Фосфолипазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения

010903 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится в основном к ферментам фосфолипазам, полинуклеотидам, кодирующим указанные ферменты, способам получения и применения данных полинуклеотидов и полипептидов. В частности, настоящее изобретение относится к новым полипептидам, обладающим фосфолипазной активностью, нуклеиновым кислотам, кодирующим их, и антителам, которые связываются с ними. Также предлагаются промышленные способы и продукты, связанные с применением указанных фосфолипаз. Предпосылки создания изобретения Фосфолипазы представляют собой ферменты, которые гидролизуют сложноэфирные связи фосфолипидов. В связи с важностью их функции в метаболизме фосфолипидов данные ферменты широко распространены среди прокариотов и эукариотов. Фосфолипазы воздействуют на метаболизм, построение и реорганизацию биологических мембран и участвуют в каскадах сигнальных реакций. Известно несколько типов фосфолипаз, которые различаются по своей специфичности, в зависимости от положения атакуемой связи в молекуле фосфолипида. Фосфолипаза А 1 (ФЛА 1) удаляет жирную кислоту при действии на 1-е положение, с образованием свободной жирной кислоты и 1-лизо-2-ацилфосфолипида. Фосфолипаза А 2 (ФЛА 2) удаляет жирную кислоту при действии на 2-е положение с образованием свободной жирной кислоты и 1-ацил-2-лизофосфолипида. Ферменты ФЛА 1 и ФЛА 2 могут представлять собой внутриклеточные, внеклеточные, связанные с мембранами или растворимые ферменты. Внутриклеточный ФЛА 2 найден практически во всех клетках млекопитающих. Фосфолипаза С (ФЛС) удаляет фосфатный фрагмент, с образованием 1,2-диацилглицерина и фосфатного основания. Фосфолипаза D (ФЛD) образует 1,2-диацилглицерофосфат и основную группу. ФЛС и ФЛD важны для функционирования клетки и осуществления ею сигнальной функции. ФЛD является доминирующей фосфолипазой в биологическом катализе (см., например, Godfrey, T. and West S. (1996) Industrial enzymology, 299-300, Stockton Press, NewYork). Пататины представляют собой другой тип фосфолипаз, которые, как считается, работают в режиме ФЛА (см., например, Hirschberg H.J. et al., (2001), Eur J Biochem 268(19):5037-44). Семена обычных масличных растений, таких как соя, рапс, подсолнечник, кунжутное семя и арахис, используются в качестве источника масел и кормов. В процессе экстрагирования масла семена подвергаются механической и термической обработке. Масло выделяют и отделяют от жмыха с помощью растворителя. С использованием отгонки затем также растворитель отделяют от масла и восстанавливают. Масло подвергают дегумированию (способ рафинирования путем гидратации) и очистке. Содержащийся в жмыхе растворитель может быть удален путем выпаривания при термической обработке в устройстве для удаления растворителя, с последующей сушкой жмыха и охлаждением. После отделения растворителя путем отгонки полученное масляное сырье обрабатывают с получением пищевого масла с использованием особых процедур дегумирования и физической очистки. Оно также может использоваться в качестве сырья для получения жирных кислот и сложного метилового эфира. Жмых может также использоваться в рационе животных. Дегумирование представляет собой первую стадию рафинирования растительного масла и предназначено для удаления загрязняющих фосфатидов, которые экстрагируются вместе с маслом, но мешают его дальнейшей обработке. Указанные фосфатиды растворимы в растительном масле только в безводной форме и могут быть осаждены и удалены, если их просто подвергнуть гидратации. Гидратация обычно проводится путем непрерывного смешивания небольшой пропорции воды по существу с сухим маслом. В типичном случае количество воды составляет 75% от содержания фосфатидов, которое обычно составляет 1-1,5%. Температура не является существенно важным фактором, хотя отделение гидратированных камедей достигается лучше, если снизить вязкость масла при температуре 50-80 С. В настоящее время используют различные способы дегумирования масла. Процесс дегумирования масла может быть осуществлен с помощью ферментов фосфолипаз. Фосфолипазы А 1 и А 2 используют для дегумирования масла в различных коммерческих процессах, например, в процессе ENZYMAXдегумирования (Lurgi Life Science Technologies GmbH, Германия). Фосфолипаза С (ФЛС) также рассматривается как подходящее средство для дегумирования масла, поскольку фосфатный фрагмент, получаемый в результате ее действия на фосфолипиды, обладает очень хорошей растворимостью в воде и легко удаляется, так что диглицерид остается в масле, и при этом снижаются потери (см., например, Godfrey, Т. and West S. (1996) Industrial Enzymology, 299-300, Stockton Press, New York; Dahlke (1998) AnEnzymatic oil degumming by a novel microbial phospholipase, Eur. J. Lipid. Sci. Technol. 103:333-340). Масла с высоким содержанием фосфатидов, такие как соевое масло, масло канолы и подсолнечное масло, обрабатывают способом, отличным от способов, используемых для обработки других масел, таких как пальмовое. В отличие от процесса паровой обработки и способа так называемой физической очистки, применяемых в случае масел с низким содержанием фосфатидов, данные масла с высоким содержанием фосфора диктуют специальные способы химической и механической обработки для удаления фосфолипидов с высоким содержанием фосфора. Данные масла обычно подвергают химической очистке способом, включающим в себя нейтрализацию свободных жирных кислот с образованием мыла и фракции нерастворимой камеди. Процесс нейтрализации характеризуется высокой эффективностью в плане-1 010903 удаления свободных жирных кислот и фосфолипидов, но данный способ приводит к значительным потерям на выходе и сказывается на ухудшении качества продукта. В некоторых случаях неочищенное масло с высоким содержанием фосфатидов подвергают дегумированию на стадии, предшествующей нейтрализации каустиком. Такой способ подходит для соевого масла, используемого для получения лецитина, в процессе которого масло вначале подвергают дегумированию водой или кислотой. Фитостеролы (растительные стеролы) являются представителями семейства тритерпеновых натуральных продуктов, которые содержат свыше 100 различных фитостеролов и более 4000 тритерпенов другого типа. В целом считается, что фитостеролы стабилизируют растительные мембраны с повышением соотношения стерол:фосфолипид, ведущим к росту ригидности мембран. Химически фитостеролы близки по структуре к холестерину. Основными фитостеролами являются -ситостерол, кампестерол и стигмастерол. Другие фитостеролы включают в себя стигмастанол (-ситостанол), ситостанол, десмостерол, халиностерол, пориферастерол, клионастерол и брассикастерол. Растительные стеролы являются важными сельскохозяйственными продуктами, полезными для использования в здравоохранении и пищевой промышленности. Они представляют собой хорошие эмульгаторы для косметической промышленности и дают множество стероидных интермедиатов и предшественников для производства гормональных фармацевтических средств. Считается, что насыщенные аналоги фитостеролов и их эфиров являются эффективными холестеринснижающими средствами, оказывающими благоприятный эффект на состояние сердечно-сосудистой системы. Растительные стеролы снижают уровень холестерина в сыворотке крови за счет ингибирования поглощения холестерина в просвете кишечника и обладают иммуномодулирующими свойствами в чрезвычайно низких концентрациях,включая усиление клеточного ответа Т-лимфоцитов и цитотоксическую способность натуральных клеток-киллеров в отношении линии раковых клеток. Кроме того, их терапевтический эффект был доказан в клинических испытаниях при лечении туберкулеза легких, ревматоидного артрита, в рамках комплексной терапии ВИЧ-инфицированных пациентов и как средств подавления иммунного стресса у марафонцев. Сложные эфиры растительных стеролов, называемые также фитостероловыми эфирами, одобрены Управлением США по контролю за пищевыми продуктами, лекарственными препаратами и косметическими средствами (FDA) как в целом безопасные (GRAS (Generally Recognized As Safe средства для применения в производстве маргаринов и пастообразных продуктов в 1999 г. В сентябре 2000 г. Управление также опубликовало внутренний регламент, который позволяет на продуктах, содержащих сложные стероловые эфиры, указывать информацию об их пользе для здоровья. Исходя из вышесказанного,обогащение пищевых продуктов сложными фитостероловыми эфирами чрезвычайно желательно для потребителей. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам,включающим в себя последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной(100%) идентичностью последовательности репрезентативной нуклеиновой кислоте согласно изобретению, например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ IDNO:105 на участке, содержащем по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250,300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300,1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250,2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более остатков, которые кодируют по меньшей мере один полипептид,обладающий фосфолипазной активностью, например активностью фосфолипазы А, С или D, и идентичность таких последовательностей определяют при анализе по алгоритму сравнения последовательностей или путем визуальной оценки. Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам,включающим в себя последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности SEQ ID NO:1 на участке, содержащем по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35,40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 и более последовательных остатков, где нуклеиновые кислоты кодируют по меньшей мере один полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, например активностью фосфолипазы А, В, С или D, и идентичность-2 010903 таких последовательностей определяют при анализе по алгоритму сравнения последовательностей или при визуальной оценке. Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам,включающим в себя последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере 78,79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности SEQ ID NO:3 на участке, включающем в себя по меньшей мере 10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 и более последовательных остатков, где указанные нуклеиновые кислоты кодируют по меньшей мере один полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, например активностью фосфолипазы А, В,С или D, и идентичность таких последовательностей определяют при анализе по алгоритму сравнения последовательностей или при визуальной оценке. Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам,включающим в себя последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере 78,79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности SEQ ID NO:5 на участке, включающем в себя по меньшей мере 10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 и более последовательных остатков, где указанные нуклеиновые кислоты кодируют по меньшей мере один полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, например активностью фосфолипазы А, В,С или D, и идентичность таких последовательностей определяют при анализе по алгоритму сравнения последовательностей или при визуальной оценке. Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам,включающим в себя последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере 50,51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности SEQ ID NO:7 на участке, включающем в себя по меньшей мере 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 и более последовательных остатков, где указанные нуклеиновые кислоты кодируют по меньшей мере один полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, например активностью фосфолипазы А, В, С илиD, и идентичность таких последовательностей определяют при анализе по алгоритму сравнения последовательностей или при визуальной оценке. В альтернативных аспектах выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты кодируют полипептид, включающий в себя последовательность, указанную в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:6 или SEQ ID NO:8. В одном аспекте данные полипептиды обладают фосфолипазной активностью,например активностью фосфолипазы A, B, C или D. В одном аспекте алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм BLAST,такой как алгоритм BLAST, версия 2.2.2. В одном аспекте параметр фильтрования установлен как blastall-p blactp-d nr pataa-F F и все другие параметры установлены по умолчанию. В одном аспекте активность фосфолипазы включает в себя каталитический гидролиз сложноэфирной связи глицерофосфата (например, расщепление сложноэфирных связей глицерофосфата). Фосфолипазная активность может включать в себя каталитический гидролиз сложноэфирной связи в фосфолипиде растительного масла. Фосфолипид растительного масла может включать в себя фосфолипид семян масличных растений. Фосфолипазная активность может включать в себя активность фосфолипазы С(ФЛС), активность фосфолипазы А (ФЛА), такую как активность фосфолипазы А 1 или фосфолипазы А 2,активность фосфолипазы D (ФЛD), такую как активность фосфолипазы D1 или фосфолипазы D2, или активность пататина. Фосфолипазная активность может включать в себя гидролиз гликопротеина, например гликопротеина из картофельных клубней. Фосфолипазная активность может включать в себя ферментативную активность пататина. Фосфолипазная активность может включать в себя ацилгидролазу липидов (АГЛ). В одном аспекте выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, которая характеризуется термостабильностью. Фосфолипид может сохранять фосфолипазную активность в условиях, включающих в себя температурный диапазон примерно от 37 и примерно до 95 С, примерно от 55 и примерно до 85 С, примерно от 70 и примерно до 95 С или примерно от 90 и до примерно 95 С. В одном аспекте выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, которая характеризуется термотолерантностью. Полипептид может сохранять фосфолипазную активность после воздействия температур в диапазоне выше 37 и примерно до 95 С или при любой температуре в диапазоне выше чем 55 и примерно до 85 С. В одном аспекте полипептид сохраняет фосфолипазную активность после воздействия температур в диапазоне выше 90 и примерно до 95 С при pH 4,5. Полипептид может сохранять фосфолипазную активность в условиях, включающих в себя примерно pH 7, 6,5, 6,0, 5,5, 5 или pH 4,5. Полипептид может сохранять фосфолипазную активность в температурных условиях в диапазоне примерно от 40 и примерно до 70 С. В одном аспекте выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота включает в себя последова-3 010903 тельность, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:7, где данная нуклеиновая кислота кодирует полипептид,обладающий фосфолипазной активностью. Нуклеиновая кислота может включать в себя по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750,800, 850 и более остатков в длину или включает в себя полную длину гена или транскрипта при наличии или в отсутствие сигнальной последовательности, в соответствии с настоящим изобретением. Жесткость условий может варьировать и включает в себя условия высокой жесткости, средней жесткости или низкой жесткости, как будет описано ниже. Жесткие условия могут включать в себя стадию промывки, например стадию промывки, включающую в себя обработку 0,2SSC при температуре примерно 65 С в течение примерно 15 мин. Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, применяемой в качестве зонда для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид фосфолипазы, например, с фосфолипазной активностью, где указанный зонд включает в себя по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 и более оснований последовательности согласно изобретению, например последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:7, и данный зонд идентифицирует нуклеиновую кислоту путем связывания или гибридизации. Зонд может включать в себя олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере примерно 10-50, примерно 20-60, примерно 30-70, примерно 40-80 или примерно 60-100 следующих друг за другом остатков последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 и/или SEQID NO:7. Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, применяемой в качестве зонда для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид фосфолипазы, например, с фосфолипазной активностью, где указанный зонд включает в себя нуклеиновую кислоту согласно изобретению, например нуклеиновую кислоту, характеризующуюся по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности сSEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 и/или SEQ ID NO:7, или их подпоследовательностью на участке, включающем в себя по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400,450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 и более следующих друг за другом остатков, где идентичность последовательностей определяют при анализе по алгоритму сравнения последовательностей или по визуальной оценке. Настоящее изобретение относится к амплификации парной праймерной последовательности, применяемой для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, где парный праймер способен осуществлять амплификацию нуклеиновой кислоты,включающей в себя последовательность согласно изобретению или ее фрагменты или подпоследовательности. Один или каждый член такой праймерной парной последовательности, применяемой для амплификации, может включать в себя олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере примерно 10-50 следующих друг за другом оснований последовательности или примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24 или 25 следующих друг за другом оснований последовательности. Настоящее изобретение относится к парным праймерам для амплификации, где парный праймер включает в себя первый член, имеющий последовательность, указанную примерно первыми (5') 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 остатками нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и второй член имеет последовательность, указанную примерно первыми (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21, 22, 23, 24 или 25 остатками комплементарной цепи первого члена. Настоящее изобретение относится к фосфолипазам, получаемым при амплификации, например, посредством полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР), с использованием парного праймера для амплификации согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к способам получения фосфолипазы путем амплификации, например, посредством полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР) с использованием парного праймера для амплификации согласно изобретению. В одном аспекте парный амплифицирующий праймер приводит к амплификации нуклеиновой кислоты из библиотеки, например генной библиотеки, такой как генная библиотека окружающей среды. Настоящее изобретение относится к способам амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, которые включают в себя амплификацию матричной нуклеиновой кислоты с помощью пары последовательностей амплифицирующего праймера, способных осуществлять амплификацию последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению или ее фрагментов или подпоследовательностей. Парный праймер для амплификации может представлять собой парный праймер для амплификации согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к кассетам экспрессии, включающим в себя нуклеиновую кислоту согласно изобретению или ее подпоследовательность. В одном аспекте экспрессирующая кассета может включать в себя нуклеиновую кислоту, которая оперативно связана с промотором. Промотор может представлять собой вирусный, бактериальный промотор, промотор млекопитающего или растительный промотор. В одном аспекте растительный промотор может представлять собой промотор из растений-4 010903 картофеля, риса, кукурузы, пшеницы, табака или ячменя. Промотор может представлять собой конститутивный промотор. Конститутивный промотор может включать в себя CaMV35S. В другом аспекте промотор может представлять собой индуцибельный промотор. В одном аспекте промотор может представлять собой тканеспецифичный промотор или промотор, регулируемый факторами окружающей среды, или промотор, регулируемый факторами развития. Таким образом, промотор может быть, например, специфичным для семян, специфичным для листа, специфичным для корня, специфичным для стебля или представлять собой промотор, индуцируемый опадением. В одном аспекте экспрессирующая кассета может также включать в себя вектор экспрессии растения или вируса растения. Настоящее изобретение относится к носителям для клонирования, содержащим экспрессирующую кассету (например, вектор) согласно изобретению или нуклеиновую кислоту согласно изобретению. Клонирующий носитель может представлять собой вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагемид, космиду,фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому. Вирусный вектор может включать в себя вектор аденовируса, вектор ретровируса или аденоассоциированный вирусный вектор. Клонирующий носитель может включать в себя бактериальную искусственную хромосому (ВАС), плазмиду, вектор, полученный из бактериофага Р 1 (РАС), дрожжевую искусственную хромосому (YAC) или искусственную хромосому млекопитающего (MAC). Настоящее изобретение относится к трансформированной клетке, содержащей нуклеиновую кислоту согласно изобретению, или экспрессирующую кассету (например, вектор) согласно изобретению, или клонирующий носитель согласно изобретению. В одном аспекте трансформированная клетка может представлять собой бактериальную клетку, клетку млекопитающего, грибковую клетку, дрожжевую клетку, клетку насекомого или растительную клетку. В одном аспекте растительная клетка может представлять собой клетку картофеля, пшеницы, риса, кукурузы, табака или ячменя. Настоящее изобретение относится к трансгенным животным, отличным от человека, содержащим нуклеиновую кислоту согласно изобретению или экспрессирующую кассету (например, вектор) согласно изобретению. В одном аспекте такое животное представляет собой мышь. Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям, содержащим нуклеиновую кислоту согласно изобретению или экспрессирующую кассету (например, вектор) согласно изобретению. Трансгенное растение может представлять собой растение кукурузы, картофеля, томата, пшеницы, масличное растение, рапс, сою, рис, ячмень или растение табака. Настоящее изобретение относится к семенам трансгенных растений, включающим в себя нуклеиновую кислоту согласно изобретению или экспрессирующую кассету (например, вектор) согласно изобретению. Трансгенное семя может представлять собой кукурузное семя, пшеничное зерно, масличное семя, рапсовое семя (растения канола), соевое семя, пальмовую косточку, семя подсолнечника, кунжутное семя, арахис или семя табачного растения. Настоящее изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду, включающему в себя последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеиновой кислоте согласно изобретению или способную к гибридизации с ней в жестких условиях. Настоящее изобретение относится к способам ингибирования трансляции фосфолипазного транскрипта в клетке, включающим в себя введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарной нуклеиновой кислоте согласно изобретению или способной к гибридизации с ней в жестких условиях. Настоящее изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду, включающему в себя последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеиновой кислоте согласно изобретению или способную к гибридизации с ней в жестких условиях. Настоящее изобретение относится к способам ингибирования трансляции фосфолипазного транскрипта в клетке, включающим в себя введение в клетку или экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеиновой кислоте согласно изобретению или способную к гибридизации с ней в жестких условиях. Антисмысловой олигонуклеотид может содержать примерно от 10 до 50, примерно от 20 до 60, примерно от 30 до 70, примерно от 40 до 80, примерно от 60 до 100, примерно от 70 до 110 или примерно от 80 до 120 оснований в длину. Настоящее изобретение относится к способам ингибирования трансляции фосфолипазы, например,фосфолипазного транскрипта в клетке, включающим в себя введение в клетку или в экспрессию в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеиновой кислоте согласно изобретению или способную к гибридизации с ней в жестких условиях. Настоящее изобретение относится к молекулам двухцепочечной ингибирующей РНК (иРНК),включающим в себя подпоследовательность последовательности согласно изобретению. В одном аспекте иРНК включает в себя примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более дуплексных нуклеотидов в длину. Настоящее изобретение относится к способам ингибирования экспрессии фосфолипазы,например фосфолипазы в клетке, включающим в себя введение в клетку или экспрессию в клетке двухцепочечной ингибирующей РНК (иРНК), где РНК содержит подпоследовательность последовательности согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к выделенному или рекомбинантному полипептиду, содержаще-5 010903 му аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86,87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности репрезентативного полипептида или пептида согласно изобретению на участке, содержащем по меньшей мере примерно 25, 50, 7 5, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 и более остатков, или на всей длине полипептида, и идентичность последовательностей определяют при анализе по алгоритму сравнения последовательностей или по визуальной оценке. Репрезентативные полипептидные или пептидные последовательности согласно изобретению содержат SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:6 или SEQ ID NO:8. В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному или рекомбинантному полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере примерно 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности SEQ ID NO:2. В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному или рекомбинантному полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере примерно 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87,88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности SEQ ID NO:4. В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному или рекомбинантному полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере примерно 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности SEQ ID NO:6. В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному или рекомбинантному полипептиду, включающему в себя аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере примерно 50, 51, 52,53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности SEQ ID NO:8. Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным полипептидам, кодируемым нуклеиновой кислотой согласно изобретению. В альтернативных аспектах полипептид может иметь последовательность, указанную в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:6 или SEQ ID NO:8. Полипептид может обладать фосфолипазной активностью, например активностью фосфолипазы А, В, С или D. Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным полипептидам, включающим в себя полипептид согласно изобретению, не содержащий сигнальной последовательности. В одном аспекте полипептид, не содержащий сигнальной последовательности, характеризуется по меньшей мере 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательности SEQ ID NO:2 на участке от 30 до 287 остатков, имеет аминокислотную последовательность,характеризующуюся по меньшей мере 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,97, 98, 99% или более идентичностью последовательности SEQ ID NO:4 на участке от 25 до 283 остатков, имеет аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 78, 79, 80, 81, 82,83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательности SEQ ID NO:6 на участке от 26 до 280 остатков, или имеет аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,99% или более идентичностью последовательности SEQ ID NO:8 на участке от 40 до 330 остатков. Идентичность последовательностей может быть определена при анализе по алгоритму сравнения последовательностей или путем визуальной оценки. Другой аспект настоящего изобретения относится к выделенному или рекомбинантному полипептиду или пептиду, включающему в себя по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95 или 100 или более следующих друг за другом оснований полипептидной или пептидной последовательности согласно изобретению, где указанные последовательности характеризуются по существу идентичностью и комплементарностью. Пептид может представлять собой, например, иммуногенный фрагмент, мотив (например, сайт связывания) или активный центр. В одном аспекте выделенный или рекомбинантный полипептид согласно изобретению (при наличии или в отсутствие сигнальной последовательности) обладает фосфолипазной активностью. В одном аспекте фосфолипазная активность включает в себя каталитический гидролиз сложноэфирной связи глицерофосфата (например, расщепление сложноэфирных связей глицерофосфата). Фосфолипидная активность может включать в себя каталитический гидролиз сложноэфирной связи в фосфолипиде, входящем в состав растительного масла. Фосфолипид растительного масла может включать в себя фосфолипид масличного семени. Фосфолипазная активность может включать в себя активность фосфолипазы С(ФЛС), активность фосфолипазы А (ФЛА), такую как активность фосфолипазы А 1 или фосфолипазы А 2,активность фосфолипазы D (ФЛD), такую как активность фосфолипазы D1 или фосфолипазы D2. Фосфолипазная активность может включать в себя гидролиз гликопротеина, например, гликопротеина из клубней картофеля. Фосфолипазная активность может включать в себя ферментативную активность пататина. Фосфолипазная активность может включать в себя активность ацилгидролазы липидов (АГЛ). В одном аспекте фосфолипазная активность характеризуется термостабильностью. Полипептид-6 010903 может сохранять фосфолипазную активность в условиях температурного диапазона примерно от 37 и примерно до 95 С, примерно от 55 и примерно до 85 С, примерно от 70 и примерно до 95 С или примерно от 90 и примерно до 95 С. В другом аспекте фосфолипазная активность может характеризоваться термотолерантностью. Полипептид может сохранять фосфолипазную активность после воздействия температуры в диапазоне выше 37 и примерно до 95 С или в диапазоне выше 55 и примерно до 85 С. В одном аспекте полипептид может сохранять фосфолипазную активность после воздействия температуры в диапазоне выше 90 и примерно до 95 С при pH 4,5. В одном аспекте полипептид может сохранять фосфолипазную активность в условиях примерноpH 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5 или pH 4. В другом аспекте полипептид может сохранять фосфолипазную активность в условиях примерно pH 7, 7,5, 8,0, 8,5, 9, 95, 10, 10,5 или pH 11. В одном аспекте выделенный или рекомбинантный полипептид может включать в себя полипептид согласно изобретению, который не содержит сигнальной последовательности. В одном аспекте выделенный или рекомбинантный полипептид может включать в себя полипептид согласно изобретению, содержащий гетерологичную сигнальную последовательность, такую как гетерологичная сигнальная последовательность липазы или гетерологичная сигнальная последовательность нелипазной природы. Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным пептидам, содержащим аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательности SEQ ID NO:2 на участке от 1 до 29 остатков, по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательности SEQ ID NO:4 на участке от 1 до 24 остатков, по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательности SEQ ID NO:6 на участке от 1 до 25 остатков или по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательности SEQ ID NO:8 на участке от 1 до 39 остатков и другим сигнальным последовательностям,указанным в перечне последовательностей, где идентичность последовательности определяют при анализе по алгоритму сравнения последовательностей или путем визуальной оценки. Указанные пептиды могут действовать в качестве сигнальных последовательностей в отношении своей эндогенной фосфолипазы или другой фосфолипазы или гетерологичного белка (фермента, отличного от фосфолипазы, или другого белка). В одном аспекте настоящее изобретение относится к химерным белкам, содержащим первый домен, который содержит сигнальную последовательность согласно изобретению, и по меньшей мере второй домен. Такой белок может представлять собой белок слияния. Второй домен может включать в себя фермент. Фермент может представлять собой фосфолипазу. Настоящее изобретение относится к химерным полипептидам, содержащим по меньшей мере первый домен, содержащий сигнальный пептид (СП) согласно изобретению или каталитический домен (КД) или активный центр фосфолипазы согласно изобретению, и по меньшей мере второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, причем для гетерологичного полипептида или пептида не характерна естественная связь с сигнальным пептидом (СП) или каталитическим доменом (КД). В одном аспекте гетерологичный полипептид или пептид не является фосфолипазой. Гетерологичный полипептид или пептид может находиться на аминоконце, карбоксильном конце или на обоих концах сигнального пептида (СП) или каталитического домена (КД). Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим химерный полипептид, где химерный полипептид содержит по меньшей мере первый домен,содержащий сигнальный пептид (СП) согласно изобретению или каталитический домен (КД) либо активный центр полипептида согласно изобретению, и по меньшей мере второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, причем для гетерологичного полипептида или пептида не характерна естественная связь с сигнальным пептидом (СП) или каталитическим доменом (КД). В одном аспекте фосфолипазная активность включает в себя удельную активность при температуре около 37 С в диапазоне примерно от 100 и примерно до 1000 единиц на 1 мг белка. В другом аспекте фосфолипазная активность включает в себя удельную активность примерно от 500 и примерно до 750 единиц на 1 мг белка. Альтернативно, фосфолипазная активность включает в себя удельную активность при 37 С в диапазоне примерно от 500 и примерно до 1200 единиц на 1 мг белка. В одном аспекте фосфолипазная активность включает в себя удельную активность при 37 С в диапазоне примерно от 750 и примерно до 1000 единиц на 1 мг белка. В другом аспекте термотолерантность включает в себя сохранение, по меньшей мере, половины от удельной активности фосфолипазы при 37 С после нагревания до повышенной температуры. Альтернативно, термотолерантность может относиться к сохранению удельной активности при 37 С в диапазоне примерно от 500 и примерно до 1200 единиц на 1 мг белка после нагревания до повышенной температуры. Настоящее изобретение относится к выделенному или рекомбинантному полипептиду согласно изобретению, где полипептид включает в себя по меньшей мере один сайт гликозилирования. В одном аспекте гликозилирование может представлять собой N-связанное гликозилирование. В одном аспекте полипептид может быть гликозилирован после экспрессии в P. pastoris или в S. pombe. Настоящее изобретение относится к белковым препаратам, включающим в себя полипептид согласно изобретению, где белковый препарат включает в себя жидкость, твердое вещество или гель. Настоящее изобретение относится к гетеродимерам, содержащим полипептид согласно изобрете-7 010903 нию и второй белок или домен. Второй член гетеродимера может представлять собой другую фосфолипазу, другой фермент или другой белок. В одном аспекте второй домен может представлять собой полипептид, а гетеродимер может представлять собой белок слияния. В одном аспекте второй домен может представлять собой эпитоп или метку. В одном аспекте изобретение относится к гомодимерам, содержащим полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к иммобилизованным полипептидам, обладающим фосфолипазной активностью, где полипептид включает в себя полипептид согласно изобретению, полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению, или полипептид, включающий в себя полипептид согласно изобретению и второй домен. В одном аспекте полипептид может быть иммобилизирован на клетке, металле, смоле, полимере, керамическом материале, стекле, микроэлектроде, графической частице, грануле, геле, пластине, матрице или капиллярной трубке. Настоящее изобретение относится к матрицам, содержащим иммобилизованный полипептид, где полипептид представляет собой фосфолипазу согласно изобретению или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к матрице, содержащей иммобилизованную нуклеиновую кислоту согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к матрице, содержащей иммобилизованное антитело согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным антителам, которые специфически связываются с полипептидом согласно изобретению или с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой согласно изобретению. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Настоящее изобретение относится к гибридомам, включающим в себя антитело согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к способам выделения и идентификации полипептида с фосфолипазной активностью, включающим в себя стадии (a) получения антитела согласно изобретению; (b) получения образца, включающего в себя полипептиды; и (c) приведения в контакт образца, полученного на стадии (b), с антителом, полученным на стадии (a), в условиях, способствующих специфическому связыванию антитела с полипептидом, с достижением при этом выделения или идентификации фосфолипазы. Настоящее изобретение относится к способам получения антитела против фосфолипазы, включающим в себя введение животному, отличному от человека, нуклеиновой кислоты согласно изобретению или полипептида согласно изобретению, в количестве, достаточном для проявления гуморального иммунного ответа, что приводит к получению антитела против фосфолипазы. Настоящее изобретение относится к способам создания рекомбинантного полипептида, включающим в себя стадии (a) получения нуклеиновой кислоты согласно изобретению, оперативно связанной с промотором; и (b) экспрессии нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (a), в условиях, позволяющих экспрессию полипептида, с образованием рекомбинантного полипептида. Нуклеиновая кислота может включать в себя последовательность, обладающую по меньшей мере 85% идентичностью последовательности SEQ ID NO:1 на участке, содержащем по меньшей мере 100 остатков, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью последовательности SEQ ID NO:3 на участке, включающем в себя по меньшей мере 100 остатков, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью последовательности кSEQ ID NO:5 на участке, включающем в себя по меньшей мере 100 остатков, или обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности SEQ ID NO:7 на участке, включающем в себя по меньшей мере 100 остатков, где идентичность последовательностей определяют при анализе по алгоритму сравнения последовательностей или путем визуальной оценки. Нуклеиновая кислота может представлять собой нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой,указанной в SEQ ID NO:1, или ее подпоследовательностью, с последовательностью, указанной в SEQ IDNO:3, или ее подпоследовательностью, с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:5, или ее подпоследовательностью, или с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:7, или ее подпоследовательностью. Данный способ может также включать в себя трансформацию хозяйской клетки нуклеиновой кислотой, полученной на стадии (a), с последующей экспрессией нуклеиновой кислотой со стадии (a), с образованием рекомбинантного полипептида в трансформированной клетке. Данный способ может также включать в себя вставку в организм животного-хозяина, отличного от человека, нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (a), с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты со стадии (a), с образованием рекомбинантного полипептида в организме животного-хозяина, отличного от человека. Настоящее изобретение также относится к способам идентификации полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, включающим в себя следующие стадии: (a) получение полипептида согласно изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению, или его фрагмента или варианта; (b) получение субстрата фосфолипазы и (c) приведение в контакт полипептида или его фрагмента или варианта, полученного на стадии (a), с субстратом со стадии (b), и выявление наличия повышения количества субстрата или снижения количества реакционного продукта, где снижение количества субстрата или повышение количества реакционного продукта идентифицирует исследуемый субстрат как субстрат для фосфолипазы. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота может обладать по меньшей мере 85% идентичностью последовательности SEQ ID NO:1 на участке, включающем в себя по меньшей мере примерно 100 остатков, по меньшей мере 80% идентичностью последовательности SEQ ID NO:3 на участке, включающем в себя по меньшей мере примерно 100 остатков, по-8 010903 меньшей мере 80% идентичностью последовательности SEQ ID NO:5 на участке, содержащем по меньшей мере примерно 100 остатков, или по меньшей мере 70% идентичностью последовательности SEQ IDNO:7 на участке, содержащем по меньшей мере примерно 100 остатков, где идентичность последовательностей определяют при анализе по алгоритму сравнения последовательностей или путем визуальной оценки. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота гибридизуется в жестких условиях с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:1, или ее подпоследовательностью, с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:3, или ее подпоследовательностью, с последовательностью, указанной в SEQ IDNO:5, или ее подпоследовательностью или с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:7, или ее подпоследовательностью. Настоящее изобретение также относится к способам идентификации фосфолипазного субстрата,включающим в себя следующие стадии: (a) получение полипептида согласно изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение исследуемого субстрата и (c) приведение в контакт полипептида, полученного на стадии (a), с исследуемым субстратом со стадии(b), и выявление наличия повышения количества субстрата или снижения количества реакционного продукта, где снижение количества субстрата или повышение количества реакционного продукта идентифицирует исследуемый субстрат как субстрат для фосфолипазы. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота может обладать по меньшей мере 85% идентичностью последовательности SEQ ID NO:1 на участке, содержащем по меньшей мере примерно 100 остатков, по меньшей мере 80% идентичностью последовательности SEQ ID NO:3 на участке, содержащем по меньшей мере примерно 100 остатков, по меньшей мере 80% идентичностью последовательности SEQ ID NO:5 на участке, содержащем по меньшей мере примерно 100 остатков, или по меньшей мере 70% идентичностью последовательности SEQ IDNO:7 на участке, содержащем по меньшей мере примерно 100 остатков, где идентичность последовательностей определяют при анализе по алгоритму сравнения последовательностей или путем визуальной оценки. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота гибридизуется в жестких условиях с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:1, или ее подпоследовательностью, с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:3, или ее подпоследовательностью, с последовательностью, указанной в SEQ IDNO:5, или ее подпоследовательностью или с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:7, или ее подпоследовательностью. Настоящее изобретение относится к способам выявления наличия специфического связывания соединения с фосфолипазой, включающим в себя следующие стадии: (a) экспрессию нуклеиновой кислоты или вектора, включающего в себя нуклеиновую кислоту, в условиях, позволяющих трансляцию нуклеиновой кислоты в полипептид; где нуклеиновая кислота и вектор содержат нуклеиновую кислоту или вектор согласно изобретению; или получение полипептида согласно изобретению; (b) приведение в контакт полипептида с исследуемым соединением; и (c) выявление наличия специфического связывания исследуемого соединения с полипептидом, означающее, что данное соединение специфически связывается с фосфолипазой. В альтернативных аспектах последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:1 на участке, содержащем по меньшей мере примерно 100 оснований, по меньшей мере 80% идентичностью последовательности SEQ ID NO:3 на участке, содержащем по меньшей мере примерно 100 оснований, по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:5 на участке, содержащем по меньшей мере примерно 100 остатков, или по меньшей мере 70% идентичностью последовательности SEQ ID NO:7 на участке, содержащем по меньшей мере примерно 100 остатков, где идентичность последовательностей определяют при анализе по алгоритму сравнения последовательностей или путем визуальной оценки. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота гибридизуется в жестких условиях с последовательностью, указанной вSEQ ID NO:1, или ее подпоследовательностью, с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:3, или ее подпоследовательностью, с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:5, или ее подпоследовательностью, с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:7, или ее подпоследовательностью. Настоящее изобретение относится к способам идентификации модулятора фосфолипазной активности, включающим в себя следующие стадии: (a) получение полипептида согласно изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение исследуемого соединения; (c) приведение в контакт полипептида, полученного на стадии (a), с исследуемым соединением, полученным на стадии (b), и определение активности фосфолипазы, где изменение фосфолипазной активности, определяемой в присутствии исследуемого соединения, сравнивают с ее активностью в отсутствие исследуемого соединения, что дает указание на то, что исследуемое соединение модулирует активность фосфолипазы. В альтернативных аспектах нуклеиновая кислота может обладать по меньшей мере 85% идентичностью последовательности SEQ ID NO:1 на участке, содержащем по меньшей мере примерно 100 остатков, по меньшей мере 80% идентичностью последовательности SEQ ID NO:3 на участке, содержащем по меньшей мере примерно 100 остатков, по меньшей мере 80% идентичностью последовательности SEQ ID NO:5 на участке, содержащем по меньшей мере примерно 100 остатков, или по меньшей мере 70% идентичностью последовательности SEQ ID NO:7 на участке, содержащем по меньшей мере примерно 100 остатков, где идентичность последовательности определяют при анализе по алгоритму сравнения последовательностей или путем визуальной оценки. В альтернативных аспектах нук-9 010903 леиновая кислота может гибридизоваться в жестких условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, или ее подпоследовательности, последовательности, указанной в SEQ ID NO:3, или ее подпоследовательности, последовательности, указанной в SEQ ID NO:5, или ее подпоследовательности либо последовательности,указанной в SEQ ID NO:7, или ее подпоследовательности. В одном аспекте активность фосфолипазы определяют при использовании фосфолипазного субстрата с выявлением наличия повышения количества субстрата или снижения количества реакционного продукта. Снижение количества субстрата или повышение количества реакционного продукта под действием исследуемого соединения сравнивают с количеством субстрата или реакционного продукта в отсутствие исследуемого соединения, что позволяет идентифицировать исследуемое соединение как активатор активности фосфолипазы. Повышение количества субстрата или снижение количества реакционного продукта при использовании исследуемого соединения в сравнении с количеством субстрата или реакционного продукта в отсутствие исследуемого соединения позволяет идентифицировать исследуемое соединение как ингибитор активности фосфолипазы. Настоящее изобретение относится к компьютерным системам, включающим в себя процессор и устройство для хранения данных, где указанное устройство для хранения данных используется для хранения полипептидной последовательности согласно изобретению или последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению. В одном аспекте компьютерная система может также включать в себя алгоритм сравнения последовательностей и устройство для хранения данных, содержащее в своем составе по меньшей мере одну стандартную последовательность. Алгоритм сравнения последовательностей может включать в себя компьютерную программу, которая показывает наличие полиморфизма. Компьютерная система может также включать в себя идентификатор, который позволяет выявить одну или более характеристик в данной последовательности. Настоящее изобретение относится к компьютерным машиночитаемым средам, содержащим хранящуюся в них последовательность, включающую в себя полипептидную последовательность согласно изобретению или последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к способам идентификации характеристик последовательности,включающим в себя стадии (a) прочтения последовательности с помощью компьютерной программы,которая идентифицирует одну или более характеристик в данной последовательности, где последовательность включает в себя полипептидную последовательность согласно изобретению или последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению; (b) идентификации одной или более характеристик в последовательности с помощью компьютерной программы. Настоящее изобретение относится к способам сравнения первой последовательности со второй последовательностью, включающим в себя стадии (a) прочтения первой последовательности и второй последовательности с помощью компьютерной программы, которая сравнивает последовательности, где первая последовательность включает в себя полипептидную последовательность согласно изобретению или последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению; и (b) выявления наличия различий между первой последовательностью и второй последовательностью с помощью компьютерной программы. В одном аспекте стадия выявления наличия различий между первой последовательностью и второй последовательностью также включает в себя стадию идентификации полиморфизма. В одном аспекте способ также включает в себя идентификатор (и использование идентификатора), позволяющий идентифицировать одну или более характеристик в последовательности. В одном аспекте способ включает в себя прочтение первой последовательности с помощью компьютерной программы и идентификацию одной или более характеристик в последовательности. Настоящее изобретение относится к способам выделения или восстановления нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью из образца окружающей среды, включающим в себя стадии (a) получения последовательности парного амплифицирующего праймера для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью, где парный праймер способен осуществлять амплификацию нуклеиновой кислоты согласно изобретению (например,SEQ ID NO:1 или ее подпоследовательности, SEQ ID NO:3 или ее подпоследовательности, SEQ ID NO:5 или ее подпоследовательности или SEQ ID NO:7 или ее подпоследовательности и т.п.); (b) выделения нуклеиновой кислоты из образца окружающей среды или обработки образца окружающей среды так, что нуклеиновая кислота в образце становится доступной для гибридизации амплифицирующим парным праймером; и (c) объединения нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (b), с парным амплифицирующим праймером со стадии (a), с последующей амплификацией нуклеиновой кислоты из образца окружающей среды, достигая при этом выделения или восстановления нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью, содержащейся в образце окружающей среды. В одном аспекте каждый член парного амплифицирующего праймера содержит олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере 10-50 следующих друг за другом оснований в последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению. В одном аспекте последовательность парного амплифицирующего праймера представляет собой амплифицирующую пару согласно изобретению.- 10010903 Настоящее изобретение относится к способам выделения или восстановления нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью, из образца окружающей среды, включающим в себя стадии (a) получения полинуклеотидного зонда, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению или ее подпоследовательность; (b) выделения нуклеиновой кислоты из образца окружающей среды или обработки образца окружающей среды так, чтобы нуклеиновая кислота в данном образце стала доступной для гибридизации с полинуклеотидным зондом, полученным на стадии (a); (c) объединения выделенной нуклеиновой кислоты или обработанного образца окружающей среды со стадии (b) с полинуклеотидным зондом, полученным на стадии (a); и (d) выделения нуклеиновой кислоты, которая специфически гибридизуется с полинуклеотидным зондом, полученным на стадии(a), с достижением при этом выделения или восстановления нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с фосфолипазной активностью, из образца окружающей среды. В альтернативных аспектах образец окружающей среды включает в себя образец воды, образец жидкости, образец почвы, образец воздуха или биологический образец. В альтернативных аспектах биологический образец получают из бактериальной клетки, из клетки простейшего, из клетки насекомого, из клетки дрожжей, из растительной клетки, из грибковой клетки или из клетки млекопитающего. Настоящее изобретение относится к способам создания варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей фосфолипазу, включающим в себя стадии (a) получения матрицы нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеиновую кислоту согласно изобретению; (b) модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов к матричной последовательности или их сочетания с получением варианта матричной нуклеиновой кислоты. В одном аспекте данный способ также включает в себя экспрессию варианта нуклеиновой кислоты с образованием полипептида фосфолипазы. В альтернативных аспектах модификации, добавления или делеции вводятся посредством склонной к ошибкам ПЦР, перестановки, направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов, сборки с использованием ПЦР, мутагенеза с использованием механизма спаривания в рамках ПЦР, мутагенеза in vivo, кассетного мутагенеза, рекурсивного согласованного мутагенеза, экспоненциального согласованного мутагенеза, сайт-специфичного мутагенеза, вторичной сборки генов, генного мутагенеза по механизму насыщения сайтов (ГМНС (GSSM, повторной сборки по механизму синтеза с использованием лигирования (ПСЛ (SLR и/или их сочетания. В альтернативных аспектах модификации, добавления или делеции могут вводиться способом, выбранным из группы,включающей в себя рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, мутагенез с использованием ДНК, модифицированной фосфотиоатом, мутагенез с использованием урацилсодержащей матрицы, мутагенез с использованием гэпированного дуплекса, мутагенез по механизму точечного ошибочного спаривания при репарации, мутагенез, связанный с недостаточностью функционирования системы репарации в хозяйском штамме, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, делеционный мутагенез, мутагенез на основе системы рестрикции-селекции, мутагенез на основе системы рестрикцииочистки, синтез искусственного гена, согласованный мутагенез, создание мультимера химерной молекулы нуклеиновой кислоты и/или их сочетания. В одном аспекте данный способ многократно повторяют до получения фосфолипазы, обладающей измененной или иной активностью, измененной или иной стабильностью в сравнении с фосфолипазой,кодируемой матричной нуклеиновой кислотой. В одном аспекте измененная или иная активность представляет собой активность фосфолипазы в кислых условиях, когда фосфолипаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, неактивна в кислых условиях. В одном аспекте измененная или иная активность представляет собой активность фосфолипазы при высокой температуре, когда фосфолипаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, неактивна при высокой температуре. В одном аспекте данный способ многократно повторяют до получения кодирующей фосфолипазу последовательности, характеризующейся измененным использованием кодона в сравнении с матричной нуклеиновой кислотой. Данный способ может быть многократно повторен до получения гена фосфолипазы, характеризующегося повышенным или сниженным уровнем экспрессии транскрипта или стабильности в сравнении с матричной нуклеиновой кислотой. Настоящее изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу, с целью повышения ее экспрессии в хозяйской клетке, где описываемый способ включает в себя (a) получение нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей фосфолипазу,и (b) идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте,полученной на стадии (a), и замещения его предпочтительным или нейтрально используемым кодоном,кодирующим ту же аминокислоту, что и замещенный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, широко представленный в кодирующих последовательностях генов хозяйской клетки и непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, слабо представленный в кодирующих последовательностях генов хозяйской клетки, за счет чего достигается модификация нуклеиновой кислоты, направленная на повышение ее экспрессии в хозяйской клетке. Настоящее изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу, где описываемый способ включает в себя (a) получение нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей фосфолипазу, и (b) идентификацию кодона в нуклеиновой кислоте,- 11010903 полученной на стадии (a), и замещение его другим кодоном, кодирующим ту же нуклеиновую кислоту,что и замещенный кодон, за счет чего достигается модификация кодона в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу. Настоящее изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу, с целью повышения ее экспрессии в хозяйской клетке, где описываемый способ включает в себя (a) получение нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей фосфолипазу,и (b) идентификацию непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте,полученной на стадии (a), и замещение ее предпочтительным или нейтрально используемым кодоном,кодирующим ту же аминокислоту, что и замещенный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, широко представленный в кодирующих последовательностях генов хозяйской клетки, и непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, слабо представленный в кодирующих последовательностях генов хозяйской клетки, за счет чего достигается модификация нуклеиновой кислоты, направленная на повышение ее экспрессии в хозяйской клетке. Настоящее изобретение относится к способам модификации кодона в нуклеиновой кислоте, кодирующей фосфолипазу, с целью снижения ее экспрессии в хозяйской клетке, где описываемый способ включает в себя (a) получение нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующей фосфолипазу,и (b) идентификацию по меньшей мере одного предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте, полученной на стадии (a), и замещение его непредпочтительным или предпочтительным кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замещенный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, широко представленный в кодирующих последовательностях генов