Фосфолипазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения

Дата публикации и выдачи патента Номер заявки ФОСФОЛИПАЗЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИХ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ В настоящем изобретении предлагаются новые полипептиды, обладающие фосфолипазной активностью, включая, например, активность фосфолипазы A, B, C и D, активность пататина,активность фосфатаз фосфатидной кислоты (PAP) и/или липидацилгидролазы (LAH), кодирующие их нуклеиновые кислоты и антитела, которые с ними связываются. Также предлагаются промышленные способы, например, дегуммирования масла и продукты, связанные с применением таких фосфолипаз. 015591 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение, в общем, относится к ферментам фосфолипазам, полинуклеотидам, кодирующим ферменты, способам получения и применения таких полинуклеотидов и полипептидов. В частности, изобретение относится к новым полипептидам, обладающим фосфолипазной активностью, кодирующим их нуклеиновым кислотам и антителам, которые их связывают. Также предлагаются промышленные способы и продукты, связанные с применением таких фосфолипаз. Уровень техники Фосфолипазы представляют собой ферменты, которые гидролизуют сложноэфирные связи фосфолипидов. В связи с важным значением в метаболизме фосфолипидов такие ферменты широко распространены среди прокариот и эукариот. Фосфолипазы влияют на метаболизм, построение и реорганизацию биологических мембран и вовлечены в каскады передачи сигналов. Известно несколько типов фосфолипаз, которые отличаются по своей специфичности в зависимости от положения атакуемой связи в молекуле фосфолипида. Фосфолипаза A1 (PLA1) отщепляет жирную кислоту, действуя на положение 1,с образованием свободной жирной кислоты и 1-лизо-2-ацилфосфолипида. Фосфолипаза A2 (PLA2) отщепляет жирную кислоту, действуя на положение 2, с образованием свободной жирной кислоты и 1-ацил-2-лизофосфолипида. Ферменты PLA1 и PLA2 могут быть внутриклеточными или внеклеточными,связанными с мембранами или растворимыми. Внутриклеточный PLA2 найден почти в каждой клетке млекопитающих. Фосфолипаза C (PLC) отщепляет остаток фосфата с образованием 1,2-диацилглицерина и сложного фосфатного эфира. Фосфолипаза D (PLD) образует 1,2-диацилглицерофосфат и группу основания. PLC и PLD важны для функционирования клеток и передачи сигнала. PLD является преобладающей фосфолипазой в биологическом катализе (смотри, например, Godfrey, T. and West S. (1996) Industrialenzymology, 299-300, Stockton Press, New York). Пататины представляют собой другой тип фосфолипаз,которые, как считают, работают как PLA (смотри, например, Hirschberg H.J., et al., (2001), Eur. J.Biochem. 268(19): 5037-44). Обычные масличные семена, такие как соевые бобы, семена рапса, семена подсолнечника, рисовые отруби, кунжут и арахис, используют в качестве источников масел и кормов. В процессе экстракции масла осуществляют механическую и термическую обработку семян. Масло отделяют от жмыха с помощью растворителя. Затем, используя дистилляцию, растворитель отделяют от масла и извлекают. Масло подвергают "дегуммированию" и рафинируют. Растворитель из жмыха можно выпарить термической обработкой в "тостерах для удаления растворителя" с последующей сушкой и охлаждением жмыха. После отделения растворителя с использованием дистилляции полученное неочищенной масло перерабатывают в пищевое масло, используя специальные способы дегуммирования и физическую рафинацию. Его также можно использовать в качестве промышленного сырья для получения жирных кислот и метиловых эфиров. Измельченный материал можно использовать в рационе животных. Дегуммирование является первой стадией рафинирования растительного масла и предназначено для удаления загрязняющих фосфатидов, которые экстрагируются вместе с маслом, но мешают последующей обработке масла. Такие фосфатиды растворимы в растительном масле только в безводной форме и их можно осадить и удалить, если их просто гидратировать. Гидратацию обычно осуществляют непрерывным смешиванием небольшой части воды с, по существу, безводным маслом. Обычно количество воды составляет 75% от содержания фосфатидов, которое обычно составляет от 1 до 1,5%. Температура не является решающим фактором, хотя отделение гидратированных смол происходит лучше, когда вязкость масла понижена, при 50-80C. В настоящее время применяют множество способов дегуммирования масла. Способ дегуммирования масла может быть осуществлен ферментативно с использованием ферментов фосфолипаз. Фосфолипазы A1 и A2 применяли для дегуммирования масла в различных коммерческих способах, например "дегуммирование ENZYMAX" (Lurgi Life Science Technologies GmbH, Germany). Фосфолипазу C (PLC) также предлагали для дегуммирования масла, так как остаток фосфата, образуемый при ее действии на фосфолипиды, обладает высокой растворимостью в воде и легко удаляется, а диглицерид может оставаться в масле, и потери снижаются; смотри, например, Godfrey, T. and West S. (1996) Industrial Enzymology, p. 299-300, Stockton Press, New York; Dahlke (1998) "An enzymatic process for the physical refining ofphospholipase", Eur. J. Lipid Sci. Technol., 103: 333-340. Масла с высоким содержание фосфатидов, такие как соевое масло, масло канолы и подсолнечника,обрабатывают по-другому, не так как другие масла, такие как пальмовое масло. В отличие от паровой обработки или способа "физической рафинации", используемых для масел с низким содержанием фосфатидов, такие масла с высоким содержанием фосфора требуют химических и механических обработок для удаления фосфорсодержащих фосфолипидов. Такие масла обычно рафинируют химически способом,который приводит к нейтрализации свободных жирных кислот с образованием мыла и фракции нерастворимых смол. Способ нейтрализации является очень эффективным для удаления свободных жирных кислот и фосфолипидов, но такой способ также приводит к значительным потерям выхода продукта и ухудшению качества. В некоторых случаях неочищенное масло с высоким содержанием фосфатидов-1 015591 подвергают дегуммированию на стадии, предшествующей нейтрализации щелочью. Такой способ подходит для соевого масла, используемого для получения лецитина, когда масло сначала подвергают дегуммированию с использованием воды или кислоты. Фитостерины (растительные стерины) являются представителями семейства природных продуктов"тритерпенов", которое включает в себя более 100 разных фитостеринов и более 4000 других типов тритерпенов. В общем, считают, что фитостерины стабилизируют растительные мембраны, при этом увеличение соотношения стерин/фосфолипид приводит к увеличению жесткости мембран. Химически фитостерины очень похожи на холестерин по структуре, и предполагается, что они регулируют текучесть мембран растений, как и холестерин в мембранах животных. Основными фитостеринами являются-ситостерин, кампестерин и стигмастерин. К другим фитостеринам относятся стигмастанол (-ситостанол), ситостанол, десмостерин, дигидробрассикастерин, халинастерин, пориферастерин, клионастерин и брассикастерин. Растительные стерины являются важными сельскохозяйственными продуктами для медицинской и пищевой промышленности. Они применимы как эмульгаторы в косметической промышленности и составляют большую часть промежуточных продуктов и предшественников стероидов для получения гормональных фармацевтических средств. Насыщенные аналоги фитостеринов и их сложные эфиры были предложены в качестве эффективных снижающих содержание холестерина средств, полезных в области кардиологии. Растительные стерины снижают уровни холестерина в сыворотке, ингибируя всасывание холестерина в просвете кишечника, и обладают иммуномодулирующими свойствами при чрезвычайно низких концентрациях, включая усиленный клеточный ответ T-лимфоцитов и цитотоксическую способность клеток-природных киллеров, направленную против линии злокачественных клеток. Кроме того,показано их терапевтическое действие в клинических исследованиях при лечении туберкулеза легких,ревматоидного артрита, лечении зараженных ВИЧ пациентов и для подавления иммунного стресса у бегунов на длинные дистанции. Сложные эфиры растительных стеринов, также называемые сложными эфирами фитостеринов,одобрены Администрацией по контролю за продуктами питания и лекарствами (FDA) США как полностью безопасные GRAS (Generally Recognized As Safe) средства для применения в маргаринах и бутербродных пастах в 1999 году. В сентябре 2000 года FDA также опубликовала внутренний регламент, который позволяет маркировать пищевые продукты, содержащие сложные эфиры фитостеринов, с указанием информации о пользе для здоровья. Следовательно, обогащение продуктов питания сложными эфирами фитостеринов особенно требуется для признания товара потребителем. Соевое масло широко используют, и оно является важным пищевым продуктом, составляя 30% продукции масла из семян и фруктов. Соевые бобы содержат только 20% масла, и экстракцию обычно осуществляют, используя растворитель, такой как гексан, в коммерческом масштабе. Признанное качество соевого масла и питательная ценность пищевого белка делает сою основной масличной культурой. Перед экстракцией соевые бобы необходимо очистить, раздробить и получить хлопья, так как для эффективной экстракции масла растворителем требуется, чтобы каждая содержащая масло клетка была разрушена, чтобы улучшить перенос вещества. Клеточные стенки, главным образом состоящие из целлюлозы в сочетании с гемицеллюлозами, пектиновыми веществами и лигнином, также могут быть разрушены с помощью ферментов, чтобы достичь значительного повышения выходов и скоростей экстракции. Содержащее диацилглицерин (DAG) масло является пищевым маслом, содержащим 80% или большее количество DAG по сравнению с природными жирными кислотами. Показано, что у людей повышение уровня триглицеридов в хиломикронах после приема пищи заметно ниже после употребления в пищу эмульсии DAG-масла по сравнению с TAG-маслом со сходным составом жирных кислот. В исследованиях, проводимых на мужчинах японцах и мужчинах и женщинах американцах, длительное потребление DAG-содержащего масла стимулировало потерю массы и уменьшение количеств жира в организме. В одном исследовании показано, что замена обычного масла для приготовления пищи DAG-содержащим маслом снижает частоту ожирения и другие факторы риска. Сущность изобретения В настоящем изобретении предлагаются изолированные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую или полную (100%) идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L,D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V,D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350,400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или более остатков, и в одном аспекте нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий фосфолипазной (PL) активностью, например активностью фосфолипазы A (PLA), фосфолипазы C (PLC) или фосфолипазы D (PLD), или любой-2 015591 комбинацией фосфолипазных активностей, например активностью PLA, PLC и/или PLD в виде многофункциональной активности. В одном аспекте идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. В настоящем изобретении предлагаются изолированные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую или полную (100%) идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M,D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E,M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450,500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или более последовательных остатков, и в одном аспекте нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий фосфолипазной (PL) активностью, например активностью фосфолипазы A, C или D или любой комбинацией фосфолипазных активностей, например активностью PLA, PLC и/или PLD в виде многофункциональной активности. В одном аспекте идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. В альтернативных аспектах изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий последовательность, которая указана в SEQ ID NO: 177 или SEQID NO: 178, имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R,D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N,D171V, D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R. В одном аспекте такие полипептиды обладают фосфолипазной активностью, например активностью фосфолипазыA, B, C или D, или любой комбинацией фосфолипазных активностей, например активностью PLA, PLC и/или PLD в виде многофункциональной активности. В одном аспекте алгоритмом сравнения последовательностей является алгоритм BLAST, такой как алгоритм BLAST в версии 2.2.2. В одном аспекте устанавливают параметры фильтрования -p blastp -d "nrpataa" -F F и все другие опции устанавливают по умолчанию. В альтернативных аспектах изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, но не имеющий сигнальной последовательности или последовательности пробелка или гомологичной промоторной последовательности; или нуклеиновая кислота (полинуклеотид) согласно изобретению кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью и дополнительно содержащий гетерологичную аминокислотную последовательность, или нуклеиновая кислота (полинуклеотид) согласно изобретению содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность; или нуклеиновая кислота (полинуклеотид) согласно изобретению содержит или состоит из последовательности, кодирующей гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность или метку или эпитоп, или гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит гетерологичную промоторную последовательность; или нуклеиновая кислота (полинуклеотид) согласно изобретению содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность, содержащую или состоящую из N-концевого и/илиC-концевого удлинения для направления к эндоплазматическому ретикулуму (ER) или внутриклеточным мембранам, или к эндоплазматическому ретикулуму (ER) или системе внутриклеточных мембран растений, или гетерологичная последовательность кодирует сайт рестрикции; или нуклеиновая кислота (полинуклеотид) согласно изобретению содержит гетерологичную промоторную последовательность, содержащую или состоящую из конститутивного или индуцируемого промотора или специфичного для клеток промотора, или специфичного для растений промотора, или специфичного для бактерий промотора. В одном аспекте фосфолипазная активность заключается в катализе гидролиза глицерофосфатной сложноэфирной связи (т.е. расщепления глицерофосфатных сложноэфирных связей). Фосфолипазная активность может заключаться в катализе гидролиза сложноэфирной связи в фосфолипиде растительного масла. Фосфолипид растительного масла может содержать фосфолипид семян масличных культур. Фосфолипазная активность может включать активность фосфолипазы C (PLC); активность фосфолипазы A (PLA), такую как активность фосфолипазы A1 или фосфолипазы A2; активность фосфолипазы D (PLD), такую как активность фосфолипазы D1 или фосфолипазы D2; активность фосфолипазы B (PLB), например активность фосфолипазы и лизофосфолипазы (LPL) или активность фосфолипазы и лизофосфолипазы-трансацилазы (LPTA), или активность фосфолипазы и лизофосфолипазы (LPL) и лизофосфолипазы-трансацилазы (LPTA); или активность пататина или их комбинацию. Фосфолипазная активность может заключаться в гидролизе гликопротеида, например гликопротеида,обнаруженного в клубне картофеля. Фосфолипазная активность может включать в себя ферментативную активность пататина. Фосфолипазная активность может включать в себя липидацилгидролазную (LAH) активность. В одном аспекте фосфолипаза согласно изобретению может обладать многофункциональной-3 015591 активностью, например комбинацией одной или нескольких ферментативных активностей, описанных в настоящей публикации, например фосфолипаза согласно изобретению может обладать активностью PLC и PLA; активностью PLB и PLA; активностью PLC и PLD; активностью PLC и PLB; активностью PLB и пататина; активностью PLC и пататина; PLD и PLA; активностью PLD, PLA, PLB и PLC; или активностью PLD, PLA, PLB, PLC и пататина; или активностью фосфолипазы и лизофосфолипазы (LPL), или активностью фосфолипазы и лизофосфолипазы-трансацилазы (LPTA), или активностью фосфолипазы и лизофосфолипазы (LPL) и лизофосфолипазы-трансацилазы (LPTA), или любой их комбинацией. Например, в одном аспекте полипептид согласно изобретению является ферментативно активным,но не имеет липазной активности, например не имеет какой-либо ферментативной активности, которая оказывает влияние на нейтральную фракцию масла (триглицериды). Может быть желательным применение такого полипептида в конкретном способе, например в способе дегуммирования, при котором важно,чтобы нейтральная фракция масла не повреждалась (не уменьшалась, например не гидролизовалась). Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ дегуммирования, включающий в себя применение полипептида согласно изобретению, обладающего фосфолипазной активностью, но не имеющего липазной активности. В одном аспекте изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, который является термостабильным. Например,полипептид согласно изобретению, например вариантные или измененные ферменты согласно изобретению, например конкретные варианты последовательностей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177 и SEQ ID NO: 178, которые указаны в табл. 5 и в примерах 4 и 7, могут быть термостабильными. Термостабильный полипептид согласно изобретению может сохранять связывающую и/или ферментативную активность, например фосфолипазную активность, в условиях, включающих в себя температуру в диапазоне примерно от -100 до примерно -80C, примерно от -80 до примерно -40C,примерно от -40 до примерно -20C, примерно от -20 до примерно 0C, примерно от 0 до примерно 37C,примерно от 0 до примерно 5C, примерно от 5 до примерно 15C, примерно от 15 до примерно 25C,примерно от 25 до примерно 37C, примерно от 37 до примерно 45C, примерно от 45 до примерно 55C,примерно от 55 до примерно 70C, примерно от 70 до примерно 75C, примерно от 75 до примерно 85C,примерно от 85 до примерно 90C, примерно от 90 до примерно 95C, примерно от 95 до примерно 100C, примерно от 100 до примерно 105C, примерно от 105 до примерно 110C, примерно от 110 до примерно 120C или при 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112,113, 114, 115C или выше. Термостабильные полипептиды согласно изобретению могут сохранять активность, например фосфолипазную активность, при температурах в диапазоне примерно от -100 до примерно -80C, примерно от -80 до примерно -40C, примерно от -40 до примерно -20C, примерно от-20 до примерно 0C, примерно от 0 до примерно 5C, примерно от 5 до примерно 15C, примерно от 15 до примерно 25C, примерно от 25 до примерно 37C, примерно от 37 до примерно 45C, примерно от 45 до примерно 55C, примерно от 55 до примерно 70C, примерно от 70 до примерно 75C, примерно от 75 до примерно 85C, примерно от 85 до примерно 90C, примерно от 90 до примерно 95C, примерно от 95 до примерно 100C, примерно от 100 до примерно 105C, примерно от 105 до примерно 110C, примерно от 110 до примерно 120C или при 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110,111, 112, 113, 114, 115C или выше. В некоторых вариантах термостабильные полипептиды согласно изобретению сохраняют активность, например фосфолипазную активность, при температуре в описанных выше диапазонах при значении pH, составляющем примерно pH 3,0, примерно pH 3,5, примерноpH 4,0, примерно pH 4,5, примерно pH 5,0, примерно pH 5,5, примерно pH 6,0, примерно pH 6,5, примерно pH 7,0, примерно pH 7,5, примерно pH 8,0, примерно pH 8,5, примерно pH 9,0, примерно pH 9,5, примерно pH 10,0, примерно pH 10,5, примерно pH 11,0, примерно pH 11,5, примерно pH 12,0 или более. В другом аспекте изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, который является термоустойчивым. Например, полипептид согласно изобретению, например вариантные или измененные ферменты согласно изобретению, например конкретные варианты последовательностей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 175, SEQ IDNO: 175, SEQ ID NO: 177 и SEQ ID NO: 178, которые указаны в табл. 5 и в примере 4 и 7, могут быть термоустойчивыми или термоактивными. Термоустойчивые полипептиды согласно изобретению могут сохранять связывающую и/или ферментативную активность, например фосфолипазную активность, после воздействия условий, включающих в себя температуру в диапазоне примерно от -100 до примерно-80C, примерно от -80 до примерно -40C, примерно от -40 до примерно -20C, примерно от -20 до примерно 0C, примерно от 0 до примерно 5C, примерно от 5 до примерно 15C, примерно от 15 до примерно 25C, примерно от 25 до примерно 37C, примерно от 37 до примерно 45C, примерно от 45 до примерно 55C, примерно от 55 до примерно 70C, примерно от 70 до примерно 75C, примерно от 75 до примерно 85C, примерно от 85 до примерно 90C, примерно от 90 до примерно 95C, примерно от 95 до примерно 100C, примерно от 100 до примерно 105C, примерно от 105 до примерно 110C, примерно от 110 до примерно 120C или при 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,-4 015591 112, 113, 114, 115C или выше. Термоустойчивые полипептиды согласно изобретению могут сохранять активность, например фосфолипазную активность, после воздействия температуры в диапазоне примерно от -100 до примерно -80C, примерно от -80 до примерно -40C, примерно от -40 до примерно -20C,примерно от -20 до примерно 0C, примерно от 0 до примерно 5C, примерно от 5 до примерно 15C,примерно от 15 до примерно 25C, примерно от 25 до примерно 37C, примерно от 37 до примерно 45C,примерно от 45 до примерно 55C, примерно от 55 до примерно 70C, примерно от 70 до примерно 75C,примерно от 75 до примерно 85C, примерно от 85 до примерно 90C, примерно от 90 до примерно 95C,примерно от 95 до примерно 100C, примерно от 100 до примерно 105C, примерно от 105 до примерно 110C, примерно от 110 до примерно 120C или при 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106,107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115C или выше. В некоторых вариантах термоустойчивые полипептиды согласно изобретению сохраняют активность, например фосфолипазную активность, после воздействия температуры в описанных выше диапазонах при значении pH, составляющем примерно pH 3,0,примерно pH 3,5, примерно pH 4,0, примерно pH 4,5, примерно pH 5,0, примерно pH 5,5, примерно pH 6,0, примерно pH 6,5, примерно pH 7,0, примерно pH 7,5, примерно pH 8,0, примерно pH 8,5, примерноpH 9,0, примерно pH 9,5, примерно pH 10,0, примерно pH 10,5, примерно pH 11,0, примерно pH 11,5,примерно pH 12,0 или более. В одном аспекте полипептид сохраняет фосфолипазную или другую активность после воздействия температуры в диапазоне от более чем 90 до примерно 95C при pH 4,5. В одном аспекте изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностью, которая указана в SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A,E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W,I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R,D234K или Q265R, при этом нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью. Нуклеиновая кислота может иметь длину, составляющую по меньшей мере примерно 10,20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850,или длину остатков или иметь полную длину гена или транскрипта с сигнальной последовательностью,которая описана в настоящей публикации, или без нее. Условия жесткости могут представлять собой условия высокой жесткости, умеренной жесткости или низкой жесткости, которые описаны в настоящей публикации. Условия жесткости могут включать стадию промывки, например стадию промывки, которая заключается в промывке в 0,2 SSC при температуре около 65C в течение примерно 15 мин. В настоящем изобретении предлагается нуклеиновая кислота, применяемая в качестве зонда для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с ферментативной активностью, например фосфолипазной активностью, при этом зонд содержит по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или больше следующих друг за другом оснований последовательности согласно изобретению, например последовательности,которая указана в SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R,T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V,D234G, D234R, D234K или Q265R, и зонд позволяет идентифицировать нуклеиновую кислоту посредством связывания или гибридизации. Зонд может содержать олигонуклеотид, содержащий примерно 10100 следующих друг за другом оснований последовательности согласно изобретению или ее фрагментов или подпоследовательностей, например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 оснований или более, или имеющий любую требуемую длину в пределах последовательности,которая указана в SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R,T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L,D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, 3168N, D171V,D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R. В настоящем изобретении предлагается нуклеиновая кислота, применяемая в качестве зонда для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с ферментативной активностью, например фосфолипазной активностью, при этом зонд содержит нуклеиновую кислоту согласно изобретению,например нуклеиновую кислоту, имеющую по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную (100%) идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R,T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L,D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V,D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R, или ее подпоследовательности на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или более следующих друг за-5 015591 другом остатков; и в одном аспекте идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. В настоящем изобретении предлагается пара последовательностей амплифицирующих праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, при этом пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность согласно изобретению или ее фрагменты или подпоследовательности. Один или каждый член пары последовательностей праймеров для амплификации может содержать олигонуклеотид,содержащий по меньшей мере примерно от 10 до 50 следующих друг за другом оснований последовательности или примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более следующих друг за другом оснований последовательности. В настоящем изобретении предлагается пара праймеров для амплификации, при этом пара праймеров содержит первый член, имеющий последовательность, которая представлена первыми (5'-) примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более остатками нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и второй член, имеющий последовательность, которая представлена первыми (5'-) примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более остатками комплементарной нити первого члена. В настоящем изобретении предлагаются фосфолипазы, полученные посредством амплификации,например полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются способы получения фосфолипазы посредством амплификации, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием пары праймеров для амплификации согласно изобретению. В одном аспекте пара праймеров для амплификации амплифицирует нуклеиновую кислоту из библиотеки, например библиотеки генов, такой как библиотека генов из окружающей среды. В настоящем изобретении предлагаются способы амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, включающие в себя амплификацию матричной нуклеиновой кислоты с пары последовательностей праймеров для амплификации, способных амплифицировать последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению или ее фрагменты или подпоследовательности. Парой праймеров для амплификации может быть пара праймеров для амплификации согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются кассеты экспрессии, содержащие нуклеиновую кислоту согласно изобретению или ее подпоследовательность. В одном аспекте кассета экспрессии может содержать нуклеиновую кислоту, которая оперативно связана с промотором. Промотор может представлять собой промотор вируса, бактерии, млекопитающего или растения. В одном аспекте растительным промотором может быть промотор картофеля, риса, кукурузы, пшеницы, табака или ячменя. Промотор может быть конститутивным промотором. Конститутивным промотором может быть промотор CaMV35S. В другом аспекте промотор может быть индуцируемым промотором. В одном аспекте промотор может быть тканеспецифичным промотором или регулируемым факторами окружающей среды или регулируемым при развитии промотором. Таким образом, промотор может быть специфичным для семян, специфичным для листьев, специфичным для корней, специфичным для стебля или индуцируемым опаданием промотором. В одном аспекте кассета экспрессии может дополнительно содержать экспрессирующий вектор растения или вируса растений. В настоящем изобретении предлагаются носители для клонирования, содержащие кассету экспрессии (например, вектор) согласно изобретению или нуклеиновую кислоту согласно изобретению. Носитель для клонирования может представлять собой вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагмиду, космиду,фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому. Вирусный вектор может представлять собой аденовирусный вектор, ретровирусный вектор или вектор на основе аденоассоциированного вируса. Носитель для клонирования может представлять собой бактериальную искусственную хромосому (BAC),плазмиду, полученный на основе бактериофага P1 вектор (PAC), дрожжевую искусственную хромосому(YAC) или искусственную хромосому млекопитающих (MAC). В настоящем изобретении предлагается трансформированная клетка, содержащая нуклеиновую кислоту согласно изобретению, или кассету экспрессии (например, вектор) согласно изобретению, или носитель для клонирования согласно изобретению. В одном аспекте трансформированная клетка может быть клеткой бактерии, клеткой млекопитающего, клеткой гриба, дрожжевой клеткой, клеткой насекомого или растительной клеткой. В одном аспекте растительная клетка может быть клеткой картофеля,пшеницы, риса, кукурузы, табака или ячменя. В настоящем изобретении предлагаются трансгенные животные, отличные от человека, содержащие нуклеиновую кислоту согласно изобретению или кассету экспрессии (например, вектор) согласно изобретению. В одном аспекте животным является мышь, крыса, коза, кролик, овца, свинья или корова или другое млекопитающее. В настоящем изобретении предлагаются трансгенные растения, содержащие нуклеиновую кислоту согласно изобретению или кассету экспрессии (например, вектор) согласно изобретению. Трансгенным растением может быть растение кукурузы, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, рас-6 015591 тение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя или растение табака. В настоящем изобретении предлагаются трансгенные семена, содержащие нуклеиновую кислоту согласно изобретению или кассету экспрессии (например, вектор) согласно изобретению. Трансгенным семенем может быть семя кукурузы, зерно пшеницы, семя масличной культуры, семя рапса (растение канолы), семя сои, косточка пальмы, семя подсолнечника, семя кунжута, арахис, зерно риса или семя растения табака. В настоящем изобретении предлагается антисмысловой олигонуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную или способную гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются способы ингибирования трансляции фосфолипазной матрицы в клетке, включающие в себя введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную или способную гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагается антисмысловой олигонуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную или способную гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются способы ингибирования трансляции фосфолипазной матрицы в клетке, включающие в себя введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную или способную гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой согласно изобретению. Антисмысловой олигонуклеотид может иметь длину примерно от 10 до 50, примерно от 20 до 60, примерно от 30 до 70, примерно от 40 до 80, примерно от 60 до 100, примерно от 70 до 110 или примерно от 80 до 120 оснований. В настоящем изобретении предлагаются способы ингибирования трансляции фосфолипазы, например фосфолипазной матрицы в клетке, включающие в себя введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную или способную гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются двунитевые ингибирующие молекулы РНК (РНКi), содержащие подпоследовательность последовательности согласно изобретению. В одном аспекте РНКi имеет длину примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше дуплексов нуклеотидов. В настоящем изобретении предлагаются способы ингибирования экспрессии фосфолипазы, например фосфолипазы в клетке, включающие в себя введение в клетку или экспрессию в клетке двунитевой ингибирующей РНК(i-РНК), при этом РНК содержит подпоследовательность последовательности согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагается изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% или более, или полную (100%) идентичность последовательностей с типичным полипептидом или пептидом согласно изобретению (например, последовательностями SEQ ID NO: 175 или SEQ ID NO: 176, имеющими одну или несколько мутаций E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R,T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L,D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V,D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K, или Q265R, на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100,125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 или больше остатков, или на протяжении полной длины полипептида; и в одном аспекте идентичности последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. В одном аспекте настоящего изобретения предлагается изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или больше, или полную(100%) идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 175 или SEQ ID NO: 176,имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L,D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V,E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R,Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G,D234R, D234K или Q265R. В настоящем изобретении предлагаются изолированные, синтетические или рекомбинантные полипептиды, кодируемые нуклеиновой кислотой согласно изобретению. В альтернативных аспектах полипептид может иметь последовательность, которая указана в SEQ ID NO: 175 или SEQ ID NO: 176, имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M,D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, E41A,E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W,I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R,-7 015591D234K или Q265R. Полипептид может обладать фосфолипазной активностью, например активностью фосфолипазы A, B, C или D, или любой комбинацией фосфолипазной активности, например активностью PLA, PLC и/или PLD в виде многофункциональной активности. Например, в одном аспекте полипептид согласно изобретению является ферментативно активным, но не имеет липазной активности, например не имеет какой-либо ферментативной активности, которая оказывает влияние на нейтральную фракцию масла (триглицериды). В одном аспекте изобретения предлагается способ дегуммирования,включающий в себя применение полипептида согласно изобретению, обладающего фосфолипазной активностью, но не имеющего липазной активности, так чтобы в способе дегуммирования любая нейтральная фракция масла не повреждалась (не уменьшалась, не изменялась, не разрушалась, например, не гидролизовалась). В альтернативных аспектах полипептиды согласно настоящему изобретению обладают фосфолипазной активностью, но не имеют сигнальной последовательности или последовательности пробелка; или обладают фосфолипазной активностью и дополнительно содержат гетерологичную аминокислотную последовательность, или нуклеиновая кислота (полинуклеотид) согласно изобретению содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность. В одном аспекте гетерологичная аминокислотная последовательность содержит или состоит из последовательности, кодирующей гетерологичную (лидерную) сигнальную последовательность или метку или эпитоп, или гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит гетерологичную промоторную последовательность; в одном аспекте гетерологичная(лидерная) сигнальная последовательность содержит или состоит из N-концевого и/или C-концевого удлинения для направления в эндоплазматический ретикулум (ER) или внутриклеточную мембрану, или в эндоплазматический ретикулум (ER) или систему внутриклеточных мембран растения, или гетерологичная последовательность кодирует сайт рестрикции. В настоящем изобретении предлагаются изолированные, синтетические или рекомбинантные полипептиды, содержащие полипептид согласно изобретению, не имеющий сигнальной последовательности. В одном аспекте полипептид, в котором отсутствует сигнальная последовательность, имеет по меньшей мере 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность последовательности с остатками 30-287 последовательности SEQ ID NO: 175 или SEQ ID NO: 176, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M,D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, E41A,E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W,I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R,D234K или Q265R. Идентичности последовательностей можно определить в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. В другом аспекте настоящего изобретения предлагается изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид или пептид, содержащий по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 или больше следующих друг за другом оснований полипептидной или пептидной последовательности согласно изобретению, по существу, идентичных ей последовательностей и комплементарных им последовательностей. Пептид может представлять собой, например, иммуногенный фрагмент, мотив (например, участок связывания) или активный участок. В одном аспекте изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид согласно изобретению (с сигнальной последовательностью или без нее) обладает фосфолипазной активностью. В одном аспекте фосфолипазная активность заключается в катализе гидролиза глицерофосфатной сложноэфирной связи (т.