTPs (2 ммоль/л) и 0,125 мкл Т. aquaticus термостабильной ДНК-полимеразы(Boehringer Mannheim) в конечно объеме - 25 мкл. Специфические -актиновые праймеры используют для амплификации 548 bр фрагмента в качестве внутреннего контроля. PCR смесь покрывают минеральным маслом и амплификацию проводят после инкубации смеси в течение 7 мин при 94 С, 38 циклов с денатурацией при 94 С в течение 30 с, ренатурацию праймера при 60 С в течение 45 с, удлинение при 72 С в течение 60 с и инкубация при 72 С в течение 7 мин.PCR продукты разделяют на агарозном геле в присутствии этидиний бромида. Полосы делают видимыми в УФ-свете, фотографируют и количественно определяют денситометрическим методом по фотографии, используя программный пакет Molecular Analyst (Bio-Rad, RichmondCA). Измерение цитокина с помощью ELISA. Коммерчески доступные ELISA наборы цитокина используют для определения профиля цитокина, секретируемого CD4+ T-клетками селезенки, выделенными из иммунизированных и неиммунизированных животных. Определение белка цитокина в супернатантах тканевой культуры из Т-клеток селезенки помощью сэндвичELISA проводят, применяя моноклональные антитела (mAb), специфичные для определенных цитокинов. Вкратце, ELISA платшеты покрывают в течение ночи mAb крыс против цитокина мыши. Планшеты блокируют 3% FCS вPBS в течение 2 ч, далее аликвоты каждого образца прибавляют в каждую лунку. Цитокинспецифические биотинилированные mAb крыс против мыши прибавляют к каждой лунке, за которым следует авидинпероксидаза. Цветную реакцию достигают прибавлением колориметрических субстратов. Планшеты прочитывают вELISA спектрофотометре и вычисляют концентрацию цитокина из стандартной кривой, полученной из контрольных рекомбинантных цитокинов.Aнти-HSV2 CTL отклики. После вакцинации определяют присутствие антигенспецифических цитотоксических Т лимфоцитов (CTL) в Т-клетках селезенки. Лимфоциты селезенки получают, как описано ранее. Лимфоциты из каждой обработанной группы, собирают (n=5) и далее культивируют в течение 3 дней без антигена при 107 клеток/лунке в 12-луночных культуральных планшетах. EL-4 (Н 2b) клеткимишени (АТСС) инкубируют с пептидом, относящимся к HSV2 gB CTL эпитопу, расположенному между остатками 495-505 (Hanke et al.,1991, J. Virol. 65:1177) H2b рестриктированных клеток и инкубируют в течение 4 ч при 37 С. Мишени промывают и к каждой лунке прибавляют 100 мкл титров, содержащих 1x104 клеток. Эффекторные лимфоциты промывают, прибавляют к лункам при различных концентрациях и культивируют в течение 4 ч при 37 С. Используя набор CytoTox 96 (Promega, Madison WI),процент специфического лизиса вычисляют из супернатантной лактатдегидрогеназы (lactatedehydrogenase, LDH), измеренной в стандартном спектрофотометре для прочтения ELISA планшетов (HTS 7000 +BioAssay Reader, PerkinElmer, San Jose, CA), регистрируя абсорбцию при 490 нм. Определение НSV2-антигенспецифического лизиса производят по стандартным критериям. Данные выражают в виде процента специфического лизиса = 100 х [(экпериментальное - эффектор спонтанный - мишень спонтанная) /мишень максимальная - мишень спонтанная)]. Результаты Кривая выживания, представленная на фиг. 1, демонстрирует эффективность липосомного пептида в защите мышей от систематического заражения летальной дозой HSV2, а также установления количества инокуляций (вакцинаций, прививок), необходимых для достижения 100% защиты. Фиг. 1 показывает количество доз липосомной HSV2gD(l-23)-TM вакцины, требуемых для защиты BALB/c мышей от летального заражения HSV2. Группам из 7 мышей давали 2, 3 или 4 иммунизации до заражения летальной дозой HSV2. Четырьмя вакцинациями животные, иммунизированные липосомной вакциной, не проявляли нейрологических осложнений, связанных с заражением HSV2, никаких других симптомов инфекции не обнаруживалось на протяжении исследования. Наиболее существенно, что все мыши выживали при летальном заражении HSV2. Двумя или тремя еженедельными иммунизациями защищали менее 100% мышей. Наоборот, мыши, получившие четыре вакцинации плацебо (т.е. буфера) не защищались от заражения HSV2. 18 Липосомную HSV2gD(l-23)-TM также проверяли на трех группах C57BL/6 мышей и было найдено, что добиваются аналогичных защитных эффектов, сравнимых с результатами,полученными с BALB/c мышами. В табл. 2 суммировали данные результаты. Группу 1 мышей вакцинировали на 1-ой и 4-ой неделях подкожно; группу 2 мышей вакцинировали на 1 неделе подкожно и на 4 неделе интраректально; и группу 3 мышей (контрольная группа) оставили без вакцинаций. Через неделю после последней вакцинации (на 4 недели), мышей заражали внутриперитонеально летальной дозой HSV2 и контролировали в течение трех недель заболеваемость и смертность. Что касается BALB/c мышей, группы мышей, получающие вакцинации липосомной HSV2gD(l-23)-TM имели значительные количества оставшихся в живых,если их вакцинировали или подкожным введением, или если вводили дозу подкожной сенсибилизации, за которой следуют бустеринъекции в слизистую оболочку.HSV2gD(l-23)-TM с другими методами представления антигена. Каждой группе из 7 мышей давали 4 иммунизации до заражения летальной дозой HSV2. К тому же, четыре вакцинации липосомной HSV2gD(l-23)-TM вакциной приводят к 100% защите мышей от летальной дозыHSV2gD(l-23)-TM не обеспечивают существенную защиту от летального заражения с HSV2. Это отчетливо демонстрирует, что и липосома,и белковые компоненты, полученные генной инженерией, должны связываться друг с другом для достижения эффективного иммунного ответа (реакции). Особенно важным является открытие, что липосомная HSV2gD(l-23)-TM вакцина обеспечивает значительно лучшую защиту, чем иммунизация термоинактивированным вирусом,поскольку полагают, что противовирусные вакцины обычно дают хороший стимул для иммунного ответа (реакции) (Desrosiers, 1992, AIDSRes. Hum. Retrovir. 8:1457). В конце исследования мышей приносили в жертву и собирали сыворотку для установления природы иммунного ответа (реакции) в это время. Найдено, что сыворотка вакцинированных мышей содержит высокие титры антител(1:100), что в частности, признает использование пептида для стимуляции иммунного ответа(реакции) и, кроме того, вызванное осаждение активного вируса, предполагающее, что антите 19 ла узнают эпитоп на поверхности вируса. Антитела также осаждают HSV2gD(l-23)-ТМ липосомы, а не липосомы без пептида, предполагая,что они узнают, в частности gD эпитоп HSV2. В табл. 3 представлена сводка иммунологических анализов, демонстрирующих, что липосомная HSV2gD(l-23)-TM, введенная подкожно один раз в неделю в течение четырех недель, генерирует более сильный иммунный ответ (реакцию) по сравнению со стандартными адъювантами. Вакцинация антигеном, смешанным с неполным адъювантом Фрейнда или квасцами, не могла обеспечить мышам защиту от вирусного заражения. Данные получали из теста нейтрализующего антитела и реакцию гиперчувствительности замедленного типа проводили параллельно данным выживания с наиболее высоким титром антитела (гуморальная иммунная реакция) и наблюдали наибольшую степень припухлости стопы (Т-клеточная иммунная реакция) для липосомной HSV2gD(l-23)TM группы. Другое важное преимущество, связанное с лечением липосомной HSV2gD(1-23)TM заключалось в том, что в отличие от результатов у мышей, получивших неполный адъювант Фрейнда с антигеном, не было раздражения или воспаления в месте инъекции у любой из мышей (17/17 наблюдалось покраснение в месте инъекции с неполным адъювантом Фрейнда против 0/17 для липосомной HSV2gD(l-23)-TM). Если применяли квасцы, у 17/17 мышей развивались осязаемые гранулемы в месте инъекции. Наоборот,липосомнаяHSV2gD(l-23)-TM не вызывала образования гранулем у любой из мышей. В заключении данные результаты наводят на мысль, что В и/или Т-клеточные иммунные реакции (судя по титрам нейтрализующих антител и степени припухлости стопы) приводят к защитной