хозяйской клетки, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, слабо представленный в кодирующих последовательностях генов хозяйской клетки, за счет чего достигается модификация нуклеиновой кислоты с целью снижения уровня ее экспрессии в хозяйской клетке. В альтернативных аспектах хозяйская клетка представляет собой бактериальную клетку, грибковую клетку, клетку насекомого,дрожжевую клетку, растительную клетку или клетку млекопитающего. Настоящее изобретение относится к способам получения библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных сайтов фосфолипазы или сайтов связывания субстрата, где модифицированные активные сайты или сайты связывания субстрата получают из первой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую первый активный сайт или первый сайт связывания субстрата, где описываемый способ включает в себя (a) получение первой нуклеиновой кислоты, кодирующей первый активный сайт или первый сайт связывания субстрата, где первая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновую кислоту согласно изобретению; (b) получение набора мутагенных олигонуклеотидов, которые кодируют природные варианты аминокислоты, с множеством целевых кодонов в первой нуклеиновой кислоте; и (c) с использованием набора мутагенных олигонуклеотидов получение множества вариантов нуклеиновых кислот, кодирующих активный сайт или сайт связывания субстрата, которые кодируют набор вариаций аминокислот в каждом кодоне для аминокислоты, который подвергся мутагенезу, за счет чего образуется библиотека нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных сайтов фосфолипазы и сайтов связывания субстрата. В альтернативных аспектах данный способ включает в себя мутагенез первой нуклеиновой кислоты на стадии (a) посредством способа, включающего в себя систему оптимизированной направленной эволюции, генный мутагенез по механизму насыщения сайтов (ГМНС (GSSM, повторную сборку по механизму синтеза с использованием лигирования (ПСЛ (SLR. Данный способ может также включать в себя мутагенез первой нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (a), или ее вариантов по способу, включающему в себя склонную к ошибкам ПЦР, перестановку, направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, сборку с использованием ПЦР, мутагенез с использованием механизма спаривания в рамках ПЦР, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный согласованный мутагенез, экспоненциальный согласованный мутагенез, сайт-специфичный мутагенез, вторичную сборку генов, генный мутагенез по механизму насыщения сайтов (ГМНС (GSSM, повторную сборку по механизму синтеза с использованием лигирования (ПСЛ (SLR и их сочетание. Данный способ может также включать в себя мутагенез первой кислоты, полученной на стадии (a), или ее вариантов по методу, включающему в себя рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, мутагенез с использованием ДНК,модифицированной фосфотиоатом, мутагенез с использованием урацилсодержащей матрицы, мутагенез с использованием гэпированного дуплекса, мутагенез по механизму точечного ошибочного спаривания при репарации, мутагенез, связанный с недостаточностью функционирования системы репарации в хозяйском штамме, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, делеционный мутагенез, мутагенез на основе системы рестрикции-селекции, мутагенез на основе системы рестрикции-очистки, синтез искусственного гена, согласованный мутагенез, создание мультимера химерной молекулы нуклеиновой кислоты и их сочетание. Настоящее изобретение относится к способам создания малой молекулы, включающим в себя стадии (a) получения набора биосинтетических ферментов, способных осуществлять синтез или модификацию малой молекулы, где один из ферментов включает в себя фермент фосфолипазу, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получения субстрата по меньшей мере для одного фер- 12010903 мента со стадии (a); и (c) проведения реакции субстрата со стадии (b) с ферментами в условиях, облегчающих осуществление множества биокаталитических реакций, с образованием малой молекулы в результате серии биокаталитических реакций. Настоящее изобретение относится к способам модификации малой молекулы, включающим в себя стадии (a) получения фермента фосфолипазы, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получения малой молекулы; и (c) проведения реакции фермента, полученного на стадии (a), с малой молекулой, полученной на стадии (b), в условиях, способствующих ферментативной реакции, катализируемой ферментом фосфолипазой, что приводит к модификации малой молекулы за счет ферментативной реакции под действием фосфолипазы. В одном аспекте способ включает в себя получение множества малых молекул в качестве субстратов для фермента со стадии (a), за счет чего достигается создание библиотеки модифицированных малых молекул, образуемых в результате по меньшей мере одной ферментативной реакции, катализируемой фосфолипазой. В одном аспекте способ также включает в себя набор дополнительных ферментов в условиях, облегчающих проведение множества биокаталитических реакций с участием ферментов, с получением библиотеки модифицированных малых молекул,образуемых в результате множества ферментативных реакций. В одном аспекте данный способ также включает в себя стадию анализа библиотеки с целью определения того, присутствует ли в данной библиотеке конкретная модифицированная малая молекула, которая проявляет желательную активность. Стадия анализа библиотеки может также включать в себя стадии систематического удаления всех, кроме одной, биокаталитических реакций, используемых для получения части из множества модифицированных малых молекул в данной библиотеке, путем тестирования модифицированных малых молекул на наличие или отсутствие конкретной модифицированной малой молекулы с желательной активностью, с последующей идентификацией по меньшей мере одной конкретной биокаталитической реакции, которая создает конкретную модифицированную малую молекулу с желательной активностью. Настоящее изобретение относится к способам определения функционального фрагмента фермента фосфолипазы, включающим в себя стадии (a) получения фермента фосфолипазы, включающего в себя аминокислотную последовательность согласно изобретению, и (b) делетирования множества аминокислотных остатков из последовательности, полученной на стадии (a), и тестирование оставшейся подпоследовательности на фосфолипазную активность, за счет чего достигается определение функционального фрагмента фермента фосфолипазы. В одном аспекте активность фосфолипазы определяют с помощью субстрата фосфолипазы, с последующим выявлением наличия повышения количества субстрата или снижения количества реакционного продукта. В одном аспекте снижение количества субстрата фермента или повышение количества реакционного продукта при использовании исследуемого соединения в сравнении с количеством субстрата или реакционного продукта в отсутствие исследуемого соединения позволяет идентифицировать исследуемое соединение как активатор активности фосфолипазы. Настоящее изобретение относится к способам расщепления сложноэфирной связи глицерофосфата,включающим в себя следующие стадии: (a) получение полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, где указанный полипептид включает в себя аминокислотную последовательность согласно изобретению, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, включающей в себя сложноэфирную связь глицерофосфата; и (c) приведение в контакт полипептида со стадии (a) с композицией, полученной на стадии (b), в условиях, когда полипептид расщепляет сложноэфирную связь глицерофосфата. В одном аспекте указанные условия включают в себя значения pH примерно от pH 5 и примерно до 5,5 или примерно от pH 4,5 и примерно до 5,0. В одном аспекте указанные условия включают в себя температуру в диапазоне примерно от 40 С и примерно до 70 С. В одном аспекте композиция включает в себя растительное масло. В одном аспекте композиция включает в себя фосфолипид из масличных семян. В одном аспекте реакция расщепления может приводить к образованию экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида. Настоящее изобретение относится к способам дегумирования масла, включающим в себя следующие стадии: (a) получение полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, где указанный полипептид включает в себя аминокислотную последовательность согласно изобретению, или полипептид,кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, включающей в себя растительное масло; и (c) приведение в контакт полипептида со стадии (a) с растительным маслом,полученным на стадии (b), в условиях, когда полипептид может расщеплять сложноэфирные связи в растительном масле, за счет чего достигается дегумирование масла. В одном аспекте растительное масло включает в себя масло из масличных семян. Растительное масло может включать в себя пальмовое масло, рапсовое масло, кукурузное масло, соевое масло, масло канолы, кунжутное масло, арахисовое масло или подсолнечное масло. В одном аспекте способ также включает в себя добавление фосфолипазы согласно изобретению, другой фосфолипазы или их сочетания. Настоящее изобретение относится к способам превращения негидратируемого фосфолипида в гидратируемую форму, включающим в себя следующие стадии: (a) получение полипептида, обладающего фосфолипазной активностью, где указанный полипептид включает в себя аминокислотную последовательность согласно изобретению, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, включающей в себя негидратируемый фосфолипид; и (c) приведе- 13010903 ние в контакт полипептида со стадии (a) с негидратируемым фосфолипидом, полученным на стадии (b), в условиях, когда полипептид может расщеплять сложноэфирные связи в негидратируемом фосфолипиде,за счет чего достигается превращение негидратируемого фосфолипида в его гидратируемую форму. Настоящее изобретение относится к способам дегумирования масла, включающим в себя следующие стадии: (a) получение композиции, включающей в себя полипептид согласно изобретению, обладающий фосфолипазной активностью, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, включающей в себя жир или масло, содержащие фосфолипид; и (c) приведение в контакт полипептида со стадии (a) и композиции, полученной на стадии (b), в условиях, когда полипептид может осуществлять дегумирование фосфолипидсодержащей композиции (в условиях, когда полипептид согласно изобретению может катализировать гидролиз фосфолипида). В одном аспекте содержащая масло композиция включает в себя растительное, животное масло, масло из водорослей или рыбий жир. Растительное масло может включать в себя соевое масло, рапсовое масло, кукурузное масло, масло из пальмовых косточек, масло канолы, подсолнечное масло, кунжутное масло или арахисовое масло. Полипептид может гидролизовать фосфатид в гидратируемом и/или негидратируемом фосфолипиде в композиции, содержащей масло. Полипептид может гиролизовать фосфатид по глицерил-фосфоэфирной связи с образованием диглицерида и водорастворимого фосфатного соединения. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы С, В, А или D. В одном аспекте добавляют активную фосфолипазу D и фермент фосфатазу. Контактирование может включать в себя гидролиз гидратированного фосфолипида в масле. Условия гидролиза могут включать в себя температуру в диапазоне от 20 до 40 С при щелочном pH. Щелочные условия могут включать в себя pH примерно от pH 8 до 10. Условия гидролиза могут включать в себя время реакции примерно от 3 до 10 мин. Условия гидролиза могут включать в себя гидролиз гидратируемых и негидратируемых фосфолипидов масла при температуре примерно от 50 до 60 С, при pH примерно от pH 5 до 6,5, с проведением реакции в течение примерно от 30 до 60 мин. Полипептид может быть связан с фильтром, и жир или масло, содержащие фосфолипид,пропускают через фильтр. Полипептид может быть добавлен к раствору, включающему в себя жир или масло, содержащие фосфолипид, и затем раствор пропускают через фильтр. Настоящее изобретение относится к способам превращения негидратируемого фосфолипида в гидратируемую форму, включающим в себя следующие стадии: (a) получение композиции, содержащей полипептид, обладающий фосфолипазной активностью согласно изобретению, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, включающей в себя негидратируемый фосфолипид; и (c) приведение в контакт полипептида со стадии (a) и композиции, полученной на стадии (b), в условиях, когда полипептид превращает негидратируемый фосфолипид в его гидратируемую форму. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы С. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы D, и при этом также может быть добавлен фермент фосфатазы. Настоящее изобретение относится к способам каустической очистки фосфолипидсодержащей композиции, включающим в себя следующие стадии: (a) получение композиции, включающей в себя полипептид согласно изобретению, обладающий фосфолипазной активностью, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, включающей в себя фосфолипид; и (c) приведение в контакт полипептида со стадии (a) и композиции, полученной на стадии (b), до,во время или после очистки каустиком. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы С. Полипептид может быть добавлен до каустической очистки, и композиция, содержащая фосфолипид, может включать в себя растение, при этом полипептид может экспрессироваться трансгенно, полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, может быть добавлен во время дробления семени или другой части растения, или полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, добавляют после разрушения или перед очисткой. Полипептид может быть добавлен во время очистки каустиком, при этом могут быть добавлены варьирующие количества кислоты и каустика, в зависимости от содержания фосфора и свободных жирных кислот. Полипептид может быть добавлен после очистки каустиком: в смеситель с интенсивным перемешиванием или в ретенционный смеситель перед разделением; после стадии нагревания, в центрифугу, в мыльную основу; промывную воду или на стадии обесцвечивания или дезодорирования. Настоящее изобретение относится к способам очистки фитостерола или тритерпена, включающим в себя следующие стадии: (a) получение композиции, включающей в себя полипептид согласно изобретению, обладающий фосфолипазной активностью, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, включающей в себя фитостерол или тритерпен; и (c) приведение в контакт полипептида, полученного на стадии (a), и композиции, полученной на стадии (b),в условиях, когда полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы С. Фитостерол или тритерпен может включать в себя растительный стерол. Растительный стерол может быть получен из растительного масла. Растительное масло включает в себя кокосовое масло, масло канолы, масло какао, кукурузное масло, хлопковое масло, льняное масло, оливковое масло, пальмовое масло, арахисовое масло, масло, полученное из рисовых отрубей,сафлоровое масло, кунжутное масло, соевое масло или подсолнечное масло. Данный способ может включать в себя использование неполярных растворителей для количественной экстракции свободных- 14010903 фитостеролов и сложных фитостериловых эфиров жирной кислоты. Фитостерол или тритерпен могут включать в себя -ситостерол, кампестерол, стигмастерол, стигмастанол, -ситостанол, ситостанол, десмостерол, халинастерол, пориферастерол, клионастерол или брассикостерол. Настоящее изобретение относится к способам рафинирования насыщенного масла, включающим в себя следующие стадии: (a) получение композиции, включающей в себя полипептид согласно изобретению, обладающий фосфолипазной активностью, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно изобретению; (b) получение композиции, включающей в себя масло, содержащее фосфолипид; и (c) приведение в контакт полипептида, полученного на стадии (a), и композиции, полученной на стадии(b), в условиях, когда полипептид может катализировать гидролиз фосфолипида в композиции. Полипептид может обладать активностью фосфолипазы С. Полипептид может проявлять активность фосфолипазы в водном растворе, добавляемом в композицию. Уровень воды может варьировать примерно от 0,5 до 5%. Время обработки может быть менее чем примерно 2 ч, менее чем примерно 60 мин, менее чем примерно 30 мин, менее чем примерно 15 мин или менее чем примерно 5 мин. Условия гидролиза могут включать в себя температуру в диапазоне примерно 25-70 С. Условия гидролиза могут включать в себя использование каустиков. Условия гидролиза могут включать в себя значения pH в диапазоне примерно от pH 3 до 10, примерно от pH 4 до 9, примерно от pH 5 до 8. Условия гидролиза могут включать в себя добавление эмульгаторов и/или перемешивание после контакта на стадии (c). Способы могут включать в себя добавление деэмульгатора и/или применение нагревания для ускорения отделения водной фазы. Способы могут включать в себя дегумирование перед проведением стадии контакта для сбора лецитина с проведением центрифугирования и последующего добавления ФЛС, ФЛС и/или ФЛА для удаления негидратируемых фосфолипидов. Способы могут включать в себя дегумирование неочищенного масла с помощью воды до содержания менее 10 м.д пищевых жиров, с последующей физической очисткой до содержания менее чем 50 м.д. биодизельных масел. Способы могут включать в себя добавление кислоты для облегчения гидратации негидратируемых фосфолипидов. Детали осуществления одного или более вариантов согласно изобретению указаны ниже в описании и прилагаемых рисунках. Другие особенности, цели и преимущества настоящего изобретения будут понятны из описания, рисунков и формулы изобретения. Все публикации, патенты, патентные заявки, последовательности из Генбанка (GenBank) и депозиты АТСС, процитированные в настоящем описании, включены в него в качестве ссылок. Краткое описание рисунков Приведенные рисунки являются иллюстративными, они даны для пояснения вариантов осуществления изобретения и не рассматриваются как ограничивающие область настоящего изобретения, охватываемого прилагаемой формулой изобретения. Фиг. 1 представляет собой блок-схему компьютерной системы, подробно описанной ниже. Фиг. 2 представляет собой схему, иллюстрирующую один аспект способа 200 сравнения новой нуклеотидной или белковой последовательности с последовательностями в базе данных для определения уровня гомологии между новой последовательностью и последовательностями из базы данных, как будет подробно описано ниже. Фиг. 3 представляет собой схему, иллюстрирующую один вариант осуществления способа настоящего изобретения с помощью компьютера для определения того, являются ли две последовательности гомологичными, как подробно описано ниже. Фиг. 4 представляет собой схему, иллюстрирующую один аспект описываемого способа, применяемого для выявления наличия данной характеристики в последовательности, что подробно описано ниже. На фиг. 5 А, 5 В и 5 С дана схематическая иллюстрация модели двухфазной системы, моделирующей ФЛС-опосредованное рафинирование, что подробно описано ниже в примере 2. На фиг. 6 схематически проиллюстрирован репрезентативный способ рафинирования растительного масла с использованием фосфолипаз согласно изобретению. На фиг. 7 схематически проиллюстрирован репрезентативный вариант осуществления способа рафинирования согласно изобретению до получения физически очищенных масел, что подробно описано ниже. На фиг. 8 схематически проиллюстрирован процесс гидролиза фосфатидов с использованием фосфолипазы С согласно изобретению, что подробно описано ниже. На фиг. 9 схематически проиллюстрировано применение фосфолипазы С согласно изобретению в качестве каустической очищающей добавки (Long Mix Caustic Refining), что подробно описано ниже. На фиг. 10 схематически проиллюстрировано применение фосфолипазы С согласно изобретению в качестве вспомогательного средства для дегумирования, что подробно описано ниже. Символы на различных рисунках относятся к соответствующим описанным в тексте элементам.