Cash (гомолог каспазы) с “гибель-эффекторным” доменом, модуляторы функций fas-рецепторов

1 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение в целом касается области науки, изучающей рецепторы, относящиеся к суперсемейству TNF/NGF-рецепторов,и контроль за их биологическими функциями. Суперсемейство TNF/NGF-рецепторов включает такие рецепторы как рецептор факторов некроза опухолей р 55 и р 75 (т.н. "TNF-R", также обозначаемые, соответственно, как CD120a иCD120b: в данном тексте они будут обозначаться как p55-R и p75-R) и рецепторы FASлигандов (также обозначаемые как FAS/AP01 или FAS-R, или CD95, а в данном тексте они будут обозначаться как FAS-R) и другие. Конкретнее, настоящее изобретение касается новых белков, которые связываются с другими белками, которые сами связываются с белком MORT1 (или FADD), они также называются MORT-1 связывающимися белками, или касается белков,которые напрямую связываются с белкомMORT-1, а конкретнее изобретение касается одного такого белка, обозначенного здесь какG1 (также обозначается как "CASH" для "гомолога каспазы", но далее будет называться как"G1"), который связывается с MORT1 связывающимся белком Mch4 (также обозначаемым/называемым как CASP-10) и, повидимому, связывается с другим MORT1 связывающимся, называемым МАСН (также обозначаемым/называемым как CASP-8), и, вероятно, сам связывается с MORT-1 напрямую. Соответственно настоящее изобретение, в принципе, касается новых белков, которые способны модулировать или опосредовать функцииMORT-1 напрямую или косвенно или других белков, связывающихся с MORT-1 напрямую или ненапрямую. В частности, настоящее изобретение касается белка G1, его получения и его использования, а также некоторых новых изоформ G1, их получения и использования. Предпосылки для изобретения в соответствующей области техники Фактор некроза опухолей (TNF-) и лимфотоксин (TNF-) (далее аббревиатура TNF будет относится и к TNF- и к TNF-) являются многофункциональными провоспалительными цитокинами, образуемыми в основном моноядерными фагоцитирующими клетками, обладающими разнообразными эффектами на клетки(Wallach, 1986, In "Interferon 7", ed. by I. Gresser,Acad. Press, London, pp. 83-122; и BeutlerCerami, 1987). И TNF-, и TNF- проявляют свою активность путeм связывания со специфическими поверхностно-клеточными рецепторами. Некоторые из их проявлений являются, вероятно, для организма позитивными: например, они могут разрушать опухолевые клетки или клетки,заражeнные вирусами, и обусловливать противобактериальную активность гранулоцитов. В этом случае TNF являются факторами защиты 2 организма против опухолей и инфекционных агентов и участвуют в заживлении ран. Таким образом, TNF могут быть использованы в качестве противоопухолевого средства, при применении которого оно связывается со своими рецепторами на поверхности опухолевых клеток и таким образом инициирует события, приводящие к гибели опухолевых клеток. Также TNF могут быть использованы в качестве противоинфекционных агентов. Однако и TNF-, и TNF- также обладают отрицательными проявлениями. Существуют доказательства того, что избыточная выработкаTNF- может играть основную патогенетическую роль в развитии некоторых заболеваний. Например, действие TNF-, в первую очередь,на сосудистую систему известно как главная причина развития симптомов септического шока (Tracey et аl., 1986). При некоторых заболеваниях TNF может обусловливать существенную потерю веса (кахексию) путем подавления активности адипоцитов, приводя к анорексии, что привело к обозначению TNF- как кахетина. Также было описано, что TNF- является медиатором повреждений тканей при ревматических заболеваниях (BeutlerCerami, 1987) и основным медиатором повреждений, наблюдающихся при синдроме "трансплантат против хозяина" (Piquet et al., 1987). Кроме того, TNF известен как участник воспалительного процесса и многих других заболеваний. Два отчeтливо различающихся и независимо экспрессируемых рецептора - р 55 и р 75TNF-R - которые специфически связывают иTNF-, и TNF-, инициируют и (или) опосредуют описанные выше биологические проявления TNF. Эти два рецептора включают разные по структуре внутриклеточные домены, что указывает на различие их сигнальной активностиSchall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al.,1990; и Heller et al., 1990). Однако пока точно не установлены клеточные механизмы, по которым действуют, например, различные белки и, повидимому, другие факторы, вовлечнные во внутриклеточную передачу сигналов, на рецепторы р 55 и р 75 TNF-R. При этом существует внутриклеточный сигнальный путь, который активен обычно после связывания рецепторов своего лиганда, т.е. TNF ( или ), и который ассоциирован с запуском каскада реакций, в конечном счете, приводящих к наблюдаемому ответу клеток на TNF. С точки зрения обозначенного выше цитотоксического действия TNF в большинстве изученных к настоящему времени типов клеток данное проявление опосредуется в основном рецептором р 55 TNF-R. Антитела к внеклеточным доменам (т.е. доменам связывания лиганда) рецептора р 55 TNF-R сами могут опосредовать 3 цитотоксическое действие (см. ЕР 412486), что коррелирует с эффективностью перекрестного сшивания рецептора с антителами, что рассматривается как первый этап в запуске внутриклеточного сигнального механизма. Далее, мутационный анализ (Brakebusch et al., 1992; Tartagliaet al., 1993) показал, что биологические функции р 55 TNF-R зависят от сборки его внутриклеточного домена: соответственно, было подтверждено, что запуск внутриклеточного сигнального механизма, приводящего к цитотоксическому действию TNF, является следствием связывания двух или большего числа внутриклеточных доменов р 55 TNF-R. Более того, TNF ( и ) является гомотримером, а раз так, то было подтверждено, что индукция внутриклеточного сигнального механизма через р 55 TNF-R происходит благодаря его способности связываться и образовывать поперечные сшивки с молекулами рецепторов, т.е. образовывать агрегации рецепторов. Другим членом суперсемейства TNF/NGFрецепторов является FAS-рецептор (FAS-R),который также называют FAS-антигеном: это поверхностно-клеточный белок, экспрессируемый в различных тканях и проявляющий сходство с рядом других поверхностно-клеточных рецепторов, включая TNF-R и NGF-R. РецепторFAS-R опосредует гибель клеток по типу апоптоза (Itoh et al., 1991) и, по-видимому, работает как негативный селектор автореактивных Тлимфоцитов, т.е. в ходе созревания Тлимфоцитов FAS-R опосредует апоптотическую гибель Т-клеток, распознающих собственные антигены. Также lpr было установлено, что мутации в гене FAS-R (мутации lpr) обусловливают лимфопролиферативное расстройство у мышей, которое напоминает системную красную волчанку, являющуюся аутоиммунным заболеванием человека (Watanabe-Fukunaga et al.,1992). Лигандом для рецептора FAS-R предположительно является ассоциируемая с клеточной поверхностью молекула, которую несут,помимо других типов клеток. Т-киллеры (или цитотоксические Т-лимфоциты - CTL), соответственно, когда такие CTL контактируют с клетками, несущими FAS-R, они способны индуцировать апоптотическую гибель клеток, несущихFAS-R. Кроме того, было сформировано моноклональное антитело, являющееся специфичным в отношении FAS-R, это моноклональное антитело способно индуцировать гибель несущих FAS-R клеток по типу апоптоза, включая мышиные клетки, трансформированные внесением кДНК, кодирующей FAS-R человека (Itohet al., 1991). При том, что цитотоксическое действие лимфоцитов опосредуется взаимодействием вырабатываемого лимфоцитами лиганда с широко распространенным поверхностно-клеточным рецептором FAS-R (CD95), который обладает способностью запускать механизм гибели 4 клеток, также было установлено, что различные другие нормальные клетки, помимо Тлимфоцитов, экспрессируют FAS-R на своей поверхности и могут быть убиты опосредованно действием этого рецептора. Предполагается, что неконтролируемая индукция такой гибели является фактором тканевых повреждений при определенных заболеваниях, например, разрушения клеток печени при остром гепатите. Соответственно, обнаружение путей сдерживания цитотоксической активности FAS-R может иметь терапевтическое значение. С другой стороны, поскольку было также обнаружено, что некоторые клетки злокачественных опухолей и клетки, зараженные ВИЧ,несут FAS-R на своей поверхности, то антитела к FAS-R или лиганду FAS-R могут быть использованы для контроля опосредуемого FAS-R цитотоксического действия на такие клетки и тем самым служить способом борьбы с клетками злокачественных опухолей или клетками, зараженными ВИЧ (см. Itoh et аl., 1991). Нахождение каких-либо ещ путей усиления цитотоксической активности FAS-R также может иметь терапевтическое значение. Очевидно, имеет место насущная необходимость разработки способа модулирования клеточных ответов на TNF ( или ) и лигандFAS-R. Например, при описанных выше патологиях, когда наблюдается сверхэкспрессия TNF или лиганда FAS-R, желательным становится подавление цитотоксического действия, индуцируемого TNF или лигандом FAS-R, в то время как при других ситуациях, например, при заживлении повреждений, желательным оказывается усиление действия TNF, или в случае сFAS-R в отношении опухолевых или ВИЧзараженных клеток желательным является усиление эффекта, вызываемого FAS-R. Заявителями был предложен ряд соответствующих подходов (см., например, заявки на европейские патентыЕР-186833, ЕР 308378, ЕР-398327 и ЕР-412486), направленных на контроль отрицательного действия TNF путeм подавления связывания TNF на их рецепторах с использованием антител к TNF или с использованием растворимых рецепторов TNF(т.е. достаточных для растворения внеклеточных доменов таких рецепторов) с целью создания конкуренции за связывание TNF на рецепторах TNF-R, расположенных на клеточных поверхностях. Кроме того, на основании того,что связывание TNF с их рецепторами является необходимым для проявления соответствующих индуцируемых эффектов TNF, заявители предлагали подходы (см., например, ЕРО-568925),направленные на модулирование действия TNF путeм изменения активности рецепторов TNF-R. Вкратце, заявка ЕРО-568925 касается способа модулирования передачи сигнала и (или) расщепления TNF-R таким образом, чтобы пептиды или иные молекулы могли взаимодейство 5 вать либо с самим рецептором, либо с эффекторными белками, взаимодействующими с этим рецептором, в результате чего обеспечивается модуляция нормальной функции TNF-R. В заявке ЕРО-568925 описана конструкция и дана характеристика различных мутантных форм р 55TNF-R, имеющих мутации в составе внеклеточного, трансмембранного и внутриклеточного доменов р 55 TNF-R. В этом случае были идентифицированы участки этих доменов в составе р 55 TNF-R, являющиеся ключевыми с точки зрения обеспечения функций рецептора, т.е. связывания своего лиганда (TNF) и последующей передачи сигнала и запуска внутриклеточного сигнального механизма, которые, в конечном счете, и приводят к наблюдаемым проявлениям действия TNF на клетки. Кроме того, также описан ряд подходов к выделению и идентификации белков, пептидов или иных факторов,которые способны связываться с различными участками вышеуказанных доменов TNF-R,белки, пептиды и иные факторы которых могут быть вовлечены в регуляцию или модулирование активности рецептора TNF-R. Также в заявке ЕРО-568925 представлен ряд подходов к выделению и клонированию последовательностей ДНК, кодирующих такие белки и пептиды, для конструирования экспрессирующих векторов,предназначенных для выработки таких белков и пептидов, и к получению антител или их фрагментов, взаимодействующих с TNF-R или с вышеозначенными белками и пептидами, которые связываются с различными сегментамиTNF-R. Однако заявка ЕРО-568925 не уточняет параметры белков и пептидов, действующих в отношении связывания с внутриклеточным доменом рецепторов TNF-R (например, р 55 TNFR), и не описывает "дигибридный дрожжевой подход" для выделения и идентификации таких белков или пептидов, которые связываются с внутриклеточными доменами рецепторов TNFR. Также в заявке ЕРО-568925 нет описания белков или пептидов, способных связываться с внутриклеточным доменом рецептора FAS-R. Таким образом, если желательным является подавление действия TNF или лиганда FASR, то должно быть желательным уменьшить количество или уровень активности TNF-R илиFAS-R на поверхности клеток, в то время как увеличение количества или уровня активностиTNF-R или FAS-R должно быть желательным тогда, когда подразумевается усиление действияTNF или лиганда FAS-R. В связи с этим были секвенированы и проанализированы промоторы генов, кодирующих и р 55 TNF-R, и р 75 TNF-R,и были выявлены некоторые ключевые мотивы последовательностей, для которых была установлена специфичность по отношению к различным транскрипционным факторам: это значит, что экспрессия этих рецепторов TNF-R может контролироваться на уровне соответствующих промоторов, т.е. подавление транскрипции 6 с промотора приводит к уменьшению количества этих рецепторов, а усиление транскрипции с этих промоторов - к увеличению количества этих рецепторов (ЕР-606869 и WO 95/31206). Также еще не имеется сообщений об исследовании регуляции FAS-R на уровне промотора гена, кодирующего этот рецептор. Хотя и известно, что рецепторы факторов некроза опухолей (TNF) и структурно сходный рецептор FAS-R в ответ на стимуляцию вырабатываемыми лейкоцитами лигандами опосредуют деструктивную активность в пределах клеток, приводящую к их собственной гибели, механизмы такого опосредованного влияния пока окончательно не ясны. Анализ мутаций указывает на то, что FAS-R и рецептор р 55 TNF (p55R) вовлекают разные участки своих внутриклеточных доменов в сигнальные механизмы цитотоксичности (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et(т.н. "гибель-домены", или "гибель-эффекторные домены", или "DED") характеризуются сходством аминокислотных последовательностей. "Гибель-домены" в составе FAS-R и p55-R проявляют тенденцию к самосвязыванию. Такое их самосвязывание предположительно способствует образованию агрегаций рецепторов, необходимых для инициации сигнальных механизмов (см Song et al., 1994; Wallach et al., 1994;Boldin et al., 1995), а высокий уровень интенсивности экспрессии рецепторов может приводить к опосредованию независимых от лигандов сигнальных механизмов (Boldin et al., 1995). Некоторые проявления цитотоксичности у лимфоцитов опосредуются взаимодействием вырабатываемого лимфоцитом лиганда с рецептором FAS-R (CD95) - широко распространeнным поверхностно-клеточным рецептором,который обладает способностью опосредовать гибель клеток (также см. NagataGolstein,1995), и эта гибель клеток моноядерными фагоцитами вовлекает комплекс "лиганд-рецептор" в составе TNF и его рецептора p55-R (CD120), что структурно сходно с комплексом рецептораTNF и FAS-R происходит путeм серии межбелковых взаимодействий, начинающихся со связывания белка лиганда и рецептора с возможной активацией ферментных эффекторных функций,которые в анализируемом случае определяют неферментные межбелковые взаимодействия,инициирующие сигнал о гибели клеток: связывание тримерных TNF или молекул лигандов рецептора FAS-R с их рецепторами, происходящее в результате взаимодействие их внутриклеточных доменов (Brakebusch et al., 1992;Tartaglia et al., 1993; ItohNagata, 1993), определяемое свойством "гибель-доменов" (или "гибель-эффекторных доменов", DED) самосвязы 7 ваться (Boldin et al., 1995a), и индукция связывания двух цитоплазматических белков (которые также могут связываться друг с другом) с внутриклеточными доменами рецепторов - белка MORT-1 (или FADD) с FAS-R (Boldin et al.,1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al.,1995) и белка TRADD с p55-R (Hsu et al., 1995;Hsu et al., 1996). Три белка, которые связываются с внутриклеточным доменом FAS-R и p55-R по их "гибель-домену", вовлечнные в индукцию клеточной гибели рецепторами через образование гетеросвязанных гомологичных сегментов и также способные независимо опосредовать клеточную гибель независимо друг от друга, были идентифицированы с применением процедуры дигибридного дрожжевого скрининга. Один из этих белков - MORT-1 (Boldin et al.,1995b), также известный как FADD (Chinnaiyanet al., 1995) специфически связывается с FAS-R. Другой такой белок - TRADD (также см. Hsu etal., 1995, 1996) - связывается с p55-R, а третий такой белок - RIP (также см. Stanger et al., 1995)- связывается и с FAS-R, и с p55-R. Помимо того, что они связываются с FAS-R и p55-R, эти белки также способны связываться друг с другом, что может обусловливать функциональный механизм "перекрестного обмена информацией" между рецепторами FAS-R и p55-R. Такие связывания происходят с участием консервативного сегмента последовательности, т.н. "модуля гибель-домена" (также обозначаемого как"DED" по "Death Effector Domain" - "гибельэффекторный домен"), обычного для рецепторов и связывающихся с ними белков. Более того, хотя в дигибридном дрожжевом тесте белокMORT-1 проявлял спонтанную связываемость на FAS-R, в клетках млекопитающих такое связывание имело место только после стимуляции рецептора: это подтверждает, что MORT-1 участвует в процессе инициации сигнального механизма FAS-R. Белок MORT-1 не содержит какого-либо мотива в своей аминокислотной последовательности, характерного для проявления каталитической активности: т.