Белки, связывающие интерлейкин-18, их получение и применение
Номер патента: 3675
Опубликовано: 28.08.2003
Авторы: Ким Соо Хиун, Рубинштейн Менахем, Новик Даниела, Динарелло Чарльз
Формула / Реферат
1. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
(a) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из AA1-AA192 SEQ ID NO: 2, AA29-AA192 SEQ ID NO: 2, AA1-AA197 SEQ ID NO: 6 и AA29-AA197 SEQ ID NO: 6,
(b) мутеина любой последовательности, указанной в подпункте (a), где аминокислотная последовательность указанного мутеина обладает, по крайней мере, 70% идентичностью, по крайней мере, с одной последовательностью, указанной в подпункте (a);
где полипептид, охарактеризованный в подпункте (a) или (b), связывается с IL-18.
2. Полипептид по п.1, где любые изменения аминокислотной последовательности мутеина, охарактеризованного в подпункте (b) п.1, представляют собой аминокислотные замены в аминокислотных последовательностях, охарактеризованных в подпункте (a) п.1.
3. Полипептид по п.1, где аминокислотная последовательность содержит AA1-AA192 SEQ ID NO: 2 или AA29-AA192 SEQ ID NO: 2.
4. Полипептид по п.1, где полипептид гликозилирован в одном или нескольких положениях.
5. Полипептид по п.1, где полипептид негликозилирован.
6. Полипептид по п.1, где полипептид дополнительно содержит, по крайней мере, один радикал, присоединенный к одной или нескольким функциональным группам, которые являются одной или несколькими боковыми цепями аминокислотных остатков N- или C-концевых групп.
7. Полипептид по п.1, где полипептид претерпел циклическую перестановку.
8. Полипептид по п.1, где полипептид представляет собой невирусный белок.
9. Полипептид по п.1, где полипептид представляет собой человеческий белок.
10. Полипептид по п.1, где полипептид представляет собой слитый белок.
11. Полипептид по п.10, где полипептид содержит Ig.
12. Полипептид по п.1 или 10, где полипептид является растворимым.
13. Полипептид по п.1, где полипептид модифицирован ПЭГ.
14. Полипептид по п.6, где указанный, по крайней мере, один радикал представляет собой полиэтиленгликолевый радикал.
15. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность AA1-192 SEQ ID NO: 2 или AA29-AA192 SEQ ID NO: 2 или их варианты, содержащие консервативные аминокислотные замены.
16. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность AA1-112 SEQ ID NO: 4 или AA29-AA112 SEQ ID NO: 4 или их варианты, содержащие консервативные аминокислотные замены.
17. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность AA1-197 SEQ ID NO: 6 или AA29-AA197 SEQ ID NO: 6 или их варианты, содержащие консервативные аминокислотные замены.
18. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность AA1-161 SEQ ID NO: 8 или AA29-AA161 SEQ ID NO: 8 или их варианты, содержащие консервативные аминокислотные замены.
19. Выделенный полипептид, который включает аминокислотную последовательность AA29-40 SEQ ID NO: 10 или AA1-AA40 SEQ ID NO: 10, где полипептид связывается с IL-18 и модулирует или блокирует биологическую активность IL-18.
20. Полипептид по п.19, где полипептид содержит Ig-домен.
21. Очищенный IL-18-связывающий белок (IL-18BP), где белок характеризуется следующим:
(a) белок обладает молекулярной массой приблизительно 40 кДа по данным ДСН-ЭПАГ в исходной гликозилированной форме;
(b) белок связывается с IL-18 и модулирует или блокирует активность IL-18 и
(c) белок обладает N-концевой последовательностью, которая включает аминокислотную последовательность AA29-40 SEQ ID NO: 10 или AA1-AA40 SEQ ID NO: 10 или их варианты, содержащие консервативные аминокислотные замены.
22. Активный фрагмент белка IL-18BP по п.1 или 21, где активный фрагмент связывается с IL-18 и модулирует или блокирует активность IL-18.
23. Выделенный полипептид IL-18BP, обладающий N-концевой последовательностью, которая включает аминокислотную последовательность AA29-40 SEQ ID NO: 10 или AA1-AA40 SEQ ID NO: 10 или их варианты, содержащие консервативные аминокислотные замены, и Ig-домен, где полипептид связывается с IL-18 и модулирует или блокирует активность IL-18.
24. Смесь любых полипептидов, охарактеризованных в пп.1, 15-19, 21 и 22.
25. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
(a) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из AA1-AA192 SEQ ID NO: 2, AA29-AA192 SEQ ID NO: 2, AA1-AA112 SEQ ID NO: 4, AA29-AA112 SEQ ID NO: 4, AA1-AA197 SEQ ID NO: 6, AA29-AA197 SEQ ID NO: 6, AA1-AA161 SEQ ID NO: 8 и AA29-AA161 SEQ ID NO: 8,
(b) мутеина любой последовательности, указанной в подпункте (a), где аминокислотная последовательность указанного мутеина обладает, по крайней мере, 70% идентичностью, по крайней мере, с одной последовательностью, указанной в подпункте (a).
26. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
(a) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, кодирующей AA1-AA192 SEQ ID NO: 2 или AA29-AA192 SEQ ID NO: 2;
(b) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, кодирующей AA1-AA112 SEQ ID NO: 4 или AA29-AA112 SEQ ID NO: 4;
(c) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, кодирующей AA1-AA197 SEQ ID NO: 6 или AA29-AA197 SEQ ID NO: 6;
(d) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 7, кодирующей AA1-AA161 SEQ ID NO: 8 или AA29-AA161 SEQ ID NO: 8;
(e) нуклеотидной последовательности, комплемент которой связывается в условиях высокой жесткости с любой из нуклеотидных последовательностей, охарактеризованных в подпунктах (a)-(d), и которая кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из AA1-AA192 SEQ ID NO: 2, AA29-AA192 SEQ ID NO: 2, AA1-AA112 SEQ ID NO: 4, AA29-AA112 SEQ ID NO: 4, AA1-AA197 SEQ ID NO: 6, AA29-AA197 SEQ ID NO: 6, AA1-AA161 SEQ ID NO: 8 и AA29-AA161 SEQ ID NO: 8.
27. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9 или нуклеотидную последовательность, комплемент которой связывается с ней в условиях высокой жесткости.
28. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: I, 3, 5 и 7, или область SEQ ID NO: 1, 3, 5 и 7, кодирующую зрелый белок.
29. Способ определения, выделения или амплификации нуклеотидной последовательности, кодирующей IL-18BP, предусматривающий применение нуклеиновых кислот, охарактеризованных в любом из пп.25-28, в качестве праймера или зонда.
30. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, охарактеризованную в любом из пп.25-28.
31. Вектор по п.30, дополнительно содержащий промотор, оперативно связанный с указанной молекулой нуклеиновой кислоты.
32. Штамм эукариотических клеток, генетически модифицированных для продуцирования полипептида, охарактеризованного в любом из пп.1-23.
33. Штамм прокариотических клеток, генетически модифицированных для продуцирования полипептида, охарактеризованного в любом из пп.1-23.
34. Штамм по п.32 или 33, где клетки генетически модифицированы вектором по п.30.
35. Штамм по п.32, где клетки представляют собой клетки млекопитающего.
36. Способ получения полипептида, охарактеризованного в любом из пп.1-23, предусматривающий культивирование штамма клеток, охарактеризованного в любом из пп.32-35, в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного полипептида.
37. Моноклональное антитело, иммуноспецифично связывающееся с полипептидом, охарактеризованным в любом из пп.1-23.
38. Антитело по п.37, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.
39. Способ определения IL-18BP в образце, предусматривающий взаимодействие указанного образца с антителом, охарактеризованным в п.37, и дальнейшее определение наличия связанного антитела.
40. Способ очистки полипептида IL-18BP, предусматривающий взаимодействие образца IL-18BP с антителом против IL-18BP, охарактеризованным в п.37, удаление несвязавшегося беыър из образца с последующей элюцией связавшегося IL-18BP.
41. Способ выделения или очистки IL-18BP, охарактеризованного в любом из пп.1-23, предусматривающий
(a) пропускание образца через хроматографическую колонку, с которой связывается IL-18;
(b) промывание колонки для удаления несвязавшегося белка из образца и
(c) элюцию связавшегося IL-18BP.
42. Способ выделения или очистки IL-18BP, охарактеризованного в любом из пп.1-23, предусматривающий взаимодействие образца с субстратом, с которым связан IL-18, удаление несвязавшегося белка из образца с последующей элюцией связавшегося IL-18BP.
43. Способ получения производного IL-18BP, предусматривающий получение ДНК-конструкта, который кодирует полипептид, охарактеризованный в любом из пп.1, 15-19 и 21-23, лигированный с нуклеиновой кислотой, кодирующей второй полипептид, где при экспрессии указанный ДНК-конструкт кодирует слитый белок, содержащий полипептид, охарактеризованный в любом из пп.1, 15-19 и 21-23, слитый со вторым полипептидом.
44. Способ по п.43, где указанным вторым полипептидом является Ig.
45. Способ получения производного IL-18BP, предусматривающий химическую модификацию полипептида, охарактеризованного в любом из пп.1 и 15-19, с включением, по крайней мере, одного модифицирующего радикала.
46. Способ по п.45, где модифицирующий радикал представляет собой полиэтиленгликолевый радикал.
47. Композиция, содержащая полипептиды, охарактеризованные в любом из пп.1-24, и фармацевтически приемлемый носитель.
48. Композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, охарактеризованную в любом из пп.25-28, и фармацевтически приемлемый носитель.
49. Композиция, содержащая антитело, охарактеризованное в п.37 или 38, и фармацевтически приемлемый носитель.
50. Набор, содержащий в одном или нескольких сосудах фармацевтическую композицию, охарактеризованную в п.47.
51. Набор, содержащий в одном или нескольких сосудах фармацевтическую композицию, охарактеризованную в п.48.
52. Набор, содержащий в одном или нескольких сосудах фармацевтическую композицию, охарактеризованную в п.49.
53. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
(a) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из AA1-AA192 SEQ ID NO: 2, AA29-AA192 SEQ ID NO: 2, AA1-AA197 SEQ ID NO: 6 и AA29-AA197 SEQ ID NO: 6;
(b) мутеина любой последовательности, указанной в подпункте (a), где аминокислотная последовательность указанного мутеина обладает, по крайней мере, 70% идентичностью, по крайней мере, с одной последовательностью, указанной в подпункте (a);
где указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который связывается с IL-18.
54. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
(a) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, кодирующей AA1-AA192 SEQ ID NO: 2 или AA29-AA192 SEQ ID NO: 2;
(b) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, кодирующей AA1-AA197 SEQ ID NO: 6 или AA29-AA197 SEQ ID NO: 6;
(c) нуклеотидной последовательности, комплемент которой связывается в условиях высокой жесткости с любой из нуклеотидных последовательностей, охарактеризованных в подпунктах (a)-(b);
где указанная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который связывается с IL-18.
55. Рекомбинантная молекула ДНК, включающая молекулу нуклеиновой кислоты, охарактеризованную в п.53 или 54, лигированную со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей второй полипептид, где при экспрессии указанная рекомбинантная молекула ДНК кодирует слитый белок, содержащий полипептид, охарактеризованный в любом из пп.1, 15-19 и 21-23, слитый со вторым полипептидом.
56. Применение IL-18BP по любому из пп.1-24 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения поражения печени.
57. Применение по п.56, где поражение печени является острым.
58. Применение по п.56, где поражение печени является хроническим.
59. Применение по любому из пп.56-58, где поражение печени представляет собой алкогольный гепатит, вирусный гепатит, иммунный гепатит, фульминативный гепатит, цирроз печени и первичный билиарный цирроз печени.
60. Применение по п.59, где поражение печени представляет собой фульминативный гепатит.
61. Применение IL-18BP по любому из пп.1-24 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения артрита.
62. Применение по п.61, где артрит представляет собой воспалительный артрит.
63. Применение по п.62, где воспалительный артрит представляет собой ревматоидный артрит.
64. Применение IL-18BP по любому из пп.1-24 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения деструкции хряща.
65. Применение IL-18BP по любому из пп.1-24 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника.
66. Применение по п.65, где воспалительное заболевание кишечника представляет собой болезнь Крона.
67. Применение по п.65, где воспалительное заболевание кишечника представляет собой неспецифический язвенный колит.
68. Применение по любому из пп.56-67, где указанное лекарственное средство предназначено для подкожного введения.
69. Применение по любому из пп.56-67, где указанное лекарственное средство предназначено для внутримышечного введения.
70. Применение по любому из пп.56-69, где указанное лекарственное средство назначается ежедневно.
71. Применение по любому из пп.56-69, где указанное лекарственное средство назначается через день.
72. Применение вектора по п.30 или 31 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения поражения печени.
73. Применение вектора по п.30 или 31 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения артрита.
74. Применение вектора по п.30 или 31 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника.
75. Применение по любому из пп.72-74 для генной терапии.
76. Применение вектора по п.30 или 31 для индукции и/или увеличения эндогенной продукции IL-18BP в клетке для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения поражения печени.
77. Применение вектора по п.30 или 31 для индукции и/или увеличения эндогенной продукции IL-18BP в клетке для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения артита.
78. Применение вектора по п.30 или 31 для индукции и/или увеличения эндогенной продукции IL-18BP в клетке для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника.
79. Использование штамма клеток по любому из пп.32-35 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения поражения печени.
80. Использование штамма клеток по любому из пп.32-35 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения артрита.
81. Использование штамма клеток по любому из пп.32-35 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника.
Текст
1 Область изобретения Данное изобретение относится к интерлейкин-18-связывающему белку (IL-18), в дальнейшем IL-18BP, который способен связыватьIL-18. В частности, это изобретение относится к растворимому IL-18BP, получаемому из биологических жидкостей, к растворимым IL-ВР, получаемым в результате экспрессии соответствующих ДНК-векторов в клетках-хозяевах, к кодируемым вирусом гомологам IL-18 ВР, получаемым посредством экспрессии соответствующих ДНК-векторов в клетках-хозяевах, к векторам, экспрессирующим различные IL-BP, к векторам, применимым для экспрессии IL-18BP у людей и других млекопитающих, к антителам против IL-18BP, к терапевтическому применению указанных IL-18BP посредством модулирования и/или блокирования активности IL-18, к терапевтическому применению указанных экспрессирующих векторов для модулирования и/или блокирования активности IL-18 и к применению антител. Предпосылки изобретения В 1989 году было описано индуцируемое эндотоксином сывороточное активное вещество,стимулирующее выработку интерферона-гамма(IFN-), выделенное из клеток селезенки мыши(27). Данное сывороточное активное вещество действует не как непосредственный индукторIFN-, а скорее как костимулятор вместе с IL-2 или митогенами. Попытка выделить активное вещество из сыворотки мышей, предварительно обработанных эндотоксином, позволила выявить, по-видимому, гомогенный белок массой 50-55 кДа (26). Так как другие цитокины способны действовать как костимуляторы продукции IFN-, невозможность нейтрализации сывороточного активного вещества нейтрализующими антителами против IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 илиTNF позволяет предположить, что оно является отличным фактором. В 1995 г. те же исследователи показали, что индуцируемый эндотоксином костимулятор продукции IFN- присутствует в экстрактах печени мышей, предварительно обработанных Р.acnes (31). В этой модели, популяция макрофагов печени (клетки Купфера) увеличивается, и для этих мышей становится летальной низкая доза бактериального липополисахарида (LPS), которая не является летальной для необработанных мышей. Фактор,названный IFN- - индуцирующим фактором(IGIF), позднее обозначенный как интерлейкин 18 (IL-18), выделили в гомогенном состоянии из 1200 г печени мышей, обработанных Р.acnes. Вырожденные олигонуклеотиды, полученные из аминокислотных последовательностей очищенного IL-18, применяли для клонирования кДНКIL-18 мыши (31). IL-18 представляет собой белок массой 18-19 кДа из 157 аминокислот, который не имеет никакой явной гомологии с какимлибо пептидом из баз данных. Мессенджерные(31). Подобно индуцированному эндотоксином сывороточному активному веществу сыворотки,IL-18 сам по себе не индуцирует IFN-, a действует, главным образом, как костимулятор с митогенами или IL-2. IL-18 усиливает пролиферацию Т-клеток, по-видимому, посредством IL-2 зависимого механизма, и увеличивает in vitro продукцию цитокинов -Th-1 и в случае сочетанного действия с IL-12 проявляет синергизм,увеличивая продукцию IFN- (24). Было показано, что нейтрализующие антитела против IL-18 мыши предотвращают летальное действие низких доз LPS на мышей,предварительно обработанных Р.acnes. Другие исследователи сообщали о значении IFN- как медиатора летального действия LPS у предварительно обработанных мышей. Например, нейтрализующие анти-IFN- - антитела предупреждали развитие у мышей генерализованной реакции Шварцмана (16), а обработанные галактозамином мыши с дефицитом IFNрецептора,оказываются резистентными к гибели, вызванной LPS (7). Следовательно, не является неожиданным, что нейтрализующие антитела противLPS (31). К тому же обработка антитела против мышиного IL-18 предотвращает тяжелую печеночную цитотоксичность у выживших мышей. После того как клонировали мышиную форму, в 1996 г. описали последовательность кДНК IL-18 человека (38). Рекомбинантный IL18 человека проявляет активность нативного IL18 (38). Рекомбинантный IL-18 человека не проявляет непосредственной индуцирующий IFNактивности в Т-клетках человека, а действует как костимулятор продукции IFN- и других цитокинов Т-хелперов-1 (Тh-1) (38). В настоящее время, IL-18 рассматривают главным образом как костимулятор продукции цитокинов Th1 (IFN-, IL-2 и колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов) (20), а также как костимулятор для FAS-лиганд-опосредованной цитотоксичности клонов натуральныхкиллеров мыши (37). В результате клонирования IL-18 из поврежденных тканей и изучения экспрессии генаIL-18, выявлена тесная связь этого цитокина с аутоиммунным заболеванием. У нетучных диабетических (NOD) мышей спонтанно развивается аутоиммунный инсулит и сахарный диабет,которые усиливают и синхронизируют однократной инъекцией циклофосфамида. С помощью полимеразной цепной реакции (PCR) с обратной транскриптазой выявляют мРНК IL-18 в поджелудочной железе мышей-NOD на ранних 3 стадиях инсулита. После обработки циклофосфамидом быстро увеличивается содержание мРНК IL-18 и это предшествует возрастанию мРНК IFN- и далее развитию сахарного диабета. Интересно, что эти кинетические параметры подобны кинетике мРНК IL-12-p40, что приводит в результате к тесной корреляции с содержанием отдельных мРНК. Клонирование кДНКIL-18 из РНК поджелудочной железы с последующим секвенированием позволило выявить идентичность с последовательностью IL-18,клонированной из купферовых клеток и in vivo из предварительно активированных макрофагов. Макрофаги мышей-NOD отвечают на циклофосфамид экспрессией гена IL-18, тогда как макрофаги параллельно обработанных мышейBalb/c не реагируют. Поэтому, экспрессия IL-18 регулируется аномально у аутоиммунных мышей-NOD и тесно ассоциирована с развитием сахарного диабета (32).IL-18 играет существенную роль в иммунорегуляции или воспалении посредством увеличения функциональной активности Fasлиганда на Th-1 клетках (10). IL-18 также экспрессируется в коре надпочечника и поэтому является секретируемым нейроиммуномодулятором, играющим важную роль в настройке иммунной системы после воздействия стрессаIn vivo, IL-18 образуется в результате расщепления pro-IL-18 и, как оказалось, его эндогенная активность объясняет продукцию IFN- в случаях летальности, опосредованной Р.acnes иLPS. Вследствие его активности, блокирование биологической активности IL-18 при заболевании человека является терапевтической стратегией при многочисленных болезнях. Этого достигают использованием растворимых рецепторов или блокирующих антител к связанному с клеткой рецептору IL-18. Белки, связывающие цитокины, (растворимые рецепторы цитокинов) соответствуют внеклеточным лигандсвязывающим доменам соответствующих им рецепторов клеточной поверхности цитокинов. Их получают или посредством альтернативного сплайсинга пре-мРНК,свойственной рецептору клеточной поверхности, или посредством протеолитического расщепления рецептора клеточной поверхности. Такие растворимые рецепторы были описаны ранее, включая в частности растворимые рецепторы IL-6 и IFN- (30), TNF (11, 12), IL-1 и IL-4(21), IFN-/ (28, 29) и другие. Один цитокинсвязывающнй белок, названный остеопротегерин (OPG, также известный как фактор, ингибирующий остеокласты - ОСIF), член TNFR/Fas семейства, является первым примером растворимого рецептора, который существует только как секретируемая белок (1, 34, 39). 4 Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к IL-18 связывающим белкам, (IL-18BP) и кодируемым вирусами гомологам IL-18BP (в дальнейшем,вирусные IL-18BP), и рекомбинантным белкам,мутеинам, функциональным производным, активным фрагментам и их преобразованные через циклизование производные, способные связывать IL-18. Изобретение также относится к способу выделения IL-18BP из жидкостей организма человека, и способу получения их с помощью рекомбинантных методик. Изобретение также относится к векторам, экспрессирующим IL18BP, подходящим для экспрессии IL-18BP у людей и других млекопитающих. Отдельные IL18BP, кодируемые вирусами гомологи IL-18BP,гибридные белки, мутеины, функциональные производные, активные фрагменты и их преобразованные через циклизование производные по настоящему изобретению применимы для модулирования и/или блокирования активности IL18. Также обеспечены реплицируемые экспрессирующие векторы, содержащие последовательности ДНК, подходящие для экспрессии различных IL-18BP в клетках-хозяевах, трансформированных ими, и белки и полипептиды,продуцируемые посредством экспрессии такими хозяевами. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, состоящим из приемлемых носителей и IL-18BP, или вирусных IL-18BP или векторов, экспрессирующих их у людей и других млекопитающих, для лечения заболеваний или состояний, при которых необходимо модулирование или блокирование активности IL-18. Далее изобретение относится к антителам против IL-18BP и вирусных IL-18BP, подходящим для их аффинной очистки и иммуноанализа. Описание чертежей Фиг. 1 представляет SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) IL-18-связывающего белка, очищенного по афинной методике. Неочищенные белки мочи (500 л мочи здоровых людей, сконцентрированной ультрафильтрацией) наносят на колонку с IL-18-агарозой. Колонку промывали, а связанные белки элюировали при рН 2,2. Элюированные фракции нейтрализовывали и аликвоты анализировали с помощьюSDS-PAGE (10% акриламид) в невосстанавливающих условиях и при окрашивании серебром. Дорожки представляют собой 1: неочищенные белки мочи (1,5 мкг наносят на гель); 2-9: элюаты 1-8 соответственно с колонки с IL-18 агарозой; 10: маркеры молекулярных масс в кДа, указанные справа. Стрелка указывает зону,соответствующую IL-18BP. 5 Фиг. 2 изображает авторадиограмму SDSPAGE (7,5% акриламид) комплексов, состоящих из 125I-IL-18 (кажущаяся молекулярная масса 19 кДа), поперечно-связанного со следующими препаратами растворимого IL-18-связывающего белка; дорожка 1: промывка с IL-18-аффинной колонки; дорожка 2: элюция 2 с IL-18-аффинной колонки; дорожка 3: элюция 3 с IL-18-аффинной колонки. Справа указаны маркеры молекулярных масс (в кДа). Стрелка указывает поперечносшитый продукт (58 кДа). Фиг. 3 изображает ингибирование индуцированной IL-18 продукции IFN- посредством(A) Спленоциты мыши стимулируют (24 ч,37 С) указанными сочетаниями LPS (1 мкг/мл) и IL-18 человека (5 нг/мл), добавленными или непосредственно, или после предварительного смешивания (1 ч, 37 С) с IL-18BP мочи. Уровень muIFN- (мыши) в культуре определяют через 24 ч.(B) Спленоциты мыши инкубируют (24 ч) с LPS (1 мкг/мл) вместе с IL-18 мыши (10 нг/мл), предварительно смешанный (1 ч, 37 С) с возрастающими концентрациями IL-18BP человека.(C) Спленоциты мыши инкубируют (24 ч) с LPS (10 мкг/мл) вместе с возрастающими концентрациями IL-18BP человека.(D) Спленоциты мыши инкубируют (24 ч) с Con А (конканавалином А) (мкг/мл) вместе с возрастающими концентрациями IL-18BP человека.TNF- (20 нг/мл) и huIL-18 (человека) (25 нг/мл), добавленных или одних, или после предварительного смешивания (1 ч, 37 С) с IL18BP мочи. На фиг. 4 представлена последовательность кДНК IL-18BPa человека и белка. Сигнальный пептид подчеркнут. На фиг. 5 представлена последовательность кДНК IL-18BPb человека и белка. Сигнальный пептид подчеркнут. На фиг. 6 представлена последовательность кДНК IL-18BPc человека и белка. Сигнальный пептид подчеркнут. На фиг. 7 представлена последовательность кДНК IL-18BPd человека и белка. Сигнальный пептид подчеркнут. На фиг. 8 изображена последовательность гена IL-18BP человека. Определяют последовательность геномного клона (7,1 т.п.н.) человека и сравнивают с последовательностями различных клонов кДНК, выделенных из 3 кДНК библиотек. Общий стартовый кодон трансляции представляет собой нуклеотиды 683-685. NuMAl ген локализуется на негативной цепи от нуклеотида 3578 до конца. 6 Фиг. 9 показывает влияние рекомбинантного IL-18BP на активность IL-18 человека и мыши.(A) IL-18 человека (5 нг/мл) предварительно смешивают или с Нis6-меченым-IL-18 ВРа,или с RPMI и добавляют к клеткам селезенки мыши вместе с LPS (1 мкг/мл). Продукцию IFN измеряют через 24 ч.(B) IL-18 мыши (10 нг/мл) предварительно смешивают или с Нis6-меченым-IL-18 ВРа, или сRPMI и добавляют к клеткам селезенки мыши вместе с LPS (1 мкг/мл). Продукцию IFN- измеряют через 24 ч.(C) IL-18 человека (25 нг/мл) предварительно смешивают или с COS7-IL-18BPa, или с(D) IL-18 человека (25 нг/мл) предварительно смешивают или с COS7-IL-18BPa, или сRPMI и добавляют к KG-1 клеткам человека в присутствии TNF- (20 нг/мл). Подробное описание изобретения Данное изобретение относится к различным IL-18BP и вирусным IL-18BPs, которые связывают IL-18. Такие IL-18BP модулируют и/или блокируют биологические активности IL18. Термин IL-18BP и вирусные IL-18B включает в себя зрелый белок (без сигнальной последовательности), белок, содержащий сигнальную последовательность, мутеины IL-18BP и вирусных IL-18BP, производные IL-18BP и вирусныхIL-18BP и усеченные формы IL-18BP и вирусных IL-18BP и их соли. Далее изобретение относится к ДНК, кодирующим различные IL-18 ВР, вирусные IL18BP, мутеины, рекомбинантные белки, функциональные производные, активные фракции и их смеси. Указанная ДНК представляет собой геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК,продукт PCR или их сочетания. Эти ДНК вставляют в реплицируемые носители экспрессии для экспрессии различных IL-18BP и вирусных IL18BP в клетках-хозяине согласно данному изобретению. ДНК способны гибридизоваться с указанными ДНК при жестких условиях, а кодирование белков или полипептидов, которые связывают IL-18, также включают в данное изобретение. Одна такая ДНК кодирует IL-18BP, включающий в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и содержит терминирующий кодон на ее 3'-конце. Экспрессирующие векторы, подходящие для экспрессии различных IL-18BP или вирусных IL-18BP у людей или других млекопитающих, т.е. для генной терапии, представляют собой вирусные векторы или другие типы векторов, в которые включают ген IL-18BP или кДНКIL-18BP или ДНК, кодирующую IL-18BP по способу, который позволяет осуществить эффективную экспрессию IL-18BP или вирусногоIL-18BP у людей и других млекопитающих. Данное изобретение также включает молекулы ДНК, гибридизующиеся с указанными ДНК при жестких условиях и кодирующие белки и полипептиды, которые связывают IL-18. Выделение IL-18BP проводят в соответствии с данным изобретением, например, посредством пропускания жидкостей организма человека, таких как моча или сыворотка, через хроматографическую колонку, к которой присоединен IL-18, и последующей элюции IL-18BP. Различные IL-18BP и вирусные IL-18BP получают с помощью рекомбинантных методик,т.е. посредством экспрессирования IL-18BP в соответствующем хозяине, вслед за оперативным присоединением промоторов, энхансеров экспрессии, регуляторных последовательностей и так далее, приемлемых для данного используемого хозяина, что, например, предусматривает экспрессию в правильной ориентации. Различные IL-18BP и вирусные IL-18BP и векторы для экспрессирования EL-18BP у людей и других млекопитающих применяют для лечения и облегчения состояний, в которые вовлечен IL-18 или которые вызваны избытком экзогенно введенного или эндогенно образованного IL-18. Такими состояниями являются, например, аутоиммунные заболевания, сахарный диабет I типа, ревматоидный артрит, отторжение трансплантата, воспалительное заболевание кишечника, сепсис, рассеянный склероз, ишемическая болезнь сердца (включая сердечный приступ), ишемическое поражение мозга, хронический гепатит, псориаз, хронический панкреатит, острый панкреатит и тому подобное. Согласно данному изобретению IL-18BP выделяют из мочи здорового человека с помощью одной хроматографической стадии. Препарат неочищенной мочи человека, сконцентрированной из 500 л мочи здоровых людей, наносят на колонку, содержащей IL-18 человека, связанный с агарозой. Колонку промывают, а связанный белок элюируют при низком значении рН. Элюированные фракции нейтрализуют, а аликвоты анализируют с помощью SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) (10% акриламида) при невосстанавливающих условиях и окрашивании серебром. В частности, в элюированных фракциях выявлена белковая зона 40 кДа (фиг. 1). Белок 40 кДа, полученный на первой стадии, идентифицируют как IL-18-связывающий белок по его способности, в частности, поперечно связывать 125I-IL-18 (фиг. 2). К тому же,белок 40 кДа характеризуют, анализируя Nконцевую последовательность белка. Аликвоты из элюированного белка подвергают SDSFAGE, электроблоттингу на PVDF-мембране и 8 проводят анализ первичной структуры короткого фрагмента последовательности белка. Аналогично, аликвоты элюированного белка подвергают прямому анализу первичной структуры короткого фрагмента последовательности белка. В обоих случаях получены две полипептидные последовательности. Главная последовательность и минорная последовательность, последняя соответствующая фрагменту дефенсина человека (номер доступа р 11398), начиная с аминокислоты 65. Вычитание известной последовательности дефенсина дает следующую последовательность: где х представляет собой еще неопределенные аминокислоты. Чтобы получить более длинную и более точную последовательность и чтобы идентифицировать возможные остатки цистеина, аликвоты элюированной фракции восстанавливают ДТТ (дитиотрейтолом) при денатурирующих условиях, проводят реакцию с 4 винилпиридинон, обессоливают с помощью микроультрафильтрационного устройства (Ultrafree, cutoff 10000Lf, Millipore) и проводят анализ первичной структуры короткого фрагмента последовательности белка. После цикла 1 секвенирования, проводят реакцию остаточного белка с о-фталевым альдегидом, чтобы блокировать все N-концевые полипептиды помимо Pro, а затем продолжают секвенирование. По этому способу получена следующая одноцепочечная белковая последовательность:(T=Thr; P=Pro; V=Val; S=Ser, Q=Gln; Хнеизвестна; А=Аlа; R=Arg; K=Lys; D=Asp; CCys; F=Phe; L=Leu; E=Glu) Полученная последовательность значительно отличается от последовательности любого другого известного белка, что установлено исследованием баз данных по структуре белка. Однако исследование базы данных The Instituteof Genomic Research (TOGR) (HTTP://www,ncbi.nlm.nih.gov) с помощью tblastn программы исследования предоставило файл кДНК, обозначенный ТНС 12801, открытая рамка считывания (128 кодонов) которой, когда транслируется, содержит последовательность высоко гомологичную N-концевой последовательности IL18BP. Таким образом представляют гомологию:(Верхняя последовательность (1-40) является последовательностью IL-18BP, выделенной согласно изобретению; нижняя последовательность (51-100) получена трансляцией кДНК файла ТНС 123801 TIGR). Последовательность кДНК, идентифицированная как ТНС 12801, является, однако,только EST (экспрессированная tag последова 9 тельность), т.е. случайно выбранным клоном кДНК. Никогда не исследовали, содержит лиEST открытую рамку считывания, или экспрессируется ли белок с гена, соответствующегоEST, или с самого EST, не идентифицировали ли когда-либо любую функцию белка, кодируемого ТНС 12801. Вообще нет информации, что ТНС 123801 содержит открытую рамку считывания, кодирующую IL-18 ВР. Аффинно-очищенный IL-18BP мочи сохраняет способность связывать его меченый лиганд (125I-IL-18), и после ковалентного поперечного связывания образует комплекс с молекулярной массой 58 кДа. Молекулярная масса комплекса соответствует соотношению 1:1 IL18BP 40 кДа и IL-18 19 кДа (фиг. 2). Аффинно-очищенный IL-18BP блокирует биологическую активность IL-18 человека, равно как и мыши. Таким образом, когда IL-18BP добавляют к IL-18 или человека, или мыши, он блокирует способность IL-18 вызывать продукцию интерферона-гамма, если добавляют вместе с липополисахаридом (LPS) к культурам клеток селезенки мыши (фиг. 3). В целях данного описания выражение биологическая активность IL-18 относится, по крайней мере, к одному из следующих биологических свойств:(i) индукция IFN-, главным образом, в качестве костимулятора с митогенами, IL-1, IL-12,TNF-, LPS в различных типах клеток, таких как мононуклеарные клетки периферической крови человека, линия KG-1 клеток человека и Т-клетки,(ii) увеличение пролиферации Т-клеток,(iii) увеличение образования цитокина ТН-1 in vitro, главным образом в качестве костимулятора,(iv) синергизм с IL-12 в отношении увеличения продукции IFN-, действие костимулятора в отношении продукции IFN- и других цитокинов Т-хелперов-1,(v) костимулирующее действие в отношении FAS-лиганд-опосредованной цитотоксичности клонов натуральных киллеров мыши,(vi) индукция активации NF-kB в KG-1 клетках человека, вероятно посредством индуцирования образования гомодимера 50 NF-kB и гетеродимера р 65/р 50 NF-kB,(vii) индукция IL-8. Используемое в описании выражение связывание с IL-18 подразумевает способность IL18BP связывать IL-18, что доказывают, например, посредством связывания IL-18BP с меченым IL-18 при аффинной очистке, как описывают в примере 2 описания. Используемое в описании выражение модулирование активности IL-18 подразумевает способность IL-18BP изменять любую активность IL-18, а не блокирование, например час 003675 10 тичное ингибирование, усиление и тому подобное. Используемое в описании выражение блокирование активности IL-18 относится к активности IL-18BP, которая блокирует, по крайней мере, одну из вышеприведенных биологических активностей IL-18. Активность IL18BP, блокирующая IL-18, является примером способности IL-18BP блокировать ассоциированную с IL-18 экспрессию IFN- в спленоцитах мыши. Как будет показано более подробно ниже, модулирование или блокирование активности IL-18BP отчасти обусловлено тем, что IL18BP ингибирует вызванную IL-18 активациюNF-kB. К тому же, IL-18BP блокирует, по крайней мере, одну из следующих активностей IL18, а именно индукцию IFN- в клетках человека и мыши, индукцию IL-8 и активацию NF-kB. ДНК-зонд для скрининга кДНК библиотек получают посредством PCR с обратной транскриптазой со специфическими смысловым и антисмысловым праймерами и РНК из Т-клеток человека Jurkat с праймерами из TIGR последовательности. Полученный продукт PCR подтверждают анализом последовательности ДНК. Продукт PCR метят 32[Р] и используют в качестве зонда для скрининга четырех кДНК библиотек человека, полученных из моноцитов периферической крови, из линии Т-клеток Jurkat, из РВМС (мононуклеарных клеток, периферической крови) и из селезенки человека. Различные независимые клоны кДНК соответствуют четырем вариантам сплайсинга IL-18BP (SEQ ID NO: 1, 3, 5 и 7). Все варианты сплайсинга кодируют предполагаемые растворимые секретируемые белки. Наиболее изобилующий вариант (IL18BPa) имеет открытую рамку считывания из 192 кодонов, кодирующую сигнальный пептид,прежде упоминаемый как лидер-последовательность из 28 аминокислотных остатков, за которым следует зрелый предполагаемый IL18BPa, первые 40 остатков которого идеально соответствуют N-концевой белковой последовательности IL-18BP мочи (SEQ ID NO: 2). Положение остатков цистеина позволяет предположить, что этот полипептид принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов (Ig). Интересно, что каждый из четырех остатков Gln в зрелом IL-18BPa является участком возможного Nгликозилирования. Три других варианта IL18BP имеются в меньшем количестве, чем IL18BPa. Они включают в себя более короткую 1 т.п.н. кДНК IL-18BPb, кодирующую сигнальный пептид из 28 аминокислотных остатков с последующим зрелым белком из 85 аминокислотных остатков (SEQ ID NO: 4). Третий вариант, IL-18BPc, представляет собой кДНК 2,3 т.п.н., кодирующую сигнальный пептид из 28 аминокислотных остатков с последующим зрелым IL-18BP из 169 аминокислотных остатков(SEQ ID NO: 6). Четвертый вариант, IL-18BPd, 11 кодирует сигнальный пептид из 28 аминокислотных остатков с последующим зрелым IL18BP из 161 аминокислотных остатков (SEQ IDNO:8). Для дальнейшего исследования возможного существования дополнительных вариантов сплайсинга IL-18BP, проводят скрининг геномной библиотеки человека зондом, соответствующим полной длине кДНК IL-18BP. Пять геномных клонов, отличающихся по длине,идентифицированы в этой библиотеке. Проводят анализ последовательности ДНК этих клонов с использованием внешнего и внутреннего праймеров. Всего из этих клонов собрана последовательность 7,8 т.п.н. (SEQ ID NO:9). Не идентифицируют никакого экзона, кодирующего трансмембранный (ТМ) рецептор с последовательностью 7,8 т.п.н. Все варианты, распределенные в обычном инициирующем сайте трансляции, кодируют тот же сигнальный пептид из 28 аминокислотных остатков и растворимые зрелые белки, отличающиеся по величине и Сконцевым последовательностям. IL-18 ВР-локус содержит дополнительный ген, кодирующий белок 1 ядерного митотического аппарата(NUMA1), находящегося на минус цепи. Эти данные локализуют ген IL-18BP в хромосоме 11q 13 (36). Исследование гомологии проводят на полной белковой последовательности IL-18BPa иnih.gov), используя Smith Watermann-алгоритм. Обнаружено, что гомологи IL-18BP экспрессируются в некоторых покс-вирусах в виде секретируемых белков с ранее неизвестной функцией. Ранее сообщали, что вирусы кодируют различные рецепторы цитокинов и что такие кодируемые вирусами молекулы служат в качестве ловушек-рецепторов, что ингибирует иммунные ответы посредством нейтрализации их соответствующего цитокина (рассматривают Spriggs,МК, 1994, Сmt, Opin. Immunol., 6, 526-529). Поэтому изобретение далее относится к кодируемым вирусами гомологам IL-18BP, которые также являются блокаторами или модуляторами биологической активности IL-18. Примеры кодируемых вирусами гомологов IL-18BP представляют в табл. 1. Согласно данному изобретению кодируемый вирусом гомолог экспрессируют в прокариотическом или эукариотическом хозяине. Используемое в описании выражение кодируемый вирусом гомолог IL-18BP подразумевает сходство, по крайней мере, 50% в последовательности из, по крайней мере, 70 аминокислотных остатков. Более предпочтительно сходство составляет, по крайней мере, 50%, по крайней мере, 60%, по крайней мере, 70%, по крайней мере, 80% или более предпочтительно, по крайней мере, 90% сходства в последовательности из 100 аминокислотных остатков. 12 Таблица 1 Кодируемые вирусами белки, проявляющие высокую гомологию с IL-18BP человека Последовательность Тип вирусаVARCG7 173 Основной вирус натуральной оспыIL-18BPa экспрессируют в клетки COS7 обезьяны. С этой целью кДНК IL-18BPa включают в экспрессирующий вектор pEF-BOS млекопитающих. Кассету, кодирующую (His)6 последовательность, присоединяют к 3'-концуORF IL-18BP в рамке, чтобы облегчить очистку рекомбинантного белка. Клетки COS7 кратковременно трансфицируют экспрессирующим вектором, а бессывороточную среду этих клеток(150 мл) концентрируют и очищают посредством металлхелатирующей хроматографии. IL18BPa движется в виде одной полосы при SDSPAGE с окрашиванием серебром при восстанавливающих и невосстанавливающих условиях и имеет такую же кажущуюся молекулярную массу, как масса IL-18BP мочи. Анализ белковой последовательности этого препарата выявляет такую же N-концевую последовательность как последовательность IL-18BP мочи. Анализ IL18BPa с помощью иммуноблоттинга с антителами, полученными против IL-18BP мочи, выявляет зону с такой же молекулярной массой как масса белка мочи. Кроме того, используя иммунопреципитацию с последующими SDSPAGE и авторадиографией, устанавливают, чтоIL-18BPa вытесняет 125I-IL-18BP мочи из соединения с антителом. Поэтому IL-18BPa структурно соответствует IL-18BP, выделенному из мочи. Были проведены исследования способности сырого и очищенного IL-18BPa ингибировать биологическую активность IL-18. IL-18BPa ингибирует активность IL-18 человека и мыши в спленоцитах мыши, РВМС и линии KG-1 клеток человека (фиг. 9). Эти результаты подтверждают подлинность кДНК IL-18BPa, как кДНК,кодирующей биологически активный IL-18BP. Далее данное изобретение относится к мутеинам и фрагментам IL-18BP и вирусных IL18BP, и к рекомбинантным белкам, состоящим из IL-18BP дикого типа и вирусных IL-18BP или 13 их мутеинов или фрагментов, слитых с другим полипептидом или белком и характеризующихся способностью связывать IL-18 или его гомологи. Используемый в описании термин мутеины относится к аналогам IL-18BP или аналогам вирусного IL-18BP, в которых один или более аминокислотных остатков нативного IL-18BP или вирусного IL-18BP замещают различными аминокислотными остатками или удаляют, или один или более аминокислотных остатков присоединяют к последовательности нативного IL18BP или вирусного IL-18BP без значительного изменения способности полученных продуктов связывать IL-18 по сравнению с IL-18BP дикого типа или вирусным IL-18BP. Эти мутеины получают посредством известного синтеза и/или методами сайт-направленного мутагенеза, или любого другого известного метода, приемлемого для этого. Предпочтительно любой такой мутеин имеет последовательность аминокислот существенно повторяющую последовательность IL18BP, существенно повторяющую последовательность вирусного IL-18BP, такую, чтобы иметь, по существу, одинаковую активность сIL-18BP. Одной активностью является его способность связывать IL-18. Поскольку мутеин характеризуется значительной IL-18-связывающей активностью, его используют для очисткиIL-18, как, например, посредством аффинной хроматографии, и таким образом полагают, что он имеет активность, подобную активности IL18BP. Так, имеет ли любой данный мутеин, по существу, такую же активность как IL-18BP можно определить с помощью рутинных экспериментов, в которых такой мутеин подвергают,например простому конкурентному сэндвичанализу, чтобы установить связывает ли он или нет соответственно меченный IL-18, и таким как радиоиммуноанализ и EUSA (твердофазный иммуноферментный анализ). В предпочтительном осуществлении любой такой мутеин имеет, по крайней мере, 40% идентичности или гомологии с последовательностью или IL-18BP, или кодируемого вирусом гомолога IL-18BP. Более предпочтительно он имеет, по крайней мере, 50%, по крайней мере,60%, по крайней мере, 70%, по крайней мере,80% или наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90% идентичности или гомологии с ней. Мутеины полипептидов IL-18BP или мутеины вирусных IL-18BP, применимые в соответствии с данным изобретением, или нуклеиновая кислота, кодирующая их, включают в себя определенный набор существенно соответствующих последовательностей, как пептиды замещения или полинуклеотиды, которые рутинно получают посредством одного из обычных способов на данном уровне техники без излишних экспериментов на основании инструкций и руководства, представленных в описании. Под 003675 14 робное описание химии и структуры белка см.FreemanCo., San Francisco, 1983, которые цитируют в описании. Для ознакомления с заменами в нуклеотидной последовательности,например, такими как кодонные предпочтения,см. Ausubel et al., supra, at А, 1.1-А.1.24, и Sambrook et al., supra, в приложениях С и D. Предпочтительными заменами в отношении мутеинов согласно данному изобретению являются замены, известные как консервативные. Консервативные замены полипептидов или белков IL-18BP или вирусных IL-18BP включают в себя синонимические аминокислоты, группы которых характеризуются достаточно похожими физико-химическими свойствами, что при замещениях между членами группы сохраняется биологическая функция молекулы, Grantham,Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974). Ясно, что вставки и делеции аминокислот в указанных последовательностях можно производить без изменения их функции, особенно если вставки и делеции вовлекают только несколько аминокислот, например меньше тридцати, и предпочтительно меньше десяти, и не удаляют или замещают аминокислоты, которые являются существенными для функциональной конформации,например остатки цистеина, Anfinsen, "PrinciplesThat Govern The Folding of Protein Chains", Science, Vol. 181, pp. 22-20 (1973). Белки и мутеины, образованные с помощью таких делеции и/или вставок, входят в компетенцию данного изобретения. Однако остатки цистеина, которые не являются существенными для биологической функции, замещают на другие остатки, например, чтобы избежать образования нежелательных внутримолекулярных и межмолекулярных дисульфидных мостиков, которые вызывают снижение активности IL-18BP. Предпочтительные синонимические аминокислотные группы представлены в табл. 2. Более предпочтительно синонимические аминокислотные группы представляют собой группы,перечисленные в табл. 3, и наиболее предпочтительно синонимические аминокислотные группы представляют собой группы, перечисленные в табл. 4. Таблица 2 Предпочтительные группы синонимических аминокислот Аминокислота Таблица 3 Более предпочтительные группы синонимических аминокислот Аминокислота Таблица 4 Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот Аминокислота Примеры производства аминокислотных замен в белках, которые используют для полу 003675 16 чения мутеинов полипептидов или белков IL18 ВР, или мутеинов вирусных IL-18BP, для применения в данном изобретении, включают любые известные стадии способов, таких как представленные в патентах США RE 33653,4959314, 4588585 и 4737462 Mark et al.; 5116943et al.; и 5017691 Lee et al; и белки с замещенным лизином представляют в патентах США 4904584 (Shaw et al.). В другом предпочтительном направлении данного изобретения мутеин IL-18BP или вирусного IL-18BP имеет аминокислотную последовательность, по существу, соответствующую последовательности IL-18BP или вирусного IL18BP. Термин по существу соответствующая предназначают для рассматриваемых белков с минорными изменениями в последовательности природного белка, которые не затрагивают основные характеристики природных белков, в особенности, что касается их способности связывать IL-18. Полагают, что тип изменений,которые обычно относят к по существу соответствующие, являются такими изменениями,которые происходят в результате общепринятых методов мутагенеза ДНК, кодирующих эти белки, приводящие в результате к немногим минорным модификациям, и скринингу требуемой активности по вышеописанному способу. Кроме связывания IL-18 мутеины также модулируют и/или блокируют активность IL-18. Согласно данному изобретению мутеины включают в себя белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которые гибридизуются с ДНК или РНК, которые кодируют IL-18BP или кодируют вирусный IL-18BP согласно данному изобретению при жестких условиях. Изобретение также включает в себя такую нуклеиновую кислоту, которая также применима в качестве зонда при идентификации и очистке требуемой нуклеиновой кислоты. Кроме того, такая нуклеиновая кислота является основным кандидатом для определения кодирует ли она полипептид, который сохраняет функциональную активность IL-18BP данного изобретения. Термин жесткие условия относится к гибридизации и условиям последующего промывания, которые обычны на данном уровне техники и общепринято упоминаются как жесткие. См. Ausubel et al., Current Protocols inMolecular Biology, supra, Interscience, N.Y., 6.3 и 6.4 (1987, 1992), и Sarobrook et al., supra. Без ограничения примеры жестких условий включают в себя условия промывания 12-20 ниже рассчитанной температуры гибрида при исследовании в, например, 2 х SSC и 0,5% додецилсульфате натрия в течение 5 мин, 2 х SSC и 0,1% SDS в течение 15 мин; 0,1 х SSC 0,5% SDS при 37 С в течение 30-60 мин, а затем 0,1 х SSC и 0,5% SDS при 68 С в течение 30-60 мин. Специалисты в данной области понимают, что жесткие условия также зависят от длины последо 17 вательности ДНК, олигонуклеотидных зондов(как, например, 10-40 оснований) или смешанных олигонуклеотидных зондов. Если применяют смешанные зонды, предпочтительно используют хлорид тетраметиламмония (ТМАС) вместо SSC. См. Ausubel, выше. Далее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют IL-18BP согласно данному изобретению, но которые отличаются по последовательности кодона вследствие вырожденности генетического кода. Изобретение также относится к таким ДНК, которые, возможно, не гибридизуются при жестких условиях с последовательностями ДНК, представленными на фиг. с 4 до 7, но тем не менее кодируют IL-18BP по настоящему изобретению. Термин гибридный белок относится к полипептиду, содержащему IL-18BP или вирусный IL-18BP, или их мутеины, слитые с другим белком, который, например, имеет продолжительное время циркуляции в жидкостях организма. Таким образом, IL-18BP или вирусныйIL-18BP могут быть слиты с другим белком или полипептидом и тому подобным, например иммуноглобулином или его фрагментом. Он также может быть слит с полиэтиленгликолем (PEG) для пролонгирования времени циркуляции. Термин соли, используемый в описании,относится как к солям карбоксильных групп, так и к солям присоединения кислот аминогрупп IL18BP, вирусного IL-18BP, мутеинов или их рекомбинантных белков. Соли карбоксильной группы, образованные посредством способов,известных в данной области, включают неорганические соли, например соли натрия, кальция,аммония, железа или цинка и подобные, и соли,образованные с органическим основаниями,например аминами, такими как триэтиламин,аргинин или лизин, пиперидин, новокаин и подобные. Соли присоединения кислот включают,например, соли минеральных кислот, такие как,например, хлористо-водородная кислота или фосфорная кислота, и соли органических кислот такие как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. Конечно, любые такие соли должны иметь активность, подобную IL-18BP. Термин функциональные производные,используемый в описании, подразумевает производные IL-18BP или вирусного IL-18BP и их мутеинов и рекомбинантных белков, которые получают, например, из функциональных групп,существующих в виде боковых цепей на остатках или N- или С-концевых группах, в соответствии с методиками, известными в данной области, и их включают в изобретение, поскольку они остаются фармацевтически приемлемыми,т.е. они не разрушают активность белка, которая, по существу, подобна активности IL-18BP или вирусного IL-18BP, и не придают токсические свойства композициям, содержащим их. Эти производные включают в себя, например,боковые цепи полиэтиленгликоля, которые мас 003675 18 кируют антигенные участки и продлевают пребывание IL-18BP или вирусного IL-18BP в биологических жидкостях. Другие производные включают алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп посредством реакции с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, N-ацильные производные свободных аминогрупп остатков аминокислот,образованных с ацильными компонентами (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами), или Oацильные производные свободных гидроксильных групп (например, групп остатков серина и треонина), сформированных с ацильными компонентами. В качестве активных фракций IL-18BP или вирусного IL-18BP, мутеинов или рекомбинантных белков в данном изобретении рассматривают любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи белковой молекулы одних или вместе с ассоциированными молекулами или связанными с ними остатками, например остатками сахара или фосфата, или агрегатами белковой молекулы, или одними остатками сахара при условии, что названная фракция, по существу, сохраняет способность связывать IL18. Термин преобразованные через циклизование производные, используемый в описании,относится к линейной молекуле, концы которой соединяют вместе или непосредственно, или через линкер, чтобы образовать кольцевую молекулу, а затем кольцевую молекулу раскрывают в другом участке, чтобы образовать новую линейную молекулу с концами, отличающимися от концов исходной молекулы. Преобразование через циклизование включает те молекулы,структура которых эквивалентна молекуле, которую циклизуют, а затем открывают. Так, преобразованная циклизованием молекула синтезируется de novo как линейная молекула и никогда не проходит через стадию образования кольца и стадию раскрытия. Получение преобразованных через циклизование производных описывают в международной заявке WO 95/27732. Различные рекомбинантные клетки, такие как прокариотические клетки, например E.coli,или эукариотические клетки, такие как дрожжи или клетки насекомых, продуцируют IL-18BP или вирусные IL-18BP, способы конструирования подходящих векторов, несущих ДНК, которые кодируют IL-18BP, и приемлемы для трансформирования (например, E.coli, клетки млекопитающих и клетки дрожжей) или инфицирования клеток насекомых для того, чтобы продуцировать рекомбинантные IL-18BP или вирусный IL-18BP, хорошо известны в данной области. См. например, Ausubel et al., eds. "Current Protocols in Molecular Biology" Current Protocols, 1993; и Sambrook et al., eds. "Molecular 19 Для экспрессии IL-18BP белков или вирусных IL-18BP, ДНК, кодирующие IL-18BP или вирусный IL-18BP, их фрагменты, мутеины или рекомбинантные белки, и оперативно присоединенные регуляторные факторы транскрипции и трансляции, включают в векторы, которые способны интегрировать требуемые генные последовательности в хромосомы клеткихозяина. Чтобы выбрать клетки, которые стабильно интегрируют введенную в их хромосомы ДНК, используют один или более маркеров,предусматривающие отбор клеток-хозяев, которые содержат экспрессирующий вектор. Маркер обеспечивает прототрофию ауксотрофному хозяину, биоцидную резистентность, например к антибиотикам, или резистентность к тяжелым металлам, таким как медь и подобные. Селектируемый ген-маркер или непосредственно связывают с ДНК последовательности гена, чтобы экспрессировать, или вводят в ту же клетку посредством котрансфекции. Дополнительные элементы также необходимы для оптимального синтеза мРНК одноцепочечного связывающего белка. Эти элементы включают факторы сплайсинга, а также промоторы транскрипции, энхансеры и сигналы терминации. Названную молекулу ДНК, чтобы ввести в клетки выбора, предпочтительно включают в плазмидный или вирусный вектор, способный к автономной репликации в реципиенте-хозяине. Предпочтительные прокариотические плазмиды являются производными pBR322. Предпочтительные эукариотические векторы включают в себя BPV (вирус папилломы крупного рогатого скота). Вирус осповакцины, SV40, 2-микронный кольцевой вирус и т.д. и их производные. Такие плазмиды и векторы хорошо известны в данной области (2-5, 22). Если вектор или последовательность ДНК, содержащую конструкцию, получают для экспрессии, экспрессирующий вектор вводят в соответствующую клетку-хозяина с помощью любого из множества приемлемых способов, таких как трансформация, трансфекция, липофекция, коньюгирование, протопластное слияние, электропорация, осаждение фосфатом кальция, прямая микроинъекция и т.д. Используемые в этом изобретении клеткихозяева являются или прокариотическими, или эукариотическими. Предпочтительные прокариотические хозяева включают в себя бактерии,такие как Е.coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudonomas, Salmonella, Serratia и т.д. Наиболее предпочтительные прокариотические хозяева представляют собой E.coli. Особенно интересные бактериальные хозяева включают штамм 294 E.coli K12 (АТСС 31446), E.coli Х 1776(АТСС 27325). При таких условиях белок не гликозилируется. Прокариотический хозяин должен быть совместимым с репликоном и кон 003675 20 трольными последовательностями в экспрессирующей плазмиде. Однако поскольку природные IL-18BP являются гликозилированными белками, эукариотические хозяева являются предпочтительными по сравнению с прокариотическими. Предпочтительные эукариотические хозяева представляют собой клетки млекопитающих, например человека, обезьяны, мыши, и клетки яичников китайского хомяка (СНО), так как они обеспечивают пост-трансляционные модификации белковым молекулам, включающие правильную укладку, правильное образование дисульфидных связей, а также гликозилирование в правильных сайтах. Клетки дрожжей и клетки насекомых также выполняют посттрансляционные модификации пептидов, включая высокоманнозное гликозилирование. Существует ряд технологий рекомбинантных ДНК, которые утилизируют последовательности сильных промоторов и высокое число копий плазмид, которые используют для продукции требуемых белков в клетках дрожжей и клетках насекомых. Клетки дрожжей и насекомых распознают лидерные последовательности на клонированных генных продуктах млекопитающих и выбирают зрелый IL-18BP. После введения вектора, клетки-хозяева выращивают на селективной среде, которую выбирают для выращивания содержащих вектор клеток. Экспрессия клонированной генной последовательности(ей) приводит к продукции IL-18BP, вирусного IL-18BP, рекомбинантных белков или их мутеинов или фрагментов. Указанные способы клонирования, выделения клона, идентификации, характеристики и секвенирования описывают более подробно в дальнейшем в примерах. Экспрессированные белки затем выделяют и очищают с помощью любых общепринятых методик, включая экстракцию, осаждение, хроматографию, электрофорез или подобное, или с помощью аффинной хроматографии, используя,например анти-IL-18BP моноклональные антитела, иммобилизованные на гелевом матриксе,помещенном в колонку. Неочищенные препараты, содержащие названный рекомбинантный IL18BP, пропускают через колонку, где IL-18BP связывается на колонке специфическими антителами, тогда как примеси проходят. После промывания, белок элюируют с геля при условиях, обычно применяемых для этих целей, т.е. при высоком или низком рН, например рН 11 или рН 2. Кроме того, изобретение относится к векторам, которые полезны для экспрессии IL-18BP или вирусного IL-18BP, или их производных у млекопитающих, а точнее у людей. Векторы для кратковременной и долговременной экспрессии генов у млекопитающих хорошо известны по литературе. Исследования показывают, что доставка гена, например, к скелетной мышце, глад 21 кой мышце сосудов и печени приводит в результате к системным уровням терапевтических белков. Скелетная мышца является удобной мишенью из-за ее большой массы, кровоснабжения и доступности. Однако успешно используют и другие мишени и, в частности, костномозговые предшественники иммунных клеток. В настоящее время доступные векторы для экспрессии белков, например в мышце, включают плазмидную ДНК, липосомы, коньюгаты белокДНК и векторы, на основе аденовируса, аденоассоциированного вируса и вируса герпеса. Из них векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) оказываются наиболее эффективными в отношении продолжительности и уровней экспрессии гена и в отношении безопасности (Kessel, P.D. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14082-14087). Способы конструирования вектора на основе AAV подробно описывают (Snyder et al.,1996, Current Protocols in Human Genetics, Chapters 12.1.1-12.1.17, John WileySons) и цитируют в этом патенте. Кратко, плазмиду psub201,содержащую геном AAV дикого типа разрезают ферментом рестрикции Хbа I и сшивают с конструкцией, состоящей из эффективного эукариотического промотора, например цитомегаловирусного промотора, Kozak согласованной последовательности, последовательности ДНК,кодирующей IL-18BP или вирусный IL-18BP,или их мутеины, или рекомбинантные белки,или их фрагменты, соответствующей 3' не транслируемой области и сигнала полиаденилирования, например сигнала полиаденилирования вируса обезьяны 40. Полученную рекомбинантную плазмиду котрансфицируют с хелпер AAVплазмидой, например pAAV/Ad, в клетки млекопитающих, например Т 293 клетки. Затем культуры инфицируют аденовирусом в качестве хелпер-вируса, а культуральные супернатанты собирают через 48-60 ч. Супер-натанты фракционируют осаждением сульфатом аммония,очищают в градиенте плотности CsCl, диализуют, а затем нагревают при 56 С, чтобы уничтожить любой аденовирус, в то время как полученный рекомбинантный AAV, способный экспрессировать IL-18BP или вирусный IL-18BP,или их мутеины, или рекомбинантные белки,остается стабильным на этой стадии. До сих пор не установлена физиологическая роль растворимых рецепторов цитокинов. Растворимые рецепторы связывают свои специфические лиганда и в большинстве случаев ингибируют их биологическую активность, как показано на системе TNF (фактор некроза опухоли) (11, 12). В очень немногих случаях, например IL-6, растворимый рецептор увеличивает биологическую активность. Показано, что рекомбинантный растворимый рецептор TNF,также известный как ТВР (TNF связывающий белок) предотвращает септический шок на моделях животных, тогда как обнаружено, что рас 003675 22 творимые формы рецептора IL-1 оказывают полное ингибирование развития in vivo аллогенной реактивности у мышей-реципиентов аллотрансплантата. Аналогично обнаружено, что IL-18BP и вирусный IL-18BP данного изобретения используют в качестве модуляторов активности IL-18,например, при диабете типа I, сепсисе, аутоиммунных заболеваниях, при отторжении трансплантата, ревматоидном артрите, воспалительном заболевании кишечника, сепсисе, хроническом гепатите, псориазе, хроническом гепатите и остром гепатите. Таким образом, их можно применять, например, при любом заболевании,при котором эндогенная продукция или экзогенное введение IL-18 вызывают заболевание или ухудшение состояния пациента. Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим фармакологически приемлемый носитель и IL18BP или вирусный IL-18BP изобретения, или их активные мутеины, рекомбинантные белки и их соли, функциональные производные или их активные фракции. Далее данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим фармацевтически приемлемый носитель и, например, вирусный вектор, такой как любой один из названных вирусных векторов на основеAAV, или другой вектор, экспрессирующие IL18BP или вирусный IL-18BP, или их мутеины,фрагменты или их рекомбинантые белки и приемлемые для введения людям и другим млекопитающим с целью достижения экспрессии invivo IL-18BP или вирусного IL-18BP, или их мутеинов, или фрагментов, или рекомбинантных белков изобретения, т.е. для применения в генной терапии. Фармацевтические композиции изобретения готовят для введения смешиванием IL-18BP или вирусного IL-18BP, или их производных,или векторов, экспрессирующих их, с физиологически приемлемыми носителями и/или стабилизаторами, и/или наполнителями, и готовят в дозированной форме, например, лиофилизацией в дозированных ампулах. Способ введения представляет собой любой из принятых способов введения для подобных агентов и зависит от состояния, которое лечат, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно, посредством локальной инъекции или местной аппликации,или непрерывно посредством вливаний и т.д. Количество активного соединения, которое вводят, зависит от способа введения, заболевания,которое лечат, и состояния пациента. Для локальной инъекции, например, требуется более низкое количество белка на вес тела, чем при внутривенном вливании. Соответственно, IL-18BP или вирусные IL18BP, или векторы, экспрессирующие их invivo, показаны для лечения аутоиммунных заболеваний, диабета I типа, ревматоидного арт 23 рита, отторжения трансплантата, воспалительного заболевания кишечника, сепсиса, рассеянного склероза, ишемической болезни сердца,включая острый сердечный приступ, ишемического поражения мозга, хронического гепатита,псориаза, хронического и острого панкреатита и подобных заболеваний, при которых имеется аберрантная экспрессия IL-18, ведущая к избытку IL-18, или в случаях осложнений, обусловленных экзогенно введенным IL-18. Изобретение также включает антитела против IL-18BP или вирусного IL-18BP, а также против их мутеинов, рекомбинантных белков,солей, функциональных производных и активных фракций. Термин антитело означает поликлональное антитело, моноклональное антитело (MAT),химерных антител, антиидиотипическое (антиId) антитело к антителам, которые метят в растворимой или связанной форме, и гуманизированные антитела, а также их фрагменты, обеспеченные с помощью любых известных методов, таких как, но не ограниченных ими, ферментативное расщепление, пептидный синтез или рекомбинантные технологии. Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, полученных из сыворотки животных, иммунизированных антигеном. Моноклональные антитела содержат, по существу, гомогенную популяцию антител, специфических к антигенам, к которым популяция содержит в основном одинаковые эпитопсвязывающие участки. MAT получают по способам, известным специалистам в данной области. См., например, Kohlerand Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Патент США 4376110; Ausubel et al., eds., supra,Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); и Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience,N.Y., (1992, 1993), содержание которых приводят в полном объеме посредством цитирования. Такие антитела могут принадлежать к любому классу иммуноглобулинов, включая IgG, IgM,IgE, IgA, GILD и любым их подклассам. Гибридому, продуцирующую MAT данного изобретения, культивируют in vitro, in situ или in vivo. Продукция высоких титров MAT in vivo или insitu делает это сейчас предпочтительным способом получения. Химерные антитела представляют собой молекулы, различные части которых получают от различных видов животных, такие как молекулы, имеющие вариабельную область, полученную от MAT мыши, и констатную область иммуноглобулина человека. Химерные антитела используют главным образом для восстановления иммуногенности при применении и для увеличения выхода при продукции, например,когда MAT мыши имеют более высокий выход из гибридом, но более высокая иммуногенность 24 у людей, так что применяют химерные MAT человек-мышь. Химерные антитела и способы их получения известны в данной области. (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 32733277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly et al., заявка на европейский патент 125023 (опубликована 14 ноября, 1984); Neuberger et al., Nature 314: 268270 (1985); Taniguchi et al., заявка на европейский патент 171496 (опубликована 19 февраля,1985); Morrison et al., заявка на европейский патент 173494 (опубликована 5 марта, 1986);al., заявка на европейский патент 184187 (опубликована 11 июня, 1986); Morrison et al., заявка на европейский патент 173494 (опубликована 5 марта, 1986); Sahagan et al., J. Immunil. 137:10661074 (1986); Robinson et al., международная заявка WO 9702671 (опубликована 7 мая 1987);Laboratory Manual, supra. Эти ссылки вводят в описание в полном объеме посредством цитирования. Антиидиотипическое (анти-Id) антитело является антителом, которое распознает уникальные детерминанты, обычно ассоциированные с ангигенсвязывающим сайтом антитела. Idантитело получают иммунизацией животного того же вида и генетического типа (например,линия мышей) в качестве источника MAT сMAT, к которому анти-Id получен. Иммунизированное животное распознает и отвечает на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела посредством продуцирования антител к этим идиотипическим детерминантам(анти-Id-антитело). См., например, патент США 4699880, который приводят в описании посредством цитирования. Анти-Id-антитело также используют в качестве иммуногена, чтобы вызвать иммунный ответ у еще другого животного, продуцирующего так называемое анти-анти-Id-антитело. Антианти-Id является идентичным по эпитопу исходному MAT, которое индуцирует анти-Id. Таким образом, посредством использования антител к идиотипическим дереминантам MAT возможно идентифицировать другие клоны,экспрессирующие антитела идентичной специфичности. Соответственно, MAT, полученные противIL-18BP и родственных белков данного изобретения, используют, чтобы индуцировать антиМ-антитела у соответствующих животных, таких как BALB/c мыши. Клетки селезенки от таких иммунизированных мышей применяют для получения анти-Id гибридом, секретирующих анти-Id МАТ. К тому же, анти-Id MAT свя 25 зывают с носителем таким гемоцианин лимфы улитки (KLH) и применяют для иммунизации дополнительных BALB/c мышей. Сыворотка от этих мышей содержит анти-анти-Id антитела,которые имеют связывающие свойства исходного MAT специфического относительно эпитопаIL-18BP или эпитопов вирусного IL-18BP. Анти-Id MAT, таким образом, имеют собственные идиотипические эпитопы или идиотопы, структурно подобные оцениваемому эпитопу, такому как IL-18BP или вирусный IL18BP. Термин гуманизированное антитело означает включение, например антител, которые получают манипулированием с антителами мыши с помощью способов генетической инженерии с тем, чтобы они оказались более совместимыми с организмом человека. Такие гуманизированные антитела характеризуются сниженной иммуногенностыо и улучшенной фармакокинетикой у людей. Их получают с помощью технологий, известных в данной области,таких как описывают, например для гуманизированных анти-TNF антител в Molecular Immunology, Vol. 30, N 16,1443-1453,1993. Термин антитело также подразумевает включение обеих интактных молекул, а также их фрагментов, таких как, например, Fab иFab и F(ab')2, без фрагмента Fc интактного антитела, более быстро удаляются из циркуляции и характеризуются меньшим неспецифическим тканевым связыванием, чем интактное антитело(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983. Следует оценить, что Fab и F(ab')2 и другие фрагменты антител, полезные в данном изобретении, используют для определения и количественной оценки IL-18BP или вирусного IL-18BP,согласно способам, представленным в описании для интактных молекул антител. Такие фрагменты обычно получают посредством протеолитического расщепления, используя ферменты,такие как папаин (для получения фрагментовF(ab')2). Как отмечено, антитело является способным связывать молекулу, если оно способно специфически взаимодействовать с молекулой,чтобы вследствие этого связать молекулу с антителом. Термин эпитоп означает, что часть любой молекулы способна быть связанной антителом, которая также распознается таким антителом. Эпитопы или антигенные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и имеют особые характеристики трехмерной структуры,а также определенные характеристики заряда. Антиген представляет собой молекулу или часть молекулы, способную быть связанной антителом, которое дополнительно индуцирует 26 животное к продукции антитела, способного связывать эпитоп такого антигена. Антиген может иметь один или больше эпитопов. Указанная специфическая реакция предназначается,чтобы указать, что антиген взаимодействует высоко избирательным способом с ему соответствующим антителом и не взаимодействует с множеством других антител, которые вызываются другими антигенами. Антитела, включая фрагменты антител,полезные в данном изобретении, используют для количественного и качественного определения IL-18BP или вирусного IL-18BP или родственных белков в образце или для определения присутствия в клетках, которые экспрессируют такие белки данного изобретения. Это осуществляют иммунофлуоресцентными методами,применяющими флуоресцентно меченные антитела (см. ниже), в сочетании с световой микроскопией, проточной цитометрией и флуориметрическим определением. Антитела (или их фрагменты), полезные в данном изобретении, применяют гистологически для иммунофлуоресцентной и иммуноэлектронной микроскопии, для определения insitu IL-18BP или вирусного IL-18BP или родственных белков данного изобретения. Определение in situ включает взятие гистологического образца у пациента и обеспечение такого образца меченым антителом данного изобретения. Предпочтительно антителом обеспечивают нанесением или присоединением меченого антитела (или фрагмента) к биологическому образцу. Применение такого способа сделало возможным определение не только присутствия IL18BP или вирусного IL-18BP, или родственных белков, но также определение его распределения в исследуемой ткани. Применяя способ данного изобретения, каждый из специалистов в данной области быстро заметит, что любой из большого разнообразия гистологических методов (таких как процедуры окрашивания) можно модифицировать для проведения подобного определения in situ. Такой анализ для IL-18BP или вирусногоIL-18BP, или родственных белков данного изобретения обычно включает в себя инкубацию биологического образца, такого как биологическая жидкость, экстракт ткани, свежеполученные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые инкубируют в культуре ткани, в присутствии эффективно меченного антитела, способного идентифицировать IL18BP или родственные белки, и определение антитела посредством любой из ряда технологий, хорошо известных в данной области. Биологический образец обрабатывают твердофазной подложкой или носителем, таким как нитроцеллюлоза, или твердой подложкой,или носителем, которые иммобилизуют клетки,клеточные частицы или растворимые белки. Подложку или носитель затем промывают соот 27 ветствующим буфером с последующей обработкой эффективно меченым антителом согласно данному изобретению. Твердофазную подложку или носитель затем промывают буфером второй раз, чтобы удалить несвязанные антитела. Количество связанной метки на твердой подложке или носителе определяют общепринятыми методами. Термины твердофазная подложка,твердофазный носитель, твердая подложка,твердый носитель, подложка или носитель подразумевают любую подложку или носитель, способные связывать антиген или антитела. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, найлон амилазы,природные и модифицированные целлюлозы,полиакриламиды, габро и магнетид. Для целей данного изобретения носитель может быть растворимым до некоторой степени или нерастворимым. Материал подложки имеет любую возможную структурную конфигурацию такой длины, что сопряженная молекула способна связывать антиген или антитело. Так, конфигурация подложки или носителя является сферической как шарик или цилиндрической как внутренняя поверхность опытной пробирки, или как внешняя поверхность стержня. Альтернативно, поверхность плоская, как лист, тестполоска и т.д. Предпочтительные подложки и носители включают гранулы полистирола. Специалистам в данной области известны многие другие носители для связывания антитела или антигена, или они смогут установить то же самое посредством обычного экспериментирования. Связывающую активность данной партии антител согласно данному изобретению определяют в соответствии с хорошо известными способами. Специалисты в данной области устанавливают эффективные и оптимальные условия исследования для каждого определения посредством обычного экспериментирования. Другие стадии, такие как промывание, перемешивание, встряхивание, фильтрование и подобное, добавляют в исследование, когда необходимо в определенной ситуации. Одним из способов, по которому согласно данному изобретению антитело эффективно метят, является связывание антитела с ферментом и применение в иммуноферментном анализе (EIA). Этот фермент, в свою очередь, при экспозиции с соответствующим субстратом,взаимодействует с субстратом с образованием химического компонента, который определяют,например, с помощью спектрофотометрического, флуориметрического или визуального способов. Ферменты, которые используют для эффективного мечения антител, включают, но не ограничиваются, малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу,дельта-5-стероидизомеразу,алкогольдегидрогеназу,альфа 003675 28 глицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, пиранозооксидазу, бетагалактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу,глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэестеразу. Определение осуществляют колориметрическими методами, в которых употребляют хромогенный субстрат для фермента. Определение также проводят посредством визуального сравнения степени энзиматической реакции субстрата по сравнению с аналогично приготовленными стандартами. Определение выполняют, используя любой из целого ряда других иммунологических анализов. Например, радиоактивным мечением антител или фрагментов антител, определяют IL18BP или вирусный IL-18BP посредством применения радиоиммунного анализа (RIA). Хорошее описание RIA имеется в Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, вуWork, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) с особой ссылкой на главу, озаглавленную "An Introduction to RadioimmunoAssay and Related Techniques" by Chard, Т., введенную в описание цитированием. Радиоактивный изотоп определяют с помощью таких средств, как применение гамма-счетчика или сцинтилляционного счетчика, или посредством авторадиографии. Согласно данному изобретению антитело метят флуоресцентным соединением. Когда флуоресцентно меченное антитело подвергают действию света, надлежащей длины волны, его присутствие определяют по флуоресценции. Обычно наиболее используемыми соединениями для флуоресцентного мечения являются флуоресцеин изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фталевый альдегид и флуорескамин. Антитела также эффективно метят, используя металлы, испускающие флуоресценцию, такие как 152 Еu или другие из серии лантанидов. Эти металлы присоединяют к антителу,используя такие металл-хелатирующие группы как диэтилентриаминпентауксусная кислота(ЕТРА). Антитело эффективно метят связыванием его с биотином. Биотинилированное антитело затем определяют с помощью авидина или стрептавидина, присоединенных к флуоресцентному соединению или ферменту, такому как пероксидаза, или к радиоактивному изотопу и подобным. Также антитело эффективно метят, присоединяя его к хемилюминисцентному соединению. Присутствие хемилюминисцентно-меченного антитела затем определяют, детектируя люминисценцию, которая возникает в ходе химической реакции. Примерами особенно полезных люминисцентно-меченных соединений являются луминол, изолуминол, тероматический 29 эфир акридина, имидазол, соль акридина и эфир щавелевой кислоты. Подобным образом биолюминисцентное соединение используют для мечения антитела данного изобретения. Биолюминисценция представляет собой вид хемилюминисценции, обнаруженной в биологических системах, в которых каталитический белок увеличивает эффективность хемилюминисцентной реакции. Присутствие биолюминисцентного белка определяют по наличию люминисценции. Для мечения важными биолюминисцентными соединениями являются люциферин, люцифераза и экворин. Молекулу антитела данного изобретения адаптируют для применения в количественном иммуноанализе, также известном как двасайта или сэндвич-анализ. В типичном количественном иммуноанализе большое количество немеченных антител (или фрагмента антитела) связывают с твердой подложкой или носителем и добавляют эффективно меченные растворимые антитела, чтобы сделать возможным выявление и/или количественный анализ тройного комплекса, образованного между твердофазным антителом, антигеном и меченым антителом. Типичный и предпочтительный количественный иммуноанализ включает прямой анализ, в котором антитело, связанное с твердой фазой, сначала контактирует с тестируемым образцом, чтобы извлечь антиген из образца посредством образования двойного комплекса твердофазное антитело-антиген. После соответствующего периода инкубации твердую подложку или носитель промывают для удаления остатков жидкого образца, включая непрореагировавший антиген, если это вообще требуется, а затем осуществляют контакт с раствором, содержащим неизвестное количество меченых антител, которое функционирует как комплекс твердофазное антитело-антиген. После соответствующего периода инкубации твердую подложку или носитель промывают для удаления остатков жидкого образца, включая непрореагировавший антиген, если это вообще требуется, а затем осуществляют контакт с раствором, содержащим неизвестное количество меченых антител (которое функционирует как репортерная группа). После второго периода инкубации, в течение которого меченое антитело образует комплекс с антигеном, связанным с твердой подложкой или носителем посредством немеченого антитела, твердую подложку или носитель промывают второй раз для удаления непрореагировавших меченых антител. В другом типе иммуноанализа - сэндвичанализе, который успешно проводят с антигеном данного изобретения, используют так называемые одновременный и обратный анализ. Одновременный анализ включает в себя одну стадию инкубации, когда антитело, связанное с твердой подложкой или носителем, и меченое антитело - оба добавляют к тестируемому об 003675 30 разцу одновременно. После завершения инкубации, твердую подложку и носитель промывают для удаления остатка жидкого образца и меченого антитела, не включенного в комплекс. Присутствие меченого антитела, ассоциированного с твердой подложкой или носителем, определяют с помощью общепринятого прямого сэндвич-анализа. В обратном анализе используют ступенчатое добавление сначала раствора меченого антитела к жидкому образцу, за которым следует добавление немеченого антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, после соответствующего периода инкубации. После второй инкубации твердую фазу промывают общепринятым способом для удаления остатка исследуемого образца раствора непрореагировавшего меченого антитела. Определение меченого антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, осуществляют как в случае одновременного и прямого анализов. Данное изобретение также предусматривает молекулы ДНК, кодирующие любые из белков данного изобретения, которые описаны выше, реплицируемые носители экспрессии, содержащие любые такие молекулы ДНК, клеткихозяева, трансформированные любым таким экспрессирующим носителем, включая прокариотические и эукариотические клетки-хозяева,предпочтительно клетки СНО. Изобретение также включает в себя способ для продукции экспрессирующих векторов, кодирующих любой из белков данного изобретения, с целью их экспрессии у людей и других млекопитающих. В изобретение также включают способ получения любого из белков данного изобретения посредством культивирования трансформированной клетки, согласно данному изобретению,и возвращение белка, кодируемого молекулой ДНК, и экспрессирующего носителя в такую трансформированную клетку-хозяина. Кроме использования IL-18BP или вирусного IL-18BP для модулирования активности IL18, их также применяют для очистки самого IL18. С этой целью IL-18BP или вирусный IL18BP связывают с аффинной колонкой и пропускают неочищенный IL-18. Затем IL-18 извлекают с колонки посредством, например элюции при низком рН. Далее изобретение иллюстрируют следующими неограничивающими примерами. Пример 1. Выделение белка, связывающего IL-18.(сконцентрированной в 1000 раз, 500 мл) наносят на колонку при низкой скорости 0,25 мл/мин. Колонку промывают 250 мл 0,5 М NaCl в фосфатном буферном растворе (PBS). Связанные белки затем элюируют 25 мМ лимонной 31 кислоты рН 2,2 и бензамидином (1 мМ), немедленно нейтрализуют 1 М Na2CO3. Собирают фракции по 1 мл. Фракции анализируют с помощью SDS-PAGE и окрашивания серебром. Белок, связывающий IL-18, элюируется во фракциях 2-8 в виде белка 40000 Да (фиг. 1). В зоне 40 кДа, соответствующей IL-18BP, при окрашивании серебром проявляется отчетливый желтый цвет. Анализируют различные фракции посредством поперечного связывания с 125I-IL18, SDS-PAGE и авторадиографии как описывают в примере 2. Белок, связывающий IL-18,обнаруживают во фракциях 2-8, элюированных с колонки с IL-18-агарозой (фиг. 2). Пример 2. Поперечное связывание аффинно-очищенного IL-18BP с меченым IL-18. Образцы (40 мкл) IL-18BP после первой стадии очистки инкубируют (70 мин при 4 С) с 125I-IL-18 (5000000 cpm - число импульсов в минуту). Дисукцинимидил суберат (DSS), растворенный в диметилсульфоксиде (Me2SO, 20 мМ),добавляют до конечной концентрации 2 мM и смесь оставляют в течение 20 мин при 4 С. Реакцию останавливают добавлением 1 М трисНСl, рН 7,5 и 1 М NaCl до конечной концентрации 100 мМ. Добавляют образец буфера, содержащего дитиотрейтол (DTT, 25 мМ конечная) и смеси анализируют в SDS-PAGE (7,5% акриламид) с последующей авторадиографией (фиг. 2). Особую зону с молекулярной массой 58 кДа, вероятно содержащую белок 40 кДа поперечно-связанный с 125I-IL-18 20 кДа, обнаруживают во фракциях, элюированных с IL-18 аффинной колонки (дорожки 2 и 3), но не в промывной жидкости с колонки (дорожка 1),содержащей все другие неочищенные белки мочи. Пример 3. Анализ последовательности белка. Элюированные фракции с аффинной колонки примера 1 разделяют с помощью SDSPAGE (10% акриламид) при невосстанавливающих условиях, электроблоттинга на PVDF мембране (Pro-Blot, Applied Biosystems, USA). Мембрану окрашивают кумасси голубым, вырезают зону 40 кДа и проводят анализ белковой последовательности с помощью микросеквенатора Precise (Applied Biosystems, USA). Получена следующая основная последовательность: где х представляет собой еще не установленные аминокислоты. Кроме того, получена минорная последовательность Из-за этой двойной последовательности невозможно получить данные относительно более длинной последовательности. Минорную последовательность идентифицируют как фрагмент дефенсина человека ( доступа р 11398), 003675 32 начиная с 65 аминокислоты дефенсина. Основную последовательность не связывают ни с одним известным белком, основываясь на исследованиях всех доступных баз данных в NCBI иTIGR с помощью blastp и tbiastn программ исследования. Для того чтобы получить более длинную и более точную последовательность и для того чтобы идентифицировать предполагаемые остатки цистеина, другую аликвоту фракции,элюированной с колонки IL-18-агарозы, восстанавливают DTT в 6 М гуанидине НСl, проводят реакцию с 4-винилпиридином, обессоливают с помощью микроультрафильтрационного устройства (Ultrafree, cutoff 10 000 Daltons, Millipore) и проводят определение первичной структуры короткого фрагмента молекулы белка. После цикла 1 секвенирования, фильтер взаимодействует с о-фталевым альдегидом, чтобы блокировать все N-концевые полипептиды другие, чем Pro. По этому способу получают только основную последовательность, как следующая:C=Cys; F=Phe; L=Leu; E=Glu) В циклах 6, 7, 8 и 11 получают низкий уровень сигнала Thr. Из-за этого низкого уровня его рассматривают более осторожно, чтобы не обозначить данный аминокислотный остаток в названных циклах. Полученная последовательность значительно отличается от последовательности любого другого известного белка, что установлено исследованием баз данных по структуре белка. Однако исследование база данных TIGR с помощью tbiastn программы исследования обеспечило файл кДНК, обозначенный ТНС 12801, открытая рамка считывания (218 кодон) которого,когда транслируется, содержит последовательность высоко гомологичную N-концевой последовательности IL-18BP. Настоящим представлена гомология(Верхняя последовательность (1-40) представляет собой последовательность IL-18BP, выделенного согласно изобретению; нижняя последовательность (51-100) получена трансляцией кДНК из файла ТНС 123801 TIGR). Предполагаемая белковая последовательность, полученная транслированием файла ТНС 12801, вызывает сомнения в отношении остатков 2 и 4 IL-18BP. Она подтверждает идентичность аминокислотных остатков 6, 7 и 8 IL18BP как Thr и, по-видимому, подходит также для остатка 11. Пример 4. IL-18BP является гликопротеином. Аликвоту (0,3 мл) элюированных фракций примера 1 очищают далее гель-хроматографией 33 на колонке Superose 12 (1 х 30 см, Pharmacia,Sweden). Колонку предварительно уравновешивают и элюируют фосфатным буферным раствором и азидом натрия (0,02%) при скорости течения 0,5 мл/мин и собирают фракции по 1 мл. Белок, связывающий IL-18, элюируется во фракциях 20-25 как белок 40000 Да, что устанавливают методом SDS-PAGE и окрашиванием серебром. Образец, содержащий белок 40000 Да (фракция 23, 50 мкл, 50 нг белка) взаимодействует с N-гликозидазой F (PNG-ase F, BioRad) согласно инструкции. Кратко, аликвоту денатурируют кипячением в присутствии 5% SDS в течение 10 мин, 10 х 07 буфера (2,5 мкл), 10%NP-40 (2,5 мкл) и PNGase F (1 мкл), 1 ч при 37 С. Образец анализируют методом SDS-PAGE(10% акриламид) при невосстанавливающих условиях и сравнивают с негидролизованнымIL-18BP из такой же фракции с Superose 12. Показано, что зона 40 кДа IL-18BP исчезает из фракции, обработанной PNGase. Выявляют новые зоны, соответствующие 30 кДа (даже выше зоны PNGase) и 20 кДа. Исчезновение зоны 40 кДа указывает, что эта зона является Nгликозилированным белком. Пример 5. Блокирование биологической активности IL-18 с помощью IL-18BP. Способность IL-18BP, выделенного из мочи, блокировать активность IL-18 определяют посредством измерения индуцированной IL-18 продукции IFN- в мононуклеарных клетках. IL18 индуцирует IFN-, если добавляют вместе или с низкими концентрациями LPS, IL-12, IL-2,или с другими стимуляторами. Активность IL18 тестируют в спленоцитах мыши, в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) человека и в линии KG-1 клеток человека. Клетки селезенки получают от здоровых мышей,промывают, суспендируют в среде RPMI 1640,дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой при 5 х 106 клеток/мл, 1,0 мл культуры стимулируют LPS (или 0,5 или 1 мкг/мл) вместе с рекомбинантным IL-18 человека или мыши (или 0,5 или 5 нг/мл). IL-18-связывающий белок человека (0,5 или 50 нг/мл) добавляют к рекомбинантному IL-18 перед добавлением к клеткам селезенки. После культивирования в течение 24 ч, клетки селезенки подвергают трем циклам замораживания (-70 С) и оттаивания (комнатная температура), клеточный дебрис удаляют центрифугированием, а супернатант анализируют в отношении IFN-, используя ELISA-наборы дляIFN- мыши (Endogen). Как показывают на фиг. 3 А, IL-18BP блокирует активность huIL-18 (человека) в слленоцитах мыши дозазависимым способом. В отличие от этого используемый в качестве контроля растворимый рецептор интерферона-/ не оказывает никакого действия. Аналогично, IL-18BP человека ингибирует активность рекомбинантного IL-18 мыши, позволяя предположить, что IL-18BP человека распо 003675 34 знает IL-18 мыши (фиг. 3 В). В спленоцитах мыши высокие концентрации LPS индуцируют эндогенный IL-18, приводя к продукции IFN-. Действительно, индукция INF- посредствомLPS также ингибируется IL-18BP мочи (фиг. 3 С). Конканавалин A (Con A) активирует Тклетки, чтобы продуцировать IFN- в отсутствие IL-18 (13). Действительно, индукция IFNконканавалином Ф не ингибируется посредством IL-18BP даже при высоких концентрациях(фиг. 3 Д). Эти данные демонстрируют, что IL18BP является специфически ингибитором биоактивности IL-18 скорее, чем неспецифическим ингибитором продукции IFN-. IL-18BP также ингибирует активность IL-18 человека в KG-1 клетках человека, индуцированную сочетаниемIL-18 человека, а также мыши, что оценивают посредством коиндукции IFN- в мононуклеарных клетках человека и мыши. КонцентрацияIL-18BP, которая снижает активность IL-18 на 90%, сравнима с концентрацией самого IL-18,позволяя предположить высокое сродство взаимодействия между этими двумя белками. Пример 6. Выделение клонов кДНК, кодирующих IL-18BP. Тотальная РНК из юркатных Т-клеток(CRL 8163, American Type Culture Collection) обратно-транскрибирована с Superscript Rnase H обратной транскриптазой (Gibco-BRL) и произвольными праймерами (Promega, Madison WI). Затем полученные фрагменты кДНК амплифицируют посредством PCR, используя TagДНК полимеразу (Sigma) и праймеры, соответствующие нуклеотидам 24-44 (смысловой) и 500-481 (обратный) клона ТНС 12801 TIGR. Амплификацию проводят в 30 циклах отжига(55 С, 2 мин) и элонгации (70 С, 1 мин). Полученные продукты PCR разделяют методом электрофореза в агарозном геле (1%), элюируют и клонируют с pGEM-Teasy ТА вектором клонирования (Promega). ДНК из индивидуальных клонов секвенируют с Т 7 и SP6 праймерами. Полученный фрагмент 477 пар оснований метят 32 Р посредством рендом-праймирования. Этот зонд используют для скрининга различных кДНК человека и геномных библиотек. Двойные нитроцеллюлозные фильтры подвергают гибридизации с зондом при 60 С в буфере, содержащем 6 х SSC, 10 х раствор Денхардта, 0,1%-80 С на пленке Kodak XAR. Двойные позитивные клоны очищают из колоний. Плазмиды вырезаются из -рСЕУ 9 клонов и плазмиды самолигируются. кДНК из других библиотек выделяют согласно инструкциям авторов. Автоматизированный анализ последовательности ДНК из выделенных клонов проводят на секвенаторах 35 моделей 373 А и 377 (Applied Biosystems), используя смысловой и антисмысловой праймеры. Используют стандартные протоколы для этих процедур копирования (33). Проведен скрининг следующих библиотек: библиотека кДНК моноцитов человека, сконструированная в -рСЕУ 9 векторе клонирования(15), любезно предоставленная Т. Miki библиотека кДНК юркатных лейкозных Т-клеток человека, библиотека кДНК лейкоцитов периферической крови человека, все от Clontech (PaloAltoCA). Геномная библиотека плаценты человека в лямбда- FIX II векторе получена отStratagene (La Jolla, CA). Получены и охарактеризованы все клоны кДНК, соответствующие четырем различным вариантам сплайсинга IL-18BP. Все варианты сплайсинга кодируют предполагаемые растворимые секретируемые белки. Наиболее преобладающий вариант (IL-18BPa) имеет открытую рамку считывания из 192 кодонов, кодирующую сигнальный пептид из 28 аминокислотных остатков с последующим зрелым предполагаемым(SEQ ID NO: 2). Положение остатков цистеина позволяет предположить, что этот полипептид принадлежит к супер-семейству иммуноглобулинов (Ig). Каждый их четырех остатков Gln в зрелом IL-18BPa является возможным участкомN-гликозилирования. Другие три варианта сплайсинга IL-18BP имеются в значительно меньшем количестве. Другая кДНК IL-18BPb 1 т.п.н. кодирует зрелый белок из 85 аминокислотных остатков(SEQ ID NO: 4). Третий вариант, IL-18 ВРс,представляется 2,3 т.п.н. кДНК, кодирующей зрелый IL-18BP из 169 аминокислотных остатков (SEQ ID NO: 6). Четвертый вариант, BL18BPd, кодирует зрелый IL-18BP из 133 аминокислотных остатков (SEQ ID NO: 8). Внутриэкзонный сплайсинг происходит в двух сайтах вдоль про-мРНК. Эти явления и дополнительный 5' экзон в IL-18BPa приводят к 3 различным 5' UTRs в разных клонах кДНК. Поэтому вполне возможно, что различные варианты IL-18BP образуются в ответ на определенные сигналы регуляции транскрипции. До сих пор не обнаружено ни одной кДНК,кодирующей рецептор с трансмембранным доменом. Пример 7. Конструкция экспрессирующего вектора млекопитающих, продукция рекомбинантного IL-18BP и оценка биологических активностей рекомбинантного IL-18BP. Кодирующую область кДНК IL-18BPa амплифицируют посредством PCR со смысловым праймером и обратным праймером: 36 Продукты PCR вырезают посредством Хbа 1 и клонируют в сайте Xba I pEF-BOS экспрессирующего вектора (25), чтобы получить pEFBOS-IL-18BPa. Конструкции подтверждают секвенированием ДНК. Серии 6 х 107 COS7 клеток в 1,4 мл TDбуфера, содержащего плазмидную ДНК pEFBOS-IL-18BPa (10 мкг) и ДЕАЕ-декстран (120 мкг), инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, как описывают (35). Клетки затем промывают ДМЕМ-10% фетальная бычья сыворотка, культивируют в течение 4 ч в ДМЕМ-10, промывают и инкубируют в течение 3-5 дней в бессывороточной среде ДМЕМ. Культуральную среду собирают, концентрируют в 6 раз ультрафильтрацией (10 kD cutoff) и выделяют IL-18BP-His6 на колонке Talon (Clontech) с имидазолом в качестве элюента согласно инструкции авторов. Иммунологическую перекрестную реактивность мочевого и СOS7-экспрессированногоIL-18BP оценивают следующим образом: IL18BP мочи (5 мкг) метят 125I по способу с хлорамином Т. Супер-натанты COS7 клеток (250 мкл) смешивают (1 ч, комнатная температура) с антителами к IL-18BP мочи, разбавляют 1:1000 в забуференном фосфатом растворе (PBS),0,05% твине 20 и 0,5% бычьем сывороточном альбумине (Wash Buffer). Затем добавляют IL18BP мочи (106 импульсов в минуту) и через 1 ч добавляют белок-G-sepharose (20 мкл). Смесь суспендируют (1,5 ч, 4 С), затем гранулы изолируют и промывают 3 х Wash Buffer и раз вPBS. Гранулы элюируют буфером для образца,разделяют методом SDS-PAGE (10% акриламид) при восстанавливающих условиях с последующей авторадиографией.IL-18BPa движется в виде одной зоны наSDS-PAGE с окрашиванием серебром при восстанавливающих и невосстанавливающих условиях и имеет такую же кажущуюся молекулярную массу, как масса IL-18BP мочи (данные не представлены). При анализе последовательности белка этого препарата выявляют такую жеN-концевую последовательность как последовательность IL-18BP мочи, указывая, что последний не деградируется на N-конце. Иммуноблотинговый анализ IL-18BP с антителами, полученными против IL-18BP мочи,выявляет зону с такой же молекулярной массой как масса белка мочи. Кроме того, используя иммунопреципитацию с последующими SDSPAGE и авторадиографией, показывают, что IL19BPa способен вытеснять 125I-IL-18BP мочи из комплекса с антителами. Поэтому, IL-18BPa структурно соответствует IL-18BP мочи. Исследуют способность неочищенного и очищенного IL-18BPa ингибировать биологическую активность IL-18. IL-18BPa ингибирует дозазависимым способом индуцирующую IFNактивность IL-18 человека и мыши в спленоци 37 тах мыши, РВМС и в линии KG-1 клеток человека (фиг. 9). Результаты различных биоисследований, а также анализ изменения подвижности (пример 8) показывают, что ингибирование активностиIL-18 является свойством присущим клонированному IL-18BP, а не свойством сопутствующих примесей в IL-18BP мочи, таких как коэлюирующийся фрагмент дефенсина. Пример 8. Анализ изменения электрофоретической подвижности. Изучают влияние мочевого и рекомбинантного IL-18BP на индуцированную IL-18 активацию NF-kB в KG-1 клетках человека. KG1 клетки человека (4 х 106 в 1 мл RMPI) стимулируют или huIL-18 (человека) (10 нг/мл), или(20 мин, комнатная температура). После 20 мин при 37 С, клетки три раза промывают охлажденным льдом PBS и немедленно замораживают в жидком азоте. Клеточные осадки повторно суспендируют в трехкратном упаковочном колоночном объеме буфера А (20 мМ трис рН 7,6,0,4 М NaCl, 0,2 мМ EDTA, глицерин (20% по объему), 1,5 мМ MgCl2, 2 мМ дититрейтол(DDT), 0,4 мМ PMSF, 1 мМ Na3VO4 2 мкг/мл каждого из лейпептина, пепстагина и апротинина). Клеточный дебрис удаляют центрифугированием (15000 х g, 15 мин), аликвоты супернатанта замораживают в жидком азоте и хранят при -80 С. Концентрацию белка определяют по методу Бредфорда (Bio-Rad), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Двухцепочечный олигонуклеотид, соответствующий элементу, связывающему NF-kB (10 пмол, Promega), метят [32P]dCTP (300 Ки/ммол) и Т 4 полинуклеотидкиназой (New England Biolabs). Свободные нуклеотиды удаляют центрифугированием с нанесением препарата на спинколонку. Экстракты (10 мкг белка) клеток, обработанные IL-18 или IL-18+IL-18BP, инкубируют (15 мин, комнатная температура) с меченым зондом (3 х 104 импульсов в минуту) вместе с поли dI.dC (500 нг, Pharmacia) и денатурированной ДНК спермы лосося (100 нг, Sigma) в 20 мкл буфера, содержащего HEPES (рН 7,5, 10 мМ), 60 мМ КСl, 1 мМ MgCl, 2 мМ EDTA, 1 мМDTT и глицерин (5% по объему). Затем смеси наносят на 5% неденатурирующие полиакриламидные гели. Электрофорез проводят при 185 Вт в 0,5 х ТВЕ (40 мМ трис НСl, 45 мМ борной кислоты и 2,5 мМ EDTA). Гели высушивают под вакуумом и проводят авторадиографию всю ночь при -80 С. Обнаружено, что IL-18 индуцирует образование гомодимера р 50 NF-kB и гетеродимера р 65/р 50 NF-kB. Мочевой, а также рекомбинантный IL-18BP ингибирует активациюNF-kB, вызванную IL-18, что устанавливают по анализу изменения электрофоретической подвижности с экстрактами KG-1 клеток, связывающими радиоактивный олигонуклеотид, со 003675 38 ответствующий согласованной последовательности NF-kB. Пример 9. Экспрессия IL-18BP в Е.coli,клетках дрожжей и насекомых.IL-18BP также продуцируется другими рекомбинантными клетками, такими как прокариотические клетки, например Е. coli, или другими эукариотическими клетками такими как клетки дрожжей и насекомых. Имеются хорошо известные способы для конструирования соответствующих векторов, несущих ДНК, которые кодируют любой IL-18BP, и пригодны для трансформирования Е.coli и клеток дрожжей,или инфицирования клеток насекомых для того,чтобы продукцировать рекомбинантный IL18BP. Для экспрессии в клетках дрожжей, ДНК,кодирующую IL-18BP (пример 6) вырезают и вставляют в экспрессирующие векторы, подходящие для трансфекции клеток дрожжей. Для экспрессии в клетках насекомых, ДНК, кодирующую IL-18BP, вставляют в бакуловирус, а клетки насекомых инфицируют вышеназванным рекомбинантным бакуловирусом. Для экспрессии в Е.coli, ДНК, кодирующую IL-18BP, подвергают сайтнаправленному мутагенезу с соответствующими олигонуклеотидами с тем, чтобыATG кодон инициации вставить именно до первого кодона зрелого IL-18BP. Альтернативно,такую ДНК получают посредством PCR с соответствующими смысловым и антисмысловым праймерами. Полученные ДНК-конструкции затем вводят в прокариотические экспрессирующие векторы, соответственно сконструированные посредством технологий, хорошо известных на данном уровне техники (23). Пример 10. Конструкция экспрессирующего вектора, ассоциированного с аденовирусом,для экспрессии IL-18BPa in vivo. Функциональный ген, кодирующий IL18BPa, конструируют на основе плазмиднойpcDNA3 (Invitrogen, San Diego CA). кДНК IL18BP с Kozak-согласованной последовательностью на 5' конце сшивают в сайте Хbа pcDNA3 по способу, который разрушает сайт рестрикции. Новые Хbа 1 сайты вставляют посредством сайтнаправленного мутагенеза до неомициновой кассеты (основание 2151 исходной последовательности pcDNA3) и после сигнала поаденилирования SV40 (основание 3372 исходной последовательности pcDNA3). Эту конструкцию вырезают посредством Xbal и полученный 4,7 т.п.н. миниген вставляют в Xbal-сайт плазмидной psub201 как описывают (Snyder et al., 1996,Current Protocols in Human Genetics, Chapters 12.1.1-12.1.17, John WileySons). Полученную рекомбинантную плазмиду котрансфицируют с хелпер AAV плазмидой pAAV/Ad в Т 293 клетки человека. Культуры затем инфицируют аденовирусом в качестве хелпер-вируса и клетки собирают после 48-60 ч инкубации. Клетки подвергают 3 циклам замораживания-оттаивания,клеточный дебрис удаляют центрифугировани 39 ем, а супернатант насыщают сульфатом аммония 33% насыщения. Затем смесь центрифугируют, a rAAV осаждают из супернатанта сульфатом аммония при 50% насыщения. Далее вирус очищают посредством CsCl, диализуют и,наконец, нагревают в течение 15 мин при 56 С,чтобы уничтожить любой вирус. Пример 11. Конструкция рекомбинатных белков слияния IL-18BP. Получение белков, содержащих IL-18BP,слитых с константной областью тяжелой цепиIgG2, проводят следующим образом: ДНК IL18BP подвергают сайтнаправленному мутагенезу с соответствующими олигонуклеотидами с тем, чтобы ввести уникальный сайт рестрикции непосредственно перед и после кодирующих последовательностей. Плазмиду, несущую константную область тяжелой цепи IgG2, напримерpRKCO42Fcl (6), подвергают подобному сайтнаправленному мутагенезу, чтобы ввести тот же уникальный сайт рестрикции так близко, как возможно к Asp 216 тяжелой цепи IgG1 по способу, который допускает трансляцию в фазе слитого белка. Фрагмент dsDNA, состоящий из 5' нетранслированных последовательностей и кодирующий IL-18BP, получают посредством расщепления в уникальных сайтах рестрикции или, альтернативно, посредством PCR с соответственно сконструированными праймерами. Аналогично расщепляют мутантныйpRKCD42Fcl, чтобы образовать большой фрагмент, содержащий плазмиду и последовательности IgG1. Затем два фрагмента лигируют с образованием новой плазмиды, кодирующей полипептидный предшественник, состоящий изIL-18BP и приблизительно 227 С-концевых аминокислот IgG1 (область петли и СН 2 и СН 3 домены). ДНК, кодирующую рекомбинантные белки, выделяют из плазмиды посредством рестрикции соответствующими ферментами рестрикции, а затем вводят в эффективные прокариотические и эукариотические экспрессирующие векторы. Пример 12. Получение химически модифицированных IL-18BP. Для увеличения периода полу-жизни IL18BP в плазме, получают IL-18BP, которые химически модифицируют полиэтиленгликолем(PEG). Модификацию осуществляют поперечным сшиванием PEG с остатком цистеина молекулы IL-18BP. Конструируют мутантные IL18 ВР, которые содержат дополнительный остаток цистеина на аминоконцах, в участках гликозилирования и на карбоксильных концах каждого IL-18BP. Мутагенез осуществляют методомPCR, используя олигонуклеотиды, содержащие требуемую мутацию. Эти мутантные белки экспрессируют обычным способом, хорошо известным в данной области. Проводят pegylation этих белков и определяют активность. Пример 13. Получение поликлональных антител к IL-18BP. 40 Кроликам первоначально вводят подкожно 5 мкг чистого препарата IL-18BP мочи, эмульгированного в полный адьювант Фрейнда. Через три недели им снова вводят подкожно 5 мкг препарата IL-18BP в неполном адьюванте Фрейнда. Две дополнительные инъекции IL18BP, растворенного в PBS, проводят с 10 дневными интервалами. У кроликов забирают кровь через 10 дней после последней иммунизации. Рост уровня антител определяют с помощью радиоиммуноанализа. 125I-меченый IL18BP (166000 импульсов в минуту) смешивают с различными разведениями (1:50, 1:500, 1:5000 и 1:50000) сыворотки кролика. Суспензию гранул белок-G-агарозы (2 С мкл, Pharmacia) добавляют в общем объеме 200 мкл. Смесь оставляют в течение 1 ч при комнатной температуре, затем гранулы промывают 3 раза и считают связанную радиоактивность. Антисыворотку кролика к лептину человека используют в качестве негативного контроля. Титр IL-18BP- антисыворотки оказывается между 1:500 и 1:5000, в то время как отрицательный контроль меньше чем 1:50. Пример 14. Получение моноклональных антител к IL-18BP. Самкам Balb/C мышей (в возрасте 3 месяцев) вводят сначала 2 мкг очищенного IL-18BP в эмульсии полного адьюванта Фрейнда, а через три недели подкожно в неполном адьюванте Фрейнда. Три дополнительные инъекции делают с 10-дневными интервалами подкожно вPBS. Конечные бустер-инъекции производят внутрибрюшинно за 4 и 3 дня до слияния мышам, показывающим наивысший тирт связывания, что определяют посредством IRIA (см. ниже). Слияние проводят, используя NSO/1 линию клеток меланомы и лимфоциты, полученные как из селезенки, так и из лимфатических узлов животных, в качестве сливающихся клеток. Слитые клетки распределяют в многолуночные планшеты для микрокультуры и гибридомы селектируют в ДМЕМ, дополненной HAT и 15% сыворткой лошади. Гибридомы, которые, как обнаружено, продуцируют антитела к IL-18BP,субклонируют по методу лимитирующих разведении и вводят Balb/C мышам, которым введен пристан для образования асцита. Изотипы антител определяют, используя коммерчески доступный EUSA-набор (Amersham, UK). Скрининг гибридом, продуцирующих анти-IL-18BP моноклональные антитела, проводят следующим образом. Гибридомные супернатанты тестируют относительно присутствия антиIL-18 ВР антител с помощью инвертного твердофазного радиоиммуноанализа (IRIA). ELISAпланшеты (Dynatech Laboratories, Alexandria,VA) покрывают Talon-очищенным IL-18BPaHis6 (10 мкг/мл, 100 мкл/лунку). После инкубации в течение ночи при 4 С, планшеты промывают дважды PBS, содержащим BSA (бычий сывороточный альбумин) (0,5%) и твин-20 41 в течение, по крайней мере, 2 ч при 37 С. Добавляют гибридомные культуральные супернатанты (100 мкл/лунку) н планшеты инкубируют в течение 4 ч при 37 С. Планшеты промывают 3 раза и добавляют конъюгат пероксидазы хрена с антителами козы к антителам мыши (HRP, Jackson Labs, 1:10000, 100 мкл/лунку) в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают 4 раза, а окраску проявляют посредствомABTS 2,2-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6 сульфокислота, Sigma) с Н 2O2 в качестве субстрата. Планшеты считывают с помощью автоматического ELISA-планшет-ридера. Образцы,дающие OD, которое, по крайней мере, в 5 раз выше, чем величина негативного контроля, считают позитивными. Пример 15. Аффинная хроматография IL18BP с моноклональными антителами. Антитела против IL-18BP используют для очистки IL-18BP с помощью аффинной хроматографии. Секретируемую гибридомой асцитную жидкость, содержащую моноклональные антитела, очищают осаждением суфатом аммония при 50% насыщения с последующим экстенсивным диализом против PBS. Приблизительно 10 мг иммуноглобулинов связывают с 1 мл Affigel 10 (Bio Rad USA), как рекомендует производитель. 250 мл белков мочи человека (эквивалентных 250 л неочищенной мочи) наносят на 0,5 мл колонку с анти-IL-18 ВР-антителами при 4 С при скорости течения 0,25 мл/мин. Колонку промывают PBS до тех пор, пока не перестанет определяться белок в промывной жидкости. IL18BP элюируют 25 мМ буфером лимонной кислоты, рН 2,2, (8 х 1 колонка, объем фракций) и немедленно нейтрализуют 1 М Na2 СО 3. Дальнейшую очистку этого препарата осуществляют с помощью гель-фильтрации. Пример 16. ELISA-тест (метод твердофазного иммуноферментного анализа). Титрационные микропланшеты (Dynatechor Maxisorb, by Nunc) покрывают анти-IL-18 ВР моноклональными антителами (бессывороточный гибридомный супернатант или иммуноглобулины асцитной жидкости) в течение ночи при 4 С. Планшеты промывают PBS, содержащим BSA (0,5%) и твин 20 (0,05%) и блокируют тем же раствором в течение, по крайней мере, 2 ч при 37 С. Тестируемые образцы разбавляют блокирующим раствором и добавляют в лунки(100 мкл/лунку) в течение 4 ч при 37 С. Затем планшеты 3 раза промывают PBS, содержащим твин 20 (0,05%) с последующим добавлением анти-IL-18 ВР сыворотки кролика (1:1000, 100 мкл/лунку) для дальнейшей инкубации в течение ночи при 4 С. Планшеты промывают 3 раза и добавляют конъюгат пероксидазы хрена с антителами козы к антителам кролика (HRP, Jackson Labs, 1:10000, 100 мкл/лунку) в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают 4 раза, а окраску проявляют посредствомABTS 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6 сульфокислоты, Sigma) с Н 2O2 в качестве субстрата. Планшеты считывают с помощью автоматического аппарата для прочтения планшетов. Пример 17. Негликозилированный IL-18BP человека биологически активен. Исследуют способность очищенного рекомбинантного IL-18BPa ингибировать биологическую активность IL-18. IL-18BPa ингибирует дозазависимым способом индуцирующуюU/мл PNGase F, New England Biolabs). Смесь инкубируют в течение 24 ч при 37 С при невосстанавливающих условиях. Аликвоты из образца и из негидролизованного IL-18BP-His6 анализируют посредством SDS-PAGE при невосстанавливающих условиях с последующим иммуноблотингом с антителами к IL-18BP. Обнаруживают, что зона 40 кДа IL-18BP-His6 исчезает в PNGase-обработанной фракции, и выявляют новую зону 20 кДа. Молекулярная масса продукта и специфичность PNGase F указывают,что IL-18BP-His6 является полностью дегликозилированным.PNGase-обработанные фракции, негидролизованный IL-18BP-His6 и контрольный образец, содержащий PNGase в буфере, раздельно адсорбируют на Talon-гранулах, промывают фосфатным буфером и элюируют имидазолом(100 мМ). Элюированные фракции подвергают биоанализу, используя IL-18 человека (20 нг/мл), LPS (2 мкг/мл) и спеноциты мыши. Результаты представляют в следующей таблице Образец Контроль Негидролизованный IL-18BP-His6 Обработанный PNGase IL-18BP-His6IL-18BP биологически активен как модулятор активности IL-18. Предшествующее описание отдельных направлений выявляет основную сущность изобретения так, что другие, применяя современные знания, легко модифицируют и/или приспособят для различных применений такие конкретные направления без отступления от основных представлений и поэтому такие приспособления и модификации должны быть и предназначаются для включения в значение и область эквивалентов описанных направлений. Понятно,что фразеология и терминология служат для описания, а не ограничения. 43 Примеры Часть 1. Примеры 18-25, относящиеся к использованию ингибиторов IL-18 при поражении печени. Пример 18. Продуцирование IL-18BP-Histag. Очищенный рекомбинантный IL-18BP человека, содержащий his-метку (r-hIL-18BP-Histag), продуцировали в клетках СНО. Продуцирование рекомбинантных белков в эукариотических клетках известно специалистам. Существуют хорошо известные методы, которые используются для конструирования соответствующих векторов,несущихIL-18BPкодирующую ДНК, и которые являются подходящими для трансфекции эукариотических клеток, осуществляемой в целях продуцирования рекомбинантного IL-18BP. Для экспрессии в клетках, ДНК, кодирующую IL-18BP (см., например, Novick et al., 1999), вырезали и встраивали в экспрессирующие векторы, подходящие для трансфекции клеток. Альтернативно, такая ДНК может быть получена посредством ПЦР с использованием подходящих смысловых и антисмысловых праймеров. Затем полученные кДНК-конструкции встраивали в соответствующим образом сконструированные эукариотические экспрессирующие векторы методами,хорошо известными специалистам (Maniatis,1982). Рекомбинантный белок очищали до чистоты выше 95%, и было обнаружено, что он является биологически активным in vitro и in vivo и имеет высокую аффинность по отношению к своему лиганду. Пример 19. Протективное действие IL18BP против индуцированной эндотоксином гибели клеток в мышиной модели. Для того чтобы определить, обладает лиIL-18BP, ингибитор IL-18, протективным действием против высокой дозы липополисахаридов(ЛПС) у мышей, использовали мышиную модель. ЛПС вызывает острое поражение печени у мышей с последующей быстрой их гибелью. 4 мг/кг рекомбинантного человеческого(полученную путем рекомбинантного продуцирования белка), внутрибрюшинно инъецировали(i.p.) мышам C57BL/6. Через 1 ч инъецировали 60 мг/кг ЛПС (летальные дозы). Выживаемость этих мышей сравнивали с выживаемостью группы животных, которые получали только ЛПС (без IL-18BP). Пять из 7 мышей, которым инъецировалиrhIL-18BP-his, выживали после инъекции ЛПС,в отличие от контрольных мышей, которые все погибали в пределах 3 дней. Пробы крови брали через 5 ч после инъекции ЛПС в отсутствии или в присутствии возрастающих доз rhIL-18BP-his и анализировали с помощью ELISA на содержание IFN в кровотоке (фиг. 1). 0,4 и 4 мг/кг rhIL-18BP индуцирова 003675 ли 2-кратное снижение IFN в сыворотке. Такое ингибирование не происходило при более низких дозах rhIL-18BP (0,004 и 0,4 мг/кг). Пример 20. IL-18BP обладает протективным действием против поражения печени в мышиной модели заболевания. Для оценки эффекта IL-18BP использовали мышиную модель фульминативного гепатита. После последовательного введения Propionibacterium acnes (P.acnes) и липополисахарида(ЛПС), у мышей развивалось острое поражение печени. Мышам инъецировали возрастающие дозыrhIL-18BP-his (4; 0,4; 0,04; 0 мг/кг) через различные промежутки времени (1 ч, 20 мин, одновременно), а затем мышам C57BL/6, сенсибилизированным Р.acnes, инъецировали ЛПС. При введении, i.p., rhIL-18BP-his одновременно с ЛПС, ни одна из мышей не выживала, а уровни(показатель поражения печени) как показано на фиг. 2. Помимо этого проводили мониторинг выживания мышей (фиг. 3): при введении i.p. rhIL18BP-his за 20 мин перед введением ЛПС, гибель мышей, которым вводили две самые высокие дозы IL-18BP (4 и 0,4 мг/кг), происходила на 10 ч позже по сравнению с контрольными мышами, которые получали NaCl вместо IL18BP. Результаты измерения уровней IFN- в сыворотке представлены на фиг. 4. rhIL-18BP (4 мг/кг) на 90% ингибировал уровни IFN- в кровотоке и на 80% ингибировал уровни аланинаминотрансферазы в кровотоке (данные не приводятся). При введении rhIL-18BP-his за 1 ч до ЛПС,кривые выживаемости и уровни IFN- в кровотоке были аналогичны тем, которые наблюдались при введении rhIL-18BP-his за 20 мин до введения ЛПС, но уровни аланинаминотрансферазы в кровотоке оставались неизменными(данные не приводятся). Помимо этого, ткань мышиной печени была проанализирована путем окрашивания гематоксилином-эозином, а также с помощью туннельной микроскопии. В печени мышей, у которых предварительно был индуцирован тяжелый гепатит, обнаруживался обширный некроз по сравнению с печенью нормальных мышей. В противоположность этому, ткань мышиной печени, обработанная IL-18BP, обнаруживала значительно меньшие очаги некроза, чем у необработанных мышей. Пример 21. Антитела против IL-18 защищают от летального эндотоксикоза. Для того чтобы определить, защищает ли блокирование IL-18 анти-IL-18 антителами от 45 воздействия летальных доз бактериальных липополисахаридов, мышам C57BL/6J сначала инъецировали нейтрализующее кроличье антитело против мышиного IL-18 (поликлональное) или нормальную кроличью сыворотку (НКС) в качестве контроля. Через 30 мин после обработки антителом мышам инъецировали летальные дозы ЛПС, происходящих либо от E.coli (фиг. 5 А), либо от S.typhimurium (фиг. 5 В). Эксперименты осуществляли с использованием 10-12 мышей на группу, и проводили два раза при двух различных условиях. Как показано на фиг. 5 А, обработка мышей антисывороткой против IL-18 способствовала предупреждению гибели мышей, индуцированной введением 40 мг/кг ЛПС E.coli. После обработки анти-IL-18 антителом выживало 100% мышей, в отличие от мышей, обработанных нормальной кроличьей сывороткой, из которых выживало лишь 10% (р 0,005). На фиг. 5 В показано, что мыши, обработанные этим антителом, также были защищены от летального действия S.typhimurium (50% выживание в отличие от 0% выживания; р 0,05). Пример 22. Блокирование IL-18 и TNFзащищает мышей от СоnА- и РЕА-индуцированной гепатотоксичности. Для оценки роли IL-18 и TNF- в поражении печени использовали две экспериментальные модели гепатотоксичности. Введение конканавалина А (СоnА) и Pseudomonas aeruginosa(PEA) мышам приводит к индуцированию поражения печени, и такие мыши являются моделями Т-клеточно-опосредованного гепатита. Мышей C57BL/6J предварительно обрабатывали антисывороткой против IL-18 или растворимым рецептором TNF-, TNFsRp55. Уровни аланинаминотрансферазы в сыворотке(ALT) измеряли как показатель поражения печени (фиг. 6). Как показано на фиг. 6 А, антисыворотка против IL-18 и растворимые TNF-рецепторы значительно снижали СоnА-индуцированные уровни ALT в сыворотке по сравнению с контрольной инъекцией только одного носителяTNFрецептора и антисыворотки против IL-18 приводило к полному ингибированию СоnАиндуцированного поражения печени. Как показано на фиг. 6 В, у РЕАинъецированных мышей, нейтрализация ингибиторов TNF- или антител против IL-18 приводила к 93%-му и 83%-му ингибированию уровней ALT в сыворотке соответственно. Комбинированное блокирование IL-18 и TNFприводило к 99%-й защите. Пример 23. Уровни IL-18-связывающего белка в плазме увеличены у пациентов с хроническим заболеванием печени.(ХЗП) различной этиологии и у 31 здоровых контрольных индивидуумов посредством специфического ELISA с использованием моноклонального антитела против IL-18BP. Уровни IL-18BP в плазме были значительно выше у пациентов с ХЗП (12,910,89 нг/мл; среднееср.кв.ош.), чем у здоровых индивидуумов (4,960,43 нг/мл, р 0,001). Пациенты с циррозом печени имели значительно большие уровни, чем пациенты с нециррозным ХЗП(19,231,28 нг/мл, n=67, ср. 6,490,51 нг/мл,n=66, р 0,001). Пациенты с заболеванием на стадии В по классификации Чайльда-Пьюга имели более высокие уровни IL-18BP, чем пациенты с заболеванием на стадии А (22,482,44 нг/мл, ср. 9,571,25 нг/мл, р 0,001). Однако какого-либо значимого отличия между этими уровнями на стадиях заболевания В и С по классификации Чайльда (22,482,44 нг/мл, ср. 20,624,75 нг/мл, р=0,7) не наблюдалось. Уровни IL-18BP в плазме положительно коррелировали со скоростью осаждения GOT, биллирубина и эритроцитов. Была обнаружена отрицательная корреляция с протромбиновым временем. В итоге, результаты показали, что уровниIL-18BP в плазме были увеличены при ХЗП и коррелировали с тяжестью заболевания независимо от его этиологии. Хотя очевидно, что эндогенный антагонист провоспаления, вызываемого IL-18, увеличивает уровни IL-18BP, однако, это повышение не является достаточным для противодействия подавлению медиаторов провоспаления у пациентов с ХЗП. Пример 24. Ингибирование алкогольного гепатита под действием IL-18BP. Четырем группам крыс (5 крыс на группу) вводили этанол и корм, содержащий кукурузное масло, путем внутрижелудочного вливания в течение 4 недель. У контрольных крыс, этанол заменяли декстрозой такой же калорийности. Крысам ежедневно инъецировали мышиный IL18BP (1 мг/кг) или физиологический раствор. На срезах печени проводили паталогоанатомический анализ и измеряли уровни в сыворотке печеночных ферментов, TNF-, Fas-лигандов иIFN-. У крыс, которым вводили этанол и физиологический раствор, наблюдалось некровоспалительное поражение и экспрессия печеночных ферментов, TNF-, Fas-лигандов и IFN-. Инъекция крысам мышиного IL-18BP защищала этих крыс от некровоспалительного поражения и значительно снижала уровни печеночных ферментов, TNF-, Fas-лигандов и IFN (90%). Пример 25. Ингибирование индуцированного конканавалином А гепатита под действиемIL-18BP или с инъекцией (1 мг/кг), которую вводили за 2 ч до введения СоnА, а затем ежедневно. Поражение печени оценивали путем определения сывороточных уровней печеночных ферментов, TNF-, Fas-лиганда и IFN-. Результаты гистопаталогии печени сравнивали с результатами, полученными для мышей, обработанных только конканавалином А. Предварительная обработка IL-18BP приводила к значительному снижению уровней печеночных ферментов и TNF- в сыворотке,причем гистопатологическая оценка не выявила какого-либо воспаления у этих мышей по сравнению с контрольными мышами, обработанными СоnА. Часть II. Примеры 26 и 27, относящиеся к использованию ингибиторов IL-18 при артритах. Пример 26. Продуцирование метки IL18BP-his. Для проведения эксперимента, подробно описанного ниже в примере 27, рекомбинантный человеческий IL-18BP, содержащий меткуKim et аl., 2000. Рекомбинантный белок очищали до чистоты выше 95%, и было установлено,что он является биологически активным in vitro и in vivo и имеет высокую аффинность к его лиганду. Продуцирование рекомбинантных белков в других эукариотических системах с меткой или без меток, облегчающих очистку рекомбинантных белков, известно специалистам. Существуют хорошо известные методы, которые используются для конструирования соответствующих векторов, несущих ДНК, кодирующую IL-18BP,и которые являются подходящими для трансфекции эукариотических клеток, осуществляемой в целях продуцирования рекомбинантногоIL-18BP. Для экспрессии в клетках ДНК, кодирующую IL-18BP (см., например, Novick et аl.,1999), вырезали из клонирующего вектора и встраивали в экспрессирующие векторы, подходящие для трансфекции клеток. Альтернативно,такая ДНК может быть получена посредством ПЦР с использованием подходящих смысловых и антисмысловых праймеров. Затем полученные кДНК-конструкции встраивали в соответствующим образом сконструированные эукариотические экспрессирующие векторы методами,хорошо известными специалистам (Maniatis,1982). Пример 27. Блокирование эндогенного IL18 в мышиной модели артрита. Методы Индуцирование коллаген-индуцированного артрита (КИА).DBA/1 (8-12 недельных) путем иммунизации нативным бычьим коллагеном типа II (СII), как было описано ранее (Plater-Zyberk et al., 1995). Через 25 дней после CII-иммунизации, мышей ежедневно оценивали на развитие заболевания. Обработка rhIL-18BP-6his. Обработку С 11-иммунизированных мышейDBA/1 начинали после появления первых клинических признаков заболевания. Для нейтрализации эндогенного IL18 у обработанных коллагеном мышей использовали рекомбинантный человеческий IL-18BP, содержащий метку из 6 гистидинов (rhIL-18BPa-6his). Мышам ежедневно в течение 7 дней внутрибрюшинно (i.p.) инъецировали rhIL-18BP-6his при 5 различных концентрациях, 10, 3, 1, 0,5, 0,25 мг/кг/инъекцию. Контрольным мышам давали только носитель,т.е. плацебо, (0,9% NaCl). Оценка развития заболевания Клиническая оценка (клинические балльные показатели). После первого появления клинических симптомов оценка мышей проводилась каждый день исследователем, которому был неизвестен протокол обработки. Каждую конечность оценивали на тяжесть поражения (оценки 0-3,5,максимальная оценка 14/мышь). Прогрессирование отека (воспаления) измеряли на лапах,которые обнаруживали первые признаки заболевания, с использованием точного штангенциркуля (Proctest 2T, Kroeplin Langenmesstechnik). Прогрессирование заболевания оценивали ежедневно в течение 8 дней от начала эксперимента, а затем всех мышей умерщвляли и проводили гистопатологический анализ лап. Гистологическая оценка эрозии хряща и микроскопическая оценка воспаления. После завершения экспериментов, т.е. на 8-й день их начала, мышей умерщвляли, и лапы,на которых обнаруживались первые признаки заболевания, иссекали. Суставы фиксировали,декальцинировали и заливали в парафин. Делали стандартные срезы (5-7 мкм) суставов и окрашивали гематоксилином/эозином/сафранином О. Каждый сустав оценивался 2 исследователями, которым был неизвестен протокол обработки (отсутствие деструкции хряща или кости = 0; локализованная эрозия хряща = 1-2; более обширные эрозии = 3; общая деструкция хряща и наличие эрозии костей = 4). Конечные оценки каждой мыши представляли собой среднее значение из результатов всех оцененных суставов. Микроскопическую оценку воспаления или синовита выражали в баллах от 0 до 4 следующим образом: отсутствие воспаления = 0; небольшое утолщение выстилающего слоя и/или некоторая инфильтрация клеток в субвыстилающем слое = 1-2; утолщение выстилающего слоя и/или более выраженный приток клеток субвыстилающего слоя = 3; присутствие клеток в синовиальном 49 пространстве и высокая степень инфильтрации синовия множеством воспалительных клеток = 4. Определение антител против коллагена. Антитела против бычьего коллагена типаII оценивали с использованием твердофазного иммуферментного анализа (ELISA). Измеряли титры IgG1 и IgG2a. Вкратце, планшеты сенсибилизировали 10 мкг бычьего коллагена, а затем сайты неспецифического связывания блокировали 0,1 М этаноламином (Sigma). Затем добавляли серийные разведения 1:2 сыворотки, после чего инкубировали с козьим антимышиным антителом конкретного изотипа, конъюгированным с пероксидазой (Southern BiotechnologyAssociates, Birmingham, AL, USA) и с субстратом (5-аминосалициловая кислота, Sigma). Планшеты считывали при 492 нм. Титры выражали как среднееср.кв.ош. разведение, которое давало полумаксимальную величину. Анализ на IL-6. Уровни IL-6 определяли с помощью ELISA(RD systems, Minneapolis, MN, USA). Биологическую активность IL-6 определяли с помощью анализа на пролиферацию с использованием клеток В 9. Вкратце, 5 х 103 клеток В 9 в 200 мкл среды RPMI 1640 с 5% FCS на лунку высевали в круглодонный микротитрационный планшет и инкубировали в течение 3 дней с использованием человеческого рекомбинантногоIL-6 (RD systems Minneapolis, MN, USA) в качестве стандарта. После завершения инкубирования добавляли 0,5 мкКи 3[Н]тимидина (NENDupont, Boston, MA, USA) на лунку. Через 3 ч клетки собирали и определяли включение тимидина. Предел детекции для биоанализа IL-6 составлял 1 пг/мл. Статистический анализ. Значимые различия оценивали в соответствии с критерием Манна-Уитни с использованием программы для статистического анализаSigmaStat и программы GraphPad Prism. Результаты Мышиную экспериментальную модель КИА (коллаген-индуцированного артрита) использовали для оценки эффективности IL-18BP в качестве агента для лечения артрита. Введение коллагена и неполного адъюванта Фрейнда мышам DBA/I индуцировало развитие эрозивного воспалительного артрита и было использовано как идеальная возможность для исследования терапевтического потенциала IL-18BP. Для достижения этой цели эндогенный IL-18 нейтрализовали с использованием IL-18BP и оценивали влияние на различные патогенные параметры. Были проведены исследования зависимости от дозы. Три группы мышей DBA/I с коллаген-индуцированным артритом терапевтически обрабатывали (т.е. после начала заболевания) 5 дозами IL-18BP, i.p. (внутрибрюшинно). На первой клинической стадии заболевания вводили IL-18BP при концентрациях 10, 3, 1, 0,5 или 50 0,25 мг/кг. Контрольным мышам инъецировали физиологический раствор (хлорид натрия,NaCl). Помимо этого вводили, i.p., 10000 ME интерферона(IFN-) для оценки эффекта IFN у этих экспериментальных животных с моделью заболевания артритом. Проводили мониторинг его влияния на тяжесть заболевания путем ежедневной визуальной оценки каждой отдельной лапы как описано выше. Мышей умерщвляли на 8-й день после начала эксперимента. Были измерены следующие величины:- визуальные клинические оценки (0-3,5 на лапу) (фиг. 7 А и В),- опухание/отек сустава (в мм, измерено с помощью штангенциркуля) в лапе с первым признаком поражения, при условии, что она была задней лапой (фиг. 8),- число лап, пораженных заболеванием(фиг. 9),- оценка эрозии лапы с первым признаком поражения (деструкция хряща 0-4),- гистопатологический анализ лапы с первым признаком развивающегося артрита,- уровни антител против коллагена типа II,- уровни IL-6. Клиническая оценка тяжести заболевания. Как показано на фиг. 7 А и B, клиническая тяжесть заболевания значительно снижалась у групп мышей, обработанных 1 мг/мл (Р 0,01) и 0,5 мг/мл (0,01 Р 0,05) rhIL-18BP. Мыши, которые получали низкую дозу rhIL-18BP (0,25 мг/кг) или высокую дозу rhIL-18BP (10 мг/кг),имели клиническую оценку, аналогичную оценке, полученной для группы плацебо. Доза в 1 мг/кг IL-18BP была почти такой же эффективной, как и интерферон(обозначенный IFNb на фиг. 7 А). Воспаление суставов и опухание лапы(отек). Макроскопическое воспаление (опухание) исследовали путем измерения отека лапы, начиная с дня 1 после развития заболевания и до дня 8, т.е. окончания эксперимента. Результаты представлены на фиг. 8 А и В. Эффективные дозы IL-18BP составляли 1, 3 и 10 мг/кг. Введение более низких доз не оказывало благоприятного воздействия на опухание лап. Как показано на фиг. 8 А и 8 В, благоприятное воздействие на опухание лапы оказывал интерферон- (IFNb) при концентрации 10000 ME. Микроскопическую оценку синовита проводили по окончании эксперимента на гистопатологических срезах и выражали в баллах("балльные показатели синовита"). Результаты оценок воспаления (опухания) и синовита систематизированы в табл. 5. rhIL-18BP-обработка при дозах 1 и 3 мг/кг приводила к снижению опухлости, однако, обработка любыми дозамиIL-18BP оказывала лишь ограниченное воздействие на воспалительный синовит (табл. 5). 51 Таблица 5 Воздействие IL-18BP-обработки на воспаление суставов Балльный покаОпухание (ППК,затель синовита среднееср.от.) На фиг. 9 показано, что число лап, пораженных заболеванием, снижалось после введения IL-18BP. В частности, терапевтические инъекции IL-18BP при дозах 1 и 0,5 мг/кг снижали число лап, пораженных заболеванием, что указывало на то, что блокирование IL-18 in vivo приводит к прекращению распространения артрита на другие суставы. Обработка 1 и 0,5 мг/кгIL-18BP очевидно может даже приводить к восстановлению некоторых пораженных артритом суставов до их нормального состояния. Защита сустава от разрушения. Обработка мышей rhIL-18BP обеспечивала защиту суставов от деструкции. Полуколичественная система оценки продемонстрировала,что эрозия костей поддается дозо-зависимому протективному воздействию, которое дает значимые результаты при дозах 10 и 3 мг/кг(р 0,05). У мышей, получавших 1 мг/кг rhIL18BP, наблюдалась меньшая эрозия, чем у мышей, получавших только носитель. Какого-либо защитного эффекта при дозах 0,5 и 0,25 мг/кг не наблюдалось. Интересно отметить, что защитное действие на суставы при дозах 3 и 10 мг/кгIL-18BP было сравнимым или даже более выраженным, чем защитное действие 10000 ME интерферона(IFN-). Показана гистология здорового (А) и пораженного (В) сустава по сравнению с суставом животного, обработанного IL-18BP (С). Срезы брали в конце эксперимента от тех лап, на которых были обнаружены первые признаки развития артрита. Сустав, взятый от мышей с артритом, обнаруживал тяжелые деструктивные артритные поражения с уменьшением хрящевой массы, а также с эрозиями и многочисленными клетками воспалительного инфильтрата в пораженном синовиальном слое. В суставе мышей, обработанных rhIL-18BP, наблюдался почти нормальный хрящ, несмотря на присутствие воспалительных клеток в синовиальном пространстве. При этом наблюдаемый хрящ имел не только большую массу, но был также более гладким на вид. Обработка антителами против IL-18 модулирует уровни антител против коллагена типа II. Мыши с КИА имели более высокие уровни антител IgG1 и IgG2a против коллагена типа II в кровотоке. Антитела изотипа IgG1 ассоциированы с ТН 2-опосредованными заболеваниями, а антитела изотипа IgG2a и IgG2b ассоциированы 52 с TH1-опосредованными заболеваниями. Артрит обычно классифицируется как ТН 1 опосредованное заболевание. Антитела изотипов IgG-1 и IgG2a против коллагена типа II (СII) определяли в сыворотке животных, обработанных IL-18BP (фиг. 12). Уровни анти-СII антител изотипов IgG-1 иIgG2a не были значительно модифицированы обработкой IL-18BP на 4-й или 8-й дни (D4, D8) клинического заболевания. Однако через 8 дней после rhIL-18 ВР-обработки наблюдалось 2,6- и 3,4-кратное снижение отношения коллагенспецифических антител IgG1/IgG2a при дозах 1 и 3 мг/кг соответственно. На фиг. 12 проиллюстрирован эксперимент, в котором использовалась доза 3 мг/кг. В основном, те же самые результаты были получены с использованием количества 1 мг/кг IL-18BP. Снижение отношения анти-СII антител IgG1/IgG2a указывало на снижение концентрации антител изотипа IgG2a против коллагена типа II и на повышение концентрации антител изотипа IgG1 против коллагена типа II, что дало основание предположить о тенденции сдвига в сторону ТН 2-опосредованного заболевания в данной модели артрита. Снижение уровней IL-6 после нейтрализации IL-18. Для понимания сущности эффектов блокирования IL-18 измеряли уровни IL-6 в сыворотке животных, обработанных IL-18BP. Показано,что уровни биологически активного IL-6 значительно снижались у животных, подвергаемыхIL-18BP-обработке при всех тестируемых дозах,т.е. при 1, 3 и 10 мг/кг, а также обработке интерфероном(IFNb). Иммуноактивные уровниIL-6, измеренные в сыворотке животных, обработанных 3 мг/кг rhIL-18BP, были значительно снижены (Р 0,0023) по сравнению с уровнями животных, обработанных физиологическим раствором. Уровни IL-6 в сыворотке пораженных животных, обработанных 1, 3 или 10 мг IL-18BP или 10000 ME INF, были аналогичны уровням в сыворотке нормальных мышей (NMS), взятой у здоровых животных, т.е. у животных, не имеющих воспалительного заболевания. Полученные данные продемонстрировали,что IL-18 регулирует уровни IL-6 в начале развития заболевания. Поскольку IL-6 является маркером воспаления, эти данные показали, чтоIL-18BP-обработка пораженных мышей приводила к ослаблению воспаления у этих животных. На основании проведенных выше экспериментов могут быть сделаны следующие выводы:- введение IL-18BP снижает клиническую тяжесть артрита;- IL-18BP ингибирует последующее прогрессирование или распространение данного заболевания;- уровни IL-6 в сыворотке снижаются, а отношения анти-СII антител IgG1/IgG2a снижаются после IL-18 ВР-терапии. Данные, приведенные выше, указывают на то, что нейтрализация биоактивности IL-18 после начала заболевания является антиревматической терапией, ослабляющей заболевание. Полученные результаты ясно продемонстрировали, что блокирование IL-18 приводит к снижению клинического прогрессирования артрита и, что более важно, к прекращению прогрессирования деструкции хряща и костей. Поэтому блокирование IL-18 белком IL-18BP, антителом против IL-18 или любым другим IL-18 блокирующим агентом может рассматриваться как новая антиревматическая терапия, ослабляющая заболевание. Вышеприведенное описание конкретных вариантов осуществления изобретения иллюстрирует общую концепцию настоящего изобретения так, чтобы любые специалисты, опираясь на современные знания, могли легко модифицировать и/или адаптировать различные применения этих конкретных вариантов изобретения, не выходя за рамки основной концепции, а поэтому, такие адаптации и модификации должны входить в объем и серию эквивалентов, описанных вариантов осуществления изобретения. Очевидно, что используемая здесь фразеология или терминология применяется лишь для описания изобретения, а не для его ограничения. Часть III. Примеры 28 и 29, относящиеся к воспалительному заболеванию кишечника. Пример 28. Экспрессия IL-18BP эндотелиальными клетками и макрофагами в процессе активной болезни Крона. Сбор образцов. Биопсию слизистой кишечника брали из образцов, полученных в результате хирургической операции пациентов с болезнью Крона(БК) или язвенным колитом (ЯК). В эксперименте участвовали четырнадцать пациентов с БК (трое мужчин и одиннадцать женщин), при этом, средний возраст пациентов составлял 37,8 лет (от 20 до 78 лет), а средняя продолжительность болезни составляла 8,3 года (от 1 до 21 года). У восьми пациентов поражения локализовались в подвздошной кишке, а у шести пациентов - в толстой кишке. Двенадцать пациентов принимали иммунодепрессанты. Диагноз активной БК делали на основе гистопатологического анализа и в соответствии со следующими критериями: наличие изъязвлений, повышенное число воспалительных клеток и трансмуральное воспаление. Было идентифицировано семь пациентов с активной БК и семь пациентов,имеющих неактивное заболевание. Каких-либо отличий, зависящих от возраста, локализации заболевания, пола, лекарственной терапии и продолжительности заболевания, между паци 003675 54 ентами с активной БК и пациентами с неактивной БК не наблюдалось. Средний возраст 5 пациентов с ЯК (трое мужчин и две женщины) составлял 37,6 лет (от 30 до 44 лет). У всех пациентов заболевание было локализовано в толстой кишке, и все они проходили терапию иммунодепрессантами. Средняя продолжительность заболевания составляла 4 года (от 1 до 9 лет). Контрольные образцы получали от 5 пациентов, подвергшихся хирургической операции по поводу расстройств, не связанных с ВЗК(трое мужчин и две женщины). Средний возраст этой группы составлял 55,2 года (от 24 до 76 лет). У всех пациентов заболевание локализовалось в толстой кишке. Полуколичественный ОТ-ПЦР-анализ на человеческие IL-18 и IL-18BP. Полноразмерную РНК экстрагировали из замороженного биоптата кишечника пациентов с БК, ЯК или контрольных пациентов. Экстракцию РНК осуществляли с использованием тризола (Gibco) в соответствии с инструкциями производителей. Полученные образцы количественно оценивали путем измерения оптической плотности при 260 нМ. Целостность РНК оценивали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. кДНК синтезировали из 1 мкг полноразмерной РНК с использованием системы обратной транскрипции Promega в соответствии с инструкцией производителей. ПЦР-реакции осуществляли в общем объеме 50 мкл в присутствии 1 ед. ДНК-полимеразы AmpliTaq (PerkinElmer, Roche, USA), 2,5 мМ dNTP (Amersham,USA) и 50 пмоль прямого и обратного ПЦРпраймеров. Реакционные смеси инкубировали в термоячейке РТС-200 Peltier Effect Thermal Cycler (MJ Research, USA) при следующих условиях: денатурация - 1 мин при 94 С, отжиг - 1 мин при 55 С и удлинение - 1 мин при 72 С. Было определено оптимальное число циклов для IL18BP, IL-18 и -актина перед насыщением полос (31, 28 и 25 соответственно). На основе опубликованных последовательностей(AF110799, D49950, Х 00351) были сконструированы следующие ПЦР-праймеры: IL-18, обратный: 5'-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3'; прямой: 5'-GССТАGАGGТАТGGСТGТАА-3';AGTCTG-3'; обратный: 5'-актин,GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3'; прямой: 5'-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3'. Для исключения амплификации примесной геномной ДНК, содержащейся в этих образцах,осуществляли ПЦР-реакции в отсутствии кДНК-матрицы. ПЦР-продукты (10 мкл) анализировали с помощью электрофореза на 1%-м агарозном геле в 1 х ТАЕ-буфере. Размер ПЦРпродуктов подтверждали путем сравнения с 1 т.