- 15010903 Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к фосфолипазам (например, фосфолипазе А, В, С, D, пататиновым ферментам), к полинуклеотидам, кодирующим их, и к способам их получения и использования. Настоящее изобретение относится к ферментам, которые эффективно расщепляют сложноэфирную связь глицерофосфата в маслах, таких как растительные масла, например, в фосфолипидах масличных семян, с получением экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида. В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению обладают активностью ацилгидролазы липидов (АГЛ). В альтернативных аспектах фосфолипазы согласно изобретению могут расщеплять сложноэфирные связи глицерофосфата в фосфатидилхолине, фосфатидилэтаноламине, фосфатидилсерине и сфингомиелине. Фосфолипазы согласно изобретению (например, фосфолипаза А, В, С, D, пататиновые ферменты) могут использоваться для ферментативного дегумирования растительных масел за счет того, что фосфатный фрагмент становится растворимым в воде и может быть легко удален. Диглицеридный продукт остается в масле, что позволяет снизить потери. ФЛС согласно изобретению могут использоваться в дополнение или вместо ФЛА 1 и ФЛА 2 в процессе коммерческого рафинирования масла, таком как способ с использованием ENZYMAX, где фосфолипиды гидролизуются под действием ФЛА 1 и ФЛА 2. В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению активны при высокой и/или при низкой температуре или в широком диапазоне температур, например, они могут быть активны при температурах,варьирующих от 20 до 90 С, от 30 до 80 С и от 40 до 70 С. Настоящее изобретение также относится к фосфолипазам согласно изобретению, которые обладают активностью при щелочных pH или при кислыхpH, например в слабокислой воде. В альтернативных аспектах фосфолипазы согласно изобретению могут обладать активностью при кислых pH, таких как pH 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0 и pH 3,5. В альтернативных аспектах фосфолипазы согласно изобретению могут обладать активностью при щелочных pH, таких как pH 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 и 9,5. В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению активны в диапазоне температур примерно от 40 и примерно до 70 С в условиях низкой активности воды (при низком содержании воды). Настоящее изобретение также относится к способам дальнейшей модификации репрезентативных фосфолипаз согласно изобретению с получением ферментов с желательными свойствами. Например,фосфолипазы, получаемые по способу настоящего изобретения, могут обладать измененными характеристиками, например, измененными субстратной специфичностью, специфичностью связывания с субстратом, характеристиками расщепления субстрата, термостабильностью, профилем pH/активность,профилем pH/стабильность (таким, как повышенная стабильность при низких значениях pH, например,при pH6 или pH5, или при высоких значениях pH, например, при pH9), стабильностью к окислению,Са 2+-зависимостью, удельной активностью и т.п. Настоящее изобретение относится к изменению любого интересующего свойства. Например, изменение может приводить к получению варианта, который в сравнении с исходной фосфолипазой обладает измененным профилем зависимости активности от pH и температуры. В одном аспекте фосфолипазы согласно изобретению могут использоваться на разных стадиях обработки растительного масла, таких как экстракция растительного масла, в частности, удаление фосфолипидных камедей в процессе, называемом дегумированием масла, в соответствии с настоящим описанием. Для получения растительных масел могут использоваться разные источники, такие как соевые бобы, рапс, арахис, кунжут, подсолнечник и кукуруза. Фосфолипазы согласно изобретению могут использоваться вместо ФЛА, например, фосфолипазы А 2, на любой стадии обработки растительного масла. Определения. Термин фосфолипаза охватывает ферменты, обладающие любой фосфолипазной активностью,например активностью по расщеплению сложноэфирной связи глицерофосфата (посредством каталитического гидролиза сложноэфирной связи глицерофосфата), например, в масле, таком как растительное масло. Фосфолипазная активность согласно изобретению может приводить к образованию экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида. Фосфолипазная активность согласно изобретению включает в себя также гидролиз сложноэфирной связи глицерофосфата при высоких температурах, низких температурах, щелочных pH и кислых pH. Термин фосфолипазная активность/активность фосфолипазы также включает в себя расщепление глицерофосфатного сложного эфира с образованием экстрагируемого водой фосфорилированного основания и диглицерида. Термин фосфолипазная активность/активность фосфолипазы также включает в себя разрыв сложноэфирных связей глицерина и фосфорной кислоты в фосфолипидах. Термин фосфолипазная активность/активность фосфолипазы также включает в себя другие виды активности, такие как способность связываться с субстратом, таким как масло, например растительное масло, субстрат также включает в себя фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилсерины и сфингомиелины из растений и животных. Фосфолипазная активность/активность фосфолипазы может также включать в себя активность фосфолипазы С (ФЛС),активность фосфолипазы А (ФЛА), такой как фосфолипаза А 1 или фосфолипаза А 2, активность фосфолипазы В (ФЛВ), такой как фосфолипаза В 1 или фосфолипаза В 2, активность фосфолипазы D (ФЛD),такой как активность фосфолипазы D1 или фосфолипазы D2. Фосфолипазная активность/активность фосфолипазы может включать в себя гидролиз гликопротеина, например, гликопротеина из картофель- 16010903 ных клубней или любого растения из рода Solanum, например Solanum tuberosum. Фосфолипазная активность может включать в себя ферментативную активность пататина, такую как пататин-эстеразная активность (см., например, Jimenez (2002) Biotechnol. Prog. 18:635-640). Фосфолипазная активность может включать в себя активность ацилгидролазы липидов (АГЛ). Термин антитело включает в себя пептид или полипептид, полученный, далее смоделированный или по существу кодируемый геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулина или их фрагментами, способный к специфическому связыванию антигена или эпитопа (см., например, Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97). Термин антитело включает в себя антигенсвязывающие части, например антигенсвязывающие сайты (например, фрагменты, подпоследовательности, комплементарные гипервариабельные участки (ГВУ, которые сохраняют способность связывать антиген, включая (i) Fab-фрагмент, неполный фрагмент, состоящий из VL-, VH-, CL- и CHIдоменов; (ii) F(ab')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, включающий в себя два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из VH- и CH1 доменов; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из VL- и VH-доменов одиночного плеча антитела; (v) dAbфрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из VH-домена; и (vi) выделенный комплементарный гипервариабельный участок (ГВУ). Одноцепочечные антитела также включаются в понятие термина антитело в качестве ссылок. Термины матрица, или микроматрица, или биосхема, или схема в контексте настоящего описания означают множество целевых элементов, где каждый целевой элемент включает в себя определенное количество одного или более полипептидов (включая антитела) или нуклеиновых кислот, иммобилизованных на определенной площади поверхности субстрата, что подробно описано ниже. В контексте настоящего описания термины компьютер, компьютерная программа и процессор используются в самом широком общем контексте и включают в себя все устройства такого рода,что подробно описано ниже. Фразы кодирующая последовательность или последовательность кодирует в отношении определенного полипептида или белка означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется и транслируется в полипептид или белок, функционирующий под контролем соответствующих регуляторных последовательностей. Термин экспрессирующая кассета в контексте настоящего описания относится к нуклеотидной последовательности, которая способна воздействовать на экспрессию структурного гена (например, последовательности, кодирующей белок, такой как фосфолипаза согласно изобретению) в хозяйском организме, совместимом с такими последовательностями. Экспрессирующие кассеты включают в себя, по меньшей мере, промотор, оперативно связанный с последовательностью, кодирующий полипептид; и необязательно с другими последовательностями, например, содержащими сигналы терминации транскрипции. Могут также использоваться дополнительные факторы, необходимые или благоприятные в плане воздействия на экспрессию, например энхансеры. Фраза оперативно связанный в контексте настоящего описания относится к связи промотора по ходу транскрипции последовательности ДНК такой,что промотор опосредует транскрипцию последовательности ДНК. Таким образом, экспрессирующая кассета также включает в себя плазмиды, векторы экспрессии, рекомбинантные вирусы, любые формы вектора на основе рекомбинантной оголенной ДНК и т.п. Термин вектор включает в себя нуклеиновую кислоту, которая может инфицировать, трансфицировать или временно или постоянно трансдуцировать клетку. Известно, что вектор может представлять собой оголенную нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в составе комплекса с белком или липидом. Вектор необязательно включает в себя вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты, и/или белки, и/или мембраны (например, клеточные мембраны, липидную оболочку вируса и т.п.). Векторы включают в себя, без ограничения, репликоны(например, РНК-репликоны, бактериофаги), к которым могут быть присоединены фрагменты ДНК, реплицируясь при этом. Таким образом, векторы включают в себя, не ограничиваясь ими, РНК, автономную самореплицирующуюся кольцевую или линейную ДНК или РНК (например, из плазмид, вирусов и т.п.,см., например, патент США 5217879), охватывая как экспрессирующие плазмиды, так и неэкспрессирующие плазмиды. В том случае, когда в качестве организма-хозяина для вектора экспрессии описывается рекомбинантный микроорганизм или клеточная культура, указанный термин включает в себя и внехромосомную кольцевую, и линейную ДНК, и ДНК, которая была включена в хозяйскую(ие) хромосому(ы). В том случае, когда вектор поддерживается в хозяйской клетке, данный вектор может подвергаться либо стабильной репликации в клетках во время митоза в качестве автономной структуры, либо может быть включен в геном организма-хозяина. Плазмиды обозначаются малой буквой р, стоящей перед или после заглавных букв и/или номеров. Рассматриваемые в настоящем описании исходные плазмиды представляют собой либо коммерчески доступные, либо доступные широкому кругу людей без ограничений, либо могут быть сконструированы из доступных плазмид в соответствии с опубликованными методиками. Кроме того, описаны плазмиды, эквивалентные приведенным в настоящем изобретении, и все они известны специалистам в дан- 17010903 ной области. Термин ген означает сегмент ДНК, участвующий в образовании полипептидной цепи, включая в том числе участки перед и после кодирующей области, такие как лидерная последовательность, трейлер,промотор и энхансер, а также, где это приемлемо, последовательности, не содержащие кодонов, или интроны, разделяющие кодирующие части генов, или экзоны. Фразы нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновой кислоты в контексте настоящего описания относятся к олигонуклеотиду, нуклеотиду, полинуклеотиду или к любому их фрагменту, к ДНК или РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК, иРНК) геномного происхождения или полученным в результате синтеза, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут представлять собой смысловую или антисмысловую цепи, к пептидной нуклеиновой кислоте (ПНК) или любому ДНК-подобному или РНК-подобному материалу природного или синтетического происхождения,которые включают в себя, например, иРНК, рибонуклеопротеины (например, двухцепочечные иРНК,например, иРНП). Указанный термин включает в себя нуклеиновые кислоты, например, олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. Термин также включает в себя структуры,подобные нуклеиновым кислотам, с синтетическим скелетом (см., например, Mata (1997) Toxicol. Appl,Phermacol. 144: 189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36: 8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156). В контексте настоящего описания фразы аминокислота или аминокислотная последовательность относятся к последовательности олигопептида, пептида, полипептида или белковой последовательности, или к их фрагменту, части или субъединице, в том числе к природным или синтетическим молекулам. Термины полипептид и белок в контексте настоящего описания относятся к аминокислотам,присоединенным друг к другу посредством пептидной связи или модифицированной пептидной связи,например, пептидные изостеры, и могут содержать модифицированные аминокислоты, отличные от 20 аминокислот, кодируемых генами. Термин полипептид также включает в себя фрагменты пептидов и полипептидов, мотивы и т.п. Термин также включает в себя гликозилированные полипептиды. Пептиды и полипептиды согласно изобретению также включают в себя все имитирующие и пептид-имитирующие формы (миметики и пептидомиметики), подробно описанные ниже. В контексте настоящего описания термин выделенный указывает на то, что материал был изъят из своего исходного окружения (например, из природного окружения, если это природный компонент). Например, природный полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом организме животного,не является выделенными, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех присутствующих вместе с ним в природной системе материалов, является выделенным. Такие полинуклеотиды могут составлять часть вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут быть составной частью композиции и представлять собой выделенный компонент в таком векторе или композиции, так как они не являются частью природного окружения. В контексте настоящего описания выделенные материал или композиция могут также быть очищенной композицией, при этом не подразумевается достижение абсолютной чистоты, скорее данный термин используется как относительное понятие. Индивидуальные нуклеиновые кислоты, получаемые из библиотеки, могут быть очищены традиционным способом до электрофоретической гомогенности. В альтернативных аспектах настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые могут быть выделены и очищены из геномной ДНК или других последовательностей, имеющихся в библиотеке или другом окружении, с достижением по меньшей мере одного, двух, трех, четырех, пяти или более порядков чистоты. В контексте настоящего описания термин рекомбинантный означает, что нуклеиновая кислота примыкает к скелету нуклеиновой кислоты, к которому она не примыкает в природном окружении. В одном аспекте нуклеиновые кислоты представляют 5% или более от числа вставок нуклеиновой кислоты в популяции скелетных молекул нуклеиновой кислоты. Скелетные молекулы согласно изобретению включают в себя нуклеиновые кислоты, такие как вектор экспрессии, самореплицирующиеся нуклеиновые кислоты, вирусы, интегрирующиеся нуклеиновые кислоты и другие векторы или нуклеиновые кислоты, используемые для поддержания или для манипуляции интересующих вставок нуклеиновой кислоты. В одном аспекте обогащенные нуклеиновые кислоты составляют 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или более от числа вставок нуклеиновой кислоты в популяции рекомбинантных скелетных молекул. Термины рекомбинантные полипептиды или белки относятся к полипептидам или белкам, получаемым методами рекомбинантной ДНК, например, получаемые из клеток, трансформированных конструкций экзогенной ДНК, кодирующей желательный полипептид или белок. Синтетические полипептиды или белки представляют собой такие молекулы, которые получают химическим синтезом, что подробно описано ниже. Промоторная последовательность оперативно связана с кодирующей последовательностью в том случае, когда РНК-полимераза, которая инициирует транскрипцию на участке промотора, траскрибирует кодирующую последовательность в мРНК, что подробно описано ниже. Термин олигонуклеотид относится к одноцепочечному полидезоксинуклеотиду или к двум комплементарным полидезоксинуклеотидным цепям, которые могут быть получены путем химического- 18010903 синтеза. Такие синтетические олигонуклеотиды не содержат 5'-фосфат, и в этой связи не будут лигировать с другим олигонуклеотидом при добавлении фосфата с получением АТФ в присутствии киназы. Синтетический олигонуклеотид будет лигировать с фрагментом, который не был дефосфорилирован. Фраза по существу идентичные в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов относится к двум или более последовательностям, которые характеризуются по меньшей мере 50, 60, 70, 75,80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичностью нуклеотидов или аминокислотных остатков (в последовательности) при сравнении и согласовании, с целью максимального соответствия, по любому известному логарифму сравнения последовательностей, что будет подробно описано ниже, или путем визуальной оценки. В альтернативных аспектах изобретение относится к последовательностям нуклеиновой кислоты и полипептида, характеризующимся по существу идентичностью репрезентативной последовательности согласно изобретению, например SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и т.