Димерные тромбопоэтиновые пептидные миметики, связывающие мpl рецептор и имеющие тромбопоэтичеcкую активность

1 Область изобретения В целом, изобретение относится к соединениям, в частности, пептидам и полипептидам,которые обладают тромбопоэтической активностью. Заявленные соединения могут быть использованы для увеличения образования тромбоцитов или предшественников тромбоцитов(например, мегакариоцитов) у млекопитающих. Сущность изобретения Изобретение относится к соединениям, в частности, пептидам, которые способны стимулировать in vitro и in vivo образование тромбоцитов и их предшественников, таких, как мегакариоциты. Прежде, чем обсуждать природу заявленных соединений, остановимся на описании двух белков, обладающих тромбопоэтической активностью: тромбопоэтина (ТРО) и фактора роста и развития мегакариоцитов (MGDF). Клонирование эндогенного тромбопоэтинаChemistry 270: 511-514 (1995 быстро расширило наши знания о мегакариопоэзе (образовании мегакариоцитов) и тромбопоэзе (образовании тромбоцитов). Эндогенный ТРО человека представляет собой гликозилированный белок размером 60 - 70 кДа, состоящий из 332 аминокислот, в первую очередь образующийся в печени и почках (Bartley et al., Cell 77: 1117-1124 (1994);Chang et al., Journal of Biological Chemistry 270: 511 - 514 (1995. Белок является высококонсервативным у различных видов и имеет 23% гомологии с эритропоэтином человека (Gurney etal., Blood 85: 981-988 (1995 на аминоконцевом участке (аминокислоты 1 - 172) (Bartley et al.,Cell 77: 1117-1124 (1994. Показано, что эндогенный ТРО обладает всеми свойствами ключевого биологического регулятора тромбопоэза. Его активность in vitro включает специфическую индукцию мегакариоцитных колоний как из очищенных гематопоэтических стволовых клеток мыши (Zeigler et al., Blood 84: 4045-4052(1994 и CD34+ клеток человека (Lok et al., Nature 369: 568-571 (1994); Rasko et al., Stem Cells 15: 33:42 (1997, генерацию развития мегакариоцитов с повышенной плоидностью (Broudyet al., Blood 85:402-413 (1995 и индукцию окончательного созревания мегакариоцитов и образования тромбоцитов (Zeigler et al., Blood 84: 4045-4052 (1994); Choi et al., Blood 85: 402413 (1995. Наоборот, синтетические антисмысловые олигодезоксинуклеотиды к рецептору ТРО (с-Мрl) значительно ингибируют колониеобразующую способность предшественников мегакариоцитов (Methia et al., Blood 82: 13951401(1993. Более того,c-Mplнокаутированные мыши страдают тяжелой тромбоцитопенией и дефицитны по мегакарио 003998(rHuMGDF, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) представляет собой другой тромбопоэтический полипептид, родственный ТРО. Он получен при использовании бактерий Е. coli, трансформированных плазмидой, содержащей кДНК, кодирующей усеченный белок, соответствующий аминоконцевому связывающему рецептор домену ТРО человека (Ulich et al., Blood 86: 971976 (1995. Полипептид экстрагируют, переукладывают и очищают; далее к аминоконцевому участку присоединяют полиэтиленгликоль(ПЭГ). Полученное в результате соединение обозначают как PEG-rHuMGDF или MGDF для краткости. Различные исследования на животных моделях (Ulich, Т. R. et al., Blood 86: 871-976(1995 явным образом продемонстрировали терапевтическую эффективность ТРО и MGDF при трансплантации костного мозга и терапии тромбоцитопении, которая часто возникает в результате химиотерапии или радиационной терапии. Предварительные данные, полученные на людях, подтвердили полезность MGDF для повышения количества тромбоцитов в различных случаях. (Basser et al., Lancet 348: 127981/1996); Kato et al., Journal of Biochemistry 119: 229-236 (1995); Ulich et al., Blood 86: 971-976(1995. MGDF может быть использован для увеличения количества донорных тромбоцитов,поскольку введение MGDF повышает число циркулирующих тромбоцитов примерно в 3 раза по сравнению с первоначальным у здоровых доноров тромбоцитов. ТРО и MGDF проявляют свое действие посредством связывания с c-Mpl-рецептором, который преимущественно экспрессируется на поверхности некоторых гематопоэтических клеток, таких как мегакариоциты, тромбоциты,CD34 клетки и примитивные клетки-предшественники (Debili, N. et al., Blood 85: 391-401(1994. Подобно большинству рецепторов для интерлейкинов и белковых гормонов, с-Мрl принадлежит к классу I суперсемейства цитокиновых рецепторов (Vigon, I. et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89: 5640-5644 (1992. Активация указанного класса рецепторов включает индуцированную лигандом гомодимеризацию рецептора, которая, в свою очередь, запускает каскад передающих сигнал реакций. В целом, взаимодействие белкового лиганда с соответствующим рецептором часто имеет место на относительно протяженной поверхности раздела. Однако, как показано в случае связывания гормона роста человека со своим рецептором, только несколько ключевых остатков 3 на указанной поверхности действительно обеспечивают наибольший вклад в энергию связывания (Clackson, Т. et al., Science 267:383-386(1995. Указанное обстоятельство, а также тот факт, что основная часть оставшегося белкового лиганда служит только для экспонирования связывающих эпитопов в правильной топологии,позволяет обеспечить поиск активных лигандов много меньшего размера. С указанной целью использовали фаговую систему экспонирования пептидной библиотеки, как действенную методику идентификации небольших по размеру пептидных миметиков крупных белковых лигандов (Scott, J. К. et al.,Science 249: 386 (1990); Devlin, J. J. et al., Science 249: 404 (1990. При использовании указанного подхода были обнаружены небольшие пептидные молекулы, которые действуют как агонистыc-Mpl-рецептора (Cwirla, S. Е. et al., Science 276: 1696-1699 (1997. В данном исследовании выборочные небольшие пептидные последовательности, экспонированные как белки слияния с белками оболочки нитчатых фагов, были аффинноэлюированы против иммобилизованного с антителами внеклеточного домена c-Mpl и необходимые фаги были обогащены во втором раунде аффинной очистки. Связывающую селекцию и процесс повторного размножения осуществляли много раз для получения обогащенного пула белков с более высокой связывающей способностью. В результате были изначально получены два семейства c-Mpl-связывающих пептидов,неродственных друг другу по структуре. Затем создавали мутагенизированные библиотеки для дальнейшей оптимизации белков с наилучшей связывающей способностью, что привело к выделению очень активного пептида с IС 50 = 2 нМ и ЕС 50 = 400 нМ (Cwirla, S. E. et al., Science 276: 1696-1699 (1997. Указанный пептид из 14 аминокислотных остатков, обозначенный как ТМР (от англ. ТРО Mimetic Peptide, пептид,имитирующий ТРО), не обнаруживает явной гомологии по аминокислотной последовательности с ТРО или MGDF. Структура ТМР приведена ниже:EEGPTLRQWLAARA (однобуквенное обозначение аминокислот). Предварительно, в сходном исследовании миметических пептидов ЕРО с помощью той же самой технологии был обнаружен миметический пептид ЕРО (EMP) (Wrighton, N. С. et al.,Science 273:458-463 (1996 и было показано,что он функционирует как димер при связывании сЕРО-рецептором (EPOR). Образованный таким образом комплекс (лиганд)2/(рецептор)2 имеет С 2 симметрию в соответствии с данными рентгеновской кристаллографии (Livnah, О. etal., Science 273:464-471(1996. На основе ука 003998 4 занной информации о структуре был сконструирован ковалентно связанный димер ЕМР, у которго С-концевые участки двух ЕМРмономеров были перекрестно сшиты с гибким спейсером и было обнаружено, что он обладает существенно усиленной способностью к связыванию так же, как и in vivo/in vitro биоактивностью (Wringhton, N. С. et al., Nature Biotechnology 15: 1261-1265 (1997. Сходная стратегия димеризации Сконцевых участков была применена по отношению к ТРО миметическому пептиду (ТMP)(1997. Было обнаружено, что димер ТМР, связанный по С-концевому участку (С-С связь),обладает улучшенной связывающей аффинностью 0,5 нМ и существенно увеличенной активностью in vitro (ЕС 50 = 0,1 нМ) в исследовании клеточной пролиферации (Cwirla, S. E. et al.,Science 276: 1696-1699 (1997. Структура указанного С-С димера ТМР приведена ниже: Согласно другому аспекту изобретения,тандемные димеры могут быть далее прикреплены к одной или более структурам, которые происходят из иммуноглобулиновых белков,преимущественно относящихся к Fc-участку таких иммуноглобулинов. Полученные в результате соединения представляют собой белки слияния Fc и тандемных димеров. Ниже приведено краткое описание Fcучастков антител, которое полезно для понимания некоторых аспектов заявленного изобретения. Антитела состоят из двух функционально независимых участков, вариабельного домена,известного как Fab, который связывает антиген,и константного домена, известного как Fc, который обеспечивает эффекторные функции антител, например, связывание комплемента и фагоцитоз. Fc-участок иммуноглобулинов имеет продолжительное время полужизни в плазме крови, в то время как Fab-домен - короткое (Capon, et al., Nature 337: 525-531 (1989. Терапевтические белковые продукты конструируют при использовании Fc-домена для прикрепления к целевому белку с целью обеспечения более продолжительного времени полужизни целевого белка или придания такому белку функций, свойственных Fc-участку иммуноглобулинов, а именно связывания с Fcрецептором, связывания с белком А, связывания комплемента и переноса через плацентарный барьер (Capon, et al., Nature 337: 525-531 (1989. Например, Fc-участок антитела IgGl был слитCD30-a, молекулой, которая связывает CD30 5 рецепторы, экспрессируемые на опухолевых клетках при болезни Ходжкина, анаплазийных лимфомных клетках, Т-клетках при лейкозе и других типах клеток при злокачественных опухолях. См., например, патент США 5 480 981.IL-10, антивоспалительный, препятствующий отторжению агент был слит с Fc2a мыши для увеличения его времени полужизни при циркуляции в крови, которое обычно короткое (Zheng,X. et al., The Journal of Immunology, 154: 55905600 (1995. Также было обеспечено использование рецептора фактора некроза опухолей, связанного с Fc-участком IgGl человека, для лечения больных с септическим шоком (Fisher, С. etZee, K. et al., The Journal of Immunology, 156: 2221-2230 (1996. Fc-участок также был слит с СD4-рецептором для получения терапевтического белка с целью лечения СПИДа. См. CaponIg63 для увеличения его короткого времени полужизни и преодоления системной токсичности. См., Harvill et al., Immunotechnology, 1:95105(1995). При известности и доступности ТРО иMGDF существует потребность в разработке дополнительных соединений, обладающих биологической активностью в отношении стимулирования продукции тромбоцитов (тромбопоэтическая активность) и/или клеток-предшественников тромбоцитов, в особенности, мегакариоцитов (мегакариопоэтическая активность). Настоящее изобретение относится к новым соединениям, обладающим такой активностью, и соответствующим объектам. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к группе соединений, которые способны связываться сc-Mpl-рецептором, который является тем же самым рецептором, что и рецептор, опосредующий активность эндогенного тромбопоэтина(ТРО), и за счет этого, т. е. активации указанного рецептора, запускать трансмембранный сигнал. Таким образом, заявленные соединения обладают тромбопоэтической активностью, т. е. способностью стимулировать in vivo и in vitro продукцию тромбоцитов, и/или мегакариоцитарной активностью, т. е. способностью стимулировать in vivo и in vitro продукцию предшественников тромбоцитов. Согласно первому предпочтительному варианту осуществления изобретения, заявленные соединения имеют следующую общую структуру: TMP1-(L1)n-TMP2, где ТМР 1 и ТМP2 каждый независимо друг от друга выбраны из группы соединений, имеющих коровую структуру: Х 2 - Х 3- Х 4 - X5 - Х 6 - Х 7 - X8 - Х 9 - Х 10,причем Х 2 выбран из группы, включающей Glu,Asp, Lys и Val;n является 0 или 1; заявлены также физиологически приемлемые соли указанных соединений. В одном случае L1 представляет собой(Gly)n, где n равняется 1-20 и когда n больше 1,то до половины остатков Gly могут быть замещены другими аминокислотными остатками,выбранными из остальных 19 природных аминокислот или их стереоизомеров. Помимо коровой структуры X2-X10, показанной выше для TMP1 и TMP2, возможны также другие родственные структуры, причем один или более из указанных ниже элементов добавляется к ТМР 1 и/или ТМP2 коровой структуре:X14 выбран из группы, включающей Ala,Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu и Gly. В другом предпочтительном случае заявленные соединения имеют общую формулу:(Fс)m - (L2)q - ТМР 1 - (L1)n - ТМР 2 - (L3)r (Fc)p,причем ТМР 1, ТМР 2 и n описаны выше; L1,L2 и L3 представляют собой линкерные группы,которые каждая по себе независимо друг от друга выбраны из линкерных групп, описываемых здесь; Fc представляет собой Fc-участок иммуноглобулина (как определено здесь ниже); значения m, p, q и r каждое по себе независимо друг от друга выбраны из группы, включающей 0 и 1, причем по крайней мере одно из значенийm или р равно 1 и далее, если m равно 0, то q равно 0, и если р равно 0, то r равно 0; также заявлены физиологически приемлемые соли указанных соединений.(Gly)n, где n равняется 1-20 и когда n больше 1,то до половины остатков Gly могут быть замещены другими аминокислотными остатками,выбранными из остальных 19 природных аминокислот или их стереоизомеров. Производные описанных выше соединений(охарактеризованные ниже) также входят в объем изобретения. Соединения в соответствии с настоящим изобретением преимущественно являются пептидами и могут быть получены стандартными синтетическими методами или любыми другими методами получения пептидов. Те заявленные соединения, которые относятся к пептидным веществам, могут быть синтезированы стандартными реакциями, известными из органической химии, дополнительно к обычным реакциям, известным из химии пептидов, когда это необходимо. Заявленные в соответствии с настоящим изобретением соединения могут быть использованы для профилактических или терапевтических целей путем включения их в подходящие фармацевтически приемлемые материалыносители и введения в эффективном количестве индивидууму, например, человеку (или другому млекопитающему). В объем настоящего изобретения также включены другие родственные объекты. Краткое описание фигур Многочисленные другие аспекты и преимущества изобретения будут более понятны из детального описания, в котором приведены отсылки на следующие иллюстрации. На фиг. 1 показаны Fc полинуклеотидная и белковая последовательность (SEQ ID NO:3 кодирующая цепь в направлении считывания 5'3'; SEQ ID NO:4 представляет собой комплементарную цепь в направлении считывания 3'5'; SEQ ID NO:5 является кодируемой аминокислотной последовательностью) IgGl человека, которые могут быть использованы для получения Fc-слитых соединений, заявленных в соответствии с изобретением. На фиг. 2 приведена схема получения пэгированного пептида 19 (SEQ ID NO:17). На фиг. 3 приведена схема получения пэгированного пептида 20 (SEQ ID NO:18). На фиг. 4 показано число тромбоцитов,образовавшихся in vivo у нормальных самок мышей BDF1, обработанных в дозе 100 мкг/кгболюсной инъекцией различных соединений,представленных следующим образом: PEGMGDF обозначает нативный ТРО человека, к Nконцевой аминогруппе которого путем восстановительного аминирования аминокислот 1-63 присоединен PEG средней мол. массы около 20 кДа, экспрессированный в бактериях Е. coli (поэтому он не является гликозилированным) (см. заявку WO 95/26746, озаглавленную Компози 003998 8 ции и способы стимулирования роста и дифференцировки мегакариоцитов); ТМР обозначает соединение SEQ ID NO:1; TMP-TMP обозначает соединение SEQ ID NO:21; PEG-ТМР-ТМР обозначает соединение SEQ ID NO:18, причем группа PEG имеет среднюю мол. массу PEGa,прикрепленного, как показано на фиг. 3; TMPTMP-Fc определено ниже и Fc-TMP-ТМР обозначает то же самое, за исключением того, чтоBDF1, обработанных различными соединениями, которые доставлены посредством имплантированного осмотического насоса в 7-дневный период. Соединения определены так же, как указано в описании к фиг. 4. На фиг. 6 А, 6 В и 6 С показаны схематические диаграммы предпочтительных соединений,заявленных в соответствии с настоящим изобретением. На фиг. 6 А показано Fc-соединение слияния, причем Fc-участок слит с N-концевым участком ТМР-димера и представлен мономерной формой (одна цепь). На фиг. 6 В показаноFc-соединение слияния, причем Fc-участок слит с N-концевым участком ТМР-димера и представлен димерной формой, а каждый Fcмономер прикреплен к ТМР-димеру. Детальное описание предпочтительных вариантов изобретения Для того, чтобы найти соединения небольшого размера в качестве терапевтических агентов с наиболее желаемыми свойствами, были сконструированы различные типы димеров ТМР и родственных структур, характеризующиеся тем, что С-концевые участки ТМРпептида были соединены с N-концевыми участками второго ТМР-пептида как непосредственным образом, так и посредством линкера, и далее были исследованы эффекты такой стратегии димеризации на биологическую активность полученных указанным образом димерных молекул. В некоторых случаях указанные так называемые тандемные димеры (C-N-связь) конструируют таким образом, чтобы линкеры находились между двумя мономерами, причем линкеры, предпочтительно, относятся к природным аминокислотам, так, чтобы их можно было синтезировать с помощью рекомбинантных технологий. Настоящее изобретение основано на обнаружении группы соединений, которые обладают тромбопоэтической активностью и проявляют свою активность путем связывания с эндогенным ТРО-рецептором, а именно c-Mpl. 9 Соединения и их производные Согласно первому предпочтительному варианту осуществления изобретения, заявленные соединения имеют следующую общую структуру:TMP1-(L1)n-TMP2,где ТМР 1 и ТМP2 каждый независимо друг от друга выбраны из группы соединений, имеющих коровую структуру: Х 2 - Х 3- Х 4 - X5 - X6 - Х 7 - X8 - X9 - X10,причем Х 2 выбран из группы, включающей Glu,Asp, Lys и Val;n является 0 или 1; заявлены также физиологически приемлемые соли указанных соединений. В одном случае L1 представляет собой(Gly)n, где n равняется 1-20 и когда n больше 1,то до половины остатков Gly могут быть замещены другими аминокислотными остатками,выбранными из остальных 19 природных аминокислот или их стереоизомеров. Помимо коровой структуры X2-X10, показанной выше для TMP1 и ТМP2, возможны также другие родственные структуры, причем один или более из указанных ниже элементов добавляется к ТМР 1 и/или ТМP2 коровой структуре:X14 выбран из группы, включающей Ala,Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu и Gly. Термин ТМР относится к соединению,которое включает по меньшей мере 9 субъединиц (Х 2 - X10), причем Х 2 - X10 имеют коровую структуру. Х 2 - X14 субъединицы предпочти 003998 10 тельно являются аминокислотами, независимым образом выбранными из 20 природных аминокислот, однако, изобретение охватывает соединения, в которых Х 2 - Х 14 независимым образом выбраны из группы нетипичных, неприродных аминокислот, хорошо известных из уровня техники. Специфические предпочтительные аминокислоты идентифицированы для каждого положения. Например, Х 2 может быть Glu, Asp,Lys или Val. Здесь применен как трехбуквенный, так и однобуквенный код обозначения аминокислот; в каждом случае используются стандартные аббревиатуры для 20 природных аминокислот или их хорошо известных вариантов. Указанные аминокислоты могут относиться как к L, так и к D стереоизомерам (за исключением Gly, который не имеет ни L, ни D стереоизомерии), и TMPs могут включать комбинации стереоизомеров. Однако L-стереоизомеры предпочтительны для всех аминокислот ТМР-цепи. Изобретение также относится к обратным (ревертированным) ТМР-молекулам, когда аминоконцевая и карбокси-концевая последовательности аминокислот ревертированы. Например,реверсия молекулы, в норме имеющей последовательность X1 - X2 - X3, приведет к последовательности Х 3 - Х 2 - Х 1. Изобретение также охватывает обратно ревертированные ТМР-молекулы, причем, подобно ревертированным ТМР,аминоконцевая и карбоксиконцевая последовательности аминокислот ревертированы и остатки, которые в норме являются L-энатиомерами в ТМР, изменены с образованием D-стереоизомерной формы. Кроме того, в объем изобретения включены физиологически приемлемые соли TMPs. Физиологически приемлемые соли означают любые соли, в отношении которых известно или будет обнаружено позднее, что они являются физиологически приемлемыми. Некоторые специфические предпочтительные варианты включают ацетат, трифторацетат, гидрохлорид, гидробромид, сульфат, цитрат, тартрат, гликолят,оксалат. Также подразумевается, что описанные выше TMPs могут быть производными TMPs. Такие производные TMPs включают соединения, в которых осуществлены одна или более описанных ниже модификаций: один или более пептидил [-C(O)NR-]-мостиков (связей) замещен непептидильным мостиком, таким как-СН 2-карбаматный мостик [-CH2-OC(O)NR-]; фосфонатный мостик; -СН 2-сульфонамид [-CH2S(O)2NR-] мостик; мочевина [-NHC(O)NH-] мостик; -СН 2-вторичный амин мостик или алкилированный пептидильный мостик [-C(O)NR6,где R6 представляет собой низший алкил]; пептиды, причем N-концевой участок дериватизирован в -NRR1 группу; -NRC(O)R группу;-NHC(O)NHR группу, где R и R1 являются водородом или низшим алкилом с условием, что R 11 и R1 не являются оба водородом; сукцинимидную группу; бензилоксикарбонил -NH-(CBZNH-) группу; бензилоксикарбонил -NH-группу,имеющую от 1 до 3 заместителей фенилового кольца, выбранных из группы, включающей низший алкил, низший алкокси, хлор и бром; и пептиды, в которых свободные С-концевые участки дериватизированы в структуру -C(O)R2, гдеR2 выбран из группы, включающей низший алкокси и -NR3R4, где R3 и R4 независимо друг от друга выбраны из группы, включающей водород и низший алкил. Под низшим понимается группа, имеющая от 1 до 6 атомов углерода. Кроме того, в молекулу ТМР могут быть введены модификации индивидуальных аминокислот путем обеспечения реагирования аминокислотных остатков-мишеней пептида с органическим дериватизирующим агентом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или концевыми группами. Сказанное иллюстрируется следующим. Лизинильные и аминоконцевые остатки могут реагировать с янтарным ангидридом и ангидридом карбоновой кислоты. Дериватизация такими агентами имеет эффект реверсии заряда лизинильных остатков. Другие подходящие реагенты для дериватизации альфа-аминосодержащих остатков включают имидоэфиры,такие как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензолсульфоновую кислоту, О-метилизомочевину, 2,4-пентандион и катализируемую трансаминазой реакцию с глиоксилатом. Аргинильные остатки могут быть модифицированы путем реакции с одним или несколькими соответствующими реагентами, среди которых фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2 циклогександион и нингидрин. Дериватизация аргинильных остатков требует прохождения реакции в щелочных условиях, поскольку рКа гуанидиновой функциональной группы имеет высокое значение. Более того, указанные реагенты могут взаимодействовать с лизиновыми группами так же, как и с аргинин-гуанидиновыми группами. Специфическая модификация тирозильных остатков per se интенсивно изучалось, особый интерес вызвало введение спектральных меток в тирозильные остатки путем обеспечения реакции с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометана. В более общих случаяхN-ацетилимидизол и тетранитрометан могут быть использованы для формирования О-ацетил тирозильных групп и 3-нитропроизводных соответственно. Карбоксильные боковые группы (аспартил или глутамил) могут быть избирательно модифицированы путем обеспечения реакции с карбодиимидами (R'-N=C=N-R'), такими как 1 циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилпептил)карбодиимид. Более того, аспартильные или 12 глутамильные остатки могут быть конвертированы в аспарагинильные и глутаминильные остатки путем обеспечения реакции с ионами аммония. Глутаминильные и аспарагинильные остатки часто деамидированы по сравнению с соответствующими глутамиловыми и аспартиловыми остатками. Альтернативно, указанные остатки могут быть деамидированы в среднещелочных условиях. Форма указанных остатков также включена в объем заявленного изобретения. Дериватизация бифункциональными агентами полезна для перекрестного связывания пептидов или их функциональных производных с водонерастворимым поддерживающим матриксом или с другими макромолекулярными носителями. К обычно используемым перекрестно-связывающим агентам относятся, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, N-гидроксисукцинимидные эфиры,например, эфиры 4-азидосалициловой кислоты,гомобифункциональные имидоэфиры, в том числе дисукцинимидильные эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-Nмалеимидо-1,8-октан. Дериватизирующие агенты, такие как метил-3[(р-азидофенил)дитио] пропиомидат, обеспечивают образование фотоактивируемых интермедиатов, способных к образованию перекрестных связей в присутствии света. Альтернативно, реакционноспособные водорорастворимые матриксы, такие как углеводы, активированные цианогенбромидом, и реакционноспособные субстраты, описанные в Патентах США 3 969 287; 3 691 016; 4 195 128; 4 247 642; 4 229 537 и 4 339 440, могут быть использованы для иммобилизации белка. Другие возможные модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп сериловых или треониловых остатков, оксидацию атома серы Cys, метилирование альфа-аминогрупп лизиновых, аргининовых и гистидиновых боковых цепей (Creighton, Т. Е., Proteins: StructureN-концевого амина и, в некоторых случаях,амидирование С-концевых карбоксильных групп. Такие дериватизированные группы предпочтительно улучшают одно или более свойств заявленных соединений, в том числе тромбопоэтическую активность, растворимость, абсорбцию, биологическое время полужизни и т. д. Альтернативно, дериватизированные группы обеспечивают то, что полученные соответствующим путем соединения имеют те же самые или практически те же самые свойства, что и соединения, которые не подверглись дериватизации. Указанные группы могут также альтернативным образом элиминировать или ослаб 13 лять какой-либо нежелательный побочный эффект заявленных соединений и тому подобное. Кроме коровой структуры X2-X10, охарактеризованной выше, специальным образом раскрываются и другие структуры, в частности, те,в которых одна или более дополнительных X групп прикреплены к коровой структуре. Таким образом, X1 и/или X11, X12, X13 и X14 могут быть прикреплены к коровой структуре. Примерами таких дополнительных структур являются следующие: Х 2-Х 3-Х 4-Х 5-Х 6-Х 7-Х 8-Х 9-Х 10-Х 11; Х 2-Х 3-Х 4-Х 5-Х 6-Х 7-Х 8-Х 9-Х 10-Х 11-Х 12; Х 2-Х 3-Х 4-Х 5-Х 6-Х 7-Х 8-Х 9-Х 10-Х 11-Х 12-Х 13; Х 2-Х 3-Х 4-Х 5-Х 6-Х 7-Х 8-Х 9-Х 10-Х 11-Х 12-Х 13-Х 14; Х 1-Х 2-Х 3-Х 4-Х 5-Х 6-Х 7-Х 8-Х 9-Х 10; Х 1-Х 2-Х 3-Х 4-Х 5-Х 6-Х 7-Х 8-Х 9-Х 10-Х 11; Х 1-Х 2-Х 3-Х 4-Х 5-Х 6-Х 7-Х 8-Х 9-Х 10-Х 11-Х 12; Х 1-Х 2-Х 3-Х 4-Х 5-Х 6-Х 7-Х 8-Х 9-Х 10-Х 11-Х 12-Х 13; Х 1-Х 2-Х 3-Х 4-Х 5-Х 6-Х 7-Х 8-Х 9-Х 10-Х 11-Х 12-Х 13-Х 14,где X1-X14 описаны выше. ТМР 1 или ТМР 2 могут быть одинаковыми или различаться по длине и/или структуре последовательности. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения ТМР 1 и ТМР 2 одинаковы. Особенно предпочтительна следующая структура ТМР:Ilе-Glu-Gly-Рrо-Тhr-Leu-Аrg-Gln-Тrp-Leu-АlаАlа-Аrg-Аlа (SEQ ID NO:1). Используемое здесь понятие имеющее структуру означает, inter alia, что соединение может включать дополнительные аминокислоты на С-концевом участке или на обоих участках последовательности. Однако если имеется структура X2-X10, X1-X14 или одна из других последовательностей, приведенных в качестве примеров, остающаяся химическая структура является относительно менее важной. Безусловно, любая структура за пределами коровой структуры X2-X10 или Х 1-Х 14 не будет оказывать существенного влияния на тромбопоэтическую активность заявленных соединений. Например,N-концевой остаток метионина входит в объем притязаний. Кроме того, несмотря на то, что многие предпочтительные заявленные соединения являются тандемными димерами, поскольку содержат два компонента ТМР, другие заявленные соединения являются тандемными мультимерами TMPs, т. е., например, соединениями следующей структуры:TMP1 - L-TMP2-L-TMP3; ТМР 1 -L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4; ТМР 1 -L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-TMP5; причем ТМР 1, ТМР 2, ТМР 3, ТМР 4 и ТМР 5 могут иметь одинаковую или различную структуру, а каждый из элементов ТМР и L определен, как указано здесь, и каждый из линкеров является факультативным. Предпочтительно заявленные соединения включают 2-5 элементов ТМР, особенно предпочтительно 2-3 и более предпочтительно 2. В первом случае заявленные соединения предпочтительно содержат менее 14 60, более предпочтительно менее 40 аминокислот в целом (т. е. они являются пептидами). Как указывалось выше, заявленные в соответствии с первым возможным вариантом осуществления изобретения соединения предпочтительно являются ТМР-димерами, которые или связаны непосредственным образом, или с помощью линкерной группы. Мономерные ТМРкомпоненты показаны в соответствующей ориентации считывания от N-концевого участка к С-концевому участку слева направо. Таким образом, можно видеть, что заявленные соединения все ориентированы таким образом, что Сконцевой участок ТMP1 прикреплен непосредственно или с помощью линкера к N-концевому участку TMP2. Такая ориентация считается тандемной ориентацией и заявленные соединения могут в целом считаться тандемными димерами. Такие соединения рассматриваются как димеры даже в том случае, когда ТМР 1 и ТМР 2 структурно различны, т. е. в объем изобретения включены как гомодимеры, так и гетеродимеры. Линкерная группа (L1) не является обязательной. Когда она присутствует, не является критическим фактором ее химическая структура, поскольку она в первую очередь служит спейсером. Линкер должен быть выбран таким образом, чтобы не влиять на биологическую активность конечного соединения, и чтобы иммуногенность конечного соединения существенно не повышалась. Линкер предпочтительно состоит из аминокислот, связанных между собой пептидными связями. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения линкер представляет собой Yn, гдеY представляет собой природную аминокислоту или ее стереоизомер, а n имеет значения от 1 до 20. Таким образом, линкер может включать от 1 до 20 аминокислот, соединенных между собой пептидными связями, причем аминокислоты выбраны из 20 природных аминокислот. В более предпочтительном случае от 1 до 20 аминокислот выбраны из Gly, Ala, Pro, Asn, Gln, Cys, Lys. Более предпочтительно, линкер состоит из большей части аминокислот, которые стерически не затруднены, например, Gly, GlyGly[(Gly)2], Gly-Gly-Gly[(Gly)3](Gly)20, Ala,Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala, и т. д. Другие специфические примеры линкеров приведены ниже:(эти структуры обеспечивают сайт гликозилирования при их получении в рекомбинантных клеточных системах млекопитающих, способных осуществлять гликолизирование по указанным сайтам);Asn Gly (SEQ ID NO:9). Например, (Gly)3Lys(Gly)4 означает GlyGly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. Также является предпочтительной комбинация Gly и Ala. 15 Возможно использование непептидных линкеров. Например, могут быть использованы алкильные линкеры, такие как -HN-(CH2)S-CO-,s = 20 - 20. Указанные алкильные линкеры могут быть далее замещены стерически незатрудненной группой, такой как низший алкил (например, С 1-С 6), низший ацил, галоген (например, Cl, Br), CN, NH2, фенил и т. д. К другому типу непептидного линкера относится группа полиэтиленгликоля, например:-HN-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-O-CH2-CO-,причем n имеет такое значение, что общая мол. масса линкера варьирует от около 101 до около 5000, предпочтительно, от 101 до 500. В целом, обнаружено, что линкер длиной около 0-14 субъединиц (например, аминокислот) предпочтителен для тромбопоэтических соединений первого варианта осуществления изобретения. Пептидные линкеры могут быть изменены с образованием производных тем же самым образом, как указано выше для TMPs. Соединения этой первой группы могут быть линейными или циклическими. Понятие циклический означает, что, по меньшей мере,два отдельных, т. е. не смежных участка молекулы, соединены друг с другом. Например, амино и карбоксиконцевые участки молекулы могут быть ковалентно связаны с формированием циклической молекулы. Альтернативно, молекула может содержать два или более остатковCys (например, в составе линкера), которые обеспечивают циклизацию за счет образования дисульфидных связей. Далее раскрывается, что более одного тандемного пептидного димера могут быть связаны между собой с образованием димера димеров. Таким образом, например,тандемный димер, содержащий остаток Cys,способен сформировать внутримолекулярную дисульфидную связь с Cys другого такого димера. См., например, соединение SEQ ID NO:20 ниже. Заявленные соединения могут быть также ковалентно или нековалентно связаны с молекулой-носителем, например, линейным полимером (полиэтиленгликолем, полилизином, декстраном и т. д.), полимером с разветвленной цепью (см., например, патент США 4 289 872, заявитель Denkenwalter et al., выданный 15.09.1981; Патент США 5 229 490, заявитель Таm, выданный 20.07.1993; заявка WO 93/21259, заявительFrechet et al., опубликованная 28.10.1993), липидом, холестероловой группой (такой, как стероид) или углеводом или олигосахаридом. Другие возможные носители включают один или более водорастворимых полимеров, таких как полноксиэтиленгликоль или полипропиленгликоль,как описано в патентах США 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144, 4 670 417, 4 791192 и 4179 337. К другим полезным полимерам, известным из уровня техники, относятся монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлоза или другие 16 полимеры на основе углеводов, поли(N-винилпирролидон)полиэтиленгликоль,сополимеры пропиленгликоля, сополимер полипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин) и поливиниловый спирт, а также смеси указанных полимеров. ПЭГ-группы, в основном, прикрепляются к заявленным соединениям посредством ацилирования, восстановительного алкилирования, добавления по Михаэлю, тиолового алкилирования или других методов хемоселективного конъюгирования/лигирования реакционноспособной группы ПЭГа (например, альдегидной,аминной, эфирной, тиоловой, -галоацетиловой,малеимидовой или гидразиновой) с реакционноспособной группой соединения - мишени (например, альдегидной, амминной, эфирной, тиоловой, -галоацетиловой, малеимидовой или гидразиновой). Углеводные (олигосахаридные) группы могут быть соответствующим образом прикреплены к тем сайтам, в отношении которых известно, что они являются сайтами гликозилирования в белках. В целом, О-связанные олигосахариды прикрепляются к остаткам серина (Ser) или треонина (Thr), в то время как N-связанные олигосахариды прикрепляются к остаткам аспарагина (Asn), когда они являются частью последовательности Asn-X-Ser/Thr, где X может быть любой аминокислотой, за исключением пролина. Структуры N-связанных или О-связанных олигосахаридов и остатков сахара в каждом типе молекул различны. Один тип сахара, который обычно обнаруживается в обоих типах молекул,является N-ацетилнейраминовой кислотой (известной как сиаловая кислота). Сиаловая кислота обычно является концевым остатком Nсвязанных и О-связанных олигосахаридов и благодаря своему отрицательному заряду могут придавать кислые свойства гликозилированному соединению. Такой (такие) сайт (сайты) могут быть включены в линкер заявленных соединений и предпочтительно гликозилируются клеткой в процессе рекомбинантного получения полипептидных веществ (например, клетками млекопитающих, таких как СНО, ВНК, COS). Однако такие сайты могут быть гликозилированы с помощью синтетических или полусинтетических методов, известных из уровня техники. Некоторые из заявленных пептидов приведены ниже. Используется однобуквенный аминокислотный код и линкеры выделены скобками для ясности. Дополнительные аббревиатуры ВrАс и PEG означают бромацетил (ВrСН 2 С(О и полиэтиленгликоль соответственно. В каждом из указанных выше соединений предполагается наличие N-концевого Met (или М при использовании однобуквенного кода). Также в объем изобретения входят мультимеры(например, тандемные и нетандемные, ковалентно связанные и нековалентно связанные) выше указанных соединений. Во втором варианте осуществления изобретения описанные выше соединения могут быть слиты с одной или более Fc-группами, как непосредственным образом, так посредством линкерных групп. В целом, формула соединений, входящих в указанную группу, следующая:(Fc)m - (L2)q - ТМР 1 - (L1)n - ТМР 2 - (L3)r - (Fc)p,причем TMP1, ТМP2 и n описаны выше; L1,L2 и L3 являются линкерными группами, каждая из которых независимо друг от друга выбрана из линкерных групп, описанных выше; Fc представляет собой участок иммуноглобулина; m, p,q и r независимо друг от друга выбраны из группы значений, включающих 0 и 1, причем,по крайней мере, m или р равно 1 и, если m равно 0, то q равно 0, а если р равно 0, то r равно 0; также заявлены физиологически приемлемые соли указанных соединений. Соответственно, соединения указанной второй группы имеют структурные особенности, как определено для первой группы выше,но они слиты по меньшей мере с одной Fcгруппой как непосредственным образом, так с помощью одной или более линкерных групп.Fc-последовательность описанных выше соединений может быть выбрана из тяжелой цепи IgGl человека(см. Ellison, J.W. etal., NucleicAcids Res. 10: 4071-4079 (1982 или любой другой Fc-последовательности, известной из уровня техники (например, другие классы IgG включают, но не ограничиваются IgG2, IgG3 и IgG4 или другие Ig). Хорошо известно, что Fc-участки антител состоят из мономерных полипептидных сегментов, которые могут быть связаны в димерные 18 или мультимерные формы посредством дисульфидных связей или нековалентным взаимодействием. Число внутримолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных Fc-молекул варьирует от 1 до 4 в зависимости от класса (например, IgG, IgA,IgE) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3,IgA1, IgA2) антител. Используемое здесь понятие Fc обычно для мономерных, димерных и мультимерных форм Fc-молекул. Следует отметить, что Fc-мономеры спонтанно димеризуются, когда в молекуле имеются соответствующие остатки Cys и не создадутся условия, предотвращающие димеризацию посредством дисульфидных связей. Даже если остатки Cys, которые в норме формируют дисульфидные связи в Fcдимере, удаляют или замещают другими остатками, мономерные цепи обычно димеризуются посредством нековалентных взаимодействий. Используемый здесь термин Fc означает какуюлибо из указанных форм: нативный мономер,нативный димер, нативный димер (связанный дисульфидной связью), модифицированные димеры (связанные дисульфидными связями и/или нековалентно) и модифицированные мономеры(т. е. производные). Варианты, аналоги или производные Fcучастка могут быть получены, например, путем различных замещений остатков аминокислот или последовательностей. Варианты (или аналоги) полипептидов включают инсерционные варианты, причем один или более аминокислотных остатков добавляют к аминокислотной последовательностиFc. Инсерции могут быть локализованы на одной или обеих концевых последовательностях белка или могут генерироваться на внутренних участках аминокислотной последовательностиFc. Инсерционные варианты с дополнительными остатками на одном или обоих концевых участках могут включать, например, белки слияния или белки, содержащие аминокислотные метки или характерные структуры. Например, Fc-молекула может необязательно содержать N-концевой Met, особенно в тех случаях,когда молекула рекомбинантным образом экспрессируется в бактериальных клетках, например, Е. coli. В Fc-делеционных вариантах один или более аминокислотных остатков в Fc-полипептиде удалены. Делеции могут затрагивать один или оба концевых участков полипептида Fc или же один или более аминокислотных остатков могут быть удалены в пределах аминокислотной последовательности Fc. Делеционные варианты,таким образом, включают все фрагменты Fcполипептидной последовательности. В замещенных Fc-вариантах один или более аминокислотных остатков Fc-полипептида удалены или замещены альтернативными остатками. В одном случае замещения консервативны по своей природе, однако, изобретение отно 19 сится и к замещениям, которые являются неконсервативными. Например, остатки цистеина могут быть делегированы или замещены другими аминокислотами, чтобы предотвратить образование некоторых или всех дисульфидных перекрестных связей Fc-последовательностей. В частности, аминокислотные остатки в положениях 7 и 10 SEQ ID NO:5 являются цистеиновыми остатками. Можно удалить каждый из таких цистеиновых остатков или заместить один или более цистеиновых остатков другими аминокислотами, например Ala или Ser. Кроме того, модификации могут быть сделаны введением аминокислотных замен для: (1) удаления сайта связывания Fc-рецептора; (2) удаления сайта связывания комплемента (Clq) и/или (3) удаления сайта антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Такие сайты известны из уровня техники и любые известные замены в Fc-последовательности могут быть осуществлены. Например, см. Molecular Immunology, Vol. 29, No. 5, 633-639 (1992) в отношении сайтов ADCC IgGl. Подобным образом один или более остатков тирозина могут быть замещены фенилаланиновыми остатками. Более того, другие варианты аминокислотных вставок, делеций (например, 1-25 аминокислот) и/или замещений входят в объем настоящего изобретения. Консервативные аминокислотные замены, в целом, предпочтительны. Более того, изменения могут быть в форме измененных аминокислот, например,пептидомиметических или D-аминокислот.Fc-последовательности соединения ТМР могут быть также дериватизированы, т. е. представлять собой модификации, отличные от вставок, делеций или замещений аминокислотных остатков. Предпочтительно, модификации являются ковалентными и включают, например,химическое связывание с полимерами, липидами, другими органическими и неорганическими веществами. Производные в соответствии с изобретением могут быть получены для увеличения времени полужизни в циркуляции или для улучшения способности полипептида нацеливаться на нужные клетки, ткани или органы. Возможно также использование рецепторсвязывающего домена интактной Fc-молекулы как Fc-части заявленных соединений, например,как описано в заявке WO 96/32478, озаглавленной Измененные полипептиды с увеличенным временем полужизни. Дополнительные члены класса молекул, обозначенных здесь как Fc, являются таковыми, описанными в заявке WO 97/34631, озаглавленной Иммуноглобулинподобные домены с увеличенным временем полужизни. Обе из указанных опубликованных заявок РСТ приведены здесь в качестве ссылок.Fc-слияния могут быть сделаны на N- или С-концевом участке TMP1 или ТМP2 или на обоих N- и С-концевых участках TMPs. Неожи 003998 20 данно было обнаружено, что пептиды, в которых Fc-участок лигирован с N-концевым участком ТМР, обладают большей биологической активностью, чем другие модификации, и, таким образом, белки слияния, имеющие Fc-домен на N-концевом участке TMP1 (т. е. r и р равны 0,a m и q равны 1 в общей формуле) предпочтительны. Когда Fc-цепь сливают с N-концевым участком ТМР или линкера такое слияние обычно затрагивает С-концевой участок Fc-цепи и наоборот (vice versa). Также предпочтительными соединениями являются димеры (например, тандемные и нетандемные) указанных выше соединений общей формулы, также приведенной выше. В таких случаях каждая Fc-цепь будет связана с тандемным димером ТМР пептидов. Схематический пример такого соединения показан на фиг. 6 С. Предпочтительный пример указанного типа соединений основан на фиг. 6 С, причем Fc является димером соединения SEQ ID NO:5, каждыйL1 представляет собой (Gly)8. Это соединение обозначается здесь как Fc-TMP1-L-TMP2. Оно также представлено в форме димера (посредством Fc-участка) и имеет последовательностьSEQ ID NO:34. Аналогичное соединение, в котором Fc-группа прикреплена посредством линкера к С-концевому участку TMP2-гpyпп на фиг. 6 С также включено в объем изобретения и обозначено здесь, как TMP1-L-TMP2-Fc. Некоторые специфические примеры соединений второй группы приведены ниже: В каждом из указанных соединений рассматривается наличие дополнительного Nконцевого Met (M, как обозначается с помощью однобуквенного кода). Остаток Met может быть прикреплен на N-концевом участке Fc-группы в тех случаях, когда имеется Fc-группа, прикрепленная к N-концевому участку ТМР. В тех случаях, когда Fc-группа прикреплена к Сконцевому участку ТМР, остатки Met могут 21 быть прикреплены к N-концевому участку ТМРгруппы. В каждом из двух указанных выше случаевFc, предпочтительно, представляет собой Fcучасток тяжелой цепи IgGl человека или его биологически активный фрагмент, производное или димер. См. Ellison, J. W. et al., Nucleic AcidsFc SEQ ID NO:5 является наиболее предпочтительной для Fc в составе указанных выше соединений. Также предпочтительными являются указанные выше соединения, в которых Fc представляет собой димерную форму последовательности SEQ ID NO:5 и каждая Fc-цепь прикреплена к ТМР тандемному димеру. Кроме того, несмотря на то, что многие из предпочтительных соединений второй группы включают один или более тандемных димеров,в которых имеется две связанных ТМР-группы,другие из заявленных соединений включают тандемные мультидимеры TMPs, т. е. соединения следующей, например, структуры:TMP1 -L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-TMP5-L-Fc,где TMP1, TMP2, TMP3, TMP4 и ТМР 5 могут иметь одну и ту же или различную структуру, а Fc и каждая группа ТМР и L определены,как указано выше, и каждый линкер является факультативным. В каждом из указанных выше случаев Fc-группа может быть мономерной или димерной и в тех случаях, когда Fс является димерной, один или более мультимеров ТМР могут быть прикреплены к каждой Fc-цепи. Также рассматриваются другие примеры, скажем, когда ТМР-димеры или мультимеры прикреплены к обоим N- и С-концевым участкам одной или обеих Fc-цепей, включая случай, когда ТМР-димеры или мультимеры прикреплены ко всем четырем концевым участкам Fc-цепей. Предпочтительно, заявленные соединения второй группы имеют, в целом, около 200-400 аминокислот (т. е. они являются полипептидами). Способы получения Заявленные соединения могут быть получены различным образом. Поскольку многие соединения являются пептидами, или включают пептиды, способы получения пептидов имеют непосредственное отношение к заявленному изобретению. Например, могут быть использованы технологии твердофазного синтеза. Подходящие технологии хорошо известны из уровня техники и включают методы, описанные в следующих источниках информации: Merrifield,in Chem. Polypeptides, pp. 336-61 (KatsoyannisPhase Peptide Synthesis (1969); U.S. Pat. No. 3,941,763; Finn et al., The Proteins, 3rd ed., vol. 2,pp. 105-253 (1976); and Erickson et al., The Proteins, 3rd ed., vol. 2, p. 257-527 (1976). Твердофазный синтез является предпочтительной методикой синтеза индивидуальных пептидов,поскольку он наиболее эффективен и недорог при получении небольших пептидов. Пептиды также могут быть получены в трансформированных клетках-хозяевах с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Для этого получают рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую пептид. Способы конструирования таких ДНк и/или РНК молекул хорошо известны из уровня техники. Например, последовательности, кодирующие пептиды, могут быть вырезаны из ДНК с помощью подходящих ферментов рестрикции. Соответствующие последовательности могут быть получены при использовании полимеразной цепной реакции(PCR) с включением необходимых рестрикционных сайтов для последующего клонирования. Альтернативно, ДНК/РНК молекула может быть синтезирована с помощью методик химического синтеза, таких как фосфорамидный метод. Также может быть применена комбинация различных подходов. Изобретение также относится к вектору,кодирующему пептиды, для экспрессии в подходящем хозяине. Вектор включает молекулу ДНК, кодирующую пептиды, оперативно связанную с подходящими последовательностями,контролирующими экспрессию. Способы такого функционального связывания как до, так и после того, как ДНК-молекула, кодирующая пептид, будет встроена в подходящий вектор, хорошо известны. К последовательностям, контролирующим экспрессию, относятся промоторы, активаторы, энхансеры, операторы, сайты связывания рибосом, стартовые сигналы, стопсигналы, сигналы кэпирования, сигналы полиаденилирования и другие сигналы, вовлеченные в контролирование транскрипции или трансляции. Вектор, содержащий молекулу ДНК, кодирующую пептид, используют для трансформации подходящего хозяина. Трансформация может быть осуществлена с помощью методов,хорошо известных из уровня техники. Для целей настоящего изобретения могут быть использованы любые из многочисленных и доступных хорошо известных клеток-хозяев. Выбор определенного хозяина зависит от множества факторов, известных из уровня техники. Указанные факторы включают, например, совместимость с выбранным вектором экспрессии,токсичность для клетки-хозяина пептидов, кодируемых ДНК-молекулой, способ трансформации, легкость выделения пептидов, характеристики экспрессии, биологическую безопасность и стоимость. Баланс указанных факторов соблюдается при условии, что не все клетки 23 хозяева одинаково эффективны для экспрессии определенной ДНК-последовательности. В целом, полезными клетками-хозяевами из числа микроорганизмов являются бактерии(например, Е. coli), дрожжи (например, Saccharomyces sp. и Pichia pastoris), а также клетки насекомых, растений, млекопитающих (в том числе человека), грибов, выращенные в культуре, и другие клетки-хозяева, известные из уровня техники. Далее,трансформированные клеткихозяева культивируют в подходящих условиях ферментации для обеспечения экспрессии нужных пептидов. Такие условия ферментации хорошо известны из уровня техники. Наконец, пептиды очищают из ферментационной среды или из клеток-хозяев, в которых они экспрессируются. Методы очистки хорошо известны из уровня техники. Соединения, которые содержат производные пептидов или непептидные группы, могут быть синтезированы с помощью хорошо известных методик органической химии. Применение соединений Заявленные соединения обладают способностью связывать и активировать рецептор сMpl и/или обладают способностью стимулировать образование (как in vivo, так и in vitro) тромбоцитов (тромбопоэтическая активность) и предшественников тромбоцитов (мегакариоцитопоэтическая активность). Для измерения активности (активностей) указанных соединений можно использовать стандартные методы, например, такие, как описаны в заявке WO 95/26746, озаглавленной как Композиции и способы стимулирования роста и дифференцировки мегакариоцитов. Исследования in vivo далее описано в примерах. Состояния, для коррекции которых используются заявленные способы и композиции,в целом, представляют собой такие заболевания,при которых наблюдается недостаточность мегакариоцитов/тромбоцитов или она подразумевается или ожидается в будущем (например, в результате плановой хирургической операции или донорства тромбоцитов). Такие состояния могут быть результатом недостаточности (временной или постоянной) активного Mpl-лигандаin vivo. Обычное название недостаточности тромбоцитов - тромбоцитопения и, следовательно, способы и композиции в соответствии с настоящим изобретением могут применяться для профилактического или терапевтического лечения тромбоцитопении у больных, которые в этом нуждаются. Всемирная организация здравоохранения классифицирует степень тромбоцитопении в зависимости от числа циркулирующих тромбоцитов в организме (Miller, et al., Cancer 47: 210211 (1981. Например, у индивидуумов, не обнаруживающих признаков тромбоцитопении 24 крайней мере, 100000 клеток/мм 3. При средней тромбоцитопении (степень 1) уровень циркулирующих тромбоцитов составляет 79000 99000/мм 3. Умеренная тромбоцитопения (степень 2) характеризуется числом тромбоцитов около 50000 - 74000 клеток/мм 3 и тяжелая 25000 - 49000 тромбоцитов/мм 3. Угрожающая жизни или истощающая тромбоцитопения характеризуется концентрацией циркулирующих тромбоцитов менее чем 25000 клеток/мм 3. Тромбоцитопения (недостаточность тромбоцитов) может возникать по различным причинам, включая химиотерапию или терапию другого характера с использованием различных лекарств, радиационную терапию, хирургию,кровопотерю при несчастных случаях или другие специфические заболевания. Примерами таких заболеваний, для которых характерна тромбоцитопения и которые могут быть вылечены в соответствии с заявленным изобретением, являются следующие: апластическая анемия; идиопатическая или иммунная тромбоцитопения (ITP), включая идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, ассоциированную с раком груди; ассоциированная с ВИЧ ITP и связанная с ВИЧ тромботическая тромбоцитопеническая пурпура; метастатические опухоли, в результате которых развивается тромбоцитопения; системный волчаночный эритематоз, в том числе неонатальный волчаночный синдром спленомегалии; синдром Фалькони; недостаточность витамина В 12; недостаточность фолиевой кислоты; аномалия Мэя-Хегглина; синдром Вискотта-Элдриха; хроническое заболевание печени; миелодипластический синдром,ассоциированный с тромбоцитопенией; пароксизмальная ноктурнальная гемоглобинурия; острая глубокая тромбоцитопения вследствие терапии с помощью С 7 ЕЗ Fab (Abciximab); аллоиммунная тромбоцитопения, включая материнскую аллоиммунную тромбоцитопению; тромбоцитопения, ассоциированная с антифосфолипидными антителами и тромбозом; аутоиммунная тромбоцитопения; вызванная лекарствами иммунная тромбоцитопения, включая тромбоцитопению, обусловленную карбоплатином, гепарином; фетальная тромбоцитопения; вызванная беременностью тромбоцитопения; синдром Хьюджеса; волчаночная тромбоцитопения; кровопотеря при несчастных случаях и/или обширная кровопотеря; миелопролиферативные нарушения; тромбоцитопения у больных со злокачественными опухолями; тромботическая тромбоцитопеническая пурпура, включая явную тромботическую микроангиопатию, такую, как гемолитический уремический синдром у расовых больных; аутоиммунная гемолитическая анемия; скрытая перфорация дивертикулами тощей кишки; аплазия красных кровяных клеток; аутоиммунная тромбоцитопения; эпидемическая нефропатия; острая почечная недостаточность, вызванная рифампицином; тромбо 25 цитопения Пэриса-Троуссэ; неонатальная аллоиммунная тромбоцитопения; пароксизмальная ноктурнальная гемоглобинурия; гематологические изменения при раке желудка; детский гемолитический уремический синдром; гематологические синдромы, связанные с вирусной инфекцией, включая ассоциированную с гепатитом А и инфицированием цитомегаловирусом тромбоцитопению. Также, различные виды терапии СПИДа приводят к тромбоцитопении(например, использование AZT). В некоторых случаях заживление ран также улучшается при увеличении числа тромбоцитов. Если рассматривать недостаточность тромбоцитов, например, обусловленную возможным хирургическим вмешательством в будущем, то заявленные соединения могут вводиться в интервале времени от нескольких дней до нескольких часов до того, как организм начнет нуждаться в тромбоцитах. Если рассматривать острые ситуации, например, несчастный случай или обширную кровопотерю, заявленные соединения могут вводиться параллельно с переливаемой кровью или очищенными тромбоцитами. Заявленные в соответствии с изобретением соединения могут также оказаться полезными для стимулирования определенных типов клеток, отличных от мегакариоцитов, если такие клетки экспрессируют Mpl-рецептор. Заболевания, ассоциированные с такими клетками, которые экспрессируют Mpl-рецептор и отвечают на стимуляцию Mpl-лигандом, также входят в объем настоящего изобретения. Заявленные соединения могут быть использованы в любой ситуации, когда необходимы образование тромбоцитов или предшественников тромбоцитов или стимуляция c-Mplрецептора. Так, например, они могут быть использованы для лечения любого состояния у млекопитающих, когда существует потребность в тромбоцитах, мегакариоцитах и т. д. Такие состояния подробно описаны в следующих источниках информации: WO 95/26746; WO 95/21919; WO 95/18858; WO 95/21920 и рассматриваются здесь. Заявленные в соответствии с изобретением соединения также могут быть полезными для поддержания жизнеспособности или сохранения тромбоцитов и/или мегакариоцитов и родственных клеток. Соответственно, может оказаться целесообразным включение эффективного количества одного или более из таких соединений в композицию, содержащую указанные клетки. Под млекопитающим понимается любое млекопитающее, включая человека, домашних животных, в том числе собак и кошек; экзотическое животное или животное зоопарка, включая обезьян; лабораторное животное, включая мышей, крыс и морских спинок; сельскохозяйственных животных, включая лошадей, рогатый 26 скот, овец, коз и свиней, и т. д. Предпочтительным млекопитающим является человек. Фармацевтические композиции Настоящее изобретение также относится к способам получения фармацевтических композиций, содержащих заявленные соединения. Такие фармацевтические композиции могут быть введены путем инъекций, а также оральным, назальным, трансдермальным или другим путем, например внутривенным, внутридермальным, внутримышечным, интраперитонеальным, интратекальным, внутриглазным, внутриоболочечным, внутрилегочным (например,аэрозольные препараты), ретробульбарным, через молочную железу или подкожной инъекцией (включая введение с образованием депо для отложенного высвобождения); подъязычным,анальным, вагинальным или в ходе хирургической имплантации, например, помещением под селезеночную капсулу, роговицу или оболочку головного мозга. Лечение может включать введение одной дозы или многих доз в течение определенного промежутка времени. В целом,изобретением охватываются фармацевтические композиции, содержащие эффективные количества заявленных соединений вместе с фармацевтически приемлемыми разбавителями, консервантами, растворителями, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. Такие композиции включают разбавители различных буферных систем (например, Трис-HCl, ацетат, фосфат),различных рН и ионной силы; добавки, такие как детергенты и солюбилизирующие агенты(например, лактоза, маннитол). Необходимые вещества могут быть включены в определенные препараты полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т. д., или в липосомы. Гиалуроновая кислота также может быть использована, что может обеспечивать эффект поддерживаемого высвобождения в циркуляцию. Фармацевтические композиции могут необязательно включать другую фармацевтически приемлемую жидкость,полутвердые или твердые разбавители, которые служат фармацевтическими переносчиками, или среду, включающую (без ограничений) полиоксиэтилен сорбитан монолаурат, стеарат магния,метил- и пропилгидроксибензоат, крахмалы,сахарозу, декстрозу, гуммиарабик, фосфат кальция, минеральное масло, масло какао и теобромное масло. Такие композиции могут влиять на физический статус, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость выведения invivo заявленных белков и производных. См.,например, Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), стр. 1435-1712 (в качестве ссылки). Композиции могут быть приготовлены в жид 27 кой форме или в виде порошка, например, лиофилизированной форме. В объем изобретения также включены имплантируемые препараты с поддерживаемым высвобождением и трансдермальные препараты. Для использования в соответствии с изобретением подходят оральные твердые дозированные формы, которые в общих чертах описаны в Remigtons Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042) в гл. 89 (работа приведена здесь в качестве ссылки). Твердые дозированные формы включают таблетки, капсулы, пилюли, пастилки, лепешки,облатки и шарики. Кроме того, для получения заявленных композиций может быть использовано липосомальное или протеноидное инкапсулирование (например, протеноидные микросферы описаны в патенте США 4 925 673). Липосомы могут быть дериватизированы различными полимерами (например, как описано в патенте США 5 013 556). Описание возможных твердых дозированных форм для терапии приведено Marshall, К., Modern Pharmaceutics, Edited by G.S. Banker and C.T. Rhodes Chapter 10,1979 (в качестве ссылки). В целом, препараты включают заявленные в соответствии с изобретением вещества и инертные ингредиенты, которые обеспечивают защиту от действия среды желудка на активное вещество и высвобождение биологически активного материала в кишечнике. Также специальным образом оговариваются оральные дозированные формы охарактеризованных выше соединений. Если необходимо,соединения могут быть химически модифицированы, так чтобы оральная доставка была эффективной. В целом, химическая модификация подразумевает прикрепление по крайней мере одной группы к заданной молекуле, причем указанная группа обеспечивает (а) ингибирование протеолиза и (б) попадание в кровоток из желудка или кишечника. Также желательным может быть увеличение стабильности соединения и времени его циркуляции в крови. Примерами таких групп являются: полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля,карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и полипролин (Abuchowski and Davis, Soluble PolymerEnzyme Adducts, Enzymes as Drugs, HocenbergAppl. Biochem, 4: 185-189 (1982. Другие полимеры, которые могут быть использованы, включают поли-1,3-диоксалан и поли-1,3,6-тиоксокан. Предпочтительными для фармацевтического применения, как указано выше, являются полиэтиленгликолевые группы. Для оральных дозированных форм доставки также возможно использовать соль модифицированной алифатической аминокислоты, такую как N-(8-[2-гидроксибензоил]амино)кап 003998 28 рилат натрия (SNAC), в качестве носителя для усиления абсорбции терапевтически активных соединений, заявленных в соответствии с изобретением. Клиническая эффективность препаратов гепарина, содержащих SNAC, была показана в процессе испытаний Фазы II, осуществляемых Emisphere Technologies. См. патент США 5 792 451, озаглавленный Композиция оральной доставки лекарства и способы. Терапевтические ингредиенты могут быть включены в состав препаратов в форме микрочастиц, а именно гранул или шариков с размером частиц около 1 мм. Материал, входящий в состав капсул, может быть в виде порошка, сжатых лепешек или даже таблеток. Терапевтические вещества могут быть получены компрессией. В состав препаратов могут быть включены агенты, придающие запах и вкус. Например,белок (или производное) может быть введен в состав препарата (скажем, путем липосомного или микросферного инкапсулирования) и далее соединен со съедобным продуктом, например,охлажденным напитком, содержащим вещества,придающие запах и вкус. Можно разбавить или увеличить объем терапевтического вещества инертным материалом. Такие разбавители могут включать углеводы, особенно маннитол, -лактозу, безводную лактозу, целлюлозу, сахарозу, модифицированные декстраны и крахмал. Некоторые неорганические соли также могут быть использованы как наполнители, например, трифосфат кальция,карбонат магния и хлорид натрия. К некоторым коммерчески доступным разбавителям относятся Fast Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress иAvicell. Дезинтеграторы могут быть включены в состав терапевтического препарата в твердой дозированной форме. Материалы, которые могут быть использованы в качестве дезинтеграторов, включают (без органичений указанными) крахмал, в том числе коммерческий дезинтегрант на основе крахмала, Explotab, крахмальный гликолят натрия, Амберлит, натриевая карбоксиметилцеллюлоза, ультрамилопектин, альгинат натрия, желатин, кислая карбоксиметилцеллюлоза, природная губка, бентонит, апельсиновый отшелушиватель также могут быть использованы. Другой тип дезинтеграторов представляет собой нерастворимые катионообменные смолы. Порошкообразная камедь может быть использована в качестве дезинтегратора и связывающей субстанции и включать агар,Каrауа или трагакант. В качестве дезинтеграторов также могут применяться альгиновая кислота и его натриевая соль. Связывающие агенты могут быть использованы для соединения терапевтических агентов вместе в виде таблетки и включают материалы из натуральных продуктов, таких как гуммиарабик, трагакант, крахмал и желатин. К другим 29 относятся метилцеллюлоза (МЦ), этилцеллюлоза (ЭЦ) и карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ). Для гранулирования терапевтических средств могут быть использованы спиртовые растворы поливинилпирролидона и гидроксипропилметилцеллюлозы. Агенты, препятствующие трению, также могут быть включены в состав композиций, содержащих терапевтические агенты, для предотвращения слипания в процессе приготовления композиций. Любриканты могут составить слой между терапевтическим агентом и стенкой и включают (без ограничений указанным) стеариновую кислоту, в том числе ее кальциевую и магниевую соли, политетрафторэтилен (PTFE),жидкий парафин, растительные масла и воска. Могут использоваться растворимые любриканты, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоли различной мол. массы, Carbowax 4000 и 6000. Вещества, облегчающие скольжение лекарственного материала, также могут быть добавлены в состав композиций для обеспечения их перераспределения в процессе сжатия. К таким веществам относится крахмал, тальк, пирогенная окись кремния и гидратированный силикоалюминат. Для обеспечения растворения терапевтического агента в водной среде в качестве смачивающих агентов добавляют сурфактанты. К сурфактантам относятся анионные детергенты,такие как лаурилсульфат натрия, диоктиловый сульфосукцинат натрия и диоктиловый сульфонат натрия. Могут быть использованы и катионные детергенты, к которым относятся хлорид бензалкония или хлорид бензетония. В перечень неионных детергентов, которые могут быть включены в состав композиций в качестве сурфактантов, входят лауромакрогол 400, полиоксил 40 стеарат, гидрогенированное полиоксиэтиленовое касторовое масло 10, 50 и 60, глицерол моностеарат, полисорбат 40, 60, 65 и 80,эфир сахарозы и жирной кислоты, метилцеллюлоза и карбоксиметилцеллюлоза. Указанные сурфактанты могут быть включены в состав композиций белка или его производного как сами по себе, так и в смесях различного соотношения. Добавки, которые усиливают захват соединения, например, включают жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, линолевая кислота и линолиновая кислота. Может оказаться желательным получение композиций с контролируемым высвобождением. Лекарство может быть заключено в инертный матрикс, который обеспечивает высвобождение лекарства как путем диффузии, так и выщелачивания, например, в камеди. Медленно распадающиеся матриксы также могут быть включены в состав композиций, например, альгинаты, полисахариды. Другой формой контролируемого высвобождения указанного терапев 003998 30 тического средства является способ, основанный на терапевтической системе oros (AlzaCorp.), т. е. лекарство заключается в полупроницаемую мембрану, которая позволяет воде проникать внутрь и выдавливать лекарство через небольшое отверстие за счет осмотических эффектов. Некоторые энтерические покрытия также обеспечивают отложенный эффект высвобождения. Другие покрытия могут быть использованы для приготовления композиций. К ним относятся различные сахара, которые могут быть включены в оболочку. Терапевтический агент может быть использован в форме пленки, покрывающей таблетку, и материалы, используемые в этих случаях, делятся на 2 группы. К первой относятся неэнтерические материалы, такие как метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, метилгидроксиэтилцеллюлоза,гидроксипропилцеллюлоза, гидроксиметилцеллюлоза, натрия карбоксиметилцеллюлоза, провидон и полиэтиленгликоли. Ко второй группе относятся энтерические материалы, среди которых обычно используются эфиры фталиковой кислоты. Смеси материалов могут быть использованы для получения оптимального пленочного покрытия. Такое покрытие можно нанести в специальном контейнере, на жидкой подложке или путем компрессии. В объем изобретения также входит способ легочной доставки заявленного белка (или его производных). Белок (или его производные) доставляется в легкие млекопитающего в процессе дыхания и проникают через выстилающий легкие эпителий в кровоток. Другие сообщения на эту тему включают Adjei et al., PharmaceuticalInternal Medicine 3: 206-212 (1989) (1 антитрипсин); Smith et al., J. CLin. Invest. 84: 1145-1146 (1989) (al-протеиназа); Oswein et al.,Aerozolization of Proteins, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone,Colorado, March, 1990 (рекомбинантный гормон роста человека); Debs et al., The Journal of Immunology 140: 3482-3488 (1988) (интерферони фактор некроза опухолей ) и Platz et al., патент США 5284 656 (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор). В объем изобретения также входят различные механические устройства для легочной доставки терапевтических продуктов, включая (без ограничений) распылители, ингаляторы с измеренными дозами, порошковые ингаляторы, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. 31 Некоторые специфические примеры коммерчески доступных устройств, подходящих для осуществления настоящего изобретения,включают распылитель Ultravent, производимыйProducts, Englewood, Colorado; дозированный ингалятор Ventolin, производимый Glaxo Inc.,Research Triangle Park, North Carolina, и порошковый ингалятор Spinhaler, производимый Fisons Corp, Bedford, Massachusetts. Все такие композиции требуют применения составов, подходящих для распределения заявленных соединений. Обычно, каждая композиция специфична по отношению к определенному типу используемого устройства и может содержать подходящий выталкивающий материал помимо разбавителей, адъювантов и/или носителей, полезных в терапии. Заявленные соединения преимущественным образом могут быть приготовлены в форме частиц со средним их размером менее 10 мкм(микрон), наиболее предпочтительно, 0,5-5 мкм,для более эффективной доставки в дистальные участки легких. Носители включают углеводы, такие как трегалоза, маннитол, ксилитол, сахароза, лактоза и сорбитол. Другие ингредиенты для использования в композициях могут включать DPPC,DOPE, DSPC и DOPC. Могут быть использованы природные или синтетические сурфактанты. Может быть использован полиэтиленгликоль (не считая того, что он применялся для получения белка или аналога). Могут быть применены декстраны, такие как циклодекстран, а также соли желчных кислот и другие родственные энхансеры. Кроме того, используют целлюлозу и производные целлюлозы, аминокислоты,например, в составе буферных растворов. В объем изобретения также входит использование липосом, микрокапсул или микросфер, комплексов, включения или других типов носителей. Композиции, подходящие для использования, с помощью распылителя, как струйного,так и ультразвукового, обычно включают заявленное вещество, растворенное в воде в концентрации около 0,1-25 мг биологически активного белка на 1 мл раствора. Композиции могут также включать буфер и простой сахар (например,для стабилизации белка и регулирования осмотического давления). Композиция для распылителя может также содержать сурфактант для редуцирования или предотвращения поверхностно индуцированной агрегации белка, обусловленной атомизацией раствора при формировании аэрозоля. Композиции для использования в ингаляторном устройстве с измеренной дозой обычно содержит тонко измельченный порошок, содержащий заявленное соединение, суспендированное в выталкивающем веществе с целью под 003998 32 держки сурфактанта. Выталкивающее вещество может быть любым подходящим для указанных целей материалом, например, хлорфторуглеродом, гидрохлорфторуглеродом, гидрофторуглеродом или гидроуглеродом, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан, а также их комбинации. Подходящие сурфактанты включают сорбитантриолеат и соевый лецитин. В качестве сурфактанта может быть использована олеиновая кислота. Композиции для распределения из порошковых ингалирующих устройств представляют собой тонко измельченный сухой порошок заявленного соединения, а также могут содержать наполнители, например лактозу, сорбитол, сахарозу, маннитол, трегалозу или ксилитол в количествах, которые обеспечивают выброс порошка из устройства, например, 50-90% по отношению к весу композиции. В объем изобретения также входит назальная доставка препарата. Назальная доставка обеспечивает попадание белка непосредственно в кровоток после введения терапевтически активного продукта в полость носа, без необходимости депонирования продукта в легких. Композиции для назальной доставки могут включать декстран и циклодекстран. Доставка за счет транспорта через другие слизистые оболочки также входит в объем изобретения. Дозы Дозовый режим в качестве составляющей способа лечения указанных выше заболеваний определяется лечащим врачом при учете различных факторов, которые модифицируют действие лекарств, например, возраста, состояния,веса тела больного, пола и диеты, тяжести какой-либо инфекции, времени применения и других клинических факторов, в целом, доза варьирует от 0,1 до 100 мкг заявленного соединения на 1 кг веса тела в день, предпочтительно от 0,1 до 1000 мкг/кг и более предпочтительно от 0,1 до 150 мкг/кг, причем дозы могут даваться однократно в один день или эквивалентные дозы могут быть применены в более длинные или более короткие интервалы, например, каждый другой день, дважды в неделю, еженедельно,или два или три раза в день. Заявленное соединение может вводиться в форме первоначального болюса, затем следует продолжительная инфузия для поддержания терапевтически значимых уровней лекарства в циркуляции. В другом случае заявленные соединения могут вводиться однократной дозой. Специалист в данной области способен оптимизировать эффективные дозы и режим введения препарата на основе медицинской практики и клинического состояния индивидуального больного. Частота введения доз зависит от фармакокинетических параметров препарата и пути введения. Оптимальный фармацевтический состав определяется специалистом в данной об 33 ласти знаний и зависит от способа введения препарата и нужной дозы. Например, см.(1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042),стр. 1485-1712 (работа приведена здесь в качестве ссылки). Такие составы могут влиять на физический статус больного, скорость высвобождения препарата in vivo и скорость клиренсаin vivo вводимого агента. В зависимости от способа введения подходящая доза может быть определена в соответствии с весом тела, поверхностью тела и размером органа. Дальнейшие более тонкие вычисления, необходимые для определения подходящей дозы лечения при использовании каждого указанного выше состава, легко осуществляются специалистом в данной области без дополнительных экспериментов, особенно с учетом приведенной здесь информации о дозах и исследованиях, а также фармакокинетических данных, полученных в результате клинических экспериментов, как обсуждалось выше. Соответствующие дозы могут быть установлены в результате использования известных методов определения уровней лекарства в крови в сочетании с данными доза-ответ. Конечный дозовый режим может быть установлен лечащим врачом с учетом различных факторов, которые модифицируют действие лекарств, например, специфической активности лекарства,тяжести заболевания и отвечаемости пациента,его возраста, состояния, веса тела, пола и диеты,тяжести какой-либо инфекции, времени введения и других клинических факторов. При осуществлении исследований может появиться другая информация, относящаяся к подходящим дозовым уровням и продолжительности лечения различных заболеваний и состояний. Терапевтические методы, композиции и вещества заявленного изобретения могут быть использованы как сами по себе, так и в комбинации с другими цитокинами, растворимымMpl-рецептором, гематопоэтическими факторами, интерлейкинами, ростовыми факторами или антителами для лечения заболеваний, для которых характерны другие симптомы помимо недостаточности тромбоцитов. Также подразумевается, что заявленные соединения будут полезны для лечения некоторых форм тромбоцитопении в сочетании с распространенными стимуляторами гематопоэза, такими как IL-3 или GMCSF. К другим факторам стимуляции мегакариоцитов относятся, в частности, meg-CSF, фактор стволовой клетки (SCF), ингибирующий фактор лейкоза (LIF), онкостатин М (OSM) или другие вещества, обладающие способностью стимулировать мегакариоциты, которые могут использоваться совместно c Mpl-лигандом. Дополнительные примеры цитокинов или гематопоэтических факторов для такого совместного ведения включают IL-1 альфа, IL-1 бета, IL-2,IL-3, IL-4, EL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующий фактор-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM 003998CSF, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), ЕРО, интерферон-альфа (IENальфа), консенсусный интерферон, IEN-бета,IEN-гамма, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13,IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, тромбопоэтин(ТРО), ангиопоэтины, например, Ang-1, Ang-2,Ang-4, Ang-Y, ангиопоэтинподобный пептид человека, ростовый фактор эндотелия сосудов(VEGF), ангиогенин, морфогенетический белок кости 1, морфогенетический белок кости 2,морфогенетический белок кости 3, морфогенетический белок кости 4, морфогенетический белок кости 5, морфогенетический белок кости 6, морфогенетический белок кости 7, морфогенетический белок кости 8, морфогенетический белок кости 9, морфогенетический белок кости 10, морфогенетический белок кости 11, морфогенетический белок кости 12, морфогенетический белок кости 13, морфогенетический белок кости 14, морфогенетический белок кости 15,рецептор IA морфогенетического белка кости,рецептор IB морфогенетического белка кости,нейротрофический фактор головного мозга, цилиарный нейротрофический фактор, рецептор альфа цилиарного нейротрофического фактора,индуцируемый цитокином непрофильный хемотаксический фактор 1, индуцируемый цитокином нейтрофильный хемотаксический фактор 2 индуцируемый цитокином нейротфильный хемотаксический фактор 2 бета, ростовой фактор эндотелиальных клеток бета, эндотелии 1, эпидермический ростовой фактор, нейтрофильный аттрактант эпителиального происхождения,ростовой фактор фибробластов 4, ростовой фактор фибробластов 5, ростовой фактор фибробластов 6, ростовой фактор фибробластов 7, ростовой фактор фибробластов 8, ростовой фактор фибробластов 9, ростовой фактор фибробластов 8b, ростовой фактор фибробластов 8 с, ростовой фактор фибробластов 9, ростовой фактор фибробластов 10, кислый ростовой фактор фибробластов, основный ростовой фактор фибробластов, рецептор 1 альфа нейротрофического фактора глиальной клеточной линии, рецептор альфа 2 нейротрофического фактора глиальной клеточной линии, связанный с ростом белок,связанный с ростом белок альфа, связанный с ростом белок бета, связанный с ростом белок гамма, гепаринсвязывающий эпидермальный ростовой фактор, фактор роста гепатоцитов,рецептор фактора роста гепатоцитов, инсулинподобный ростовой фактор I, рецептор инсулинподобного ростового фактора, инсулинподобный ростовой фактор II, белок, связывающий инсулинподобный ростовой фактор, фактор роста кератиноцитов, фактор, ингибирующий лейкоз, рецептор альфа фактора, ингибирующего лейкоз, фактор роста нервов, рецептор фактора роста нервов, нейротрофин-3, нейротрофин-4, плацентарный ростовой фактор, плацентарный ростовой фактор 2, ростовой фактор эндотелиальных клеток, происходящий из 35 тромбоцитов, ростовой фактор, происходящий из тромбоцитов, ростовой фактор А цепи, происходящий из тромбоцитов, ростовой фактор АА, происходящий из тромбоцитов, ростовой фактор АВ, происходящий из тромбоцитов, ростовой фактор В-цепи, происходящий из тромбоцитов, ростовой фактор ВВ, происходящий из тромбоцитов, рецептор альфа ростового фактора, происходящего из тромбоцитов, рецептор бета ростового фактора, происходящего из тромбоцитов, стимулирующий фактор роста пре-В клеток, рецептор фактора стволовой клетки, TNF, включая TNF0, TNF1, TNF2, трансформирующий ростовой фактор альфа, трансформирующий ростовой фактор бета, трансформирующий ростовой фактор бета 1, трансформирующий ростовой фактор бета 1.2, трансформирующий ростовой фактор бета 2, трансформирующий ростовой фактор бета 3, трансформирующий ростовой фактор бета 5, латентный трансформирующий ростовой фактор бета 1, белок, связывающий трансформирующий ростовой фактор бета, белок II, связывающий трансформирующий ростовой фактор бета, белок III, связывающий трансформирующий ростовой фактор бета, рецептор типа I фактора некроза опухолей, рецептор типа II фактора некроза опухолей, рецептор активатора плазминогена урокиназного типа, ростовой фактор сосудистого эндотелия, а также химерные белки и их биологически или иммунологически активные фрагменты. В дальнейшем было бы полезным вводить как одновременно, так и последовательно, эффективное количество растворимогоMpl-рецептора млекопитающего, который, повидимому, побуждает мегакариоциты фрагментироваться с образованием тромбоцитов, как только мегакариоциты созреют. Таким образом,введение заявленного соединения (для увеличения числа зрелых мегакариоцитов) с последующим введением растворимого рецептора Mpl(для инактивации лиганда и побуждения зрелых мегакариоцитов продуцировать тромбоциты),как ожидается, может быть особенно эффективным для стимулирования образования тромбоцитов. Дозы, описанные выше, должны быть скорректированы с учетом компенсации таких дополнительных компонентов в составе терапевтической композиции. Мониторинг состояния больного осуществляется с помощью подходящих средств. В тех случаях, когда заявленные соединения добавляют в композиции тромбоцитов и/или мегакариоцитов и родственных клеток,количество включенного вещества, в целом,определяют экспериментально с помощью методик и подходов, известных из уровня техники. Примерный уровень варьирует от 0,1 мкг до 1 мг заявленного соединения на 106 клеток. Понятно, что применение заявленных в соответствии с настоящим изобретением методик для решения специфических проблем и си 003998 36 туаций находится в компетенции специалиста в данной области и осуществляется в соответствии с изложенными здесь подходами. Примеры заявленных продуктов, способов их получения,применения и производства приведены ниже. Примеры Приведенные ниже примеры описывают способы получения соединений первой группы. А. Материалы и методы. Все производные аминокислот (все альфаконфигураций) и смолы, используемые для синтеза пептидов, покупают у фирмы Novabiochem. Реагенты пептидного синтеза (DCC, HOBt, etc.) покупают в виде растворов у AppliedBiosystems, Inc. Два производных ПЭГа покупают у Shearwater Polymers, Inc. Все растворители (дихлорметан, N-метилпирролидон, метанол, ацетонитрил) покупают у ЕМ Sciences. Аналитическую HPLC осуществляют на системе Beckman для использования колонки Vydac(0,46 см х 25 см, С 18 обратная фаза, 5 мм) при скорости потока 1 мл/мин и двойной УФ детекции при 220 и 280 нм. Для всех процедур HPLC используют линейные градиенты с двумя мобильными фазами: буфер A-H2O (0,1%TFA) и буфер В-ацетонитрил (0,1 % TFА). Пептиды, на которые мы здесь ссылаемся, например, 17b, 18,19 и 20, пронумерованы со ссылкой на табл. 1 и некоторые из них приведены на фиг. 2 и 3. Синтез пептидов Все пептиды получают хорошо известным поэтапным методом твердофазного синтеза. Твердофазный синтез с Fmoc осуществляют с помощью ABI пептидного синтезатора. Обычно пептидный синтез начинают с предварительного наслаивания смолы Wang на 0,1 мМоль пластинку. Согласно стандартному пиперидиновому протоколу осуществляют Fmoc депротекцию. Связывание проводят при использованииDCC/HOBt. Защитные группы боковых цепей следующие: Glu (O-t-Bu), Thr (t-Bu), Arg (Pbf),Gln (Trt), Trp (t-Boc) и Cys (Trt). Для первого пептидного предшественника для ПЭГирования с целью защиты боковой цепиLys на линкере используют Dde, а для конечного связывания используют Boc-Ile-OH. Dde удаляют с помощью безводного гидразина (2% вNMP, 3x2 мин), затем осуществляют связывание с безводным бромацетатом по действием DCC. Для пептида 18 цистеиновую боковую цепь в линкере защищают тритиловой группой. Конечную депротекцию и расщепление всех комплексов пептидил-смола осуществляют при комнатной температуре в течение 4 ч при использовании трифторуксусной кислоты (TFA), содержащей 2,5% Н 2O, 5% фенол, 2,5% триизопропилсилан и 2,5% тиоанизол. После удаленияTFA отщепленный пептид преципитируют холодным безводным эфиром. Образование дисульфидных связей в циклическом пептиде осуществляют непосредственно на сыром материале при использовании 15% DMSO в Н 2 О (рН 37 7,5). Все сырые пептиды очищают препаративной обратнофазовой HPLC и структуру подтверждают ESI-MS и аминокислотным анализом. Альтернативно, все описанные выше пептиды могут быть также получены с помощью химических процедур t-Boc. В этом случае исходные смолы должны быть классическими смолами Merrifield или Раm и защитные группы боковых цепей следующие: Glu (OBZ1), Thr(Bzl), Arg (Tos), Trp (CHO), Cys (p - MeBzl). Для конечного отщепления пептидила от смолы используют фтористоводородную кислоту (HF). Все тандемные димерные пептиды, описанные в этом исследовании, которые имеют линкеры из природных аминокислот, могут также быть получены рекомбинантной ДНКтехнологией. Пэгирование Была разработана новая конвергентная стратегия пэгирования синтетических пептидов,которая включает объединение посредством формирования конъюгантного мостика в растворе пептида и ПЭГа, каждый из которых содержит специфическую функционально активную группу, реагирующую с другой. Предшественник пептидов может быть легко получен соответствующим твердофазным синтезом, как описано выше. Как указано ниже, пептиды преактивируют соответствующей функционально активной группой по специфическому сайту. Предшественники пептидов очищают и характеризуют до того, как осуществляют реакцию с ПЭГом. Лигирование пептида с ПЭГом обычно имеет место в водной фазе и может быть легко проконтролировано обратно-фазовой аналитической HPLC. ПЭГированные пептиды могут быть легко очищены препаративной HPLC и охарактеризованы с помощью аналитическойHPLC, аминокислотного анализа и массспектроскопией на основе лазерной десорбции. Получение пептида 19 Пептид 17b (12 мг) и МеО-ПЭГ-SH 5000(рН 8). Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и реакцию контролируют аналитической HPLC, которая показывает,что полнота прохождения реакции составляет более 80%. ПЭГированный материал выделяют препаративной HPLC. Получение пептида 20 Пептид 18 (14 мг) и МеО-ПЭГ-малеимид(25 мг) растворяют примерно в 1,5 мл водного буфера (рН 8). Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, за это время полнота трансформации составляет около 70%,что контролируют аналитической HPLC, помещая аликвоту образца на НРLC-колонку, ПЭГированный материал очищают препаративной 38 Биоисследование ТРО in vitro представляет собой митогенный анализ, использующий IL-3 зависимый клон клеток мыши 32D, которые были трансформированы рецептором mpl человека. Такое исследование более подробно описано в заявке WO 95/26746. Клетки поддерживают в среде MEM, содержащей 10% эмбрионального Клона II и 1 нг/мл MIL-3. Перед добавлением образца приготавливают клетки,дважды отмывая их ростовой средой без MIL-3. Строят стандартную кривую на основе 12 значений для ТРО от 3333 до 39 пкг/мл. Четыре разведения, оцененные как попадающие на линейный участок стандартной кривой (от 1000 до 125 пкг/мл), приготавливают для каждого образца в троекратном повторении. Аликвоту объемом 100 мкл каждого разведения образца или стандарта вносят в соответствующие лунки 96 луночного планшета для микротитрования, содержащие 10 000 клеток/лунку. После инкубирования в течение 44 ч при 37 С и 10% СО 2 в каждую лунку добавляют MTS (соединение тетразолия, которое восстанавливается в результате биологической активности клеток до формазана). Примерно через 6 ч определяют оптическую плотность на ридере планшетов при 490 нм. Строят кривую доза-ответ (log концентрации ТРО против O.D.