иммунной реакции, вызванной липосомной(HD) из 45 аминокислот. Конструкцию создавали удачным удлинением и амплификацией кодирующей области гена. Ген затем лигировали вpTrcHis экспрессирующий вектор и проверяли исследованием последовательности. Исследование экспрессии в малом масштабе инициировали индукцией 1 mM IPTG и подтверждали анализом вестерн-блоттинга с применением антител мыши, генерируемых при исследованиях вакцинации липосомной HSV2gD(l-23)-ТМ. Белок также анализировали с помощью SDSPAGE и находили полосы, которые соответствовали предполагаемому молекулярному весу(6 kD), судя по окраске Кумасси. Продемонстрировав, что предполагаемый белок экпрессировал в малом масштабе, серию ферментации завершали в 10 л с Е. coli, содержащихpTrcHis/HSV2gD(l-23)-HD конструкцию, которая давала примерно 60 г клеточной пасты. После индукции экспрессию HSV2gD(l-23)-HD проверяли вестерн-блоттингом во время ферментации. Бактерии из примерно 30 г клеточной пасты лизировали с помощью French Press в буфере, содержащем 1% дезоксихолата и 5 mM имидазола. После центрифугирования осадка клеточного дебриса, HSV2gD(l-23)-HD нашли преимущественно в водорастворимом супернатанте. Очистка достигалась при пропускании супернатанта,содержащего растворимыйHSV2gD(l-23)-HD белок, через колонку с никельсодержащей сефарозой. Колонку успешно промывали растворами, содержащими 5 mM имидазола, 200 mМ имидазола и далее 5 mМ имидазола с 1% дезоксихолата, для удаления всех остаточных белков. HSV2gD(l-23)-HD белок окончательно элюировали 200 mМ имидазола, раствором 1% дезоксихолата. Пиковые фракции определяли SDS-PAGE окрашенным Кумасси и вестерн-блоттингом. Все пиковые фракции, содержащие HSV2gD(l-23)-HD, собирали и концентрировали с помощью MilliporeUltraprep концентратора. Показано, что конечный концентрат содержал чистый HSV2gD(l23)-HD, судя по присутствию единственной полосы на SDS-PAGE геле, окрашенном Кумасси. Из этого первого опыта получили примерно 2-3 мг HSV2gD(l-23)-HD для исследования липосомной композиции и вакцинации. Липосомный препарат и процедуры вакцинации, проверка индукции иммунного ответаHSV2gD(l-23)-HD вызывать защитную иммунную реакцию. Процент выживания с помощью данной особой композиции достигал 40%. Для сравнения, буфером обработанные контрольные животные не оставались в живых, в то время какHSV2gD(l-23)-TM контрольная группа имела 100% выживаемость. Пример III-HIV. Получение HIV (gp120HD) и HIV(gp120-HD) в COS-1 клетках. Для конформационного изучения эпитопа получают gp120 последовательность из рНХВ 2-env плазмиды, содержащей gpl60 ген (NIHAIDS Research and Reagent Program, Rockville,MD) при амплификации плазмидной ДНК сPCR и субклонированием 1536-bр продукта для секвенирования с помощью дидезоксинуклеотидного метода. Используя 5' (sence) праймер,соответствующий первым 21-bp HIV 120 генаATGAGAGTGAAGGAGAAATAT и 3' (antisence) праймер, соответствующий нуклеотидам 1515 до 1536 TGCTCTTTTTTCTCTCTGCAC,удаляющих HIV gp41 белок, gp120 сегмент клонируют и амплифицируют PCR. Кроме того,каждый праймер фланкируют (ограничивают) удобными сайтами фермента рестрикции для того, чтобы совместить множественные клонирующие сайты pcDNA4-His экспрессирующего вектора. PCR продукт лигируют в pcDNA4-His,содержащий HD область в виде плазмиды кассеты гена (gene cassette plasmid) (Invitrogen, Inc.San Diego, CA). Делеционные мутанты создают с помощью PCR амплификации, используя две 5' и 3' праймерные пары, которые исключают нуклеотиды, кодирующие остатки в gpl20 белке; они включают 136-151gpl20, 128-194gpl20 и 123-203gpl20. Праймеры содержат удобные последовательности фермента рестрикции, предусматривающие лигирование двух продуктов гена. Каждую мутацию, следовательно, замещают двумя аминокислотами, кодируемыми специфическим представляющим интерес сайтом рестрикции. Конечные гены проверяют секвенированием ДНК с применением схемы и реагентов из набора AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) и результаты проводят на наборе ALFExpress (Amersham PharmaciaBiotech, Piscataway, NJ) аппарате секвенирования и анализируют AM программным обеспечением v.3.02 (Amesham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Плазмиды трансфектируют в COS1 клетки (ATCC, Rockville, MD) с помощью реагента DEAE-декстрана. Стабильные трансфектанты собирают с помощью Zeocin (Invitrogen,Inc., San Diego, СА) и клонируют ограниченным разведением. gpl20-HD белки очищают селективным сродством к никелю, связанному с твердым носителем. Клоны, которые продуцируют высокие уровни белка, оценивают вестерн-блоттингом или FACS анализом. Гистидиновый линкер HIV(gp120)-HD, HIV136151gpl20, HTV128-194gp120 и HIV123203gpl20 удаляют расщеплением энтерокиназой после того, как закончена очистка. Если необходимо, выполняют исключение размера (численности), ионный обмен или хроматографию гидрофобного взаимодействия с последующейNYNKRKRIHIGPGRAFYTTK (SEQ. ID No. 19 и получают из последовательности данного белка, используя преимущества E.coli кодона(Looman et al., 1987, EMBO J. 6:2489). Синтетические гены, кодирующие HIV последовательность, собирают синтезом, гибридизацией, PCR и лигированием при перекрывании олигонуклеотидов. Собранный ген полной группы, кодирующий HFV фрагменты, амплифицируют с помощью PCR и затем лигируют в экспрессирующую плазмиду. Конечные гены проверяют секвенированием ДНК.HIV-HD-coдержащие pTrcHis плазмиды трансформируют в E.coli. Бактерии инкубируют в LB среде с ампициллином (50 мкг/мл) при 37 С до мид-лог фазы. Во время оптимальной экспрессии клетки собирают центрифугированием. Клеточный дебрис лизируют (разрушают) и центрифугируют. Лизат анализируют на присутствие белка. HIV-HD-белки очищают с помощью селективного сродства к никелю, связанному с твердым носителем. Если необходимо, можно проводить исключение размера (численности), ионный обмен или хроматографию гидрофобного взаимодействия с последующей очисткой HFV-HD. Получение липосомы. Липосомы получают воздействием ультразвука на зонд согласно ранее описанным процедурам (Fujii et al., 1997,Biochemistry 36:4959). Вкратце, липиды (с белком или без) растворяют в органическом растворителе, таком как хлороформ/метанол. Тонкие липидные пленки создают при отборе пипеткой аликвот липидных растворов в круглодонные стеклянные трубки и упариванием растворителя при 65 С в токе азота. Пленки помещают в вакуум, по крайней мере, на 8 ч для удаления остаточного органического растворителя. Получение липосом достигается гидратированием липидных пленок буфером и инкубированием суспензии при 65 С в течение 5-10 мин перед разрушением пробы (зонда) ультразвуком. Далее для получения стерильного препарата липосомы фильтруют через 0,22 мкм фильтр. Липосомы разделяют по размерам с помощью динамического рассеяния света и образование агрегатов продолжается по крайней мере четыре недели. Процедуры вакцинации и проверка индукции иммунного ответа (реакции) к вирусному антигену. BALB/c самок мышей (6-8-недельных) подкожно вакцинируют 1, 4 и 8 недели препаратом проверяемой вакцины или буфером. Места инъекции контролируют на побочные реакции, такие как развитие гранулем и/или об 23 разование струпа. Когда животных подвергают иммунизации вакциной интраназально, или дают наркоз галотаном, проверяемый продукт (1020 мкл) вводят в ноздри при вдыхании с применением стерильного наконечника на микропипетторе (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis. 168:622). Измерение гуморальных иммунных ответов с ELISA. Через постоянные промежутки времени во время процедуры вакцинации (например, 1 х в неделю), измеряли иммунный отклик (реакцию) мышей к вирусному антигену. Липосомы, содержащие антигенную детерминанту, также используют в качестве мишеней для анализа антитело / ELISA, как описано ранее (Tuso et al., 1993, Transplantation 55:1375). Результаты последней проверки используют для измерения уровня связывания и конфигурации изотипа антител. Анализ гиперчувствительности замедленного типа (delayed type hypersensitivity, DTH).DTH ответ к вирусному антигену у вакцинированных мышей проверяют с помощью теста на припухлость стопы. Вакцинированным животным дают наркоз галотана и вводят 50 мкл липосомного антигена или свободного антигена в одну заднюю стопу и 50 мкл буфера в другую заднюю стопу. Через 24, 48 и 72 ч измеряют степень припухлости стопы мышей с помощью штангенциркуля Vernier и сравнивают с фоновыми изменениями. Цитокин-специфический анализ мРНК. Тклетки иммунизированных и неиммунизированных животных исследуют на цитокинспецифические мРНК уровни основных цитокинов, которые могут осуществлять рефлекторную реакцию сенсибилизации, связанную с иммунизацией, включающую IL-2, IFN-, IL-4, IL5, IL-6 иIL-10. Т-клетки селезенки выделяют, как описано ранее, через 1 и 4 недели после иммунизации. Полную РНК выделяют с помощью модификации (Cosenza et al., 1995, Liver Tranpl. Surg. 1:16) метода, описанного Chomczynsky et al.,1987, Analyt. Biochem. 162:156. Свежие или замороженные клетки (2x106) разрушают в 1 мл денатурированного раствора (4 mМ тиоцианата гуанидина, 25 mМ цитрата натрия (рН 7,0), 0,5% саркозила и 0,1 mM 2-меркаптоэтанола). РНК осаждают инкубацией с одним объемом изопропилового спирта в течение ночи при -20 С. Концентрацию полной РНК доводят до 260 nМ и образцы до проведения анализа хранят приal., 1987, Analyt. Biochem. 162:156. Одноцепочечную кДНК получают транскрипцией 2 мкг полной РНК в 20 мкл полной реакционной смеси, используя птичий вирус миеломного лейкоза обратной транскриптазы (Boehringer Mannheim,Indianapolis, IN). Последовательности специфи 004797 24 ческих олигонуклеотидных праймеров цитокинов мышей (табл. 1) используют для амплификации ДНК-фрагментов заранее определенного размера для каждого из представляющих интерес генов. PCR смесь содержит 1 мкл кДНК, 2,5 мкл PCR 10 х буфер, 1 мкл каждого из 5' и 3' праймеров, 2,5 мкл 10xdNTPS (2 ммол/л) и 0,125 мклT.aquaticus термостабильной ДНКполимеразы (Boehringer Mannheim) в конечном объеме - 25 мкл. Специфические Р-актиновые праймеры используют для амплификации 548 bр фрагмента в качестве внутреннего контроля.PCR смесь покрывают минеральным маслом и амплификацию проводят после инкубации смеси в течение 7 мин при 94 С, 38 циклов с денатурацией при 94 С в течение 30 с, ренатурацию праймера при 60 С в течение 45 с, удлинение при 72 С в течение 60 с и инкубация при 72 С в течение 7 мин. PCR продукты разделяют на агарозном геле в присутствии этидиний бромида. Полосы делают видимыми в УФ-свете, фотографируют и количественно определяют денситометрическим методом по фотографии, используя программный пакет Molecular Analyst(Bio-Rad, Richmond, CA). Измерение цитокина с помощью ELISA в Т-клетках селезенки. Активность Т-клеток данных животных также измеряют продуцированием цитокинов в ответ на инкубацию Т-клеток селезенки с вирусным антигеном. Селезенки удаляют из вакцинированных животных и гомогенаты селезенки получают осторожным разрушением селезенок стерильным пружинным штифтом и проталкиванием клеток через нейлоновое сито. Клеточные суспензии промывают и помещают на планшет при 1x105 клеток/лунке в 96-луночном титрационном микропланшете. После инкубации клеток при 37 С в течение 3-4 дней с различными количествами вирусного антигена собирают супернатанты из лунок и проверяют на присутствие цитокинов. Коммерчески доступные ELISA наборы цитокина используют для определения профиля цитокина. Определение белка цитокина в супернатантах тканевой культуры с помощью сэндвич-ELISA проводят с применением моноклональных антител (mAb), специфических для определенных цитокинов. Вкратце, ELISA планшеты покрывают в течение ночи mAb крыс против цитокина мыши. Планшеты блокируют 3% сывороткой эмбрионального теленка в PBS в течение 2 ч,далее аликвоты каждого образца прибавляют в каждую лунку. Цитокин-специфические биотинилированные mAb крыс против мыши прибавляют к каждой лунке с последующим прибавлением авидинпероксидазы. Цветная реакция достигается прибавлением колориметрических субстратов. Планшеты прочитывают в ELISA спектрофотометре и вычисляют концентрацию цитокина из стандартной кривой, полученной из контрольных рекомбинантных цитокинов. Все наборы ELISA цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL 25mМ), пенициллин (25 IU/мл), стрептомицин (25 мкг/мл) и гентамицин (80 мкг/мл). Клетки культивируют при концентрации 1x106 клеток/мл сHIV-HD пептидом (5 мкг/мл) или без него в 96 луночных планшетах с U-образными лунками в течение 3-4 дней в 5% СО 2. Культуры подвергают действию импульсов 20 мкл ресазуринового красителя в течение 3 ч и далее измеряют флуоресценцию на Cytofluor II (Perseptive Biosystems, Inc., Farmington, MA). Анти-HIV CTL отклики. После вакцинации определяют присутствие антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) в Тклетках селезенки. Лимфоциты селезенки получают, как описано ранее. Лимфоциты из каждой обработанной группы собирают (n=5) и далее культивируют в течение 3 дней без антигена при 107 клеток/лунке в 12-ти луночных культурных планшетах. Клетки мишени L5198Y лимфомы(H2d) (ATTC) инкубируют с пептидом, относящимся к HIV CTL эпитопу H2d рестриктированных клеток и инкубируют в течение 4 ч при 37 С. Мишени промывают и к каждой лунке прибавляют 100 мкл титров, содержащих 1x104 клеток. Эффекторные лимфоциты промывают,прибавляют к лункам при различных концентрациях и культивируют в течение 4 ч при 37 С. Используя набор CytoTox 96 (Promega, MadisonWI), процент специфического лизиса вычисляют из супернатантной лактатдегидрогеназы(LDH), измеренной в стандартном спектрофотометре для прочтения ELISA (HTS 7000 + BioAssay Reader, Perkin Elmer, San Jose, СА), регистрируя абсорбцию при 490 нм. ОпределениеHSV2-антигенспецифического лизиса производят по стандартным критериям. Данные выражают в виде процента специфического лизиса = 100 х[( экспериментальное - эффектор спонтанный - мишень спонтанная)/мишень максимальная - мишень спонтанная)]. Пример IV. Вирус гриппа (INFV). Получение INFV-HD. Нуклеотидную последовательность выбранных эпитопов получают из белковой последовательности, используя преимущества E.coli кодона (Looman et al., 1987,EMBO J. 6:2489). Последовательность(и), вставленная в кассету гена, относится к эпитопам изYASL (SEQ ID No. 22. Комбинация эпитопов вакцины может создаваться из Т-В эпитопа, как сообщалось Brumeanu et al., 1997 (НА 110 004797Virol. 71:5473). Если соответствующую(ие) последовательность(и) получают, синтетический ген, кодирующий INFV-HD собирают синтезом,гибридизацией, PCR и лигированием при перекрывании олигонуклеотидов. Собранный ген полной длины, кодирующий INFV фрагменты,амплифицируют PCR и затем лигируют в экспрессирующую плазмиду. Конечные гены проверяют секвенированием ДНК.INFV-HD содержащие плазмиды трансформируют в E.coli. Бактерии инкубируют в LB среде с ампициллином (50 мкг/мл) при 37 С до мид-лог фазы. В это время добавляют IPTG для индуцирования trp/lac гибридного промотора. Ежечасно точки исследуют для определения оптимальной постиндукционной экспрессииINFV-HD белков. Во время оптимальной экспрессии клетки собирают центрифугированием. Клеточный дебрис лизируют и центрифугируют. Лизат анализируют на присутствие белка.INFV-HD белки очищают с помощью селективного сродства к никелю, связанному с твердым носителем. Если необходимо, можно проводить исключение размера (численности), ионный обмен или хроматографию гидрофобного взаимодействия с последующей очисткой INFV-HD. Модель вирусной инфекции. INFV штамм,используемый для демонстрации эффективности вакцины, представляет рекомбинациюA/PR/8/34 вируса, названную PR8. Вирус культивируют в 10-12 дневных оплодотворенных яйцеклетках цыпленка с помощью аллантоидной инокуляции с последующей инкубацией при 37 С в шюттль-аппарате в течение 40-48 и 20-24 ч при 4 С и далее выделяют из аллантоидной жидкости. Реакция вирусной гемагглютинации с 0,5% эритроцита цыпленка должна проводиться в 96-луночных микротитрационных планшетах для определения гемагглютинирующих единиц (hemagglutinating unit, HAU), в 1 мл вирусного штамма. На BALB/c модели мыши показано, что 1200 HAU штамма PR8, введенный внутриназально с помощью применения стерильного наконечника на микропипетторе мышам, которым давали наркоз метофаном (20 мкл), продуцировали явные симптомы инфекции через 4 дня,включая уменьшенную подвижность, подтянутость, 20% потерю веса тела и смерть в течение 2 недель. Используя MDCK анализ цитолиза,проведенного в 96-луночных микротитрационных планшетах с 50% точкой эквивалентности,было найдено, что высокий титр инфекционного вируса, присутствующего в гомогенатах легкого, получали через 4 дня постинфекции. Процедуры вакцинации и проверка индукции иммунного ответа (реакции) к вирусному антигену. BALB/c самкам мышей (6-8 недельным) подкожно вводят 1, 4 и 8 недель препарат вакцины или буфера. Места инъекции контро 27 лируют на побочные реакции, такие как развитие гранулем. Если животных подвергают иммунизации вакциной интраназально, им дают наркоз метофаном и проверяемый продукт (1020 мкл) вводят в ноздри при вдыхании с применением стерильного наконечника на микропипетторе (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis. 168:622).INFV РНК проводят на легких экспериментальных животных, взятых через 4 дня после вирусного заражения для установления эффективности иммунизации для профилактики вирусной инфекции. Образцы легкого, взятого от мышей,быстро замораживают, растирают и замороженный порошок хранят при -70 С до обработки данных. Выделение полной РНК и RT-PCR анализ вирусной РНК проводят, используя модификацию ранее описанных методик (Chomczynsky et al., 1987, Analyt. Biochem. 162:156; Shirwan et al., 1993, J. Immunol. 151:5228; Lakeman,Whitley, 1995, J. Inf. Dis. 171:857). Праймеры,которые должны использоваться, являются специфическими для матричного гена (сегмент 7) А вируса гриппа (Atmar et al., 1996, J. Clin. Microbiol. 34:2604). RT-PCR анализ проводят, используя Titan One Tube RT-PCR систему (BoehringerMannheim, Indianapolis, IN) реагентов и процедуры. Вкратце, 1 пкг - 1 мкг полной РНК матрицы инкубируют в присутствии 0,2 mM dNTPS,0,4 мкМ antisense праймера FAMI (5'GAGAGACTTGAAGATGTCTTTGC-3' (SEQ IDmM MgCl2 и AMV/Expand High Fidelity ферментов при следующих условиях: один цикл при 60 С в течение 30 мин; 94 С в течение 2 мин; 10 циклов при 94 С в течение 30 с, 55 С в течение 30 с, 68 С в течение 45 с, 25 циклов при 94 С в течение 30 с, 55 С в течение 30 с, 68 С в течение 45 с, увеличивая удлиняющий сегмент 5 с для каждого цикла; за которым следует один цикл при 68 С в течение 7 мин. Положительные результаты основаны на видимой полосе 212 bр в 1,5% NuSieve-агарозном геле (FMC Bioproducts, Rockland, ME), окрашенном этидиний бромидом и сфотографированном с помощью УФ-лампы для просвечивания гелей (BioRad GelDoc 1000). Было показано, что данный способ чувствителен и высокоспецифичен для измерения присутствия вирусной ДНК (Lakeman,Whitley, 1995, J. Inf. Dis. 171:857). Последовательность HAI области. Последовательность НАI области (сегмент 4) можно объяснить амплифицированием HAI области из вирусной ДНК в RT-PCR реакции, далее 1100 bр продукт субклонировали для секвенирования и секвенировали с использованием метода дидезокси-нуклеотидной терминации. RT-PCR анализ проводят с применением Titan One Tube RT 004797PCR System, как указано выше, со следующими различиями; праймеры амплификации являются кДНК праймером (5'-AGCAAAAGCAGGGGAVirol. 75:205), условиями будут - один цикл при 60 С в течение 30 мин; 94 С в течение 2 мин, 10 циклов при 94 С в течение 30 с, 60 С в течение 30 с, 68 С в течение 45 с; двадцать пять циклов при 94 С в течение 30 , 60 С в течение 30 с,68 С в течение 45 с, уcвеличивая удлиняющий сегмент 5 с для каждого цикла; за которым следует один цикл при 68 С в течение 7 мин. 1100bр продукт субклонируют в ТА PCR 2.1 клонирующий вектор (Invitrogen, Carlsbad, CA) для последующего секвенирования. Секвенирование проводят с использованием процедуры и реагентов от набора AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) и результаты получают на наборе ALFExpress (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) установки секвенирования и анализируют с помощью АМпрограммного обеспечения v.3.02 комплекта(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Измерение ответов антител с помощьюELISA. Через постоянные промежутки времени во время процедуры вакцинации, измеряют иммунный ответ мышей к вирусному антигену. Липосомы, содержащие антигенную детерминанту также используют в качестве мишеней для анализа антитело/ELISA, как описано ранее(Tuso et al., 1993, Transplantation 55:1375). Результаты последней проверки используются для измерения уровня связывания и конформации изотипа антител. Пролиферация антиген-индуцированных Т-клеток. Сенсибилизацию хозяина к INFN антигенам измеряют с помощью пролиферации антиген-индуцированных Т-клеток. Селезенки удаляют из вакцинированных мышей и гомогенаты получают осторожным разрушением селезенок стерильным пружинным штифтом и проталкиванием клеток через нейлоновое сито. Клетки суспендируют в RPMI 1640 среде, содержащей 10% FCS, 10 mM Hepes буфера, Lглутамин (2 mМ), пенициллин (25 IU/мл),стрептомицин (25 мкг/мг) и гентамицин (80 мкг/мл). Клетки культивируют при концентрации 1x106 клеток/мл с химически синтезированными пептидами, соответствующими антигенам(5 мкг/мл), или без них в 96-луночных планшетах с U-образными лунками в течение 3-4 дней в 5% СО 2. Культуры подвергают действию импульсов с 20 мкл ресазуринового красителя в течение 3 ч и далее измеряют флуоресценцию на Cytofluor II (Perseptive Biosystems, Inc.,Farmington, MA). Анти-INFV CTL ответы. После вакцинации определяют присутствие антигенспецифических цитотоксичных Т-лимфоцитов (CTL) в Т-клетках селезенки. Лимфоциты селезенки по 29 лучают, как описано ранее. Лимфоциты из каждой обработанной группы собирают (n=5) и далее культивируют в течение 3 дней без антигена при 107 клеток/лунке в 12-луночных культуральных планшетах. Клетки мишени (АТСС) Р 815 мастоцитомы или L5178 лимфомы (H2d) инкубируют с пептидом, относящимся к INFVNP CTL эпитопу (аминокислоты 147-158) H2d рестриктированных клеток и инкубируют в течение 4 ч при 37 С. Мишени промывают и к каждой лунке прибавляют 100 мкл титров, содержащих 1x104 клеток. Эффекторные лимфоциты промывают, прибавляют к лункам при различных концентрациях и культивируют в течение 4 ч при 37 С. Используя набор CytoTox 96 (Promega, Madison WI), процент специфического лизиса вычисляют из супернатантной лактатдегидрогеназы (LDH), измеренной в стандартном спектрофотометре для прочтенияElmer, San Jose, CA), регистрируя абсорбцию при 490 нм. Определение НSV2-антигенспецифического лизиса производят по стандартным критериям. Данные выражают в виде процента специфического лизиса = 100 х [(экспериментальное - эффектор спонтанный - мишень спонтанная)/(мишень максимальная - мишень спонтанная)]. Пример V. Нетипичный Н. influenzae(NTHi) и Н. Influenzae типа b (Hib). Клонирование NTHi белков. Последовательность гена полной длины, кодирующего Р 6,получают из штамма NTHi с помощью RT-PCR амплификации Р 6 мРНК (Deich et al., 1988, J.(SEQ ID No. 29, 5 mM DTT, 5 U RNase ингибитор, 1,5 mM MgCl2 и AMV/Expand High Fidelity ферментов при следующих условиях: один цикл при 60 С в течение 30 мин; 94 С в течение 2 мин; десять циклов при 94 С в течение 30 с; 55 С в течение 30 с; 68 С в течение 45 с; двадцать пять циклов при 94 С в течение 30 с; 55 С в течение 30 с; 68 С в течение 45 с, увеличивая удлиняющий сегмент 5 с для каждого цикла; за которым следует один цикл 68 С в течение 7 мин. Положительные результаты основаны на видимой полосе 867 bр в 1,0% NuSieveагарозном геле (FMC Bioproducts, Rockland,ME), окрашенном этидиний бромидом и сфотографированном с помощью цифровой системы обработки изображений (BioRad, Gel Doc 2000).PCR продукт субклонируют для целей секвенирования в ТА 2.1 векор, используя ТА клони 004797 30 рующий набор (Invitrogen, Carlsbad, CA) реагентов и процедуры. Получение плазмиды в малом масштабе осуществляют с помощью стандартного метода щелочного лизиса (Maniatis, 1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.,Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring HarborLaboratory Press, NY, p. 125). Вставку PCR продукта секвенируют с помощью стандартного метода дидезокситерминации, используя процедуру и реагенты из набора AutoCycle (AmershamPharmacia Biotech, Piscataway, NJ) и результаты получают на ALFEexpress II (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) приборе секвенирования и анализируют с помощью программного обеспечения AlfWin Sequence Analyser v.2.0(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Получение NTHi(P6)-HD. Если получают ген, кодирующий Р 6, синтетический ген, кодирующий NTHi(P6)-HD собирают синтезом, гибридизацией, PCR и лигированием при перекрывании олигонуклеотидов. HD сегмент добавляют к N- или С-концу белка через линкер, содержащий глицин и серин. Это позволяет нам проверить влияние, которое оказывает относительное расположение HD в отношении антигена на процессирование иммунной системы. Собранный ген полной длины, кодирующий NTHi(P6)HD фрагмент, амплифицируют с помощью PCR и лигируют в плазмиду экспрессии. Конечный ген проверяют секвенированием ДНК.NTHi(P6)-HD содержащую плазмиду трансформируют в E.coli. Бактерии инкубируют в LB среде с ампициллином (50 мкг/мл) при 37 С до мид-лог фазы. В это время добавляютIPTG для индуцирования trp/lac гибридного промотора. Ежечасно точки проверяют для определения оптимальной постиндукционной экспрессии NTHi(P6)-HD белка. Во время оптимальной экспрессии клетки собирают центрифугированием. Клеточный дебрис лизируют и центрифугируют. Лизат и клеточный дебрис анализируют на присутствие белка. Для экстракции NTHi(P6)-HD белка из лизированного клеточного дебриса используют 1-2% раствор дезоксихолата натрия. NTHi(P6)-HD далее очищают селективным сродством к никелю, связанному с твердым носителем. Если необходимо, можно проводить исключение размера (численности), ионный обмен или хроматографию гидрофобного взаимодействия с последующей очисткой NTHi(P6)-HD. Получение липосомы. Имеются три общих подхода для получения стабильных NTHi(P6)HD липосом. Сначала липосомы включают в композицию так, что белок и липиды растворяют вместе в органическом растворителе (хлороформ/метанол) и далее сушат в тонкую пленку. При повторном суспендировании в водном буфере липиды и белки собирают в большие бислойные структуры. Суспензию затем разрушают ультразвуком для получения мелколамеллярных пузырьков (SUV). Для меньших белковых кон 31 струкций данный метод работает хорошо. Однако для данных экспериментов возможно нежелательно подвергать действию белок в жестких условиях растворителя вследствие возможности денатурирования белка. Таким образом,чтобы предотвратить нежелательные конформационные изменения, может применяться второй метод, который включает солюбилизациюNTHi(P6)-HD в ресуспендированном буфере до гидратации липидной пленки. При гидратации липидами белок спонтанно связывается с заново образованной мембраной и включается в бислойSUV во время действия ультразвука. Третий метод включает получение липосом безNTHi(P6)-HD белка и далее прибавлением его к уже образованным SUV, давая возможность HD интегрировать в липидный бислой. Липосомы получают действием ультразвука на зонд согласно ранее описанным методикам (Fujii et al.,1997, Biochemistry 36:4959). Вкратце, липиды (с белком или без) растворяют в органическом растворителе, таком как хлороформ/метанол. Тонкие липидные пленки создают при отборе пипеткой аликвот липидных растворов в круглодонные стеклянные трубки и упариванием растворителя при 65 С в токе азота. Пленки помещают в вакуум, по крайней мере, на восемь часов для удаления остаточного органического растворителя. Наоборот, липидные порошки нужного состава можно получить техническим приемом, таким как распылительной сушкой, и далее их используют вместо липидных пленок. Получение липосом выполняют гидратированием липидных пленок или порошков в буфере и инкубированием суспензии при 65 С в течение 5-10 мин до воздействия ультразвука на зонд(пробу). Липосомы затем фильтруют через 0,22 мкм фильтр для стерилизации препарата. Липосомы должны разделяться по размерам с помощью динамического рассеяния света и образованием агрегатов, продолжающихся, по крайней мере, четыре недели. Возможно, что конформацию NTHi(P6)-HD белка необходимо сохранить. Поэтому из трех подходов, которые могут применяться для получения липосом, мы предвидим, что прибавление белка в качестве компонента гидратирующего раствора или прибавление к липосомам после того, как они уже образованы, может быть предпочтительным. Бактериальные штаммы. NTHi штаммы 9333 (изолят цереброспинальной жидкости),35056 (изолят верхней респираторной инфекции), 43095 (изолят воспаления среднего уха),49766 (изолят абсцесса легкого, штамм сравнения для проверки антимикробной восприимчивости) (АТСС) и Hib штамм 51654 (АТСС) использовали для демонстрации эффективности в модели бактериальной инфекции. До применения замороженную биомассу организма пассируют в свежем бульоне Brain Heart Infusion, дополненным NAD (2 мкг/мл) и гемом (10 мкг/мл) и инкубируют в течение 24 ч при 37 С с 10% 32 СО 2. Стандартную кривую для каждого организма, состоящего из колоний-образующих единиц, от помутнения при 480 нм используют для регулирования инокулята бактерий, необходимых или для бактериальных проверок, или для дозы интраперитонеального заражения. Процедуры вакцинации и проверка индукции иммунного ответа к бактериальному антигену. Группы крыс раннего возраста (n=6 на группу) иммунизируют на 5, 12 19 и 26 послеродовые дни или на 5 и 26 дни проверяемым препаратом вакцины или буфера. Систематическая вакцинация крыс проводится подкожным введением липосомных вакцин. Когда животных подвергают иммунизации вакциной интраназально, им дают наркоз метофаном и проверяемый препарат (20 мкл) вводят с применением стерильного наконечника на микропипетторе(Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis. 168:622). Крыс раннего возраста помещают с их кормящими матерями и проверяют побочные реакции на процедуру вакцинации, такие как образование гранулем, покраснение или образование струпа в месте вакцинации. Через одну неделю после последней вакцинации, крысам раннего возраста дают наркоз галотаном и собирают кровь кардиальной пункцией и отхождения слизистой оболочки, промытые солевым раствором для сбора секретов слизистой оболочки. Животных умерщвляют с помощью двуокиси углерода. Титры антител с бактерицидными свойствами сыворотки и жидкости слизистой измеряют, как описано ниже. Для исследования интраперитонеального заражения крысы раннего возраста (26-дневного возраста) заражают бактериями и их кровь иCSF проверяют на бактериальную нагрузку,сравнивая с невакцинироваными крысами. Взятие образцов крови и CSF для бактерий двумя днями после заражения указывает, что имеется значительная бактериальная нагрузка у животных (т.е. 1 х 104 CFU/мл крови; 1 х 104 CFU/млCSF). Сыворотку от вакцинированных крыс 26 дневного возраста, содержащих высокие титры антител с бактерицидными свойствами, вводят внутривенно крысам 6-дневного возраста. На следующий день крысы раннего возраста (n=10) получают дозу NHTi интраперитонеально, как описано ниже. Затем крыс раннего возраста проверяют на заболеваемость и смертность, выживших умерщвляют после 26 дней и кровь иNHTi. Интраперитонеальное заражениее с NTHi. Культуру 24 часового возраста in vivo, пассированную NHTi , доводят до 5x107 - 5x109 CFU/ мл и 100 мкл данной культуры вводят интраперитонеально крысам 5-10 дневного возраста (Smithet al., 1973, Inf. Immun. 8:278). Зараженных крыс раннего возраста оставляют с кормящими матерями после вакцинации. В течение 18-96 ч после заражения, по крайней мере, 90% крыс раннего 33 возраста умирают при использовании данной дозы пассированных бактерий. Измерение ответов антигенспецифического антитела с помощью ELISA. Образцы сыворотки и слизистой каждой крысы проверяют наNTHi(P6)-HD белок прибавляют к соответствующим образом обработанным 96-луночным планшетам при инкубации в течение ночи при комнатной температуре. Планшеты блокируют 1% бычьим сывороточным альбумином в бикарбонатном буфере, рН 9,6 в течение 30 мин при 37 С. Затем планшеты промывают 0,05%Tween 20/PBS. Разбавленные аликвоты каждого образца сыворотки и слизистой прибавляют к планшетам, покрытых антигеном, за которым следует инкубация в течение 2 ч при 37 С и промывание Tween 20/PBS буфером в конце инкубации. Моноклональные тела, соединенные щелочной фосфатазой, специфические для IgG иIgA крысы прибавляют к лункам в течение одного часа при 37 С. Далее клетки промываютTween/PBS буфером и PNPP субстратом в диэтаноламинном буфере, рН 9,5, прибавляют к лункам для инициирования цветной реакции. Реакцию останавливают с помощью 0,75 н. гидроокиси натрия или считывают при 405 нм в спектрофотометре Spectramax ELISA для прочтения планшетов. Концентрации IgG и IgA крыс вычисляют из стандартной кривой, полученной из контрольных образцов известных концентраций IgG или IgA крысы, покрытых на 96-луночных планшетах и обрабатывают, как описано выше. Анализ антитела с бактерицидными свойствами. Образцы сыворотки, проверяемые на присутствие антител с бактерицидными свойствами, инкубируют при 56 С в течение 30 мин для инактивации комплемента. Далее проверяемые сыворотки серийно разбавляют забуференным фосфатом физиологическим раствором(PBS). 24-часовую бактериальную культуру доводят до 5x104 CFU/мл в стерильном РСМ буфере, состоящем из PBS с 0,15 mМ СаСl2 и 1mМ MgCl2, содержащего бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin, BSA). Сыворотки от невакцинированных крыс раннего возраста используют в качестве комплементного источника. Данные сыворотки собирают, разделяют на аликвоты и хранят при -70 С до использования. Бактерии (20 мкл), серийно разбавленная сыворотка (20 мкл), комплемент (20 мкл) и 40 мкл 1% BSA в РСМ буфере прибавляют к каждой лунке 96-луночного агглютинационного планшета. Для определения начальной бактериальной концентрации 10 мкл аликвотов образца смеси помещают при нулевом времени на свежие BHI агаровые пластинки,содержащие питательный агар и добавляютNAD и гель. После инкубации реакционных смесей при 37 С с 10% двуокиси углерода в 34 течение одного часа с встряхиванием, 10 мкл из каждой лунки помещают на планшет в двух экземплярах и инкубируют в течение ночи при 37 С в присутствии 10% двуокиси углерода для определения CFU/лунке. Контроли включают лунку без сыворотки для обеспечения того, чтобы один комплемент не вызывал киллинг бактерий и лунку с проверяемой сывороткой, но без комплемента, чтобы быть уверенным, что сывороточный комплемент в проверяемом образце успешно инактивирован. Все анализы проводят трижды и данные разбавления, продуцирующие 50% киллинг бактерий, используют для сравнения активности различных сывороток. Пример VI. Вирус гепатита С. Получение HCV(E2/NSI)-HD и HCV(E2/NSIHVRI)-HD в СНО клетках. Нуклеотидную последовательность HCV E2/NSI белка получают из PCR амплификации штамма HCV,полученного как описано ниже. Используя 5' праймер, соответствующий первому 21 bpE2/NS1 гена CAAACCATGATCGCCCACGGA и 3' праймер, соответствующий остаткам 622-628,GAAGTTGACAGTGCAGGGGTA, элиминируют трансмембранный домен (Cocquerel et al.,1998, J. Virol. 72(3):2183-91). К тому же каждый праймер фланкируют удобными сайтами рестрикции. PCR продукт лигируют в pcDNA3.1His,содержащий HD область в качестве плазмиды кассеты гена (Invitrogen, Inc., San Diego, CA).HVR1 E2/NSI гена, соответствующего первым 27 аминокислот от остатка 384 до остатка 410. Делеционный мутант получают PCR амплификацией, используя 5' праймер CAACTCATCAACACCAATGGC и тот же самый 3' праймер используют для контроля дикого типа. Конечные гены проверяют секвенированием ДНК. Плазмиды трансфектируют в СНО клетки(Lipofectamine, Gibco/BRL Gaithersburg, MD) согласно рекомендуемой производителем методике. Стабильные трансфектанты отбирают,используя G418 (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) и клонируют с помощью ограничивающего разбавления. Идентификацию клонов, которые продуцируют высокие уровни белка, проводят вестерн-блоттингом.HCV(E2/NSIHVR1)-HD белки очищают с помощью селективного сродства к никелю, связанному с твердым носителем. Гистидиновый линкер удаляют расщеплением энтерокиназой после окончания очистки. Если необходимо,можно проводить исключение размера (численности), ионный обмен или хроматографию гидрофобного взаимодействия с последующей очисткойNS1HVR1)-HD белков. Получение HCV(HVR1)-HD и HCV(C)-HD белков в Е. coli. Нуклеотидные последователь 35 ности выбранных эпитопов получают из белковой последовательности, используя преимущества Е. coli кодона (Looman et al., 1987, EMBO J. 6:2489). Последовательность(и) антигена, вставляемая в кассету гена, соответствует эпитопам от NP(147-161, TYORTRALVRTGMDP; 55-69YPYDVPDYASL). Когда соответствующая последовательность(и) получена, синтетический ген, кодирующий HCV-HD, флакируют удобными сайтами рестрикции, собирают синтезом,гибридизацией и лигированием перекрывающихся олигонуклеотидов. Вкратце, сборку фрагментов достигают нагреванием при 65 С и ренатурацией олигонуклеотидов, когда их возвращают к комнатной температуре. После инкубации в течение 2 мин на льду фрагменты лигируют ДНК-лигазой. Собранные гены полной длины, кодирующие HCV фрагменты, амплифицируют PCR, расщепляют ферментами рестрикции и изолируют гель-электрофорезом. Затем HCV ген лигируют в подобным образом расщепленную плазмиду экспрессии, содержащую HD ген (например, pTrcHis или pQE30). Конечные гены проверяют секвенированием ДНК.HCV-HD содержащие плазмиды трансофрмируют в E.coli. Бактерии инкубируют в LB среде с ампициллином (50 мкг/мл) при 37 С до мид-лог фазы. В это время добавляют IPTG для индуцирования trp/lac гибридного промотора. Ежечасно точки проверяют для определения оптимальной постиндукционной экспрессииHCV-HD белка. Во время оптимальной экспрессии клетки собирают центрифугированием. Клеточный дебрис лизируют и центрифугируют. Лизат анализируют на присутствие белка.HCV-HD белки очищают селективным сродством к никелю, связанному с твердым носителем. Гистидиновый линкер удаляют расщеплением энтерокиназой после окончания очистки. Если необходимо, можно проводить исключение размера (численности), ионный обмен или хроматографию гидрофобного взаимодействия с последующей очисткой HCV-HD. Липосомный препарат и процедуры вакцинации, проверка индукции иммунного ответа,измерения ответа ELISA антитела, DTH анализ,анализ цитокин-специфической мРНК, измерения ELISA цитокина, пролиферация антигениндуцированных Т-клеток и анти-HIV CTL ответы являются по существу такими, как описано выше в примере III. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Иммуногенная одноламеллярная липосомная композиция, включающая пузырекобразующие липиды и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант и гидрофобную область,при этом гидрофобная область имеет площадь 36 поверхности более 500 2 и связана с мембраной данной одноламеллярной липосомной композиции, причем иммуногенная композиция вызывает ответ, связанный с клеточным иммунитетом. 2. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, дополнительно включающая один или несколько адъювантов. 3. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является рекомбинантно продуцированной, химически синтезированной или их комбинацией. 4. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что гидрофобная область является пептидом. 5. Иммуногенная липосомная композиция по п.4, отличающаяся тем, что гидрофобная область содержит от 15 до 500 аминокислотных остатков. 6. Иммуногенная липосомная композиция по п.5, отличающаяся тем, что гидрофобная область включает одну или несколько аминокислот, которые выбирают из группы, состоящей изAla, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe,Pro, Ser, Thr, Trp, Туr и Val. 7. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что антигенная детерминанта происходит из антигена, который выбирают из группы, состоящей из HSV gB илиNA, H.influenzae Р 5 или Р 6, фимбриального протеина и протеина D. 8. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что антигенная конструкция дополнительно включает линкерную область, соединяющую антигенные детерминанты с гидрофобной областью. 9. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что линкерная область является пептидом. 10. Иммуногенная липосомная композиция по п.9, отличающаяся тем, что пептидная линкерная область содержит от 1 до 200 аминокислотных остатков. 11. Иммуногенная липосомная композиция по п.10, отличающаяся тем, что аминокислотные остатки выбирают из группы, состоящей изAla, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His,Ile,Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Туr и Val. 12. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является гибридным (слитым) белком. 13. Иммуногенная липосомная композиция по п.9, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является гибридным (слитым) белком. 14. Применение иммуногенно эффективного количества композиции по п.1 для индуцирования иммуногенного ответа у животногохозяина. 15. Применение иммуногенно эффективного количества композиции по п.2 для индуци 37 рования иммуногенного ответа у животногохозяина. 16. Применение по п.14, отличающееся тем, что животное-хозяин является млекопитающим. 17. Применение по п.16, отличающееся тем, что млекопитающее является человеком. 18. Применение по п.14, отличающееся тем, что животное является птицей. 19. Применение по п.17, отличающееся тем, что антигенную детерминанту выбирают из группы, состоящей из HSV gB или gD, HIVgp120, CMV gВ, HCV Е 2, INFV НА или NA,H.influenzae Р 5 или Р 6, фимбриального протеина и протеина D. 20. Вакцинная композиция, включающая эффективное количество композиции по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель. 21. Вакцинная композиция по п.20, дополнительно включающая один или несколько адъювантов. 22. Кассета ДНК для вставки в экспрессирующий вектор, включающая последовательности, которые кодируют иммуногенный гибридный (слитый) белок, при этом данный белок включает гидрофобную область с площадью поверхности более 500 2 и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант. 23. Кассета ДНК по п.22, отличающаяся тем, что антигенная детерминанта происходит от антигена, который выбирают из группы, состоящей из HSV gB или gD, HIV gp120, CMVgB, HCV E2, INFV НА или NA, H.influenzae P5 или Р 6, фимбриального протеина и протеина D. 24. Кассета ДНК по п.22, отличающаяся тем, что гидрофобная область является пептидом, состоящим из от 15 до 500 аминокислотных остатков. 25. Кассета ДНК по п.24, отличающаяся тем, что пептид включает одну или несколько аминокислот, которые выбирают из группы,состоящей из Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile,Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Туr и Val. 26. Кассета ДНК по п.22, отличающаяся тем, что гибридный (слитый) белок дополнительно включает линкерную область, соединяющую антигенную детерминанту и гидрофобную область. 27. Кассета ДНК по п.26, отличающаяся тем, что линкерная область содержит 1-200 аминокислотных остатков. 28. Кассета ДНК по п.27, отличающаяся тем, что аминокислотные остатки выбирают из группы, состоящей из Ala, Arg, Asn, Asp, Cys,Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro,Ser, Thr, Trp, Туr и Val. 29. Вектор, включающий кассету ДНК по п.22. 30. Способ получения иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции, включающий 38 экспрессию гена, который кодирует гибридный (слитый) белок, включающий гидрофобную область с площадью поверхности более 500 2 и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант,растворение пузырек-образующих липидов и гибридного (слитого) белка в подходящем органическом растворителе,образование липидной пленки или высушенного распылением порошка при испарении органического растворителя,гидратирование липидной пленки или порошка и диспергирование гидратированной липидной пленки или порошка с образованием иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции. 31. Способ получения иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции, включающий экспрессию гена, который кодирует гибридный (слитый) белок, включающий гидрофобную область с площадью поверхности более 500 2 и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант,растворение гибридного (слитого) белка в водном буфере,гидратирование или липидных порошков или липидных пленок с буфером, содержащим гибридный (слитый) белок, и диспергирование липидных порошков или пленок с образованием иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции. 32. Способ получения иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции, включающий экспрессию гена, который кодирует гибридный (слитый) белок, включающий гидрофобную область с площадью поверхности более 500 2 и антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант,растворение гибридного (слитого) белка в водном буфере и прибавление гибридного (слитого) белка к предварительно образованным одноламеллярным липосомам с получением иммуногенной одноламеллярной липосомной композиции. 33. Иммуногенная одноламеллярная композиция, включающая антигенную конструкцию, включающую одну или несколько антигенных детерминант и гидрофобную область с площадью поверхности более 500 2, и фармацевтически приемлемый носитель. 34. Иммуногенная композиция по п.33, отличающаяся тем, что антигенная конструкция дополнительно включает линкерную область,соединяющую антигенные детерминанты с гидрофобной областью. 39 35. Иммуногенная композиция по п.33, дополнительно включающая один или несколько адъювантов. 36. Иммуногенная липидная композиция в виде эмульсии, включающая масло, пузырекобразующие липиды и антигенную конструкцию, содержащую одну или несколько антигенных детерминант и гидрофобную область, которая имеет площадь поверхности более 500 2. 37. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что антигенная конструкция представляет собой гибридный (слитый) белок. 38. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что ответ, связанный с клеточным иммунитетом, включает ответ аллергической реакции замедленного типа. 39. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что липиды, содержащие липосому, находятся в жидкой фазе при температуре тела. 40. Иммуногенная липосомная композиция по п.1, отличающаяся тем, что липиды содержат не более 10% холестерина. 41. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что липиды, содержащие липосому, находятся в жидкой фазе при температуре тела. 42. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что липиды содержат не более 10% холестерина. 43. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является рекомбинантно продуцированной, химически синтезированной или их комбинацией. 44. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что гидрофобная область является пептидом. 45. Вакцинная композиция по п.44, отличающаяся тем, что гидрофобная область содержит от 15 до 500 аминокислотных остатков. 46. Вакцинная композиция по п.44, отличающаяся тем, что гидрофобная область включает одну или несколько аминокислот, которые выбирают из группы, состоящей из Ala, Asn,Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser,Thr, Trp, Туr и Val. 47. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что антигенная детерминанта происходит из антигена, который выбирают из группы, состоящей из HSV gB или gD, HIV 40 48. Вакцинная композиция по п.20, отличающаяся тем, что антигенная конструкция дополнительно включает пептидную линкерную область, соединяющую антигенные детерминанты с гидрофобной областью. 49. Вакцинная композиция по п.48, отличающаяся тем, что пептидная линкерная область содержит от 1 до 200 аминокислотных остатков. 50. Вакцинная композиция по п.49, отличающаяся тем, что аминокислотные остатки выбирают из группы, состоящей из Ala, Arg,Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys,Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Туr и Val. 51. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что липиды находятся в жидкой фазе при температуре тела. 52. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что липиды содержат не более 10% холестерина. 53. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что антигенная конструкция является рекомбинантно продуцированной, химически синтезированной или их комбинацией. 54. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что гидрофобная область является пептидом. 55. Композиция по п.54, отличающаяся тем, что гидрофобная область содержит от 15 до 500 аминокислотных остатков. 56. Композиция по п.55, отличающаяся тем, что гидрофобная область включает одну или несколько аминокислот, которые выбирают из группы, состоящей из Ala, Asn, Cys, Gln, Gly,His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Туr иVal. 57. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что антигенная детерминанта происходит из антигена, который выбирают из группы, состоящей из HSV gB или gD, HIV gp120, CMVgB, HCV E2, INFV НА или NA, H.influenzae P5 или Р 6, фимбриального протеина и протеина D. 58. Композиция по п.36, отличающаяся тем, что антигенная конструкция дополнительно включает пептидную линкерную область, соединяющую антигенные детерминанты с гидрофобной областью. 59. Композиция по п.58, отличающаяся тем, что пептидная линкерная область содержит от 1 до 200 аминокислотных остатков. 60. Композиция по п.59, отличающаяся тем, что аминокислотные остатки выбирают из группы, состоящей из Ala, Arg, Asn, Asp, Cys,Glu, Gln, Gly, His, lle, Leu, Lys, Met, Phe, Pro,Ser, Thr, Trp, Туr и Val.
МПК / Метки
МПК: C12N 15/62, A61K 9/127, A61P 37/00
Метки: липосомные, иммуногенные, композиции
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/22-4797-immunogennye-liposomnye-kompozicii.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Иммуногенные липосомные композиции</a>
Бициклические ароматические соединения, фармацевтическая и косметическая композиции на их основе, и применение косметической композиции
Номер патента: 1216
Опубликовано: 25.12.2000
Автор: Бернардон Жан-Мишель
МПК: C07C 69/618, C07D 333/24, A61K 31/38...
Метки: основе, бициклические, применение, ароматические, косметическая, композиции, косметической, фармацевтическая, соединения
Формула / Реферат:
1. Биароматические соединения пропинила общей формулы (I) где R1 является (I) радикалом -СН3; (II) радикалом -CH2-O-R5; (III) радикалом -СО-R6, где R5 и R6 имеют значения, приведенные ниже, Аr является радикалом, выбираемым из радикалов формул (а)-(е): где R5 и R7 имеют значения, приведенные ниже, Х является радикалом формулы где R8 и R9 имеют значения, приведенные ниже, R2 и R3, одинаковые или различные, являются (I) атомом водорода;...
Фармацевтические композиции для парентерального применения, содержащие индолкарбоновые кислоты
Номер патента: 211
Опубликовано: 24.12.1998
Авторы: Россато Мария Тереза, Лоди Андреа
МПК: A61K 47/10
Метки: содержащие, парентерального, фармацевтические, кислоты, композиции, применения, индолкарбоновые
Формула / Реферат:
1. Фармацевтическая композиция в приемлемой для парентерального введения форме, содержащая раствор (Е)-3-[2-(фенилкарбамоил)этенил]-4,6-дихлориндол-2-карбоновой кислоты или ее физиологически приемлемой соли в изотоническом растворе сахара, содержащем смешивающийся с водой органический растворитель для указанного соединения, причем рН указанного препарата находится в пределах от 7 до 9. 2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем,...
Способ получения композиции поперечно-сшитого биологически совместимого полисахаридного геля, композиции указанного геля и применение композиций
Номер патента: 1500
Опубликовано: 23.04.2001
Автор: Огеруп Бенгт
МПК: A61P 5/00, C08B 37/08, A61K 31/715...
Метки: получения, полисахаридного, композиций, композиции, применение, геля, совместимого, биологически, поперечно-сшитого, способ, указанного
Формула / Реферат:
1. Способ получения композиции поперечно-сшитого биологически совместимого полисахаридного геля, включающий следующие стадии: приготовление водного раствора растворимого в воде поперечно-сшиваемого полисахарида; инициирование реакции поперечного сшивания указанного полисахарида в присутствии полифункционального агента, обеспечивающего сшивание полисахарида; обеспечение стерического затруднения реакции поперечного сшивания до ее завершения перед...
Липосомальная вакцинная композиция, применение липосомальной вакцинной композиции, способ приготовления липосомальной вакцинной композиции и способ лечения млекопитающего.
Номер патента: 839
Опубликовано: 24.04.2000
Авторы: Гарсон Натали Мари-Жозеф Клод, Фрид Мартин
МПК: A61K 39/39
Метки: липосомальной, приготовления, способ, млекопитающего, вакцинная, вакцинной, лечения, липосомальная, применение, композиции, композиция
Формула / Реферат:
1. Липосомальная вакцинная композиция, содержащая антиген или антигенную композицию, иммунологически активную сапониновую фракцию и стерин, характеризующаяся тем, что отношение сапониновая фракция : стерин составляет от 1:1 до 1:100 (по массе). 2. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что отношение сапониновая фракция : стерин составляет от 1:1 до 1:5 (по массе). 3. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что отношение...
Железо-декстрановое соединение для применения в качестве компонента терапевтической композиции для профилактики или лечения дефицита железа, способ получения указанного железо-декстранового соединенияи применение указанного соединения для изготовления терапевтической композиции для парентерального введения
Номер патента: 3427
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Андреасен Ханс Берг, Христенсен Ларс
МПК: A61K 47/48, A61P 7/06
Метки: изготовления, лечения, композиции, качестве, применение, компонента, профилактики, соединение, соединения, введения, получения, применения, соединенияи, парентерального, терапевтической, дефицита, способ, железо-декстранового, железо-декстрановое, железа, указанного
Формула / Реферат:
1. Соединение железо-декстран для применения в производстве терапевтической композиции для профилактики или лечения дефицита железа у животного или человека путем парентерального введения, содержащее гидрированный декстран со среднемассовой молекулярной массой (СМММ) от 700 до 1400 Да, предпочтительно около 1000 Да, среднечисловой молекулярной массой (СЧММ) от 400 до 1400 Да, где 90 мас.% декстрана имеет молекулярные массы менее 2700 Да, а СМММ...
Предыдущий патент: Инфекционные клоны вируса ньюкаслской болезни, вакцины и диагностические анализы
Следующий патент: Ликер
Случайный патент: Двигатель внутреннего сгорания с поршнями возвратно-поступательного хода с кривошипом и множеством круговых блоков скольжения