п., на участке, составляющем примерно 100 остатков,150 остатков, 200 остатков, 300 остатков, 400 остатков, или на участке, варьирующем примерно от 50 остатков до полной длины нуклеиновой кислоты или полипептида. Последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть по существу идентичными на всей длине участка, кодирующего полипептид. Дополнительно, по существу идентичная аминокислотная последовательность представляет собой последовательность, которая отличается от эталонной последовательности одним или более консервативных или неконсервативных замещений, делеций или вставок аминокислот, особенно если такое замещение осуществляется в сайте, отличном от активного центра молекулы, и при условии, что полипептид по существу сохраняет свои функциональные свойства. Консервативное замещение аминокислот включает в себя, например, замещение одной аминокислоты другой аминокислотой того же класса (например, замещение одной гидрофобной аминокислоты, такой как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другой гидрофобной аминокислотой, или замещение одной полярной аминокислоты другой полярной аминокислотой, такое как замещение лизина аргинином, аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой или аспарагина глутамином). Одна или более аминокислот могут быть делетированы, например,из полипептида фосфолипазы, что приводит к модификации структуры полипептида без существенного изменения его биологической активности. Например, могут быть удалены аминокислоты на амино- или карбоксильном конце, которые не требуются для проявления биологической активности фосфолипазы. Модифицированные последовательности полипептидов согласно изобретению могут быть проанализированы на наличие биологической активности фосфолипазы с использованием множества способов,включающих в себя приведение в контакт модифицированной последовательности полипептида с фосфолипазным субстратом с последующим определением того, будет ли такой модифицированный полипептид снижать количество специфического субстрата в реакционной среде или повышать уровень биопродуктов в ферментативной реакции, осуществляемой функциональной фосфолипазой, на данном субстрате, что подробно описано ниже. Термин гибридизация относится к способу, с помощью которого цепь нуклеиновой кислоты соединяется с комплементарной цепью посредством спаривания оснований. Реакции гибридизации могут быть чувствительными и селективными, так что конкретная интересующая последовательность может быть идентифицирована даже в образцах, в которых она присутствует в низких концентрациях. Соответствующие жесткие условия могут быть заданы, например, концентрациями соли или формамида в растворах, используемых перед гибридизацией, или в процессе гибридизации, или температурой гибридизации, и все они хорошо известны специалистам в данной области. Например, уровень жесткости может быть повышен за счет уменьшения концентрации соли, повышения концентрации формамида или повышения температуры гибридизации, а также изменения времени проведения гибридизации, что подробно описано ниже. В альтернативных аспектах нуклеиновые кислоты согласно изобретению определяют по их способности гибридизоваться в условиях различной жесткости (например, в условиях высокой, средней и низкой жесткости), что подробно описано ниже. Термин вариант относится к полинуклеотидам или полипептидам согласно изобретению, модифицированным по одному или более парам оснований, кодонам, интронам, экзонам или аминокислотным остаткам (соответственно), при сохранении биологической активности фосфолипазы согласно изобретению. Указанные варианты могут быть получены с помощью множества способов, включая такие способы, как, например, склонная к ошибкам ПЦР, перестановка, направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, сборка с использованием ПЦР, мутагенез с использованием механизма спаривания в рамках ПЦР, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный согласованный мутагенез, экспоненциальный согласованный мутагенез, сайт-специфичный мутагенез, вторичная сборка генов, генный мутагенез по механизму насыщения сайтов (ГМНС (GSSM и их сочетание. Методики получения вариантов фосфолипаз, обладающих активностью, например, при значениях pH или температуры, которые отличаются от соответствующих параметров для фосфолипазы дикого типа, также включены в настоящее описание. Термин мутагенез по механизму насыщения, или ГМНС (GSSM), включает в себя способ, в котором используются вырожденные олигонуклеотидные праймеры для введения точечных мутаций в по- 19010903 линуклеоотид, что подробно описано ниже. Термин система оптимизированной направленной эволюции, или оптимизированная направленная эволюция, включает в себя способ вторичной сборки фрагментов родственных последовательностей нуклеиновой кислоты, например, родственных генов, что подробно описано ниже. Термин повторная сборка по механизму синтеза с использованием лигирования, или ПСЛ(SLR), включает в себя способ лигирования олигонуклеотидных фрагментов в нестохастическом режиме, что подробно описано ниже. Получение нуклеиновых кислот и манипулирование ими. Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам (например, к репрезентативным последовательностям SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ IDNO:105), включая экспрессирующие кассеты, такие как векторы экспрессии, кодирующие полипептиды и фосфолипазы согласно изобретению. Настоящее изобретение также включает в себя способы выявления новых последовательностей фосфолипазы с использованием нуклеиновых кислот согласно изобретению. Включаются также способы модификации нуклеиновых кислот согласно изобретению, например,посредством синтеза с использованием реакции лигирования, системы оптимизированной направленной эволюции и/или мутагенеза по механизму насыщения. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть получены, выделены и/или использованы для манипуляций, например, путем клонирования и экспрессии библиотек кДНК, амплификации транскрипта или геномной ДНК посредством ПЦР и т.п. В практике осуществления способов настоящего изобретения гомологичные гены могут быть модифицированы манипулированием матричной нуклеиновой кислотой, что подробно описано ниже. Настоящее изобретение может быть осуществлено в сочетании с любым способом или процедурой или устройством, которые известны в данной области техники и описаны в научной и патентной литературе. Основные методики. Нуклеиновые кислоты, используемые в практике осуществления настоящего изобретения, независимо от их природы: РНК, иРНК, антисмысловая нуклеиновая кислота, кДНК, геномная ДНК, векторы,вирусы или их гибриды - могут быть выделены из множества источников, получены генно-инженерными методами, амплифицированы и/или экспрессированы/получены рекомбинантными методами. Рекомбинантные полипептиды, получаемые на основе таких нуклеиновых кислот, могут быть выделены в индивидуальном виде или могут быть клонированы и проанализированы на наличие желательной активности. Может использоваться любая рекомбинантная система экспрессии, включающая системы экспрессии в клетках бактерий, млекопитающих, дрожжей, насекомых или растений. Альтернативно, указанные нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы in vitro в соответствии с известными методиками химического синтеза, описанными в литературе (например, Adams (1983) J.(1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; Патент США 4458066). Методики работы с нуклеиновыми кислотами, такие как, например, субклонирование, мечение зондами (например, мечение случайным праймером с использованием полимеразы Кленова, никтрансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и т.п., хорошо описаны в научной и патентной литературе (см., например, Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. ), Vols. 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John WileyWith Nucleic Acids Probes, Part I. Theory and Nucleic Acids Preperation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993. Другие способы получения и работы с нуклеиновыми кислотами, используемые в практике осуществления настоящего изобретения, включают в себя клонирование из геномных образцов и, при желании,скрининг и повторное клонирование вставок, выделенных или амплифицированных на основе, например,геномных клонов или клонов кДНК. Источники нуклеиновой кислоты, используемые в способах настоящего изобретения, включают в себя библиотеки геномной ДНК или кДНК, содержащиеся, например,в искусственных хромосомах млекопитающих (MAC) (см., например, патенты США 5721118; 6025155), искусственных хромосомах человека (см., например, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335),искусственных хромосомах дрожжей (YAC), бактериальных искусственных хромосомах (ВАС), искусственных хромосомах Р 1 (см., например, Woon (1998) Genomics 50:306-316), P1-производных векторах- 20010903 В одном аспекте нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид согласно изобретению, собирают в соответствующей фазе с лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслированного полипептида или его фрагмента. Настоящее изобретение относится к белкам слияния и к нуклеиновым кислотам, кодирующим их. Полипептид согласно изобретению может быть слит с гетерологичным пептидом или полипептидом,таким как N-концевые идентифицирующие пептиды, которые придают желательные характеристики,такие как повышенная стабильность или упрощенная очистка. Пептиды и полипептиды согласно изобретению могут также быть синтезированы и экспрессированы в виде белков слияния с присоединенными к ним одним или более дополнительными доменами, с целью, например, получения более иммуногенного пептида, с целью более легкого выделения синтезированного рекомбинантными методами пептида, для идентификации и выделения антител и антителоэкспрессирующих В-клеток и т.п. Домены, облегчающие выявление и очистку, включают в себя, например, металлхелатирующие пептиды, такие как полигистидиновые тракты и гистидин-триптофановые модули, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, который позволяют проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе FLAGS удлинения/аффинной очистки (ImmunexCorp, Seattle WA). Включение расщепляемых линкерных последовательностей, таких как фактор Xa или энтерокиназа (Invitrogen, San Diego СА), между доменом, вводимым для очистки, и пептидом или полипептидом, включающим в себя мотив, способствует облегчению очистки. Например, вектор экспрессии может включать в себя последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эпитоп, связанный с шестью гистидиновыми остатками, за которыми следует тиоредоксин и сайт расщепления энтерокиназой(см., например, Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414). Гистидиновые остатки облегчают выявление и очистку, тогда как сайт расщепления энтерокиназы обеспечивает средство, позволяющее очищать эпитоп из оставшейся части белка слияния. Методики, относящиеся к векторам, кодирующим белки слияния, и к применению таких белков слияния, хорошо описаны в научной и патентной литературе (см., например, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53). Контрольные последовательности транскрипции и трансляции. Настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот (например, ДНК) согласно изобретению, оперативно связанным с контрольной(ыми) последовательностью(ями) экспрессии (например, транскрипции или трансляции), например, промоторами или энхансерами для направления или модуляции синтеза/экспрессии РНК. Контрольная последовательность экспрессии может находиться в векторе экспрессии. Примеры бактериальных промоторов включают в себя lacI, lacZ, T3, Т 7,gpt, lambda PR, PL и trp. Примеры промоторов эукариотического происхождения включают в себя предранний промотор CMV, тимидинкиназу HSV, ранний и поздний промотор SV40, LTR из ретровируса и металлотионеин I мыши. Промоторы, подходящие для экспрессии полипептида в бактериях, включают в себя lac или trp промоторы Е. coli, lacI промотор, lacZ промотор, Т 3 промотор, Т 7 промотор, gpt промотор, лямбда PR промотор, лямбда PL промотор, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3-фосфоглицераткиназа (ФГК), и промотор кислой фосфатазы. Эукариотические промоторы включают в себя предранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, промоторы белков теплового шока, ранний и поздний промоторы SV40, LTR из ретровирусов и промотор металлотионеина I мыши. Могут также использоваться другие известные промоторы для контроля экспрессии генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах. Векторы экспрессии и клонирующие носители. Настоящее изобретение относится к векторам экспрессии и клонирующим носителям, которые включают в себя нуклеиновые кислоты согласно изобретению, например, последовательности, кодирующие фосфолипазы согласно изобретению. Векторы экспрессии и клонирующие носители согласно изобретению могут включать в себя вирусные частицы, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагемиды, космиды, фосмиды, бактериальные искусственные хромосомы, вирусные ДНК (например, вирус осповакцины,аденовирус, вирус оспы птиц, вирус псевдобешенства и производные SV40), искусственные хромосомы на основе Р 1, дрожжевые плазмиды, искусственные хромосомы дрожжей и любые другие векторы, специфичные для конкретных интересующих хозяйских организмов (таких, как бациллы, Aspergillus и дрожжи). Векторы согласно изобретению могут включать в себя последовательности хромосомной ДНК,внехромосомной ДНК и синтетической ДНК. Специалистам в данной области известно большое число подходящих коммерчески доступных векторов. Примеры таких векторов включают в себя из числа бактериальных - pQE-векторы (Qiagen), плазмиды pBluescript, pNH-векторы (векторы ламбда-ZAP(Stratagene; ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); из числа эукариотических - pXT1, pSG5(Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Однако может использоваться любая другая плазмида или любой другой вектор, при условии, что они реплицируются и жизнеспособны в хозяйском организме. В настоящем изобретении могут использоваться как низкокопийные векторы, так и высококопийные векторы. Вектор экспрессии может включать в себя промотор, сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор может также включать в себя соответствующие после- 21010903 довательности для амплификации экспрессии. Векторы экспрессии млекопитающих могут содержать ориджин репликации, любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донор сплайсинга и акцепторные сайты, а также последовательности терминации транскрипции и 5'фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах последовательности ДНК получают при сплайсинге SV40 и могут использоваться сайты полиаденилирования для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов. В одном аспекте векторы экспрессии содержат один или более селектируемых маркерных генов для осуществления селекции хозяйских клеток, содержащих данный вектор. Такие селектируемые маркеры включают в себя гены, кодирующие дигидрофолятредуктазу, гены, придающие устойчивость к неомицину культуре эукариотических клеток, гены, придающие клеткам Е. coli устойчивость к тетрациклину или ампициллину, и ген TRP1 в клетках S. cerevisiae. Промоторные участки могут быть выделены из любого желательного гена с использованием хлорамфениколтрансферазных (ХАТ (CAT векторов или других векторов с селектируемыми маркерами. Векторы, подходящие для экспрессии полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках,могут также содержать энхансеры для повышения уровня экспрессии. Энхансеры и cis-активные элементы ДНК обычно имеют длину примерно от 10 и примерно до 300 п.н. и действуют на промотор, повышая его транскрипцию. Примеры включают в себя энхансер SV40 на дальней стороне ориджина репликации на участке от 100 до 270 п.н., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на дальней стороне ориджина репликации и энхансер аденовируса. Последовательность ДНК может быть встроена в вектор с помощью различных процедур. В основном последовательность ДНК лигируют в желательном положении в векторе с последующим расщеплением вставки и вектора соответствующими рестрикционными эндонуклеазами. Альтернативно, оба конца вставки делают тупыми, и тогда вектор может быть лигирован. В данной области известно множество методик клонирования, например, описанных в работе Аусубеля и Самбрука (Ausubel and Sambrook). Такие процедуры, как и ряд других, известны специалистам в данной области. Вектор может иметь вид плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают в себя последовательности хромосомной ДНК, внехромосомной ДНК и синтезированной ДНК, производныеSV40; бактериальные плазмиды, фаговые ДНК, бакуловирус, дрожжевые плазмиды, векторы, полученные на основе сочетаний плазмид и фаговых ДНК, ДНК вирусов, таких как вирус осповакцины, аденовирус, вирус оспы птиц и вирус псевдобешенства. Описано, например, Самбруком (Sambrook), множество векторов клонирования и экспрессии для использования в работе с прокариотическими и эукариотическими хозяйскими организмами. Конкретные бактериальные векторы, которые могут использоваться, включают в себя коммерчески доступные плазмиды, содержащие элементы хорошо известного вектора клонирования pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Уппсала, Швеция), GEM1 (Promera Biotec, Madison, WI,США), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A,pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 и pCM7. Конкретные эукариотические векторы включают в себя pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3,pBPV, pMSG и pSVL (Pharmacia). Однако может использоваться любой другой вектор при условии, что он реплицируется и жизнеспособен в хозяйской клетке. Хозяйские клетки и трансформированные клетки. Настоящее изобретение относится также к трансформированной клетке, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, например последовательность, кодирующую фосфолипазу согласно изобретению, вектор согласно изобретению. Хозяйская клетка может представлять собой любые хозяйские клетки, известные специалистам в данной области, включая как прокариотические клетки, так и эукариотические клетки, такие как бактериальные клетки, грибковые клетки,клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Примеры бактериальных клеток включают в себя Е. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Salmonella typhimirium, a также различные виды рода Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus. Примеры клеток насекомых включают в себя клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9. Примеры клеток млекопитающих включают в себя CHO,COS или меланому Bowes или любые другие линии клеток мыши или человека. Выбор подходящего организма хозяина доступен специалисту в данной области. Вектор может быть введен в хозяйские клетки с использованием множества методик, включая трансформацию, трансфекцию, трансдукцию, вирусную инфекцию, обстрел генными конъюгатами илиTi-опосредованный перенос генов. Конкретные способы включают в себя трансфекцию с использованием фосфата кальция, трансфекцию, опосредованную ДЭАЭ-декстраном, липофекцию или электропорацию (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, 1986). Так, где это приемлемо, полученные генно-инженерными методами хозяйские клетки могут культивироваться в традиционных питательных средах, модифицированных, как это требуется, для активации промоторов, выбранных трансформантов или амплифицированных генов согласно изобретению. После трансформации соответствующего хозяйского штамма и роста хозяйского штамма до нужной плотности клеток выбранный промотор может быть далее индуцирован соответствующими способами(например, путем изменения температуры или химической индукции), и клетки могут культивироваться в течение дополнительного периода времени для образования желательного полипептида или его фрагмента. Клетки могут быть собраны центрифугированием, разрушены с использованием физических или химических методов, и полученный неочищенный экстракт сохраняется для дальнейшей очистки. Микробные клетки, используемые для экспрессии белков, могут быть разрушены традиционным способом,включая цикл замораживание-оттаивание, озвучивание, механическое разрушение, использование лизирующих средств. Такие методы хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессированный полипептид или его фрагмент может быть выделен из культуры рекомбинантных клеток и подвергнут очистке способами, включая осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на лектине. При необходимости, могут использоваться также стадии проведения повторной укладки белка для придания нужной конфигурации полипептиду. Если желательно, на конечных стадиях очистки может использоваться высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Могут использоваться различные системы культивирования клеток млекопитающих для экспрессии рекомбинантного белка. Примеры систем экспрессии клеток млекопитающих включают в себя линииCOS-7 из фибробластов почки обезьяны и другие клеточные линии, способные к экспрессии белков на основе совместимого вектора, такие как клеточные линии С 127, 3 Т 3, CHO, HeLa и BHK. Конструкции в хозяйских клетках могут использоваться обычным способом для получения генного продукта, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В зависимости от природы организмахозяина, используемого в данной процедуре рекомбинантного синтеза, полипептиды, образованные хозяйскими клетками, содержащими вектор, могут быть гликозилированы или могут не подвергаться гликозилированию. Полипептиды согласно изобретению могут включать в себя или не включать в себя исходный остаток метионина. Системы бесклеточной трансляции также могут использоваться для получения полипептида согласно изобретению. В системах бесклеточной трансляции может использоваться мРНК, транскрибированная на основе конструкции ДНК, содержащей промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид или его фрагмент. В некоторых аспектах конструкция ДНК может быть линеаризована перед проведением реакции транскрипции in vitro. Далее транскрибированную мРНК инкубируют с соответствующим бесклеточным экстрактом для проведения трансляции, таким как экстракт ретикулоцитов кролика, с получением желательного полипептида или его фрагмента. Векторы экспрессии могут содержать один или более селектируемых маркерных генов, обеспечивающих фенотипический признак, подходящий для селекции трансформированных хозяйских клеток,такой как дигидрофолятредуктаза или устойчивость к неомицину в случае культуры эукариотических клеток или такой как устойчивость к тетрациклину или ампициллину в случае клеток Е. coli. Амплификация нуклеиновых кислот. В практике осуществления настоящего изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды согласно изобретению, или модифицированные нуклеиновые кислоты могут репродуцироваться,например, путем амплификации. Настоящее изобретение относится к последовательностям парных амплифицирующих праймеров, используемых для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды с фосфолипазной активностью. В одном аспекте парные праймеры способны к амплификации нуклеиновой кислоты согласно изобретению, содержащей, например, репрезентативную последовательность SEQ ID NO:1 или ее подпоследовательность; последовательность SEQ ID NO:3 или ее подпоследовательность; последовательность SEQ ID NO:5 или ее подпоследовательность; и последовательностьSEQ ID NO:7 или ее подпоследовательность и т.