е. расщепления глицерофосфатных сложноэфирных связей). Фосфолипазная активность может заключаться в катализе гидролиза сложноэфирной связи в фосфолипиде растительного масла. Фосфолипид растительного масла может содержать фосфолипид семян масличных культур. Фосфолипазная активность может включать в себя активность фосфолипазы C (PLC); активность фосфолипазы A (PLA),такую как активность фосфолипазы A1 или фосфолипазы A2; активность фосфолипазы D (PLD), такую как активность фосфолипазы D1 или фосфолипазы D2; активность фосфолипазы B (PLB), например активность фосфолипазы и лизофосфолипазы (LPL) или активность фосфолипазы и лизофосфолипазытрансацилазы (LPTA), или активность фосфолипазы и лизофосфолипазы (LPL) и лизофосфолипазытрансацилазы (LPTA); или активность пататина или их комбинацию. Например, в одном аспекте фосфолипаза обладает комбинацией одной или нескольких ферментативных активностей, описанных в настоящей публикации, например фосфолипаза может обладать активностью PLC и PLA; активностью PLB и PLA; активностью PLC и PLD; активностью PLC и PLB; активностью PLB и пататина; активностьюPLC и пататина; PLD и PLA; активностью PLD, PLA, PLB и PLC; или активностью PLD, PLA, PLB, PLC и пататина; или активностью фосфолипазы и лизофосфолипазы (LPL), или активностью фосфолипазы и лизофосфолипазы-трансацилазы (LPTA), или активностью фосфолипазы и лизофосфолипазы (LPL) и лизофосфолипазы-трансацилазы (LPTA), или любой их комбинацией. Фосфолипазная активность может заключаться в гидролизе гликопротеида, например гликопротеида, обнаруженного в клубне картофеля. Фосфолипазная активность может включать в себя ферментативную активность пататина. Фосфолипазная активность может включать в себя активность липидацилгидролазы (LAH).-8 015591 В одном аспекте изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид может включать полипептид согласно изобретению, в котором отсутствует сигнальная последовательность. В одном аспекте изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид может включать полипептид согласно изобретению, содержащий гетерологичную сигнальную последовательность, такую как гетерологичная сигнальная последовательность фосфолипазы или другого белка, отличного от фосфолипазы. В одном аспекте настоящего изобретения предлагаются химерные белки, содержащие первый домен, включающий в себя сигнальную последовательность согласно изобретению, и, по меньшей мере,второй домен. Белок может представлять собой слитый белок. Второй домен может включать в себя фермент. Ферментом может быть фосфолипаза. В настоящем изобретении предлагаются химерные полипептиды, содержащие, по меньшей мере,первый домен, включающий в себя сигнальный пептид (SP) согласно изобретению или каталитический домен (CD), или активный участок фосфолипазы согласно изобретению, и, по меньшей мере, второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, при этом гетерологичный полипептид или пептид в природе не связан с сигнальным пептидом (SP) или каталитическим доменом (CD). В одном аспекте гетерологичный полипептид или пептид не является фосфолипазой. Гетерологичный полипептид или пептид может быть расположен на аминоконце, карбоксильном конце или на обоих концах сигнального пептида (SP) или каталитического домена (CD). В настоящем изобретении предлагаются изолированные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие химерный полипептид, при этом химерный полипептид содержит, по меньшей мере, первый домен, содержащий сигнальный пептид (SP) или каталитический домен (CD), или активный участок полипептида согласно изобретению, и, по меньшей мере, второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, при этом гетерологичный полипептид или пептид в природе не связан с сигнальным пептидом (SP) или каталитическим доменом (CD). В одном аспекте фосфолипазная активность соответствует удельной активности примерно при 37C в диапазоне примерно от 10 до примерно 100 единиц на миллиграмм белка. В другом аспекте фосфолипазная активность соответствует удельной активности примерно от 100 до примерно 1000 единиц на миллиграмм, примерно от 500 до примерно 750 единиц на миллиграмм белка. Альтернативно, фосфолипазная активность соответствует удельной активности при 37C в диапазоне примерно от 100 до примерно 500 единиц на миллиграмм белка. В одном аспекте фосфолипазная активность соответствует удельной активности при 37C в диапазоне примерно от 500 до примерно 1200 единиц на 1 миллиграмм белка. В другом аспекте фосфолипазная активность соответствует удельной активности при 37C в диапазоне примерно от 750 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка. В другом аспекте термоустойчивость заключается в сохранении, по меньшей мере, половины удельной активности фосфолипазы при 37C после нагревания до повышенной температуры. Альтернативно, термоустойчивость может заключаться в сохранении удельной активности при 37C в диапазоне примерно от 500 до примерно 1200 единиц на миллиграмм белка после нагревания до повышенной температуры, такой как температура примерно от 0 до примерно 20C, примерно от 20 до примерно 37C, примерно от 37 до примерно 50C, примерно от 50 до примерно 70C, примерно от 70 до примерно 75C, примерно от 75 до примерно 80C, примерно от 80 до примерно 85C, примерно от 85 до примерно 90C, примерно от 90 до примерно 95C, примерно от 95 до примерно 100C, примерно от 100 до примерно 110C или выше. Альтернативно, термоустойчивость может заключаться в сохранении удельной активности при 37C в диапазоне примерно от 1 до примерно 1200 единиц на миллиграмм белка или примерно от 500 до примерно 1000 единиц на миллиграмм белка после нагревания до повышенной температуры. В другом аспекте термоустойчивость может заключаться в сохранении удельной активности при 37C в диапазоне примерно от 1 до примерно 500 единиц на миллиграмм белка после нагревания до повышенной температуры, как описано выше. В настоящем изобретении предлагается изолированный, синтетический или рекомбинантный полипептид согласно изобретению, при этом полипептид содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования. В одном аспекте гликозилирование может быть N-связанным гликозилироваиием. В одном аспекте полипептид может быть гликозилирован после экспрессии в P. pastoris или S. pombe. В настоящем изобретении предлагаются ферменты фосфолипазы и нуклеиновые кислоты, которые их кодируют, имеющие последовательность любой из иллюстративных фосфолипаз согласно изобретению, с одним или несколькими или всеми измененными сайтами гликозилирования, которые описаны выше. Таким образом, изобретение относится к способам пслучения вариантов последовательностей,кодирующих фосфолипазы, имеющим повышенную экспрессию в клетке-хозяине, при этом способ включает в себя модификацию кодирующей фосфолипазу последовательности согласно изобретению,так что один, несколько или все мотивы, кодирующие N-связанные сайты гликозилирования, модифицируют с получением не гликозилируемого мотива. Изобретение также относится к кодирующей фосфолипазу последовательности, полученной таким способом, и к ферментам, кодируемым такой последовательностью. В настоящем изобретении предлагаются способы получения варианта кодирующей фосфолипазу последовательности, кодирующей фосфолипазу, имеющую повышенную резистентность к протеазам,-9 015591 включающие в себя модификацию аминокислоты, эквивалентной аминокислоте в положении 131 последовательности SEQ ID NO: 175 или SEQ ID NO: 176, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R,T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L,D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V,D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R, с получением одного, нескольких или всех из следующих остатков: лизина (K); серина (S); глицина (G); аргинина (R); глутамина (Q); аланина (A); изолейцина (I); гистидина (H); фенилаланина (F); треонина (T); метионина (M); лейцина (L). Изобретение также относится к изолированным, синтетическим или рекомбинантным фосфолипазам, кодируемым последовательностью, полученной таким способом. В настоящем изобретении предлагаются способы получения варианта кодирующей фосфолипазу последовательности, кодирующей фосфолипазу, имеющую пониженную резистентность к протеазам,включающим в себя модификацию аминокислоты, эквивалентной аминокислоте в положении 131 последовательности SEQ ID NO: 175 или SEQ ID NO: 176, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, Е 41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R,T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L,D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V,D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R с получением одного, нескольких или всех из следующих остатков: триптофана (W); глутамата (E); тирозина (Y). Изобретение также относится к изолированным, синтетическим или рекомбинантным фосфолипазам, кодируемым последовательностью, полученной таким способом. В настоящем изобретении предлагаются препараты белков, содержащие полипептид согласно изобретению, при этом препарат белка представляет собой жидкость, твердое вещество или гель. В настоящем изобретении предлагаются гетеродимеры, содержащие полипептид согласно изобретению и второй белок или домен. Второй член гетеродимера может представлять собой другую фосфолипазу, другой фермент или другой белок. В одном аспекте второй домен может представлять собой полипептид и гетеродимер может быть слитым белком. В одном аспекте второй домен может представлять собой эпитоп или метку. В одном аспекте в настоящем изобретении предлагаются гомодимеры, содержащие полипептид согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются иммобилизованные полипептиды, обладающие фосфолипазной активностью, при этом полипептид содержит полипептид согласно изобретению, полипептид,кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению, или полипептид содержит полипептид согласно изобретению и второй домен (например, слитый белок). В одном аспекте полипептид согласно изобретению иммобилизован на клетке, везикуле, липосоме, пленке, мембране, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитовой частице, шарике, геле, планшете, кристаллах, таблетке, пилюле, капсуле, порошке, агломерате, поверхности, пористой структуре, матрице или капиллярной трубке. В одном аспекте полипептид согласно изобретению иммобилизован на таком материале, как зерна, шелуха, кора, кожа, волос, эмаль, кость, раковина и полученные из них материалы или вещества корма животных, или их сочетания. Полипептиды согласно изобретению (например, фосфолипазы) также могут присутствовать отдельно или в виде смеси фосфолипаз или фосфолипаз и других гидролитических ферментов, таких как целлюлазы, ксиланазы, протеазы, липазы, амилазы или окислительновосстановительные ферменты, такие как лакказы, пероксидазы, каталазы, оксидазы или редуктазы. Они могут быть приготовлены в твердой форме, такой как порошок, лиофилизованные препараты, гранулы,таблетки, пластинки, кристаллы, капсулы, пилюли, подушечки, или в жидкой форме, такой как водный раствор, аэрозоль, гель, паста, взвесь, эмульсия вода/масло, в виде крема, капсулы, везикулярной или мицеллярной суспензии. В одном аспекте такие препараты согласно изобретению могут содержать любой из следующих ингредиентов или их сочетание: полиолы, такие как полиэтиленгликоли, поливиниловые спирты, глицерин, сахара, такие как сахароза, сорбит, трегалоза, глюкоза, фруктоза, мальтоза, гелеобразующие агенты, такие как камеди, каррагинаны, альгинаты, декстраны, производные целлюлозы,пектины, соли, такие как хлорид натрия, сульфат натрия, сульфат аммония, хлорид кальция, хлорид магния, хлорид цинка, сульфат цинка, соли жирных кислот и их производные, хелаторы металлов, такие какEDTA, EGTA, цитрат натрия, противомикробные средства, такие как жирные кислоты, их производные,парабены, сорбаты, бензоаты, дополнительные соединения для блокирования действия протеаз, такие как белки-наполнители, такие как БСА, гидролизаты пшеницы, боратные соединения, эмульгаторы, такие как неионогенные и ионогенные детергенты, которые можно использовать по отдельности или в сочетании, фитостерины, витамины, аминокислоты, восстановители, такие как цистеин, или антиоксидантные соединения, такие как аскорбиновая кислота, также могут быть включены диспергирующие вещества. В одном аспекте используют поперечное сшивание и модификацию белков, такую как пегилирование, модификация жирными кислотами и гликозилирование, чтобы повысить стабильность полипептида согласно изобретению (например, ферментативную стабильность). В одном аспекте полиолы и/или сахара составляют примерно от 5 до примерно 60% препарата или более, примерно от 10 до примерно 50%- 10015591 препарата, примерно от 20 до примерно 40% препарата или примерно от 5 до примерно 20% препарата. В другом аспекте гелеобразующие агенты составляют примерно от 0,5 до примерно 10% препарата, примерно от 1 до примерно 8% препарата, примерно от 2 до примерно 5% препарата или примерно от 0,5 до примерно 3% препарата. В другом аспекте соли, такие как хлорид натрия, сульфат натрия, сульфат аммония, хлорид кальция и/или хлорид магния, составляют примерно от 1 до примерно 30% препарата,примерно от 2 до примерно 20% препарата, примерно от 5 до примерно 15% препарата или примерно от 1 до примерно 10% препарата. В другом аспекте хлорид цинка присутствует в препарате в концентрациях, составляющих примерно от 0,1 до примерно 20 мМ, примерно от 0,5 до примерно 10 мМ, примерно от 1 до примерно 5 мМ или примерно от 0,1 до примерно 5 мМ. В еще одном аспекте сульфат цинка присутствует в препарате в концентрациях, составляющих примерно от 0,1 до примерно 20 мМ, примерно от 0,5 до примерно 10 мМ, примерно от 1 до примерно 5 мМ или примерно от 0,1 до примерно 5 мМ. В другом аспекте соли жирных кислот и/или их производные составляют примерно от 5 до примерно 40% препарата, примерно от 10 до примерно 30% препарата, примерно от 15 до примерно 25% препарата или примерно от 5 до примерно 20% препарата. В другом аспекте хелаторы металлов,такие как EDTA, EGTA и/или цитрат натрия, присутствуют в препарате в концентрациях, составляющих от 0,1 до примерно 10 мМ, примерно от 0,5 до примерно 8 мМ, примерно от 1 до примерно 5 мМ или примерно от 0,1 до примерно 1 мМ. В другом аспекте противомикробные препараты, такие как парабены, сорбаты и/или бензоаты, составляют примерно от 0,01 до примерно 10% препарата, примерно от 0,05 до примерно 5% препарата, примерно от 0,1 до примерно 1% препарата или примерно от 0,05 до примерно 0,5% препарата. В еще одном аспекте белки-наполнители, такие как БСА и/или гидролизаты пшеницы, составляют примерно от 1 до примерно 20% препарата, примерно от 5 до примерно 15% препарата, примерно от 2,5 до примерно 7,5% препарата или примерно от 1 до примерно 5% препарата. В другом аспекте эмульгаторы, такие как неионогенные и/или ионогенные детергенты, присутствуют в препарате в концентрациях, составляющих примерно от 1 критической концентрации мицеллообразования (CMC) до примерно 10 CMC, примерно от 2,5 CMC до примерно 7,5 CMC, примерно от 1 CMC до примерно 5 CMC или примерно от 3 CMC до примерно 6 CMC. В другом аспекте витамины, аминокислоты,восстановители и/или антиоксиданты составляют примерно от 0,1 до примерно 5% препарата, примерно от 0,5 до примерно 4% препарата, примерно от 1 до примерно 2,5% препарата или примерно от 0,1 до примерно 1% препарата. В настоящем изобретении предлагаются матрицы, содержащие иммобилизованный полипептид,при этом полипептид представляет собой фосфолипазу согласно изобретению или является полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются матрицы, содержащие иммобилизованную нуклеиновую кислоту согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагается матрица, содержащая иммобилизованное антитело согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются изолированные, синтетические или рекомбинантные антитела, которые специфично связываются с полипептидом согласно изобретению или с полипептид, кодируемым нуклеиновой кислотой согласно изобретению. Антитело может быть моноклональным или поликлональным антителом. В настоящем изобретении предлагаются гибридомы, содержащие антитело согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются способы выделения или идентификации полипептида с фосфолипазной активностью, включающие в себя стадии: (a) получение антитела согласно изобретению;(b) получение образца, содержащего полипептиды; и (c) осуществление контакта образца со стадии (b) с антителом со стадии (a) в условиях, при которых антитело может специфично связываться с полипептидом, что приводит, таким образом, к выделению или идентификации фосфолипазы. В настоящем изобретении предлагаются способы получения антитела против фосфолипазы, включающие в себя введение животному, отличному от человека, нуклеиновой кислоты согласно изобретению или полипептида согласно изобретению в количестве, достаточном для того, чтобы вызвать гуморальный иммунный ответ, получая таким образом антитело против фосфолипазы. В настоящем изобретении предлагаются способы получения рекомбинантного полипептида, включающие в себя стадии: (a) получение нуклеиновой кислоты согласно изобретению, оперативно связанной с промотором; и (b) экспрессия нуклеиновой кислоты со стадии (a) в условиях, которые обеспечивают возможность экспрессии полипептида, с получением таким образом рекомбинантного полипептида. Нуклеиновая кислота может содержать последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 175 или SEQ ID NO: 176, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y,D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E, M176W,D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R, на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 100 остатков, при этом идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. Нуклеиновая кислота может представлять собой нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, которая указана в SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющей- 11015591 одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M,D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E,M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R. Способ может дополнительно включать в себя трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой со стадии (a) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты со стадии (a) с получением таким образом рекомбинантного полипептида в трансформированной клетке. Способ может дополнительно включать в себя внедрение в организм животного-хозяина, отличного от человека, нуклеиновой кислоты со стадии (a) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты со стадии (a) с получением таким образом рекомбинантного полипептида в организме животного-хозяина, отличного от человека. В настоящем изобретении предлагаются способы идентификации полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, включающие в себя следующие стадии: (a) получение полипептида согласно изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению, или его фрагмента или варианта, (b) получение субстрата фосфолипазы и (c) осуществление контакта полипептида или его фрагмента или варианта со стадии (a) с субстратом со стадии (b) и регистрации уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, при этом уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции свидетельствует о выявлении полипептида, обладающего фосфолипазной активностью. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 85% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующихE41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R,Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G,D234R, D234K или Q265R, на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 100 остатков, при этом идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота гибридизуется в жестких условиях с последовательностью, которая указана в SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y,E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W,E125K, S168N, D171V, D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K илиQ265R. В настоящем изобретении предлагаются способы идентификации субстрата фосфолипазы, включающие в себя следующие стадии: (a) получение полипептида согласно изобретению или полипептида,кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение тестируемого субстрата и (c) осуществление контакта полипептида со стадии (a) с тестируемым субстратом со стадии (b) и регистрацию уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, при этом уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции идентифицирует тестируемый субстрат как субстрат фосфолипазы. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота может иметь по меньшей мере 85% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F,D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E, M176W, D230H,D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R, при этом идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота гибридизуется в жестких условиях с последовательностью, которая указана в SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F,D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E, M176W, D230H,D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R. В настоящем изобретении предлагаются способы определения того, связывается ли соединение специфично с фосфолипазой, включающие в себя следующие стадии: (a) экспрессия нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, в условиях, обеспечивающих трансляцию нуклеиновой кислоты с образованием полипептида, при этом нуклеиновая кислота и вектор представляют собой нуклеиновую кислоту или вектор согласно изобретению; или получение полипептида согласно изобретению (b) осуществление контакта полипептида с тестируемым соединением и (c) определение того, связывается ли тестируемое соединение специфично с полипептидом, что приводит, таким образом, к определению того, что соединение специфично связывается с фосфолипазой. В альтернативных аспектах последовательность нуклеиновой кислоты имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M,D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E,M176W, D230H, D230R, D234W, 0234V, D234G, D234R, D234K или Q265R, при этом идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота гибридизует- 12015591 ся в жестких условиях с последовательностью, которая указана в SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178,имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L,D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V,D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R, или ее подпоследовательностью. В настоящем изобретении предлагаются способы идентификации модулятора фосфолипазной активности, включающие в себя следующие стадии: (a) получение полипептида согласно изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение тестируемого соединения; (c) осуществление контакта полипептида со стадии (a) с тестируемым соединением со стадии (b); и измерение фосфолипазной активности, при этом изменение фосфолипазной активности, измеренное в присутствии тестируемого соединения по сравнению с активностью в отсутствие тестируемого соединения позволяет определять, что тестируемое соединение модулирует фосфолипазную активность. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота может иметь по меньшей мере 85% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F,D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E, M176W, D230H,D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R, на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 100 остатков, при этом идентичность последовательностей определяют в анализе с использованием алгоритма сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота может гибридизоваться в жестких условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, которые указаны в SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющих одну или несколько мутаций, кодирующихE41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R,Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G,D234R, D234K или Q265R или их подпоследовательности. В одном аспекте фосфолипазную активность измеряют, обеспечивая субстрат фосфолипазы и выявляя увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции. Уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции в присутствии тестируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции в отсутствие тестируемого соединения идентифицирует тестируемое соединение как активатор фосфолипазной активности. Увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции в присутствии тестируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции в отсутствие тестируемого соединения идентифицирует тестируемое соединение как ингибитор фосфолипазной активности. В настоящем изобретении предлагается компьютерная система, содержащая процессор и устройство накопления данных, при этом указанное устройство накопления данных используют для хранения последовательности полипептида согласно изобретению или последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению. В одном аспекте компьютерная система может дополнительно содержать алгоритм сравнения последовательности и устройство накопления данных, в котором сохранена по меньшей мере одна эталонная последовательность. Алгоритм сравнения последовательностей может включать в себя компьютерную программу, которая показывает полиморфизм. Компьютерная система может дополнительно включать в себя идентификатор, который позволяет выявлять один или несколько характерных признаков указанной последовательности. В настоящем изобретении предлагаются машиночитаемые носители, на которых сохранена последовательность, включающая в себя последовательность полипептида согласно изобретению или последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются способы идентификации характерного признака в последовательности, включающие в себя стадии (a) прочтения последовательности с использованием компьютерной программы, которая выявляет один или несколько характерных признаков в последовательности,при этом последовательность включает в себя полипептидную последовательность согласно изобретению или последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению; и (b) идентификации одного или нескольких характерных признаков с помощью компьютерной программы. В настоящем изобретении предлагаются способы сравнения первой последовательности со второй последовательностью, включающие в себя стадии (a) прочтения первой последовательности и второй последовательности с помощью компьютерной программы, которая сравнивает последовательности, при этом первая последовательность содержит последовательность полипептида согласно изобретению или последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению; и (b) определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью с помощью компьютерной программы. В одном аспекте стадия определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью дополнительно включает в себя стадию идентификации полиморфизма. В одном аспекте способ дополнительно включает в себя идентификатор (и применение идентификатора), который идентифицирует один или несколько характерных признаков последовательности. В одном аспекте способ- 13015591 включает в себя прочтение первой последовательности с использованием компьютерной программы и идентификацию одного или нескольких характерных признаков последовательности. В настоящем изобретении предлагаются способы выделения или извлечения нуклеиновой кислоты,кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью из образца, взятого из окружающей среды,включающие в себя стадии (a) получения пары последовательностей амплифицирующих праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью, при этом пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту согласно изобретению (например,последовательность SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R,T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V, D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V,D234G, D234R, D234K или Q265R, или ее подпоследовательность и т.д.); (b) выделения нуклеиновой кислоты из образца, взятого из окружающей среды, или обработки образца, взятого из окружающей среды, так чтобы нуклеиновая кислота в образце была доступна для гибридизации с парой праймеров для амплификации; и (c) объединения нуклеиновой кислоты со стадии (b) с парой праймеров для амплификации со стадии (a) и амплификации нуклеиновой кислоты из образца, взятого из окружающей среды,что приводит, таким образом, к выделению или извлечению нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью из образца, взятого из окружающей среды. В одном аспекте каждый член пары последовательностей праймеров для амплификации включает в себя олигонуклеотид,содержащий по меньшей мере примерно от 10 до 50 следующих друг за другом оснований последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению. В одном аспекте пара последовательностей амплифицирующих праймеров представляет собой пару праймеров для амплификации согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются способы выделения или извлечения нуклеиновой кислоты,кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью из образца, взятого из окружающей среды,включающие в себя стадии (a) получения полинуклеотидного зонда, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению или ее подпоследовательность; (b) выделения нуклеиновой кислоты из образца, взятого из окружающей среды, или обработки образца, взятого из окружающей среды, так чтобы нуклеиновая кислота в образце была доступна для гибридизации с полинуклеотидным зондом со стадии (a); (c) объединения изолированной нуклеиновой кислоты или обработанного образца,взятого из окружающей среды, со стадии (b) с полинуклеотидным зондом со стадии (a); и (d) выделения нуклеиновой кислоты, которая специфично гибридизуется с полинуклеотидным зондом со стадии (a),что приводит, таким образом, к выделению или извлечению нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью из образца, взятого из окружающей среды. В альтернативных аспектах образец, взятый из окружающей среды, представляет собой образец воды, образец жидкости, образец почвы, образец воздуха или биологический образец. В альтернативных аспектах биологический образец получают из бактериальной клетки, клетки простейшего, клетки насекомого, дрожжевой клетки,растительной клетки, клетки грибов, клетки водорослей, клетки лишайника или клетки млекопитающего. В настоящем изобретении предлагаются способы получения варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей фосфолипазу, включающие в себя стадии (a) получения матричной нуклеиновой кислоты, включающей в себя нуклеиновую кислоту согласно изобретению; (b) модификации, делетирования или добавления одного или нескольких нуклеотидов в последовательность матрицы или сочетания указанных изменений с получением варианта матричной нуклеиновой кислоты. В одном аспекте способ дополнительно включает в себя экспрессию варианта нуклеиновой кислоты, чтобы получить вариант фосфолипазного полипептида. В альтернативных аспектах модификации,добавления или делеции вводят посредством склонной к ошибкам ПЦР, перетасовку, направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, сборку с использованием ПЦР, мутагенез с использованием ПЦР, имитирующей генетическую рекомбинацию при половом процессе ("половая ПЦР"), мутагенез invivo, кассетный мутагенез, множественный мутагенез, регулируемый по типу обратной связи, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфичный мутагенез, вторичную сборку генов, генный мутагенез по механизму насыщения сайтов (GSSM), вторичную сборку по механизму синтеза с использованием реакции лигирования (SLR) и/или используя сочетание указанных способов. В альтернативных аспектах модификации, добавления или делеции вводят способом, выбранным из группы, состоящей из рекомбинации, рекомбинации последовательностей, регулируемой по типу обратной связи, мутагенеза ДНК, модифицированной фосфотиоатом, мутагенеза с использованием урацилсодержащей матрицы,мутагенеза с использованием дуплекса с пробелами, мутагенеза по механизму точечного ошибочного спаривания при репарации, мутагенеза, связанного с недостаточностью функционирования системы репарации в хозяйском штамме, химического мутагенеза, радиогенного мутагенеза, делеционного мутагенеза, мутагенеза на основе системы рестрикции-селекции, мутагенеза на основе системы рестрикцииочистки, синтеза искусственного гена, множественного мутагенеза, создания мультимера химерной молекулы нуклеиновой кислоты или их сочетания. В одном аспекте способ многократно повторяют, пока не будет получена фосфолипаза, имеющая измененную или другую активность или измененную или другую стабильность по сравнению с фосфо- 14015591 липазой, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой. В одном аспекте измененная или другая активность представляет собой фосфолипазную активность в кислых условиях, при этом фосфолипаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, не активна в кислых условиях. В одном аспекте измененная или другая активность представляет собой фосфолипазную активность при высокой температуре, при этом фосфолипаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, не активна при высокой температуре. В одном аспекте способ многократно повторяют, пока не будет получена последовательность, кодирующая фосфолипазу, имеющая измененное использование кодонов по сравнению с матричной нуклеиновой кислотой. Способ можно многократно повторять, пока не будет получен ген фосфолипазы, имеющий более высокий или более низкий уровень экспрессии или стабильности первичного транскрипта по сравнению с матричной нуклеиновой кислотой. В настоящем изобретении предлагаются способы модификации кодонов в нуклеиновой кислоте,кодирующей фосфолипазу, для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине, при этом способ включает в себя (a) получение нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей фосфолипазу; и (b) идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте со стадии(a) и его замену предпочтительным или нейтрально используемым кодоном, кодирующим такую же аминокислоту, что и замененный кодон, при этом предпочтительный кодон представляет собой кодон, широко представленный в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, слабо представленный в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, что приводит, таким образом, к модификации нуклеиновой кислоты для увеличения ее экспрессии в клетке-хозяине. В настоящем изобретении предлагаются способы модификации кодонов в нуклеиновой кислоте,кодирующей фосфолипазу, при этом способ включает в себя (a) получение нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей фосфолипазу; и (b) идентификацию кодона в нуклеиновой кислоте со стадии (a) и его замену другим кодоном, кодирующим такую же аминокислоту, что и замененный кодон, за счет чего достигается модификация кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу. Настоящее изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу, для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине, при этом описываемый способ включает в себя (a) получение нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей фосфолипазу,и (b) идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте,полученной на стадии (a), и его замену предпочтительным или нейтрально используемым кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, при этом предпочтительный кодон представляет собой кодон, широко представленный в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, слабо представленный в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, за счет чего достигается модификация нуклеиновой кислоты для повышения ее экспрессии в клетке-хозяине. Настоящее изобретение относится к способам модификации кодона в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу, для снижения ее экспрессии в клетке-хозяине, при этом описываемый способ включает в себя (a) получение нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей фосфолипазу; и (b) идентификацию по меньшей мере одного предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте, полученной на стадии (a), и его замену непредпочтительным или менее предпочтительным кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, при этом предпочтительный кодон представляет собой кодон, широко представленный в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, слабо представленный в кодирующих последовательностях генов клетки-хозяина, за счет чего достигается модификация нуклеиновой кислоты для снижения уровня ее экспрессии в клетке-хозяине. В альтернативных аспектах клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку, клетку грибов, клетку насекомого, дрожжевую клетку, растительную клетку, клетку водорослей, клетку лишайника или клетку млекопитающего. Настоящее изобретение относится к способам получения библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных сайтов фосфолипазы или сайтов связывания субстрата, при этом модифицированные активные сайты или сайты связывания субстрата получают из первой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую первый активный сайт или первый сайт связывания субстрата, при этом описываемый способ включает в себя (a) получение первой нуклеиновой кислоты, кодирующей первый активный сайт или первый сайт связывания субстрата, при этом первая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислоту согласно изобретению; (b) получение набора мутагенных олигонуклеотидов, которые кодируют встречающиеся в природе варианты аминокислот в нескольких целевых кодонах в первой нуклеиновой кислоте; и (c) использование набора мутагенных олигонуклеотидов для получения набора вариантов нуклеиновых кислот, кодирующих активный сайт или кодирующих сайт связывания субстрата, которые кодируют ряд вариантов аминокислот в каждом кодоне для аминокислоты, который подвергали мутагенезу, благодаря чему создают библиотеку нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных сайтов фосфолипазы и сайтов связывания субстрата. В альтернативных