Полипептиды монооксигеназы со смешанными функциями, способные катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, кодирующие их нуклеиновые кислоты, способы применения полипептидов и нуклеиновых кислот и трансгенные растения

1 Область техники Настоящее изобретение касается, главным образом, новых последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды эпоксигеназ жирных кислот, а более предпочтительно полипептиды монооксигеназ со смешанными функциями, способные катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты. Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения происходят из растений,выбранных из группы, состоящей из Crepis spp.,в том числе Crepis palaestina, Euphorbia lagascae и Vernonia galamensis. Последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению представляют собой средство, с помощью которого можно изменить метаболизм жирных кислот или манипулировать этим метаболизмом в таких организмах, как дрожжи, плесневые грибы, бактерии, насекомые, птицы, млекопитающие и растения. Настоящее изобретение распространяется на генетически модифицированные растения с масличными семенами, трансформированные молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Получаемые из таких растений масла являются средством получения экономически выгодного сырья для эффективного производства, среди прочего,покрытий, смол, клеев, пластмасс, поверхностно-активных веществ и смазочных веществ. В настоящем описании и в формуле изобретения, если по контексту не требуется иное,слово включают или его вариации, такие как включает или включающий, следует понимать, как означающие включение указанной составляющей или группы составляющих, но не исключение никакой иной составляющей или группы составляющих. Подробности библиографического описания публикаций, на которые авторы делают ссылки в настоящем описании, приведены в конце описания. Идентификационные номера последовательностей (последов. ) для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, упоминаемые в настоящем описании, определены на основе библиографии. Уровень техники Во всем мире существует значительный интерес к производству химических пищевых веществ, таких как жирные кислоты, для целей промышленного использования, при этом предпочтительно из возобновляемых растительных источников, а не из невозобновляемых продуктов нефтехимии. Эта концепция широко распространена среди изготовителей и потребителей, поскольку она основана на сохранении ресурсов и обеспечивает значительные возможности выведения новых видов технических культур для сельского хозяйства. В природе существует широкое разнообразие необычных жирных кислот, и они хорошо охарактеризованы (BadamPatil, 1981; Smith,1970). Многие из этих необычных жирных ки 004568 2 слот обладают потенциалом промышленного использования, что вызвало интерес к окультуриванию видов растений, которые могли бы обеспечить сельскохозяйственное производство определенных жирных кислот. Одним из классов жирных кислот, которые вызывают особый интерес, являются эпоксижирные кислоты, состоящие из ацильной цепи,в которой две соседние углеродные связи соединены эпоксидным мостиком. Благодаря их высокой реактивности они находят значительное применение в производстве покрытий, смол,клеев, пластмасс, поверхностно-активных и смазочных веществ. Эти жирные кислоты в настоящее время производят путем химического эпоксидирования из растительных масел, главным образом, из соевого и льняного масел, однако,этот процесс приводит к получению смесей кратных и изомерных форм, а кроме того, он требует значительных производственных затрат. Другие авторы предпринимают попытки в качестве коммерческих источников эпоксижирных масел вывести сорта некоторых диких растений, содержащих такие масла (например,Euphorbia lagascae, Vernonia galamensis). Однако трудности, связанные с агрономической пригодностью и низкой урожайностью, резко ограничивают возможности коммерческого использования традиционных подходов к селекции и возделыванию этих видов растений. Быстро развивающиеся познания в области технологии рекомбинантной ДНК значительно повышают эффективность коммерчески важных производственных процессов за счет экспрессии генов, выделенных из одного организма или вида, в другом организме или виде, что определяет его новый фенотип. Более конкретно,обычные производственные процессы можно сделать более эффективными или экономически более выгодными за счет того, что использование методов рекомбинантной ДНК ведет к получению большего выхода на единицу затрат. Кроме того, выбор подходящего организма-хозяина для экспрессии представляющей интерес генетической последовательности обеспечивает получение соединений, которые в норме не продуцируются или не синтезируются этим хозяином, с высоким выходом и высокой чистотой получаемого продукта. Однако, несмотря на общую эффективность технологии рекомбинантной ДНК, выделение генетических последовательностей, кодирующих важные для метаболизма жирных кислот ферменты, в частности генов, кодирующих 12-эпоксигеназные ферменты жирных кислот,ответственных за выработку 12,13-эпокси-9 октадеценовой кислоты (верноловой кислоты) и 12,13-эпокси-9,15-октадекадиеновой кислоты,среди прочих, остается главным препятствием для получения с помощью методов генетической инженерии организмов, вырабатывающих эти жирные кислоты. 