п. Любой специалист в данной области может разработать последовательность парных амплифицирующих праймеров для любой части указанной последовательности или ее полной длины. Настоящее изобретение относится к последовательности парных амплифицирующих праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, где указанный парный праймер способен к амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность согласно изобретению или ее фрагмент, или ее подпоследовательность. Один или каждый член последовательности парного амплифицирующего праймера может включать в себя олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере 10-50 следующих друг за другом оснований последовательности или примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 следующих друг за другом оснований последовательности. Настоящее изобретение относится к парным амплифицирующим праймерам, где парный праймер содержит в качестве первого члена последовательность, указанную примерно первыми (5') 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 остатками нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и второй член имеет последовательность, указанную примерно первыми (5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24 или 25 остатками комплементарной цепи для первого члена. Настоящее изобретение относится к фосфолипазам, получаемым при амплификации, например, путем полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР),- 23010903 с использованием парного амплифицирующего праймера согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к способам получения фосфолипазы в результате амплификации, например, путем полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР), с использованием парного амплифицирующего праймера согласно изобретению. В одном аспекте парный амплифицирующий праймер проводит амплификацию нуклеиновой кислоты из библиотеки, например, из библиотеки генов, такой как библиотека окружающей среды. Реакции амплификации могут использоваться для количественного определения содержания нуклеиновой кислоты в образце (такого, как количество транскрипта в клеточном образце), мечения нуклеиновой кислоты (например, путем добавления ее к матрице или носителю в блоттинг-анализе), выявления нуклеиновой кислоты или количественного определения содержания конкретной нуклеиновой кислоты в образце. В одном аспекте настоящего изобретения транскрипт, выделенный из клетки или библиотеки кДНК, подвергается амплификации. Любой специалист в данной области может выбрать и разработать соответствующие олигонуклеотидные праймеры для амплификации. Способы амплификации хорошо известны в технике и включают в себя, например, полимеразно-цепьевую реакцию ПЦР (см., например,PCR Protocolos, A Guide To Methods And Application, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) and PCR(1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117), амплификацию на стадии транскрипции (см., например, Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173), самоподдерживаемую репликацию последовательности (см., например, Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874), амплификацию с участием репликазы Q Beta (см., например, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1492); автоматизированный тест на амплификацию репликазой Q Beta (см., например, BurgAusubel; Патенты США 4683195 и 4683202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564). Определение степени идентичности последовательности. Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, содержащим последовательности, характеризующиеся по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью репрезентативной последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению (например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106) на участке, включающем по меньшей мере примерно 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900,950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 или более остатков. Настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим последовательности, характеризующиеся по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности репрезентативного полипептида согласно изобретению. Степень идентичности последовательностей (гомологии) может быть определена с использованием любой компьютерной программы на основе соответствующих параметров, включая описанные в настоящем изобретении, такой как BLAST 2.2.2. или FASTA версия 3.0t78, в которых используются фиксированные значения параметров, заданные по умолчанию. В альтернативных вариантах идентичность последовательностей может охватывать область, включающую в себя по меньшей мере примерно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 350, 400 последовательных остатков или распространяться на всю длину нуклеиновой кислоты или полипептида. Протяженность идентичности последовательностей (гомологии) может быть определена с использованием любой компьютерной программы на основе соответствующих параметров, включая описанные в настоящем изобретении, такой как BLAST 2.2.2. или FASTA версия 3.0t78, в которых используются фиксированные значения параметров, заданные по умолчанию.- 24010903 Гомологичные последовательности также включают в себя последовательности РНК, в которых уридины замещают тимины в последовательностях нуклеиновых кислот. Гомологичные последовательности могут быть получены с использованием любой приведенной в настоящем описании процедуры и могут представлять собой результат коррекции ошибок секвенирования. Следует понимать, что последовательности нуклеиновых кислот, указанные в настоящем описании, могут быть представлены в традиционном однобуквенном варианте (см., например, Stryer, Lubert, Biochemisrty, 3rd Ed., W.H. FreemanCo., New York) или в любом другом формате, который позволяет записать идентичность нуклеотидов в последовательности. В данном аспекте изобретения могут использоваться разные программы сравнения последовательностей, приведенные в настоящем описании. Идентичность последовательностей белков и/или нуклеиновых кислот (гомология) может быть оценена с использованием множества алгоритмов сравнения последовательностей и программ, известных в данной области. Такие алгоритмы и программы включают в себя, без ограничения, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA и CLUSTALW (Pearson and Lipman, Proc.et al., J. Mol. Biol. 215(3): 403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3: 266-272, 1993). Гомология или идентичность могут быть измерены с использованием программного обеспечения для анализа последовательности (например, пакета программ компьютерной группы по генетике Центра Биотехнологии при Университете Висконсин для анализа последовательностей (Sequence Analysis Software Package of Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 UniversityAvenue, Madison, WI 53705. Указанное программное обеспечение выбирает сходные последовательности, присваивая определенное значение степени гомологии для разных делеций, замещений и других модификаций. Термины гомология и идентичность в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые выявлены как одинаковые при сравнении и сопоставлении с целью поиска максимального соответствия в окне сравнения или на разработанном участке, где указанный процент идентичности измеряют с использованием любого числа алгоритмов сравнения последовательностей, при ручном сопоставлении или путем физической оценки. Для целей сравнения последовательностей одна последовательность выполняет роль эталонной последовательности (примерами такой последовательности являются SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ IDNO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и т.п.), с которой сравнивают исследуемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей исследуемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости, присваивают координаты подпоследовательности и разрабатывают параметры программы работы с алгоритмом сравнения последовательностей. Может использоваться программа с параметрами, заданными по умолчанию, или могут быть разработаны альтернативные параметры. Далее алгоритм сравнения последовательностей позволяет вычислить процент идентичности исследуемых последовательностей эталонной последовательности на основе параметров используемой программы. Окно сравнения в контексте настоящего описания включает в себя отсылку к сегменту любого одного из множества соприкасающихся остатков. Например, в альтернативных аспектах настоящего изобретения соприкасающиеся остатки, количество которых варьирует от 20 до полной длины репрезентативной последовательности согласно изобретению, например SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и т.п., сравнивают с эталонной последовательностью, содержащей то же число соприкасающихся положений после оптимального сопоставления двух последовательностей. Если эталонная последовательность имеет требуемую идентичность репрезентативной последовательности согласно изобретению, т.е. характеризуется 50, 51, 52, 53,54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83,84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичностью последовательности согласно изобретению, например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и т.п., то данная последовательность входит в область настоящего изобретения. В альтернативных вариантах подпоследовательности, варьирующие примерно от 20 до 600, примерно от 50 до 200 и примерно от 100 до 150 соприкасающихся остатков, сравнивают с эталонной последовательностью с тем же числом соприкасающихся положений после оптимального сопоставления двух последовательностей. Методы сопоставления последовательностей для целей их сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное сопоставление последовательностей с целью их сравнения может быть проведено, например, по алгоритму определения локальной гомологии Смита и Ватермана (SmithWaterman, Adv. Appl, Math. 2:482, 1981), по алгоритму определения гомологии путем сопоставления по методу Нидлмана и Вунша (NeedlemanWunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970), путем поиска сходства по методу Персона и Липмана (PersonLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444,1988), по компьютеризированному варианту применения указанных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения компьютерной группы по генетике Центра Биотехноло- 25010903 гии при Университете Висконсин для анализа последовательностей (Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI или путем ручного сопоставления и визуальной оценки. Другие алгоритмы определения гомологии или идентичности включают в себя, например, в дополнение к программе BLAST (Инструмент поиска по базовому локальному сопоставлению Национального Центра биологической информации (Basic Local Alignment Searth Tool at the National Center for Biological Information, ALIGN, AMAS, (Анализ множества сопоставляемых последовательностей (Analysis(Protein Multiple Sequences Alignment, ASSET (Инструмент статистической оценки сопоставляемых сегментов (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool, BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Программа сравнительного анализа биологической последовательности (Biological Sequence Comparative AnalysisPoints, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, Алгоритм Смита-Ватермана (Smith-Waterman алгоритм), DARWIN, Лас-Вегас-алгоритм, FNAT (Улучшенный инструмент сопоставления нуклеотидов (Forced Nucleotide Aligned Tool, Framealign, Framesearch, DYNAMIC,FILTER, FSAP (Пакет анализа последовательностей Фристенского (Fristensky Sequence AnalysisPackage, GAP (Программа глобального сопоставления (Global Alignment Program, GENAL, GIBBS,GenQuest, ISSC (Чувствительная программа сравнения последовательностей (Sensitive Sequences Comparison, LALIGN (Программа локального сопоставления (Local Sequence Alignment, LCP (Программа определения локального содержания (Local Content Program, MACAW (Программа Воркбенка проведения множественного сопоставления, конструирования и анализа (Multiple Alignment, ConstructionAnalysis Workbench, MAP (Программа множественного сопоставления (Multiply Alignment Program,MBLKP, MBLKN, PIMA (Программа сопоставления множества последовательностей, функционирующих в зависимости от структуры фрагментов (Pattern-Induced Multi-Sequence Alignment, SAGA (Сопоставление последовательностей по генетического алгоритму (Sequence Alignment by Genetic Algorithm иWHAT-IF. Такие согласующие программы могут быть также использованы для скрининга геномных баз данных с целью идентификации полинуклеотидных последовательностей, обладающих по существу идентичными последовательностями. Доступно большое число геномных баз данных, например, значительная часть человеческого генома доступна в составе информационной базы, входящей в Проект секвенирования человеческого генома (Human Genome Sequencing Project (Gibbs, 1995. Ряд геномов был подвергнут секвенированию, например, М. genitalium (Fraser et al., 1995), M. jannaschii (Buit et al., 1996),H. influenzae (Fleischmann et al., 1995), E. coli (Blattner et al., 1997), дрожжей (S. cerevisiae) (Mewes et al.,1997) и D. melanogaster (Adams et al., 2000). Был достигнут значительный прогресс при секвенировании геномов модельного организма, такого как мышь, С. elegans и Arabadopsis sp. Базы данных, содержащие информацию о геномах, сопровождаемые сведениями функционального характера, поддерживаются разными организациями и доступны через интернет. В практике осуществления настоящего изобретения также используются алгоритмы BLAST, BLAST 2.0 и BLAST 2.2.2. Они описаны в литературе (см., например, Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410). Программное обеспечения для проведение анализов методом BLAST доступно через Национальный Центр биотехнологической информации. Данный алгоритм включает в себя идентификацию вначале пары последовательностей с высоким балльным показателем (HSP) путем идентификации коротких слов с длиной W в запрашиваемой последовательности, которая либо сразу позволяет отыскать соответствующий вариант, либо удовлетворяет некоторому пороговому положительному значению балльного показателя Т при сопоставлении со словом той же длины в базе данных последовательностей. Т относится к окружению порогового значения балльного показателя для данного слова (Altschul (1990), как указано выше). Такое исходное попадание в окружение слова действует как затравка для начальных этапов поиска, ведущая далее к нахождению более длинных HSP, содержащих их. Попадание слова распространяется в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько кумулятивный балльный показатель будет при сопоставлении повышаться. Кумулятивный балльный показатель рассчитывается с использованием, для нуклеотидных последовательностей, параметров М (присваиваемый балльный показатель для пары согласованных остатков, который всегда 0). В случае аминокислотных последовательностей используют матрицу для подсчета кумулятивного балльного показателя. Расширение данного попадания слова в каждом направлении прекращается в том случае, когда кумулятивный балльный показатель при сопоставлении уменьшается на величину X относительно максимального достигнутого значения; значение кумулятивного балльного показателя доходит до 0 или ниже за счет накопления одного или более результатов сопоставления остатков с отрицательными значениями балльного показателя или при достижении конца любой из последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, T и X определяют чувствительность и скорость сопоставления. Программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует в качестве заданного параметра по умолчанию длину слова (W) из 11 позиций,ожидаемое значение (Е), равное 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. В случае аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует в качестве заданного параметра по умолчанию длину слова 3 и значение ожидаемого результата (Е) 10, а также матрицу BLOSUM62 для вычисления балльного показателя (см. HenikoffHenikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) с использованием для- 26010903 сопоставлений параметра (В), равного 50, ожидаемого значения (Е), равного 10, М=5, N=-4 и сравнения обеих цепей. Алгоритм BLAST также осуществляет статистический анализ результатов поиска сходства двух последовательностей (см. KarlinAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873). Одним из критериев сходства, по алгоритму BLAST, является наименьшая сумма вероятностей (P(N, которая дает указание на вероятность того, что согласование между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может быть случайно достигнуто. Например, нуклеиновая кислота считается похожей на эталонную последовательность, если наименьшая сумма вероятностей при сравнении исследуемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой меньше чем примерно 0,2, более предпочтительно меньше чем примерно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше чем примерно 0,001. В одном аспекте изобретения гомологию между белковыми последовательностями и последовательностями нуклеиновой кислоты оценивают с использованием инструмента поиска по базовому локальному сопоставлению (BLAST). Например, может использоваться пять специфических программ для осуществления следующих задач: (1) BLASTP и BLAST3 проводят сравнение запрашиваемой аминокислотной последовательности в базе данных белковых последовательностей; (2) BLASTN проводит сравнение запрашиваемой нуклеотидной последовательности в базе данных нуклеотидных последовательностей; (3)BLASTX проводит сравнение продуктов шестирамочной трансляции запрашиваемой нуклеотидной последовательности (обе цепи) в базе данных белковых последовательностей; (4) TBLASTN проводит сравнение запрашиваемой белковой последовательности в базе данных нуклеотидных последовательностей, транслируемых во всех шести рамках считывания (для обеих цепей); и (5) TBLASTX проводит сравнение продуктов шестирамочной трансляции запрашиваемой нуклеотидной последовательности в базе данных по шестирамочной трансляции нуклеотидных последовательностей. Программа BLAST находит гомологичные последовательности путем идентификации сходных сегментов, которые рассматриваются как пары сегментов с высоким балльным показателем между запрашиваемой аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты и исследуемой последовательностью, которая предпочтительно была получена из базы данных белковых последовательностей или последовательностей нуклеиновой кислоты. Пары сегментов с высоким балльным показателем идентифицируют предпочтительно (например, сопоставляют) с помощью матрицы определения балльного показателя, многие из которых известны в данной области. Предпочтительно используемой для вычисления балльного показателя матрицей является матрица BLOSUN62 (Gonnet et al., Science 256:1443-1445; 1992;HenikoffHenikoff, Proteins 17:49-61, 1993). Менее предпочтительно, могут использоваться также матрицы РАМ или РАМ 250 (см., например, Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting DistanceRelationship: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical research Foundation). В одном аспекте настоящего изобретения для определения того, будет ли нуклеиновая кислота иметь идентичность по последовательности, требуемую для соответствия области настоящего изобретения, программы NCBI BLAST 2.2.2 используют параметры, заданные по умолчанию для BLASTP. В программе BLAST 2.2.2 имеется примерно 38 установленных параметров. В данном репрезентативном аспекте настоящего изобретения используются все значения, заданные по умолчанию, за исключением значения установки фильтрования (т.