е. его способность опосредовать гибель клеток предположительно не основана на активности самого MORT-1, а,скорее всего, обусловливается активацией некоторых других белков (белка), которые связывают MORT-1 и действуют далее вниз по сигнальному каскаду. Экспрессия в клетках мутантных вариантов MORT-1, утративших N-концевую часть молекулы, как было показано, блокирует цитотоксичность, индуцируемую FAS/AP01et al., 1996): это указывает на то, что этот Nконцевой сегмент передат сигнал о гибели клеток от обоих рецепторов через межбелковые взаимодействия. Недавние исследования выявили группы цитоплазматических тиоловых протеаз, которые проявляют структурное сходство с протеазойditis elegans и с конвертазой ICE интерлейкинаl человека в связи с различными физиологическими параметрами процессов гибели клеток(см. обзоры Kumar, 1995 и Henkart, 1996). Также имеется ряд указаний на то, что протеазы (протеаза) этого семейства могут участвовать в проявлении цитотоксичности клеток, индуцируемой с участием рецепторов FAS-R и TNF-R. Для специфических пептидных ингибиторов протеаз и двух белков-блокираторов их функций, кодируемых вирусами - белка вируса коровьей оспыcrmA и бакуловирусного белка р 35 - было показано обеспечение защиты клеток от проявления цитотоксичности (Enari et al., 1995; Los et al.,1995; Tewari et al., 1995; Xue et al., 1995; Beidleret al., 1995). Быстрое расщепление некоторых специфических клеточных белков предположительно действием протеаз семейства CED3/ICE может быть продемонстрировано в клетках вскоре после стимуляции рецепторов FAS-R или TNF-R. Необходимо заметить, что эти протеазы семейства CED3/ICE, также называемые каспазами, вырабатываются в виде неактивных предшественников и активируются путeм протеолитического расщепления в ходе индукции гибели клеток. Эти каспазы являются консервативными цистеиновыми протеазами, которые расщепляют специфические клеточные белки ниже от остатков аспарагиновой кислоты и, соответственно, играют ключевую роль во всех известных к настоящему времени процессах запрограммированной гибели клеток. Помимо их гомологичных С-концевых участков, из состава которых образуются зрелые формы протеаз, белки-предшественники включают уникальные N-концевые сегменты. Взаимодействия этих "продоменов" со специфическими регуляторными молекулами обеспечивает дифференцированную активацию различных каспаз с участием различных сигналов индукции гибели клеток (Boldin et al., 1996; Muzio et al., 1996;Ahmad et al., 1997). Недавно была выделена, клонирована и охарактеризована одна такая протеаза и е различные изоформы (включая ингибиторные формы), обозначенная МАСН (также обозначается CASP-8), которая является MORT1 связывающимся белком и которая служит модулятором MORT-1 и, соответственно, FAS-R иp55-R, и которая также может быть действовать независимо от MORT-1; также было описано возможное использование данной протеазы, в частности, в приведнных в подробном списке цитируемых материалов совместных, одновременно ожидающих решения заявок на израильский патент 114615, 114986, 115319,116588 и 117932, а также в соответствующем РСТ -PCT/US 96/10521, равно как и в недавней публикации заявителей (Boldin et al., 1996). Другая такая протеаза, включая е изоформыMch4 (также обозначаемая CASP-10), также недавно была выделена и охарактеризована заявителями настоящего изобретения (неопубликованные материалы) и другими исследователями(Fernandes-Alnemri et al., 1996; Srinivasula et al.,1996). Этот белок Mch4 также является MORTlсвязывающимся белком, который служит для модуляции активности MORT-1 и, соответственно, по-видимому, как модулятор FAS-R иp55-R, и который также может действовать независимо от MORT-1. Таким образом, подробности, касающиеся всех аспектов свойств, характеристик и путей использования Mch4 представлены в вышеназванных публикациях, которые полностью включены в список цитирования настоящего изобретения. Также нужно отметить, что каспазы МАСН (CASP-8) и Mch4 (CASP-10), которые включают сходные "продомены" (см. Boldin etal., 1996; VincentDixit, 1997), взаимодействуОбычное наименование или наименование, под которым описан впервые Рецептор p55TNF Рецептор p75TNF Рецептор FAS 10 ют с помощью своих "продоменов" с MORT-1: это взаимодействие опосредуется мотивом гибель-домена" или "гибель-эффекторными доменами" (DED), находящимися в N-концевой части MORT-1 и имеющимися в дуплицированном виде в составе МАСН (CASP-8) и Mch4 (CASP10) (см. Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al.,1995). Также заслуживает упоминания то, что, с точки зрения сказанного выше, различные белки, ферменты и рецепторы, вовлечнные во внутриклеточные сигнальные процессы, приводящие к гибели клеток, получали неодинаковые наименования. Для преодоления возможных неточностей предлагается нижеследующий список разных наименований, включая новые наименования, принимаемые в связи с новыми стандартами, для каждого из данных белков или их составляющих, а также даны наименования,принятые к использованию в настоящем тексте с учетом соответствующего удобства. Резюме изобретения Объектом настоящего изобретения является представление новых белков, включая все их изоформы, аналоги, фрагменты или производные, которые способны связываться с MORT1 связывающимися белками, такими как, например, вышеназванные белки Mch4 и МАСН и их изоформы, или способны связываться с самимMORT-1. С учтом того, что сам белок MORT-1 связывается с внутриклеточным доменом рецептора FAS-R, новые белки по настоящему изобретению благодаря связыванию с MORT1 связывающимися белками и, соответственно,косвенно с MORT-1, или благодаря прямому связыванию с белком MORT-1, способны тем самым подавлять внутриклеточные сигнальные механизмы, инициированные связыванием FASлиганда на его рецепторе: т.е. таким образом новые белки по настоящему изобретению являются модуляторами опосредованного FAS-R влияния на клетки. Белок MORT-1 также вовлечн в модулирование влияния TNF на клетки через его участие в модуляции p55-R: соответственно, новые белки по настоящему изобретению также рассматриваются как модуляторы влияния TNF на клетки, осуществляемого через рецептор p55-R. Также, по аналогии с охарактеризованным выше модулированием влияния на клетки, опосредуемого рецепторами FAS-R иp55-R, белки по настоящему изобретению также могут быть медиаторами или модуляторами других цитотоксических медиаторов или индукторов путем действия на общие или сопряжнные внутриклеточные сигнальные механизмы, в которых участвую Т белки по настоящему изобретению - например, G1 и его изоформы. Эти новые белки по настоящему изобретению обозначены белками "G1" и, как отмечалось выше,включают собственно белок G1 (рассмотренный 11 ниже), все его изоформы, аналоги, фрагменты и производные. Другим объектом изобретения является представление антагонистов (например, антител, пептидов, органических соединений или даже некоторых изоформ вышеуказанных новых белков G1, их изоформ, аналогов, фрагментов и производных, которые могут быть использованы для подавления сигнального механизма или, более конкретно, проявление цитотоксичности, если это является желательным. Дальнейшим объектом настоящего изобретения является использование вышеназванных новых белков G1, их изоформ, аналогов, фрагментов и производных с целью выделения и охарактеризования дополнительных белков или факторов, которые могут быть вовлечены в регуляцию активности рецепторов, например,других протеаз, которые расщепляют новые белки с превращением их в биологически активные, и(или) с целью выделения и идентификации других рецепторов, расположенных до начала сигнальных процессов, связывающих эти новые белки, их аналоги, фрагменты и производные (например, другие FAS-R или родственные рецепторы), в функционирование которых,соответственно, они также вовлекаются. Ещ одним объектом настоящего изобретения является представление ингибиторов, которые могут быть внесены в клетки с целью связывания или взаимодействия с белком G1 и возможными изоформами G1, обладающими протеазной активностью (белок G1 включает участок, гомологичный протеолитическим сегментам Mch4 и МАСН), и ингибирования их внутриклеточной активности, которая, по крайней мере, для некоторых изоформ G1, является протеолитической активностью. Кроме того, объектом настоящего изобретения является использование вышеназванных новых белков G1, их изоформ, аналогов, фрагментов и производных в качестве антигенов для приготовления поликлональных и(или) моноклональных антител к ним. Со своей стороны эти антитела могут быть использованы, например, для очистки новых белков из различных источников, таких как клеточные экстракты или трансформированные клеточные линии. Далее, эти антитела могут быть использованы для целей диагностики, например, для идентификации расстройств, связанных с аномальным функционированием клеточных процессов, опосредованных FAS-R или другими родственными рецепторами. Другим объектом настоящего изобретения является представление фармацевтических композиций, включающих вышеназванные белкиG1, их изоформы или аналоги, фрагменты или производные, равно как и фармацевтические композиции, включающие вышеназванные антитела или другие антагонисты. 12 В соответствии с настоящим изобретением выделен новый белок G1, который способен связываться или взаимодействовать с Mch4,который сам связывается с MORT-1, который, в свою очередь, связывается со внутриклеточным доменом FAS-R. Также G1 может взаимодействовать с другим MORT1-связывающимся белком, называемым МАСН, и также может быть способен связываться или взаимодействовать напрямую с MORT-1. Белок G1, по-видимому,функционирует как модуляторный фактор механизма гибели клеток, инициируемого связыванием FAS-лиганда на рецепторе FAS-R на поверхности клеток, что, по-видимому, обеспечивается наличием у него протеолитического сегмента, сходного с протеолитическими сегментами Mch4 и МАСН, соответственно белокG1 также может быть активной внутриклеточной протеазой. Далее, в зависимости от процессов транскрипции и трансляции в ходе экспрессии G1, особенно по его протеолитическому сегменту, некоторые изоформы G1 могут быть экспрессированы с исключением активного протеолитического сегмента и таким образом могут служить в качестве антагонистов протеолитической активности, опосредуемой, например, участием Mch4 и МАСН. Протеазы семейства CED3/ICE могут быть вовлечены в процессы апоптоза, опосредуемые FAS-R. БелокMORT-1 (или FADD) связывается с внутриклеточным доменом FAS-R в ходе активации этого рецептора, а новый белок G1 по настоящему изобретению связывается с MORT1-связывающимися белками, такими как Mch4 и, вероятно,также МАСН, или напрямую с белком MORT-1. Белок G1, клонированный и охарактеризованный в соответствии с настоящим изобретением,может существовать в виде множественных изоформ, некоторые из которых включают сегмент гомологии с CED3/ICE, обладающий протеолитической активностью (протеолитический домен), сходный с таковым у Mch4 и у некоторых изоформ МАСН, и которые могут обусловливать гибель клеток в случае экспрессии в них. Таким образом, активация этого нового гомолога CED3/ICE (т.е. различных изоформ G1,включающих протеолитический домен) с участием FAS-R (путм прямого или непрямого взаимодействия с MORT-1), по-видимому, формирует эффекторный компонент опосредуемогоFAS-R механизма гибели клеток. Более того, белок G1 также функционирует в качестве эффекторного компонента механизма гибели клеток, инициируемого связыванием TNF на рецепторе p55-R на поверхности клеток: в этом случае путм непрямого связывания MORT-1 с белком TRADD - белком, который сам связывается с внутриклеточным доменом p55-R (Hsu et al., 1995), после этого или одновременно с этим происходит связывание белка G1 с MORT1-связывающимися белками,такими как, например, Mch4 или МАСН, или 13 связывание с MORT-1 напрямую с превращением G1 в активную протеазу, вовлечeнную в опосредование клеточной гибели. Также нужно отметить, что, хотя G1 проявляет, по крайней мере, некоторые параметры последовательности, ключевые для функционирования протеаз CED3/ICE, он, однако, обладает и рядом отличительных характеристик последовательности, которые могут обеспечить ему уникальный и, по-видимому, ткане/клеточноспецифичный характер активности. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, представляется новый белок, обозначенный G1. Этот белок G1 был выделен и клонирован с применением дигибридного скрининга и был охарактеризован как молекула, которая связывается с Mch4. Как отмечалось выше, Mch4 является MORT1 связывающимся белком, который способен запускать клеточную гибель, хотя, однако, также надо отметить, что некоторые изоформы Mch4 обладают противоположной активностью, а именно они ингибируют уничтожение клеток. Кроме того, секвенирование G1 показало, что этот белок включает в составе своей N-концевой части два так называемых "MORT-МОДУЛЯ"(ММ), которые также обнаруживаются в составеMORT1-связывающихся белков Mch4 и МАСН. Эти "MORT-модули" в составе G1 предположительно придают ему способность связываться сMch4, а также могут быть фактором прямого связывания с MORT-1 и связывания с МАСН или со специфическими изоформами МАСНG1 вслед за N-концевым сегментом, включающим "MORT-модули", также находится длинный сегмент, проявляющий сходство с протеолитическим сегментом МАСН и Mch4. Более того, исходя из данных начального анализа вероятной локализации последовательности генаG1 находится на хромосоме 2 в тесной близости от локализаций генов Mch4 и МАСН, что также указывает на наличие связи между белками G1, Mch4 и МАСН. Более подробно, по крайней мере, три возможные изоформы белка G1 были получены в соответствии с настоящим изобретением (см. ниже пример 1). Две из этих изоформ были выделены и клонированы: считается, что они представляют два варианта альтернативного сплайсинга нового белка, обозначенного G1(или CASH). Эти две изоформы были названыG1 (или CASH) для более длинной изоформы и G1 (или CASH) для более короткой изоформы (поскольку существует более одной короткой изоформы, то данная короткая изоформаG1 обозначается как G11, а другая короткая изоформа - как G12: см. ниже пример 1). Каждая из этих изоформ G1 -и- включает дваN-концевых "гибель-домена"/MORT-модуля и может связываться друг с другом опосредованно через эти "гибель-доменные мотивы", а также может связываться с MORT-1, Mch4 и МАСН опосредованно через эти же "гибельдоменные мотивы". Более длинная изоформаG1 имеет уникальный С-концевой сегмент (в сравнении с короткой изоформой G1), при том,что этот уникальный С-концевой сегмент характеризуется гомологией последовательности с таковой в сегменте протеазной активности каспаз. С точки зрения биологической активности,более короткая изоформа G1 подавляет гибель клеток и цитотоксичность, опосредуемую рецепторами p55-R и FAS-R, в то время как, напротив, более длинная изоформа G1 обладает цитотоксическим действием в отношении, по крайней мере, некоторых типов клеток (например, клеток линии 293) при том, что эта цитотоксичность вовлекает их протеазогомологичный сегмент. Однако надо отметить,что длинная изоформа Gl также может ингибировать цитотоксичность, опосредуемую рецепторами p55-R и FAS-R в других типах клеток (например, клеток HeLa). Эти данные определяют, что белок G1 (а именно его различные изоформы) действуют как ослабителиингибиторы и(или) индукторы-усилители сигнальных механизмов клеточной гибели, опосредуемых рецепторами p55-R и FAS-R. Также следует отметить, что ради простоты обозначения разных изоформ G1, напримерG1 и G1, часто в настоящем тексте будет применяться простое обозначение "G1", но при этом должно быть понятно, что в этих случаях понятие "G1" обозначает все изоформы G1, т.е. оно обозначает и индукторы-усилители цитотоксичности, и ингибиторы-ослабители клеточной цитотоксичности. Когда же подразумеваются специфичные изоформы G1, то они будут и именоваться соответствующим образом, например, G1 или G1. С учeтом сказанного, когда используется собирательное обозначение "G1",относящееся к разным изоформам, то оно часто обозначается в данном тексте как "модулятор": это означает, что он может проявлять и ингибиторное, и усиливающее действие в отношении обсуждаемой биологической функции. С точки зрения сказанного выше становится ясно, как это было описано выше и будет рассмотрено ниже, что G1 является модулятором активности MORT-1 и, соответственно, модулятором клеточных эффектов, опосредуемых рецепторами FAS-R и p55-R, а также, повидимому, другими рецепторами из семейства рецепторов TNF/NGF и других, которые могут участвовать в сходных компонентах и механизмах внутриклеточной передачи сигналов. Таким образом, поскольку G1 имеет протеазоподобный сегмент (по крайней мере, в составе длинной изоформы), он может напрямую 15 отвечать за цитотоксичность и воспалительные процессы, вызываемыми или индуцируемыми различными стимуляторами, включая те, которые попадают через рецепторы из состава семейства рецепторов TNF/NGF и, вероятно, также других семейств рецепторов. Также G1 может служить в качестве ингибитора цитотоксичности и воспалительных процессов за счт того, что он входит в состав комплекса других белков и, соответственно, может влиять на цитотоксическую и воспалительную активность этих других белков (например, белков, Mch4 и МАСН или даже MORT-1), что, в конечном счте, приводит к подавлению их цитотоксической активности или их активности при воспалении. Также ещe G1 может служить в качестве усилителя или обусловливателя клеточной цитотоксичности и воспалительных процессов,других белков (например, белков, Mch4 и МАСН или даже MORT-1), за счeт связывания с ними с последующим связыванием с MORT-1,или действуя независимо от MORT-1, но в каждом случае обеспечивая цитотоксическую активность различных белков или их действие по индукции воспалительных процессов. Также аналогичным путeм белок G1 может служить в качестве ингибитора или обусловливателя других внутриклеточных медиаторов или модуляторов, вовлечнных в механизмы, в которых активно участвует сам G1. Белок MORT-1 (аббревиатура "Mediator ofReceptor Toxicity" -медиатор токсичности рецепторов - Boldin et al., 1995b) способен связываться с внутриклеточным доменом FAS-R. Этот FAS-связывающийся белок предположительно действует в качестве медиатора или модулятора действия лиганда рецептора FAS-R на клетки путeм опосредования или модулирования внутриклеточных сигнальных механизмов,которые обычно запускаются после связывания лиганда FAS-R на поверхности клеток. Дополнительно к специфичности по FAS-связыванию,для MORT-1 было показано наличие других параметров (см. ссылочный пример 1), например, в его составе имеется сегмент, гомологичный сегментам "гибель-доменов" (DD) в составеp55-TNF-R и FAS-R (p55-DD и FAS-DD) соответственно, он также способен к самосвязыванию. Также MORT-1 сам по себе способен активировать клеточную цитотоксичность; такая активность, по-видимому, связана со способностью к самосвязыванию. Также было обнаружено, что коэкспрессия сегмента MORT-1, который включает последовательность, гомологичную "гибель-домену" (MORT-DD - присутствует в С-концевой части MORT-1), в существенной степени нарушает процессы гибели клеток,индуцируемые FAS, чего можно ожидать, исходя из способности к связыванию с "гибельдоменом" в составе FAS-IC. Кроме того, при тех же условиях эксперимента, было обнаружено, 003269 16 что коэкспрессия части МОRТ-1, которая не содержит сегмента MORT-DD (N-концевая часть MORT-1, аминокислоты 1-117: "головная часть MORT-1"), приводит в результате к отсутствию помех FAS-индуцируемой клеточной гибели, а то и к некоторому возрастанию цитотоксичности, индуцируемой FAS. Соответственно весьма вероятно, чтоMORT-1 также связывается с другими белками,вовлечeнными во внутриклеточные сигнальные механизмы. Эти MORT1-связывающиеся белки также могут, соответственно, действовать в качестве непрямых медиаторов или модуляторов влияния лигандов рецептора FAS-R на клетки путeм опосредования или модулирования активности MORT-1; или же эти MORT1 связывающиеся белки могут действовать напрямую как медиаторы или модуляторы связанного с MORT-1 внутриклеточного сигнального механизма путeм опосредования или модулирования активности MORT-1, который, что явствует из описанного выше, обладает независимой способностью активировать клеточную цитотоксичность. Эти MORT1-связывающиеся белки также могут быть использованы в любой из стандартных процедур скрининга с целью выделения, идентификации и охарактеризования дополнительных белков, пептидов, факторов, антител и т.п., которые могут быть вовлечены в сигнальные механизмы, связанные с MORT-1 или связанные с FAS-R, или могут являться элементами других внутриклеточных сигнальных процессов. Были выделены такие MORT1 связывающиеся белки, и они описаны в упоминавшихся выше совместных, находящихся на стадии рассмотрения израильских заявках 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 и в соответствующем им РСТPCT/US 96/10521 (в части, касающейся МАСН и его изоформ) и в статьях Fernandes-Alnemri et al. (1996) и Srinivasula et al. (1996) (в части, касающейся Mch4 и других "Мсh"-белков). Один из таких MORT1 связывающихся белков - ранее упоминавшийся белок МАСН - был исходно клонирован, секвенирован и частично охарактеризован как имеющий следующие параметры: кДНК МАСН кодирует открытую рамку ORF-B; МАСН связывается с MORT-1 по очень жсткому и высокоспецифичному типу; МАСН-связывающий сайт в составе MORT-1 положен выше "гибельдоменного мотива" MORT-1; участок ORF-B для МАСН является его участком взаимодействия с MORT-1; и МАСН характеризуется способностью к самосвязыванию и сам по себе может индуцировать клеточную цитотоксичность. Кроме того, позднее проведeнные исследования,также отражeнные в упоминавшихся выше совместных, находящихся на стадии рассмотрения заявках, а также в публикации Boldin et al.(1996), показали, что действительно МАСН существует в виде серии изоформ. Более того,упоминавшаяся выше ORF-B МАСН на самом 17 деле является одной из изоформ МАСН, обозначенной как MACH1. В вышеназванных публикациях, касающихся белка Mch4, было показано, что этот белок также связывается сMORT-1 (или FADD) и напрямую вовлечн в клеточную цитотоксичность с участием MORT1 или независимую от него, что связывается с его протеолитической активностью. Соответственно, настоящее изобретение представляет последовательность ДНК, кодирующую белок G1, его аналоги или фрагменты,способные связываться или взаимодействовать напрямую или опосредованно с MORT-1 и (или) с MORT1-связывающимися белками, такими как, например, Mch4 или МАСН, притом, что упомянутый белок G1, его аналоги или фрагменты способны опосредовать внутриклеточный эффект, опосредованный FAS-R или p55TNF-R, или что упомянутый белок G1, его аналоги или фрагменты способны также модулировать или опосредовать внутриклеточные эффекты активности других белков, с которыми они могут связываться напрямую или ненапрямую. В частности, настоящее изобретение представляет последовательность ДНК, выбираемую из группы, включающейa) последовательность кДНК, производную от сегмента, кодирующего нативный белок G1;b) последовательности ДНК, способные гибридизовать с последовательностью (а) в условиях средней степени жeсткости и которые кодируют биологически активный белок G1; иc) последовательности ДНК, которые являются вырожденными в результате изменения генетического кода в последовательностях ДНК,определенных в пп. (а) и (b) и кодирующих биологически активный белок G1. Другим специальным вариантом вышеназванной последовательности ДНК по настоящему изобретению является последовательность ДНК, включающая, по крайней мере, часть последовательности, кодирующей, по крайней мере, одну из изоформ белка G1. Другой вариант вышеназванной последовательности ДНКэто последовательность, кодирующая белок G1,приведнный на фиг. 1 (изоформа G1). Другой подобный вариант - это вторая изоформа белкаG1, приведeнная на фиг. 2 (изоформа G1). Настоящее изобретение представляет белки G1, их аналоги, фрагменты или производные,кодируемые любыми из обозначенных выше последовательностей ДНК по настоящему изобретению, притом, что упомянутые белки, их аналоги, фрагменты или производные способны связываться или взаимодействовать прямо или косвенно с MORT-1 и(или) с любыми MORT1 связывающимися белками, такими как, например, Mch4 или МАСН, и опосредовать внутриклеточный эффект, опосредованный FAS-R илиp55-TNF-R, или активностью любых других медиаторов или индукторов цитотоксичности, с 18 которыми упомянутые белки G1, их аналоги,фрагменты или производные способны прямо или непрямо связываться. Специальный вариант настоящего изобретения связан с белками G1, их аналогами, фрагментами и производными. Другой вариант представляет любую изоформу белка G1, их аналоги, фрагменты и производные. Также настоящим изобретением представляются векторы, кодирующие вышеназванный белок G1 и его аналоги, фрагменты или производные по настоящему изобретению, которые включают вышеназванные последовательности ДНК по настоящему изобретению, так, что эти векторы способны экспрессироваться в подходящих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах; трансформированные эукариотические или прокариотические клеткихозяева, несущие такие векторы; и способ получения белка G1 или его аналогов, фрагментов или производных по настоящему изобретению путeм выращивания таких трансформированных клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии упомянутого белка, его аналогов, фрагментов или производных и эффективных с точки зрения посттрансляционных модификаций упомянутого белка в случае, если необходимо получать упомянутый белок и экстрагировать упомянутый экспрессированный белок, его аналоги, фрагменты или производные из культуральной среды с упомянутыми трансформированными клетками или из клеточных экстрактов, полученных из упомянутых трансформированных клеток. Все приведeнные определения подразумевают включение всех изоформ белкаG1. В другом варианте настоящее изобретение также представляет антитела или их активные производные или фрагменты, специфичные в отношении белка G1, его аналогов, фрагментов и производных по настоящему изобретению.Eщe в одном варианте настоящее изобретение представляет различные пути использования вышеназванных последовательностей ДНК или кодируемых ими белков в соответствии с настоящим изобретением, притом, что, помимо прочего, такое использование подразумевает следующее.(А) Способ модулирования гибели клеток или воспалительных процессов, включающий обработку упомянутых клеток одним или большим числом белков G1, их аналогов, фрагментов или производных по настоящему изобретению, как описывалось выше, притом, что упомянутая обработка упомянутых клеток включает внесение в упомянутые клетки одного или большего числа белков, их аналогов, фрагментов или производных в форме, подходящей для их внутриклеточного введения, или внесение в упомянутые клетки нуклеотидной последовательности, кодирующей один или большее число упомянутых белков, их аналогов, фрагментов 19 или производных в форме пригодного вектора,несущего упомянутую последовательность так,чтобы упомянутый вектор был способен обеспечивать включение упомянутой последовательности в упомянутые клетки таким образом,чтобы упомянутая последовательность экспрессировалась в упомянутых клетках; и(В) способ модулирования гибели клеток или воспалительных процессов, включающий обработку упомянутых клеток одним или большим числом ингибиторов одного или большего числа белков/ферментов, опосредующих гибель упомянутых клеток или воспалительные процессы, при том, что упомянутые ингибиторы выбирают из группы, включающей: (1) один или большее число белков G1, их аналогов, фрагментов или производных по настоящему изобретению, способные ингибировать гибель упомянутых клеток или воспалительные процессы; и (2) ингибиторы одного или большего числа белков G1 по настоящему изобретению, при том, что упомянутые один или большее число белков G1 упрочивают/усиливают или опосредуют гибель упомянутых клеток или воспалительные процессы. Более конкретно, вышеназванные способы по настоящему изобретению включают следующие специальные варианты: 1) способ модулирования влияния лигандаFAS-R или p55-R, включающий обработку упомянутых клеток одним или большим числом белков G1, их аналогов, фрагментов или производных по настоящему изобретению, способных связываться с MORT1-связывающимися белками, такими как Mch4 или MACH, притом, что, в свою очередь, связанный с ними МОRТ-1 напрямую связывается со внутриклеточным доменом FAS-R, или способных связываться напрямую или опосредованно с MORT-1 или сp55-R, что тем самым обеспечивает способность модулировать/опосредовать активность упомянутых рецепторов FAS-R или p55-R, при том,что упомянутая обработка упомянутых клеток включает внесение в упомянутые клетки одного или большего числа белков, их аналогов, фрагментов или производных в форме, пригодной для их внутриклеточного введения, или внесение в упомянутые клетки последовательности ДНК, кодирующей упомянутые один или большее число белков, их аналогов, фрагментов или производных в форме подходящего вектора,несущего упомянутую последовательность, так,что упомянутый вектор способен обеспечивать попадание упомянутой последовательности в упомянутые клетки таким образом, чтобы упомянутая последовательность экспрессировалась в упомянутых клетках; 20 2) способ модулирования влияния лиганда(1), описанным выше, при том, что упомянутая обработка клеток включает внесение в упомянутые клетки упомянутого белка G1 или его аналогов, фрагментов или производных в форме,пригодной для внутриклеточного введения или внесение в упомянутые клетки последовательности ДНК, кодирующей упомянутый белок G1 или его аналоги, фрагменты или производные в виде подходящего вектора, несущего упомянутую последовательность, так, чтобы упомянутый вектор обеспечивал попадание упомянутой последовательности в упомянутые клетки таким образом, чтобы упомянутая последовательность экспрессировалась в упомянутых клетках; 3) способ в соответствии с п. (2), описанным выше, притом, что упомянутая обработка упомянутых клеток производится путем трансфекции упомянутых клеток рекомбинантным вирусным вектором, включающий следующие этапы:(a) конструирование рекомбинантного вектора вируса животного, несущего последовательность, кодирующую вирусный поверхностный белок (лиганд), который способен связываться со специфичным поверхностноклеточным рецептором на поверхности клеток,несущих рецепторы FAS-R или p55-R, и вторую последовательность, кодирующую белок, выбираемый из белка G1, его аналогов, фрагментов и производных, так, что при экспрессии в упомянутых клетках обеспечивается способность к модуляции-опосредованию активности упомянутых FAS-R или p55-R; и(b) инфицирование упомянутых клеток упомянутым в п. (а) вектором; 4) способ модулирования влияния лигандаFAS-R или p55-R, включающий обработку упомянутых клеток антителами или их активными фрагментами, или их производными в соответствии с настоящим изобретением так, что упомянутая обработка осуществляется путем внесения подходящей композиции, включающей упомянутые антитела, их активные фрагменты или их производные в упомянутые клетки, притом, что, когда, по крайней мере, часть белка G1 появляется на поверхности клетки, упомянутая композиция формируется для внеклеточного применения, а когда упомянутые белки G1 полностью внутриклеточны, то упомянутая композиция формируется для внутриклеточного внесения; 5) способ модулирования влияния лигандаp55-R, включающий обработку упомянутых клеток олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей антисмысловую последовательность по отношению, по крайней мере, к части последовательности белка G1 по настоящему изобретению, притом, что упомянутая 21 олигонуклеотидная последовательность способна блокировать экспрессию белка G1; 6) способ по п. (2), описанному выше, для обработки опухолевых клеток, или клеток, инфицированных ВИЧ, или других больных клеток, включающий(a) конструирование рекомбинантного вектора вируса животного, несущего последовательность, кодирующую вирусный поверхностный антиген, способный связываться со специфичным рецептором поверхности опухолевых клеток или с рецептором поверхности клеток,заражнных вирусом ВИЧ, или с рецептором других больных клеток, а также последовательность, кодирующую белок, выбираемый из белка G1, его аналогов, фрагментов и производных по настоящему изобретению, таким образом,что в случае экспрессии упомянутые опухолевые, ВИЧ-зараженные или другие больные клетки становятся способными уничтожать упомянутые клетки; и(b) инфицирование упомянутых опухолевых или зараженных вирусом ВИЧ клеток, или других больных клеток упомянутым в п. (а) вектором; 7) способ модулирования влияния лигандаFAS-R или TNF на клетки, включающий применение рибозимной процедуры, в которой вектор,кодирующий рибозимную последовательность,способную взаимодействовать с клеточной последовательностью мРНК, кодирующей белокG1 по настоящему изобретению, вносят в упомянутые клетки в такой форме, которая позволяет экспрессировать упомянутую рибозимную последовательность в упомянутых клетках, и при том, что упомянутая рибозимная последовательность экспрессируется в упомянутых клетках так, что взаимодействует с упомянутой клеточной последовательностью мРНК и расщепляет упомянутую последовательность мРНК, в результате чего происходит ингибирование экспрессии упомянутого белка G1 в упомянутых клетках; 8) способ, выбираемый из методов по настоящему изобретению, при том, что последовательность, кодирующая упомянутый белок G1,включает, по крайней мере, одну из изоформG1, аналоги, фрагменты и производные любой из представленных изобретением форм, которые способны связываться напрямую или ненапрямую с MORT-1 или с MORTl-связывающимися белками, такими как, например, Mch4 или МАСН, при том, что связанный с ними MORT1, в свою очередь, специфически связывается сFAS-IC, или которые способны связываться напрямую или ненапрямую с MORT-1 или вышеназванными MORT1-связывающимися белками,при том, что связанный с ними MORT-1, в свою очередь, связывается с TRADD или, в свою очередь, связывается с р 55-IС; 9) способ выделения и идентификации белков по настоящему изобретению, способных 22 связываться напрямую или ненапрямую с белком MORT-1 или с MORT1-связывающимися белкам и, включающий применение дигибридного дрожжевого теста, в котором последовательность, кодирующая упомянутые белокMORT-1 или MORT1-связывающиеся белки,входит в состав одного гибридного вектора, а последовательность из библиотек кДНК или геномной ДНК входит в состав второго гибридного вектора, притом, что векторы затем используют для трансформации дрожжевых клеток-хозяев и выделяются позитивные трансформированные клетки с последующим экстрагированием упомянутого второго гибридного вектора с целью получения последовательности,кодирующей белок, который связывается с упомянутыми белком MORT-1 или с MORT1 связывающимися белками; 10) способ в соответствии с любым из пп.(1)-(9), описанными выше, при том, что упомянутый белок G1 является одной из изоформG1, аналогом, фрагментом или производным любой из них; 11) способ в соответствии с любым из пп.(1)-(10), описанными выше, при том, что белок G1 или любые из его изоформ, аналогов,фрагментов или производных вовлечены в модулирование клеточного эффекта, опосредуемого или модулируемого любым другим цитотоксическим медиатором или индуктором, с которым упомянутые белок G1, его изоформа, аналог, фрагмент или производное способны связываться напрямую или ненапрямую; 12) способ скрининга других соединений,таких как, например, пептиды, органические соединения, антитела и т.п. с целью получения специфических лекарственных препаратов, которые были бы способны подавлять активностьG1, например, подавлять протеазную активность изоформы G1, подавляя таким образом клеточную цитотоксичность или усиливая цитотоксичность за счeт подавления активностиG1. Варианты вышеназванного способа скрининга по п.