3 До настоящего изобретения имелось лишь ограниченное количество биохимических данных, указывающих на природу эпоксигеназных ферментов жирных кислот, в частности 12 эпоксигеназ. Однако известно, что у Euphorbialagascae образование 12,13-эпокси-9-октадеценовой кислоты (верноловой кислоты) из линолевой кислоты катализируется цитохром-Р 450 зависимой 12-эпоксигеназой (Bafor et al., 1993;Blee et al., 1994). Кроме того, развивающиеся семена растений льна обыкновенного могут преобразовывать добавляемую верноловую кислоту в 12,13-эпокси-9,15-октадекадиеновую кислоту с помощью эндогенной 15-десатуразы(Engeseth and Styrone, 1996). Эпоксижирные кислоты могут также вырабатываться в тканях растений с помощью пероксидзависимой пероксигеназы (Blee and Schuber, 1990). В своих работах, которые привели к настоящему изобретению, его авторы пытались выделить последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют гены, важные для продуцирования эпоксижирных кислот, таких как 12,13-эпокси-9-октадеценовая кислота (верноловая кислота) или 12,13-эпокси-9,15-октадекадиеновая кислота, и перенести эти генетические последовательности в высокопродуктивные коммерческие сорта растений с масличными семенами и/или в другие накапливающие масла организмы. Краткое изложение сущности изобретения Новые последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды эпоксигеназ жирных кислот, а более предпочтительно полипептиды монооксигеназ со смешанными функциями, способные катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, представляют собой один из основных объектов настоящего изобретения. Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения происходят из растений, выбранных из Crepis sp., в том числе Crepis palaestina, Euphorbia lagascae и Vernonia galamensis. В соответствии с вышесказанным один аспект настоящего изобретения касается выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы Crepispalaestina со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из(а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имеющий аминокислотную последовательность SEQID No: 1 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и(в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б). Второй аспект настоящего изобретения касается выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы Crepis sp., за исключением Crepis palaestina, со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из(а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имеющий аминокислотную последовательность SEQID No: 3 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и(в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б). Следующий аспект настоящего изобретения касается выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы Vernonia galamensis со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из(а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имеющий аминокислотную последовательность SEQID No: 5 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и(в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б). Авторы настоящего изобретения также выделили нуклеотидные последовательности,представленные в последов.19 и 20, которые происходят из Euphorbia lagascae и кодируют предполагаемую последовательность цитохром-Р-450-зависимой монооксигеназы, либо последовательность, подобную последовательности цитохром-Р-450-зависимой монооксигеназы. Следующий аспект касается генетической конструкции, которая включает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующую полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, или ее часть, которая кодирует ферментативно активную часть указанного полипептида, функционально связанную с последовательностью промотора, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть может быть транскри 5 бирована в смысловой ориентации по отношению к направлению транскрипции in vivo существующего в природе гена монооксигеназы. Еще один аспект касается генетической конструкции, которая включает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующую полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, или ее часть, которая способна модифицировать экспрессию указанного полипептида, функционально связанную с последовательностью промотора, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть может быть транскрибирована в антисмысловой ориентации по отношению к направлению транскрипции in vivo существующего в природе гена монооксигеназы. Следующий аспект настоящего изобретения касается способа уменьшения экспрессии гена, кодирующего полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, в клетке или в микроорганизме, включающий введение генетической конструкции по настоящему изобретению в клетку или в микроорганизм и инкубацию указанной клетки или микроорганизма в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для осуществления экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид монооксигеназы, в данной генетической конструкции. Другой аспект настоящего изобретения касается способа получения рекомбинантного ферментативно активного полипептида монооксигеназы со смешанными функциями в клетке,причем указанный способ включает культивирование клетки, содержащей генетическую конструкцию по настоящему изобретению, в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид монооксигеназы, в указанной генетической конструкции. Еще один аспект настоящего изобретения касается способа получения рекомбинатного ферментативно активного полипептида монооксигеназы со смешанными функциями в трансгенном растении, включающий следующие стадии:(а) введение генетической конструкции по настоящему изобретению в клетку или ткань растения;(б) регенерацию трансформированного растения из указанной клетки или