-Фон) и осуществляют анализ линейной регрессии точек, попадающих на линейный участок стандартной кривой. Определяют концентрации неизвестных тестобразцов с помощью результирующего линейного уравнения и коррекции для фактора разбавления. АббревиатурыHPLC: жидкостная хроматография высокого разрешения: ESI-MS: масс-спектрометрия на основе ионизации электронного распыления;MALDI-MS: масс-спектрометрия на основе связанного с матриксом лизерного распределения ионизации; ПЭГ: полиэтиленгликоль. Все аминокислоты обозначены стандартным трехбуквенным или однобуквенным кодом. t-Boc: третичный бутоксикарбонил; tBu: третичный бутил; BzL: бензил; DCC: дициклогексилкарбозиимид; HOBt: 1-гидроксибеизриазол; NMP: Nметил-2-пирролидинон; Pbf: 2,2,4,6,7-пендаметилдигидробензофуран-5-сульфонил; Тrt: тритил; Dde: l-(4,4-диметил-2,6-диоксициклогексилиден)этил. В. Результаты. ТМР тандемные димеры с полиглициновыми линкерами. Конструирование последовательного связанных ТМР димеров основано на предположении, что димерная форма ТМР необходима для его эффективного взаимодействия с с-Мрl (рецептор ТРО) и в зависимости от того,каким образом компоненты будут располагаться по отношению друг к другу в рецепторном комплексе, две молекулы ТМР могут быть соединены друг с другом в конфигурации от С-концевого участка к N-концевому участку таким об 39 разом, чтобы не нарушать общую димерную конформацию. Ясно, что активность тандемно связанных димеров может также зависеть от подлежащего выбора длины и строения линкера, соединяющего С- и N-концевые участку двух последовательно выровненных ТМР мономеров. Поскольку не доступна какая-либо информация о структуре ТМР, связанного с c-Mpl,был синтезирован набор димерных пептидов с линкерами, содержащими от 0 до 10 и 14 глициновых остатков (табл. 1). Глицин был выбран из-за своей простоты и подвижности. Было высказано предположение, что подвижная полиглициновая пептидная цепь может обеспечить свободную укладку двух последовательных ТМР-повторов в необходимую конформацию, в то время как более стерически затрудненные аминокислотные последовательности способны образовать нежелательные вторичные структуры, чья жестокость может нарушить корректную укладку димерного пептида в рецепторный комплекс. Пептиды могут быть без затруднений получены с помощью подходящих методов твердофазного синтеза пептидов (Merrifiled, R.B.,Journal of the American Chemical Society 85: 2149(1963 на основе Fmoc и t-Boc химических подходов. В отличие от синтеза связанного по Сконцевым участкам параллельного димера (SEQID NО:2), который требует использования ортогонально защищенного лизинового остатка как начальной точки ветвления для построения двух пептидных цепей псевдосимметричным образом(Cwirla, S.E. etal., Science 276:1696-1699 (1997,синтез тандемных димеров представляет собой простую поэтапную сборку непрерывных пептидных цепей от С-концевого участка к Nконцевому участку. Поскольку димеризация ТМР имеет более существенное воздействие на пролиферативную активность по сравнению со связывающей аффинностью, как показано для С-концевого димера (Cwirla, S. Е. et al., Science 176-1696-1699 (1997, синтетические пептиды тестировали непосредственно на биологическую активность в исследовании ТРО-зависимой клеточной пролиферации при использовании IL-3 зависимого клона мышиных клеток 32D, трансфицированного с-Мрl полной длины (Palacios,R. et al., Cell 41: 727 (1985. Как показывают результаты тестирования (см. табл. 1 ниже), все из тандемных димеров с полиглициновыми линкерами более чем в 1000 раз активны по сравнению с мономером и даже более активны,чем С-концевой димер, в исследованиях клеточной пролиферации. Абсолютная активность С-концевого димера в описанном исследовании была ниже, чем нативного белка ТРО, что отличается от предварительного сообщения, которое свидетельствует о том, что С-концевой димер так же активен, как натуральный лиганд (Cwirla,Е. Е. et al., Science 276: 1696-1699 (1997. Это может быть обусловлено различиями в условиях 40 двух указанных экспериментов. Тем не менее,различие в активности между тандемными димерами (С-концевой участок первого мономера связан с N-концевым участком второго мономера) и параллельными димерами (С-концевой участок первого мономера связан с С-концевым участком второго мономера) в одном и том же исследовании явным образом демонстрирует преимущество тандемно димеризованного продукта по сравнению с параллельно димеризованным продуктом. Интересно заметить, что линкер может иметь широкий диапазон длины. Оптимальный линкер с выбранными ТМР мономерами (SEQ ID NO:1) состоит из 8 остатков глицина. Другие тандемные димеры Последовательно по отношению к первой серии тандемных ТМР димеров были сконструированы отдельные другие молекулы как с различными линкерами, так и содержащие модификации в пределах самого мономера. Первая из указанных молекул, пептид 13, имеет линкер,состоящий из GPNG, последовательности, в отношении которой известна высокая способность формировать вторичную структуру по типу бета-поворота. Несмотря на все еще примерно в 100 раз большую активность, чем мономер, указанный пептид в 10 раз менее активен, чем GGGG-связанный аналог. Таким образом, введение относительно жесткого бетаповорота в линкерный участок, по-видимому,вызывает слабое нарушение оптимальной конформации агониста в коротком линкере. Тrр 9 в последовательности ТМР представляет собой высококонсервативный остаток среди активных пептидов, выделенных из случайных пептидных библиотек. Также обнаруживается высококонсервативный Тrр в консенсусной последовательности ЕРО миметических пептидов и установлено, что указанный остаток триптофана вовлечен в формирование гидрофобного ядра между двумя ЕРО миметическими пептидами (EMPs) и вносит вклад в гидрофобные взаимодействия с рецептором ЕРО (Livnah,О. et al., Science 273: 464-471 (1996. По аналогии считается, что остаток Тrр 9 в ТМР может иметь сходную функцию в димеризации пептидного лиганда, и в целях попытки модулировать и оценить эффекты моновалентных гидрофобных сил за счет двух индоловых колец, были получены определенные аналоги путем введения мутаций в положении Тrр. Так, в пептиде 14 остаток Тrр в каждом из двух ТМР мономеров был замещен на Cys и внутримолекулярная дисульфидная связь сформировалась между двумя остатками цистеина путем окисления, что, как было предположено, имитирует гидрофобные взаимодействия между двумя остатками Тrр при димеризации пептидов. Пептид 15 является редуцированной формой пептида 14. В пептиде 16 два остатка Тrр замещены на Ala. Как показывают результаты исследований, все три аналога 41 неактивны. Эти данные также показывают, что Тrр является важным остатком для обеспечения активности ТРО миметического пептида, а не только для образования димера. Следующие два пептида (пептиды 17 а и 18) содержат в составе 8-аминокислотного линкера остаток Lys или Cys. Указанные два соединения являются предшественниками двух ПЭГированных пептидов (пептиды 19 и 20), в которых боковая цепь Lys или Cys модифицирована полиэтиленгликолем (ПЭГ). Было принято решение ввести молекулу ПЭГа в середину относительно длинного линкера, так чтобы объемный ПЭГ-компонент (5 кДа) достаточно далеко отстоял от важных связывающих сайтов в молекуле пептида. ПЭГ представляет собой известный биосовместимый полимер, который все чаще используется в качестве ковалентного модификатора для улучшения фармакокинетических профилей пептидных и основанных на пептидах терапевтических средств. Для соответствующего ПЭГирования синтетических или рекомбинантных пептидов был разработан модульный метод. Данный метод основан на хорошо разработанной в настоящее время стратегии хемоселективного лигирования, которое включает специфическую реакцию между двумя взаимоподходящими реакционноспособными функциональными группами. Так,для ПЭГирования пептида 19 боковую цепь лизина преактивируют бромацетиловой группой с получением пептида 17b для обеспечения реакции с тиол-дериватизированным ПЭГом. Для этого ортогональная защитная группа Dde используется для защиты -амина лизина. После того, как собрана целая пептидная цепь, Nконцевой амин снимают с защиты t-Boc. Затем удаляют Dde для обеспечения бромацетилирования. Указанная стратегия приводит к получению высококачественного сырого пептида, который легко очищается при использовании подходящей обратнофазовой HPLC. Лигирование пептида с тиол-модифицированным ПЭГом проводят в водной буферной среде при рН = 8 и реакцию завершают в течение 30 мин. MALDIMS анализ очищенного ПЭГированного материала выявляет характерный, напоминающий колокол спектр с приращением 44 кДа между соседними пиками. Для ПЭГ-пептида 20 остаток цистеина помещают в область линкера и его тиоловая группа боковой цепи служит сайтом прикрепления для малеимидсодержащего ПЭГа. Сходные условия используют для ПЭГирования указанного пептида. Как показывают данные исследования, указанные два ПЭГированные пептиды имеют более высокую биоактивностьin vitro по сравнению с неПЭГированными соединениями. Пептид 21 имеет в своем 8-аминокислотном линкере возможную гликозилированную структуру NGS. Поскольку приведенные в качестве примеров тандемные димеры состоят из 42 природных аминокислот, связанных пептидными связями, экспрессия такой молекулы в подходящей эукариотической клеточной системе будет приводить к получению гликопептида с углеводной группой, добавленной на карбоксиамидную боковую цепь Asn. Гликозилирование - это обычный процесс посттрансляционной модификации, который может вносить позитивный вклад в биологическую активность данного белка путем увеличения его растворимости в воде и стабильности in vivo. Как показывают данные анализа, введение указанной гликозилированной структуры в линкер поддерживает высокую биологическую активность. Синтетический предшественник возможного гликопептида имеет активность, сравнимую с таковой связанного (Glу)8-линкером аналога. Будучи гликозилированным, этот пептид, как ожидается, имеет сходный порядок активности с ПЭГированными пептидами, поскольку ПЭГ и углеводный остаток имеют одинаковые физикохимические свойства. Последний пептид является димером димеров. Его получают окислением пептида 18,которое формирует межмолекулярную дисульфидную связь между двумя цистеиновыми остатками, локализованными в линкере. Указанный пептид конструируют для того, чтобы установить, активен ли ТМР в качестве тетрамера. Данные исследования показывают, что такой пептид не более активен, чем средний тандемный димер на такой же молярной основе, что непрямым образом поддерживает идею о том,что активной формой ТМР является действительно димер, а не димеризация тандемного димера будет обеспечивать дальнейшее влияние на биологическую активность. Приведенная ниже табл. I суммирует относительные активности описанных выше соединений, выраженные, как ЕС 50, установленные на основании исследований in vitro, описанных выше. Таблица 1 Соединение EC50 ТРОSEQ ID NO:41 [кодируемая аминокислотная последовательность]. Указанный дуплекс амплифицируют в РСR-реакции при использовании 1830-52 и 1830-55 в качестве смыслового и антисмыслового праймеров.Fc-участок молекулы генерируют с помощью PCR-реакции с ДНК Fc при использовании следующих праймеров: Примечание: в табл. 1 цифры обозначают примерно 1 log активности, так что различие в активности между 1 и 4 является примерно 1000-кратным. Приращение 0,5 является промежуточной точкой, так что различие в активности между 1 и 3,5 примерно 500-кратное.ND означает, что значение не определено.II. Следующие методы касаются получения некоторых соединений второй группы, описанных здесь. А. Получение соединения Fc-слияния, показанного на фиг. 6 С. ДНК-последовательность,кодирующуюFс-участок IgGl человека, слитую с сохранением рамки считывания с димером ТРОмиметического пептида (SEQ ID NO:34), помещают под контроль промотора luxPR в плазмидном векторе экспрессии, как описано ниже. Ген слияния конструируют с использованием стандартной PCR-технологии. Матрицами для PCR-реакций служат векторы слияния, содержащие Fc-последовательность и синтетический ген, кодирующий остаток соединения SEQID NO:34. Синтетический ген конструируют на основе 4 перекрывающихся олигонуклеотидов,приведенных ниже: Олигонуклеотиды 1830-51 и 1830-52 содержат перекрывающиеся 24 нуклеотида, позволяя двум генам сливаться вместе в корректной рамке считывания путем объединения указанных выше PCR-продуктов в третьей реакции при использовании внешних праймеров 1216-52 и 1830-55. Конечный PCR-генный продукт (полноразмерный ген слияния) расщепляют рестрикционными эндонуклеазами XbaI и ВаmHI и затем лигируют в вектор pAMG21 (см. ниже),также расщепленный ХlаI и ВаmHI. Лигированный ДНК трансформируют компетентные клетки хозяйского штамма Е. coli 2596 (GM 221,описанного ниже). Клоны скринируют на способность продуцировать рекомбинантный белковый продукт и на корректность нуклеотидной последовательности гена слияния. Уровни экспрессии белка определяют в исследовании 50 мл шейкерных флаконов. Лизаты целых клеток анализируют на экспрессию гена слияния посредством окрашивания Кумасси PAGE-гелей. Аминокислотная последовательность белка слияния показана ниже под соответствующей нуклеотидной последовательностью:pANG21 Плазмида экспрессии pAMG621 доступна из АТСС под регистрационным номером 98113,под которым она была депонирована 24 июля 1996 г.GM221 (Amgen хозяйский штамм 2596) Хозяйский штамм Amgen2596 представляет собой штамм Е. coli К-12, который был модифицирован с тем, чтобы содержать температурочувствительный лямбда репрессор сI857s7 в раннем участке ebg и lacIQ репрессор в позднем участке ebg (68 мин). Наличие двух указанных репрессорных генов позволяет использование такого хозяина с различными системами экспрессии, однако, оба репрессора иррелевантны по отношению к экспрессии с luxPR. Нетрансформированный хозяин не имеет устойчивости к антибиотикам. Сайт связывания с рибосомой гена с I857s7 модифицирован с включением усиленного RBS. Он был встроен в ebg оперон между нуклеотидным положением 1170 и 1411, как пронумеровано в соответствии с регистрационным номером Genbank M644415bBa, в делецией встроенной ebg-последовательности. Конструкцию доставляют в хромосому при использовании рекомбинантного фага, обозначенного MMebg- с I857s7 (усиленный RBS4),клеток F' tet/393. После рекомбинации только хромосомная вставка, описанная выше, остается в клетке. Ее переобозначают F 'tet/GM 101.F' tet/GM 101 затем модифицируют доставкой lac IQ конструкта в ebg-оперон между нуклеотидами в положении 2493 и 2937, как 46 пронумеровано в соответствии с регистрационным номером Genbank M64441Gb-Ba, с делецией встроенной ebg-последовательности. Конструкцию доставляют в хромосому при использовании рекомбинантного фага, обозначенного AGebg-LacIQ5, в клетки F' tet/GM 101. После рекомбинации только хромосомная вставка, описанная выше, сохраняется в клетке. Ее переобозначают F' tet/GM 221. F' tet эписому выделяют из штамма при окрашивании акридиновым оранжевым в концентрации 25 мкг/мл вLB. Штамм идентифицируют как устойчивый к тетрациклину и хранят как GM221. Конструкцию слияния Fc, содержащуюся в плазмиде pAMG21 (здесь на нее ссылаются как на pAMG21-Fc-TMP-TMP), которая, в свою очередь, содержится в хозяйском штаммеGM221, депонируют в АТСС под регистрационным номером 98 957 22.10.1998 г. Экспрессия Культуры Е. coli GM 221 с pAMG21-FcTMP-TMP инкубируют в бульоне Лурии, содержащем 50 мкг/мл канамицина при 37 С до индукции. Индукцию генного продукта экспрессии Fc-TMP-TMP с luxPR промотора обеспечивают добавлением синтетического аутоиндуктора N-(3-оксохексаноил)-DL-гомосеринлактона в культуральную среду до конечной концентрации 20 нг/мл и культуры инкубируют при 37 С 3 ч. Через 3 ч бактериальные культуры исследуют под микроскопом на наличие телец включения и затем собирают центрифугированием. Преломляющие свет тельца включения наблюдают в индуцированных культурах, что свидетельствует о том, что Fc-TMP-TMP наиболее вероятным образом продуцируется в нерастворимой фракции Е. coli. Осадки клеток лизируют непосредственным образом путем ресуспендирования в буфере для образцов Лэммли,содержащем 10% бета-меркаптоэтанола, и анализируют в SDS-PAGE. В SDS-PAGE геле обнаруживают интенсивно окрашенную Кумасси полосу размером около 30 кДа. Ожидаемый генный продукт имеет 269 аминокислот и мол. массу около 29,5 кДа. Ферментацию осуществляют в стандартных условиях периодического процесса в объеме 10 л, что приводит к сходным уровням экспрессии Fc-TMP-TMP, наблюдаемым при мелкомасштабном производстве. Очистка Fc-TMP-TMP Клетки разрушают в воде (1/10) путем гомогенизации под высоким давлением (2 сеанса при 14 000 PSI) и тельца включения собирают центрифугированием (4200 RPM в J-6B в течение 1 ч). Тельца включения солюбилизируют в 6 М гуанидине, 50 мМ трисе, 8 мМ DTT, рН 8,7,в течение 1 ч при соотношении 1/10. Солюбилизированную смесь разводят в 20 раз 2 М мочевиной, 50 мМ трисом, 160 мМ аргинином, 3 мМ цистеином, рН 8,5. Смесь перемешивают в течение ночи на холоду. В этот момент процедурыFc-TMP-TMP мономерные субъединицы диме 47 ризуются с образованием связанного дисульфидными мостиками соединения, имеющего структуру, показанную на фиг. 6 С. Затем препарат концентрируют ультрафильтрацией примерно в 10 раз. Далее его разводят в 3 раза 10 мМ трисом, 1,5 М мочевиной, рН 9. РН смеси доводят до 5,0 уксусной кислотой. Преципитат удаляют центрифугированием и супернатант наслаивают на колонку Fast Flow с SPСефарозой, уравновешенную 20 мМ NaAc, 100 мМ NaCl, рН 5 (10 мг/мл наслаиваемый белок,комнатная температура). Белок элюируют при использовании градиента в 20 объемах колонки тем же самым буфером с содержанием NaCl от 100 до 500 мМ. Пул фракций, собранных с колонки, разводят в 3 раза и наслаивают на колонку с SP-Сефарозой HP в 20 мМ NaAc, 150 мМNaCl, рН 5 (10 мг/мл наслаиваемый белок, комнатная температура). Белок элюируют при использовании градиента в 20 объемах колонки тем же самым буфером с содержанием NaCl от 150 до 400 мМ. Пики объединяют и фильтруют.III. Ниже приведены суммарные данные испытаний in vivo на мышах различных заявленных соединений. Мыши. Здоровые самки BDFl примерно 10-12-недельного возраста. Схема забора крови. Десять мышей в расчете на группу обрабатывают в день 0, две группы из 20 мышей обрабатывают через 4 дня. У 5 мышей забирают кровь в каждую точку отсчета, в целом у животных забирают кровь минимум три раза в неделю. Мышей анестезируют изофлураном и общий объем 140-160 мкл крови получают пункцией орбитального синуса. Кровь исследуют в специальном анализаторе Technicon HlE, оснащенном специальной программой для анализа крови мыши. Оценивают такие параметры, как лейкоциты, эритроциты, гематокрит, гемоглобин, тромбоциты, нейтрофилы. Обработка. Мышей инъецируют подкожно болюсным введением препарата или имплантируют им микроосмотические насосы для постоянной доставки лекарства в течение 7 дней. Подкожные инъекции осуществляют в объеме 0,2 мл. Осмотические насосы встраивают подкожно, делая разрез между лопатками у анестезированных мышей. Соединения разводят в PBS 0,1% BSA. Во все эксперименты включают одну контрольную группу, помеченную носитель. Животным этой группы вводят только разбавитель. Концентрацию тестируемых соединений в насосах доводят таким образом, что откалиброванная скорость потока препаратов из насоса обеспечивала уровни обработки, указанного в диаграммах. Соединения. Титрованные дозы препаратов доставлялись мышам в течение 7 дней с помощью микро-осмотических насосов. Мышам вводили различные соединения однократными дозами 100 мкг/кг. Некоторые из соединений 48 затем вводили мышам однократной болюсной инъекцией. Результаты тестирования активности. Результаты экспериментов по тестированию активности приведены на фиг. 4 и 5. В исследованиях типа доза-ответ с 7-дневными микроосмотическими насосами (данные не показаны) максимальный эффект наблюдался при тестировании соединения SEQ ID NO:18 в дозе 100 мкг/кг/день. Доза 10 мкг/кг/день была примерно на 50% менее активной по сравнению с максимальной, а доза 1 мкг/кг/день была наименьшей,при которой активность еще выявлялась в данной системе анализа. Соединение в дозе 10 мкг/кг/день было примерно таким же активным,как и неПЭГированное соединение rHu-MGDF в дозе 100 мкг/кг/день в том же самом эксперименте.IV. Обсуждение. Хорошо известно, что MGDF действует сходным образом с гормоном роста человека(hGH), т. е. одна молекула белкового лиганда связывает две молекулы рецептора для активации последнего (Wells, J. A. et al., Ann. Rev. Biochem. 65: 609-634 (1996. Это взаимодействие имитируется действием существенно меньших по размеру пептидов ТМР. Однако настоящие исследования позволяют предположить, что такая имитация требует согласованного действия двух ТМР-молекул, поскольку ковалентная димеризация ТМР как в С-С параллельной, так и в C-N последовательной ориентации увеличивает биологический потенциал in vitro первоначального мономера более чем в 103 раз. Относительно низкий биологический потенциал мономера, возможно, обусловлен неэффективным образованием нековалентного димера. Предобразованный ковалентный димер обладает способностью элиминировать энтропийный барьер для формирования нековалентного димера, которое исключительным образом направляется слабыми, нековалентными взаимодействиями между двумя молекулами небольшого, состоящего из 14 аминокислотных остатков пептида. Интересно отметить, что большая часть тандемных димеров более активна, чем Сконцевые параллельные димеры. Тандемная димеризация, по-видимому, приводит к формированию молекулы с лучше подогнанной конформацией, чем это обеспечивает С-С параллельная димеризация. Кажущиеся несимметричные свойства тандемного димера, должно быть, делают его ближе к природному лиганду,который, как несимметричная молекула, имеет два различных сайта для связывания двух идентичных рецепторных молекул. Введение молекулы ПЭГа усиливает активность in vivo модифицированного пептида,обеспечивая его защиту от протеолитической деградации и замедляя его выведение посредством почечной фильтрации. Неожиданным оказалось то, что ПЭГирование способно далее 49 увеличивать биологическую активность тандемно димеризованного ТМР пептида, как определяется в исследовании клеточной пролиферации.V. Ниже приведены суммированные данные исследований in vivo, проведенных на обезьянах с различными заявленными соединениями. Для оценки гематологических параметров самок обезьян, ассоциированных с введением АМР 2 посредством подкожной инъекции, был разработан и использован следующий протокол. Формировали 5 групп, состоящих из трех обезьян каждая. Группа 1 была контрольной, животные этой группы получали ацетатный буфер (20 мМ ацетата натрия, 0,25 М хлорида натрия, рН 5), не содержащий ни АМР 2, ни ПЭГированный рекомбинантный MGDF (ПЭГ-rHuMGDF) человека. Группа 2 получала одну или более доз АМР 2 с интервалами, описанными ниже. Группа 3 получала 1000 мкг/кг АМР 2 с интервалами,описанными ниже. Группа 4 получала 5000 мкг/кг АМР 2 с интервалами, описанными ниже,и группа 5 получала 100 мкг/кг ПЭГ-r HuMGDF с интервалами, описанными ниже. День, в который была введена первая однократная доза, был обозначен как День 0 Цикла 1. В Цикле 2 дозы вводились в День 21, 23,25, 28, 30 и 32. Во время Цикла 3 однократную дозу вводили в День 84, а во время Цикла 4 - в День 123. Животных наблюдали с целью выявления клинических симптомов один раз в день во время периода адаптации, три раза в день (до введения дозы, через 30 мин после введения дозы и через 2-3 ч после введения дозы) в дни введения препарата и один раз в день, когда препарат не вводили. Потребление пищи каждым животным рассчитывали каждый день на основе числа кусочков пищи, которые получали животные и которые оставались, начиная с 7 дней до начала периода введения доз и до самого конца восстановительного периода. Вес тела каждого животного определяли дважды до начала сведения доз и дважды в течение периода дозирования и периода восстановления. Образцы крови для гематологического исследования получали до начала дозирования и в Дни 1, 3, 5,7, 9, 11, 13, 15, 20, 22, 24, 26, 29, 31, 33, 35, 37,39, 41, 43, 45, 47, 49, 55, 62, 69, 76, 83, 85, 87, 89,91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 111, 122, 124,126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144,150. Для фармакокинетического анализа 0,5 мл сыворотки собирали до начала дозирования и через 1,4 и 24 ч после введения доз. Образцы собирали в Дни 0, 21, 32, 84 и 124 и хранили примерно при -70 С до начала исследований. Для выявления антител отбирали 2 мл образца крови за неделю до введения однократной дозы и в Дни 0 (до начала дозирования), 6, 13, 20, 27,34, 41, 48, 55, 62, 69, 76, 83, 90, 97, 104, 111, 118,129, 126, 143 и 150. Образцы хранили при -70 С до исследований. 50 Результаты исследований показывают, что уровни тромбоцитов увеличиваются во всех обработанных группах, причем наибольшее увеличение наблюдается при введении ПЭГrHuMGDF и высоких доз АМР 2. В Цикле 1 пик числа тромбоцитов увеличивается примерно в 3,3 раза и 3,1 раза в группах, которым вводили ПЭГ-rHuMGDF (День 9) и 5000 мкг/кг АМР 2(День 9) соответственно, по сравнению со средним пиковым значением в контрольной группе. При низкой дозе АМР 2 число тромбоцитов увеличивается примерно в 1,5 раз по сравнению с контрольным в те же самые дни исследований. Сходные ответы регистрируются во всех других циклах. Однако в Цикле 4 группа, обработанная ПЭГ-rHuMGDF, не обнаруживала такого большого увеличения числа тромбоцитов, как в предыдущих циклах. В группе ПЭГ-rHuMGDF число тромбоцитов увеличилось примерно в 2 раза по сравнению с контрольной группой через 9 дней после введения дозы в этом цикле. Для сравнения среднее число тромбоцитов при наивысшей дозе препарата в группе АМР 2 Цикла 4 было в 3,3 раза больше, чем в контрольной группе. Кроме того, у животных, получавших ПЭГ-rHuMGDF, среднее количество тромбоцитов было на 53% ниже, чем в контрольной группе в начале Цикла 4 (на дозу), а среднее число тромбоцитов в группе в конце цикла 4 (27 дней после введения дозы) было на 79% ниже, чем в контрольной группе. Для всех АМР 2 животных среднее число тромбоцитов в начале и конце Цикла 4 составляло 15% от количества тромбоцитов в контрольной группе. В Цикле 1 и 2 тенденция к уменьшению числа эритроцитов (RBC) наблюдалась во всех обработанных группах по сравнению с контролем. Уменьшение было наиболее очевидным к Дню 41-43 и наибольшее уменьшение числаRBC наблюдалось в группе ПЭГ-rHuMGDF. Число RBC начинало возвращаться к нормальным уровням (по сравнению с контролем) к Дню 47. Количество лейкоцитов (WBC) во время Циклов 1 и 2 существенно увеличивалось (в 2,6 раза) по сравнению с контролем к Дню 33. Значения приближались к нормальным (контрольным), начиная с Дня 37. Сходный ответ наблюдался в Цикле 3 с отсутствием явных изменений числа WBC в Цикле 4 в какой-либо из обработанных групп. Во время цикла 3 число RBC незначительно уменьшалось к Дню 13 (за однократной дозой Цикла 3) во всех обработанных группах за исключением группы, получавшей 500 мкг/кг АМР 2. Уровни RBC начинали возвращаться к нормальным (по сравнению с контролем) к Дню 17. В Цикле 4 количество RBC увеличивалось во всех трех обработанных группах по сравнению с контрольной, за исключением группы,получавшей 500 мкг/кг АМР 2. В отличие от 51 других циклов, в Цикле 4 наблюдалась более чем одно, резкое падение значений. Эти уменьшения появлялись в Дни 1-9 после введения дозы и начинали восстанавливаться к Дню 11. Полученные результаты свидетельствуют о том, что увеличение числа тромбоцитов по сравнению с контрольными животными может быть выявлено через 7-9 дней после введения препаратов у всех животных во всех циклах. Повидимому, повторные дозы вызывают более высокий ответ с точки зрения образования тромбоцитов по сравнению с однократными дозами. Начиная с Цикла 4, тромбоцитарный ответ в группе ПЭГ-rHuMGDF был ниже по сравнению с предыдущими циклами и по сравнению с ответом при высокой дозе АМР 2. Уменьшение числа RBC наблюдалось в Циклах 1, 2, 3 и 4 в наиболее интенсивно обработанных группах в определенной точке каждого цикла,однако, все гематологические параметры возвращались к нормальным уровням (по сравнению с контролем) после прекращения введения препарата. Более того, приведенные результаты свидетельствуют о том, что обработка АМР 2 хорошо переносится обезьянами резус, а АМР 2 приводит к увеличению числа тромбоцитов после различных циклов обработки. Не выявлялось,что показано на основе результирующего учета числа тромбоцитов, что существует биологический значительный иммунно-опосредованный ответ на АМР 2. В противоположность указанному, введение в различных циклах ПЭГrHuMGDF ингибирует тромбоцитарный ответ в Цикле 4, позволяя предположить, что антитела к ПЭГ-rHuMGDF образуются в организме и такие анти-MGDF антитела могут перекрестно реагировать с эндогенным ТРО обезьян резус. Несмотря на подробное описание изобретения, специалисту в данной области ясно, что могут быть сделаны его различные изменения и модификации, которые не выходят за рамки сущности и объема изобретения.TMP1(L1)n-TMP2,где ТМР 1 и ТМP2, каждый независимо друг от друга, выбран из группы коровых соединений,имеющих структуру Х 2 - Х 3 - Х 4 - Х 5 - Х 6 - Х 7 - Х 8 - Х 9 - Х 10,причем Х 2 выбран из группы, включающей Glu,Asp, Lys и Val; Х 3 выбран из группы, включающей Gly иL1 представляет собой линкер, а n = 0 или 1,а также его физиологически приемлемые соли. 2. Соединение по п.1, причем TMP1 и ТМР 2 независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Х 2-Х 3-Х 4-Х 5-Х 6-Х 7-Х 8-Х 9-Х 10-Х 11; Х 2-Х 3-Х 4-Х 5-Х 6-Х 7-Х 8-Х 9-Х 10-Х 11-Х 12; Х 2-Х 3-Х 4-Х 5-Х 6-Х 7-Х 8-Х 9-Х 10-Х 11-Х 12-Х 13; Х 2-Х 3-Х 4-Х 5-Х 6-Х 7-Х 8-Х 9-Х 10-Х 11-Х 12-Х 13-Х 14;X14 выбран из группы, включающей Ala,Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu и Gly. 3. Соединение по п.1, в котором TMP1 и/или ТМР 2 дериватизированы одним или более из указанных ниже способов: один или более пептидил [-С(О)NR-]мостиков (связей) замещены непептидильным мостиком, таким как -СH2-карбаматный мостик