(12) включают(1) способ скрининга лиганда, способного связываться с белком G1 по настоящему изобретению так, как это было описано выше,включающий контактирование матрикса в аффинной хроматографии, к которому присоединн упомянутый белок, с клеточным экстрактом так, что в результате лиганд связывается с упомянутым матриксом с последующей элюцией,выделением и анализом упомянутого лиганда;(2) способ скрининга последовательности ДНК, кодирующей лиганд, способный связываться с белком G1 по настоящему изобретению, включающий применение дигибридного дрожжевого теста, в котором последовательность, кодирующая упомянутый белок, входит в состав одного гибридного вектора, а последова 23 тельности из библиотек кДНК или геномной ДНК входят в состав второго гибридного вектора, с трансформацией дрожжевых клеток-хозяев упомянутыми векторами с последующим выделением позитивных трансформированных клеток и экстрагированием упомянутого второго гибридного вектора с целью получения последовательности, кодирующей упомянутый лиганд;(3) способ идентификации и выработки лиганда, способного модулировать клеточную активность модулированную/опосредованную белком MORT-1 или MORT1-связывающимся белком, включающий:(a) скрининг лиганда, способного связываться с полипептидом, включающим, по крайней мере, часть белка MORT-1 или MORTlсвязывающихся белков, выбираемых из белков МАСН, белков Mch4 и других MORT1 связывающихся белков;MORT1-связывающихся белков или частей рецептора, входящего в семейство рецепторовTNF/NGF, найденного с помощью упомянутого этапа скрининга по способности к упомянутому связыванию; и(4) способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать проявляющуюся в модуляции или опосредовании клеточную активность белка G1 по настоящему изобретению, включающий:(b) идентификация и охарактеризование лиганда, помимо MORT-1 или MORT1 связывающихся белков или частей рецептора,входящего в семейство рецепторов TNF/NGF,найденного с помощью упомянутого этапа скрининга по способности к упомянутому связыванию; и(c) получение упомянутого лиганда в достаточно изолированном и очищенном виде;(5) способ идентификации и получения лиганда, способного модулировать клеточную активность,модулированную/опосредованную белком G1, включающий(b) идентификация и охарактеризование лиганда, помимо MORT-1 или MORT1 связывающихся белков или частей рецептора, 003269 24 входящего в семейство рецепторов TNF/NGF,найденного с помощью упомянутого этапа скрининга по способности к упомянутому связыванию; и(6) способ идентификации и получения молекулы, способной напрямую или опосредованно модулировать клеточную активность,модулированную/опосредованную G1, включающий(a) скрининг молекулы, способной модулировать проявляющуюся в модуляции/опосредовании активность G1;(7) способ идентификации и получения молекулы, способной напрямую или ненапрямую модулировать клеточную активность, модулированную/опосредованную белком G1 по настоящему изобретению, включающий(a) скрининг молекулы, способной модулировать проявляющуюся в модуляции/ опосредовании активность упомянутого белка(с) получение упомянутой молекулы, по существу, в изолированном и очищенном виде. Настоящее изобретение также представляет фармацевтическую композицию, предназначенную для модулирования влияния лигандаFAS-R или TNF на клетки или влияния любых других цитотоксических медиаторов или индукторов на клетки так, как это было описано выше, включающие в качестве активного ингредиента один из следующих компонентов:(i) белок G1 в соответствии с настоящим изобретением и его биологически активные фрагменты, аналоги, производные смесей;(ii) рекомбинантный вектор вируса животного, кодирующий белок, способный связываться на поверхностно-клеточном рецепторе и кодирующий белок G1 или его биологически активные фрагменты или аналоги в соответствии с настоящим изобретением;(iii) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность по отношению к последовательности белка G1 по настоящему изобретению, при том,что упомянутый олигонуклеотид может быть второй последовательностью в составе вирусного вектора в соответствии с п. (ii), описанным выше. Также настоящее изобретение представляетMORT1 связывающимся белково-индуцированного влияния, или влияния любого другого цитотоксического медиатора или индуктора на клетки, 25 включающий обработку упомянутых клеток в соответствии со способом по любому из пп.(1)(10), описанных выше с использованием белковG1, их аналогов, фрагментов или производных или с использованием последовательностей,кодирующих белки G1, их аналоги или фрагменты, при том, что упомянутая обработка приводит в результате к усилению или подавлению помянутого влияния, вызванного MORT-1, и таким образом влияния, опосредуемого рецепторами FAS-R и p55-R, или упомянутых иных цитотоксических медиаторов или индукторов.II. Способ в соответствии с описанным выше, при том, что упомянутые белок G1, его аналог, фрагмент или производное являются той частью белка G1, которая специфически участвует в связывании с MORT-1 или с MORT1 связывающимися белками, или с упомянутыми иными цитотоксическими медиатором или индуктором, или при том, что упомянутая последовательность белка G1 кодирует ту часть белкаG1, которая специфически участвует в связывании с MORT-1 или с MORT1-связывающимися белками, или с иными цитотоксическими медиатором или индуктором.III. Способ в соответствии с описанным выше, при том, что упомянутый белок G1 является любой из изоформ G1, а упомянутые изоформы способны усиливать связанное с MORT1 влияние или связанный с другими цитотоксическими медиатором или индуктором влияние,тем самым также усиливая влияние на клетки,связанные с рецепторами FAS-R или p55-R, или влияние на клетки другого цитотоксического медиатора или индуктора.IV. Способ в соответствии с описанным выше, при том, что белок G1 является любой из изоформ G1, а упомянутые изоформы способны подавлять влияние, связанное с MORT-1 или связанное с иным цитотоксическим медиатором или индуктором влияние на клетки, тем самым также подавив влияние на клетки, связанное с рецепторами FAS-R или p55-R, или влияние на клетки другого цитотоксического медиатора или индуктора. Как видно из всего сказанного выше, а также и из подробного описания ниже, G1 также может быть использован вне связи с белкомMORT-1 с целью обработки (лечения) клеток или тканей. Выделение белков G1, их идентификация и характеристика могут быть осуществлены с помощью любой из стандартных поисковых технологий, использующихся для выделения и идентификации белков, например, с помощью дигибридного дрожжевого теста, методов аффинной хроматографии и любых других хорошо известных стандартных процедур,применяемых для подобных целей. Более того, некоторые изоформы белка G1 могут включать только протеазоподобный сегмент (проявляющий гомологию с описанными выше протеазными сегментами в составе других 26 известных протеаз), но при отсутствии реальной протеазной активности, в результате чего такие изоформы могут служить, в первую очередь, в качестве ингибиторов так, как это было описано выше. Далее, поскольку G1 или любая из его изоформ могут быть вовлечены в модуляцию внутриклеточных механизмов, не связанных сMORT-1, то G1 или любая из его изоформ могут быть использованы для модулирования сигналов в любых прочих внутриклеточных путях и механизмах. Другие аспекты и варианты настоящего изобретения также представляются, исходя из нижеследующего подробного описания настоящего изобретения. Надо заметить, что, по мере использования, следующие термины - "модулирование влияния FAS-лиганда или TNF на клетки" и"модулирование влияния MORT-1 или MORT1 связывающегося белка на клетки" - понимаются как относящиеся к воздействию как in vitro, так и in vivo, а, кроме того, также предполагают и подавление (ингибирование), и усиление/ обусловливание. Краткое описание чертежей Фиг. 1 А является схематическим изображением первичной нуклеотидной последовательности, кодирующей одну из изоформ белкаG1, подробно описанной в примере 1; фиг. 1 В - схематическим изображением расшифрованной аминокислотной последовательности изоформы, представленной на фиг. 1 А; фиг. 2 - схематическим изображением первичной нуклеотидной последовательности и расшифрованной аминокислотной последовательности второй изоформы белка G1, подробно описанной в примере 1; фиг. 3 - схемой сравнения аминокислотных последовательностей сплайсинговых вариантов белка G1 (или CASH) человека (hCASH,hCASH) и мыши (CASH), а также консервативных мотивов, найденных в составе этих белков. На фиг. 3 осуществлено параллельное сопоставление аминокислотных последовательностей G1 мыши (mCASH), G1 человекаFLICE1/Mch5), CASP-10 (Mch4/FLICE2), CASP3 (СРР 32/апопаин/Yаmа) и CASP-1 (ICE). CASP1 и CASP-3 показаны без их продоменных сегментов. В каждой последовательности аминокислотные остатки пронумерованы справа. Прерывистые линии указывают на разрывы последовательностей, сделанные с целью оптимизации сопоставления. Затенены модули "гибельдоменов" (DED). Обведены аминокислоты, оказывающиеся идентичными более чем в трх белках. В пределах участков "протеазной гомологии" аминокислоты, сопоставленные с остатками в составе CASP-1 так, что их участие в 27 обеспечении каталитической активности было подтверждено с применением кристаллографической рентгенографии, обозначены следующим образом: остатки, предположительно участвующие в катализе и соответствующие гистидину-237 и цистеину-285 в составе CASP-1, интенсивно затемнены и помечены закрашенными кружками под столбцом сопоставления. Остатки, образующие карман связывания для карбоксилатной боковой цепи Pl-Asp и соответствующие аргинину-179, глутамину-238, аргинину 341 и серину-347 в составе CASP-1, затемнены в меньшей степени и помечены незакрашенными кружками. Известные и выявленные в экспериментах сайты расщепления по Asp-X и сайты потенциального расщепления, найденные в одинаковых положениях в G1 (CASH), затенены. Горизонтальные стрелки указывают на N- и С-терминальные концы малой и большой субъединиц CASP-1. С-концы белков помечены звздочками; фиг. 4 (А и В) воспроизводят авторадиограммы, полученные в ходе идентификации транскриптов G1 с помощью метода Нозернблоттинга в различных тканях человека (сердце,головной мозг, плацента, лгкие, печень, скелетные мышцы, почки, поджелудочная железа,селезнка, тимус, простата, семенники, яичники,тонкий кишечник, толстый кишечник и лимфоциты периферической крови PBL). Тестирование с применением метода Нозерн-блоттинга было проведено следующим образом: помеченный изотопно зонд мРНК, соответствующий[см. фиг. 2], т.е. сегменту, общему для обоих клонированных сплайсинговых вариантов G1[CASH]), был получен с использованием РНКполимеразы Т 7 (Promega) и применeн для анализа множественных тканевых точек человека(Clontech), включающих пoли(A)+-PHK (2 мкг на одну линию), происходящих из различных тканей человека; фиг. 5 является схематическим представлением результатов анализа взаимодействия(CASH), равно как и G1 (CASH), были оценены в репортерном штамме дрожжей SFY526pGAD1318 и pGADGH-GAL4. Количественный анализ связывания в клетках дрожжей в тесте по экспрессии -галактозидазы был проведен так, 003269 28 как это описано в ссылочных примерах 1-3. Полученные результаты выражены во времени,необходимом для получения отчетливого окрашивания. Во всех тестированных случаях идентичные результаты были получены тогда, когда тестируемые нуклеотидные вставки были помещены в обеих комбинациях в пределах ДНКсвязывающего домена и конструкций активаторного домена плазмид. Ни одна из тестированных вставок не взаимодействовала с рядом контрольных белков, включая внутриклеточные домены p55-R (CD120a),p75-R (CD120b), СD40,ламин, и пустые GAL4 векторы; фиг. 6 (A-D) представляет результаты оценки влияния мутантных вариантов G1(САSН), G1 (CASH) и G1 (CASH) на жизнеспособность клеток и индукцию клеточной гибели. Количественный анализ гибели клеток, индуцируемой а клетках HeLa-Fas (данные схематически показаны в виде диаграммы на фиг. 6 А) и в клетках 293-Т (данные схематически показаны в виде диаграммы на фиг. 6 В и 6 С) путем трансфекции этих клеток определенными конструкциями, был проведен так, как это описано в примере 1. Клетки (5105 клеток 293 Т или 3105 клеток HeLa в расчете на 6 сантиметровые чашки) были перемежающимся способом трансфицированы с использованием кДНК определенных белков вместе с плазмидойpCMV-Gal с помощью метода осаждения в растворе фосфата кальция. Каждую чашку трансфицировали 5 мкг конструкции р(кДНК); если же трансфекция осуществлялась двумя дифференцированными конструкциями, то по 2,5 мкг каждой, из них плюс 1,5 мкг вектора,экспрессирующего -галактозидазу. Клетки промывали в течение 6-10 ч после трансфекции и затем инкубировали еще 14 ч без дополнительной обработки. Моноклокальное антитело кCD95 (анти-FAS-R) (СН 11 [Oncor, Gaithersburg,MD], 0,5 мкг/мл) и рекомбинантный TNF человека (100 нг/мл) были добавлены к клеткам одновременно вместе с циклогексимидом (10 мкг/мл) с последующей инкубацией в течение еще 4 ч. Затем клетки окрашивали с использованием 5-бром-4-хлор-3-индоксилD-галактопиранозида (X-Gal) и тестировали их с помощью фазоконтрастного микроскопа. Во всех проиллюстрированных экспериментах гибель клеток оценивали спустя 24 ч после трансфекции клеток HeLa-Fas и спустя 20 ч после трансфекции клеток 293-Т. Приведeнные данные(среднееS.D.; n усреднено, по крайней мере,по трeм экспериментам) являются процентом окрашенных в синий цвет клеток, подсчитываемых с учeтом демонстрации ими блеббинга("пузырчатости") мембран. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение в одном из своих аспектов касается новых белков G1, которые способны связываться или взаимодействовать 29 напрямую или ненапрямую с MORT-1 или сMORT1-связывающимися белками, такими как,например, Mch4 или МАСН, тем самым связываясь со внутриклеточным доменом рецептораFAS-R, с которым связывается MORT-1, или связываясь с внутриклеточным доменом рецептора p55TNF-R, с которым связывается белокTRADD, с которым, в свою очередь, связывается белок MORT-1. Соответственно белки G1 по настоящему изобретению рассматриваются в качестве медиаторов или модуляторов FAS-R,играя тем самым роль, например, в сигнальных механизмах, которые инициируются связыванием лиганда FAS с рецептором FAS-R, а также играя роль в сигнальных механизмах, которые инициируются связыванием TNF на рецептореp55-R. В группу белков G1 по настоящему изобретению включн новый белок G1 и его изоформы. Более конкретно, в соответствии с настоящим изобретением представлен новый белок G1(также называемый CASH), который, очевидно,является гомологом протеазы CED3 нематоды. Этот новый белок G1, хотя и является близкородственным, при этом проявляет определнные отличия по структуре и субстратной специфичности, соответственно он может выполнять в какой-то степени отличающиеся функции в клетках млекопитающих. Действительно, известны два разных типа активности протеаз. Основной функцией ICE (также называемойCASP-1) представляется процессирование предшественника IL-1, в то время как дляCED3 было отчeтливо показано функционирование в качестве эффектора запрограммированной клеточной гибели. Эта последняя функция также, как полагается, является функцией, по крайней мере, некоторых гомологичных белков млекопитающих, например, некоторых изоформ белков МАСН (также называемых CASP-8),описанных в вышеназванных совместных, находящихся на стадии рассмотрения патентных заявках, а также упоминавшихся выше родственных белков Mch4 (также называемых CASP10), с которыми белок G1 по настоящему изобретению связывается. Аминокислотная последовательность MACH1 показывает тесное родство с СРР 32 (также называемым CASP-3), являющимся наиболее близким из известных гомологом млекопитающих CED3. Субстратная специфичность МАСН также сходна с таковой у СРР 32, за исключением того, что MACHl, повидимому, характеризуется более ограниченной субстратной специфичностью в сравнении с СРР 32. Протеаза СРР 32 предпочтительно расщепляет являющиеся субстратом пептиды по соответствующему сайту в составе поли-(АДФрибозо)полимеразы (PARP), а также ещe проявляет протеолитическую активность в отношении пептидов, соответствующих сайту расщепления протеазой ICE в составе предшественникаPARP-соответствующую последовательность. Такое соотношение MACH1 с СРР 32 и CED3 и отсутствие его сходства с ICE соответствует тому предположению, что MACH1 сходным образом с CED3 является регулятором клеточной гибели. MACH1 в то же время проявляет ряд параметров последовательности, отличающих его от CED3 и от СРР 32, равно как и от других членов семейства CED3/ICE. С-концевая часть MACH1, расположенная выше его участка, гомологичного CED3/ICE, показывает отсутствие какого-либо сходства со всеми аналогично расположенными сегментами любого из соответствующих гомологов. Кроме того, имеется и ряд уникальных характеристик последовательности и в пределах сегмента гомологии с протеазами семейства CED3/ICE. Наличие таких различий подтверждает, что MACH1 принадлежит к обособленной эволюционной ветви данного семейства и что его участие в контроле клеточной гибели в определнной степени отличается от такового, описанного ранее для гомологов из семейства CED3/ICE. Также белокG1 по настоящему изобретению и его вероятные изоформы показывают некоторые отчeтливые отличия в пределах сегмента гомологии с протеазами CED3/ICE в составе последовательности G1, а раз так, то такие различия могут представлять уникальные характеристики, отражающие специфичность активности G1 в клетках млекопитающих. Одно важное отличие может относиться к механизму, по которому осуществляется регуляция протеазы. Будучи вовлечeнной и в онтогенетически регулируемые процессы клеточной гибели, и в индуцируемый рецепторами иммунный цитолиз, расщепление белков протеазами семейства CED3/ICE должно бы быть подверженным регуляции как сигналами, которые формируются внутри клетки, так и сигналами,приходящими с рецепторов, находящихся на внешней поверхности клетки. В онтогенетических процессах клеточной гибели активация таких протеаз предположительно включает механизмы, которые влияют на экспрессию генов,в результате чего происходит усиление синтеза этих протеаз, равно как и снижение интенсивности синтеза некоторых белков, таких как BCL-2,который является антагонистом апоптотической индукции. Однако это точно не соответствует случаю, когда цитотоксичность опосредуется рецепторами FAS-R или TNF-R. Клетки могут быть уничтожены с участием лиганда TNF-R или FAS-R даже тогда, когда активность белкового синтеза внутри них полностью заблокирована (в действительности они могут быть уничтожены в этом случае с большей эффективностью) и остаются стимулозависимыми и в таких условиях. Активация протеаз семействаCED3/ICE рецепторами TNF и FAS-R также может происходить по механизму, который является независимым от белкового синтеза. Уникальные параметры последовательностиMACH1 могут позволить ему участвовать в работе такого механизма. Сходным образом уникальные характеристики последовательности белка G1 по настоящему изобретению также согласуются с его вероятной способностью участвовать в работе такого механизма. Таким образом, новый белок G1 может быть ещe одним членом недавно обнаруженной группы протеаз, которая включает выше упоминавшуюся протеазу МАСН (и еe изоформы) иMch4, для которых была установлена связываемость, либо напрямую, либо через белокадаптор, со внутриклеточным доменом поверхностно-клеточного рецептора. По взаимодействию механизмов действия связанных с рецепторами белков, которые обладают иными каталитическими свойствами, представляется вероятным, что связывание G1 с Mch4 или G1 с МАСН(или изоформой MACH1) и, в свою очередь,связывание Mch4 или МАСН с MORT-1, или же прямое связывание G1 с MORT-1 позволяет стимулировать протеазную активность G1 иFAS-лиганда на рецепторе FAS-R. Также это может позволять активировать протеазу рецептором p55-R за счeт связывания MORT-1 сTRADD, который, в свою очередь, связывается с p55-R. Для других членов семейства протеазCED3/ICE было обнаружено проявление полной своей активности только после протеолитического процессинга, который происходит либо путeм саморасщепления, либо под влиянием протеаз этого же семейства (обзор Kumas, 1995;Henkart, 1996). Например, как это было подробно описано в упоминавшихся выше совместных,находящихся на стадии рассмотрения патентных заявках в связи с МАСН, цитотоксическое действие вследствие коэкспрессии двух основных потенциально саморасщепляющихся продуктов MACH1, в противоположность отсутствию цитотоксичности в клетках в случае экспрессии полноразмерного участка гомологииMACH1 также проявляет свою полную активность только после процессинга. Ферментная активность, наблюдаемая в лизатах бактерий,которые экспрессируют полноразмерный сегмент, по-видимому, отражает наличие автопроцессинга данного белка, происходящего в таких условиях, или процессинга, осуществляемого некоторыми бактериальными протеазами. Пока неясно, по какому механизму такой процессинг протекает в клетках млекопитающих и как он может осуществляться при опосредовании рецепторами FAS-R и p55-R, а также пока ещ точно не определено, каким является относи 003269 тельный вклад протеазной активности МАСН 1 в цитотоксичность, индуцируемую FAS-R иTNF. Оценка такого вклада затруднена тем, что имеет место также экспрессия MACH1, в составе которой отсутствует сегмент гомологии сCED3/ICE, приводящая к выраженной цитотоксичности. По-видимому, такое проявление цитотоксичности отражает способность MACH1 связываться с MACH1. Из-за такой способности трансфицируемые молекулы МАСН могут в результате агрегируемости приводить к конформационным изменениям молекул MACH1,что является угрожающим для трансфицированной клетки. Такой механизм может также обусловливать цитотоксичность, наблюдаемую тогда, когда в клетках сверхэкспрессированы молекулы, которые действуют до МАСН (белкиMORT1, TRADD или "гибель-домены" в составе либо p55-R, либо FAS-R). В то же время, однако, нельзя исключить того, что цитотоксичность, наблюдаемая при индукции экспрессии МАСН или молекул, которые действуют до еe проявления, также отражает, помимо протеолитической активности гомологичного CED3/ICE сегмента в составе МАСН, активацию некоторых других механизмов, которые предположительно участвуют в цитотоксическом проявлении FAS-R и p55-R (например, активацию нейтральной или кислой сфингомиелиназ). Также нельзя исключать и того, что протеолитическая активность сегмента гомологии CED3/ICE служит другим функциям, помимо индукции цитотоксичности. Для более чeткого понимания функции MACH1 необходимо было бы идентифицировать эндогенные белковые субстраты,которые расщепляются вследствие активации МАСН 1. Обнаружение путей нарушения активности МАСН 1, например, путeм экспрессирования молекул-ингибиторов, также может внести вклад в понимание функций этого белка и тем самым послужить выяснению путей регуляции его активности, если это является желательным. Соответственно белок G1 по настоящему изобретению и его вероятные изоформы могут быть активными в аналогичном ключе по сравнению с вышеупомянутыми белками МАСН при наличии или отсутствии прямого взаимодействия с другими белками, а именно G1 может действовать напрямую путм связывания сMORT-1 или действовать косвенно через связывание с Мсh4 и (или) МАСН и, в свою очередь,путeм связывания Mch4 и (или) МАСН сMORT-1 или в соответствии с иным, пока точно не установленным механизмом, специфичным для белка G1. Сходным образом регуляция активности G1 может быть аналогичной таковой,ранее охарактеризованной для белков МАСН. Такое может существовать внутри клеток,которые экспрессируют естественные ингибиторы G1 в отношении протеазной активности, 33 проявляемой этим белком. Существование изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга, характерных для других членов семейства CED3/ICE, было определено как фактор физиологического ограничения функций этих протеаз. Для некоторых из изоформ таких других протеаз было сообщено об их активности в качестве естественных ингибиторов полноразмерных изоформ, что, вероятно, обусловливается формированием неактивных гетеродимеров между ними. Это может быть справедливым также и для G1 и его некоторых вероятных изоформ, например, таких изоформ, в которых потенциальный N-концевой сайт расщепления отсутствует. Экспрессия таких ингибиторных изоформ может определять работу механизма клеточной самозащиты против цитотоксичности, обусловливаемой FAS-R и TNF.G1 может обладать еще и другими функциями: например, G1 или любая из его изоформ могут иметь усиливающее или упрочивающее влияние на другие белки, обладающие ферментной активностью, например, на протеолитическую активность различных изоформ Mch4 и МАСН; такая усиливающая или упрочивающая активность осуществляется по механизму, в котором G1 выступает в качестве индуктора связывания других белков с MORT-1 (например,белков Mch4 и МАСН). Кроме того, G1 или любая из его изоформ также могут играть роль, не связанную с цитотоксичностью, но могут выступать в качестве "пристанища" для молекул(т.н. "депо-сайта"), которые вовлечены в действие FAS-R и TNF, не связанное с проявлением цитотоксичности. Некоторые из специфичных изоформ G1 по настоящему изобретению проиллюстрированы ниже в примере 1. Одна из нихmCASH), очевидно, представляет собой 1 мг варианта сплайсинга, включающего протеазный гомологичный сегмент и, по крайней мере, в некоторых типах клеток (например, в клетках 293 Т) обладает цитотоксической активностью. Другая изоформа, обозначенная G1 (CASH),выделенная у человека, по-видимому, является коротким вариантом сплайсинга без протеазного гомологичного сегмента, эта изоформа, действующая как ингибитор сигнальных механизмов клеточной гибели. Из-за уникальной способности рецепторовFAS-R и TNF-R обусловливать клеточную гибель, равно как и способности рецепторов TNF опосредовать различные другие типы активности, связанные с повреждением тканей, нарушение функций этих рецепторов может иметь негативные последствия для организма. Действительно, для обоих типов функций этих рецепторов - избыточной и недостаточной - было продемонстрировано участие в патологических 34 проявлениях различных заболеваний. Идентификация молекул, которые участвуют в сигнальной активности этих рецепторов, и обнаружение путей модулирования функций этих молекул представляет собой возможный ключевой приeм, необходимый для новых лечебных методологий в отношении таких заболеваний. С точки зрения предполагаемой важной роли G1 в токсичности, обусловливаемой участием FAS-R и TNF, считается, в частности, важным создать лекарства, которые бы могли блокировать протеолитическую функцию таких молекул, что ранее было выполнено в отношении других представителей семейства протеаз CED3/ICE. Уникальные параметры последовательности гомологичного CED3/ICE сегмента в составе G1 могут позволить создавать лекарства, которые бы нарушали их защищенность от цитотоксичности, обусловливаемой избыточной иммунной активностью, без нарушения физиологических процессов гибели клеток, в которые вовлечены другие члены семейства CED3/ICE. Как отмечалось выше, G1 или любые из его изоформ также могут быть вовлечены в модулирование других внутриклеточных сигнальных механизмов, таких как, например, действие иных цитотоксических медиаторов или индукторов или других белков, действующих вне зависимости от связывания с MORT-1 или сMORT1-независимосвязывающимися белками. Далее, G1 или, по крайней мере, его изоформы,которые включают протеазоподобный сегмент,но без реальной протеазной активности, могут быть вовлечены в первичную ингибиторную функцию: т.е. подавлять те механизмы (например, сигнальные механизмы в общих или цитотоксических механизмах), в которых G1 или его изоформы участвуют либо путeм прямого связывания с участниками этих механизмов, либо путм косвенного связывания с другими белками, которые, в свою очередь, связываются с участниками этих механизмов. Итак, настоящее изобретение также касается последовательности ДНК, кодирующей белок G1, и белков G1, кодируемых такими последовательностями ДНК. Более того, настоящее изобретение также касается последовательностей ДНК, кодирующих биологически активные аналоги, фрагменты и производные белка G1, равно как и аналоги, фрагменты и производные, ими кодируемые. Получение таких аналогов, фрагментов и производных проводится с помощью стандартных методик (см., например, методическое руководство Sambrook et al., 1989), с помощью которых в последовательностях ДНК, кодирующих белок G1, один или большее число кодонов может быть делетировано, добавлено или заменено другими с последующим получением аналогов,имеющих, по крайней мере, одну замену аминокислотного остатка по сравнению с нативным белком. 35 Полипептид или белок, который "по существу соответствует" белку G1, включает не только белок G1, но также и полипептиды или белки, которые являются аналогами G1. Аналогами, которые в существенной степени соответствуют белку G1, являются полипептиды, в составе которых одна или большее число аминокислот нативной аминокислотной последовательности G1 замещены другой аминокислотой, делетированы и(или) вставлены, в результате чего получаемый белок проявляет,по существу, такой же или больший уровень биологической активности в сравнении с белком G1, которому он соответствует. С целью обеспечения соответствия белкуG1, по существу, изменения в аминокислотной последовательности белков G1, таких как его изоформы, должны быть относительно небольшими. Хотя количество замен может быть больше десяти, предпочтительно, чтобы оно не превышало десяти замен, более предпочтительно, чтобы число замен не было более пяти, а наиболее предпочтительно - не более трх таких замен. При том, что любые методики могут быть использованы для выявления биологически активных белков, которые в существенной степени соответствуют белкам G1, одним из таких методов является использование стандартной процедуры мутагенеза в отношении ДНК, кодирующей белок, с получением в результате малого числа модификаций. Белки,экспрессируемые такими клонами, затем могут быть подвергнуты скринингу по их способности связываться с различными MORT1-связывающимися белками, такими как, например, Mch4 и МАСН, или даже напрямую с MORT-1, и(или) по их FAS-R- и р 55-R-опосредующей активности, и(или) способности опосредовать активность любых других внутриклеточных механизмов таким образом, как это было описано выше. Под "консервативными" изменениями подразумеваются те изменения, которые, как ожидается, не должны изменять активность белка и которые обычно подвергаются скринингу в первую очередь, поскольку они, как ожидается, не приводят к существенному изменению размера, заряда или конфигурации данного белка и, следовательно, как также ожидается, не приводят к изменению его биологических свойств. Консервативные замещения в белках G1 включают такой аналог, в котором, по крайней мере, один аминокислотный остаток в составе полипептида замещн консервативным образом другой аминокислотой. Предпочтительно выполнять такие замещения в соответствии со следующим перечнем, который представлен в табл. 1 А; такие замещения могут быть определены путeм рутинного экспериментирования с целью получения модифицированных структурных и функциональных характеристик синтезирован 003269 36 ной полипептидной молекулы при поддержании биологической активности, характерной для белка G1. Таблица 1 А Исходный остаток Примеры замещения АlаIle; Leu С другой стороны, другая группа замещений в составе белка G1 представлена такими замещениями, когда, по крайней мере, один аминокислотный остаток в составе полипептида удаляется и другой остаток вносится на его место в соответствии с табл. 1 В. Типы замещений,которые могут быть произведены в составе полипептида, могут основываться на анализе частоты аминокислотных замен между гомологичными белками у различных видов организмов,такие как те, которые представлены в табл. 1-2 уCreighton Т.Е., 1983 (Proteins: Structure and Molecular Properties, FreemanCo., San Francisco,CA). Основываясь на подобных анализах, альтернативные консервативные замещения определены здесь как замены в пределах одной из следующих пяти групп. Таблица 1 В 1. Маленькие алифатические, неполярные или слабополярные остатки: Ala, Ser, Thr (Pro,Gly); 2. Полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды: Asp, Asn, Glu, Gln; 3. Полярные, положительно заряженные остатки: His, Arg, Lys; 4. Крупные алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val (Cys); и 5. Крупные ароматические остатки: Phe,Туr, Тrр. Три аминокислотных остатка, взятые в вышеприведнной таблице в скобки, характеризуются специфической ролью в пространственной архитектуре белков. Глицин является единственной аминокислотой, лишенной какой-либо 37 боковой цепи и таким образом обеспечивает подвижность цепи. Это, однако, имеет тенденцию к образованию какой-либо иной вторичной структуры, помимо -спиральной. Пролин благодаря своей необычной геометрии обеспечивает плотность упаковки цепи и в принципе обеспечивает тенденцию к образованию структур типа -плоскостей, хотя в некоторых случаях остаток цистеина может принимать участие в образовании дисульфидных связей, которые важны для пространственной складчатости белка. Следует отметить, что цитированный вышеSchulz et al. объединял вышеназванные группы 1 и 2. Надо заметить также, что тирозин, благодаря его потенциалу к образованию водородной связи, проявляет существенное родство с серином и треонином и т.п. Консервативные аминокислотные замещения в соответствии с настоящим изобретением,например, такие, какие описаны выше, хорошо известны в данной области техники и, как ожидается, должны поддерживать биологические и структурные свойства данного полипептида после замещения аминокислот. Большинство делеций и замен в соответствии с настоящим изобретением являются такими, которые не приводят к радикальным изменениям характеристик данного белка или полипептидной молекулы. Под "характеристиками" понимаются как изменения во вторичной структуре, например,наличие -спиралей или -плоскостей, так и изменения в биологической активности, например, связывание с MORT1-связывающимися белками или с MORT-1, или опосредование влияния на клетки лиганда FAS-R или TNF. Примеры проведения аминокислотных замен в составе белков, которые могут быть использованы для получения аналогов белков G1 по использованию в настоящем изобретении,включают любые известные методы, такие как представленные в патентах США RE-33653,4959314, 4588585 и 4737462 у Mark et al.; 5116943 у Koths et al.; 4965195 у Namen et al.; 4879111 у Chong et al.; и 5017691 у Lee et al.; и лизинзамещeнные белки, представленные патентом США 4904584 (Shaw et al.). Помимо консервативных замещений, обсуждавшихся выше, которые не должны сколько-нибудь существенно изменять активность белка G1, и консервативные замещения, и менее консервативные, и "более случайные" изменения, которые ведут к увеличению биологической активности аналогов белков G1, также находятся в пределах масштаба настоящего изобретения. Когда должно быть определено точное проявление замещения или делеции, специалисту в данной области техники должно быть ясно,что такое проявление замещения(замещений), делеции(делеций) и т.п. может быть оценено с помощью стандартных тестов на 38 связывание и гибель клеток. Проведение скрининга с использованием таких стандартных тестов не включает каких-либо неподходящих экспериментов. Приемлемыми аналогами являются те из них, которые сохраняют, по крайней мере, способность связывания с MORT1-связывающимися белками, как это отмечалось выше, или сMORT-1, или с другими белками, тем самым в соответствии с описанным выше, опосредуя активность рецепторов FAS-R и p55-R или других белков, отмеченных выше. Таким образом,могут быть получены аналоги, которые проявляют так называемый "доминантно-негативный эффект", а именно аналоги, которые дефектны или по связыванию с MORT1-связывающимися белками (например, Mch4 или МAСН), или по связыванию с MORT-1, или с другими белками,или по последующей сигнальной или протеазной активности после такого связывания. Такие аналоги могут быть использованы, например,для подавления влияния лиганда FAS-R или влияния других белков за счт конкуренции с естественными MORT1-связывающимися белками или другими белками. Например, представляется вероятным, что изоформы МАСН,МАСН 2 и МАСН 3, являются "естественными" аналогами, которые служат в качестве ингибиторов активности МАСН за счeт конкуренции по связыванию активных (протеазных) изоформ МАСН с MORT-1, что представляется существенным для активации этих изоформ МАСН. Поскольку в результате активные изоформы МАСН не могут связываться с MORT-1,то внутриклеточные сигнальные механизмы,опосредуемые рецепторами FAS-R и p55-R,также окажутся подавленными. Сходным образом G1 или любая из его изоформ также могут служить в качестве ингибиторов влияния FASлиганда за счeт конкуренции с различнымиMORT1-связывающимися белками по связыванию с MORT-1 или за счeт взаимодействия с ними таким путeм, который предотвращает их связывание с MORT-1. Также могут быть получены так называемые "доминантно-позитивные" аналоги G1, которые будут служить для усиления влияния FAS-лиганда или TNF. Они могут иметь такую же или лучшую способность к связыванию с MORT1-связывающимися белками или даже такие же или лучшие свойства по связыванию с MORT-1 и такие же или лучшие характеристики в отношении сигнальных механизмов по сравнению с естественными белкамиG1. На генетическом уровне эти аналоги в принципе получают путeм сайт-направленного мутагененза в отношении нуклеотидов в составе ДНК, кодирующей белок G1, тем самым получая ДНК, кодирующую данный аналог, с последующим синтезом этой ДНК и экспрессией рекомбинантного полипептида в клеточной культуре. Обычно аналоги проявляют такие же или 39 улучшенные качественные показатели биологической активности в сравнении с естественно встречающимся белком: Ausubel et al., 19871995, Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publ.Wiley Intersci., New York, NY;Spring Harbor, NY. Приготовление белка G1 в соответствии с изложенным здесь или альтернативной нуклеотидной последовательности, кодирующей такой же полипептид, которая отличается от естественной последовательности из-за изменений,учитывающих известную вырожденность генетического кода, может быть осуществлено путeм сайт-специфического мутагенеза ДНК,которая кодирует ранее приготовленный аналог или нативный вариант белка G1. Сайтспецифический мутагенез позволяет получать аналоги путeм использования специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК с желательной мутацией, а также достаточное число соседствующих нуклеотидов с получением затравочной последовательности достаточного размера и сложности, необходимых для образования стабильного дуплекса по обе стороны от"пересекаемого" делеционного соединения. Обычно предпочтительной является затравка,состоящая примерно из 20-25 нуклеотидов при том, что примерно 5-10 комплементирующих нуклеотидов с каждой стороны последовательности заменяются. В целом, методика сайтспецифического мутагенеза хорошо известна в данной области техники, примером чему служит публикация Adelman et al., 1983 (DNA, 2, 183),данные которые включены в настоящий текст путeм цитирования. Нужно принять во внимание, методика сайт-специфического мутагенеза обычно использует фаговый вектор, который существует как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной формах. Обычные векторы, используемые в методе направленного мутагенеза, включают такие векторы, как фаг М 13, например, так, как это описано Мессингом с соавт. (Messing et al.,1981, 3d Cleveland Symp. on MacromoleculesRecombinant DNA, ed. A. Walton, Elsevier, Amsterdam), данные которого включены здесь в виде цитирования. Эти фаги являются легко доступными на коммерческой основе и их использование в принципе хорошо известно специалистам в данной области техники. С другой стороны, также для получения одноцепочечной ДНК могут быть использованы плазмидные векторы, несущие одноцепочечный фаговый сайт начала репликации (Veira et al., 1987, Methods Enzymol., 153, 3). В целом, сайт-специфический мутагенез в соответствии с описываемым здесь осуществляют сначала путeм получения одноцепочечного вектора, который включает в пределах своей 40 последовательности последовательность ДНК,кодирующую необходимый полипептид. Олигонуклеотидную затравку, несущую желательным образом мутировавшую последовательность, получают синтетическим путeм с помощью автоматического ДНК-олигонуклеотидного синтеза. Эту затравку затем отжигают с одноцепочечным вектором, содержащим белоккодирующую последовательность, и подвергают воздействию ДНК-полимеризующих ферментов,таких как фрагмент Клнова полимеразы I кишечной палочки, с целью завершения синтеза цепи, несущей данную мутацию. Таким образом, как и мутировавшая последовательность,вторая цепь нест желательную мутацию. Такой гетеродуплексный вектор затем используют для трансформации подходящих клеток, таких как клетки JM101 E.coli, а клоны отбирают по включению рекомбинантных векторов, несущих мутантную последовательность. После того как такой клон отобран, мутантный белок G1 может быть выделен и внесн в состав подходящего вектора, обычно в состав трансформационного или экспрессирующего вектора такого типа, который может быть использован для трансфекции подходящего организма-хозяина. Соответственно, ген или нуклеиновая кислота, кодирующие белок G1, также могут быть обнаружены, получены и(или) модифицированыin vitro, in situ и(или) in vivo путeм использования известных методик амплификации ДНК или РНК, таких как полимеразная цепная реакция(ПЦР) и химический олигонуклеотидный синтез. ПЦР позволяет амплифицировать (увеличивать в числе) специфические последовательности ДНК путeм повторения реакций с участием ДНК-полимеразы. Эта реакция может быть использована вместо клонирования: всe, что в этом случае требуется, - это знать состав нуклеотидной последовательности. С целью осуществления ПЦР формируют затравки, которые комплементарны представляющей интерес последовательности. Затем эти затравки генерируют с помощью автоматизированного синтеза ДНК. Поскольку затравки могут быть сформированы так, чтобы они гибридизовали с частью конкретного гена, то могут быть созданы такие условия, при которых возможно проскакивание ошибок в комплементарности оснований. Амплификация таких участков, несущих ошибки,может приводить к синтезу мутантного продукта, в результате чего образуется пептид, обладающий новыми свойствами (т.е. по сути - это сайт-направленный мутагенез). См. также руководство Ausubel et al., цитированное выше, глава 16. Также путeм объединения синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы и метода ПЦР РНК может быть использована в качестве исходного материала для синтеза внеклеточного домена 41 рецептора пролактина с исключением этапа клонирования. Более того, затравки для ПЦР могут быть сконструированы так, чтобы включать новые рестрикционные сайты или другие элементы,такие как терминирующие кодоны по концам генного сегмента, предназначенного для амплифицирования. Такое помещение рестрикционных сайтов по 5'- и 3'-концам амплифицируемой генной последовательности позволяет направленно получать генные сегменты, кодирующие белок G1 или его фрагменты, сформированные так, чтобы быть пригодными для лигирования на другие последовательности и(или) клонирующие сайты в составе векторов. ПЦР и другие методы амплификации РНК и(или) ДНК хорошо известны в данной области техники и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением без излишних экспериментов, основываясь на руководстве,приведeнном в настоящем тексте. Известные методы амплификации ДНК или РНК включают, но этим не ограничиваются, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и сходные амплификационные процессы (см., например, патенты США 4683195, 4683202, 4800159, 4965188Amplification), а также амплификация по РНКпосредникам, основанная на использовании РНК, являющейся антисмысловой по отношению к последовательности-мишени и используемой в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США 5130238 - Malek etal.: торговая марка NASBA) и иммунная ПЦР,которая является комбинацией ДНКамплификации с мечением антител (Ruzicka etal., 1993, Science, 260, 487; Sano et al., 1992, Science, 258, 120; Sano et al., 1991, Biotechniques, 9,1378), при том, что полное содержание патентов и цитируемых статей полностью включено в виде ссылок. Аналогичным образом биологически активные фрагменты белков G1 (например, такие как любые белки G1 или его изоформы) могут быть получены так, как это было описано выше по отношению к получению аналогов белковG1. Подходящими фрагментами белков G1 являются те, которые сохраняют свойственную белку G1 способность опосредовать биологическую активность рецепторов FAS-R и p55-R или других белков так, как это было описано выше. Соответственно, могут быть получены такие фрагменты белков G1, которые обладают "доминантно-негативным" или"доминантнопозитивным" действием в соответствии с описанным выше для характеристики аналогов. Необходимо отметить, что эти фрагменты пред 003269 42 ставляют специальный тип аналогов по настоящему изобретению, а именно они определяют участки белков G1, являющиеся производными от полной последовательности белка G1 (например, от последовательности любого G1 или их изоформ), при том, что такая часть или фрагмент обладали какой-либо из вышеобозначавшихся желательных характеристик. Такой фрагмент может быть, например, пептидом. Сходным образом производные могут быть получены путeм стандартных модификаций боковых групп одного или большего числа аминокислотных остатков в составе белка G1,его аналогов или фрагментов или путeм соединения белка G1, его аналогов или фрагментов с другой молекулой, например, антителом, ферментом, рецептором и т.п., что хорошо известно в данной области техники. Соответственно, под понятием "производных" в данном тексте понимаются производные, которые могут быть получены из функциональных групп, которые находятся на боковых цепях аминокислотных остатков или N-, или С-концевых групп с помощью известных методик, и включены в настоящее изобретение. Производные могут быть химическими составляющими, такими как углеводные или фосфатные остатки, в результате чего получаемая фракция будет иметь такую же или более высокую биологическую активность по сравнению с белками G1. Например, производные могут включать алифатические эфиры карбоксильных групп,амиды карбоксильных групп, полученные в результате реакций с аммонием или с первичными или вторичными аминами, N-ацильные производные или свободные аминогруппы аминокислотных остатков, образованные ацильными составляющими (например, алканоильные группы или ароильные группы с углеродным кольцом) или O-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, в остатках серина или треонина), образованные ацильными составляющими. Термин "производное" должен включать только те производные, которые не изменяют одну аминокислоту на другую из 20 естественных природных аминокислот. Хотя белок G1 является белком или полипептидом, он является последовательностью аминокислотных остатков. Полипептид, включающий более длинную последовательность,который содержит полную последовательность белка G1, в соответствии с принятыми здесь определениями, должен также включаться в параметры такого полипептида, т.к. добавления не влияют на основные и новые характеристики изобретения, т.е. если оно сохраняет или усиливает биологическую активность белка G1 или если удлинeнный полипептид может быть впоследствии расщеплeн с получением белка или полипептида, обладающего биологической активностью белка G1. Таким образом, например, 43 настоящее изобретение также включает слитые белки, состоящие из белка G1 и других аминокислот или пептидов. Новый белок G1, его аналоги, фрагменты и производные пригодны для использования в ряде направлений, например: 1). Белок G1, его аналоги, фрагменты и производные могут быть использованы для миметирования или усиления функций MORT1 связывающихся белков, таких как, например,Mch4 или МАСН (включая их различные изоформы) или даже самого MORT-1 и, следовательно, лиганда FAS-R или TNF, или других белков в случаях, когда желательным является усиление влияния лиганда FAS-R или TNF, или другого белка, как, например, при применении в противоопухолевых, противовоспалительных,противо-ВИЧ и т.п. целях, при достижении которых желательной является индукция цитотоксичности с участием лиганда FAS-R или TNF,или иных белков. В этом случае белок G1, его аналоги, фрагменты или производные, которые усиливают влияние лиганда FAS-R, или TNF,или другого белка, т.е. цитотоксическое действие, могут быть внесены в клетки с помощью стандартных процедур, известных к настоящему времени. Например, тогда, когда белок G1 является полностью внутриклеточным (как это предполагается) и должен быть внесeн только внутрь клеток, в которых желательно проявление влияния лиганда FAS-R, или TNF, или другого белка, необходимо применять специальную систему для внутриклеточного внедрения белка. Одним из путей для решения такой задачи является создание рекомбинантного животного вируса, например, производного от Vaccinia, в состав ДНК которого должны быть встроены следующие два гена: ген, кодирующий лиганд,который связывается с поверхностноклеточными рецепторами, специфически экспрессируемыми данными клетками, например,такой лиганд как антиген gр 120 СПИДа (ВИЧ),специфически связывающийся на некоторых типах клеток (на CD4 лимфоцитах и родственных лейкозных клетках), или же какой-либо иной лиганд, который специфически связывается с клетками, несущими рецепторы FAS-R илиp55-R, таким образом, чтобы такой рекомбинантный вирусный вектор был бы способен связываться такими клетками, несущими FAS-R или p55-R; и ген, кодирующий белок G1. Таким образом, экспрессия на поверхности вируса антигена, который связывается на поверхности клетки-мишени, позволит точно направлять этот вирус на опухолевую клетку или другую клетку,несущую FAS-R или p55-R с тем, чтобы после этого последовательность, кодирующая белокG1 (например, последовательность G1) была внесена внутрь клеток с помощью этого вируса и, соответственно, экспрессирована в этих клетках, что в результате приведт к усилению влияния лиганда FAS-R или TNF и далее при 003269 44 ведeт к гибели опухолевых клеток или других клеток, несущих FAS-R или p55-R, если их желательно уничтожить. Конструирование такого рекомбинантного животного вируса производится с помощью стандартных процедур (см.,например, Sambrook et al., 1989). Другим возможным путeм внесения последовательности белка G1 (например, либо белка G1, либо любой из его изоформ) является внесение в форме олигонуклеотидов, которые могут быть поглощены клеткой с последующей их экспрессией внутри неe. Ещe одним путeм усиления такой клеточной цитотоксичности может быть подавление активности изоформ G1 (например, G1), которые сами по себе являются ингибиторами клеточной цитотоксичности. Пути ингибирования таких изоформ G1 многочисленны и включают те, которые рассмотрены в нижеследующем п.2 в связи с их применением для специфического подавления ингибиторных изоформ белка G1,таких как, например, изоформа G1. 2). Они могут быть использованы для подавления влияния на клетки лиганда FAS-R, илиTNF, или другого белка, например, в таких случаях, как повреждение тканей при септическом шоке, отторжении при синдроме "трансплантат против хозяина" или остром гепатите, т.е. тогда,когда желательным является блокирование индуцируемых лигандом FAS-R или TNF внутриклеточных сигналов с FAS-R или с p55-R, или сигналов, индуцируемых иными белками. В этом случае возможным является, например,внесение в клетки с помощью стандартных процедур олигонуклеотидов, имеющих антисмысловые кодирующие последовательности по отношению к последовательности, кодирующей белок G1, что обеспечивает эффективное блокирование трансляции мРНК, кодирующих белок G1, и тем самым блокирование его экспрессии, что приводит к подавлению влияния лиганда FAS-R, или TNF, или другого белка. Такие олигонуклеотиды могут быть внесены в клетки с использованием выше описанного способа конструирования рекомбинантных животных вирусов, вторая встроенная последовательность в составе которых является данной олигонуклеотидной последовательностью. Далее, как уже отмечалось выше и ниже будет рассмотрено в качестве примера, была выделена, по крайней мере, одна изоформа белка G1, которая рассматривается в качестве "естественного ингибитора" клеточной цитотоксичности - это G11. Соответственно, такая изоформа белка G1 может быть введена в клетки напрямую или с использованием подходящего вектора, несущего нуклеотидную последовательность, кодирующую эту изоформу: следовательно, в случае экспрессии в этих клетках эта изоформа G1 будет работать как ингибитор цитотоксичности. 45 Другая возможность предоставляется использованием антител, специфичных в отношении белка G1 по ингибированию его внутриклеточной сигнальной активности. Ещe одним путeм подавления влияния лиганда FAS-R или TNF является недавно разработанный "рибозимный подход". Рибозимы это молекулы РНК, обладающие каталитической активностью, направленной на расщепление молекул РНК. Рибозимы могут быть искусственно сконструированы таким образом, чтобы избирательно расщеплять РНК-мишень, например, мРНК, кодирующую белок G1 по настоящему изобретению. Такие рибозимы должны характеризоваться последовательностью, специфичной в отношении мРНК белка G1 и должны быть способны взаимодействовать с ней (путем комплементрного связывания) с последующим расщеплением мРНК, в результате чего происходит уменьшение (или полное прекращение) экспрессии белка G1, а степень уменьшения экспрессии зависит от уровня интенсивности экспрессии рибозима в клетке-мишени. Для внесения в выбранную клетку рибозимов (например, в клетки, несущие рецепторы FAS-R или p55-R) может быть использован любой подходящий вектор, например, плазмида, векторы на основе вирусов животных (ретровирусы),которые обычно используются для подобных целей (см. также п.1, описанный выше, где описаны вирусные векторы, включающие в качестве второй встраиваемой последовательности кДНК, кодирующую последовательность выбираемого рибозима). Как обзоры методов применения рибозимов см. Chen et al., 1992; Zhaoal., 1993. 3). Белок G1, его аналоги, фрагменты или производные также могут быть использованы для выделения, идентификации и клонирования других белков того же типа, т.е. тех, которые связываются с внутриклеточным доменом рецептора FAS-R или с функционально родственными рецепторами, или тех, которые связываются с вышеописанными MORT1-связывающимися белками, или тех, которые связываются с белком MORT-1 и тем самым связываются с функционально родственными рецепторами,такими, как FAS-R и p55-R, и, соответственно,вовлечены во внутриклеточные сигнальные процессы. В этом случае может быть использована вышеназванная система дигибридного дрожжевого скрининга, или может быть использована недавно разработанная система блотгибридизации по Саузерну с последующим ПЦРклонированием в нежестких условиях (Wilks etal., 1989). В этой публикации были описаны идентификация и клонирование двух потенциальных протеинтирозинкиназ с применением Саузерн-блот-гибридизации в нежестких усло 003269 46 виях с последующим ПЦР-клонированием, основывающемся на известной последовательности основного киназного мотива. Такой подход может быть использован в соответствии с настоящим изобретением с использованием последовательности белка G1 при идентификации и клонировании тех белков, которые родственны MORT1-связывающимися белкам. 4). Еще одним подходом к использованию белка G1 или его аналогов, фрагментов или производных по настоящему изобретению является использование их в аффинной хроматографии с целью выделения и идентификации других белков или факторов, с которыми они могут связываться, например, белка MORT-1, MORT1 связывающихся белков или иных белков или факторов, вовлеченных во внутриклеточные сигнальные процессы. В случае такого применения белок G1, его аналоги, фрагменты или производные по настоящему изобретению могут быть по отдельности присоединены к матриксам для аффинной хроматографии и затем подвергнуты контакту с клеточными экстрактами или изолированными белками или факторами, которые предположительно участвуют во внутриклеточных сигнальных процессах. По окончании процедуры аффинной хроматографии другие белки или факторы, которые оказались связанными с белком G1 или с его аналогами,фрагментами или производными по настоящему изобретению, могут быть элюированы, выделены и охарактеризованы. 