Антивирусная фармацевтическая композиция, содержащая глицирризиновую кислоту и, по меньшей мере, один белок, имеющий активность в отношении вируса простого герпеса типа 1

1 Данное изобретение относится к фармацевтической антивирусной композиции, содержащей глицирризиновую кислоту и, по меньшей мере, один белок, обладающий антивирусной активностью. Известно, что вирус простого герпеса типа 1 вызывает лицевые и ротоглоточные поражения (Manual of Clinical Microbiology, Murray,Baron, Pfaller, Tenover, Yolken, 6th edition, pages 876-883, American Society for Microbiology,Washington D.C., 1993). В прошлом инфекции вируса простого герпеса типа 1 лечили видарабином (GoodmanGilman, Le basi farmacologiche della terapia,Zanichelli, Biologna, 7th ed., page 1156, 1991), но он был полностью заменен aцикловиромof Therapeutics McGraw Hill Companies, 9th ed.,chapter 50, page 1193, 1996; Am. J. Med., 73,Suppl., 18.6-192, 1982 and Clin. Pharmacokinet.,8, 187-201, 1983) вследствие его токсичности. В настоящее время ацикловир является,таким образом, наиболее применимым лекарственным средством в лечении поражений полости рта и губ (высыпания от лихорадки), но его местное применение часто вызывает жжение и раздражение слизистых оболочек. Кроме того,ацикловир является вполне эффективным при введении во время первой инфекции, но не очень эффективным в случае рецидивирующих инфекций вирусом простого герпеса 1. Кроме того, пероральное лечение имеет недостаток, заключающийся в том, что оно вызывает побочные эффекты, такие как тошнота,диарея, зуд, головные боли, почечная недостаточность и нефротоксичность. Таким образом, все еще существует реальная потребность в лекарственном средстве, которое является активным в лечении инфекций,вызываемых вирусом простого герпеса типа 1,даже в случае рецидивирующих инфекций, и которое не имеет побочных действий. В самом деле, было также показано, что глицирризиновая кислота обнаруживает некоторую вирусную активность. При антивирусных дозах она сильно ингибирует синтез вирусных гликопротеинов и только при очень высоких дозах она ингибирует также синтез клеточных гликопротеинов. Фактически, хотя действие глицирризиновой кислоты на синтез белков как в нормальных, так и в инфицированных клетках,является практически не затронутым даже при дозах 4 мМ, синтез гликопротеинов обнаруживает существенное различие в нормальных и инфицированных клетках. В самом деле, при концентрации 0,5 мМ ( которая ингибирует 50% репликации вирусов) глицирризиновая кислота вызывает уменьшение включения глюкозаминаН 3 более 10% в инфицированных клетках и не обнаруживает ингибирования в нормальных клетках. Увеличенная доза глицирризиновой кислоты до 1 мМ вызывает 80% уменьшение 2 этого вируса, обнаруживает отсутствие ингибирования синтеза гликопротеинов в контроле и 20% уменьшение в синтезе гликопротеинов в инфицированных клетках. При 4 мМ синтез гликопротеинов в нормальных клетках также слегка изменяется, но образование вируса ингибируется на 99% (L' Igiene Moderna, Pompel R,and Marcialis M.A., 83, 385-391, 1985). Кроме того, таблица А показывает результаты тестов, в которых проводили обработку клеток, инфицированных вирусом простого герпеса типа 1 (HSV1), 8 мМ глицирризиновой кислоты. Индуцированные клетки выдерживали в контакте с глицирризиновой кислотой в течение 2 ч при 37 С. Экспериментальные результаты,представленные в этой таблице, показывают,что имеется сильное уменьшение инфекции при 12, 17 и 22 ч и что эти клетки сохраняют их клеточную целостность. Это ингибирование составляет приблизительно 2 логарифма при 12 ч от момента инфицирования и 3 логарифма(Nature, Pompei R. et al., 281, No. 5733, 689690, 1979). Таблица А. Образование вируса (БОЕ/мл) после указанных часов Часы 12 17 22 Контроль 3 х 106 5,4 х 106 2,6 х 107 Глицирризиновая кислота 8 мМ 4,2 х 104 1,2 х 104 1,1 х 104 БОЕ = бляшкообразующая вирусная единица. В литературе известна также антивирусная активность и, более конкретно, антигерпетическая (анти-HSV1) активность различных типов лизоцимов, таких как лизоцим индюка, лизоцим человека, куриный лизоцим, денатурированный(инактивированный нагреванием) куриный лизоцим и куриный лизоцим, расщепленный трипсином (Current Microbiology, Cisani et al., 10,35-40, 1984). Действительно, лизоцимы являются ферментами, которые широко распространены в природе и содействуют защите организма против некоторых инфекционных агентов, вызывая их расщепление (т.е. лизис) или способствуя их расщеплению (Mol. Cell. Biochеm. Jolles et al.,63, 165-189, 1984; Anticancer Res., Save et al.,9, 583-592, 1989). Кроме того, в литературе описана антивирусная активность и, более конкретно, антигерпетическая (анти-HSV1) активность лактоферрина (Fujihara Т. and Hayashi H. Lactoferrinvitro, J. Inf. Dis., 172, 380-388, 1994). Теперь было неожиданно обнаружено, что глицерризиновая кислота оказывает синергиче 3 ское действие на белки, обладающие антивирусной активностью. Таким образом, первой целью этого изобретения является обеспечение фармацевтической композиции, характеризующейся тем, что она содержит глицерризиновую кислоту и, по меньшей мере, один белок, имеющий антивирусную активность. Предпочтительно, этот белок выбран из группы, включающей в себя лизоцимы и лактоферрины. Типичными примерами лизоцимов являются лизоцим индюка, лизоцим человека, куриный лизоцим, инактивированный нагреванием куриный лизоцим и куриный лизоцим, расщепленный трипсином. Предпочтительно, этот лизоцим является куриным лизоцимом или лизоцимом человека. Типичными примерами лактоферринов являются бычий и человеческий лактоферрины. В типичном случае фармацевтическая композиция этого изобретения применена для лечения локальных вирусных инфекций. Предпочтительно, вирус является вирусом герпетического типа. Еще более предпочтительно вирус представляет собой вирус простого герпеса типа 1 (HSV1). Предпочтительно фармацевтические композиции этого изобретения готовят в виде подходящих дозированных форм. Примерами подходящих дозированных форм являются кремы,мази и содержащие лекарственное средство пластыри для локального (местного) применения. Эти дозированные формы могут также содержать общепринятые ингредиенты, такие как: консерванты, стабилизаторы, поверхностноактивные вещества, буферы, соли для регуляции осмотического давления, эмульгаторы, подслащивающие вещества, красящие агенты, агенты улучшающие вкус и запах и т.п. Количество активных ингредиентов в фармацевтической композиции этого изобретения могут варьировать в широком диапазоне в зависимости от известных факторов, таких как,например, стадия и тяжесть инфекции, вес тела пациента, тип дозированной формы, способ введения, число дозированных форм, вводимых в день, и эффективность активных ингредиентов. Однако, оптимальное количество будет определено легко и обычным образом специалистом с квалификацией в данной области. Предпочтительно количество глицерризиновой кислоты, лизоцима и/или лактоферрина в дозированной форме данного изобретения будет таким, что оно обеспечивает суточное введение 0,25 - 8 мг/мл глицирризиновой кислоты, 0,5 10 мг/мл лизоцима и/или 0,1 - 4 мг/мл лактоферрина. Еще более предпочтительно, оно будет таким, что оно обеспечивает суточное введение 0,5 - 2 мг/мл глицирризиновой кислоты, 0,5 - 4 мг/мл лизоцима или 0,25 - 1 мг/мл лактоферри 003126 4 на. Дозированные формы фармацевтической композиции этого изобретения могут быть приготовлены в соответствии со способами, которые хорошо известны фармацевту, и включают в себя смешивание, гранулирование, прессование, растворение и т.п. Следующие далее примеры предназначены для иллюстрации этого изобретения без его какого-либо ограничения. В экспериментах использовали следующие соединения:- вирус простого герпеса типа 1, поставляемый NIH, Rockville, Maryland;- клетки VERO из почки Африканской зеленой мартышки из ICN ELOW, Costa Mesa, CA;- модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM), дополненную фетальной телячьей сывороткой, инактивированной в течение 30 мин при 56 С, поставляемой ICN FLOW, CostaVERO высевали на 24-луночные планшеты и инфицировали приблизительно 1 HSV1-вирусной инфицирующей единицей х 100 клеток в течение одного часа при комнатной температуре. Затем различные количества от 0 до 8 мг/мл куриного лизоцима, лизоцима индюка и лизоцима человека добавляли в термостате при 37 С и в присутствии СО 2 (5%). После 48 ч, когда цитопатический эффект был полным в контроле, эти клетки замораживали и размораживали дважды для индуцирования разрушения и, следовательно, высвобождения вируса. Концентрацию инфицирующих вирусных частиц, полученную для каждого разведения лизоцима, титровали после центрифугирования. Титрование проводили разведением содержимого каждой лунки от 10-1 до 10-7 и помещением его в контакт с клетками одноклеточного слоя в многолуночном планшете, имеющем 6 лунок(каждый), в течение 1 ч при комнатной температуре. После прохождения инфицирования клетки накрывали слоем питательного агара и, после 48 ч инкубирования, их окрашивали красителем нейтральным красным и считали макроскопически видимые вирусные бляшки. Таким образом,определяли процент ингибирования, полученный на вирусной бляшке лизоцимом, в сравнении с контролем. Полученные таким путем экспериментальные данные приведены в табл. 1. 5 Таблица 1. Ингибирование (%) вирусных бляшек различными лизоцинами Доза (мг/мл) 0 8 6 4 2 1 Куриный 0 933 824 716 606 49+5 Индюшачий 0 895 804 685 556 455 Человеческий 0 905 796 704 594 453 Процент от контролястандартное отклонение.i) значимо ингибирует образование бляшек герпетического вируса на клетках VERO;ii) это действие является зависимым от дозы;iv) доза 50% ингибирования (ID50) равна 1 мг/мл; 2) индюшачий и человеческий лизоцим обнаружили антигерпетическую активность,сходную с активностью куриного лизоцима. Пример 2. Его проводили, как пример 1, за исключением того, что разные количества от 0 до 1 мг/мл только глицирризиновой кислоты добавляли к одноклеточным слоям клетокVERO, инфицированных HSV1. Эти экспериментальные результаты показаны в табл. 2. Таблица 2. Ингибирование глицирриновой кислотой (%) вирусных бляшек Дозы (мг/мл) 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Ингибирование (%) 0 104 277 508 7512 Пример 3. Его проводили, как пример 1, за ислючением того, что 0,5 мг/мл глицирризиновой кислоты и различные количества куриного лизоцоима от 0 до 1 мг/мл добавляли к одноклеточным слоям клеток VERO, инфицированныхHSV1. Эти экспериментальные результаты показаны в табл. 3. Таблица 3. Ингибирование (%) вирусных бляшек (глицирризиновая кислота 0,5 мг/мл + различные дозы куриного лизоцима) Куриный лизоцим/ 0,2 0,4 0,6 0,8 1 дозы (мг/мл) Ингибирование (%) 726 838 858 879 888 Как можно видеть из табл. 3, ассоциации глицирризиновой кислоты и лизоцимов характеризуются заметным синергическим действи 6 ем. Например, в связи с суммой активностей,измеряемых отдельно (табл. 1 и 2), ингибирование (%), ожидаемое для ассоциации, содержащей 0,5 мг/мл куриного лизоцима и 0,5 мг/мл глицирризиновой кислоты, равное приблизительно 35-40%. В противоположность этому результаты, показанные в табл. 3, доказывают,что ингибирование (%) этой ассоциации равно приблизительно 84%. Этот синергизм подтверждается индексомFIC, который в этом случае испытания равен 0,125. Как известно, индекс FIC (фракционированные ингибирующие концентрации) получают делением концентрации 50% ингибирования. вируса смеси двух продуктов на дозу 50% ингибирования вируса каждого продукта в отдельности. Индекс FIC0,5 означает, что имеется значимый синергизм между этими двумя продуктами. Пример 4. Его проводили, как пример 1, за исключением того, что различные количества бычьего и человеческого лактоферрина добавляли к одноклеточным слоям клеток VERO, инфицированных HSV1. Экспериментальные данные, полученные таким образом, приведены в табл. 4. Таблица 4(мг/мл) Бычий лактоферрин 2 0,25 Человеческий лактоферрин 3 0,25 Токсичность, выраженная в виде минимальной токсической дозы, на 50% этих клеток;доза, ингибирующая 50% вирусных бляшек на клетках Табл. 4 показывает, что эти лактоферрины являются не очень токсичными и что их действие на вирус уже очень хорошо выражено при уровнях, значимо более низких, чем токсичные уровни. Пример 5. Его проводили, как пример 1, за исключением того, что 0,5 мг/мл глицирризиновой кислоты и различные количества от 0 до 1 мг/мл человеческого лактоферрина добавляли к одноклеточным слоям клеток VERO, инфицированных HSV1. Таблица 5. Ингибирование (%) вирусных бляшек (глицирризиновая кислота 0,5 мг/мл + различные дозы лактоферрина человека) Доза лактоферрина человека 0 0,0075 0,015 0,031 0,062 0,125 0,250 0,5 1 Ингибирование (%) 302 304 506 505 6010 8015 100 100 100 Как можно видеть из табл. 5, ассоциации глицирризиновой кислоты и лактоферрина характеризуются заметным синергическим действием, например, в связи с суммой активностей,измеряемых отдельно (табл. 2 и 4), ингибирование (%), ожидаемое для ассоциации, содержащей 0,25 мг/мл лактоферрина и 0,5 мг/мл глицирризиновой кислоты, равно приблизительно 65-75%. В противоположность этому результаты, показанные в табл. 5, доказывают, что ингибирование (%) этой ассоциации равно приблизительно 100%. Этот синергизм подтверждается индексом вой кислоты, 0,1 мг/мл лактоферрина человека и различные количества от 0 до 1 мг/мл куриного лизоцима добавляли к одноклеточным слоям клеток VERO, инфицированных HSV1. Эти экспериментальные результаты показаны в табл. 6. Таблица 6. Ингибирование (%) вирусных бляшек (глицирризиновая кислота 0,5 мг/мл и лактоферрин человека 0,1 мг/мл+ различные дозы куриного лизоцима) Куриный лизоцим/дозы 0 0,25 0,5 0,75 1 Как можно видеть из табл. 6, ассоциации глицирризиновой кислоты, лактоферрина и лизоцимов характеризуются заметным синергическим действием. Например, в связи с суммой активностей, измеряемых отдельно, ингибирование (%), ожидаемое для ассоциации, содержащей 0,1 мг/мл лактоферрина, 0,5 мг/мл глицирризиновой кислоты и 0,5 мг/мл лизоцима,равно приблизительно 65%. В противоположность этому результаты, показанные в табл. 6,доказывают, что ингибирование (%) этой ассоциации равно приблизительно 98%. 8 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Антивирусная фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит глицирризиновую кислоту и, по меньшей мере,один белок, имеющий активность в отношении вируса простого герпеса типа 1, при условии,что когда указанный выше белок является лизоцимом и композиция находится в форме водного раствора, она не содержит соли щелочного или щелочно-земельного металла. 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем,что указанный белок является лизоцимом и/или лактоферрином. 3. Композиция по п.2, отличающаяся тем,что лизоцим выбран из группы, включающей куриный лизоцим, лизоцим индюка, лизоцим человека, инактивированный нагреванием куриный лизоцим, куриный лизоцим, расщепленный трипсином. 4. Композиция по п.2, отличающаяся тем,что лактоферрин является человеческим или бычьим лактоферрином.