п.н.-лэддером (Gibco) после окрашивания геля. 55 Относительную количественную оценку полос,окрашенных этидийбромидом, осуществляли при УФ-излучении с использованием аналитической программы Kodak Digital Sciences, и эту оценку выражали как отношение гена-мишени(hIL-18BP, hIL-18) к гену "домашнего хозяйства" (h-актин). Генерирование моноклональных антител против hIL-18BP. Мышам BALB/c подкожно инъецировали в четыре конечности, а также внутризатылочно,50 мкг изоформы rhIL-18BP-6his (выделенной и очищенной из клеток яичника китайского хомячка) (Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel) в PBS с адъювантом (эмульсия MPL + TDM,RIBI Immunochem Research, Inc.) на дни 0, 7 и 28. Через четыре дня после 3-й иммунизации выделяли лимфоузлы и гидролизовали 2,4 мкг/мл коллагеназы (коллагеназа IV, Worthington Biochemical Corp.) и 0,1% ДНКазой (Sigma). Затем выделенные клетки подвергали слиянию с клетками миеломы Sp2/0 с использованием ПЭГ 1000 (FLUKA). Эти клетки ресуспендировали вHAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) и распределяли по 96-луночным планшетам при концентрации 5 х 10-4 клеток/мл. Образцы супернатанта от гибридомных культур скринировали на присутствие реактивных антител с помощью прямого скринирующего анализа. Для этого, ELISA-планшеты сенсибилизировали козьими антимышиными антителами F(ab')2(Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland), затем добавляли супернатанты от гибридомных культур с последующим добавлением биотинилированного rhIL-18BP-6his (выделенного и очищенного из клеток COS как описаноE.coli, Serono Pharmaceutical Research Institute,Geneva), и наконец конъюгат стрептавидинпероксидаза хрена (ПХ)(Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland) визуализировали с использованием о-фенилендиамина(OPD) (Sigma). Ненейтрализующие антитела отбирали и субклонировали. В этом исследовании было использовано мышиное моноклональное антитело IgG1, 95-H20. Иммуногистохимические исследования на локализацию IL-18BP-положительных клеток. Образцы тканей быстро замораживали и хранили при -80 С. Получали серийные криосрезы (10 мкм), наносили их на покрытые полиL-лизином предметные стекла Superfrost/Plus(Polylabo, Plan-les-Ouates, Switzerland) и фиксировали в охлажденном льдом ацетоне. Локализацию человеческого белка IL-18BP определяли иммуногистохимическим методом с использованием моноклонального антитела (mAb) 95H20. После кратковременной регидратации вPBS, срезы предварительно инкубировали в течение 30 мин в PBS, содержащем 2% фетальную(BSA) (Sigma, St. Louis, МО, USA). Эндогенную пероксидазную активность блокировали путем погружения предметных стекол в раствор PBS,2% FCS, 1% человеческой сыворотки, 0,5% BSA и 1% перекись водорода (Н 2O2) (Fluka, Switzerland) на 1 ч. После промывки в PBS, срезы инкубировали в течение ночи с супернатантом неразведенной культуры mAb 95-H20. После второй промывки в PBS, срезы инкубировали с биотинилированным козьим антимышиным антителом (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland) (5 мкг/мл) в PBS, содержащем 0,5% BSA, в течение 1 ч. Чувствительность окрашивания возрастала при инкубировании в течение 30 мин с комплексом "авидин/биотинилированная ПХ" (Vectastain EliteABC Kit, Vector Laboratories, CA, USA). Затем предметные стекла промывали PBS и проявляли с использованием раствора 30% H2O2, 3,3 амино-9-этилкарбазола (АЕС) (Sigma), N,Nдиметилформамида (Merck) в ацетатном буфере,рН 5. После контрастного окрашивания гематоксилином (Sigma), срезы покрывали глицерином и покровными стеклами. В качестве контрольного изотипа использовали мышиное антитело IgG1 (R и D-система). Для идентификации клеточной локализации человеческого IL-18 ВР осуществляли двухцветный иммуногистохимический анализ на срезах слизистой кишечника. После 10 минутной регидратации в PBS, срезы предварительно инкубировали в течение 30 мин в PBS,содержащем 2% FCS, 1% человеческую сыворотку и 0,5% BSA. Для определения совместной локализации в эндотелиальных клетках, срезы инкубировали в течение ночи с биотинилированным mAb 95-H20 (20 мкг/мл), смешанным с ФИТЦ-конъюгированным мышиным антителом против человеческого CD31 (1:50) (Pharmingen,CA, USA) в PBS/0,5% BSA. Для определения совместной локализации в макрофагах, срезы инкубировали в течение ночи с биотинилированным mAb 95-H20 (20 мкг/мл), смешанным с ФИТЦ-конъюгированным антителом против человеческого CD68 (1:25) (Dako, Denmark). После промывки в PBS на 1 ч добавляли стрептавидин-техасский красный (Southern Biotechnology Associates, AL, USA). Предметные стекла снова промывали и срезы покрывали мовиолом и покровными стеклами. В качестве контрольного изотипа использовали биотинилированное мышиное антитело IgG1 (Pharmingen), а затем стрептавидин-техасский красный. Клеточная культура. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) (Clonetics Corp., San Diego,CA) культивировали с использованием среды для роста эндотелиальных клеток (EGM), в ко 57 торую были добавлены рекомбинантный человеческий эпидермальный фактор роста (hEGF)(10 нг/мл), гидрокортизон (1 мкг/мл), гентамицин и амфотерицин В (50 мкг/мл), бычий мозговой экстракт (ВВЕ) (3 мг/мл) и 2% фетальной бычьей сыворотки (FCS) (Clonetics Corp., SanDiego, CA) в соответствии с инструкциями производителей. Чашки с тканевыми культурами предварительно покрывали человеческим фибронектином (10 мкг/см 2) (Boehringer, Mannheim). Клетки инкубировали в 5% СO2 инкубаторе с повышенной влажностью и проводили эксперименты с использованием HUVEC при пассаже 3. HUVEC обрабатывали человеческим IL-1 (10 нг/мл), TNF- (10 нг/мл) и IFN(20 нг/мл) (R and D system, Germany) в течение 24 ч. По окончании периода культивирования,клетки собирали, РНК выделяли и подвергали ОТ-ПЦР для анализа мРНК-транскриптов IL18BP и IL-18. Супернатанты собирали и анализировали на экспрессию белков IL-18BP и IL-18 с помощью ELISA. Человеческую моноцитарную клеточную линию ТНР-1 поддерживали в суспензионной культуре в среде RPMI, в которую были добавлены 10% термоинактивированная FCS, Lглутамин (2 мМ), пенициллин-стрептомицин (10 ед./мл) (Gibco BRL, Life Technologies) и меркаптоэтанол (50 мкМ) (Fluka). Эту культуру инкубировали в 5% СО 2-инкубаторе с повышенной влажностью и пассировали каждые 5 дней при 1:10. За три дня перед проведением экспериментов человеческие моноциты дифференцировали при плотности 0,4 х 105 клеток/мл с использованием витамина D3 (80 нМ) (BiomolResearch Laboratories, USA) и оставляли для адгезии. После дифференциации к клеточным культурам добавляли ЛПС (100 нг/мл) (Calbiochem), человеческий IL-1 (10 нг/мл), TNF- (10 нг/мл) и IFN (20 нг/мл). Через 48 ч, супернатанты собирали и анализировали на экспрессию белков IL-18BP и IL-18 с помощью ELISA. Измерения уровней продуцирования IL18BP и IL-18. Присутствие IL-18BP оценивали с помощью анализа ELISA в бесклеточных супернатантах от клеток HUVEC, нестимулированных или стимулированных в течение 24 ч смесью цитокинов (IL-1, TNF, IFN), а также от клеточной линии ТНР-1, нестимулированной или стимулированной в течение 48 ч (ЛПС, IL-1,TNF-, IFN). Для этого планшеты сенсибилизировали в течение ночи иммобилизованным моноклональным антителом (mAb) (клон 657.27 при 0,5 мкг/100 мкл/лунку, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel), направленным противhIL-18BP детектировали с использованием кроличьего поликлонального антитела (разведенного 1/10000), вырабатываемого против rhIL18BP-6his (выделенного и очищенного из клеток 58 яичника китайского хомячка, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel), а затем инкубировали с аффинноочищенным козьим антикроличьим антителом IgG, конъюгированным с пероксидазой хрена (разведенным в отношении 1/20000)(Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland). Это иммобилизующее mAb, а также кроличье поликлональное антитело тестировали с помощью Вестерн-блот-анализа для подтверждения специфичности к IL-18BP. В качестве стандарта использовали рекомбинантный hIL18BP-6his. Чувствительность ELISA составляла 100 пг/мл. Параллельно оценивали уровни IL-18 с использованием набора для ELISA-анализа человеческого IL-18 (MBL, Immunotech). Чувствительность ELISA составляла 12,5 пг/мл. Экспрессия hIL-18BPa-his6 в клетках СНО. Рекомбинантный человеческий IL-18BP(hIL-18BPa-his6-метка) выделяли из клеток яичника китайского хомячка (Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel). Результаты Экспрессия мРНК-транскриптов IL-18BP в кишечных биоптатах. Анализ экспрессии мРНК IL-18BP осуществляли с помощью ОТ-ПЦР на тканевых гомогенатах, полученных из хирургических образцов толстой кишки от пациентов с активным БК, неактивным БК или ЯК и от невоспалительной ткани кишечника. Транскрипты IL-18BP и актина детектировали во всех тестируемых кишечных гомогенатах. Аналогичным образом транскрипты для IL-18 были обнаружены во всех тканевых гомогенатах, т.е. от пациентов с БК,ЯК или не-ВЗК-контролей. Отношение уровней мРНК для IL-18BP или для IL-18 к уровням мРНК контрольного актина продемонстрировали статистически значимое увеличение (как описано ниже) количества транскриптов для обоих IL-18BP и IL-18 в биоптатах, полученных от пациентов с активным БК, по сравнению с биоптатами, полученными от пациентов с неактивным БК, с ЯК и от контрольных пациентов с отсутствием ВЗК. Эти данные показали, что IL18BP подвержен позитивной регуляции в ткани слизистой в процессе активной БК, и это является главным свидетельством того, что уровень экспрессии IL-18BP позволяет четко дифференцировать активную БК от неактивной БК, ЯК и не-ВЗК-контроля. Статистический анализ экспрессии мРНКтранскриптов IL-18BP в кишечных биоптатах. После сбора всех имеющихся данных осуществляли дисперсионный анализ. Результат анализа явно выявил резко отклоняющиеся значения, относящиеся к результатам, полученным для одного из пациентов из группы с активной БК (очень высокое OD-отношение для IL-18, а именно 16252, и очень низкое OD-отношение для IL-18BP, а именно 1058). Это единственная и очень нетипичная пара значений не позволяет подтвердить правильность ANOVA-модели (р 59 величина критерия Шапиро-Уилкса для нормальности остаточных дисперсий 0,0001), а поэтому было принято решение игнорировать эту пару измерений в статистическом анализе. Используемая ANOVA-модель учитывала фактор-группу (контроль, активная БК, неактивная БК и ЯК), белок (IL-18 или IL-18BP) и число пациентов (23 пациента). Имеется значимое различие внутри группы (р-величина 0,0001). Также интересно отметить, что различие в OD-отношениях между IL-18 и IL-18BP является незначимым (р-величина = 0,369). Кроме того, была также проведена корреляция между уровнями экспрессии IL-18 и IL-18BP. Коэффициент корреляции между IL-18 и IL18BP был равен 0,67, что позволяет предположить тесную взаимосвязь между ODотношениями, измеренными для IL-18 и IL18BP. После оценки результатов, касающихся группового эффекта, был использован метод Шеффе для сравнения различных групп. Может быть сделан вывод, что OD-отношение для активного БК значительно выше, чем для контроля (+3280), ЯК (+2590), а особенно для неактивного БК (+4580), как в случае экспрессии IL18BP, так и в случае экспрессии IL-18. Иммуногистохимическая локализация IL18BP в кишечной ткани. Для оценки клеточной экспрессии IL-18BPin situ осуществляли иммуногистохимический анализ на криосрезах, полученных из кишечных тканей от пациентов с активным БК и от неВЗК-контролей, с использованием моноклональных антител против hIL-18 ВР. IL-18 ВРположительные клетки детектировали в собственной пластинке слизистой (lamina propria), в подслизистом слое и в мышечном слое (данные не приводятся). Позитивно окрашенные мононуклеарные клетки, присутствующие в собственной пластинке слизистой и в подслизистом слое, имели избыточную цитоплазму, везикулярное сетеобразное ядро и морфологически соответствовали тканевым макрофагам. В мышечном слое позитивно окрашенные клетки имели избыточную цитоплазму с несколькими открытыми просветами в середине, что позволяет предположить о позитивном окрашивании микрососудов, и эти клетки морфологически соответствовали эндотелиальным клеткам. Крупные сосуды также специфически окрашивались моноклональными антителами противhIL-18BP. Значительное увеличение положительно окрашенных клеток, наблюдаемое в образцах, полученных от пациентов с активным БК, по сравнению с образцами, полученными от контрольных пациентов с отсутствием ВЗК,коррелировало с повышенным уровнем экспрессии IL-18BP, наблюдаемым в ОТ-ПЦРанализе. Смежные срезы инкубировали с соответствующим мышиным контрольным изотипом.IL-18 ВР-позитивные клетки, присутствующие в воспалительных тканях кишечника,были идентифицированы с использованием специфических маркеров макрофагов (антиСD68 антитела) и эндотелиальных клеток (антиСD31 антитела) (данные не приводятся). СD68 положительные клетки (зеленая окраска) и IL18 ВР-положительные клетки (красная окраска) были обнаружены в собственной пластинке слизистой и в подслизистом слое кишечных тканей от пациентов с активной БК (данные не приводятся). СD31-положительные клетки (зеленая окраска) и IL-18 ВР-положительные клетки(красная окраска) были обнаружены в подслизистом слое. Для подтверждения того факта, что макрофаги и эндотелиальные клетки были также IL-18BP-положительными, клетки обоих цветов, зеленого от анти-СD68 антитела или анти-СD31 антитела и красного от анти-IL-18BP антитела анализировали вместе, в результате чего было продемонстрировано, что все клетки,которые связываются с антителами против IL18BP, были либо СD68-положительными, либоCD31-положительными (оранжево-желтая окраска). Двойное иммуномечение продемонстрировало, что эти макрофаги и эндотелиальные клетки являются главным источником окрашивания IL-18BP в воспалительных тканях, полученных от пациентов с БК. Экспрессия мРНК и белка IL-18BP эндотелиальными клетками. Для исследования способности человеческих эндотелиальных клеток продуцировать IL18BP, а также для подтверждения результата,полученного посредством иммуноокрашивания и реакции ОТ-ПЦР на всех биоптатах, осуществляли дополнительные эксперименты с помощью реакции ОТ-ПЦР на эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC). Эндотелиальные клетки обрабатывали смесью цитокинов (hIL-1, hTNF-, hIFN) и через 24 ч собирали для экстракции РНК и ПЦР-анализа. Отношение уровней мРНК для IL-18BP к уровням мРНК для контрольного актина продемонстрировало увеличение количества транскриптов IL18BP в обработанных клетках по сравнению с нестимулированными клетками, через 24 ч. Кроме того, очевидно, что мРНК IL-18BP конститутивно экспрессируется в эндотелиальных клетках. Был также проанализирован уровень мРНК IL-18 и было продемонстрировано его небольшое увеличение в обработанных клетках. Однако мРНК IL-18 не экспрессировался в нестимулированных эндотелиальных клетках.ELISA-анализ супернатантов культуры нестимулированных клеток (среда) и клеток
МПК / Метки
МПК: C07K 14/54
Метки: получение, белки, интерлейкин-18, связывающие, применение
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-3675-belki-svyazyvayushhie-interlejjkin-18-ih-poluchenie-i-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Белки, связывающие интерлейкин-18, их получение и применение</a>
Клеточная везикула, называемая “экзосома”, ее получение и применение для стимуляции иммунного ответа
Номер патента: 2827
Опубликовано: 31.10.2002
Авторы: Рапосо Граса, Зитвожель Лоранс, Реньо Армелль, Амигорена Себасьян
МПК: C12N 5/08, A61K 39/00
Метки: везикула, называемая, экзосома, стимуляции, клеточная, иммунного, ответа, получение, применение
Формула / Реферат:
1. Мембранная везикула, называемая декзосомой, выделенная из своего естественного окружения, отличающаяся тем, что она (i) происходит от дендритной клетки, (ii) включает билипидный слой, окружающий цитозольную часть, (iii) имеет на своей поверхности молекулы класса I и/или II главного комплекса гистосовместимости (СМН), (iv) содержит одну или несколько молекул CD63 и (v) имеет диаметр примерно от 60 до 90 нм. 2. Везикула по п.1, отличающаяся...
Поли /9,9′ -спиробисфторены/, их получение и применение.
Номер патента: 1312
Опубликовано: 26.02.2001
Авторы: Вернет Волфганг, Ритц Ральф-Роман
МПК: C07C 25/22, C08G 61/00, H05B 33/14...
Метки: поли, получение, 9,9, применение
Формула / Реферат:
1. Поли(бис-9,9'-фторены) с одинаковыми или разными повторяющимися структурными элементами формулы I где оба R1 независимо друг от друга представляют Н, C1-C18-алкил, C6-C14-арил, С7-С15-аралкил, C1-C18-алкоксил, R2-(O-CnH2n)m-O-, C1-C18-алкилтио, C1-C18-диалкиламино, -С(О)ОН, -С(O)O-C1-C18-алкил, -С(О)-N(C1-C18-aлкил)2, -SО3Н, -SО3-C1-C18-алкил, -SO2-N(C1-C18-алкил)2, C1-C17-алкил-С(O)-O- или C1-C17-алкил-С(O)-, R2 обозначает Н или...
Производные 2,3-диарил-пиразоло[1,5-b]пиридазинов, их получение и их применение в качестве ингибиторов циклооксигеназы 2 (цог-2)
Номер патента: 2775
Опубликовано: 29.08.2002
Авторы: Нейлор Алан, Кемпбелл Айан, Мэтьюз Нил, Бесуик Пол Джон
МПК: A61P 29/00, A61K 31/5025, C07D 487/04...
Метки: качестве, цог-2, циклооксигеназы-2, получение, 2,3-диарил-пиразоло[1,5-b]пиридазинов, применение, производные, ингибиторов
Формула / Реферат:
1. Соединения формулы (I) и их фармацевтически приемлемые производные, в которых R0 представляет собой галоген, C1-6алкил, С1-6алкоксигруппу, C1-6алкоксигруппу, замещенную одним или более чем одним атомом фтора, или O(CH2)nNR4R5; R1 и R2 независимо выбраны из Н, С1-6алкила, C1-6алкила, замещенного одним или более чем одним атомом фтора, C1-6алкоксигруппы, C1-6гидроксиалкила, SC1-6алкила, С(O)Н, С(O)С1-6алкила, C1-6алкилсульфонила,...
Замещенные индолиноны, их получение и их применение в качестве лекарственных средств
Номер патента: 3514
Опубликовано: 26.06.2003
Авторы: Редеманн Норберт, Хеккель Армин, Грелль Вольфганг, Вальтер Райнер, Ван Меель Якобус С.А.
МПК: A61K 31/4045, A61P 35/00, C07D 209/34...
Метки: получение, индолиноны, средств, лекарственных, применение, замещенные, качестве
Формула / Реферат:
1. Замещенные индолиноны общей формулы в которой X обозначает атом кислорода или серы, R1 обозначает атом водорода, C1-C4алкоксикарбонильную или C2-C4алканоильную группу, R2 обозначает карбокси- или C1-C4алкоксикарбонильную группу либо необязательно замещенную одной или двумя C1-C3алкильными группами аминокарбонильную группу, при этом заместители могут быть идентичными или разными, R3 обозначает атом водорода или C1-C6алкильную группу,...
Бициклические антагонисты тахикининов, их получение и применение в фармацевтической композиции
Номер патента: 697
Опубликовано: 28.02.2000
Авторы: Аркамоне Федерико, Джаннотти Данило, Куартара Лаура, Маджи Карло Альберто
МПК: C07K 7/22, A61K 38/12
Метки: композиции, бициклические, тахикининов, антагонисты, применение, фармацевтической, получение
Формула / Реферат:
1. Бициклические соединения общей формулы где X1, Х2, Х3, Х4, Х5 и Х6, одинаковые или различные, представляют собой группу -NR'CO- или -CONR'-, где R' является Н или C1-3-алкилом; Y представляет собой группу, выбранную из -NRCO-, -CONR- или -SS-, где R является Н или C1-3-алкилом; по меньшей мере, одна из групп R1, R2, R3 и R4, одинаковых или различных, является гидрофильной, а остальные группы являются гидрофобными; m и n, одинаковые...
Предыдущий патент: Биспиперидины в качестве противотромботических агентов, их применение, способ их получения (варианты), промежуточные продукты и терапевтическая композиция
Следующий патент: Гербицидная смесь, содержащая замещенное 3-гетероциклилом производное бензоила и вспомогательный агент
Случайный патент: Способ и устройство для прокладки и ремонта изолированного трубопровода