аспектах данный способ включает в себя мутагенез первой нуклеиновой кислоты со стадии (a) способом, включающим в себя систему оптимизи- 15015591 рованной направленной эволюции, генный мутагенез по механизму насыщения сайтов (GSSM) и вторичную сборку по механизму синтеза с использованием лигирования (SLR). Указанный способ может также включать в себя мутагенез первой нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (a), или ее вариантов способом, включающим в себя склонную к ошибкам ПЦР, перетасовку, направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, сборку с использованием ПЦР, мутагенез с использованием ПЦР,имитирующей генетическую рекомбинацию при половом процессе (половая ПЦР), мутагенез in vivo,кассетный мутагенез, множественный мутагенез, регулируемый по типу обратной связи, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфичный мутагенез, вторичную сборку генов, генный мутагенез по механизму насыщения генных сайтов (GSSM), вторичную сборку по механизму синтеза с использованием лигирования (SLR) и их сочетание. Указанный способ может дополнительно включать в себя мутагенез первой нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (a), или ее вариантов способом, включающим в себя рекомбинацию, рекомбинацию последовательностей, регулируемую по типу обратной связи, мутагенез ДНК, модифицированной фосфотиоатом, мутагенез с использованием урацилсодержащей матрицы, мутагенез с использованием дуплекса с пробелами, мутагенез по механизму точечного ошибочного спаривания при репарации, мутагенез, связанный с недостаточностью функционирования системы репарации в хозяйском штамме, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, делеционный мутагенез, мутагенез на основе системы рестрикции-селекции, мутагенез на основе системы рестрикцииочистки, синтез искусственного гена, множественный мутагенез, создание мультимера химерной молекулы нуклеиновой кислоты и их сочетание. Настоящее изобретение относится к способам получения малой молекулы, включающим в себя стадии (a) получения набора биосинтетических ферментов, способных осуществлять синтез или модификацию малой молекулы, при этом один из ферментов включает в себя фермент фосфолипазу, кодируемую нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получения субстрата по меньшей мере для одного фермента со стадии (a) и (c) осуществления взаимодействия субстрата со стадии (b) с ферментами, в условиях, которые способствуют осуществлению множества биокаталитических реакций, с образованием малой молекулы в результате серии биокаталитических реакций. Настоящее изобретение относится к способам модификации малой молекулы, включающим в себя стадии (a) получения фермента фосфолипазы, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получения малой молекулы и (c) осуществления взаимодействия фермента, полученного на стадии (a), с малой молекулой, полученной на стадии (b), в условиях, способствующих протеканию ферментативной реакции, катализируемой ферментом фосфолипазой, что приводит к модификации малой молекулы за счет ферментативной реакции под действием фосфолипазы. В одном аспекте способ включает в себя получение множества малых молекул в качестве субстратов для фермента со стадии (a), за счет чего достигается создание библиотеки модифицированных малых молекул, образуемых в результате по меньшей мере одной ферментативной реакции, катализируемой фосфолипазой. В одном аспекте способ также включает в себя использование набора дополнительных ферментов в условиях, которые способствуют протеканию множества биокаталитических реакций с участием ферментов, с получением библиотеки модифицированных малых молекул, образуемых в результате множества ферментативных реакций. В одном аспекте данный способ дополнительно включает в себя стадию тестирования библиотеки с целью определения того, присутствует ли в данной библиотеке конкретная модифицированная малая молекула, которая проявляет требуемую активность. Стадия тестирования библиотеки также может дополнительно включать в себя стадии систематического исключения всех, кроме одной, биокаталитических реакций, используемых для получения части из множества модифицированных малых молекул в данной библиотеке, посредством тестирования части модифицированных малых молекул в отношении наличия или отсутствия конкретной модифицированной малой молекулы с требуемой активностью и идентификации по меньшей мере одной конкретной биокаталитической реакции, которая создает конкретную модифицированную малую молекулу с требуемой активностью. Настоящее изобретение относится к способам определения функционального фрагмента фермента фосфолипазы, включающим в себя стадии (a) получения фермента фосфолипазы, содержащего аминокислотную последовательность согласно изобретению, и (b) делетирования множества аминокислотных остатков из последовательности, полученной на стадии (a), и тестирование оставшейся подпоследовательности в отношении фосфолипазной активности, за счет чего достигается определение функционального фрагмента фермента фосфолипазы. В одном аспекте фосфолипазную активность измеряют с помощью субстрата фосфолипазы и выявления повышения количества субстрата или снижения количества продукта реакции. В одном аспекте снижение количества субстрата фермента или повышение количества продукта реакции в присутствии тестируемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции в отсутствие тестируемого соединения позволяет идентифицировать тестируемое соединение как активатор фосфолипазной активности. Настоящее изобретение относится к способам расщепления сложноэфирной связи глицерофосфата,включающим в себя следующие стадии: (a) получение полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, при этом указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно изобретению, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получе- 16015591 ние композиции, содержащей сложноэфирную связь глицерофосфата; и (c) осуществление контакта полипептида со стадии (a) с композицией со стадии (b), в условиях, при которых полипептид расщепляет сложноэфирную связь глицерофосфата. В одном аспекте указанные условия включают в себя значенияpH примерно от pH 5 до примерно 8,5 или примерно от pH 4,5 (или более кислых, т.е. pH4,5) до примерно 9,0 (или более щелочных (т.е. pH9. В одном аспекте условия включают в себя температуру в диапазоне примерно от 40 до примерно 70C. В одном аспекте композиция включает в себя растительное масло. В одном аспекте композиция включает в себя фосфолипид из семян масличных культур. В одном аспекте реакция расщепления может приводить к образованию экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида. В настоящем изобретении предлагаются способы гидролиза, расщепления или разрушения содержащей фосфолипиды композиции, включающие в себя получение по меньшей мере одного полипептида согласно изобретению, обладающего фосфолипазной активностью, или полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, кодируемого по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой согласно изобретению; получение композиции, содержащей фосфолипид; и осуществление контакта полипептида с композицией в условиях, при которых фосфолипаза гидролизует, расщепляет или разрушает содержащую фосфолипид композицию. В одном аспекте способ включает в себя применение перемешивания на мешалке с большими сдвиговыми усилиями с последующим перемешиванием с низкими сдвиговыми усилиями или без сдвиговых усилий композиции вместе по меньшей мере с одним полипептидом согласно изобретению, обладающим фосфолипазной активностью, чтобы обеспечить возможность соответствующего "контактирования" фосфолипидного субстрата с фосфолипазой. По меньшей мере один полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, также может присутствовать на стадии смешивания с большими сдвиговыми усилиями. Способ может быть осуществлен на практике в любом масштабе, например в масштабе примерно от 1 грамма (г) до примерно 500, 1000, 2000, 2500, 5000 г или более, или в любом количестве в данном диапазоне. В настоящем изобретении предлагаются способы дегуммирования масла, включающие в себя следующие стадии: (a) получение по меньшей мере одного полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, при этом указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно изобретению, или полипептид кодируется нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, содержащей растительное масло; и (c) осуществление контакта полипептида со стадии (a) с растительным маслом со стадии (b), в условиях, при которых полипептид может расщеплять сложноэфирные связи в растительном масле, благодаря чему осуществляют дегуммирование масла. В одном аспекте растительное масло представляет собой масло из семян масличных культур. Растительное масло может представлять собой масло из рисовых отрубей, пальмовое масло, рапсовое масло, кукурузное масло, соевое масло, масло канолы, кунжутное масло, арахисовое масло или подсолнечное масло. В одном аспекте способ дополнительно включает в себя добавление фосфолипазы согласно изобретению, другой фосфолипазы или их сочетания. В одном аспекте в способе добавляют более одного полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, при этом по меньшей мере один полипептид является ферментом согласно изобретению. В одном аспекте ферменты добавляют в определенном порядке, например в определенном порядке добавляют PLC с разными специфичностями, например, сначала добавляют фермент с активностью PC и PE (или вместе добавляют два фермента, один с активностью PC, а другой с активностью РЕ), затем добавляют фермент с активностью PI-PLC или любое их сочетание. В одном аспекте способа дегуммирования масла композиция, содержащая масло, содержит полученное из растения, животного, водоросли или рыбы масло или жир. Растительное масло может представлять собой масло из рисовых отрубей, соевое масло, рапсовое масло, кукурузное масло или масло из пальмовых косточек, масло канолы, подсолнечное масло, кунжутное масло или арахисовое масло. Полипептид может гидролизовать фосфатид в гидратируемом и/или негидратируемом фосфолипиде в композиции, содержащей масло. В одном аспекте полипептид может гидролизовать фосфатид по глицерилфосфоэфирной связи с образованием диглицерида и водорастворимого фосфатного соединения. В одном аспекте полипептид может обладать активностью фосфолипазы C. В одном аспекте полипептид представляет собой фосфолипазу D, а также добавляют фермент фосфатазу. В одном аспекте способа дегуммирования масла контактирование приводит к гидролизу гидратированного фосфолипида в масле. Условия гидролиза могут включать в себя щелочные условия, например, в одном аспекте условия включают в себя температуру в диапазоне примерно от 20 до 40C при щелочном значении рН. Щелочные условия могут включать в себя значение pH примерно от pH 8 до 10 или выше. Условия гидролиза могут быть сделаны щелочными в любое время в ходе процесса, например, в одном аспекте фосфолипазу, такую как PLC, добавляют до того, как условия становятся щелочными (например,"нейтрализация каустическим средством" масла, содержащего кислоту, такую как фосфатидная кислота). В одном аспекте способа дегуммирования масла основание вызывает изомеризацию 1,2-DAG, образуемого с помощью PLC, с образованием 1,3-DAG, который является более полезным для здоровья с пищевой точки зрения по сравнению с 1,2-DAG, например 1,3-DAG сжигается, давая энергию, а не хранится в виде жира (как 1,2-DAG). Таким образом, в настоящем изобретении предлагается способ щелоч- 17015591 ного рафинирования масла, при котором фосфолипазу, например, фермент согласно изобретению, включая PLC, добавляют "в начале процесса", т.е. перед добавлением какой-либо кислоты и каустического средства, например, как показано в примерном способе, изображенном на фиг. 13. Одним из последствий добавления PLC в начале процесса щелочного рафинирования согласно изобретению (смотри дополнительное обсуждение ниже) и добавления кислоты и каустического средства после добавления PLC является образование повышенного уровня 1,3-DAG (а не 1,2-DAG). Это может быть следствием катализируемой кислотой или основанием миграции ацила. С точки зрения питания 1,3-DAG лучше, чем 1,2DAG. Таким образом, изобретение включает в себя способ дегуммирования масла с использованием PLC согласно изобретению, при этом конечный продукт в виде очищенного от смол масла содержит не менее чем примерно 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 или 5,0% 1,3-DAG. В одном аспекте способа дегуммирования масла условия гидролиза могут включать в себя время реакции примерно от 3 до 10 или более минут. Условия гидролиза могут включать в себя гидролиз гидратируемых и негидратируемых фосфолипидов в масле при температуре примерно от 50 до 60C, при pH примерно от pH 5 до 6,5, или от pH 5 до 7,5, или от pH 5 до 8,0, с использованием времени реакции примерно от 30 до 60 мин. В одном аспекте способа дегуммирования масла полипептид связывают с фильтром и содержащий фосфолипид жир или масло пропускают через фильтр. Полипептид может быть добавлен к раствору,содержащему фосфолипидсодержащий жир или масло, и затем раствор пропускают через фильтр. В одном аспекте способ дегуммирования масла дополнительно включает в себя физическое удаление смолы, образуемой в процессе дегуммирования, посредством добавления отверждающего вещества,например талька или эквивалента. В одном аспекте это увеличивает извлечение масла. В изобретении также предлагаются способы превращения негидратируемого фосфолипида в гидратируемую форму, включающие в себя следующие стадии: (a) получение полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, при этом указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность согласно изобретению, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, содержащей негидратируемый фосфолипид; и (c) осуществление контакта полипептида со стадии (a) с негидратируемым фосфолипидом со стадии (b), в условиях, при которых полипептид может расщеплять сложноэфирные связи в негидратируемом фосфолипиде, за счет чего достигается превращение негидратируемого фосфолипида в гидратируемую форму. Настоящее изобретение относится к способам дегуммирования масла, включающим в себя следующие стадии: (a) получение композиции, содержащей полипептид согласно изобретению, обладающий фосфолипазной активностью, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, включающей в себя жир или масло, содержащие фосфолипид; и (c) осуществление контакта полипептида со стадии (a) и композиции со стадии (b) в условиях, при которых полипептид может осуществлять дегуммирование фосфолипидсодержащей композиции (в условиях, при которых полипептид согласно изобретению может катализировать гидролиз фосфолипида). В одном аспекте содержащая масло композиция включает в себя растительное, животное масло,масло из водорослей или рыбий жир. Растительное масло может представлять собой масло из рисовых отрубей, соевое масло, рапсовое масло, кукурузное масло, масло из пальмовых косточек, масло канолы,подсолнечное масло, кунжутное масло или арахисовое масло. Полипептид может гидролизовать фосфатид в гидратируемом и/или негидратируемом фосфолипиде в композиции, содержащей масло. Полипептид может гидролизовать фосфатид по глицерилфосфоэфирной связи с образованием диглицерида и водорастворимого фосфатного соединения. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы C, B, A или D. В одном аспекте добавляют активность фосфолипазы D и фермент фосфатазу. Контактирование может приводить к гидролизу гидратированного фосфолипида в масле. Условия гидролиза могут включать в себя температуру в диапазоне примерно от 20 до 40C при щелочном значении pH. Щелочные условия могут включать в себя значение pH примерно от pH 8 до 10. Условия гидролиза могут включать в себя время реакции примерно от 3 до 10 мин. Условия гидролиза могут включать в себя гидролиз гидратируемых и негидратируемых фосфолипидов в масле при температуре примерно 50-60C при pH примерно от pH 5 до 6,5 с использованием времени реакции примерно от 30 до 60 мин. Полипептид может быть связан с фильтром, и содержащий фосфолипид жир или масло пропускают через фильтр. Полипептид может быть добавлен к раствору, содержащему фосфолипидсодержащий жир или масло, и затем раствор пропускают через фильтр. Настоящее изобретение относится к способам превращения негидратируемого фосфолипида в гидратируемую форму, включающим в себя следующие стадии:(a) получение композиции, содержащей полипептид, обладающий фосфолипазной активностью согласно изобретению, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, включающей в себя негидратируемый фосфолипид; и (c) осуществление контакта полипептида со стадии (a) и композиции со стадии (b) в условиях, при которых полипептид превращает негидратируемый фосфолипид в его гидратируемую форму. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы C. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы D, и при этом также может- 18015591 быть добавлен фермент фосфатаза. Настоящее изобретение относится к способам каустического рафинирования фосфолипидсодержащей композиции, включающим в себя следующие стадии: (a) получение композиции, содержащей фосфолипазу, которая может представлять собой полипептид согласно изобретению, обладающий фосфолипазной активностью, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, содержащей фосфолипид; и (c) осуществление контакта полипептида со стадии(a) и композиции со стадии (b) до, во время или после рафинирования каустическим средством. Полипептид может обладать фосфолипазной активностью, например активностью PLC, PLB, PLD и/или PLA. Полипептид может быть добавлен до рафинирования каустическим средством, т.е. "в начале" процесса перед добавлением кислоты или каустического средства, как показано на фиг. 13. Полипептид (который может представлять собой фермент, например PLC, согласно изобретению) может быть добавлен во время каустического рафинирования, и могут быть добавлены различные уровни кислоты и каустического средства в зависимости от уровней фосфора и уровней свободных жирных кислот. Полипептид (который может представлять собой фермент согласно изобретению) может быть добавлен перед рафинированием каустическим средством или после рафинирования каустическим средством: в смеситель с интенсивным перемешиванием или в смеситель для непрерывного смешивания жидких потоков; после стадии нагревания; в центрифугу, соапсток; промывную воду и/или на стадии обесцвечивания или дезодорации. Способ может включать в себя применение концентрированных растворов каустического средства, например более концентрированных, чем промышленный стандарт 11%,чтобы уменьшить массу смолы. В альтернативных аспектах концентрированный раствор каустического средства имеет концентрацию примерно от 12 до 50%, например примерно 20, 30, 40, 50 или 60%, или более концентрированный. Композиция, содержащая фосфолипид, может представлять собой растение. Полипептид может быть экспрессирован трансгенно в растении. Полипептид, обладающий фосфолипазной активностью,может быть добавлен во время дробления семени или другой части растения, или полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, добавляют после разрушения или перед очисткой. Также предлагается способ каустического рафинирования для гидролиза фосфолипидов в масле(например, растительном масле) с использованием полипептида согласно изобретению с образованием диацилглицерина (DAG) и водорастворимого сложного фосфатного эфира. В одном аспекте фермент согласно изобретению должен работать в способе рафинирования каустическим средством, включая,необязательно, низкое содержание воды и/или диапазон температур примерно от 55 до примерно 70C. Применение способа каустического рафинирования при низким содержанием воды в таком диапазоне температуры будет максимизировать выход за счет увеличения DAG и уменьшения уносимого масла. В одном аспекте фермент, используемый в данном способе каустического рафинирования согласно изобретению, имеет очень хорошую активность по отношению к фосфатидилхолину (PC) и фосфатидилэтаноламину (PE), является активным в диапазоне pH примерно от pH 6 до 9, является активным вплоть до 75C и является активным при низком содержании воды; в масле, например, примерно от 2 до 5% воды,например, представляет собой фермент, кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 177 или SEQ IDNO: 178, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R,D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N,D171V, D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R. В другом аспекте изобретения в способе каустического рафинирования для гидролиза фосфолипидов в масле используют два фермента: PI-специфичную PLC (гидролизует PI) и PC-PLC, которая гидролизует PC, PE и PA. Такой вариант позволяет получать масло, подходящее для химического или физического рафинирования, и максимизирует повышение выхода DAG и уменьшение уносимого масла. Настоящее изобретение относится к способам очистки фитостерина или тритерпена, включающим в себя следующие стадии: (a) получение композиции, содержащей полипептид согласно изобретению, обладающий фосфолипазной активностью, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, содержащей фитостерин или тритерпен; и (c) осуществление контакта полипептида со стадии (a) и композиции со стадии (b) в условиях, при которых полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы C. Фитостерин или тритерпен может включать в себя растительный стерин. Растительный стерин может быть получен из растительного масла. Растительное масло может представлять собой масло из рисовых отрубей, кокосовое масло, масло канолы, масло какао, кукурузное масло, хлопковое масло, льняное масло, оливковое масло, пальмовое масло, арахисовое масло, масло, полученное из рисовых отрубей, сафлоровое масло, кунжутное масло, соевое масло или подсолнечное масло. Данный способ может включать в себя использование неполярных растворителей для количественной экстракции свободных фитостеринов и сложных эфиров фитостеринов и жирных кислот. Фитостерин или тритерпен могут включать -ситостерин, кампестерин, стигмастерин, стигмастанол, -ситостанол, ситостанол, десмостерин, халинастерин, пориферастерин, клионастерин или брассикостерин. В настоящем изобретении предлагаются способы рафинирования неочищенного масла, включаю- 19015591 щие в себя следующие стадии: (a) получение композиции, содержащей полипептид согласно изобретению, обладающий фосфолипазной активностью, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, включающей в себя масло, содержащее фосфолипид; и (c) осуществление контакта полипептида, полученного на стадии (a), и композиции, полученной на стадии (b), в условиях, при которых полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы C. Полипептид может проявлять активность фосфолипазы в водном растворе, добавляемом в композицию. Уровень воды может составлять примерно от 0,5 до 5%. Время обработки может составлять менее чем примерно 2 ч, менее чем примерно 60 мин, менее чем примерно 30 мин, менее чем примерно 15 мин или менее чем примерно 5 мин. Условия гидролиза могут включать в себя температуру в диапазоне примерно 25-70C. Условия гидролиза могут включать в себя использование каустического средства. Можно использовать концентрированные растворы каустического средства, например более концентрированные, чем промышленный стандарт 11%, чтобы уменьшить массу смолы. В альтернативных аспектах концентрированный раствор каустического средства имеет концентрацию примерно от 12 до 50%, например примерно 20, 30, 40, 50 или 60%,или более концентрированный. Условия гидролиза могут включать в себя значения pH в диапазоне примерно от pH 3 до 10, примерно от pH 4 до 9, примерно от pH 5 до 8. Условия гидролиза могут включать в себя добавление эмульгаторов и/или перемешивание после контактирования на стадии (c). Способы могут включать в себя добавление деэмульгатора и/или нагревание или охлаждение (например, примерно от 4C до примерно-20C или ниже), чтобы ускорить отделение водной фазы. Способы могут включать в себя дегуммирование перед стадией контактирования, чтобы собрать лецитин с помощью центрифугирования, и затем добавление PLC, PLC и/или PLA, чтобы удалить негидратируемые фосфолипиды. Способы могут включать в себя дегуммирование неочищенного масла с помощью воды до содержания фосфора менее 10 ч./млн для пищевых масел и последующее физическое рафинирование до содержания фосфора менее чем 50 ч./млн для биодизельных масел. Способы могут включать в себя добавление кислоты для стимулирования гидратации негидратируемых фосфолипидов. В одном аспекте добавление кислоты стимулирует снижение содержания металлов кальция и магния. В настоящем изобретении предлагается способ ослабления, лечения или профилактики опосредованной липополисахаридами (ЛПС) токсичности, включающий в себя введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей полипептид согласно изобретению. В изобретении предлагается способ детоксикации эндотоксина, включающий в себя осуществление контакта эндотоксина с полипептидом согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагается способ деацилирования 2'- или 3'-цепи жирных кислот липида A, включающий в себя осуществление контакта липида A с полипептидом согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к применениям полипептида согласно изобретению для производства фармацевтической композиции, например, для производства фармацевтической композиции для профилактики, лечения или ослабления опосредованной липополисахаридами (ЛПС) токсичности или для детоксикации эндотоксина, или деацилирования 2'- или 3'-цепи жирных кислот липида A. В настоящем изобретении предлагаются способы детоксикации эндотоксина, включающие в себя осуществление контакта эндотоксина с полипептидом согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагается способ очистки смазочных веществ, включающий в себя следующие стадии: (a) получение композиции, содержащей фермент согласно изобретению; (b) получение смазочного вещества и (c) обработка смазочного вещества ферментом в условиях, при которых фермент может избирательно гидролизовать масла в смазочном веществе, таким образом очищая его. Смазочным веществом может быть смазочное масло для гидравлических систем. В настоящем изобретении предлагается способ обработки ткани, включающий в себя следующие стадии: (a) получение композиции, содержащей фермент согласно изобретению, (b) получение ткани и(c) обработка ткани ферментом. Обработка ткани может включать в себя улучшение качества на ощупь и драпировки конечной ткани, окраски, получения негорючих тканей, получения водоотталкивающих свойств, получения видимого блеска или отделки смолой. Ткань может содержать хлопок, вискозу, искусственный шелк, волокна лиоцель из эвкалипта, лен, волокна рами, все их смеси или их смеси с полиэфирными волокнами, шерсть, полиамиды, акриловые волокна или полиакриловые волокна. В настоящем изобретении предлагается ткань, пряжа или волокно, содержащие фермент согласно изобретению. Фермент может быть адсорбирован, абсорбирован или иммобилизован на поверхности ткани, пряжи или волокна. В настоящем изобретении предлагаются способы экспрессии фосфолипазы C, включающие в себя получение штамма Pichia с фенотипом Mut+; встраивание гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующей фосфолипазу C, в штамм Pichia и культивирование штамма Pichia в условиях, при которых экспрессируется фосфолипаза C. Способ также может включать в себя добавление в среду культивирования цинка. Изобретение также относится к клеточным системам, изолированным клеткам и линиям клеток для экспрессии фосфолипазы C, включая штамм Pichia, имеющий фенотип Mut+, содержащий гетероло- 20015591 гичную нуклеиновую кислоту, кодирующую фосфолипазу C, оперативно связанную с промотором, работающим в штамме Pichia. В настоящем изобретении предлагаются системы резистентных к зеоцину дрожжевых клеток (например, дрожжевых клеток, линий клеток, отдельных клеток) для экспрессии гетерологичного белка,включающие в себя стадии получения клетки Pichia sp. (например, P. pastoris), содержащей гетерологичную нуклеиновую кислоту, способную экспрессировать гетерологичный белок; культивирования клетки в условиях, включающих присутствие зеоцина в начальной концентрации; отбора клеток, резистентных к начальной концентрации зеоцина, и повторного культивирования в условиях, включающих в себя более высокую концентрацию зеоцина; и отбора клеток, культивируемых на стадии (c), резистентных к более высокой концентрации зеоцина. В одном аспекте гетерологичный белок представляет собой фермент или необязательно фосфолипазу, или необязательно фосфолипазу C (PLC), например любой фермент согласно изобретению. В настоящем изобретении предлагаются способы получения биотоплива, включающие в себя: (A)(a) получение фермента фосфолипазы согласно изобретению или фермента фосфолипазы, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) согласно изобретению, или фермента фосфолипазы, полученного способом согласно настоящему изобретению; (b) получение композиции биомассы, содержащей липид или сложный алкиловый эфир; (c) осуществление контакта фермента фосфолипазы по п.(a) с композицией биомассы по п.(b), чтобы образовать биотопливо или переэтерифицировать липид или сложный алкиловый эфир; (B) способ (A), в котором биотопливо представляет собой или содержит биодизельное топливо; (C) способ (A) или (B), в котором композиция биомассы, содержащей липид или сложный алкиловый эфир, представляет собой или содержит растительное масло и/или животный жир; (D) любой из способов (A)-(C), в котором композиция биомассы, содержащей липид или сложный алкиловый эфир, представляет собой или содержит водоросли, растительное масло, натуральное растительное масло, растительное масло первого отжима, отработанное растительное масло, животный жир, топленое сало, сало, лярд или желтый жир; или (E) любой из способов (A)-(D), в котором фермент фосфолипаза представляет собой или содержит полипептид, имеющий последовательность, которая указана в любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 178 или любом их сочетании. В настоящем изобретении предлагается биотопливо: (a) полученное способом по п.68, (b) содержащее (i) фермент фосфолипазы согласно изобретению или фермент фосфолипазы, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) согласно изобретению, или фермент фосфолипазы,полученный способом согласно настоящему изобретению. В настоящем изобретении предлагается сухой экстракт барды (DDS), сухая гранулированная барда(DDS), конденсированный экстракт барды (CDS), влажная гранулированная барда (DWG) или сухая гранулированная барда с растворимыми компонентами (DDGS), содержащими: (i) фермент фосфолипазу,имеющую последовательность, которая указана в любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-SEQ IDNO: 178 или любом их сочетании, или (ii) фермент фосфолипазу согласно изобретению, или фермент фосфолипазу, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) согласно изобретению, или фермент фосфолипазу, полученную способом согласно настоящему изобретению. В настоящем изобретении предлагается биомасса, содержащая: (a) (i) фермент фосфолипазу,имеющую последовательность, которая указана в любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-SEQ IDNO: 178 или любое их сочетание, или (ii) фермент фосфолипазу согласно изобретению, или фермент фосфолипазу, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) согласно изобретению, или фермент фосфолипазу, полученную способом согласно настоящему изобретению; или(b) биомассу по п.(a), при этом биомасса представляет собой или содержит биоэтанол, биопропанол, биобутанол, биопропанол или биометанол или любое их сочетение. В настоящем изобретении предлагается основанный на нефти продукт, содержащий: (a) (i) фермент фосфолипазу, имеющую последовательность, которая указана в любой из последовательностей SEQ IDNO: 1-SEQ ID NO: 178 или любое их сочетание, или (ii) фермент фосфолипазу согласно изобретению,или фермент фосфолипазу, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты (полинуклеотидом) согласно изобретению, или фермент фосфолипазу, полученный способом согласно настоящему изобретению; или (b) основанный на нефти продукт по п.(a), содержащий масло, биодизельное топливо или бензин, или биоэтанол, биопропанол, биобутанол, биопропанол или биометанол; или смесь биоэтанола,биопропанола, биобутанола, биопропанола, биометанола и/или биодизельного топлива и бензина. Подробное раскрытие одного или нескольких вариантов осуществления изобретения приведено на прилагаемых чертежах и в описании ниже. Другие признаки, объекты и преимущества изобретения будут понятны из описания и чертежей, и из формулы изобретения. Все публикации, патенты, патентные заявки, последовательности из GenBank и депозиты АТСС,упоминаемые в настоящем описании, включены в него в виде ссылок для всех целей. Краткое описание чертежей Приведенные чертежи являются иллюстративными для пояснения вариантов осуществления изобретения и не рассматриваются как ограничивающие объем настоящего изобретения, охватываемый прилагаемой формулой изобретения.- 21015591 Фиг. 1 представляет собой блок-схему компьютерной системы, подробно описанной ниже. Фиг. 2 представляет собой график последовательности технологических операций, иллюстрирующий один аспект способа 200 для сравнения новой нуклеотидной или белковой последовательности с последовательностями в базе данных для определения уровней гомологии между новой последовательностью и последовательностями из базы данных, как подробно описано ниже. Фиг. 3 представляет собой график последовательности технологических операций, иллюстрирующий один процесс, протекающий в компьютере, для определения того, являются ли две последовательности гомологичными, как подробно описано ниже. Фиг. 4 представляет собой график последовательности технологических операций, иллюстрирующий один аспект работы идентификатора для выявления наличия данного характерного признака в последовательности, как подробно описано ниже. На фиг. 5A-5C приведена схематичная иллюстрация модельной двухфазной системы, моделирующей опосредованное PLC дегуммирование, которое подробно описано ниже в примере 2. Фиг. 6 схематично иллюстрирует типичный способ рафинирования растительного масла с использованием фосфолипаз согласно изобретению. Фиг. 7 схематично иллюстрирует типичный способ дегуммирования согласно изобретению для физически очищенных масел, который подробно обсуждается ниже. Фиг. 8 схематично иллюстрирует гидролиз фосфатидов с использованием фосфолипазы C согласно изобретению, который подробно обсуждается ниже. Фиг. 9 схематично иллюстрирует типичный способ каустического рафинирования согласно изобретению и иллюстрирует альтернативный вариант, включающий в себя применение фосфолипазы C согласно изобретению в качестве "добавки при каустическом рафинировании" (каустическое рафинирование с длительным перемешиванием), как подробно обсуждается ниже. Фиг. 10 схематично иллюстрирует применение фосфолипазы C согласно изобретению в качестве вспомогательного средства для дегуммирования, как подробно обсуждается ниже. Фиг. 11 представляет собой таблицу, описывающую выбранные характерные признаки приведенных в качестве примера нуклеиновых кислот и полипептидов согласно изобретению, которые подробно описаны ниже. Фиг. 12 схематично иллюстрирует данные, полученные в двух ферментных системах согласно изобретению, которые описаны в примере 3, ниже. Фиг. 13 схематично иллюстрирует примерный способ каустического рафинирования согласно изобретению и иллюстрирует альтернативный вариант, включающий в себя применение фосфолипазы C согласно изобретению в качестве "добавки при каустическом рафинировании" (каустическое рафинирование с длительным перемешиванием), который подробно обсуждается ниже. Фиг. 14 иллюстрирует другой вариант способов согласно изобретению, в таком способе используют две стадии центрифугирования, как подробно обсуждается ниже. Фиг. 15 иллюстрирует другой вариант способов согласно изобретению, в таком способе используют три стадии центрифугирования, как подробно обсуждается ниже. Фиг. 16 иллюстрирует другой примерный вариант данного способа с использованием обработки кислотой и наличием стадии центрифугирования перед стадией дегуммирования, как подробно обсуждается ниже. Фиг. 17 иллюстрирует результаты экспериментов по расщеплению in vitro, в которых используют варианты фосфолипазы C согласно изобретению, которые подробно обсуждаются в примере 4 ниже. Фиг. 18 иллюстрирует результаты культивирования в ферментере периодического действия с использованием фермента согласно изобретению, которые подробно обсуждаются в примере 5 ниже. Фиг. 19 иллюстрирует результаты сравнений скорости потребления кислорода ("OUR") культурами штаммов P. pastoris MutS согласно изобретению, как подробно обсуждается в примере 5 ниже. Фиг. 20 иллюстрирует сравнение профилей потребления метанола штаммами P. pastoris MutS согласно изобретению, как подробно обсуждается в примере 5 ниже. Фиг. 21 иллюстрирует профиль "OUR" культуры с рекомбинантной формой приведенного в качестве примера фермента PLC согласно изобретению, SEQ ID NO: 2, который подробно обсуждается в примере 5 ниже. Фиг. 22 иллюстрирует результаты анализа в SDS-ПААГ, показывающие качество белка PLC, продуцируемого в культуре, и соответствующий профиль OUR культуры с рекомбинантной формой приведенного в качестве примера фермента PLC согласно изобретению, SEQ ID NO: 2, которые подробно обсуждаются в примере 5 ниже. Фиг. 23 иллюстрирует результаты анализа в SDS-ПААГ, показывая количество активной PLC, локализованной внутриклеточно в культуре с рекомбинантной формой приведенного в качестве примера фермента PLC согласно изобретению, SEQ ID NO: 2, которые подробно обсуждаются в примере 5 ниже. Фиг. 24 иллюстрирует визуальный анализ морфологических изменений в дрожжевых клетках, связанных с активной PLC рекомбинантной формой приведенного в качестве примера фермента PLC согласно изобретению, SEQ ID NO:2, который подробно обсуждается в примере 5 ниже.- 22015591 На фиг. 25 графически суммированы данные, показывающее статус эффективности продукции PLC через 95 ч TFT (общее время ферментации) в Pichia, с использованием приведенного в качестве примера фермента PLC согласно изобретению, SEQ ID NO: 2, которые подробно обсуждаются в примере 5 ниже. Фиг. 26 представляет собой итоговую таблицу данных, полученных в результате скрининга экспрессии в колониях адаптированных к зеоцину клеток согласно изобретению, которые подробно обсуждаются в примере 5 ниже. Фиг. 27 иллюстрирует данные, показывающие, что уровни белка PLC были выше в культурах, содержащих колонии адаптированных к зеоцину клеток согласно изобретению, которые подробно обсуждаются в примере 5 ниже. Фиг. 28 иллюстрирует данные, показывающие сравнение роста адаптированных к зеоцину колоний согласно изобретению по сравнению с контролем, которые подробно обсуждаются в примере 5 ниже. Фиг. 29 иллюстрирует результаты эксперимента с нагреванием, показывающие термостабильность приведенного в качестве примера фермента согласно изобретению SEQ ID NO: 2, условия указаны на чертеже, и результаты подробно обсуждаются в примере 6 ниже. Фиг. 30 иллюстрирует суммарные данные ЯМР, полученные в эксперименте по нагреванию, показывающие термостабильность приведенного в качестве примера фермента согласно изобретению, SEQID NO: 2, которые подробно обсуждаются в примере 6 ниже. Фиг. 31-33 иллюстрируют данные, показывающие термостабильность последовательности SEQ IDNO: 2, полученные с использованием p-NPPC в условиях, указанных на чертеже, которые подробно обсуждаются в примере 6 ниже. Фиг. 34 иллюстрирует данные, показывающие термостабильность последовательности SEQ ID NO: 2, полученные с использованием анализа ДСК, которые подробно обсуждаются в примере 6 ниже. Фиг. 35 иллюстрирует массовую долю отдельных видов фосфолипидов (PL) (PA, PE, PI и PC) относительно общего PL, остающегося после обработки мутантной фосфолипазой согласно изобретению. Фиг. 36 иллюстрирует лучшие мутанты GSSM, выбранные для введения в библиотеку GeneReassembly, которые содержат типичные фосфолипазы согласно изобретению. Фиг. 37 иллюстрирует типичный способ получения спирта, который включает в себя применение ферментов согласно настоящему изобретению. Сходные символы на различных чертежах относятся к сходным элементам. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к фосфолипазам, например полипептидам, обладающим активностью фосфолипазы A, B, C, D, пататина, фосфатаз фосфатидной кислоты (PAP) и/или липидацилгидролазы (LAH) или эквивалентной активностью, к кодирующим их полинуклеотидам и способам их получения и применения. В настоящем изобретении предлагаются ферменты, которые эффективно расщепляют глицерофосфатную сложноэфирную связь в маслах, таких как растительные масла, например фосфолипиды семян масличных культур, с образованием экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида. В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению обладают активностью липидацилгидролазы (LAH). В альтернативных аспектах фосфолипазы согласно изобретению могут расщеплять глицерофосфатные сложноэфирные связи в фосфатидилхолине (PC), фосфатидилэтаноламине(PE), фосфатидилсерине (PS), фосфатидилинозитоле (PI), фосфатидной кислоте и/или сфингомиелине или их сочетании. Например, в одном аспекте фосфолипаза согласно изобретению является специфичной по отношению к одному или нескольким конкретным субстратам, например фермент согласно изобретению может обладать специфичностью действия по отношению к PE и PC; PE и PI; PE и PS; PS и РЕ; PS иPI; PI и PE; PS, PI и PC; PE, PI и PC или РЕ, PS, PI и PC. Фосфолипазу согласно изобретению (например, полипептиды, обладающие активностью фосфолипазы A, B, C, D, пататина, фосфатаз фосфатидной кислоты (PAP) и/или липидацилгидролазы (LAH) или эквивалентной активностью) можно применять для ферментативного дегуммирования растительных масел, так как остаток фосфата растворим в воде и его можно легко удалять. Диглицеридный продукт будет оставаться в масле и поэтому потери будут снижены. PLC согласно изобретению можно применять в дополнение или вместо PLA1 и PLA2 при коммерческом дегуммировании масла, например, в способеENZYMAX, в котором фосфолипиды гидролизуют, используя PLA1 и PLA2. В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению активны при высокой и/или при низкой температуре или в широком диапазоне температур, например, они могут быть активны при температурах в диапазоне от 20 до 90C, от 30 до 80C и от 40 до 70C. Настоящее изобретение также относится к фосфолипазам согласно изобретению, которые обладают активностью при щелочных pH или при кислых pH,например в слабокислой воде. В альтернативных аспектах фосфолипазы согласно изобретению могут обладать активностью при кислых pH, таких как pH 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0 и 3,5 или более кислые (т.е.pH 3,5). В альтернативных аспектах фосфолипазы согласно изобретению могут обладать активностью при щелочных pH, таких как pH 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10 или более щелочные (т.е. pH 10). В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению активны в диапазоне температур примерно от 40C до примерно 70, 75 или 80C или выше в условиях низкой активности воды (при низком содержании воды).- 23015591 Настоящее изобретение также относится к способам дополнительной модификации типичных фосфолипаз согласно изобретению с получением ферментов с желательными свойствами. Например, фосфолипазы, получаемые способами согласно изобретению, могут обладать измененными характеристиками,такими как субстратная специфичность, специфичность связывания субстрата, картины расщепления субстрата, термостабильность, профиль pH/активность, профиль pH/стабильность (например, повышенная стабильность при низких значениях pH, например при pH6 или pH5, или при высоких значенияхpH, например при pH9), стабильность к окислению, зависимость от Ca2+, удельная активность и т.п. Настоящее изобретение относится к изменению любого представляющего интерес свойства. Например,изменение может приводить к получению варианта, который в сравнении с исходной фосфолипазой обладает измененным профилем зависимости активности от pH и температуры. В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению можно применять на разных стадиях обработки растительного масла, таких как экстракция растительного масла, в частности удаление "фосфолипидных смол" в процессе, называемом "дегуммированием масла", который описан в настоящей публикации. Изобретение относится к композициям (например, содержащим ферменты согласно изобретению) и способам получения растительных масел из разных источников, например масло из рисовых отрубей,соевых бобов, рапса, арахиса, кунжута, подсолнечника и кукурузы. Фосфолипазные ферменты согласно изобретению можно применять вместо PLA, например фосфолипазы A2, на любой стадии обработки растительного масла. Термин "фосфолипаза" охватывает ферменты, обладающие любой фосфолипазной активностью,например расщепляющие сложноэфирную связь глицерофосфата (катализируя гидролиз сложноэфирной связи глицерофосфата), например, в масле, таком как растительное масло. Фосфолипазная активность согласно изобретению может приводить к образованию экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида. Фосфолипазная активность согласно изобретению включает в себя также гидролиз сложноэфирной связи глицерофосфата при высоких температурах, низких температурах, щелочных pH и кислых pH. Термин "фосфолипазная активность" также включает в себя расщепление глицерофосфатного сложного эфира с образованием экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида. Термин "фосфолипазная активность" также включает в себя разрыв сложноэфирных связей глицерина и фосфорной кислоты в фосфолипидах. Термин "фосфолипазная активность" также включает в себя другие виды активности, такие как способность связываться и гидролизовать субстрат, такой как масло, например растительное масло, субстрат также включает в себя фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилсерины и сфингомиелины из растений и животных. "Фосфолипазная активность" может также включать в себя активность фосфолипазы C (PLC), активность фосфолипазы A(PLA), такую как активность фосфолипазы A1 или фосфолипазы A2, активность фосфолипазы B (PLB),такую как активность фосфолипазы B1 или фосфолипазы B2, включая активность лизофосфолипазы(LPL) и/или активность лизофосфолипазы-трансацилазы (LPTA); активность фосфолипазы D (PLD), такую как активность фосфолипазы D1 или активность фосфолипазы D2; и/или активность пататина или любое их сочетание. "Фосфолипазная активность" может включать в себя гидролиз гликопротеида, например гликопротеида, обнаруженного в клубнях картофеля или любого растения рода Solanum, например Solanum tuberosum. Фосфолипазная активность может включать в себя ферментативную активность лататина, такую как эстеразная активность пататина (смотри, например, Jimenez (2002) Biotechnol. Prog.,18: 635-640). Фосфолипазная активность может включать в себя активность липидацилгидролазы (LAH). Фосфолипазная активность может быть специфичной по отношению к одному или нескольким конкретным субстратам, например фермент согласно изобретению может обладать специфичностью действия по отношению к PE и PC; PE и PI; PE и PS; PS и PE; PS и PI; PI и PE; PS, PI и PC; PE, PI и PC, или PE, PS, PI и PC, или любому их сочетанию. В одном аспекте фосфолипаза согласно изобретению может обладать многофункциональной активностью, например сочетанием одной или нескольких ферментативных активностей, описанных в настоящей публикации. Например, в одном аспекте полипептид согласно изобретению является ферментативно активным, но не имеет липазной активности или не обладает никакой ферментативной активностью, которая влияет на нейтральную фракцию масла (триглицерид). Может быть желательным применение такого полипептида в конкретном способе, например в способе дегуммирования, когда важно,чтобы нейтральная фракция масла не повреждалась (не уменьшалась, не разрушалась, например, не гидролизовалась). Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ дегуммирования, включающий в себя применение полипептида согласно изобретению, обладающего фосфолипазной активностью, но не имеющего липазной активности. В одном аспекте фосфолипазы PLC согласно изобретению используют (например, катализируют гидролиз) множество фосфолипидных субстратов, включая фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламин (PE), фосфатидилсерин (PS), фосфатидилинозитол (PI) и/или фосфатидную кислоту или их сочетание. Кроме того, такие ферменты могут обладать различной степенью активности на лизофосфолипидных формах указанных фосфолипидов. В различных аспектах ферменты PLC согласно изобретению могут проявлять предпочтение по отношению к фосфатидилхолину и фосфатидилэтаноламину в качестве субстратов.- 24015591 В одном аспекте фосфолипазы PLC фосфатидилинозитола согласно изобретению используют несколько фосфолипидных субстратов, включая фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и фосфатидную кислоту или их сочетание. Кроме того, указанные ферменты могут обладать различной степенью активности на лизофосфолипидных формах указанных фосфолипидов. В различных аспектах ферменты PLC фосфатидилинозитола согласно изобретению могут проявлять предпочтение по отношению к фосфатидилинозитолу в качестве субстрата. В одном аспекте пататиновые ферменты согласно изобретению используют несколько фосфолипидных субстратов, включая фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и фосфатидную кислоту или их сочетание. Кроме того, указанные ферменты могут обладать различной степенью активности на лизофосфолипидных формах указанных фосфолипидов. В различных аспектах пататины согласно изобретению основаны на сохранении сходства аминокислотных последовательностей. В различных аспектах указанные ферменты имеют разнообразный набор биохимических свойств и могут осуществлять реакции, характерные для классов ферментов PLA1, PLA2, PLC или PLD. В одном аспекте фосфолипазы PLD согласно изобретению используют несколько фосфолипидных субстратов, включая фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и фосфатидную кислоту или их сочетание. Кроме того, указанные ферменты могут обладать различной степенью активности на лизофосфолипидных формах таких фосфолипидов. В одном аспекте указанные ферменты применимы для осуществления реакции переэтерификации для получения структурированных фосфолипидов. Термины "матрица", или "микроматрица", или "биочип", или "чип" в используемом в настоящем описании смысле означают множество целевых элементов, где каждый целевой элемент включает в себя определенное количество одного или более полипептидов (включая антитела) или нуклеиновых кислот,иммобилизованных на определенной площади поверхности подложки, что подробно описано ниже. В используемом в настоящем описании смысле термины "компьютер", "компьютерная программа" и "процессор" используются в самом широком общем контексте и включают в себя все устройства такого рода, которые подробно описаны ниже. Термины "кодирующая последовательность" или "последовательность кодирует" конкретный полипептид или белок означают последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется и транслируется в полипептид или белок в том случае, если последовательность помещена под контроль соответствующих регуляторных последовательностей. Термин "экспрессирующая кассета" в используемом в настоящем описании смысле относится к нуклеотидной последовательности, которая способна воздействовать на экспрессию структурного гена(например, последовательности, кодирующей белок, такой как фосфолипаза согласно изобретению) в хозяине, совместимом с такими последовательностями. Экспрессирующие кассеты включают в себя, по меньшей мере, промотор, оперативно связанный с последовательностью, кодирующий полипептид; и необязательно с другими последовательностями, например сигналами терминации транскрипции. Могут также использоваться дополнительные факторы, необходимые или благоприятные в отношении воздействия на экспрессию, например энхансеры. Термин "оперативно связанный" в используемом в настоящем описании смысле относится к связи промотора выше последовательности ДНК, так что промотор опосредует транскрипцию последовательности ДНК. Таким образом, экспрессирующая кассета также включает в себя плазмиды, экспрессирующие векторы, рекомбинантные вирусы, любые формы вектора на основе рекомбинантной "голой" ДНК и т.п. Термин "вектор" включает в себя нуклеиновую кислоту,которая может инфицировать, трансфицировать или временно или постоянно трансдуцировать клетку. Известно, что вектор может представлять собой "голую" нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в составе комплекса с белком или липидом. Вектор необязательно включает в себя вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты, и/или белки, и/или мембраны (например, клеточные мембраны, липидную оболочку вируса и т.п.). Векторы включают в себя, без ограничения, репликоны (например,РНК-репликоны, бактериофаги), к которым могут быть присоединены фрагменты ДНК, которые при этом становятся реплицируемыми. Таким образом, векторы включают в себя, без ограничения, РНК, автономную самореплицирующуюся кольцевую или линейную ДНК или РНК (например, из плазмиды,вирусы и т.п., смотри, например, патент США 5217879) и охватывают как экспрессирующие плазмиды, так и неэкспрессирующие плазмиды. В том случае когда в качестве хозяина для "экспрессирующего вектора" описывают рекомбинантный микроорганизм или клеточную культуру, указанный термин включает в себя и внехромосомную кольцевую и линейную ДНК, и ДНК, которая была включена в хромосому(хромосомы) хозяина. В том случае, когда вектор поддерживается в клетке-хозяине, такой вектор может либо стабильно реплицироваться клетками во время митоза в виде автономной структуры, либо может быть включен в геном хозяина."Плазмиды" обозначают малой буквой "р", стоящей перед и/или после заглавных букв и/или номеров. Рассматриваемые в настоящем описании исходные плазмиды представляют собой либо коммерчески доступные, доступные широкому кругу людей без ограничений, либо могут быть сконструированы из доступных плазмид в соответствии с опубликованными методиками. Кроме того, плазмиды, эквивалентные плазмидам, описанным в настоящей публикации, известны специалистам в данной области.- 25015591 Термин "ген" означает участок ДНК, участвующий в образовании полипептидной цепи, включая, в том числе, области, предшествующие или следующие после кодирующей области, такие как лидерная последовательность, трейлер, промоторы и энхансеры, а также, где это приемлемо, промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими участками (экзонами). Фразы "нуклеиновая кислота" или "последовательность нуклеиновой кислоты" в используемом в настоящем описании смысле относятся к олигонуклеотиду, нуклеотиду, полинуклеотиду или к любому их фрагменту, к ДНК или РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК, iРНК) геномного происхождения или полученным в результате синтеза, которые могут быть однонитевыми или двунитевыми и могут представлять собой смысловую или антисмысловую цепь, к пептидонуклеиновой кислоте (ПНК) или любому ДНК-подобному или РНК-подобному веществу природного или синтетического происхождения, включая, например, iРНК, рибонуклеопротеиды (например, двунитевые iРНК, например, iРНП). Указанный термин включает в себя нуклеиновые кислоты, например олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. Термин также охватывает структуры, подобные нуклеиновым кислотам, с синтетическими остовами (смотри, например, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol., 144: 189-197;Strauss-Soukup (1997) Biochemistry, 36: 8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 6: 153-156). В используемом в настоящем описании смысле термины "аминокислота" или "аминокислотная последовательность" относятся к последовательности олигопептида, пептида, полипептида или белка или к их фрагменту, части или субъединице, в том числе к встречающимся в природе или синтетическим молекулам. Термины "полипептид" и "белок" в используемом в настоящем описании смысле относятся к аминокислотам, связанным друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, например пептидные изостеры, которые могут содержать модифицированные аминокислоты, отличные от 20 аминокислот, кодируемых генами. Термин "полипептид" также включает в себя пептиды и фрагменты, мотивы полипептидов и тому подобное. Термин также охватывает гликозилированные полипептиды. Пептиды и полипептиды согласно изобретению также включают в себя все формы "миметиков" и "пептидомиметиков", которые подробно описаны ниже. В используемом в настоящем описании смысле термин "изолированный" указывает на то, что материал был изъят из своего исходного окружения (например, из природного окружения, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом организме животного, не является изолированным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех присутствующих вместе с ним в природной системе веществ,является изолированным. Такие полинуклеотиды могут составлять часть вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут быть составной частью композиции и все же быть изолированными, так как такой вектор или композиция не являются частью их природного окружения. В используемом в настоящем описании смысле изолированный материал или композиция также может быть "очищенной" композицией, т.е. не требуется достижение абсолютной чистоты, скорее данный термин используется как относительное понятие. Отдельные нуклеиновые кислоты, получаемые из библиотеки, могут быть очищены традиционным способом до электрофоретической гомогенности. В альтернативных аспектах настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые были очищены из геномной ДНК или других последовательностей, имеющихся в библиотеке или другом окружении, с достижением по меньшей мере одного, двух, трех, четырех, пяти или более порядков чистоты. В используемом в настоящем описании смысле термин "рекомбинантный" означает, что нуклеиновая кислота граничит с "остовом" нуклеиновой кислоты, с которым она не соседствует в своем природном окружении. В одном аспекте нуклеиновые кислоты составляют 5% или более от количества вставок нуклеиновых кислот в популяции "молекул остова" нуклеиновой кислоты. "Молекулы остова" согласно изобретению включают в себя нуклеиновые кислоты, такие как экспрессирующие векторы, самореплицирующиеся нуклеиновые кислоты, вирусы, интегрирующиеся нуклеиновые кислоты и другие векторы или нуклеиновые кислоты, используемые для поддержания или обработки представляющих интерес вставок нуклеиновой кислоты. В одном аспекте обогащенные нуклеиновые кислоты составляют 15, 20,30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или более от количества вставок нуклеиновой кислоты в популяции рекомбинантных молекул остова. Термин "рекомбинантные" полипептиды или белки относится к полипептидам или белкам, получаемым с использованием технологии рекомбинантной ДНК, например получаемым из клеток, трансформированных конструкций экзогенной ДНК, кодирующей требуемый полипептид или белок. "Синтетические" полипептиды или белки представляют собой полипептиды или белки, полученные химическим синтезом, как подробно описано ниже. Промоторная последовательность "оперативно связана" с кодирующей последовательностью в том случае, когда РНК-полимераза, которая инициирует транскрипцию с промотора, будет траскрибировать кодирующую последовательность в мРНК, что подробно описано ниже. Термин "олигонуклеотид" относится либо к однонитевому полидезоксинуклеотиду, либо к двум комплементарным полидезоксинуклеотидным нитям, которые могут быть получены путем химического синтеза. Такие синтетические олигонуклеотиды не содержат 5'-фосфата и, следовательно, не будут лиги- 26015591 ровать с другим олигонуклеотидом без добавления фосфата из АТФ в присутствии киназы. Синтетический олигонуклеотид будет лигировать с фрагментом, который не был дефосфорилирован. Фраза "по существу, идентичные" в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидовотносится к двум или более последовательностям, которые имеют по меньшей мере 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90,95, 98 или 99% идентичность нуклеотидов или аминокислотных остатков (в последовательности) при сравнении и выравнивании с целью максимального соответствия, измеряемую с использованием любого известного алгоритма сравнения последовательностей, которые подробно обсуждаются ниже, или путем визуального просмотра. В альтернативных аспектах изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты и полипептида, имеющим существенную идентичность с приведенной в качестве примера последовательностью согласно изобретению, например последовательностью SEQ ID NO: 175 или SEQ ID NO: 176, имеющей одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y,E41R, E94R, D100L, D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W,E125K, S168N, D171V, D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K илиQ265R и т.д., на протяжении области, составляющей по меньшей мере примерно 100, 150, 200, 300,400 остатков или области в диапазоне примерно от 50 остатков до полной длины нуклеиновой кислоты или полипептида. Последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть, по существу, идентичными на протяжении всей длины области, кодирующей полипептид. Дополнительно, "по существу, идентичная" аминокислотная последовательность представляет собой последовательность, которая отличается от эталонной последовательности одной или более консервативными или неконсервативными заменами, делециями или вставками аминокислот, особенно если такая замена осуществляется в сайте, который не является активным центром молекулы, и при условии,что полипептид, по существу, сохраняет свои функциональные свойства. Консервативная аминокислотная замена включает в себя, например, замену одной аминокислоты другой аминокислотой того же класса (например, замену одной гидрофобной аминокислоты, такой как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другой гидрофобной аминокислотой, или замену одной полярной аминокислоты другой полярной аминокислотой, такую как замена лизина аргинином, аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой или аспарагина глутамином). Одна или более аминокислот могут быть делетированы, например, из полипептида фосфолипазы, что приводит к модификации структуры полипептида без существенного изменения его биологической активности. Например, могут быть удалены аминокислоты на амино- или на карбоксильном конце, которые не требуются для проявления биологической активности фосфолипазы. Модифицированные последовательности полипептидов согласно изобретению можно анализировать в отношении биологической активности фосфолипазы с использованием любого количества способов,включающих в себя осуществление контакта модифицированной последовательности полипептида с субстратом фосфолипазы и определение того, будет ли такой модифицированный полипептид снижать количество специфического субстрата в анализе или повышать количество биологических продуктов ферментативной реакции, осуществляемой функциональной фосфолипазой на данном субстрате, что подробно обсуждается ниже. Термин "гибридизация" относится к способу, с помощью которого цепь нуклеиновой кислоты связывают с комплементарной цепью посредством спаривания оснований. Реакции гибридизации могут быть чувствительными и избирательными, так что конкретная представляющая интерес последовательность может быть идентифицирована даже в образцах, в которых она присутствует в низких концентрациях. Могут быть заданы соответствующие жесткие условия, например, концентрациями соли или формамида в растворах, используемых перед гибридизацией или в процессе гибридизации, или температурой гибридизации, и такие условия хорошо известны специалистам в данной области. Например, жесткость может быть повышена за счет уменьшения концентрации соли, повышения концентрации формамида или повышения температуры гибридизации, изменения времени гибридизации, что подробно описано ниже. В альтернативных аспектах нуклеиновые кислоты согласно изобретению определяют по их способности гибридизоваться в условиях различной жесткости (например, в условиях высокой, умеренной и низкой жесткости), которые указаны в настоящем описании. Термин "вариант" относится к полинуклеотидам или полипептидам согласно изобретению, модифицированным по одному или более парам оснований, кодонам, интронам, экзонам или аминокислотным остаткам (соответственно), при сохранении биологической активности фосфолипазы согласно изобретению. Варианты могут быть получены любыми способами, включая такие способы, как, например,склонная к ошибкам ПЦР, перетасовка, направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов,сборка с использованием ПЦР, мутагенез с использованием ПЦР, имитирующей генетическую рекомбинацию при половом процессе (половая ПЦР), мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, множественный мутагенез, регулируемый по типу обратной связи, экспоненциальный множественный мутагенез, сайтспецифичный мутагенез, вторичная сборка генов, GSSM и их сочетание. Способы получения вариантов фосфолипаз, обладающих активностью, например, при значениях pH или температуры, которые отличаются от соответствующих параметров для фосфолипазы дикого типа, также включены в настоящее изобретение. Термин "насыщающий мутагенез" или генный мутагенез по механизму насыщения сайтов (GeneSite Saturation Mutagenesis (GSSM, или "GSSM", включает в себя способ, в котором используют вырожденные олигонуклеотидные праймеры для введения точечных мутаций в полинуклеотид, который подробно описан ниже. Термин "система оптимизированной направленной эволюции", или "оптимизированная направленная эволюция", включает в себя способ вторичной сборки фрагментов родственных последовательностей нуклеиновой кислоты, например родственных генов, что подробно описано ниже. Термин "вторичная сборка по механизму синтеза с использованием лигирования", или "SLR",включает в себя способ лигирования олигонуклеотидных фрагментов неслучайным образом, что подробно описано ниже. Получение нуклеиновых кислот и манипулирование ими Настоящее изобретение относится к изолированным и рекомбинантным нуклеиновым кислотам(например, к приведенным в качестве примера последовательностям SEQ ID NO: 177 или SEQ ID NO: 178, имеющим одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W, E41F, E41Y, E41R, E94R, D100L,D100M, D100Y, D100F, D100W, A104L, D111R, T112R, Y116W, I117W, P118W, E125K, S168N, D171V,D171E, M176W, D230H, D230R, D234W, D234V, D234G, D234R, D234K или Q265R, включая кассеты экспрессии, такие как экспрессирующие векторы, кодирующие полипептиды и фосфолипазы согласно изобретению. Изобретение также относится к способам выявления новых последовательностей фосфолипаз с использованием нуклеиновых кислот согласно изобретению. Также предлагаются способы модификации нуклеиновых кислот согласно изобретению, например посредством вторичной сборки посредством синтеза с использованием реакции лигирования, системы оптимизированной направленной эволюции и/или насыщающего мутагенеза. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть получены, выделены и/или использованы для манипуляций, например, путем клонирования и экспрессии библиотек кДНК, амплификации транскрипта или геномной ДНК посредством ПЦР и тому подобными способами. В практике осуществления способов посредством согласно изобретению гомологичные гены могут быть модифицированы посредством обработки матричной нуклеиновой кислоты, что подробно описано ниже. Изобретение может быть осуществлено на практике в сочетании с любым способом или протоколом или устройством, которые известны в данной области техники и хорошо описаны в научной и патентной литературе. Основные методики Нуклеиновые кислоты, используемые при практическом осуществлении настоящего изобретения,независимо от их природы: РНК, iРНК, антисмысловая нуклеиновая кислота, кДНК, геномная ДНК, векторы, вирусы или их гибриды, могут быть выделены из множества источников, получены генноинженерными способами, амплифицированы и/или экспрессированы/получены рекомбинантно. Рекомбинантные полипептиды, получаемые на основе таких нуклеиновых кислот, могут быть выделены отдельно или могут быть клонированы и проанализированы в отношении требуемой активности. Может быть использована любая рекомбинантная система экспрессии, включая системы экспрессии клеток бактерий, млекопитающих, дрожжей, насекомых или растений. Альтернативно, указанные нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы in vitro хорошо известными способами химического синтеза, описанными, например, в Adams (1983) J. Am. Chem. Soc.,105: 661; Belousov (1997) Nucleuc. Acids Res., 25: 3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med., 19: 373380; Blommers (1994) Biochemisrty, 33: 7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol., 68: 90; Brown (1979)Meth. Enzymol., 68: 109; Beaucage (1981) Tetra. Lett., 22: 1859; в патенте США 4458066. Способы работы с нуклеиновыми кислотами, такие как, например, субклонирование, мечение зондами (например, мечение случайным праймером с использованием полимеразы Кленова, никтрансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и тому подобные, хорошо описаны в научной и патентной литературе (смотри, например, Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,ed. John Wiley and Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acids Probes, Part I. Theory and Nucleic Acids Preperation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993. Другие способы, применимые для получения и работы с нуклеиновыми кислотами, используемые при практическом осуществлении настоящего изобретения, включают в себя клонирование из геномных образцов и, при желании, скрининг и повторное клонирование вставок, выделенных или амплифицированных, например из геномных клонов или клонов кДНК. Источники нуклеиновой кислоты, используемые в способах согласно изобретению, включают в себя библиотеки геномной ДНК или кДНК, содержащиеся, например, в искусственных хромосомах млекопитающих (MAC), смотри, например, патенты США 5721118, 6025155, искусственных хромосомах человека (смотри, например, Rosenfeld (1997)Nat. Genet. 15: 333-335), искусственных хромосомах дрожжей (YAC), бактериальных искусственных хромосомах (BAC), искусственных хромосомах P1 (смотри, например, Woon (1998) Genomics, 50: 306316), векторов, являющихся производными P1 (PAC) (смотри, например, Kern (1997) Biotechniques, 23: 120-124), космидах, рекомбинантных вирусах, фагах или плазмидах. В одном аспекте нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид согласно изобретению, собирают- 28015591 в соответствующей фазе с лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслированного полипептида или его фрагмента. Настоящее изобретение относится к слитым белкам и к кодирующим их нуклеиновым кислотам. Полипептид согласно изобретению может быть слит с гетерологичным пептидом или полипептидом,таким как N-концевые идентифицирующие пептиды, которые придают желательные характеристики,такие как повышенная стабильность или упрощенная очистка. Пептиды и полипептиды согласно изобретению также могут быть синтезированы и экспрессированы в виде белков, слитых белков с одним или несколькими дополнительными доменами, например, для получения более иммуногенного пептида, с целью более простого выделения рекомбинантно синтезированного пептида, для идентификации и выделения антител и B-клеток, экспрессирующих антитела, и т.п. Домены, облегчающие выявление и очистку, включают в себя, например, пептиды, хелатирующие металлы, такие как полигистидиновые участки и гистидинтриптофановые модули, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованных металлах, домены белка A, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе FLAG-удлинения/аффинной очистки (Immunex Corp., Seattle WA). Включение расщепляемых линкерных последовательностей, таких как фактор Xa или энтерокиназа (Invitrogen, San Diego CA), между доменом, вводимым для очистки, и пептидом или полипептидом, включающим в себя мотив, способствует облегчению очистки. Например, экспрессирующий вектор может включать в себя последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эпитоп, связанный с шестью гистидиновыми остатками, за которыми следует тиоредоксин и сайт расщепления энтерокиназой (смотри, например, Williams (1995) Biochemistry, 34: 1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif., 12: 404-414). Гистидиновые остатки облегчают выявление и очистку, тогда как сайт расщепления энтерокиназы обеспечивает средство, позволяющее очищать эпитоп из оставшейся части слитого белка. Методики, относящиеся к векторам, кодирующим слитые белки, и к применению таких слитых белков, хорошо описаны в научной и патентной литературе, смотри, например, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12: 441-53. Последовательности регуляции транскрипции и трансляции Настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот (например, ДНК) согласно изобретению, оперативно связанным с последовательностью(ями) регуляции экспрессии (например, транскрипции или трансляции), например промоторами или энхансерами для управления или модулирования синтеза/экспрессии РНК. Последовательность регуляции экспрессии может находиться в векторе экспрессии. Примерами бактериальных промоторов являются lacI, lacZ, T3, T7, gpt, PR лямбда,PL и trp. Примерами эукариотических промоторов являются немедленный ранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промотор SV40, LTR ретровируса и промотор металлотионеина I мыши. Промоторы, подходящие для экспрессии полипептида в бактериях, включают промоторы lac или trpE. coli, промотор laI, промотор lacZ, промотор T3, промотор T7, промотор gpt, промотор PR лямбда, промотор PL лямбда, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3-фосфоглицераткиназа (ФГК), и промотор кислой фосфатазы. Эукариотические промоторы включают немедленный ранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, промоторы белков теплового шока, ранний и поздний промоторы SV40, LTR. из ретровирусов и промотор металлотионеина I мыши. Также можно использовать другие известные промоторы для регуляции экспрессии генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах. Экспрессирующие векторы и клонирующие носители Настоящее изобретение относится к экспрессирующим векторам и клонирующим носителям, содержащим нуклеиновые кислоты согласно изобретению, например последовательности, кодирующие фосфолипазы согласно изобретению. Экспрессирующие векторы и клонирующие носители согласно изобретению могут включать вирусные частицы, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагмиды, космиды, фосмиды, бактериальные искусственные хромосомы, вирусные ДНК (например, вирус осповакцины, аденовирус, вирус оспы птиц, вирус псевдобешенства и производные SV40), искусственные хромосомы на основе P1, дрожжевые плазмиды, искусственные хромосомы дрожжей и любые другие векторы, специфичные для конкретных интересующих хозяев (таких как Bacillus, Aspergillus и дрожжи). Векторы согласно изобретению могут включать в себя последовательности хромосомной ДНК, внехромосомной ДНК и синтетической ДНК. Специалистам в данной области известно большое число подходящих векторов, которые являются коммерчески доступными. Примерами таких векторов являются из числа бактериальных: pQE-векторы (Qiagen), плазмиды pBluescript, pNH-векторы (векторы ZAP лямбда (Stratagene;ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); из числа эукариотических: pXT1, pSG5 (Stratagene),pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Однако можно использовать любую другую плазмиду или любой другой вектор, при условии, что они реплицируются и жизнеспособны в хозяине. В настоящем изобретении можно использовать как низкокопийные векторы, так и высококопийные векторы. Экспрессирующий вектор может включать в себя промотор, сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор может также включать в себя соответствующие последовательности для амплификации экспрессии. Экспрессирующие векторы млекопитающих могут содержать начало репликации, любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирова- 29