5). Как отмечалось выше, белок G1 или его аналоги, фрагменты или производные по настоящему изобретению могут также быть использованы в качестве антигенов (иммуногенов) с целью выработки специфичных к ним антител. Эти антитела также могут быть использованы для целей очистки данного белка G1 (например,собственно G1 или любой из его изоформ) как из клеточных экстрактов, так и из линий трансформированных клеток, вырабатывающих белокG1 или его аналоги или фрагменты. Кроме того,эти антитела могут быть использованы для диагностических целей для идентификации расстройств, связанных с аномальным функционированием систем лиганда FAS-R или TNF, например, избыточного или недостаточного клеточного влияния, индуцируемого лигандомFAS-R или TNF. Таким образом, при том, что такие заболевания связаны с нарушением функционирования системы внутриклеточных сигнальных механизмов, вовлекающей белокMORT-1 или какие-либо другие, например, вышеназывавшиеся MORT1-связывающиеся белки или собственно белок G1, то такие антитела будут служить важным диагностическим средством. Также необходимо отметить, что выделение, идентификация и охарактеризование белкаG1 по настоящему изобретению может быть осуществлено с использованием любой из из 47 вестных стандартных процедур скрининга. Например, в качестве одной из таких процедур скрининга дигибридный дрожжевой тест, описанный в данном тексте, был использован для идентификации белка MORT-1 и в дальнейшем различных MORT1-связывающихся белков и белка G1 по настоящему изобретению. Также,как описано выше и будет описано далее, могут быть применены и другие подходы, такие как аффинная хроматография, методики гибридизации ДНК и т.п., которые хорошо известны в данной области техники в связи с выделением,идентификацией и охарактеризованием белкаG1 по настоящему изобретению или с выделением, идентификацией и охарактеризованием других белков, факторов, рецепторов и подобного, которые способны связываться с белкомG1 по настоящему изобретению. Как уже указывалось выше, белок G1 может быть использован для выработки антител,специфичных в отношении белков G1, например, в отношении G1 и его изоформ. Эти антитела или их фрагменты могут быть использованы так, как это подробнее будет описано ниже,и должно быть понятно, что в таких случаях эти антитела или их фрагменты, те, которые специфичны в отношении белков G1. Основываясь на данных настоящего изобретения о том, что, по крайней мере, некоторые из белков G1 или их возможные изоформы являются протеазами, сходными с протеазами семейства CED3/ICE, для этих белков G1 и их изоформ представляется следующее специальное медицинское применение: было обнаружено, что уже существуют специфические ингибиторы других протеаз CED3/ICE, которые способны проникать в клетку и могут эффективно блокировать запрограммированную гибель клеток. Следовательно, в соответствии с настоящим изобретением является возможным сформировать такие ингибиторы, которые смогут предотвращать гибель клеток, индуцируемую лигандом FAS-R или TNF, т.е. тот механизм, в котором принимает участие протеаза G1. Далее,с точки зрения уникальных параметров последовательностей этих новых протеаз G1, представляется возможным конструировать такие ингибиторы, которые были бы высокоспецифичными в отношения влияния TNF и лигандаFAS-R на клетки. Данные настоящего изобретения также представляют путь изучения механизма, в котором "уничтожающая клетки протеаза" активируется в ответ на лиганд FAS-R иTNF: соответственно, это позволяет разрабатывать лекарственные препараты, которые смогли бы контролировать степень такой активации. Существует достаточно много заболеваний, при лечении которых такие лекарства могли бы оказать значительную помощь. Среди таких заболеваний - острый гепатит, при котором острые поражения ткани печени, по-видимому, отражают гибель печеночных клеток, опосредован 003269 48 ную лигандом рецептора FAS-R; индуцируемая аутоиммунным ответом гибель клеток, такая как гибель -клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, приводящая к диабету; гибель клеток в ходе отторжения пересаженной ткани (например, почек, сердца и печени); гибель олигодендроцитов головного мозга при рассеянном склерозе; и подавляемая при СПИДе самогибель Т-лимфоцитов, в результате чего обеспечивается размножение вируса СПИДа и, следовательно, развитие собственно СПИДа. Как было отмечено выше, вполне возможно, что G1 или одна или большее число его возможных изоформ (например, изоформа G1) может служить в качестве "естественного" ингибитора протеазы G1 или изоформ протеазыG1, и это также можно использовать так, как было выше отмечено для специфических ингибиторов таких протеаз G1. Также другие соединения, такие как пептиды, органические соединения, антитела и т.п., могут быть подвергнуты скринингу с целью получения специфических лекарственных средств, способных ингибировать протеазы G1. Не ограничивающий такого применения пример того, как пептидные ингибиторы протеаз G1 могли бы быть получены и скринированы,основывается на ранее проведнных исследованиях пептидных ингибиторов протеазы ICE илиICE-подобных протеаз, субстратной специфичности ICE и стратегий анализа эпитопов с использованием синтеза пептидов. Минимальным условием для эффективного расщепления пептида протеазой ICE, как было установлено, является наличие четырх аминокислот влево от сайта расщепления при жeстком предпочтении наличия остатка аспарагиновой кислоты в положении P1 и достаточности наличия метиламина справа от остатка P1 (Sleath et al., 1990; Howard et al., 1991; Thornberry et al., 1992). Более того, было установлено, что флуорогенный пептидный субстрат (являющийся тетрапептидом) ацетил-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-метилкумарил-7 амид) - сокращeнно Ac-DEVD-AMC, - соответствующий последовательности АДФ-рибозополимеразы (PARP), расщепляется в клетках через короткое время после стимуляции рецептораFAS-R, равно как и других апоптотических процессов (Kaufmann, 1989; Kaufmann et al., 1993;Lazebnik et al., 1994), и эффективно расщепляется протеазой СРР 32 (являющейся членом семейства протеаз CED3/ICE) и протеазами МАСН (а также, вероятно, протеазами G1). С учeтом важности наличия остатка Asp в положении Р 1 в составе субстрата, тетрапептиды, имеющие аспарагиновую кислоту в четвртом положении и различное сочетание аминокислот в первых трх положениях, могут быть быстро скринированы по связыванию с активным сайтом протеаз G1 с использованием, на 49 пример, метода, разработанного Гейзеном (Geysen, 1985; Geysen et al., 1987), в котором большое число пептидов, прикреплнных на тврдом носителе, скринируют на специфические взаимодействия с антителами. Связывание протеаз МАСН со специфическими пептидами может быть выявлено с помощью различных хорошо известных специалистам в данной области техники методов, таких как изотопное мечение протеаз G1 и т.п. Было показано, что с применением этого метода по Гейзену можно протестировать, по крайней мере, 4000 пептидов за один рабочий день. Поскольку определeнные преимущества может иметь конструирование пептидных ингибиторов, которые избирательно подавляют протеазы G1 без каких-либо помех физиологическим процессам, связанным с гибелью клеток, в которых участвуют другие члены семейства протеаз CED3/ICE, пул пептидов, связывающихся с протеазами G1, для анализа в таком тесте, который был описан выше, может быть синтезирован в дальнейшем в виде флуорогенного пептидного субстрата, предназначенного для тестирования избирательного расщепления протеазами G1 при отсутствии расщепления другими протеазами семейства CED3/ICE. Пептиды, для которых определено избирательное расщепление протеазами G1, могут затем быть модифицированы с целью усиления внутриклеточной проницаемости и ингибирующей активности в отношении G1-опосредуемой гибели клеток, как в обратимом, так и в необратимом режиме действия. Торнберри с соавт. (Thornberry et al., 1994) сообщили, что тетрапептид(ацилокси)метилкетон Ас-Туr-Val-Ala-AspCH2OC (О)-[2,6-(СF3)2] Рh является сильным инактиватором протеазы ICE. Сходным образом Миллиген с соавт. (Milligan et al., 1995) сообщили, что тетрапептидные ингибиторы, включающие хлорметилкетоновую или альдегидную группы, соответственно, необратимо и обратимо ингибируют протеазу ICE. Кроме того, было показано ингибирование ICE бензилоксикарбоксил-Аsр-СН 2 ОС(О)-2,6-дихлорбензолом(DCB) (Mashima et al., 1995). Соответственно тетрапептиды, избирательно связывающиеся с протеазами G1, могут быть модифицированы с использованием, например, альдегидной группы, хлорметилкетоновой, (ацилокси)метилкетоновой или СН 2OС(О)-DCB-групп при решении задачи создания пептидного ингибитора активности протеазы G1. Поскольку некоторые специфические ингибиторы других протеаз семейства CED3/ICE характеризуются внутриклеточной проницаемостью, то внутриклеточная проницаемость пептидных ингибиторов нуждается в усилении. Например, пептиды могут быть модифицированы или превращены в свои производные химическим путeм с целью усиления их проницаемости через клеточную мембрану и облегчения 50 транспортировки таких пептидов через мембрану в цитоплазму. Мураниши с соавт. (Muranishiet al., 1991) сообщили о получении производного тиротропинового рилизинг-гормона с использованием лауриновой кислоты с образованием липофильного лауроильного производного, обладавшего хорошими характеристиками прохождения через клеточные мембраны. Закария с соавт. (Zacharia et al., 1991) также сообщили, что окисление метионина в сульфоксид и замещение пептидной связи его кетометиленовым изоэфиром (СОСН 2) приводит к облегчению транспорта пептида через клеточную мембрану. Имеется ряд модификаций производных,которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Кроме того, лекарство или пептидные ингибиторы, которые способны подавлять активность G1 в отношении гибели клеток, или их возможные изоформы могут быть соединены или включены в комплексы вкупе с молекулами, которые обеспечат более лгкое проникновение внутрь клетки. Патент США 5149782 представляет соединение молекулы, предназначенной для транспортировки через клеточную мембрану, с мембрано-сочетающимся агентом, таким как слитогенные полипептиды, полипептиды, образующие ионные каналы, другие мембранные полипептиды и жирные кислоты с длинной цепью,например, миристиновая кислота и пальмитиновая кислота. Эти сочетающиеся с мембраной агенты встраивают молекулярный конъюгат внутрь липидного бислоя плазмалеммы и облегчают его проникновение в цитоплазму. Лоу с соавт. (Low et al.) в патенте США 5108921 рассматривают приемлемые способы трансмембранной доставки молекул, таких как(не ограничиваясь этим) белки и нуклеиновые кислоты, основанные на механизме опосредованной рецепторами эндоцитозной активности. Эти рецепторные системы являются системами,распознающими галактозу, маннозу, маннозо-6 фосфат, трансферрин, асиалогликопротеин,транскобаламин (витамин B12), -2-макроглобулины, инсулин и другие пептидные факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (EGF). Лоу с соавт. указывает, что пищевые рецепторы, такие как рецепторы биотина и фолатов, могут преимущественно использоваться для интенсификации транспорта через клеточную мембрану, благодаря особенностям локализации и многочисленности биотиновых и фолатных рецепторов на поверхности большинства клеток и связанных с этими рецепторами процессами трансмембранного транспорта. Таким образом, комплекс, образованный соединением, предназначаемым для транспортировки в цитоплазму, и лигандом, таким как биотин или фолат, контактируют с клеточной мембраной,несущей биотиновые или фолатные рецепторы с целью инициации механизма трансмембранного 51 транспорта, опосредованного этими рецепторами, тем самым обеспечивая вхождения желательного соединения в клетку. Для протеазы ICE известна способность к толерантности по отношению к свободному замещению по положению Р 2, и такая толерантность к свободным замещениям была использована при разработке эффективной, высокоизбирательной аффинной метки, содержащей биотин(Thornberry et al., 1994). Соответственно, положение P2, равно как и, по-видимому, N-конец тетрапептидного ингибитора могут быть модифицированы или использованы для получения производных соединений, например, путeм присоединения молекулы биотина, с целью усиления проницаемости этих пептидных ингибиторов через клеточную мембрану. Кроме того, в данной области техники известно, что слияние желательной пептидной последовательности с сигнальной (лидерной) пептидной последовательностью с получением"химерного полипептида" может быть использовано для транспортировки такого "химерного полипептида" через клеточную мембрану в цитоплазму этой клетки. Как должно быть хорошо понятно специалистам, изучающим пептиды, подразумевается,что пептидные ингибиторы протеолитической активности в соответствии с настоящим изобретением должны включать пептидомиметические лекарственные средства или ингибиторы, которые могут быть подвергнуты быстрому скринингу по связыванию с протеазой G1 с целью получения по возможности наиболее стабильных ингибиторов. Также должно быть понятно, что такие же способы облегчения или усиления транспорта пептидных ингибиторов через клеточные мембраны, которые обсуждались выше, также применимы в отношении самого белка G1 или самих его изоформ, равно как и других белков и пептидов, которые проявляют сво влияние внутри клеток. Что касается антител, упоминаемых на протяжении настоящего текста, термин "антитело" включает в себя поликлональные антитела,моноклональные антитела (mAbs), химерные антитела, антиидиопатические (анти-Id) антитела к антителам, которые могут быть помечены в растворимой или связанной форме, равно как и их фрагменты, полученные любым из известных методов, таких как (не ограничиваясь этим) ферментное расщепление, пептидный синтез или рекомбинантные технологии. Поликлональные антитела - это гетерогенные популяции молекул антител, выделенных из сыворотки животных, иммунизованных какимлибо антигеном. Моноклональное антитело включает, по существу, гомогенную популяцию антител, специфичных в отношении антигенов,при том, что эти популяции включают, по существу, сходные эпитопы сайтов связывания. Мо 003269 52 ноклональные антитела могут быть получены с использованием методов, известных специалистам в данной области техники: см., например,KohlerMilstein, 1975, Nature, 256, 495-497; патент США 4376110; Ausubel et al., eds. HarlowLane 1988, Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab. и Colligan et al., CurrentProtocols in Immunology, eds. Greene Publ. Assoc.Wiley Interscience, NY (1992-96), полное содержание которых привлечено в данном тексте в виде ссылок. Такие антитела могут принадлежать к любому классу иммуноглобулинов - IgG,IgM, IgE, IgA, GILD - и любому их подклассу. Гибридомы, вырабатывающие моноклональные антитела по настоящему изобретению, могут культивироваться in vitro, in situ или in vivo. Получение высоких титров моноклональных антител in vitro или in situ делает такой подход более предпочтительным для их получения. Химерные антитела являются молекулами,в составе которых различные части происходят от разных видов животных, например, такие как антитела, включающие вариабельные домены,выделенные из моноклональных антител мыши,и константные домены иммуноглобулинов человека. Химерные антитела, в первую очередь,используются для снижения иммуногенности при их применении и для увеличения выхода продукта, например, когда мышиные моноклональные антитела характеризуются более высоким выходом из гибридов, но более высокой иммуногенностыо в клетках человека, поэтому химерные "человеко-мышиные" моноклональные антитела и могут быть использованы. Химерные антитела и способы их получения хорошо известны в науке: Cabilly et al., 1984, Proc.Cabilly et al., заявка на европейский патент 125023 (опубликована 14 ноября 1984 г.); Neuberger et al., 1985, Nature, 314, 268-270; Taniguchiet al., заявка на европейский патент 171496al., заявка на европейский патент 173494(опубликована 5 марта 1986 г.); Neuberger et al.,заявка РСТ WO 8601533 (опубликована 13 марта 1986 г.); Kudo et al., заявка на европейский патент 184187 (опубликована 11 июня 1986 г.); Sahagan et al., 1986, J. Immunol, 137, 10661074; Robinson et al., заявка на международный патент WO 8702671 (опубликована 7 мая 1987 г.); Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,3439-3443; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 84, 214-218; Better et al., 1988, Science, 240: 1041-1043; и HarlowLane, Antibodies: A Laboratory Manual, цитировано выше. Эти работы полностью включены в данный текст в виде ссылок. Антиидиотипическое (анти-Id) антитело это антитело, которое распознат уникальные детерминанты, в принципе связанные с антиген 53 связывающим сайтом антитела. Антиидиотипическое антитело может быть приготовлено путeм иммунизации животного того же вида и генетического типа (например, инбредной линии мышей) в качестве источника моноклонального антитела, по отношению к которому получают антиидиотипическое антитело. Иммунизованное животное должно распознавать и реагировать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела путм выработки антитела по отношению к этим идиотипическим детерминантам (анти-Id антитело). См., например, патент США 4699880, который включeн в виде ссылки. Антиидиотипическое антитело также может быть получено в виде "иммуногена" с целью индукции иммунного ответа ещe в одном животном,вырабатывающем т.н. антиантиидиотипическое антитело. Антиантиидиотипическое антитело может быть по параметрам эпитопа идентичным исходному моноклональному антителу, которое индуцировало анти-Id. Таким образом, с помощью использования антител к идиотипическим детерминантам моноклонального антитела возможным является идентифицировать другие клоны,экспрессирующие антитела, которые обладают идентичной специфичностью. Соответственно, моноклональные антитела, сформированные к белкам G1, их аналогам,фрагментам или производным по настоящему изобретению, могут быть использованы для индукции антиидиотипических антител в подходящих животных, таких как мыши линииBALB/c. Клетки селезeнки таких иммунизованных мышей используют для получения анти-Id гибридом, секретирующих антиидиотипические моноклональные антитела. Далее, антиидиотипические моноклональные антитела могут быть соединены с носителем, таким как гемоцианин слизня (KLH), и использованы для иммунизации новых мышей линии BALB/c. Сыворотка этих мышей будет содержать анти-антиидиотипические антитела, которые обладают свойствами связываться с исходным моноклональным антителом, специфичным в отношении эпитопа вышеописанного белка G1 или его аналогов,фрагментов или производных. Антиидиотипические моноклональные антитела, таким образом, обладают своими собственными идиотипическими эпитопами, т.е."идиотопами", сходными по структуре с эпитопом, который оценивали, таким как GRB белка-а. Термин "антитело" также обозначает как интактные молекулы, так и их фрагменты, такие как, например, Fab и F(ab')2, которые способны связываться с антигеном. Фрагменты Fab иF(ab')2 лишены Fc-домена интактного антитела,легче освобождаются из циркуляции и могут обладать меньшим уровнем неспецифического тканевого связывания в сравнении с интактным 54 антителом (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med., 24,316-325). Должно быть понятно, что Fab и F(ab')2 и другие фрагменты антител, применимые по настоящему изобретению, могут быть использованы для выявления и количественнного анализа белка G1 в соответствии со способами, описанными здесь для интактных молекул антител. Такие фрагменты обычно получают путeм протеолитического расщепления, используя такие ферменты, как папаин (при получении фрагментов Fab) или пепсин (при получении фрагментовF(ab')2). Если говорится, что антитело "способно к связыванию", то это означает способность специфически реагировать с молекулой таким образом, что происходит связывание этой молекулы с антителом. Термин "эпитоп" обозначает ту часть любой молекулы, которая может быть связана антителом и которая также может распознаваться этим антителом. Эпитопы или "антигенные детерминанты" обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками,равно как и специфическими параметрами заряда."Антиген" - это молекула или часть молекулы, способная быть связанной с антителом и к тому же способная индуцировать у животного выработку антитела, способного связываться с эпитопом этого антигена. Антиген может иметь или один, или большее число эпитопов. Специфическая реакция, упоминавшаяся выше, обозначает, что антиген будет реагировать при соблюдении высокого уровня избирательности с соответствующим ему антителом и с одним из множества других антител, которые могут связываться другими антигенами. Антитела, включая фрагменты антител,применимые по настоящему изобретению, могут быть использованы для качественного и количественного иного выявления белка G1 в пробе или для выявления присутствия клеток,которые экспрессируют белок G1 по настоящему изобретению. Это может сопровождаться иммунофлуоресцентными методиками, использующими помеченное флуоресцентным образом антитело (см. ниже), сопряжнное с применением световой микроскопии, проточной цитометрии или флуорометрии для такого выявления. Антитела (или их фрагменты), применимые по настоящему изобретению, могут быть использованы на гистологическом уровне с применением иммунофлуоресцентного или иммуноэлектронного микроскопов для выявленияin situ белка G1 по настоящему изобретению. Выявление in situ может сопровождаться выделением гистологического образца у пациента и переноса помеченного флуоресцентным способом антитела на такой образец. Предпочтителен 55 перенос антитела (или фрагмента) путeм внесения помеченного антитела (или фрагмента) в биологический образец. Путeм использования такой процедуры становится возможным определить не только присутствие белка G1, но и оценить его распределение в исследуемой ткани. С использованием настоящего изобретения специалисты в данной области техники могут легко понять, что любой из большой группы гистологических методов (таких как методики окрашивания тканей) могут быть модифицированы с целью проведения подобного выявленияin situ. Такие тесты на выявление белка G1 по настоящему изобретению обычно включают инкубацию биологического образца, такого как биологическая жидкость, тканевый экстракт, свежеполученные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые инкубировались в тканевой культуре, в присутствие маркируемого помеченного антитела, способного идентифицировать белок G1 и выявление антитела любым из ряда методов, хорошо известных в данной области техники. Биологический образец может быть обработан с помощью твердой подложки или носителем, таким как нитроцеллюлоза, или иной твeрдой подложкой или носителем, которые способны иммобилизовать клетки, клеточные частицы или растворимые белки. Подложка или носитель могут затем быть промыты подходящими буферами с последующей обработкой выявляемым помеченным антителом в соответствии с настоящим изобретением, так, как это было описано выше. Твeрдофазная подложка или носитель могут затем быть промыты буфером во второй раз с целью удаления несвязавшегося антитела. Количество связанной метки на упомянутых тврдой подложке или носителе может быть затем определено с помощью стандартных методик. Под"носителем" понимаются любые подложки или носители, способные связывать антиген или антитела. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирен, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон-амилазы,естественные и синтетические целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит. Природа носителя может быть или частично растворимой,или он может быть нерастворимым, исходя из целей настоящего изобретения. Материал подложки визуально может иметь любую возможную структурную конфигурацию до тех пор,пока присоединнная молекула способна связывать антиген или антитело. Таким образом,конфигурация подложки или носителя может быть сферической, шарообразной, цилиндрической, как внутренняя поверхность тестпробирки или внешняя поверхность палочки. С 56 другой стороны, поверхность может быть плоской, такой как у пластинки, тест-ленты и т.п. Предпочтительными подложками или носителями являются полистиреновые гранулы (шарики). Специалисты в данной области техники могут подобрать другие подходящие носители для связывания антигена или антитела, или же могут это установить с помощью рутинных экспериментов. Активность по связыванию данного набора антител, в соответствии с вышеизложенным в настоящем изобретении, может быть определена с использованием хорошо известных методов. Специалисты в данной области техники могут определить условия проведения быстрых и оптимальных тестов для каждого из определений, исходя из проведения рутинных экспериментов. Другие этапы, такие как промывка, перемешивание, встряхивание, фильтрование и подобное может быть добавлено в тесты так, как рекомендуется производителями или требуется конкретной ситуацией. Одним из способов, которым антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть помечены, является соединение антитела с ферментом с использованием в ферментативном иммунотестировании (EIA). Этот фермент, в свою очередь, когда впоследствии подвергается воздействию соответствующего субстрата, будет реагировать с этим субстратом таким образом, чтобы образовывать химический компонент, который может быть выявлен, например,спектрофотометрически, флуорометрически или визуально. Ферменты, которые могут быть использованы для выявления помеченных антител, включают, не ограничиваясь этим, малатдегидрогеназу, нуклеазу стафилококка, изомеразу 5-стероидов, алкогольдегидрогеназу дрожжей,-глицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу редьки, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу,глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Выявление может сопровождаться колориметрическим методом,который основан на использовании субстрата,хромогенного для данного фермента. Выявление также может сопровождаться визуальным сравнением степени ферментной реакции субстрата в сравнении со стандартами, приготовленными аналогичным образом. Выявление может сопровождаться использованием любого из ряда других иммунотестов. Например, путм применения изотопного мечения антител или фрагментов антител становится возможным выявлять R-РТРазу с применениемRIA (радиоиммуноанализа). Качественное описание метода RIA можно найти в руководствеHolland Publ. Co., NY) с конкретным вниманием к разделу, озаглавленному "Введение в радиоиммунный анализ и сходные методики", написанному Т. Чардом (Т. Chard), включенному здесь в виде ссылки. Радиоактивные изотопы могут быть выявлены такими способами, как использование счетчика Гейгера или сцинтилляционного счeтчика, или с помощью авторадиографического анализа. Также возможным является пометить антитело в соответствии с настоящим изобретением с помощью флуоресцентного соединения. Когда помеченное флуоресцентным способом антитело подвергают воздействию света с подходящей длиной волны, его присутствие может быть выявлено по флуоресценции. Среди наиболее часто используемых для мечения флуоресцентных соединений - флуоресцеинизотиоцианат, родамин, фикоэритрин, пикоцианин,аллоцикоцианин, о-фтальдегид и флуорескамин. Антитело также может быть выявлено путeм мечения с использованием флуоресцирующих металлов-эмитентов, таких как 152Eu или других из группы лантаноидов. Эти металлы могут быть присоединены к антителу с использованием таких хелатируюших металлы групп, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ЕТРА). Антитело также может быть получено путем его соединения с хемолюминисцентным веществом. Затем присутствие помеченного по хемолюминисцентному типу антитела определяют путeм выявления наличия люминисценции, которая возникает в процессе прохождения химической реакции. Примерами конкретно применяемых для мечения хемолюминисцирующих соединений являются, люминол, изолюминол, тероматический акридиновый эфир,имидазол, акридиновая соль и щавелевый эфир. Также для мечения антитела по настоящему изобретению могут быть использованы биолюминисцентные соединения. Биолюминисценция является вариантом хемолюминисценции,обнаруживаемым в биологических системах, в которых обладающий каталитической активностью белок повышает эффективность хемолюминисцентной реакции. Присутствие биолюминисцентного белка определяют по выявлению наличия люминисценции. Важными биолюминицентными соединениями для целей мечения являются люциферин, люцифераза и экворин. Молекула антитела по настоящему изобретению может быть адаптирована для использования в иммунометрическом тестировании,также известном как "двухсайтовое" или "сэндвич"-тестирование. В типичном иммунометрическом тесте некоторое количество непомеченного антитела (или фрагмента антитела) связывают с твeрдой подложкой или носителем и некоторое количество помеченного растворимого антитела добавляют таким образом, чтобы было возможно выявлять и(или) количественно оце 003269 58 нивать тройной комплекс между антителом на тврдой фазе, антигеном и помеченным антителом. Обычно и предпочтительно иммунометрические тесты включают "форвард"тесты, в которых антитело, связанное с твeрдой фазой, в первую очередь, контактирует с тестируемым образцом с целью выделения антигена из образца и образования бинарного комплекса "антигенантитело" в твeрдой фазе. После подходящего периода инкубации тврдую подложку или носитель промывают с целью удаления остатка жидкой пробы, включая непрореагировавший антиген, если он остался, и затем контактируют с раствором, содержащим неизвестное количество помеченного антитела (которое функционирует в качестве "репортерной молекулы"). После периода второй инкубации, необходимой для формирования комплекса помеченного антитела и антигена, связанного с тврдой подложкой или носителем через непомеченное антитело, тврдую подложку или носитель промывают во второй раз с целью удаления непрореагировавшего помеченного антитела. Другой тип "сэндвич"-метода, который также может быть использован с антигенами по настоящему изобретению, - это применение так называемых "одновременных" и "обратных" тестов. "Одновременный" тест включает однократный этап инкубации, в котором и антитело,связанное с тврдой подложкой или носителем,и помеченное антитело добавляют к тестируемому образцу в одно и то же время. После завершения инкубации твeрдую подложку или носитель промывают с целью удаления остатка жидкого образца и не вошедшего в состав комплекса помеченного антитела. Присутствие помеченного антитела, связанного с твeрдой подложкой или носителем, затем определяют так,как это осуществляется в стандартном "форвард-сэндвич"-тесте. В "обратном" тесте используется постепенное добавление сначала раствора помеченного антитела к жидкому образцу с последующим добавлением непомеченного антитела, связанного с твeрдой подложкой или носителем после подходящего периода инкубации. После второй инкубации твeрдую подложку промывают стандартным образом до освобождения еe от остатков тестируемого образца и раствора непрореагировавшего помеченного антитела. Определение помеченного антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, затем осуществляют так же, как и в "одновременном" и"форвард"-тестах. Белки G1 по настоящему изобретению могут быть получены с применением любой из существующих стандартных процедур рекомбинантной ДНК (см., например, Sambrook et al.,1989 и Ausubel et al., 1987-95, цитировано выше), в которых подходящие эукариотические и прокариотические клетки-хозяева, хорошо из 59 вестные в данной области техники, трансформируют с использованием подходящих эукариотических и прокариотических векторов, включающих последовательности, кодирующие данные белки. Соответственно, настоящее изобретение также касается таких экспрессирующих векторов и трансформированных организмовхозяев, предназначенных для выработки этих белков по настоящему изобретению. Как отмечалось выше, эти белки также включают их активные аналоги, фрагменты и производные, и таким образом векторы, кодирующие их, также включают векторы, кодирующие аналоги и фрагменты этих белков, а трансформированные организмы-хозяева включают такие, которые вырабатывают эти аналоги и фрагменты. Производные этих белков, вырабатываемые такими трансформированными организмами-хозяевами,являются производными, полученными путeм стандартной модификации этих белков или их аналогов или фрагментов. Настоящее изобретение также касается фармацевтических композиций, включающих рекомбинантные векторы на основе вирусов животных, кодирующие белки G1, так, что такой вектор также кодирует поверхностный вирусный антиген, способный связываться на специфической клетке-мишени (например, на опухолевых клетках) с поверхностными белками с целью направления внесения последовательностей белков G1 внутрь клеток. Дополнительно фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают в качестве активного компонента (а) олигонуклеотидную последовательность, кодирующую антисмысловую последовательность по отношению к последовательности, кодирующей белок G1, или (b) лекарства,которые блокируют протеолитическую активность белка G1 или его изоформ. Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением включают количество активного компонента, достаточное для достижения поставленной перед ним цели. Дополнительно фармацевтические композиции могут включать подходящие, фармацевтические приемлемые носители, включающие наполнители и подходящие компоненты, которые облегчают процессинг активных компонентов в составе препаратов, которые могут быть использованы фармацевтическими способами и которые могут стабилизировать такие препараты,предназначенные для введения пациентам, которые в них нуждаются, в соответствии с хорошо известными специалистам в данной области техники приeмами. Белок G1 и его изоформы или изотипы, как предполагается, должны экспрессироваться в различных тканях на отчтливо неодинаковом уровне и, по-видимому, при различных параметрах изотипов аналогично экспрессии белка МАСН и его различных изотипов, как это описано в упомянутых выше совместных, находя 003269 60 щихся на стадии рассмотрения заявках. Эти различия могут, по-видимому, обусловливать тканеспецифичные параметры ответа на лигандet al., 1995), заявители ранее уже показали (в соответствии с вышеупоминавшимися патентными заявками), что у изоформ МАСН, которые включают неполные сегменты гомологии сCED3/ICE (например, МАСН 3), обнаруживается эффект ингибирования активности одновременно экспрессирующихся молекул MACH и МАСН 2; для них тоже было установлено блокирование индукции гибели с участиемFAS/AP01 и p55-R. Экспресия таких ингибиторных изоформ в клетках может определять механизм клеточной самозащиты от цитотоксичности, опосредуемой FAS/AP01 и TNF. Аналогичный ингибиторный эффект также предполагается, по крайней мере, у одной из изоформ белкаG1. Высокий уровень гетерогенности изоформ МАСН и также предполагаемая аналогичная гетерогенность изоформ G1, которая по уровню существенно превосходит гетерогенность изоформ любых других протеаз семействаCED3/ICE, должны позволять осуществление тонкой настройки функций активных изоформ МАСН, а по аналогии также и у активных изоформ G1 в соответствии с настоящим изобретением. Также возможным является то, что некоторые из вероятных изоформ G1 проявляют иные функции. Например, ранее обнаруженная заявителями (что отмечалось выше), способность MACH1 связываться и с MORT-1, иMACH1 подтверждает, что эта изоформа может действительно усиливать активность каталитически активных изоформ. Средняя цитотоксичность, наблюдаемая в культурах линий 293-EBNA и MCF7, трансфицированных этой изоформой, и более существенный цитотоксический эффект, который проявляется в клеткахHeLa, по-видимому отражает активацию эндогенно экспрессируемых молекул МАСН по связыванию с трансфицированными молекулами MACH1. Возможно, некоторые из изоформ МАСН также могут действовать как "депосайты" для молекул, которые участвуют в других, не связанных с цитотоксичностью, проявлениях рецепторов FAS/AP01 и TNF. Следовательно, аналогичным образом белок-G1 и(или) его изоформы также могут обладать такой же усиливающей активностью или служить в качестве "депо-сайтов" для других таких молекул. Благодаря уникальной способности рецепторов FAS/AP01 и TNF обусловливать гибель клеток, равно как и способности рецепторовTNF опосредовать другие типы активности, связанные с повреждениями тканей, нарушения функций этих рецепторов могут быть отрицательными для организма. Тем не менее, и для