е. все параметры устанавливаются по умолчанию, за исключением параметра фильтрования, который устанавливается на значении OFF); вместо этого используется значение -F F, которое ограничивает фильтрование. Использование заданного значения фильтрования часто приводит к ситуации Карлина-Альтшуля шумового переполнения из-за короткой длины последовательности. Установленные по умолчанию значения, которые используют в репрезентативном аспекте согласно изобретению, включают в себя Фильтрование для слов низкой сложности: ON Размер слова: 3 Матрица: Blosum62 Балльное значение расхождения: наличие расхождения: 11 Удлинение:1 Другие заданные по умолчанию параметры включают в себя фильтр для слов низкой сложностиOFF, размер слова 3 для белка, матрица BLOSUM62, балльное значение удаления выявленного расхождения -11 и балльное значение удаления удлинения расхождения -1. Далее в примере 1 показан вариант настройки программы NCBI BLAST 2.2.2. В данном примере параметр -W установлен на значении 0. Это означает, что без соответствующей установки размер слова означает 3 для белков и 11 для нуклеотидов. Компьютерные системы и компьютерные программные продукты. Для целей выявления и идентификации в сравниваемых последовательностях наличия идентичности, структурной гомологии, мотивов и т.п. in silico последовательности согласно изобретению могут храниться, записываться и подвергаться манипуляциям в любой среде, которая может быть прочитана и оценена компьютером. Соответственно, настоящее изобретение относится к компьютерам, компьютерным системам, компьютерным читаемым средам, компьютерным программным продуктам и т.п., записывающим или хранящим в своей среде последовательности нуклеиновой кислоты и полипептидов со- 27010903 гласно изобретению, например, репрезентативную последовательность согласно изобретению, такую какID NO:8 и т.д. В контексте настоящего описания фразы записывается и хранится относятся к способу хранения информации в компьютерной среде. Специалист в данной области понимает и принимает любые известные способы записи информации на машиночитаемых носителях, направленные на создание продуктов, включающих в себя одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты и/или полипептидов согласно изобретению. Другой аспект настоящего изобретения относится к компьютерной читаемой среде, включающей в себя запись на ней информации по меньшей мере об одной последовательности нуклеиновой кислоты и/или полипептида согласно изобретению. Компьютерные читаемые среды включают в себя магнитные читаемые среды, оптические читаемые среды, электронные читаемые среды и магнитные/оптические читаемые среды. Например, компьютерные читаемые среды могут представлять твердый диск, флоппидиск, магнитную ленту, компакт-диск (CD-ROM), цифровой универсальный диск (DVD), оперативное запоминающее устройстве (ОЗУ (RAM или постоянное запоминающее устройстве (ПЗУ (ROM, а также другие типы или другие среды, известные в данной области техники. Аспекты настоящего изобретения включают в себя системы (например, системы, основанные на интернетном доступе), в частности компьютерные системы, которые хранят и позволяют манипулировать с последовательностями и последовательностью информации, описанной в настоящем изобретении. Один пример компьютерной системы 100 проиллюстрирован на блок-схеме, показанной на фиг. 1. В контексте настоящего описания фраза компьютерная система относится к аппаратным компонентам,программным компонентам и компонентам, используемым для хранения данных, используемых для анализа нуклеотидных или полипептидных последовательностей согласно изобретению. Компьютерная система 100 может включать в себя процессор для обработки, оценки информации о последовательности и манипуляции с нею. Процессор 105 может относиться к любому известному типу центральных процессорных устройств, таких как, например, Pentium III от Intel Corporation или аналогичный процессор отSun, Motorola, Compaq, AMD или International Bussines Machines. Компьютерная система 100 представляет собой основную целевую систему, которая включает в себя процессор 105 и один или более внутренних компонентов 110, предназначенных для хранения данных, используемых для запоминания информации, и один или более устройств для поиска информации в компонентах, содержащих введенную для запоминания информацию. Специалист в данной области понимает, что может быть пригодна также любая другая из доступных в настоящее время компьютерных систем. В одном аспекте компьютерная систем 100 включает в себя процессор 105, соединенный с шиной,которая, в свою очередь, соединена с основной памятью 115 (предпочтительно встроенной как ОЗУ) и одно или более внутренних устройств 110 для хранения данных, таких как жесткий драйвер и/или другие компьютерные читаемые среды, содержащие записанную на них информацию. Компьютерная система 100 может также включать в себя одно или более устройств 118 поиска данных для чтения данных, хранящихся во внутренних устройствах 110 хранения данных. Устройство 118 поиска данных может представлять собой, например, флоппи-диск, компакт-диск,магнитную ленту или модем, способный к соединению с удаленной системой хранения (например, через интернет) и т.п. В некоторых вариантах внутреннее устройство 110 хранения данных представляет собой удаленную компьютерную читаемую среду, такую как флоппи-диск, компакт-диск, магнитную ленту и т.п., содержащие записанные на них контрольные логические и/или другие данные. Компьютерная систем 100 может также с успехом включать в себя или быть запрограммированной на использование любого соответствующего программного обеспечения, способного читать контрольные логические данные и/или данные, получаемые из компонента хранения данных, как только оно вставляется в устройство для поиска данных. Компьютерная система 100 включает в себя экран 120, который используется для вывода результатов пользователю компьютера. Следует также отметить, что компьютерная система 100 может быть соединена с другой компьютерной системой 125 а-с в сеть или в более широкую сетевую систему для обеспечения централизованного доступа к компьютерной системе 100. Программное обеспечение для оценки и обработки нуклеотидных или аминокислотных последовательностей согласно изобретению может находиться в основной памяти 115 в процессе работы. В некоторых аспектах компьютерная система 100 может включать в себя алгоритм сравнения последовательностей для выполнения операции сравнения последовательностей нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Алгоритм и последовательность(и) могут храниться в компьютерной читаемой среде. Фраза алгоритм сравнения последовательностей относится к одной или более программам, которые могут быть введены (локально или в удаленном режиме) в компьютерную систему 100 с целью проведения сравнения данной нуклеотидной последовательности с другими нуклеотидными последовательностями и/или соединениями, содержащимися в устройствах для хранения данных. Например, алгоритм сравнения последовательностей может включать в себя операцию сравнения нуклеотидных последовательностей репрезентативной последовательности, например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и т.п., хранящейся в компьютер- 28010903 ной читаемой среде, с эталонными последовательностями, также хранящимися в компьютерной читаемой среде, для идентификации наличия гомологии или структурных мотивов. Параметры, используемые в указанных выше алгоритмах, могут быть адаптированы к соответствующей длине последовательности и степени исследуемой гомологии. В некоторых аспектах такие параметры могут представлять собой заданные по умолчанию параметры, используемые алгоритмами без каких-либо инструкций от пользователя. Фиг. 2 представляет блок-схему, иллюстрирующую один аспект способа осуществления процесса 200, направленного на сравнение новой нуклеотидной или белковой последовательности с последовательностями, имеющимися в базе данных, для определения уровня гомологии, имеющейся между новой последовательностью и последовательностями в базе данных. База данных последовательностей может представлять собой частную базу данных с хранением информации в компьютерной системе 100 или общественно доступную базу данных, такую как GENBANK, доступ к которой открыт через Интернет. Процесс 200 начинается с исходного состояния 201 и затем движется к стадии 202, на которой новую последовательность, подлежащую сравнению, вводят в память компьютерной системы 100. Как отмечалось выше, память может представлять любой тип памяти, включая ОЗУ или внутреннее устройство для хранения информации. Далее процесс 200 переходит к стадии 204, на которой открывается база данных последовательностей для анализа и сравнения. Затем процесс 200 переходит к стадии 206, на которой первая последовательность, хранящаяся в базе данных, прочитывается в памяти компьютера. Затем на стадии 210 проводится сравнение для выяснения, является ли первая последовательность той же самой, что и вторая последовательность. Важно отметить, что данная стадия не ограничивается выявлением при сравнении только точного сходства между новой последовательностью и первой последовательностью в базе данных. Специалистам в данной области известны способы, применяемые для сравнения двух нуклеотидных или белковых последовательностей, даже если они не идентичны. Например, в последовательность могут быть введены гэпы для повышения уровня гомологии между двумя исследуемыми последовательностями. Параметры, которые контролируют, будут ли гэпы или другие структурные особенности введены в последовательность в ходе сравнения, обычно задаются самим пользователем компьютерной системы. Как только на стадии 210 выполняется сравнение двух последовательностей, следует решающая стадия 210 вынесения определения относительно того, что обе последовательности одинаковы/те же самые. Разумеется, термин одинаковые/те же самые не ограничивается абсолютно идентичными последовательностями. Последовательности, которые соответствуют параметрам гомологии, задаваемым пользователем, будут обозначаться как одинаковые/те же самые в способе 200. Если сделан вывод, что обе последовательности являются одинаковыми, то процесс 200 переходит к стадии 214, на которой на экран для пользователя выводится название последовательности из базы данных. Данная стадия показывает пользователю, что последовательность с показанным наименованием соответствует критерию гомологии, который он ввел. Как только наименование последовательности выводится из хранения на экран для пользователя, процесс 200 переходит к решающей стадии 218, на которой делается вывод, существует ли еще последовательность в базе данных. Если в базе данных нет больше последовательностей, то процесс 200 заканчивается на последней стадии 220. Однако, если в базе данных имеются еще последовательности, то процесс 200 движется к стадии 204, на которой курсор переходит к следующей последовательности в базе данных, которая может быть подвергнута сравнению с новой последовательностью. Таким образом, каждая новая последовательность сопоставляется и сравнивается с каждой последовательностью в базе данных. Следует отметить, что если на решающей стадии 212 сделано заключение о том, что последовательности не являются гомологичными, то процесс 200 сразу же переходит на решающую стадию 218 для определения, есть ли другие последовательности, доступные в базе данных для сравнения. Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к компьютерной системе, включающей в себя процессор, устройство для хранения данных, хранящееся записанные в нем последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению и инструмент сравнения последовательностей для выполнения сравнительных операций. Инструмент сравнения последовательностей может включать в себя определение уровня гомологии между сравниваемыми последовательностями или идентификацию структурных мотивов, или он может идентифицировать структурные мотивы в последовательностях, которые подвергаются сравнению с кодами данной нуклеиновой кислоты и данного полипептида. Фиг. 3 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую один вариант способа осуществления процесса 250 в компьютере, направленного на определение, являются ли две последовательности гомологичными. Процесс 250 начинается с исходного состояния 252 и далее переходит к стадии 254, на которой первая подлежащая сравнению последовательность вводится в память для хранения. Затем на стадии 256 вторая последовательность, подлежащая сравнению, направляется в память. Процесс 250 переходит к стадии 260, где прочитывается первая характеристика первой последовательности, и затем к стадии 262, где прочитывается первая характеристика второй последовательности. Следует понимать, что если данная последовательность представляет нуклеотидную последовательность, то такой характеристикой обычно являются А, Т, Ц, Г или У. Если данная последовательность представляет белковую последовательность, то это может быть однобуквенный код аминокислоты, так что и первую, и вторую последова- 29010903 тельность можно легко сравнивать. Затем на решающей стадии 264 делается заключение, являются ли обе характеристики одинаковыми. Если они одинаковые, то процесс 250 переходит на стадию 268, на которой прочитываются следующие характеристики первой и второй последовательности. Далее делается заключение, являются ли следующие характеристики одинаковыми. Если они одинаковы, то по процессу 250 такое передвижение будет продолжаться до тех пор, пока обе характеристики будут неодинаковыми. Если при определении делается вывод, что следующие две характеристики неодинаковы, то процесс 250 переходит на решающую стадию 274 для определения, есть ли еще характеристики или последовательности для прочтения. Если нет больше характеристик для прочтения, то процесс 250 переходит нас стадию 276, где для пользователя на экран выводятся данные об уровне гомологии между первой и второй последовательностями. Уровень гомологии определяется при вычислении пропорции характеристик, общих для обеих последовательностей, которые являются одинаковыми, относительно всего числа характеристик в первой последовательности. Таким образом, если каждая характеристика в первых 100 нуклеотидах последовательности согласуется с каждой характеристикой во второй последовательности, то уровень гомологии между ними будет составлять 100%. Альтернативно, компьютерная программа может выполнять процедуры сравнения эталонной последовательности с последовательностью согласно изобретению для определения, отличаются ли данные последовательности по одной или более позиций. Программа может записывать длину и идентичность встроенных, делетированных, замещенных нуклеотидов или аминокислотных остатков относительно последовательности любого эталона согласно изобретению. Компьютерная программа может представлять собой программу, которая определяет, содержит ли эталонная последовательность единичный нуклеотидный полиморфизм (SNP) относительно последовательности согласно изобретению или последовательность согласно изобретению включает в себя SNP известной последовательности. Таким образом, в некоторых аспектах компьютерная программа представляет собой программу, которая идентифицируетSNP. Данный метод может быть введен в компьютерные системы, описанные выше, а метод проиллюстрирован на фиг. 3. Данный метод может быть выполнен путем прочтения последовательности согласно изобретению и стандартных последовательностей с использованием компьютерной программы с идентификацией различий также с помощью компьютерной программы. В других аспектах компьютерная система включают в себя идентификатор для идентификации характеристик нуклеиновой кислоты или полипептида согласно изобретению. Термин идентификатор относится к одной или более программам,которые позволяют идентифицировать определенные характеристики в последовательности нуклеиновой кислоты. Например, идентификатор может включать в себя программу, которая идентифицирует открытую рамку считывания (ОРС) в последовательности нуклеиновой кислоты. Фиг. 4 представляет блок-схему, иллюстрирующую один аспект способа 300 идентификации, используемого для выявления наличия определенной характеристики в последовательности. Процесс по способу 300 начинается с исходного состояния 302 и далее переходит к стадии 304, на которой первая последовательность, подлежащая оценке на наличие определенных характеристик, вводится в память 115 в компьютерной системе 100. Затем процесс 300 переходит к стадии 306, на которой открывается база данных, включающая информацию по характеристикам последовательностей. Такая база данных может содержать перечень значений характеристик вместе с их наименованиями. Например, наименование характеристики может быть инициирующий кодон, а ее значение может быть АТГ. Другой пример может включать в себя наименование характеристики ТААТАА-бокс и ее значение может быть ТААТАА. Пример такой базы данных включает в себя базу данных, созданную Компьютерной Группой по генетике при Университете Висконсин (University Wisconsin Genetics Computer Group). Альтернативно, указанные характеристики могут включать в себя структурные мотивы полипептида, такие как альфа-спирали, бета-складчатые конформации и функциональные мотивы полипептидов, такие как активные сайты ферментов, мотивы спираль-петля-спираль или другие мотивы, известные специалистам в данной области. Как только на стадии 306 открывается база данных с информацией о характеристиках,процесс 300 переходит к стадии 308, на которой прочитывается первая характеристика из базы данных. Затем на стадии 310 выполняется сравнение значения первой характеристики для первой последовательности. Далее следует решающая стадия 316, на которой делается вывод, имеется ли значение первого признака в первой последовательности. Если значение найдено, то процесс 300 переходит к стадии 318,на которой наименование найденной характеристики выводится на экран пользователю. Затем процесс 300 переходит к стадии 320 принятия решения, на которой определяется, есть ли еще характеристики в базе данных. Если характеристик больше нет, то процесс 300 заканчивается на последней стадии 324. Однако, если на базе данных имеются еще характеристики, то в соответствии с процессом 300 следует прочтение следующей характеристики последовательности на стадии 326 с возвращением процесса на стадию 310, на которой значение следующей характеристики сравнивается с ее значением в первой последовательности. Если на решающей стадии 316 значение характеристики не найдено в первой последовательности, то процесс 300 переходит сразу к стадии 320 принятия решения, с тем чтобы определить,есть ли еще характеристики в базе данных. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к компьютерным программам, которые идентифицируют открытые рамки считывания (ОРС). Последовательность полипептида или нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть