Биологически активные белки, имеющие повышенную стабильность in vivo и/или in vitro

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ БЕЛКИ, ИМЕЮЩИЕ ПОВЫШЕННУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ IN VIVO И/ИЛИ IN VITRO Изобретение относится к биологически активным белкам, содержащим по меньшей мере два домена, где первый домен из указанных по меньшей мере двух доменов содержит аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую указанную биологическую активность, и второй домен из указанных по меньшей мере двух доменов содержит аминокислотную последовательность, состоящую предпочтительно по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков, образующих конформацию случайного клубка, посредством чего указанная конформация случайного клубка опосредует повышенную стабильность указанного биологически активного белка in vivo и/или in vitro. Далее, раскрыты молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие биологически активные белки по изобретению, векторы и клетки, содержащие указанные молекулы нуклеиновых кислот. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены композиции, содержащие соединения по изобретению, а также конкретные применения биологически активных белков, молекул нуклеиновых кислот, векторов и клеток по изобретению. Настоящее изобретение относится к биологически активным белкам, содержащим по меньшей мере два домена, где первый домен по меньшей мере из двух указанных доменов содержит аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую указанную биологическую активность, и второй домен по меньшей мере из двух указанных доменов содержит аминокислотную последовательность,предпочтительно состоящую по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков, образующих конформацию случайного клубка, посредством чего указанная конформация случайного клубка опосредует повышенную стабильность указанного биологически активного белка in vivo и/или in vitro. Кроме того, раскрыты молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие биологически активные белки по изобретению, а также векторы и клетки, содержащие указанные молекулы нуклеиновых кислот. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены композиции, содержащие соединения по изобретению, а также конкретные применения биологически активных белков, молекул нуклеиновых кислот, векторов и клеток по изобретению. Обычные белки плазмы, такие как человеческий сывороточный альбумин (HSA) и иммуноглобулины (Ig), включая гуманизированные антитела, показывают длительные периоды полувыведения, типично от 2 до 3 недель, которые приписывают их специфичному взаимодействию с неонатальным рецепторомFc (FcRn), что приводит к эндосомному рециклингу (Ghetie (2002), Immunol. Res., 25:97-113). Напротив,большинство других белков, представляющих фармацевтический интерес, конкретно фрагменты рекомбинантных антител, гормоны, интерфероны и т.д., страдают от быстрого клиренса (из крови). Это особенно верно для белков, размер которых находится ниже порогового значения для почечной фильтрации,составляющего примерно 70 кДа (Caliceti (2003), Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:1261-1277). В этих случаях периоды полувыведения немодифицированного фармацевтического белка в плазме могут быть значительно меньше 1 ч, делая его, таким образом, по существу, бесполезным для большинства терапевтических применений. Для того чтобы добиться длительного фармакологического действия и также улучшенного соблюдения пациентом схемы и режима лечения с требующимися интервалами между приемами лекарственного средства, продленными до нескольких дней или даже недель, ранее создали несколько стратегий для целей разработки биофармацевтических лекарственных средств. Во-первых, применяли механизм рециклинга природных белков плазмы путем получения слитых белков с Fc частью Ig, например Enbrel гибрид между внеклеточным доменом рецептора TNF и человеческим IgG1 (Goldenberg (1999), Clin. Ther. 21:75-87), или с сывороточным альбумином, напримерAlbuferon, соответствующее слияние IFN с HSA (Osborn (2002), J. Pharmacol. Exp. Ther. 303:540-548). Альбумин с его высокой концентрацией в плазме, составляющей 600 мкМ, также использовали не прямо,когда он служил в качестве носителя для биофармацевтических агентов, наделенных альбуминсвязывающей функциональной группой, например посредством слияния с бактериальным альбуминсвязывающим доменом (ABD) из белка G стрептококков (Makrides (1996), J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:534-542) или с пептидом против HSA, отобранным из библиотеки фагового дисплея (Dennis (2002). J. Biol. Chem. 277:35035-35043; Nguyen (2006). Protein Eng. De. Sel. 19:291-297). Во-вторых, фундаментально другой методологией продления периода полувыведения биофармацевтических агентов в плазме является конъюгирование с высокосольватированными и физиологически инертными химическими полимерами, таким образом эффективно увеличивая гидродинамический радиус терапевтического белка за пределы размера гломерулярных пор, составляющего примерно 3-5 нм(PEG) при биохимически мягких условиях, либо случайным образом через боковые цепи Lys (Clark(1996), J. Biol. Chem. 271:21969-21977), либо посредством специфически введенных остатков Cys(Rosendahl (2005), BioProcess International. 52-60) было умеренно успешным и применяется в настоящее время в нескольких одобренных лекарственных средствах. Соответствующих преимуществ добивались особенно при конъюгировании с маленькими белками, обладающими специфической фармакологической активностью, например Pegasys, химически пегилированный рекомбинантный IFN-2a (Harris(2003), Nat. Rev. Drug. Discov., 2:214-221; Walsh (2003), Nat. Biotechnol. 21:865-870). Однако химическое сочетание биологически активного белка с синтетическими полимерами может иметь недостатки в том, что касается разработки и получения биофармацевтических агентов. Подходящие производные PEG являются дорогостоящими, особенно когда требуется высокая чистота, и их конъюгирование с рекомбинантным белком требует дополнительных стадий переработки и очистки invitro, которые снижают выход и увеличивают стоимость изготовления. В самом деле, PEG часто является загрязненным альдегидами и пероксидами (Ray (1985), Anal. Biochem. 146:307-312) и имеет собственную склонность к химической деградации при хранении в присутствии кислорода. Также фармацевтической функции терапевтического белка может мешать модификация аминокислотных боковых цепей поблизости от его биохимического активного сайта посредством процесса химического пегилирования. Кроме того, химическое сочетание с синтетическими полимерами обычно приводит к гетерогенной смеси молекул, которые могут показывать существенное варьирование активности in vivo. В-третьих, для продления периода полувыведения в сыворотке было предложено применение гликозилированных аналогов биологически активных белков, в которые введены новые консенсусные по-1 021222Metab. 88:2327-2335 или Elliott (2003), Nat. Biotechnol. 21:414-420). Описанные гликозилированные белки, однако, демонстрировали измененную активность in vivo, что указывает на то, что новые углеводные боковые цепи влияют на биологическую активность сконструированного белка. Кроме того, дополнительные углеводные боковые цепи, по-видимому, увеличивают антигенность образующихся биологически активных молекул, что вызывает значительные опасения относительно безопасности. Кроме того, сообщали, что слитые белки, содержащие искусственную повторяющуюся последовательность PSTAD, происходящую из Trypanosoma cruzi, индуцируют длительный период полувыведения в плазме транссиалидазы (Alvarez (2004), PNAS, 279:3375-3381). Также сообщали, что такие повторы,происходящие из Trypanosoma cruzi, индуцируют гуморальный иммунный ответ (Alvarez (2004), loc. cit.). Следовательно, желательными являются альтернативные способы пролонгации действия биологически активных белков. Технической задачей, лежащей в основе настоящего изобретения, является предоставление биологически активных белков с повышенной стабильностью in vivo и/или in vitro. Приведенная выше техническая задача решается тем, что предложены воплощения, охарактеризованные в формуле изобретения. Соответственно, данное изобретение относится к биологически активному белку, содержащему по меньшей мере два домена, где:(а) первый домен по меньшей мере из двух указанных доменов содержит аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую указанную биологическую активность; и(б) второй домен по меньшей мере из двух указанных доменов содержит аминокислотную последовательность, состоящую предпочтительно по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков,образующих конформацию случайного клубка. Согласно данному изобретению указанный второй домен, образующий/придающий конформацию случайного клубка, способен опосредовать повышенную стабильность указанного биологически активного белка in vivo и/или in vitro. Указанный второй домен, следовательно, приводит к повышенной стабильности in vivo и/или in vitro данного белка (или его фрагмента), имеющего и/или опосредующего данную биологическую активность, как определено здесь ниже. Как документально подтверждено здесь ниже и в представленных примерах, неожиданно обнаружили, что вводимые внутривенно биологически активные белки, которые модифицированы таким образом, чтобы содержать домен/часть случайного клубка, демонстрируют неожиданно длительный период полувыведения в плазме при сравнении с немодифицированными биологически активными белками, т.е. с теми, которые не имеют указанного домена случайного клубка. Термин "случайный клубок" в том виде, как он здесь используется, относится к любой конформации полимерной молекулы, включая аминокислотные полимеры, в которой отдельные мономерные элементы, образующие указанную полимерную структуру, являются, по существу, случайным образом ориентированными по отношению к смежным мономерным элементам, в то же время все еще являясь химически связанными с указанными смежными мономерными элементами. Конкретно, полипептид или аминокислотный полимер, принимающий/имеющий/образующий "конформацию случайного клубка", по существу, не имеет определенной вторичной и третичной структуры. Природа полипептидных случайных клубков и способы их экспериментальной идентификации известны специалисту в данной области и были описаны в научной литературе (Cantor (1980), Biophysical Chemistry, 2nd ed. W.H. Freeman andand Company, New York; Smith (1996), Fold Des. 1:R95-R106). Биологически активные белки по настоящему изобретению содержат домен (определенный здесь выше как указанный "второй домен" биологически активного белка по изобретению), который принимает/образует конформацию случайного клубка при физиологических условиях. Термин "физиологические условия" известен в данной области и относится к тем условиям, при которых белки обычно принимают их нативную конформацию. Более конкретно, термин "физиологические условия" относится к биофизическим параметрам в том виде, в котором они типично являются подходящими для высших форм жизни,конкретно для млекопитающих, наиболее предпочтительно для человека. Термин "физиологические условия" может относиться к биохимическим и биофизическим параметрам в том виде, в котором они обычно обнаруживаются в организме (конкретно, в жидкостях организма) млекопитающих, конкретно людей. Указанные "физиологические условия" могут относиться к соответствующим параметрам, обнаруженным в здоровом организме, а также к параметрам в том виде, в котором их обнаруживают у больных пациентов - млекопитающих или людей. Например, больной пациент - млекопитающее или человек- может иметь более высокую, но все еще "физиологическую" температуру, когда указанное млекопитающее или указанный человек страдают от лихорадки. В том что касается "физиологических условий",при которых белки принимают их нативную конформацию/состояние, самыми важными параметрами являются температура (37 С для человеческого организма), рН (7,35-7,45 для человеческой крови), осмолярность (280-300 ммоль/кг Н 2 О) и, если это необходимо, содержание белка (66-85 г/л сыворотки). Тем не менее, специалисту в данной области известно, что эти параметры могут варьировать при физиологических условиях, например температура, рН, осмолярность и содержание белка могут отличаться в дан-2 021222 ных жидкостях организма или ткани, таких как кровь, спинномозговая жидкость, перитонеальная жидкость и лимфа (Klinke (2005), Physiologie, 5th ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart). Например, в спинномозговой жидкости осмолярность может составлять около 290 ммоль/кг Н 2 О, и концентрация белка может составлять от 0,15 до 0,45 г/л. В лимфе рН может составлять около 7,4, и содержание белка может составлять от 3 до 5 г/л. При определении того, образует/принимает ли аминокислотный полимер/последовательность конформацию случайного клубка при экспериментальных условиях с использованием способов, описанных здесь ниже, биофизические параметры, такие как температура, рН, осмолярность и содержание белка,могут отличаться от физиологических условий, обычно обнаруживаемых in vivo. Температуры от 1 до 42 С или предпочтительно от 4 до 25 С могут считаться полезными для тестирования и/или проверки биофизических свойств и биологической активности белка при физиологических условиях in vitro. Считается, что некоторые буферы, в частности, в экспериментальных условиях (например, при определении структур белка, в частности при измерениях кругового дихроизма (CD) и в других способах,которые позволяют специалисту определять структурные свойства белка/аминокислотного отрезка) или в буферах, растворителях и/или эксципиентах для фармацевтических композиций представляют собой"физиологические растворы"/"физиологические условия" in vitro. Примерами таких буферов являются,например, забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS: 115 мМ NaCl, 4 мМ KH2PO4,16 мМ Na2HPO4, рН 7,4), Tris буферы, ацетатные буферы, цитратные буферы или аналогичные буферы,такие как буферы, использованные в представленных примерах. Как правило, рН буфера, представляющего собой "физиологический(ие) раствор/условия", должен составлять от 6,5 до 8,5, предпочтительно от 7,0 до 8,0, наиболее предпочтительно от 7,2 до 7,7, и осмолярность должна составлять от 10 до 1000 ммоль/кг Н 2 О, более предпочтительно от 50 до 500 ммоль/кг Н 2 О и наиболее предпочтительно от 200 до 350 ммоль/кг Н 2 О. Возможно, содержание белка в буфере, представляющем собой физиологический(ие) раствор/условия, может составлять от 0 до 100 г/л, пренебрегая (содержанием) самого белка с биологической активностью, посредством чего могут использоваться типичные стабилизирующие белки,например человеческий или бычий сывороточный альбумин. Соответственно, в контексте данного изобретения также предполагается, что конформация случайного клубка в том виде, в котором она содержится в определенном выше "втором домене" биологически активного белка по изобретению, поддерживается в фармацевтических композициях, подобных жидким фармацевтическим средствам. Предпочтительно "физиологические условия" следует использовать в соответствующих буферных системах, растворителях и/или эксципиентах. Тем не менее, предусматривается, что, например, в лиофилизированных или сухих композициях (подобных, например, фармацевтическим композициям) конформация случайного клубка в том виде, в котором она содержится во "втором домене" биологически активного белка по изобретению, временно отсутствует и/или не может быть определена. Однако указанный "второй домен" согласно белковым конструкциям по настоящему изобретению вновь примет/образует свою конформацию случайного клубка после растворения в соответствующих буферах/растворах/эксципиентах/растворителях. Это, например, происходит, когда белковые конструкции по изобретению были лиофилизированы или высушены (например, в форме фармацевтической композиции). После растворения такой лиофилизированной/высушенной белковой конструкции по изобретению, содержащей "первый" и "второй" домен, как здесь определено, часть/домен с конформацией случайного клубка вновь присутствует, и соответствующую конструкцию по изобретению, например,можно вводить пациенту-млекопитающему или человеку, нуждающемуся в медицинском вмешательстве. Как упомянуто выше, биологически активные белки по настоящему изобретению содержат домен(определенный здесь выше как указанный "второй домен" биологически активного белка по изобретению), который принимает/образует конформацию случайного клубка в/при физиологических условиях. В отличие от биологически активных белков по данному изобретению, денатурированные белки представляют собой белки, которые потеряли их функциональную конформацию и могут частично принимать конформацию случайного клубка в результате указанной денатурации. Белки можно денатурировать посредством разных способов, включая воздействие нефизиологической температуры, рН и/или концентрации соли или воздействие денатурирующих агентов, подобных мочевине/хлориду гуанидиния и детергентам. Следовательно, при исследовании белка при физиологических условиях следует избегать присутствия соединений, в отношении которых известно, что они оказывают денатурирующий эффект на белки, таких как мочевина, хлорид гуанидиния или додецилсульфат натрия. Мочевина может переноситься в концентрациях вплоть до 10 или даже 300 ммоль/л при исследовании белка для применения при физиологических условиях в человеческой крови или моче, соответственно. В отличие от денатурированных полипептидов, аминокислотная последовательность домена с конформацией случайного клубка (указанный "второй домен") в том виде, в котором она содержится в белковой конструкции по изобретению, естественным образом приобретает/имеет конформацию случайного клубка, конкретно in vivo и при введении пациентам-млекопитающим или людям, нуждающимся в медицинском вмешательстве. Соответственно, также рассматривается, что белковая конструкция по настоящему изобретению (содержащая определенный выше "первый" и "второй домен") может содержать"второй" домен, образующий/принимающий конформацию случайного клубка в форме идентифицированных здесь аланиновых, сериновых и пролиновых отрезков (или других аминокислотных отрезков,которые образуют/имеют/принимают конформацию случайного клубка при физиологических условиях),но может (например, в форме специфической композиции, подобной лиофилизату или сухой композиции) кратковременно или временно не находиться в форме случайного клубка. Тем не менее, важно, чтобы такой "второй домен" белковой конструкции по изобретению снова принимал, например, после растворения в соответствующих буферах (предпочтительно в "физиологических" буферах/эксципиентах и/или растворителях) определенную здесь конформацию случайного клубка. Указанный "второй домен"(после соответствующего растворения) способен опосредовать повышенную стабильность биологически активного белка по изобретению in vivo и/или in vitro. Биологически активный белок по данному изобретению имеет более длительный период полувыведения и большую стабильность in vivo и/или in vitro по сравнению с тем же самым "интересующим белком"/"первым доменом", который не содержит дополнительный "второй домен", как здесь определено. Термин "домен" в том виде, как он здесь используется, относится к любой области/части аминокислотной последовательности, которая способна автономно принимать специфическую структуру и/или функцию. В контексте настоящего изобретения, соответственно, "домен" может представлять собой функциональный или структурный домен. Как здесь описано, белки по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один домен/часть, имеющие и/или опосредующие биологическую активность, и по меньшей мере один домен/часть, образующие конформацию случайного клубка. Тем не менее, белки по данному изобретению также могут состоять более чем из двух доменов и могут содержать, например,дополнительную линкерную структуру между определенными здесь двумя доменами/частями или другим доменом/частью, подобную, например, протеазочувствительному сайту расщепления, аффинной метке, такой как His6-tag или Strep-tag, сигнальному пептиду, пептиду, обеспечивающему задержку, пептиду, обеспечивающему направленную доставку, подобному пептиду, обеспечивающему транслокацию через мембрану, или дополнительные эффекторные домены, подобно фрагментам антител для направленной доставки в опухоль, ассоциированным с противоопухолевым токсином или ферментом для активации пролекарства и т.д. Способы определения того, образует/принимает ли аминокислотный полимер конформацию случайного клубка, известны в данной области (Cantor (1980), loc. cit.; Creighton (1993), loc. cit.; Smith(1996), loc. cit.). Такие способы включают спектроскопию кругового дихроизма (CD), проиллюстрированную примерами здесь ниже. CD спектроскопия представляет собой способ световой абсорбционной спектроскопии, в котором измеряется разница поглощения веществом света с правой и левой круговой поляризацией. Вторичную структуру белка можно определить CD спектроскопией с использованием спектра в дальней ультрафиолетовой области с длиной волны приблизительно от 190 до 250 нм. При этих длинах волн можно проанализировать различные вторичные структуры, обычно обнаруживаемые в полипептидах, поскольку каждая конформация из -спирали параллельного и антипараллельного-складчатого слоя и случайного клубка дает характерную форму и амплитуду CD спектра. Соответственно, с использованием CD спектроскопии квалифицированный специалист способен легко определить,образует/принимает ли аминокислотный полимер конформацию случайного клубка в физиологических условиях. Другие общепринятые биофизические способы включают спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР), абсорбционную спектрометрию, инфракрасную спектрометрию и спектрометрию комбинационного рассеяния, измерение гидродинамического объема посредством гель-фильтрации, аналитическое ультрацентрифугирование или динамическое/статическое рассеяние света, а также измерения коэффициента трения или собственной вязкости (Cantor (1980), loc. cit.; Creighton (1993), loc. cit.; Smith(1996), loc. cit.). В другом воплощении биологически активный белок по данному изобретению имеет гидродинамический объем, определенный аналитической гель-фильтрацией (также известной как эксклюзионная хроматография, SEC), составляющий по меньшей мере 70 кДа, предпочтительно по меньшей мере 80 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 90 кДа, еще более предпочтительно по меньшей мере 100 кДа, особенно предпочтительно по меньшей мере 125 кДа и наиболее предпочтительно по меньшей мере 150 кДа. Специалист в данной области легко может определить гидродинамический объем специфических белков. Такие способы могут включать динамическое/статическое рассеяние света, аналитическое ультрацентрифугирование или аналитическую гель-фильтрацию, как проиллюстрировано примерами здесь ниже. Аналитическая гель-фильтрация представляет собой известный в данной области способ измерения гидродинамического объема макромолекул. В качестве альтернативы гидродинамический объем глобулярного полипептида можно оценить по его молекулярной массе. Однако, как описано здесь ниже, показано, что гидродинамический объем белков по изобретению, которые содержат определенный выше второй домен, т.е. домен, содержащий по меньшей мере 100 аминокислотных остатков и имеющий конформацию случайного клубка, имеет неожиданно большой гидродинамический объем по отношению к оценочному гидродинамическому объему соответствующего свернутого глобулярного белка на основе их молекулярной массы. Помимо вышеупомянутых, были описаны теоретические способы предсказания вторичных структур у белков. Одним примером такого теоретического способа является способ Чоу-Фасмана (Chou andFasman (1974), Biochemistry, 13:222-245), который основан на анализе относительных частот каждой аминокислоты в -спиралях, -складчатых структурах и поворотах на основе известных белковых структур, полученных рентгенокристаллографией. Однако известно, что теоретическое предсказание вторичной структуры белка является ненадежным. Как проиллюстрировано здесь ниже примерами, обнаружили, что аминокислотные последовательности, которые, как ожидается, согласно способу Чоу-Фасмана,принимают -спиральную вторичную структуру, образуют случайный клубок. Соответственно, теоретические способы, такие как алгоритм Чоу-Фасмана, имеют лишь очень ограниченную предсказательную ценность, когда данный аминокислотный полимер принимает конформацию случайного клубка. В одном воплощении аминокислотная последовательность, принимающая/имеющая/образующая конформацию случайного клубка, состоит по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков,предпочтительно по меньшей мере примерно из 150 аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 200 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно по меньшей мере примерно из 250 аминокислотных остатков, особенно предпочтительно по меньшей мере примерно из 300 аминокислотных остатков, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно из 350 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно из 400 аминокислотных остатков. В другом воплощении аминокислотная последовательность, образующая конформацию случайного клубка, состоит максимально примерно из 1000 аминокислотных остатков, предпочтительно максимально примерно из 900 аминокислотных остатков, более предпочтительно максимально примерно из 800 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно максимально примерно из 700 аминокислотных остатков, особенно предпочтительно максимально примерно из 600 аминокислотных остатков. Таким образом, аминокислотная последовательность, образующая конформацию случайного клубка,может состоять максимально примерно из 500 аминокислотных остатков или максимально примерно из 450 аминокислотных остатков. Здесь также рассматривается то, что аминокислотная последовательность,образующая конформацию случайного клубка, может состоять максимально примерно из 1200, примерно 1500 и вплоть примерно до 3000 аминокислотных остатков. Соответственно, аминокислотная последовательность, образующая конформацию случайного клубка, может состоять примерно из 100-3000 аминокислотных остатков. В конкретных воплощениях указанная аминокислотная последовательность,образующая конформацию случайного клубка, состоит примерно из 100-1000 аминокислотных остатков,как здесь охарактеризовано, т.е. содержит аланин, серин и пролин в качестве главных или уникальных остатков, как определено ниже. Сущностью настоящего изобретения, соответственно, является предложение аминокислотных полимеров, которые образуют конформацию случайного клубка при физиологических условиях и состоят, главным образом, из этих трех аминокислотных остатков, где остатки пролина представляют предпочтительно от примерно 4 до примерно 40% домена, образующего случайный клубок. Остатки аланина и серина составляют остальные по меньшей мере 60-96% указанного домена,образующего случайный клубок. Однако, как будет подробно описано здесь ниже, указанный домен,образующий случайный клубок, также может содержать другие аминокислоты, отличающиеся от аланина, серина и пролина, т.е. в качестве минорных компонентов. Термин "по меньшей мере примерно 100/150/200/250/300/300/350 (и т.д.) аминокислотных остатков" не ограничивается конкретным числом аминокислотных остатков, но также включает аминокислотные отрезки, которые содержат дополнительные 10-20% или содержат на 10-20% меньше остатков. Например, "по меньшей мере примерно 100 аминокислотных остатков" также может включать от 80 до 100 и от примерно 100 до 120 аминокислотных остатков без отступления от сущности настоящего изобретения. Предпочтительно "второй домен" биологически активного белка(ов)/полипептида(ов) по изобретению имеет максимальную длину примерно 1000 аминокислотных остатков. Однако в контексте настоящего изобретения также рассматриваются более длинные "вторые домены", т.е. "вторые домены", обеспечивающие при физиологических условиях желательную конформацию случайного клубка и содержащие вплоть примерно до 3000 аминокислотных остатков. Вновь термин "примерно" в этом контексте не лимитирован или ограничен конкретным количеством аминокислотных остатков, но также может включать примерно 10% или примерно 20% без отступления от данного изобретения. В контексте данного изобретения неожиданно обнаружили, что аминокислотные полимеры, состоящие главным образом из остатков аланина и серина или, в предпочтительном воплощении, состоящие главным образом или единственно из остатков аланина, серина и пролина, образуют конформацию случайного клубка при физиологических условиях. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложены модули/элементы последовательности/полимерные повторы/полимерные кассеты/строительные блоки, состоящие из аланина, серина и пролина, которые можно использовать как часть(части) определенного здесь "второго домена" биологически активного белка/полипептида. Тем не менее, специалисту известно, что аминокислотный полимер также может образовать конформацию случайного клубка, когда в указанном "втором домене" в качестве минорных компонентов содержатся остатки, отличные от аланина, серина и пролина. Термин "минорный компонент" в том виде, как он здесь используется, означает, что максимально 10%, т.е. максимально 10 из 100 аминокислот могут отличаться от аланина, серина и пролина, предпочтительно максимально 8%, т.е. максимально 8 из 100 аминокислот могут отличаться от аланина, серина и пролина, более предпочтительно максимально 6%, т.е. максимально 6 из 100 аминокислот могут отличаться от аланина, серина и пролина, даже более предпочтительно максимально 5%, т.е. максимально 5 из 100 аминокислот могут отличаться от аланина, серина и пролина, особенно предпочтительно максимально 4%, т.е. максимально 4 из 100 аминокислот могут отличаться от аланина, серина и пролина, еще более предпочтительно максимально 3%, т.е. максимально 3 из 100 аминокислот могут отличаться от аланина, серина и пролина и даже еще более предпочтительно максимально 2%, т.е. максимально 2 из 100 аминокислот могут отличаться от аланина, серина и пролина,и наиболее предпочтительно максимально 1%, т.е. максимально 1 из 100 аминокислот, которые образуют домен, образующий случайный клубок, могут отличаться от аланина, серина и пролина. Указанные аминокислоты, отличные от аланина, серина и пролина, могут быть выбраны из группы, состоящей из Arg,Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr и Val. Неожиданно обнаружили, что аминокислотные полимеры, раскрытые здесь и состоящие из аланина, серина и пролина, согласно изобретению принимают конформацию случайного клубка при физиологических условиях. Следовательно, они являются полезными молекулами для предоставления определенного здесь "второго домена" биологически активного белка(ов)/полипептида(ов) по изобретению, т.е. отрезка полипептида, который при физиологических условиях образует конформацию случайного клубка и, посредством этого, опосредует повышенную стабильность in vivo и/или in vitro биологически активного ("функционального") белка(ов) или полипептида(ов). Гидродинамический объем функционального белка, который слит с указанным доменом с конформацией случайного клубка, кардинально увеличивается, что можно оценить с использованием упомянутых здесь стандартных способов и что также проиллюстрировано в приложенных примерах. Поскольку считается, что сам домен с конформацией случайного клубка не приобретает стабильную структуру или функцию, биологическая активность, опосредованная интересующим функциональным белком, с которым он слит, по существу, сохраняется. Кроме того, считается, что аминокислотные полимеры, которые образуют домен с конформацией случайного клубка, как здесь раскрыто, являются биологически инертными, особенно в том, что касается протеолиза в плазме крови, иммуногенности, изоэлектрической точки/электростатического поведения,связывания с рецепторами поверхности клетки, а также интернализации, но все же биодеградируемыми,что обеспечивает очевидные преимущества над синтетическими полимерами, такими как PEG. В другом воплощении аминокислотные полимеры, приобретающие при физиологических условиях конформацию случайного клубка, содержат целый ряд "аминокислотных повторов"/"аминокислотных кассет"/"кассетных повторов", где указанные "аминокислотные повторы"/"аминокислотные кассеты"/"кассетные повторы" состоят из остатков Ala, Ser и Pro (показанных здесь как "PAS" или как "APS"),и где не более чем 6 последовательных аминокислотных остатков являются идентичными, и где указанные остатки пролина составляют более чем 4 и менее чем 40% аминокислот указанного второго домена,образующего случайный клубок. Аминокислотные полимеры, принимающие при физиологических условиях конформацию случайного клубка, могут содержать целый ряд идентичных аминокислотных повторов/кассетных повторов или целый ряд неидентичных аминокислотных повторов. Неограничивающие примеры "аминокислотных повторов", "строительных блоков", "модулей", "повторов", "аминокислотных кассет" и пр., состоящих из остатков Ala, Ser и Pro, приведены здесь ниже, см. SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 28, или фрагменты или мультимеры этих последовательностей. "Фрагмент" содержит по меньшей мере 3 аминокислоты и содержит по меньшей мере один аланин, один серин и/или один пролин. Аминокислотный повтор согласно настоящему изобретению может состоять по меньшей мере из 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более аминокислотных остатков, где каждый повтор содержит остаток(остатки) Ala, Ser и Pro. В одном воплощении аминокислотный повтор согласно настоящему изобретению не содержит более 100 аминокислотных остатков. Предпочтительно аминокислотный повтор/кассетный повтор, как здесь определено, содержит более чем примерно 4%, предпочтительно более чем примерно 5%, даже более предпочтительно более чем примерно 6%, особенно предпочтительно более чем примерно 8%, еще более предпочтительно более чем примерно 10%, даже более предпочтительно более чем примерно 15% и наиболее предпочтительно более чем примерно 20% остатков пролина. Такой аминокислотный повтор/кассетный повтор, как здесь определено, предпочтительно содержит менее чем примерно 40% или менее чем примерно 35% остатков пролина; также см. предложенные здесь ниже конструкции PAS. В еще одном другом воплощении аминокислотные полимеры, образующие при физиологических условиях конформацию случайного клубка, имеют формулу (I) где указанный аминокислотный полимер, кроме того, содержит остатки пролина, как здесь определено; х независимо выбран из целого числа от 0 до 6; у независимо выбран из целого числа от 1 до 6 для каждого n; каждый z независимо выбран из целого числа от 1 до 6;n представляет собой любое целое число,так что указанный второй домен состоит по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков и,конкретно, по меньшей мере примерно из 100-3000 аминокислотных остатков, предпочтительно примерно до 2000 и более предпочтительно примерно до 1000 аминокислотных остатков. В предпочтительных воплощениях аминокислотный полимер, содержащий определенные выше"аминокислотные повторы"/"аминокислотные кассеты"/"кассетные повторы", образующие конформацию случайного клубка, содержит не более чем 5 идентичных последовательных аминокислотных остатков,более предпочтительно не более чем 4 идентичных последовательных аминокислотных остатка и наиболее предпочтительно не более чем 3 идентичных последовательных аминокислотных остатка. Как уже было указано здесь выше, аминокислотный полимер по изобретению, который образует конформацию случайного клубка, содержит остатки пролина, где указанные остатки пролина составляют более чем примерно 4%, предпочтительно более чем примерно 5%, даже более предпочтительно более чем примерно 6%, особенно предпочтительно более чем примерно 8%, еще более предпочтительно более чем примерно 10%, даже более предпочтительно более чем примерно 15% и наиболее предпочтительно более чем примерно 20% аминокислот, составляющих домен, образующих случайный клубок. Такой аминокислотный полимер по изобретению, который образует конформацию случайного клубка, предпочтительно содержит менее чем примерно 40 или менее чем примерно 35% аминокислот, составляющих домен, образующий случайный клубок. Как показано в приложенном примере 13, полимер PAS1P2 с его меньшей долей остатков Pro демонстрирует менее выраженный минимум около 200 нм в его CD спектре, указывая на зависимость характера случайного клубка аминокислотных полимеров по данному изобретению от содержания остатков пролина. В другом предпочтительном воплощении аминокислотный полимер, содержащий определенные выше "аминокислотные повторы"/"аминокислотные кассеты"/"кассетные повторы", образующий конформацию случайного клубка, содержит более чем примерно 4%, но менее чем примерно 50%, предпочтительно более чем примерно 10%, но менее чем примерно 50% и наиболее предпочтительно более чем примерно 20%, но менее чем примерно 50% остатков аланина среди аминокислот, составляющих домен,образующий случайный клубок. В другом предпочтительном воплощении аминокислотный полимер, содержащий определенные выше "аминокислотные повторы"/"аминокислотные кассеты"/"кассетные повторы", образующий конформацию случайного клубка, содержит более чем примерно 4% и менее чем примерно 50%, предпочтительно более чем примерно 10%, но менее чем примерно 50% и наиболее предпочтительно более чем примерно 20%, но менее чем примерно 50% остатков серина среди аминокислот, составляющих домен,образующий случайный клубок. Соответственно, аминокислотный полимер, образующий конформацию случайного клубка, может содержать примерно 35% остатков пролина, примерно 50% остатков аланина и примерно 15% остатков серина (среди) аминокислот, составляющих домен, образующий случайный клубок. В качестве альтернативы аминокислотный полимер, образующий конформацию случайного клубка, может содержать примерно 35% остатков пролина, примерно 15% остатков аланина и примерно 50% остатков серина среди аминокислот, составляющих домен, образующий случайный клубок. Термин "примерно" в том виде, как он используется здесь выше, также относится к точному значению данной процентной доли. Кроме того, здесь описаны аминокислотные полимеры, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Мультимеры описанных аланино-сериновых модулей/единиц последовательности могут образовать конформацию случайного клубка в случае, если образующаяся аминокислотная последовательность дополнительно содержит остатки пролина, как определено здесь выше. Эти приведенные в качестве примеров модули/единицы последовательности могут кодироваться молекулами нуклеиновой кислоты, содержащими следующие последовательности: В предпочтительном воплощении аминокислотный полимер, образующий конформацию случайного клубка, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Альтернативно, слегка модифицированный и еще активный PAS3 может иметь изложенную выше последовательность Эта последовательность соответствует предложенной здесь SEQ ID NO: 22 в форме циклической перестановки, где последний серин был удален и другой серин был добавлен в качестве исходной аминокислоты. Как следствие, мультимеры этой модифицированной последовательности согласно данному изобретению обладают, по существу, такой же внутренней повторяющейся единицей, что и мультимеры с немодифицированной последовательностью, за исключением самого первого и самого последнего остатка. Соответственно, этот модифицированный PAS3 (SEQ ID NO: 63) можно рассматривать как пример другого "модуля"/"строительного блока" предложенных здесь аминокислотных полимеров согласно данному изобретению. Для специалиста в данной области очевидно, что также могут использоваться другие "модули" и (более короткие) фрагменты или варианты предложенных здесь аминокислотных полимеров с циклической перестановкой в качестве "модулей", "повторов" и/или строительных блоков для определенного здесь "второго домена" предложенного биологически активного белка. Тем не менее, даже другие и иллюстративные аминокислотные полимеры, образующие конформацию случайного клубка,могут содержать аминокислотные последовательности, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из Вновь в контексте настоящего изобретения также можно использовать либо фрагмент(ы), либо мультимер(ы), либо варианты этих последовательностей с циклической перестановкой и последовательности, предложенные здесь выше, в качестве строительных блоков для определенного здесь "второго домена" биологически активного белка(ов)/полипептида(ов) по изобретению. Специалист в данной области способен легко получать другие аминокислотные полимеры, которые при физиологических условиях образуют конформацию случайного клубка и составлены, главным образом, из аланина, серина и пролина, как здесь определено. Такие другие и дополнительные примеры аминокислотных полимеров,образующих конформацию случайного клубка, подлежащих применению в качестве строительных блоков или модулей определенного здесь "второго домена" биологически активного белка(ов)/полипептида(ов) по изобретению, могут, среди прочего, содержать комбинации и/или фрагменты или варианты с циклической перестановкой специфических "строительных блоков", "полимерных кассет" или "полимерных повторов", показанных выше. Соответственно, приведенные в качестве примеров модули/единицы последовательности/полимерные повторы/полимерные кассеты домена (с конформацией) случайного клубка также могут давать индивидуальные фрагменты, которые можно вновь комбинировать с образованием других модулей/единиц последовательности/полимерных повторов/полимерных кассет согласно данному изобретению. Термины "модуль(ли)", "единица(цы) последовательности", "полимерный повтор(ры)", "полимерная кассета(ты)" и "строительный блок(и)" используются здесь как синонимы и относятся к индивидуальным аминокислотным отрезкам, которые можно использовать для образования определенного здесь"второго домена" биологически активного белка/полипептида по изобретению. Указанный второй домен содержит аминокислотную последовательность, состоящую предпочтительно по меньшей мере из 100 аминокислотных остатков, и образует конформацию случайного клубка при физиологических условиях. Приведенные выше в качестве примеров модули/единицы последовательности/полимерные повторы/полимерные кассеты/строительные блоки домена (с конформацией) случайного клубка биологически активных белков/полипептидов по изобретению (т.е. определенного здесь "второго домена" указанных биологически активных белков/полипептидов) могут кодироваться молекулами нуклеиновой кислоты,включающими следующие последовательности: Модифицированный PAS3 (модифицированная SEQ ID NO: 22), как описано здесь выше, может кодироваться следующей последовательностью нуклеиновой кислоты: Достойным внимания и неограничивающим для настоящего изобретения является то, что согласно знаниям специалиста в данной области описанные и приведенные здесь в качестве примеров модули/единицы последовательности/полимерные повторы/полимерные кассеты/строительные блоки домена(с конформацией) случайного клубка (или их фрагменты, или мультимеры, или их варианты с циклической перестановкой) могут кодироваться разными последовательностями нуклеиновой кислоты согласно генетическому коду, который имеет вырожденную природу, т.е. разные кодоны в виде триплетов нуклеотидов могут кодировать тот же самый аминокислотный остаток. Кроме того, терминальные остатки могут отличаться, в зависимости от конструкции кассеты нуклеотидной последовательности согласно данному изобретению и от стратегии лигирования, применяемой для получения ее мультимеров. Например, "модуль" PAS1, как показано в SEQ ID NO: 18 и 30, может кодироваться последовательностями нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17 и 29 соответственно. В отличие от SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 30 содержит дополнительный аланин на С-конце, кодон которого может быть удален, если индивидуальные кассеты нуклеотидной последовательности лигируют через липкие концы, как описано в некоторых из приложенных примеров. Согласно описанному выше аминокислотный полимер, образующий конформацию случайного клубка, может содержать мультимер, состоящий из любой одной из аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26 или 28, как раскрыто здесь выше, или может содержать мультимер,состоящий более чем из одной аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26 или 28. Кроме того, также рассматривается, что фрагменты или варианты этих приведенных в качестве примеров последовательностей с циклическими перестановками используются для построения других модулей/единиц последовательности/полимерных повторов/полимерных кассет/строительных блоков домена(с конформацией) случайного клубка ("второго домена") биологически активного белка(ов)/полипептида(ов) по изобретению. В другом воплощении аминокислотный полимер,образующий конформацию случайного клубка, может содержать мультимер, состоящий из (циклической) перестановки аминокислотной последовательности,выбранной из группы,состоящей из или в качестве модифицированной последовательности или ра(ов) этих последовательностей с (циклическими) перестановками. В еще одном воплощении аминокислотный полимер,образующий конформацию случайного клубка,может содержать мультимер,состоящий из фрагмента/части аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из или в качестве модипоследовательности"Фрагменты" этих последовательностей, подлежащие применению согласно данному изобретению для генерации "второго домена" биологически активного белка/полипептида по изобретению, могут состоять по меньшей мере из 3, предпочтительно по меньшей мере из 4, более предпочтительно по меньшей мере из 5, даже более предпочтительно по меньшей мере из 6, все же еще более предпочтительно по меньшей мере из 8, особенно предпочтительно по меньшей мере из 10, еще более предпочтительно по меньшей мере из 12, даже еще более предпочтительно по меньшей мере из 14, все же еще более предпочтительно по меньшей мере из 16 и наиболее предпочтительно по меньшей мере из 18 последовательных аминокислот аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из указанныхSEQ ID NO: 18, 20, 22, 24, 26 и 28. Как упомянуто выше, предложенные здесь модули/единицы последовательности/строительные блоки и т.д. домена с конформацией случайного клубка являются лишь примерами аминокислотного полимера по изобретению, который образует конформацию случайного клубка при физиологических условиях. Согласно сущности настоящего изобретения эти "модули", "единицы последовательности" и/или "повторы" содержат указанное выше содержание/долю аланина, серина и пролина. Следовательно,генерация других таких "модулей", "единиц последовательности" и/или "повторов" согласно данному изобретению находится в пределах обычной квалификации специалиста в данной области. Например,отдельные фрагменты идентифицированных здесь "модулей", "единиц последовательности" и/или "повторов" по изобретению можно объединять с дополнительными отдельными "модулями", "единицами последовательности" и/или "повторами" при условии, что соблюдаются идентифицированные выше правила об общем распределении и количестве аланина, серина и пролина. Вновь, эти "модули", "единицы последовательности" и/или "повторы" также могут содержать другие аминокислотные остатки, однако только в качестве минимальных или минорных компонентов (максимально 10%, предпочтительно максимально 2% отдельного "модуля", "единицы последовательности" и/или "повтора"). Указанный отдельный "модуль", "единица последовательности" и/или "повтор" состоит согласно данному изобретению по меньшей мере из примерно 100 аминокислотных остатков. Отдельные "модули", "единицы последовательности" и/или "повторы" можно объединять для того, чтобы образовать более длинные аминокислотные полимеры, образующие случайный клубок, посредством чего максимальная длина определенного здесь "второго домена" биологически активного белка составляет примерно 3000 аминокислот. В контексте данного изобретения предпочтительными являются биологически активные белки, которые содержат по меньшей мере два домена, где первый домен, как определено здесь выше, из указанных по меньшей мере двух доменов содержит аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую указанную биологическую активность; и второй домен из указанных по меньшей мере двух доменов, как здесь определено, содержит аминокислотную последовательность, состоящую предпочтительно по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков, и образует конформацию случайного клубка при физиологических условиях. Указанная конформация случайного клубка, как здесь предложено и состоящая главным образом из аланина, серина и пролина, опосредует повышенную стабильность указанного биологически активного белка in vivo и/или in vitro. Указанный второй домен может состоять из отдельных "модулей", "единиц последовательности" и/или "повторов", как здесь предложено,или может содержать фрагменты или части этих отдельных иллюстративных "модулей", "единиц последовательности" и/или "повторов". Однако указанный второй домен может быть построен из дополнительных и/или из других отдельных "модулей", "единиц последовательности", "строительных блоков" и/или "повторов", которые не нарушают и подчиняются предложенным здесь выше идеям, и которые проллюстрированы примерами здесь ниже в описании изобретения и в приложенных примерах. Например, приложенная экспериментальная часть показывает достаточное доказательство того, что белки, содержащие определенный здесь дополнительный "второй домен", дающий конформацию случайного клубка при физиологических условиях (например, полимеры, состоящие примерно из 200 или примерно 400, или примерно 600 аминокислотных остатков и включающие в качестве "строительных блоков"PAS1P2/SEQ ID NO: 28) имеют, даже в условиях in vivo, предпочтительную стабильность в сыворотке или период полувыведения в плазме по сравнению с немодифицированным биологически активным белком. В качестве неограничивающего примера из настоящего изобретения стабильность in vivo немоди- 10021222 фицированного IFN-2b сравнивали со стабильностью in vivo модифицированного IFN-2b, который содержал дополнительный "второй домен", как здесь определено, принимающий конформацию случайного клубка при физиологических условиях. Гомополимеры большинства аминокислот, конкретно гидрофобных аминокислот, обычно являются нерастворимыми в водном растворе (Bamford (1956), Synthetic Polypeptides - Preparation, Structure, andProperties, 2nd ed., Academic Press, New York). Известно, что гомополимеры из нескольких гидрофильных аминокислот образуют вторичные структуры, например, -спираль в случае Ala (Shental-Bechor (2005),Biophys. J. 88:2391-2402) и -складчатую структуру в случае Ser (Quadrifoglio (1968), J. Am. Chem. Soc. 90:2760-2765), тогда как полипролин, самый жесткий гомоолигопептид (Schimmel (1967), Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 58:52-59), образует в водном растворе трансспираль типа II (Cowan (1955), Nature,176:501-503). С использованием теоретических принципов биофизики полимеров диаметр случайного клубка цепи из 200 аминокислотных остатков составил бы, например, в случае полиглицина примерно 75 при расчете в виде среднеквадратичного расстояния от конца до конца: с n=200 вращающихся связей длины l=3,8 для каждого расстояния С-С и "характеристическим отношением" С 2,0 для поли(Gly) (Brant (1967), J. Mol. Biol. 23:47-65; Creighton (1993), loc. cit.). Это отношение показывает, что специалист в данной области ожидал бы, что гидродинамический объем аминокислотного полимера с цепью, имеющей конформацию случайного клубка, может быть увеличен (а) с использованием большей длины цепи, I или посредством (б) применения аминокислот, которые демонстрируют большее характеристическое отношение, С. C представляет собой меру внутренней жесткости цепи молекулы с конформацией случайного клубка и имеет обычное значение 9 для большинства аминокислот (Brant (1967),loc.cit.). Только Gly, который не имеет боковой цепи, а также иминокислота Pro демонстрируют значительно меньшие значения. Следовательно, ожидается, что Gly и Pro (при денатурирующих условиях) способствуют уменьшению размеров белков с конформацией случайного клубка (Miller (1968), Biochemistry, 7:3925-3935). Соответственно, ожидается, что аминокислотные полимеры, содержащие остатки пролина, имеют относительно компактный гидродинамический объем. В отличие от этой идеи, однако,здесь показано, что гидродинамический объем аминокислотных полимеров по изобретению, которые содержат смесь остатков аланина, серина и пролина, кардинально увеличивается при определении аналитической гель-фильтрацией по сравнению с ожидаемым гидродинамическим объемом. На самом деле неожиданно, что полипептиды, содержащие смеси этих трех аминокислот, из которых каждая по одиночке имеет тенденцию образовать гомоолигопептид с определенной вторичной структурой, принимает конформацию случайного клубка при физиологических условиях. Такие полипептиды по изобретению имеют больший гидродинамический радиус, чем гомополимеры, содержащие то же самое число остатковGly, и они придают лучшую растворимость биологически активному белку согласно изобретению. В WO 2006/081249 описаны белковые конъюгаты, содержащие биологически активный белок, связанный с полипептидом, содержащим от 2 до 500 единиц аминокислотного повтора, имеющего Gly, Asn и Gln в качестве главного компонента и Ser, Thr, Asp, Gln, Glu, His и Asn в качестве минорного компонента. Описано, что указанные белковые конъюгаты имеют либо увеличенный, либо уменьшенный период полувыведения в плазме по сравнению с неконъюгированным биологически активным белком. ВWO 2006/081249, однако, не предложены какие-либо идеи для предсказания того, уменьшают ли или увеличивают специфические аминокислотные повторы период полувыведения конъюгата в плазме. Кроме того, в WO 2006/081249 не сообщается или не говорится о том, что период полувыведения белков в плазме может быть увеличен, когда конъюгированный белок содержит аминокислотный повтор, который образует конформацию случайного клубка, как показано в настоящем изобретении. Кроме того, аминокислотные повторы, раскрытые в WO 2006/081249, содержат по меньшей мере два остатка, выбранных из Gly, Asn и Gln, что явно отличается от полипептидных повторов по настоящему изобретению, которые предпочтительно состоят из остатков Ala, Ser и Pro. Термин "биологическая активность" в том виде, как он здесь используется, описывает биологический эффект вещества на живую материю. Соответственно, термины "биологически активный белок" или "полипептид, имеющий и/или опосредующий биологическую активность", в том виде, как они здесь используются, относятся к белкам или полипептидам, которые способны индуцировать биологический эффект в живых клетках/организмах, которые подвергаются влиянию указанного белка или полипептида. Тем не менее, примечательно, что в контексте настоящего изобретения термин "биологически активный белок" относится к целому белку по изобретению, который содержит и аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую указанную биологическую активность, и аминокислотную последовательность, образующую конформацию случайного клубка. Соответственно, термины "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая биологическую активность" или "аминокислотная последовательность с биологической активностью" в том виде, как они здесь используются, относятся к определенному выше "первому домену" биологически активного белка по изобретению, опосредующему, или имеющему, или способному опосредовать или иметь определенную выше "биологическую активность". Термины "аминокислотная последователь- 11021222"отрезку биологически активного полипептида" по изобретению и относятся к "первому домену" указанного биологически активного белка. В термины "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая биологическую активность" или "аминокислотная последовательность с биологической активностью" также включены функциональные фрагменты любого интересующего белка, период полувыведения которого либо in vivo, либо in vitro следует увеличить. В одном воплощении данного изобретения аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую биологическую активность согласно настоящему изобретению, можно вывести из любого "интересующего белка", т.е. из любого белка, представляющего фармацевтический или биологический интерес, или из любого белка, который полезен в качестве терапевтического/диагностического агента. Соответственно, биологически активные белки согласно настоящему изобретению могут содержать биологически активную аминокислотную последовательность, которая происходит из продуцируемых в природе полипептидов или из полипептидов,продуцируемых генной инженерией. В предпочтительном воплощении интересующий белок можно выбрать из группы, состоящей из связывающих белков, иммуноглобулинов, фрагментов антител, транспортных белков, сигнальных белков/пептидов, таких как цитокины, факторы роста, гормоны или ферменты. Термин "связывающий белок" в том виде, как он здесь используется, относится к молекуле, которая способна специфически взаимодействовать с (а) потенциальным партнером(ами) связывания так, что она способна различать указанный потенциальный партнер(ы) связывания и целый ряд других молекул в качестве указанного потенциального партнера(ов) связывания в такой степени, что из пула указанного ряда разных молекул в качестве потенциального партнера(ов) связывания связывает(ют)ся только указанный потенциальный партнер(ы) связывания или связывает(ют)ся в значительной степени. Способы измерения связывания связывающего белка с потенциальным партнером связывания известны в данной области и могут проводиться обычным путем, например с использованием ELISA, изотермической титрационной калориметрии, равновесного диализа, пул-даун анализа или установки Biacore. Типичные связывающие белки, которые являются полезными в контексте настоящего изобретения, включают, но не ограничиваютсяими, антитела, фрагменты антител, такие как Fab фрагменты, F(ab')2 фрагменты, одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), выделенные вариабельные области антител (VL- и/илиVH-области), CDR (область определения комплементарности), однодоменные антитела, пептидомиметики, происходящие из CDR, лектины, липокалины или разные типы связывающих белков, происходящих из каркаса, как описано, например, в Skerra (2000), J. Mol. Recognit. 13:167-187 или Binz (2005), Nat.Biotechnol. 23:1257-1268. Другие типичные интересующие биологически активные белки, которые являются полезными в контексте настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, человеческий гормон роста, -интерферон, -интерферон, -интерферон, фактор некроза опухоли, эритропоэтин, факторы свертывания крови, такие как фактор свертывания кровиBiotechnol. 21:865-870 или Walsh (2004), Eur. J. Pharm. Biopharm. 58:185-196. Липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL; также именуемый липокалином нейтрофилов человека, 24 р 3, утерокалином, сидерокалином или липокалином, родственным neu), как упомянуто здесь выше, является членом семейства липокалина связывающих белков, который впервые идентифицировали в качестве компонента гранул нейтрофилов. Было показано, что NGAL прочно связывается с комплексом сидерофор FeIII катехолатного типаэнтерохелин/энтеробактин (Goetz (2002),Mol. Cell. 10:1033-1043), а также с некоторыми другими сидерофорами микобактерий, включая карбоксимикобактины М.tuberculosis (Holmes (2005), Structure, 13:29-41). Эти сидерофоры представляют собой высокоэффективные хелаторы железа, которые секретируются патогенными бактериями в ответ на лимитирующие концентрации железа, так как они встречаются в жидкостях организма человека и обеспечивают поглощение железа специализированными системами бактериального импорта. Следовательно,нейтрофилы, по-видимому, высвобождают NGAL (недавно также названный "сидерокалин") в местах инфекции в качестве противомикробной стратегии системы врожденного иммунитета. Физиологическую релевантность NGAL исследовали в соответствующих нокаутированных мышах, и показали, что он лимитирует рост бактерий, который продуцируют энтерохелин (Flo (2004), Nature, 432:917-921). Следовательно, NGAL можно применять в качестве нового класса антибиотиков, который действует путем предотвращения поглощения железа бактериями. Кроме того, было описано, что NGAL участвует в физиологическом пути возвращения железа почкой (Yang (2002), Mol. Cell. 10:1045-1056). Недавно продемонстрировали, что этот механизм предотвращает ишемически-реперфузионное повреждение почки в мышиной модели тяжелой почечной недостаточности (Mori (2005), J. Clin. Invest. 115:610-621), что могло бы открыть другую область терапевтического применения. В еще одном воплощении настоящее изобретение относится к биологически активному белку по изобретению, где указанный первый домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая кодирует полипептид, имеющий и/или опосредующий указанную биологическую активность, и указанный второй домен, которые образуют конформацию случайного клубка, связаны полипептидным линкером. Этот полипептидный линкер, вставленный между указанным первым и указанным вторым доменом,предпочтительно содержит многочисленные, гидрофильные, связанные пептидными связями аминокислоты, которые ковалентно связаны с этими доменами. В еще одном другом воплощении указанный полипептидный линкер содержит сайт расщепления протеазой плазмы, который обеспечивает контролируемое высвобождение указанного первого домена, содержащего полипептид, имеющий и/или опосредующий биологическую активность. Линкеры разных типов или длины могут быть идентифицированы без чрезмерных усилий с получением полной функциональной активности специфичных полипептидов. В предпочтительном воплощении биологически активные белки по настоящему изобретению представляют собой слитые белки. Подразумевается, что слитый белок, как здесь описано, содержит по меньшей мере один домен, который опосредует биологическую активность, и по меньшей мере один другой домен, который образует конформацию случайного клубка, в одном многодоменном полипептиде. В альтернативном воплощении биологически активный белок согласно настоящему изобретению может представлять собой белковый конъюгат, где интересующий белок или полипептид/отрезок полипептида/аминокислотная последовательность, имеющие и/или опосредующие биологическую активность, конъюгированы через непептидную связь с аминокислотной последовательностью, которая образует конформацию случайного клубка. Непептидные связи, которые являются полезными для поперечно связывающихся белков, известны в данной области и могут включать дисульфидные связи, например,между боковыми цепями Cys, тиоэфирные связи или непептидные ковалентные связи, индуцированные химическими сшивателями, такими как дисукцинимидилсуберат (DSS) или сульфосукцинимидил 4-[пмалеимидофенил]бутират (Sulfo-SMPB), а также нековалентные взаимодействия белок-белок. Примечательно, что "биологически активный белок" по настоящему изобретению также может содержать более чем одну "аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую биологическую активность", т.е. определенный здесь "первый домен" биологически активного белка в контексте этого изобретения не ограничивается одной единичной интересующей биологической активностью. Кроме того, специалисту в данной области известно, что "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая биологическую активность", и "домен/часть с конформацией случайного клубка" в том виде, в котором они содержатся в биологически активных белках по изобретению, могут быть организованы в специфическом порядке. В неограничивающем примере "биологически активного белка" по настоящему изобретению, содержащего один домен/часть с конформацией случайного клубка (т.е. аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере из 100 аминокислотных остатков и образующую случайный клубок), и две аминокислотные последовательности, имеющие и/или опосредующие разные биологические активности, порядком доменов может быть "аминокислотная последовательность,имеющая и/или опосредующая первую биологическую активность" - "домен/часть с конформацией случайного клубка" - "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая вторую биологическую активность". Соответственно, и в контексте данного изобретения порядок определенного здесь "первого" и "второго" домена биологически активного полипептида по изобретению может быть организован так, что указанный "первый домен" (т.е. интересующий белок; "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая указанную биологическую активность") находится на аминоконце (N-), и указанный "второй домен" (т.е. домен, который содержит аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков, образующих/принимающих конформацию случайного клубка) находится на карбоксиконце (С-) полипептида по изобретению. Однако этот порядок также может быть обратным, например указанный "первый домен" (т.е. интересующий белок; "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая биологическую активность") находится в/на карбоксиконце (С-) и указанный "второй домен" (т.е. домен, который содержит аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков, образующих/принимающих конформацию случайного клубка) находится в/на аминоконце (N-) полипептида по изобретению. Тем не менее, как отмечено выше, также рассматривается, что более чем один домен, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей и/или опосредующей указанную биологическую активность, подлежит применению в контексте полипептидной конструкции по изобретению. Соответственно, указанный "второй домен" (т.е. домен, который содержит аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков, образующих/принимающих конформацию случайного клубка) может находиться между указанными "первыми доменами", представляющими собой аминокислотные отрезки, которые имеют и/или опосредуют интересующую или желательную биологическую активность. "Отрезок (с конформацией) случайного клубка", следовательно, может находиться между двумя доменами, имеющими и/или опосредующими желательную биологическую активность. Как и в случае со всеми воплощениями полипептида/биологически активного белка по изобретению, указанный домен(ы), содержащий аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую указанную биологическую активность, также может быть биологически активным фрагментом данного белка с желательной биологической функцией. Следовательно,определенный здесь "второй домен" (аминокислотная последовательность, состоящая по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков, образующих случайный клубок) также может находиться между двумя биологически активными фрагментами интересующего белка или между биологически активными фрагментами двух интересующих белков. Тем не менее, когда в биологически активном белке по данному изобретению также должен содержаться более чем один домен "имеющий и/или опосредующий биологическую активность", определенный здесь "второй домен", т.е. аминокислотная последовательность, состоящая по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков, образующих конформацию случайного клубка, может находиться на N- или С-конце биологически активного белка по данному изобретению. Соответствующими неограничивающими примерами, начиная с N-конца являются"аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая первую биологическую активность" - "домен/часть с конформацией случайного клубка" - "аминокислотная последовательность,имеющая и/или опосредующая вторую биологическую активность"; или"аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая первую биологическую активность" - "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая вторую биологическую активность" -"домен/часть с конформацией случайного клубка"; или"домен/часть с конформацией случайного клубка" - "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая первую биологическую активность" - "аминокислотная последовательность,имеющая и/или опосредующая вторую биологическую активность". Соответствующий порядок(и) также рассматривает(ют)ся, когда представление начинается с С-конца биологически активного белка/полипептида по настоящему изобретению. Термин "домен/часть(с конформацией) случайного клубка" в том виде, как он используется здесь в приведенных выше представлениях, соответствует "второму домену", как здесь определено, т.е. аминокислотной последовательности, состоящей по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков, которые принимают/имеют конформацию случайного клубка при физиологических условиях. Вновь следует отметить, что термин "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая первую биологическую активность", не ограничивается полноразмерными полипептидами, которые имеют и/или опосредуют указанную биологическую активность или функцию, но также включает их биологически и/или фармакологически активные фрагменты. Особенно, но не только, в контексте, где два или более "первых домена", как здесь определено, содержатся в "биологически активном белке" по изобретению, также рассматривается, что эти "первые домены" являются или представляют собой разные части белкового комплекса или фрагменты таких частей белкового комплекса. Кроме того, также рассматривается, что в контексте полипептидной конструкции по изобретению должен использоваться более чем один домен, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков, образующих/принимающих конформацию случайного клубка. Соответственно, указанные "первые домены", представляющие собой аминокислотные отрезки, которые имеют и/или опосредуют интересующую или желательную биологическую активность, могут находиться между двумя "вторыми доменами" (т.е. доменами, которые содержат аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков, образующих/принимающих конформацию случайного клубка). Следовательно, "отрезки с конформацией случайного клубка" могут находиться и N-терминально, и С-терминально по отношению к домену, имеющему и/или опосредующему желательную биологическую активность. Как проиллюстрировано примерами здесь ниже, биологически активные белки по изобретению, которые модифицированы так, что содержат домен с конформацией случайного клубка, неожиданно демонстрируют повышенную стабильность in vivo и/или in vitro по сравнению с немодифицированными биологически активными белками, которые не имеют указанного домена с конформацией случайного клубка. Термин "стабильность in vivo" в том виде, как он здесь используется, относится к способности конкретного вещества, которое вводят в живой организм, оставаться биологически доступным и биологически активным. In vivo вещество может удаляться и/или инактивироваться благодаря экскреции, агрегации, деградации и/или другим метаболическим процессам. Соответственно, в контексте настоящего изобретения биологически активные белки, которые имеют повышенную стабильность in vivo, могут хуже экскретироваться через почки (с мочой) или через кал и/или могут быть более устойчивыми против протеолиза, конкретно - против протеолиза in vivo в биологических жидкостях, подобных крови, спинномозговой жидкости, перитонеальной жидкости и лимфе. В одном воплощении повышенная стабильность in vivo биологически активного белка проявляется в продолжительном периоде полувыведения указанного биологически активного белка в плазме. Способы измерения стабильности биологически активных белков in vivo известны в данной области. Как проиллюстрировано здесь ниже примерами, биологически активные белки можно специфически определять в плазме крови и использованием методик Вестерн-блоттинга или твердофазного иммуно- 14021222 ферментного анализа (ELISA). Тем не менее, специалисту в данной области известно, что для специфического измерения периода полувыведения интересующего белка в плазме можно использовать другие способы. Такие способы включают, но не ограничиваются, физическим определением радиоактивно меченого интересующего белка. Способы радиоактивного мечения белков, например посредством радиойодирования, известны в данной области. Термин "повышенная стабильность in vitro" в том виде, как он здесь используется, относится к способности биологически активного белка не поддаваться деградации и/или агрегации и поддерживать его исходную биологическую активность в среде in vitro. Способы измерения биологической активности биологически активных белков хорошо известны в данной области. В другом воплощении настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим биологически активные белки, как здесь описано. Соответственно, указанная молекула нуклеиновой кислотыможет содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид,имеющий биологическую активность, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность аминокислот, которые образуют/принимают конформацию случайного клубка. В еще одном другом воплощении указанная молекула нуклеиновой кислоты может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую одну из раскрытых здесь аминокислотных отрезков, который образует/принимает конформацию случайного клубка. Подразумевается, что термин "молекула нуклеиновой кислоты" в том виде, как он здесь используется, включает молекулы нуклеиновых кислот, такие как молекулы ДНК и молекулы РНК. Указанная молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК. Предпочтительно указанная молекула нуклеиновой кислоты может содержаться в векторе. Кроме того, рассматривается трансфекция клеток молекулой нуклеиновой кислоты или векторами,как здесь описано. В другом воплощении настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые при экспрессии кодируют биологически активные белки по изобретению. Кроме того, в другом воплощении настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые при экспрессии кодируют раскрытые здесь полипептиды, которые полностью или частично образуют/принимают конформацию случайного клубка при физиологических условиях. Указанные молекулы нуклеиновой кислоты могут быть слиты с подходящими последовательностями контроля экспрессии,которые, как известно в данной области, обеспечивают правильную транскрипцию и трансляцию полипептида, а также с сигнальными последовательностями для обеспечения клеточной секреции или адресования к органеллам. Такие векторы могут содержать другие гены, такие как маркерные гены, которые допускают селекцию указанного вектора в подходящей клетке-хозяине и при подходящих условиях. Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержится в рекомбинантном векторе, в котором молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая описанный здесь биологически активный белок, связана функциональным образом с последовательностями контроля экспрессии, обеспечивающими экспрессию в прокариотических или в эукариотических клетках. Экспрессия указанной молекулы нуклеиновой кислоты включает транскрипицию данной молекулы нуклеиновой кислоты в транслируемую мРНК. Регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в прокариотических клеткаххозяевах, включают, например, лямбда PL, lac, trp, tac, tet или Т 7 промотор в Е.coli. Возможные регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в эукариотических клетках, предпочтительно в клетках млекопитающих или в дрожжах, хорошо известны специалистам в данной области. Они обычно включают регуляторные последовательности, обеспечивающие инициацию транскрипции и, возможно, полиА сигналы, обеспечивающие терминацию транскрипции и стабилизацию транскрипта. Дополнительные регуляторные элементы могут включать энхансеры транскрипции, а также трансляции и/или ассоциированные в природе или гетерологичные промоторные области. Примерами регуляторных элементов,обеспечивающих экспрессию в эукариотических клетках-хозяевах, являются промотор АОХ 1 или GAL1 в дрожжах или промотор CMV (вирус мозаики цветной капусты), SV40 (вирус обезьян 40), RSV (вирус саркомы Рауса), энхансер CMV, энхансер SV40 или интрон глобина в клетках млекопитающих и в других клетках животных. Помимо элементов, которые отвечают за инициацию транскрипции, такие регуляторные элементы также могут включать сигналы терминации транскрипции, такие как поли-А сайтSV40 или поли-А сайт tk ниже по течению от кодирующей области. Для конструирования рекомбинантных векторов можно использовать способы, которые хорошо известны специалистам в данной области (смотрите, например, методики, описанные в Sambrook (1989),Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. и Ausubel (1989), Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y). В этом контексте в данной области известны подходящие векторы экспрессии, такие как вектор экспрессии кДНК ОкаямаБерга pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAI, pcDNA3, pPICZalpha A (Invitrogen) или pSPORT1(GIBCO BRL). Кроме того, в зависимости от системы экспрессии, которая используется, к кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть добавлены лидерные последовательности, способные направлять полипептид в клеточный компартмент или секретировать его в культуральную среду. Настоящее изобретение также относится к векторам, конкретно - к плазмидам, космидам, вирусам и бактериофагам, которые традиционно используются в генной инженерии, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую биологически активный белок по изобретению. Следовательно, настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Предпочтительно указанный вектор представляет собой вектор экспрессии и/или вектор переноса или направленной доставки генов. Векторы экспрессии, происходящие из вирусов, таких как ретровирусы, вирус осповакцины, вирус, ассоциированный с аденовирусом, вирусы герпеса или вирус папилломы крупного рогатого скота, можно использовать для доставки полинуклеотидов или вектора по изобретению в намеченные популяции клеток. Векторы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, могут быть перенесены в клетки-хозяева хорошо известными способами, которые варьируют в зависимости от типа клеточного хозяина. Соответственно, данное изобретение, кроме того, относится к клетке, содержащей указанную молекулу нуклеиновой кислоты или указанный вектор. Такие способы, например, включают методики, описанные Sambrook (1989), loc. cit. и Ausubel (1989), loc.cit. Соответственно, трансфекция с хлоридом кальция обычно используется для прокариотических клеток, тогда как обработку фосфатом кальция или электропорацию можно использовать для других клеточных хозяев (см. Sambrook (1989), loc. cit.). В качестве другой альтернативы, молекулы нуклеиновой кислоты и векторы по изобретению можно растворять в липосомах для доставки в клетки-мишени. Молекула нуклеиновой кислоты или вектор по изобретению, который присутствует в клетке-хозяине, может быть либо интегрированным в геном клетки-хозяина, или он может сохраняться внехромосомно. Соответственно, настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор по данному изобретению. Клетки-хозяева для экспрессии полипептидов хорошо известны в данной области и включают прокариотические клетки, а также эукариотические клетки,например, клетки E.coli, дрожжевые клетки, клетки беспозвоночных, клетки CHO (клетки яичников китайского хомячка), клетки CHO-K1, клетки Hela, клетки обезьян COS-1, клетки меланомы, такие как клетки Боуса (Bowes cells), мышиные клетки L-929, линии 3 Т 3, происходящие от мышей Swiss, Balb-c или NIH, линии клеток хомяка BHK или HaK и т.п. В другом аспекте настоящее изобретение включает способы получения биологически активных белков по изобретению, включающие культивирование клетки-хозяина по данному изобретению и выделение указанного биологически активного белка из культуры, как здесь описано. Биологически активный белок по изобретению, содержащий домен с конформацией случайного клубка, можно продуцировать генной инженерией, например, путем культивирования клетки, содержащей описанную молекулу нуклеиновой кислоты или векторы, которые кодируют биологически активный белок по изобретению, и выделения указанного биологически активного белка из культуры. Биологически активный белок по изобретению можно продуцировать в любой подходящей системе клеточной культуры, включая прокариотические клетки, например E.coli BL21 или JM83, или эукариотические клетки, например клетки штамма Х-33 дрожжей Pichia pastoris или клетки CHO. Другие подходящие линии клеток, известные в данной области, можно получить из банков клеточных линий, подобных Американской коллекции типовых культур (АТСС). Подразумевается, что термин "прокариотический" включает бактериальные клетки,тогда как подразумевается, что термин "эукариотический" включает клетки дрожжей, высших растений,насекомых и млекопитающих. Трансформированных хозяев можно выращивать в ферментерах и культивировать согласно методикам, известным в данной области, для достижения оптимального роста клеток. В другом воплощении настоящее изобретение относится к способу получения биологически активного белка, описанного выше, включающему культивирование клетки по изобретению при условиях, подходящих для экспрессии биологически активного белка и выделение данного биологически активного белка из клетки или из культуральной среды. Биологически активный белок по изобретению можно выделять из ростовой среды, клеточных лизатов или клеточных мембранных фракций. Выделение и очистку экспрессируемых полипептидов по изобретению можно проводить любыми традиционными способами (Scopes (1982), "Protein Purification",Springer-Verlag, N.Y.), включая осаждение сульфатом аммония, аффинные колонки, колоночную хроматографию, гель-электрофорез и т.п., и они могут включать применение моноклональных или поликлональных антител, направленных, например, против метки, слитой с биологически активным белком по изобретению. Например, данный белок можно очистить посредством Strep-метки II, с использованием аффинной хроматографии со стрептавидином (Skerra (2000), Methods Enzymol. 326:271-304), как описано в приложенных примерах. Предпочтительными для фармацевтических применений являются, по существу, чистые полипептиды по меньшей мере примерно 90-95% гомогенности и наиболее предпочтительно 98-99% гомогенности или более. В зависимости от хозяина, применяемого в методике получения, полипептиды по настоящему изобретению могут быть гликозилированными или негликозилированными. Данное изобретение, кроме того, относится к применению биологически активного белка по изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, вектора по изобретению или клетки-хозяина по изобретению для получения лекарственного средства, где указанный биологически активный белок имеет повышенную стабильность in vivo и/или in vitro. В еще одном воплощении настоящее изобретение относится к способу лечения заболеваний и/или расстройств, при которых полезна повышенная стабильность указанного биологически активного белка,включающему введение данного биологически активного белка, как здесь определено, млекопитающему,нуждающемуся в таком лечении. В зависимости от биологической активности белка по изобретению специалист легко может определить, какое заболевание/расстройство подлежит лечению специфическим биологически активным белком по изобретению. Некоторые неограничивающие примеры перечислены в следующей таблице. Настоящее изобретение также относится к применению молекул нуклеиновых кислот, векторов, а также трансфицированных клеток, содержащих молекулы нуклеиновых кислот или векторы по настоящему изобретению, в медицинских способах, как, например, способы генотерапии на основе клеток или способы генотерапии на основе нуклеиновых кислот. В другом воплощении биологически активный белок по изобретению, содержащий определенные здесь "первый" и "второй" домены (или молекула нуклеиновой кислоты, или вектор, или клетка-хозяин по настоящему изобретению) по изобретению является частью композиции. Указанная композиция может содержать один или более чем один биологически активный белок или молекулу нуклеиновой кислоты, вектор или клетку-хозяина по изобретению, кодирующие и/или экспрессирующие данный белок. Указанная композиция может быть фармацевтической композицией, возможно дополнительно содержащей фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель. В другом воплощении настоящее изобретение относится к применению описанного здесь биологически активного белка для изготовления фармацевтической композиции для предупреждения, лечения или облегчения заболеваний, которые требуют приема такой фармацевтической композиции. В другом воплощении композиция, как она определена здесь, может быть диагностической композицией, возможно дополнительно содержащей подходящие средства для определения, где указанная диагностическая композиция имеет повышенную стабильность in vivo и/или in vitro. Композиции по данному изобретению могут находиться в твердой или в жидкой форме или могут,среди прочего, находиться в форме порошка(ов), таблетки(ок), раствора(ов) или аэрозоля(ей). Кроме того, рассматривается, что лекарственное средство по изобретению может содержать другие биологически активные агенты, в зависимости от намеченного применения данной фармацевтической композиции. Введение подходящих (фармацевтических) композиций может осуществляться разными путями,например парентеральным, подкожным, внутрибрюшинным, местным, внутрибронхиальным, внутрилегочным и интраназальным введением и, если это желательно для местного лечения, введением в пораженный участок. Парентеральные пути введения включают внутрибрюшинное, внутримышечное, внутрикожное, подкожное, внутривенное или внутриартериальное введение. Композиции по изобретению также можно вводить непосредственно в сайт-мишень, например, посредством биолистической доставки в наружный или во внутренний сайт-мишень, подобный органу, на который было оказано специфическое воздействие. Примеры подходящих фармацевтических носителей, эксципиентов и/или разбавителей хорошо известны в данной области и включают физиологические растворы с фосфатным буфером, воду, эмульсии,такие как эмульсии типа "масло-в-воде", разные типы увлажнителей, стерильные растворы и т.д. Композиции, содержащие такие носители, можно приготовить в виде препаратов хорошо известными традиционными способами. Подходящие носители могут содержать любое вещество, которое при объединении с биологически активным белком по изобретению сохраняет биологическую активность данного биологически активного белка (см. Remington's Pharmaceutical Sciences (1980), 16th ed., Osol, A. Ed). Препараты для парентерального введения могут включать стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии). Буферы, растворители и/или эксципиенты в том виде, как они применяются в контексте данной фармацевтической композиции, предпочтительно являются "физиологическими", как определено здесь выше. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, водно-спиртовые растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и забуференные среды. Парентеральные наполнители могут включать раствор хлорида натрия, раствор Рингера с декстрозой, раствор декстрозы и хлорида натрия, раствор Рингера с лактатом или нелетучие масла. Внутривенные наполнители могут включать жидкие или питательные добавки, электролитные добавки (такие как добавки на основе раствора Рингера с декстрозой) и т.п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, включая, например, противомикробные,антиоксидантные, хелатирующие агенты, инертные газы и т.п. Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать белковые носители, подобные, например, сывороточному альбумину или иммуноглобулину, предпочтительно человеческого происхождения. Эти фармацевтические композиции можно вводить субъекту в подходящей дозе. Режим дозировки будет определяться лечащим врачом и клиническими факторами. Как хорошо известно в области медицины, дозировки для любого пациента зависят от многих факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, подлежащее введению, пол, время и путь введения,общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, которые вводятся совместно. Фармацевтически активное вещество может присутствовать в количествах от 1 мкг до 20 мг/кг массы тела на дозу,например от 0,1 до 10 мг/кг массы тела, например от 0,5 до 5 мг/кг массы тела. Если схемой введения является непрерывная инфузия, фармацевтически активное вещество также должно составлять от 1 мкг до 10 мг/кг массы тела/мин. Тем не менее, дозировки меньше или больше указанных примерных интервалов также рассматриваются, особенно принимая во внимание вышеупомянутые факторы. Кроме того, рассматривается, что фармацевтическая композиция по изобретению может содержать другие биологически активные агенты, в зависимости от намеченного применения данной фармацевтической композиции. Эти другие биологически активные агенты могут представлять собой, например,антитела, фрагменты антител, гормоны, факторы роста, ферменты, связывающие молекулы, цитокины,хемокины, молекулы нуклеиновых кислот и лекарственные средства. Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается фармацевтическими композициями. Также рассматриваются композиции, подлежащие применению в исследованиях или в качестве диагонстического(их) средства(в). Например, рассматривается, что биологически активные белки, содержа- 18021222 щие домен с конформацией случайного клубка, как здесь определено, используются в диагностической установке. Для такой цели биологически активный белок по данному изобретению, содержащий определенный здесь "первый" и "второй" домен, может быть меченным детектируемой меткой. Такие метки включают, но не ограничиваются ими, радиоактивные метки (такие как [3 Н]водород, [125I]йодид или[123I]йодид), флуоресцентные метки (включая, но не ограничиваясь, флуоресцентные белки, например зеленый флуоресцентный белок (GFP), или флуорофоры, например флуоресцеинизотиоцианат (FITC,или ЯМР (ядерный магнитный резонанс) метки (например, хелаты гадолиния). Определенные здесь метки или маркеры ни в коей мере не являются ограничивающими и просто представляют собой иллюстративные примеры. Диагностические композиции по данному изобретению являются особенно полезными в экспериментах с введением метки или в диагностических медицинских установках. В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен набор, включающий биологически активный белок, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный биологически активный белок, вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, или клетку, содержащую указанную нуклеиновую кислоту или указанный вектор, как здесь описано. Преимущественно набор по настоящему изобретению дополнительно содержит возможно буфер(ы), растворы для хранения и/или остальные реактивы или вещества, необходимые для проведения медицинских, научных или диагностических анализов и для соответствующих целей. Кроме того, части данного набора по изобретению могут быть упакованы по отдельности в сосуды или бутыли либо в комбинации в контейнеры или в блоки из многих контейнеров. Набор по настоящему изобретению можно преимущественно использовать, среди прочего, для осуществления способа по изобретению, и он мог бы использоваться в целом ряде приложений, на которые здесь дается ссылка, например, в качестве диагностических наборов, в качестве исследовательских инструментов или в качестве медицинских инструментов. Дополнительно набор по изобретению может содержать средства определения, подходящие для научных, медицинских и/или диагностических целей. Изготовление данных наборов предпочтительно следует стандартным методикам, которые известны специалисту в данной области. Данное изобретение далее проиллюстрировано следующими неограничивающими графическими материалами и примерами. Графические материалы Фиг. 1. Конструкция гена для последовательностей полимеров Pro-Ala-Ser1 (PAS1;(A) Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность строительного блока дляPAS1 (SEQ ID NO: 29 и 30 соответственно), полученная гибридизацией двух комплементарных олигодезоксинуклеотидов с двумя липкими концами (строчные буквы), которые совместимы с сайтами рестрикции ЕсоО 109I и SapI.(Б) Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность строительного блока дляPAS2 (SEQ ID NO: 31 и 32 соответственно), полученная гибридизацией двух комплементарных олигодезоксинуклеотидов с двумя липкими концами (строчные буквы), которые совместимы с сайтами рестрикции EcoO109I и SapI.(B) Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность строительного блока дляPAS3 (SEQ ID NO: 33 и 34 соответственно), полученная гибридизацией двух комплементарных олигодезоксинуклеотидов с двумя липкими концами (строчные буквы), которые совместимы с сайтами рестрикции ЕсоО 109I и SapI.(Г) Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность строительного блока PAS5(SEQ ID NO: 35 и 36 соответственно), полученная гибридизацией двух комплементарных олигодезоксинуклеотидов с двумя липкими концами (строчные буквы), которые совместимы с сайтами рестрикции(Д) Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность строительного блока PAS1P2(SEQ ID NO: 39 и 40 соответственно), полученная гибридизацией двух комплементарных олигодезоксинуклеотидов с двумя липкими концами (строчные буквы), которые совместимы с сайтами рестрикции(Е) Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность строительного блока piSA(SEQ ID NO: 37 и 38 соответственно), полученная гибридизацией двух комплементарных олигодезоксинуклеотидов с двумя липкими концами (строчные буквы), которые совместимы с сайтами рестрикцииEcoO109I и SapI. Фиг. 2. Стратегия клонирования для последовательностей полимера Pro-Ala-Ser в виде слияния с(A) Отрезок нуклеотидной последовательности pASK-2xSapI, производного pASK75, используемый для субклонирования последовательности полимера (SEQ ID NO: 55). Данная нуклеотидная последовательность кодирует два сайта рестрикции SapI в обратной комплементарной ориентации, что приводит(Б) Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 41 и 42 соответственно) полимера PAS1 с 200 остатками после вставки в плазмиду pASK-2xSapI, что даетpPAS(1)200. Обозначены сайты рестрикции SapI, фланкирующие последовательность полимера (распознаваемые последовательности подчеркнуты).(B) Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 43 и 44 соответственно) IFN-2b после клонирования pASK-IBA4 (IBA GmbH, Gttingen). Обозначены одиночные сайты рестрикции KasI и HindIII, используемые для клонирования слитого белка, а также одиночный сайт рестрикции SapI для вставки последовательности полимера (распознаваемые последовательности подчеркнуты). Подчеркнуты две С-концевые аминокислоты Strep-метки II. Первая аминокислота зрелого(Г) Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность N-конца IFN-2b после вставки последовательности полимера PAS1 (SEQ ID NO: 45 и 46 соответственно). Обозначены одиночные сайты рестрикции KasI, HindIII и SapI (распознаваемые последовательности подчеркнуты). Первая аминокислота IFN-2b в виде части слитого белка обозначена (1), и две С-концевые аминокислоты Strepметки II подчеркнуты.(Д) Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 47 и 48 соответственно) IL-1ra после клонирования на pASK-IBA4 (IBA GmbH, Gttingen). Обозначены одиночные сайты рестрикции KasI и HindIII, используемые для клонирования слитого белка, а также одиночный сайт рестрикции SapI для вставки последовательности полимера (распознаваемые последовательности подчеркнуты). Подчеркнуты две С-концевые аминокислоты Strep-метки II. Первая аминокислота зрелого(Е) Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность N-конца IL-1ra после вставки последовательности полимера PAS1 (SEQ ID NO: 49 и 50 соответственно). Обозначены одиночные сайты рестрикции KasI, HindIII и SapI (распознаваемые последовательности подчеркнуты). Первая аминокислота IL-1ra в виде части слитого белка обозначена (1), и две С-концевые аминокислоты Strep-метки II подчеркнуты.(Ж) Карта плазмиды pPAS(1)200-IFN-2b. Структурный ген PAS(1)200-IFN-2b (содержащий бактериальный сигнальный пептид OmpA, Strep-метку II, полимер PAS1 с 200 остатками, т.е. 10 повторяющихся копий последовательности, показанной на фиг. 1 А, PAS(1)200, и человеческий IFN-2b) находится под транскрипционным контролем тетрациклинового промотора/оператора (tetp/o) и заканчивается терминатором липопротеина (tlpp). Каркас плазмиды, т.е. находящийся вне кассеты экспрессии, фланкированный сайтами рестрикции XbaI и HindIII, идентичен каркасу стандартного вектора клонирования и экспрессии pASK75 (Skerra (1994) Gene 151:131-135). Указаны единичные сайты рестрикции. Векторы экспрессии для PAS(1)400-IFN-2b и PAS(1)600-IFN-2b являются идентичными за исключением того, что вместо PAS(1)200 кодируется полимер PAS1 с 400 или 600 остатками, т.е. с 20 или 30 повторяющимися копиями последовательности, показанной на фиг. 1 А. Аналогично, векторы экспрессии для PAS(2)200-IFN-2b и PAS(3)200-IFN-2b несут полимерPAS2 или PAS3 из 200 (остатков), т.е. с 10 повторяющимися копиями последовательностей, показанных на фиг. 1 Б и 1 В соответственно. Аналогично, векторы экспрессии для PAS(5)192-IFN-2b иPAS(5)384-IFN-2b несут полимер PAS5 из 192 или 384 остатков, т.е. 8 или 16 повторяющихся копий последовательностей, показанных на фиг. 1 Г. Аналогично, вектор экспрессии для PAS(1P2)140-IFN-2b несет полимер PAS1P2 из 140 остатков, т.е. 7 повторяющихся копий последовательности, показанной на фиг. 1 Д. Векторы экспрессии для PAS(1)200-IL-1ra, PAS(1)400-IL-1ra, PAS(5)192-IL-1ra иPAS(5)384-IL-1ra являются аналогичными соответствующим векторам для IFN-2b за исключением того, что они несут кодирующий ген для IL-1ra вместо IFN-2b. Фиг. 3. Стратегия клонирования для последовательностей полимеров Pro-Ala-Ser и Ser-Ala согласно фиг. 1 в виде слияния с человеческим липокалином, ассоциированным с желатиназой нейтрофилов,NGAL.(A) Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 51 и 52 соответственно) С-конца (подчеркнута) варианта NGAL, несущего Strep-метку II (аминокислотная последовательность выделена курсивом), клонированная на производном pASK75, pNGAL15 (Breustedt (2006)Biochim. Biophys. Acta, 1764:161-173). Сайт рестрикции ЕсоО 109I был введен на стыке обеих кодирующих областей, что при расщеплении приводит к выступающим концам, которые совместимы с синтетической кассетой генов (указанной полосками), давая pNGAL15-Eco. Обозначен уникальный сайт рестрикции HindIII на 3'-конце кассеты экспрессии (распознаваемая последовательность подчеркнута).(Б) Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 53 и 54 соответственно) С-конца NGAL после вставки последовательности полимера PAS1 с последующейStrep-меткой II (курсив). Обозначен уникальный сайт рестрикции HindIII на 3'-конце кассеты экспрессии гена (распознаваемая последовательность подчеркнута).(B) Карта плазмиды pNGAL-PAS(1)200. Структурный ген NGAL-PAS(1)200 (содержащий сигнальный пептид OmpA, модифицированный NGAL и PAS1 с 200 остатками, PAS(1)200, а также Strepметку II) находится под транскрипционным контролем тетрациклинового промотора/оператора (tetp/o) и заканчивается терминатором липопротеина (tlpp). Каркас плазмиды, т.е. находящийся вне кассеты экспрессии, фланкированный сайтами рестрикции XbaI и HindIII, идентичен каркасу стандартного вектора клонирования и экспрессии pASK75 (Skerra (1994), Gene, 151:131-135). Указаны единичные сайты рестрикции. Векторы экспрессии для NGAL-PAS(1)100 и NGAL-piSA100 являются идентичными за исключением того, что кодируется полимер PAS1 или piSA согласно фиг. 1 лишь со 100 остатками. Фиг. 4. Анализ очищенного рекомбинантного IFN-2b, IL-1ra и NGAL, а также их полимерных слияний посредством SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) с последующим окрашиванием кумасси бриллиантовым синим R-250. Рекомбинантные белки продуцировали в E.coli BL21 посредством периплазматической секреции и очищали посредством Strep-метки II с использованием аффинной хроматографии со стрептавидином.(А) Анализ очищенного рекомбинантного IFN-2b и его слияний с PAS1 с 200, 400 или 600 остатками, соответственно, посредством 10% SDS-PAGE. Гель показывает 2 мкг белковые пробы каждого изIFN-2b, PAS(1)200-IFN-2b, PAS(1)400-IFN-2b и PAS(1)600-IFN-2b. Пробы на левой стороне восстанавливали 2-меркаптоэтанолом, тогда как соответствующие пробы на правой стороне оставляли невосстановленными. Размеры белковых маркеров (кДа), нанесенных при восстанавливающих условиях,указаны слева. Все четыре белка проявляются как одиночные гомогенные полосы с кажущимися молекулярными размерами примерно 20, примерно 80, примерно 170 и примерно 300 кДа соответственно в восстановленной форме. Эти значения значительно больше, чем расчетные массы 37,4 кДа дляPAS(1)200-IFN-2b, 54,0 кДа для PAS(1)400-IFN-2b и 70,5 кДа для PAS(1)600-IFN-2b. Этот эффект очевидно обусловлен полимерами Pro-Ala-Ser разной длины, так как сам IFN-2b с расчетной массой 20,9 кДа демонстрирует нормальную электрофоретическую подвижность. IFN-2b в невосстановленном состоянии имеет немного большую электрофоретическую подвижность благодаря более компактной форме, происходящей из-за его двух внутримолекулярных дисульфидных мостиков.(Б) Анализ очищенного рекомбинантного PAS(5)192-IFN-2b и PAS(5)384-IFN-2b посредством 10% SDS-PAGE. Гель показывает 2 мкг пробы каждого белка. Пробы на левой стороне восстанавливали 2-меркаптоэтанолом, тогда как соответствующие пробы на правой стороне оставляли невосстановленными. Размеры белковых маркеров (кДа), нанесенных при восстанавливающих условиях, указаны слева. Два белка проявляются как одиночные гомогенные полосы с кажущимися молекулярными размерами примерно 75 и примерно 120 кДа соответственно как в восстановленном, так и в невосстановленном состояниях. Это значительно больше, чем расчетные массы 36,7 кДа для PAS(5)192-IFN-2b и 52,6 кДа для PAS(5)384-IFN-2b. Этот эффект вновь обусловлен полимерами Pro-Ala-Ser разной длины.SDS-PAGE. Гель показывает 2 мкг пробы каждого белка, восстановленные 2-меркаптоэтанолом. Размеры белковых маркеров (кДа) указаны слева. Шесть белков проявляются как одиночные гомогенные полосы с кажущимися молекулярными размерами примерно 75 кДа (PAS(1)200-IFN-2b, PAS(2)200-IFN-2b,PAS(3)200-IFN-2b), 70 кДа (PAS(5)192-IFN-2b), 40 кДа (PAS(1P2)140-IFN-2b) и примерно 20 кДа(IFN-2b), соответственно. Таким образом, данные слияния с полимерами показывают значительно большие размеры, чем расчетные массы 37,4 кДа для PAS(1)200-IFN-2b, 37,4 кДа дляPAS(1P2)140-IFN-2b. Этот эффект вновь обусловлен Pro-Ala-Ser полимерами разной длины.(Г) Анализ очищенного рекомбинантного IL-1ra и его слияний с PAS1 и PAS5 с 200, 400 или 192 и 384 остатками соответственно, посредством 12% SDS-PAGE. Гель показывает 2 мкг белковые пробы каждого из IL-1ra, PAS(1)200-IL-1ra, PAS(1)400-IL-1ra, PAS(5)192-IL-1ra и PAS(5)384-IL-1ra,восстановленных 2-меркаптоэтанолом. Размеры белковых маркеров (кДа) указаны слева. Все пять белков проявляются как одиночные гомогенные полосы с кажущимися молекулярными размерами примерно 20,примерно 70, примерно 140, 66 и примерно 125 кДа соответственно. Для слияний с полимерами эти значения значительно больше, чем расчетные массы 35,3 кДа для PAS(1)200-IL-1ra, 51,9 кДа дляPAS(1)400-IL-1ra, 34,6 для PAS(5)192-IL-1ra и 50,5 кДа для PAS(5)384-IL-1ra. Этот эффект очевидно обусловлен полимерами Pro-Ala-Ser разной длины, так как сам IL-1ra с расчетной массой 19,8 кДа демонстрирует нормальную электрофоретическую подвижность.(Д) Анализ очищенных рекомбинантных NGAL и его слияний с полимером PAS1 со 100 или 200 остатками соответственно посредством 12% SDS-PAGE. Гель показывает 4 мкг белковые пробы каждого из NGAL, NGAL-PAS(1)100 и NGAL-PAS(1)200. Пробы на левой стороне восстанавливали 2-меркаптоэтанолом, тогда как соответствующие пробы на правой стороне оставляли невосстановленными. Размеры белковых маркеров (кДа), нанесенных при восстанавливающих условиях, указаны слева.NGAL-PAS(1)100 и NGAL-PAS(1)200 проявляются как одиночные гомогенные полосы с кажущимися молекулярными размерами примерно 45 и примерно 60 кДа соответственно как в восстановленном, так и в невосстановленном состояниях. Это значительно больше, чем расчетные массы 29,8 кДа дляNGAL-PAS(1)100 и 38,1 кДа для NGAL-PAS(1)200. Этот эффект обусловлен полимерамиPro-Ala-Ser разной длины, так как сам NGAL с расчетной массой 21,5 кДа демонстрирует нормальную электрофоретическую подвижность. Фиг. 5. Количественный анализ гидродинамических объемов очищенных рекомбинантных IFN-2b,IL-1ra, NGAL, а также их слияний с полимерами.PAS(1)600-IFN-2b. 250 мкл каждого белка в концентрации 0,25 мг/мл наносили на колонку SuperdexS200 10/300 GL, уравновешенную с физиологическим раствором с фосфатным буфером, PBS. Отслеживали поглощение при 280 нм и пик каждого хроматографического разделения нормировали к значению 1. Стрелка показывает исключенный объем колонки (8,0 мл).(Б) Аналитическая гель-фильтрация PAS(5)192-IFN-2b и PAS(5)384-IFN-2b. 250 мкл белка в концентрации 0,25 мг/мл наносили на колонку Superdex S200 10/300 GL, уравновешенную с PBS буфером. Отслеживали поглощение при 280 нм и пик каждого хроматографического разделения нормировали к значению 1. Стрелка показывает исключенный объем колонки (8,0 мл).(B) Калибровочная кривая для хроматограмм из (А) и (Б) с использованием Superdex S200 10/300 GL. Логарифм молекулярной массы (MW) маркерных белков (РНКаза А, 13,7 кДа; карбоангидраза, 29,0 кДа; овальбумин, 43,0 кДа; бычий сывороточный альбумин, 66,3 кДа; трансферрин, 81,0 кДа; алкогольдегидрогеназа, 150 кДа) откладывали на графике относительно их элюирующего объема (черные кружки) и аппроксимировали прямой линией. Из наблюдаемых элюирующих объемов IFN-2b и его слитых белков (черные квадратики) было определено, что их кажущиеся молекулярные массы являются следующими: IFN-2b: 22,5 кДа (расчетная: 20,9 кДа); PAS(1)200-IFN-2b: 176 кДаPAS(1P2)140-IFN-2b. 250 мкл каждого белка в концентрации 0,25 мг/мл наносили на колонку SuperdexS200 10/300 GL, уравновешенную с физиологическим раствором с фосфатным буфером, PBS. Отслеживали поглощение при 280 нм и пик каждого хроматографического разделения нормировали к значению 1. Стрелка показывает исключенный объем колонки (V0=8,0 мл).(Д) Калибровочная кривая для хроматограмм из (Г) с использованием той же самой колонкиSuperdex S200 10/300 GL. Логарифм молекулярной массы (MW) маркерных белков (РНКаза А, 13,7 кДа; карбоангидраза, 29,0 кДа; овальбумин, 43,0 кДа; бычий сывороточный альбумин, 66,3 кДа; трансферрин,81,0 кДа; алкогольдегидрогеназа, 150 кДа) откладывали на графике относительно их элюирующего объема (черные кружки) и аппроксимировали прямой линией. Из наблюдаемых элюирующих объемовIFN-2b и его слитых белков (черные квадратики) было определено, что их кажущиеся молекулярные размеры являются следующими: PAS(2)200-IFN-2b: 168 кДа (расчетная: 37,4 кДа);IL-1ra,PAS(1)200-IL-1ra,PAS(1)400-IL-1ra,PAS(5)192-IL-1ra и PAS(5)384-IL-1ra. 250 мкл каждого белка в концентрации 0,25 мг/мл наносили на колонку Superdex S200 10/300 GL, уравновешенную с физиологическим раствором с фосфатным буфером, PBS. Отслеживали поглощение при 280 нм и пик каждого хроматографического разделения нормировали к значению 1. Стрелка показывает исключенный объем колонки. Для лучшей ясности показаны только пики.(Ж) Калибровочная кривая для хроматограмм из (Е) с использованием той же самой колонкиSuperdex S200 10/300 GL. Логарифм молекулярной массы (MW) маркерных белков (РНКаза А, 13,7 кДа; карбоангидраза, 29,0 кДа; овальбумин, 43,0 кДа; бычий сывороточный альбумин, 66,3 кДа; трансферрин,81,0 кДа; алкогольдегидрогеназа, 150 кДа) откладывали на графике относительно их элюирующих объемов (черные кружки) и аппроксимировали прямой линией. Из наблюдаемых элюирующих объемовIL-1ra и его слитых белков (черные квадратики) было определено, что их кажущиеся молекулярные размеры являются следующими: IL-1ra: 19,8 кДа (расчетный: 18,8 кДа); PAS(1)200-IL-1ra: 161 кДаNGAL-piSA100. 250 мкл каждого белка в концентрации 0,25 мг/мл наносили либо на колонку SuperdexNGAL-PAS(1)200), уравновешенную с PBS буфером. Отслеживали поглощение при 280 нм и пик каждого хроматографического разделения нормировали к значению 1. Стрелка показывает исключенные объемы колонок (7,5 и 8,2 мл соответственно).(И) Калибровочные кривые для хроматограмм из (З) с использованием Superdex S75 10/300 GL иSuperdex S200 10/300 GL. Логарифм молекулярной массы (MW) маркерных белков (Superdex S75 10/300GL: цитохром с, 12,4 кДа; карбоангидраза, 29,0 кДа; овальбумин, 43,0 кДа; бычий сывороточный альбумин, 66,3 кДа; трансферрин, 81,0 кДа; алкогольдегидрогеназа, 150 кДа) откладывали на графике относительно их элюирующих объемов (черные кружки) и аппроксимировали прямой линией. Из наблюдаемых элюирующих объемов NGAL и его слитых белков (черные квадратики) было определено, что их кажущиеся молекулярные массы являются следующими: NGAL: 21,5 кДа (расчетная: 21,5 кДа);NGAL-piSA100: 54 кДа (расчетная: 29,4 кДа). Фиг. 6. Экспериментальный анализ вторичной структуры очищенного рекомбинантного IFN-2b,IL-1ra, NGAL, а также их слияний с полимерами посредством спектроскопии кругового дихроизма (CD). Спектры записывали при комнатной температуре в 50 мМ K2SO4, 20 мМ K-фосфате, рН 7,5 и нормировали к молярной эллиптичности, M, для каждого белка.IFN-2b,PAS(1)200-IFN-2b, PAS(1)400-IFN-2b и PAS(1)600-IFN-2b. CD спектр IFN-2b показывает типичные характеристики преимущественно -спирального белка с двумя негативными максимумами около 208 и 220 нм (Sreerama in: Circular Dichroism - Principles and Applications (2000), Berova, Nakanishi andWoody (Eds.) Wiley, New York, 601-620), что указывает на правильное сворачивание человеческогоIFN-2b, продуцированного в бактерии. Спектры его слитых белков с полимером Pro-Ala-Ser выявляют характерные отклонения с доминирующим негативным минимумом около 205 нм, который явно указывает на конформацию случайного клубка. Кроме того, имеется плечо около 220 нм, которое образуется из-за вклада -спирали IFN-2b и указывает на правильное сворачивание IFN-2b даже в виде части слитого белка.PAS(1)600-IFN-2b, полученные путем вычитания спектра IFN-2b из спектра соответствующего слитого белка. Все разностные CD спектры для полимеров PAS1 с 200, 400 и 600 остатками показывают сильный минимум около 200 нм, который является ясным указанием их конформации случайного клубка в забуференном водном растворе (Greenfield (1969), Biochemistry, 8: 4108-4116; Sreerama (2000), loc. cit.;(B) Спектры кругового дихроизма (CD) очищенных рекомбинантных PAS(2)200-IFN-2b,PAS(3)200-IFN-2b и PAS(1P2)140-IFN-2b вместе со спектром IFN-2b. Спектры слитых белков с полимерами показывают доминирующий негативный минимум около 205 нм, который указывает на конформацию случайного клубка, и плечо около 220 нм, которое образуется из-за вклада правильно свернутого IFN-2b.PAS(1P2)140-IFN-2b после вычитания спектра IFN-2b. Разностные CD спектры для полимеровPAS2 и PAS3, каждого с 200 остатками и полимера PAS1P2 со 140 остатками показывают значительный минимум около 200 нм, который является ясным указанием конформации случайного клубка(Д) Спектры кругового дихроизма (CD) очищенных рекомбинантных PAS(5)192-IFN-2b иPAS(5)384-IFN-2b. Спектры этих двух слитых белков показывают доминирующий негативный минимум около 205 нм, который указывает на конформацию случайного клубка, и плечо около 220 нм, которое образуется из-за вклада свернутого IFN-2b.(Е) Молярные разностные CD спектры PAS(5)192-IFN-2b и PAS(5)384-IFN-2b после вычитания спектра IFN-2b. Разностные CD спектры для полимера PAS5 со 192 и 384 остатками показывают сильный минимум около 200 нм, который является ясным указанием конформации случайного клубка(Ж) Спектры кругового дихроизма (CD) очищенных рекомбинантных IL-1ra, PAS(1)200-IL-1ra,PAS(1)400-IL-1ra, PAS(5)192-IL-1ra и PAS(5)384-IL-1ra. Спектры четырех слитых белков показывают доминирующий негативный минимум около 200 нм, который указывает на конформацию случайного клубка.PAS(5)384-IL-1ra после вычитания спектра IL-1ra. Разностные CD спектры как для полимера PAS1, так и для PAS5 с 200 или 400 и 192 или 384 остатками соответственно показывают сильный минимум около 200 нм, который является ясным указанием конформации случайного клубка (Greenfield (1969), loc. cit.;(И) CD спектры очищенных рекомбинантных NGAL, NGAL-PAS(1)100 и NGAL-PAS(1)200. CD спектр NGAL имеет типичную характеристику белка с преобладающей -складчатой структурой с нега- 23021222 тивным максимумом около 212 нм (Sreerama (2000), loc. cit.). Отсутствие позитивной полосы менее 200 нм согласуется с CD спектром его мышиного ортолога 24 р 3 (Chu (1998), J. Pept. Res. 52:390-397). Взятые в совокупности, эти данные поддерживают (представление) о правильном сворачивании человеческого белка NGAL, полученного в бактерии. Спектры двух слитых белков показывают характерные отклонения с доминирующим негативным минимумом около 195 нм, который указывает на конформацию случайного клубка, и плечом около 200 нм, которое образуется из-за вклада NGAL с его негативным минимумом при 200 нм. Последнее наблюдение указывает на правильное сворачивание белка NGAL при слиянии с полимером Pro-Ala-Ser.(К) Молярные разностные CD спектры NGAL-PAS(1)100 и NGAL-PAS(1)200 после вычитания спектра NGAL. Разностные CD спектры для полимера PAS1 со 100 или 200 остатками показывают сильный минимум около 200 нм, который является ясным указанием конформации случайного клубка(Л) CD спектры очищенного рекомбинантного NGAL-piSA100 и его молярный разностный CD спектр после вычитания спектра NGAL. Как CD спектр NGAL-piSA100, так и разностный CD спектр полимера piSA100 имеет типичную характеристику белка с преобладающей -складчатой структурой с негативным максимумом около 218 нм и позитивным максимумом менее 200 нм (Sreerama (2000), loc. cit.). Таким образом, разностный спектр явно отличается от спектров слияний с полимерами Pro-Ala-Ser сопоставимой длины, в которых явно доминирует конформация случайного клубка, приписываемая полимеру-партнеру слияния. Фиг. 7. Тест стабильности PAS(1)200-IFN-2b и PAS(5)192-IFN-2b в сыворотке. Стабильность PAS(1)200-IFN-2b (А) и PAS(5)192-IFN-2b (Б) в сыворотке анализировали инкубацией слитого белка в концентрации 0,17 мг/мл в 83% (об./об.) мышиной плазме (RocklandImmunochemicals, Gilbertsville, PA) при 37C в течение вплоть до 48 ч. Пробы (6 мкл) отбирали в указанные моменты времени и разводили 54 мкл электрофорезного буфера для SDS-PAGE и 15 мкл загрузочного буфера для SDS-PAGE, содержащего -меркаптоэтанол. Аликвоты из 25 мкл (соответствующие 0,33 мкг тестируемого белка) и контрольную пробу (0,1 мкг) наносили на 12% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Рекомбинантные белки определяли инкубацией с конъюгатомStrepTactin-щелочная фосфатаза (IBA, Gttingen, Германия), который распознает Strep-метку II, и проявляли посредством хромогенной реакции. Для обоих тестируемых белков блоты показывают сигналы постоянной интенсивности для всех моментов времени. Не могли определить продукты деградации и не было указания на агрегацию белка,которая привела бы к уменьшению концентрации тестируемого белка в течение исследованного периода времени. Фиг. 8. Фармакокинетика очищенного рекомбинантного IFN-2b и его слияний с полимером PAS1 с 200 или 400 остатками. Мыши BALB/c массой тела около 25 г получали инъекции примерно 125 мкл каждого из белковIFN-2b, PAS(1)200-IFN-2b или PAS(1)400-IFN-2b в концентрации 1 мг/мл в PBS, содержащем 1 мМ EDTA, с достижением дозы 5 мг тестируемого белка на кг массы тела (м.т.). Пробы крови отбирали, как указано. Аликвоты проб осветленной плазмы разводили 1:5 PBS. Аликвоты из 10 мкл разведенной пробы (соответствующие 1 мкл плазмы) наносили на 12% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Рекомбинантные белки определяли инкубацией с мышиным антителом 9D3 против человеческого IFN-2b (Abcam, Cambridge, Великобритания) с последующей инкубацией с конъюгатом антитела против мышиного IgG с щелочной фосфатазой (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО) и проявляли в хромогенной реакции. Самая левая полоса (М) показывает смесь очищенных IFN-2b, PAS(1)200-IFN-2b иPAS(1)400-IFN-2b (каждый в количестве 0,1 мкг, т.е. в количестве, ожидаемом в пробах плазмы в t=0) в качестве контроля. Другие полосы показывают пробы плазмы для IFN-2b, PAS(1)200-IFN-2b иPAS(1)400-IFN-2b в указанные моменты времени. Данный блот показывает самые сильные сигналы для всех трех белковых проб в самый ранний момент времени, т.е. через 30 мин, уже выявляя быстрое разрушение IFN-2b, который больше не определяется через 2 ч. В отличие от этого, и PAS(1)200-IFN-2b, и PAS(1)400-IFN-2b определяются в течение вплоть до 6 ч с явно более сильным сохранением для слияния с 400 остатками по сравнению со слиянием с 200 остатками, указывая на значительно более длительную циркуляцию (в крови) по сравнению с неслитым белком IFN-2b. Примечательно, что не было указания протеолитической деградации для каждой белковой пробы. Таким образом, не только интересующий белок IFN-2b, но также и группировка слитого полимера показывают высокую стабильность в сыворотке. Фиг. 9. Количественный анализ фармакокинетики очищенного рекомбинантного IFN-2b и его слияния с полимером PAS1 с 200 и 400 остатками. Пробы плазмы из тех же самых животных, что и животные, результаты исследования которых показаны на фиг. 8, количественно анализировали на концентрации IFN-2b, PAS(1)200-IFN-2b иPAS(1)400-IFN-2b с использованием сэндвич-метода ELISA. Соответственно, лунки планшета для микротитрования покрывали антителом 9D3 против человеческого IFN (Abcam, Cambridge, Великобритания) в качестве иммобилизованного антитела и наносили серию разведений проб плазмы из животных группы А (инъекция IFN-2b), группы Б (инъекция PAS(1)200-IFN-2b) и группы В (инъекцияPAS(1)400-IFN-2b). Связанные IFN-2b, PAS(1)200-IFN-2b и PAS(1)400-IFN-2b определяли с конъюгатом второго антитела против человеческого IFN-2b с HRP (пероксидаза хрена) (4E10-HRP; Abcam, Cambridge, Велокобритания), который распознает другой эпитоп, чем иммобилизованное антитело,с последующей хромогенной реакцией. Концентрации IFN-2b, PAS(1)200-IFN-2b иPAS(1)400-IFN-2b количественно определяли путем сравнения со стандартными кривыми, полученными с теми же самыми очищенными рекомбинантными белками, нанесенными в известной концентрации. Для оценки периода полувыведения в плазме IFN-2b, PAS(1)200-IFN-2b и PAS(1)400-IFN-2b полученные значения концентрации откладывали на графике относительно времени после внутривенной инъекции и количественно аппроксимировали, предполагая моноэкспоненциальное уменьшение. В результате неслитый белок IFN-2b демонстрировал очень быстрый клиренс с периодом полувыведения 5,5110-5 мин. В отличие от этого, фаза устранения, определенная для PAS(1)200-IFN-2b иPAS(1)400-IFN-2b значительно тормозилась с периодами полувыведения 61,75,4 мин и около 63 ч соответственно, демонстрируя, таким образом, более чем 10- и 60-кратно удлиненную циркуляцию благодаря слиянию с полимером Pro-Ala-Ser с 200 и 400 остатками соответственно по сравнению с неслитым IFN-2b. Фиг. 10. Количественный анализ фармакокинетики очищенных рекомбинантных слияний IFN-2b с полимером PAS1 с 200, 400, 600 остатками и слияний с полимером PAS5 со 192 и 384 остатками соответственно. Мыши C57BL/6 массой тела около 18 г получали инъекции примерно 125 мкл каждого из белковPAS(5)384-IFN-2b в концентрации 1 мг/мл в PBS, содержащем 1 мМ EDTA с достижением дозы 7 мг тестируемого белка на 1 кг массы тела (м.т.). Пробы крови брали через 30, 240, 360 и 480 мин. Пробы плазмы количественно оценивали на IFN-2b, PAS(1)200-IFN-2b или PAS(1)400-IFN-2b с использованием сэндвич-метода ELISA. Для оценки периода полувыведения в плазме PAS(1)200-IFN-2b,PAS(1)400-IFN-2b, PAS(1)600-IFN-2b, PAS(5)192-IFN-2b и PAS(5)384-IFN-2b полученные значения концентрации откладывали на графике относительно времени после внутривенной инъекции и количественно аппроксимировали, предполагая моноэкспоненциальное уменьшение. В результате фаза устранения, определенная для PAS(1)200-IFN-2b, PAS(1)400-IFN-2b иPAS(1)600-IFN-2b, значительно тормозилась с периодами полувыведения 66,25,6, 316,176,8 и примерно 406,860 мин соответственно, демонстрируя, таким образом, более чем 10-, 60- и 70-кратно удлиненную циркуляцию благодаря слиянию с полимером Pro-Ala-Ser с 200, 400 и 600 остатками соответственно по сравнению с неслитым IFN-2b (фиг. 9). Аналогично, фаза устранения, определенная дляPAS(5)192-IFN-2b и PAS(5)384-IFN-2b, значительно тормозилась с периодами полувыведения 40,45,6 и примерно 32193,6 мин соответственно, демонстрируя, таким образом, более чем 7- и 60 кратно удлиненную циркуляцию благодаря слиянию с полимером Pro-Ala-Ser со 192 и 384 остатками соответственно по сравнению с неслитым IFN-2b (фиг. 9). Фиг. 11. Фармакокинетика очищенного рекомбинантного NGAL и его слияния с полимером PAS1 со 100 или 200 остатками. Самки крыс Wistar массой тела около 210 г получали инъекции примерно 1050 мкл каждого из белков NGAL, NGAL-PAS(1)100 или NGAL-PAS(1)200 в концентрации 1 мг/мл в PBS с достижением дозы 5 мг тестируемого белка на 1 кг массы тела (м.т.). Пробы крови брали, как указано. Аликвоты осветленных проб плазмы разводили 1:5 PBS. Три аликвоты из 1,25 мкл разведенной пробы (соответствующие 0,25 мкл плазмы) от животных, каждому из которых инъецировали один из трех разных белков, смешивали, наносили на 12% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Рекомбинантные белки определяли путем инкубации с конъюгатом StrepTactin-щелочная фосфатаза (IBA, Gttingen, Германия), который распознает Strep-метку II, и проявляли в хромогенной реакции. Фиг. 11 А и 11 Б показывают два временных ряда с независимыми пробами плазмы разных животных из группы А (инъекция NGAL), группы Б (инъекция NGAL-PAS(1)100) и группы В (инъекцияNGAL-PAS(1)200). Самые левые полосы на фиг. 11 А и 11 Б показывают стандарт молекулярного размера (с размерами маркеров, указанными слева), следующие полосы показывают смеси трех проб плазмы,содержащих NGAL, NGAL-PAS(1)100 и NGAL-PAS(1)200, в указанные моменты времени, и крайняя правая полоса показывает смесь очищенных NGAL, NGAL-PAS(1)100 и NGAL-PAS(1)200 (каждый в количестве 0,1 мкг) в качестве контроля. Блоты показывают самые сильные сигналы для всех трех белковых проб в самый ранний момент времени, т.е. через 5 мин, с быстрым уменьшением (содержания) NGAL, который больше не определяется через 30 мин. В отличие от этого, и NGAL-PAS(1)100, и NGAL-PAS(1)200 определяются в течение значительно более длительных периодов, с немного более сильным эффектом для слияния с 200 остатками по сравнению со слиянием со 100 остатками, указывая на значительно более продолжительную циркуляцию по сравнению с неслитым белком NGAL. Примечательно, что не было указания протеолитической деградации для каждой белковой пробы. Таким образом, не только интересующий белокNGAL, но также и группировка слитого полимера показывают высокую стабильность в сыворотке. Наконец, ни одно из животных не показывало каких-либо признаков острой токсичности или воспаления,демонстрируя высокую устойчивость к слитым белкам согласно данному изобретению. Фиг. 12. Количественный анализ фармакокинетики очищенного рекомбинантного NGAL и его слияния с полимером PAS1 с 200 остатками. Пробы плазмы из тех же самых животных, результаты исследования которых показаны на фиг. 11 А,анализировали на концентрации NGAL и NGAL-PAS(1)200 с использованием сэндвич-метода ELISA. Соответственно, лунки планшета для микротитрования покрывали антителом против человеческого липокалина-2/NGAL (RD Systems, Minneapolis, MN) в качестве иммобилизованного антитела и наносили серию разведений проб плазмы из животных группы А (инъекция NGAL) или группы В (инъекцияNGAL-PAS(1)200). Связанные NGAL и NGAL-PAS(1)200 определяли с конъюгатом StrepTactinщелочная фосфатаза, который распознает Strep-метку II, с последующей хромогенной реакцией. Концентрации NGAL и NGAL-PAS(1)200 количественно определяли путем сравнения со стандартной кривой,полученной с теми же самыми очищенными рекомбинантными белками, нанесенными в известных концентрациях. Для оценки периода полувыведения в плазме NGAL и NGAL-PAS(1)200 экспериментальные значения концентрации откладывали на графике относительно времени после внутривенной инъекции и количественно аппроксимировали, предполагая моноэкспоненциальное уменьшение, на основании этого для большей ясности приведены только значения до 360 мин. Неслитый белок NGAL демонстрировал очень быстрый клиренс с периодом полувыведения 3,10,2 мин. Согласно принципам аллометрического масштабирования (Mahmood (2005), InterspeciesPharmacokinetic Scaling: Principles and Application of Allometric Scaling. Pine House Publishers, Rockville,Maryland) это значение согласуется с периодом полувыведения 10 мин, описанным для мономерной формы природного NGAL у человека (Axelsson (1995), Scand. J. Clin. Lab. Invest. 55:577-588), что указывает на механизм клеточного поглощения, который может быть уникальным для этого конкретного белка. Недавно смогли показать, что мегалин, член семейства рецептора липопротеинов низкой плотности,может действовать как рецептор NGAL в эпителиальных клетках почки и опосредовать его поглощение(Hvidberg (2005), FEBS Lett. 579:773-777). В отличие от этого, фаза устранения, определенная для NGAL-PAS(1)200, была значительно более медленной с конечным периодом полувыведения 30,91,3 мин, демонстрируя, таким образом, в десять раз более длительную циркуляцию благодаря слиянию с полимером Pro-Ala-Ser с 200 остатками по сравнению с неслитым NGAL. Эффект задержки на период полувыведения в плазме может быть даже более отчетливым для интересующего белка, который не подвергается специфическому механизму клиренса,что очевидно происходит в случае NGAL. Фиг. 13. Сравнительный анализ активности имеющегося в продаже IntronA (Schering, Kenilworth,NJ), рекомбинантного PAS(1)200-IFN-2b и рекомбинантного Fab фрагмента (служащего в качестве негативного контроля) посредством ELISA IP-10. 2105 одноядерных клеток периферической крови человека (РВМС) инкубировали с IntronA, PAS(1)200-IFN-2b или с Fab фрагментом, который был получен так же, как и PAS(1)200-IFN-2b, в разных концентрациях. Специфическая активность IntronA составляла 2,6108 U/мг согласно спецификации изготовителя. Индуцированный белок IP-10 количественно определяли посредством набора ELISA для человеческого IP-10 (BD OptEIA, BD Biosciences Pharmingen, USA). IntronA и PAS(1)200-IFN-2b индуцируют высвобождение IP-10 в зависимости от концентрации с аналогичными эффектами. Нестимулированные РВМС, а также обработанные Fab фрагментом не показывают какого-либо значимого продуцирования IP-10. Фиг. 14. Теоретическое предсказание вторичной структуры Pro-Ala-Ser и Ser-Ala полимерных последовательностей согласно способу Чоу-Фасмана (Chou and Fasman (1974), Biochemistry, 13:222-245). Эта иллюстрация показывает результат компьютерного алгоритма CHOFAS, реализованного на сервере Университета Вирджинии для сравнения последовательностей и предсказания вторичной структуры(URL:http://fasta.bioch.virginia.edu/fastawww2). Во избежание пограничных эффектов на амино- и карбоксиконцах каждый блок аминокислотной последовательности согласно фиг. 1 вставляли в трех повторных копиях и рассматривали только результат для центрального блока (заключен в рамку). В случае полимерной последовательности piSA (SEQ ID NO: 56) алгоритм Чоу-Фасмана предсказывает-спиральную вторичную структуру для 20 из 20 остатков, т.е. 100%. Это явно отличается от экспериментально наблюдаемой преобладающей конформации -складчатой структуры для этой полимерной последовательности, как части слитого белка (см. фиг. 6). В случае полимерной последовательностиPAS1 (SEQ ID NO: 57) алгоритм Чоу-Фасмана предсказывает -спиральную вторичную структуру для 12 из 20 остатков, т.е. 60%. Это отличается от экспериментально наблюдаемой преобладающей конформации случайного клубка для этой полимерной последовательности, как части слитого белка (см. фиг. 6). В случае полимерной последовательности PAS5 (SEQ ID NO: 58) алгоритм Чоу-Фасмана предсказывает-спиральную вторичную структуру для 20 из 24 остатков, т.е. 83,3%. Вновь это явно отличается от экспериментально наблюдаемой преобладающей конформации случайного клубка для этой полимерной последовательности, как части слитого белка (см. фиг. 6). Примеры Настоящее изобретение дополнительно описано посредством следующих иллюстративных неограничивающих примеров, которые обеспечивают лучшее понимание настоящего изобретения и его многих преимуществ. Если не указано иное, использовали общепринятые методы генной инженерии, как описано, например, в Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(2001). Следующие примеры иллюстрируют данное изобретение. Пример 1. Синтез генов для аминокислотных полимеров Pro-Ala-Ser и Ser-Ala. Как описано здесь выше, аминокислотные повторы, состоящие из остатков Pro, Ala и Ser, представлены здесь как "PAS" (ранее также известные как "APS"). Фрагменты генов, кодирующие повторяющуюся полимерную последовательность, содержащую остатки Pro, Ala и Ser (PAS1, который соответствуетSEQ ID NO: 28) или Ser и Ala (piSA, который соответствует SEQ ID NO: 2), получали гибридизацией и лигированием двух комплементарных олигодезоксинуклеотидов, показанных на фиг. 1 А-Е, с использованием образования конкатемера прямым способом, воспользуясь преимуществом их взаимосовместимых, но непалиндромных липких концов. Олигодезоксинуклеотиды покупали у IBA (Gttingen, Германия) и очищали препаративным электрофорезом в полиакриламидном геле с мочевиной. Аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO 30, 32, 34, 36, 38 и 40, представляют собой варианты для клонирования SEQ ID NO 18, 20, 22, 26, 2 и 28 соответственно, содержащие дополнительный аланин. Соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, показанные в SEQ ID NO 29, 31, 33, 35,37 и 39 (кодирующие аминокислоты, как показано в SEQ ID NO 30, 32, 34, 36, 38 и 40), содержат дополнительный кодон cgg для аланина, который устраняется при лигировании через липкие концы. Ферментативное фосфорилирование проводили смешиванием 200 пмоль обоих олигодезоксинуклеотидов в 100 мкл 50 мМ Tris/HCl, pH 7,6, 10 мМ MgCl2, 5 мМ DTT (дитиотрейтол), 1 мМ АТФ и инкубацией в течение 30 мин при 37 С в присутствии 10 U полинуклеотидкиназы (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Германия). После денатурации в течение 10 мин при 80 С данную смесь охлаждали до комнатной температуры в течение ночи для достижения гибридизации. Затем 50 мкл этого раствора лигировали, добавляя 1 U ДНК-лигазы Т 4 (MBI Fermentas) и 10 мкл 100 мМ Tris/HCl, pH 7,4, 50 мМ MgCl2, 20 мМ DTT, 10 мМ АТФ и в некоторых случаях 5 мМ каждого из дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ в общем объеме 100 мкл и инкубировали в течение 50 мин на льду. После 10 мин инактивации нагреванием при 70 С продукты лигирования разделяли электрофорезом в 1% (мас./об.) агарозном геле в присутствии буфера ТАЕ (40 мМTris, 20 мМ уксусная кислота, 1 мМ EDTA). После окрашивания бромистым этидием полосу, соответствующую собранному сегменту гена длиной 300 п.о. (piSA), 420 п.о. (PAS1P2), 576 п.о. (PAS5) и 600 п.о. (PAS1, 2, 3), вырезали и выделяли посредством фенольной экстракции. Пример 2. Конструирование векторов экспрессии для слитых белков интерферона -2b (IFN-2b) сPAS1, PAS2, PAS3, PAS5 и PAS1P2. Для клонирования фрагмента синтетического гена, кодирующего PAS1, PAS2, PAS3, PAS1P2 иPAS5 из примера 1, использовали производное pASK75 (Skerra, A. (1994), Gene, 151:131-135),pASK-2SapI, содержащее нуклеотидную последовательность с двумя сайтами рестрикции SapI в обратной комплементарной ориентации (фиг. 2 А). Этот вектор разрезали SapI, дефосфорилировали щелочной фосфатазой креветки (USB, Cleveland, ОН) и лигировали с фрагментом синтетической ДНК (фиг. 2 Б). Образующиеся промежуточные плазмиды обозначали pPAS(1)200, pPAS(2)200, pPAS(3)200,pPAS(5)192 и pPAS(1P2)140. После трансформации E.coli XL1-Blue (Bullock (1987), Biotechniques, 5: 376-378) получали плазмиды и последовательности клонированных вставок синтетической нуклеиновой кислоты подтверждали рестрикционным анализом и автоматическим секвенированием двухцепочечной ДНК (генетический анализатор ABI-Prism310, Perkin-Elmer Applied Biosystems, Weiterstadt, Германия) с использованием терминирующего набора BigDye, а также олигодезоксинуклеотидных праймеров, которые обеспечивали секвенирование с обеих сторон. Образующаяся плазмида, содержащая полимерную последовательность примерно из 200 остатков, служила в качестве промежуточного вектора, который обеспечивал простое дальнейшее субклонирование вставки полимерной последовательности. Кодирующий ген IFN-2b амплифицировали из плазмиды IRAMp995M1713Q (RZPD, Berlin,Germany), несущей соответствующую кДНК, с использованием олигодезоксинуклеотидов 5'-TCTGTGGGCGCCAGCTCTTCTGCCTGTGATCTGCCTCCCCAC (SEQ ID NO: 59) и 5'-GAACCAAGCTTATTCCTTACTTCTTC (SEQ ID NO: 60) в качестве праймеров. Первый прай- 27021222 мер содержит сайт рестрикции KasI на 5'-конце с последующим сайтом рестрикции SapI (подчеркнут),тогда как второй праймер содержит сайт рестрикции HindIII (подчеркнут). Амплифицированный продукт очищали, расщепляли KasI и HindIII и лигировали с вектором pASK-IBA4 (IBA Gttingen, Германия),разрезанным соответствующим образом. После трансформации E.coli XL1-Blue получали плазмиды и последовательности клонированных вставок синтетической нуклеиновой кислоты подтверждали рестрикционным анализом и автоматическим секвенированием двухцепочечной ДНК. Плазмиду, кодирующую IFN-2b в виде слияния с N-концевой Strep-меткой II, обозначали pASK-IFN-2b (фиг. 2 В). Для конструирования плазмид экспрессии, кодирующих IFN-2b в виде слияния с PAS(1)200,PAS(1)400 и PAS(1)600, pASK-IFN-2b, разрезали SapI, дефосфорилировали щелочной фосфатазой креветки и лигировали с избытком фрагмента гена полимера из 200 остатков, выделенным из промежуточной плазмиды pPAS(1)200 посредством рестрикционного расщепления SapI (фиг. 2 Г). После трансформации E.coli JM83 (Yanisch-Perron. (1985), Gene, 33:103-119) получали плазмиды и размеры вставки,кодирующей полимер, подтверждали рестрикционным анализом. Плазмиды, кодирующие IFN-2b, несущий полимерную последовательность из 200, 400 и 600 остатков, т.е. PAS(1)200-IFN-2b,PAS(1)400-IFN-2b и PAS(1)600-IFN-2b, обозначали pASK-PAS(1)200-IFN-2b (фиг. 2 Ж),pASK-PAS(1)400-IFN-2b и pASK-PAS(1)600-IFN-2b соответственно. Плазмиды, кодирующиеPAS(5)384-IFN-2b, конструировали аналогичным способом с использованием подходящей соответствующей кассеты генов, кодирующей каждую из последовательностей аминокислотного полимера. Пример 3. Конструирование векторов экспрессии для слитых белков антагониста рецептора интерлейкина-1 (IL-1ra) с PAS1 и PAS5. Кодирующий ген IL-1ra (Carter (1990), Nature, 344:633-638) амплифицировали из плазмидыIRANp969G0350D6IL1RN (RZPD, Berlin, Германия) с клонированной кДНК, используя олигодезоксинуклеотиды 5'-ACGATCGGCGCCAGCTCTTCTGCCCGACCCTCTGGGAGAAAATCC (SEQ ID NO:61) и 5'-CTGGGCAAGCTTACTCGTCCTCCTGGAAGTAG (SEQ ID NO: 62) в качестве праймеров. Первый праймер содержит сайт рестрикции KasI на 5'-конце с последующим сайтом рестрикции SapI (подчеркнут), тогда как второй праймер содержит сайт рестрикции HindIII (подчеркнут). Амплифицированный продукт очищали, расщепляли KasI и HindIII и лигировали с вектором pASK-IBA4 (IBA Gttingen, Германия), разрезанным соответствующим образом. После трансформации E.coli XL1-Blue получали плазмиды и последовательности клонированных вставок синтетической нуклеиновой кислоты подтверждали рестрикционным анализом и автоматическим секвенированием двухцепочечной ДНК. Плазмиду, кодирующую IL-1ra в виде слияния с N-концевой Strep-меткой II, обозначали pASK-IL-1ra (фиг. 2 Д). Для конструирования плазмид экспрессии, кодирующих IL-1ra в виде слияния с полимерными последовательностями аминокислот PAS(1)200, PAS(1)400, PAS(5)192 и PAS(5)384, pASK-IL-1ra, разрезали SapI, дефосфорилировали щелочной фосфатазой креветки и лигировали с избытком фрагмента гена полимера PAS(1) с 200 остатками или полимера PAS(5) со 192 остатками соответственно, выделенными из соответствующих промежуточных плазмид pPAS(1)200 и pPAS(5)192 посредством рестрикционного расщепления SapI (фиг. 2 Е). После трансформации E.coli JM83 (Yanisch-Perron. (1985),Gene ,33:103-119) получали плазмиды и размеры областей, кодирующих полимер, которые вставляли во время лигирования в одной или в нескольких повторяющихся копиях, подтверждали рестрикционным анализом. Плазмиды, кодирующие IL-1ra, несущий последовательность полимера PAS1 с 200 или 400 остатками, т.е. PAS(1)200-IL-1ra или PAS(1)400-IL-1ra, и плазмиды, несущие последовательность полимера PAS5 со 192 или 384 остатками, т.е. pPAS(5)192-IL-1ra или pPAS(5)384-IL-1ra, обозначалиpASK-PAS(1)200-IL-1ra, pASK-PAS(1)400-IL-1ra, pASK- PAS(5)192-IL-1ra и pASK-PAS(5)384-IL-1ra соответственно. Пример 4. Конструирование векторов экспрессии для слитых белков липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (NGAL), с PAS1 и piSA. Для конструирования векторов экспрессии слитых белков NGAL с PAS1 и piSA соответствующие фрагменты синтетического гена из примера 1 клонировали на производном pASK75 (Skerra, A. (1994),Gene, 151:131-135), содержащем кДНК для варианта NGAL (Breustedt (2006), loc. cit), слитого с С-концевой Strep-меткой II (Skerra, (2000), Methods Enzymol. 326:271-304), несущей сайт рестрикции ЕсоО 109I между ними (фиг. 3 А). Этот вектор, названный pNGAL15-Eco, разрезали ЕсоО 109I, дефосфорилировали щелочной фосфатазой креветки (USB, Cleveland, ОН) и лигировали с фрагментом синтетической ДНК, кодирующей PAS1 или piSA (фиг. 3 Б). После трансформации E.coli XL1-Blue (Bullock (1987), Biotechniques, 5:376-378) получали плазмиды и последовательности клонированных вставок синтетической нуклеиновой кислоты подтверждали рестрикционным анализом и автоматическим секвенированием двухцепочечной ДНК (генетический анализатор ABI-Prism310) с использованием терминирующего набора BigDye, а также олигодезоксинуклеотидных праймеров, которые обеспечивали секвенирование с обеих сторон. Плазмиды, кодирующиеNGAL, несущий последовательности полимеров PAS(1)100 и PAS(1)200, т.е. NGAL-PAS(1)100 и миду, кодирующую NGAL, несущую последовательность полимера piSA100, NGAL-piSA100, назвалиpNGAL-piSA100. Пример 5. Бактериальное продуцирование и очистка слитых белков между IFN-2b и генетически кодируемыми полимерами PAS1, PAS2, PAS3, PAS5 и PAS1P2.IFN-2b (расчетная масса: 20,9 кДа), PAS(1)200-IFN-2b (расчетная масса: 37,4 кДа),PAS(1)400-IFN-2b (расчетная масса: 54,0 кДа), PAS(1)600-IFN-2b (расчетная масса: 70,5 кДа),PAS(5)192-IFN-2b (расчетная масса: 36,7 кДа) и PAS(5)384-IFN-2b (расчетная масса: 52,6 кДа) продуцировали в E.coli BL21 (Novagen, Madison, USA; Wood (1966) J Mol Biol 16:118-133), содержащей соответствующие плазмиды экспрессии из примера 2 вместе с хелперной плазмидой для укладки pTUM4(Schlapschy (2006), Protein Eng. Des. Sel. 20:273-284) с использованием 8 л настольного ферментера с синтетической глюкозной минеральной средой, дополненной 100 мг/л ампициллина и 30 мг/л хлорамфеникола, следуя методике, описанной для продуцирования рекомбинантных Fab фрагментов (Schweck(1995), Proteins, 23:561-565). Экспрессию рекомбинантного гена индуцировали добавлением 500 мкг/л ангидротетрациклина (Skerra (1994), Gene 151:131-135), как только культура достигала ОП 550=20. После периода индукции в 2,5 ч клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали в течение 10 мин в ледяном буфере для периплазматического фракционирования (500 мМ сахароза, 1 мМ EDTA, 100 мМTris/HCl, рН 8,0; 2 мл на 1 л и ОП 550). После добавления 15 мМ EDTA и 250 мкг/мл лизоцима суспензию клеток инкубировали в течение 20 мин на льду, несколько раз центрифугировали и выделяли осветленный супернатант, содержащий рекомбинантный белок. Варианты IFN-2b очищали посредствомPAS(1P2)140-IFN-2b (расчетная масса: 31,7 кДа) продуцировали при 22 С в E.coli BL21, содержащей соответствующие плазмиды экспрессии из примера 2 вместе с хелперной плазмидой для укладки pTUM4 с использованием культур, выращиваемых в колбах на шейкере с 2 л среды LB, содержащей 100 мг/л ампициллина и 30 мг/л хлорамфеникола. Индукцию экспрессии чужеродного гена осуществляли при помощи ангидротетрациклина при ОП 550=0,5 в течение ночи (что обычно давало ОП 550 около 1,0 в момент отбора клеток). Периплазматическую экстракцию в присутствии 500 мМ сахарозы, 1 мМ EDTA,100 мМ Tris/HCl, рН 8,0, содержащих 50 мкг лизоцима на 1 мл, проводили, как описано (Breustedt (2005),loc. cit.), с последующей очисткой посредством Strep-метки II, с использованием аффинной хроматографии со стрептавидином (Skerra (2000), loc. cit.) с буфером с высоким содержанием соли (500 мМ NaCl,1 мМ EDTA, 100 мМ Tris/HCl, pH 8,0). Для всех рекомбинантных белков IFN-2b получали гомогенные белковые препараты (фиг. 4 А, Б,В) с выходами 0,15 мгл-1 ОП-1 для IFN-2b, 0,1 мгл-1 ОП-1 для PAS(1)200-IFN-2b, 0,06 мгл-1 ОП-1 дляPAS(5)384-IFN-2b и 0,05 мгл-1 ОП-1 для PAS(1P2)140-IFN-2b. Для анализа активности in vitro дополнительно удаляли загрязнения белковых препаратов эндотоксинами. Соответственно очищенные белки диализировали три раза против PBS (115 мМ NaCl, 4 мМKH2PO4, 16 мМ Na2HPO4 pH 7,4) и наносили на колонку Q Sepharose FF 16/200 (Amersham Biosciences,Uppsala, Швеция) с использованием системы kta Purifier 10 с 50 мл суперпетлей (Amersham Biosciences) и PBS в качестве подвижного буфера. Элюат, содержащий рекомбинантный белок, собирали и концентрировали примерно до 1,5 мг/мл посредством ультрафильтрации с использованием центрифужных фильтрующих устройств Amicon Ultra (30000 MWCO; 15 мл; Millipore, Billerica, MA). Дополнительную стадию удаления эндотоксина проводили с использованием аффинных колонок EndoTrap (Profos AG,Regensburg, Германия) с использованием PBS в качестве подвижного буфера. Конечное содержание эндотоксина составляло менее 1 EU/мл при концентрации белка 1 мг/мл при определении с использованием Endosafe PTS Kit (Charles River Laboratories, L'Arbresle, Франция).SDS-PAGE проводили с использованием буферной системы высокой молярности на основе Tris(Fling and Gregerson (1986), Anal. Biochem. 155:83-88). Концентрации белка определяли согласно поглощению при 280 нм с использованием расчетных коэффициентов экстинкции (Gill and von Hippel (1989),Anal. Biochem. 182:319-326) 23590 M-1 см-1 как для IFN-2b, так и для его разных слияний с полимерами согласно изобретению, так как они не содействуют поглощению в УФ-области благодаря отсутствию ароматических кислот. Пример 6. Бактериальное продуцирование и очистка слитых белков между IL-1ra и генетически кодируемыми полимерами PAS1 и PAS5.PAS(5)384-IL-1ra (расчетная масса: 50,5 кДа) продуцировали в E.coli BL21, содержащей соответствующие плазмиды экспрессии из примера 3 вместе с хелперной плазмидой для укладки pTUM4 при 22 С с