ткани; и(в) отбор трансформированного растения с высоким уровнем экспрессии в семенах ферментативно активного полипептида монооксигеназы, кодируемого указанной генетической конструкцией. Следующий аспект настоящего изобретения касается рекомбинантного полипептида монооксигеназы Crepis palaestina со смешанными функциями, способного катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранного из группы, состоящей из(а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2; и(б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID No: 1 или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода. Другой аспект настоящего изобретения касается рекомбинантного полипептида монооксигеназы Crepis sp., за исключением Crepis palaestina, со смешанными функциями, способного катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранного из группы, состоящей из(а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No: 4; и(б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID No: 3 или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода. Следующий аспект настоящего изобретения касается рекомбинантного полипептида монооксигеназы Vernonia galamensis со смешанными функциями, способного катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранного из группы,состоящей из(а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No: 6; и(б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID No: 5 или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода. Еще один аспект настоящего изобретения касается способа изменения внутриклеточного содержания эпоксигенизированной жирной кислоты, включающий культивирование клетки,содержащей генетическую конструкцию по настоящему изобретению, в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты,кодирующей полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, в указанной генетической конструкции, и последующее инкубирование указанной клетки с жирнокислотным субстратом в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для того, чтобы по меньшей мере одна углеродная связь указанного субстрата была преобразована в эпоксигруппу. Краткое описание чертежей Фиг. 1 изображает линейную схему экспрессирующей плазмиды, содержащей структурный ген эпоксигеназы, расположенный под контролем укороченного напинового промотораNOS-терминатора (правый прямоугольник с точками). Генетическая последовательность эпоксигеназы обозначена правым незакрашенным прямоугольником. Конструкция также со 7 держит NOS-промотор (левый заштрихованный прямоугольник), обеспечивающий экспрессию гена NPTLI (левый незакрашенный прямоугольник) и также расположенный перед NOSтерминатором (левый прямоугольник с точками). Также указаны последовательности, расположенные на левой и правой границах Tiплазмиды Agrobacterium tumefaciens. Фиг. 2 показывает сопоставление аминокислотных последовательностей полипептида эпоксигеназы Crepis palaestina (Cpal2; последов.2); другой эпоксигеназы, происходящей из вида Crepis, иного, чем Crepis palaestina, продуцирующего верноловую кислоту с высоким уровнем (СrерХ; последов.4); части аминокислотной последовательности полипептида эпоксигеназы из Vernonia galamensis (VgalI; последов.6); аминокислотной последовательности 12-ацетиленазы Crepis alpina (Crepl; последов.8); 12-десатураз A. thaliana (L26296; последов.9); Brassica juncea (X91139; последов.10), Glycine max (L43921; последов.11), Solanum commersonii (X92847; последов.12) и Glycine max (L43920; последов.13), а также 12-гидроксилазы Ricinus communis(U22378; последов.14). Подчеркнуты три богатые гистидином области, консервативные для несодержащих гем многофункциональных монооксигеназ. Фиг. 3 показывает фотографию нозернблот-гибридизации,показывающую семяспецифическую экспрессию гена эпоксигеназыCrepis palaestina, на примере последов.1. Анализ методом нозерн-блоттинга тотальной РНК из листьев (дорожка 1) и из развивающихся семян (дорожка 2) Crepis palaestina. 15 мкг тотальной РНК разделяли в геле и переносили на мембрану Hybond N+ (Amersham) в соответствии с инструкциями изготовителя. Блот гиоридизовали при 60 С зондом, полученным из 3'нетранслируемой области последов.1. Блот дважды промыли в 2 хSSC (NaCl-натрийцитратный буфер) при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем 0,1 хSSC при 60 С в течение 20 мин. Фиг. 4 показывает схему нуклеотидной последовательности вырожденного ПЦР-праймера(направление от 5' до 3'), использованного для выделения описываемых здесь генов эпоксигеназы Euphorbia lagascae. Фиг. 5 показывает на примере последовательности 3 фотографию дот-блотгибридизации РНК, подтверждающей экспрессию гена эпоксигеназы в растениях, синтезирующих верноловую кислоту, по сравнению с растениями, которые не синтезируют верноловую кислоту. 1 мкг тотальной РНК выделяли из определенной ткани и наносили на мембрануHybond N+ (Amersham) в соответствии с инструкциями изготовителя. Блот гибридизовали при температуре 42 С в 50%-ном формамиде с 8 меченым 32 Р зондом, полученным из последовательности 3, в течение 16 ч. Блоты дважды промыли 2 хSSC (NaCl-натрий-цитрат-ный буфер) при комнатной температуре, затем 0,5 хSSC при 55 С в течение 20 мин. Авторадиограммы экспонировали в течение ночи. Панель А показывает тотальную РНК из развивающихся семянEuphorbia lagascae (1), Euphorbia cyparissus (2),Vernonia galamensis (3) и льна (Linum usitatissimum) (4). Панель В показывает тотальную РНК из различных тканей Euphorbia lagascae,включая развивающееся семя (1), корень (2) и лист (3). Фиг. 6 приводит схему метода вычленяющей гибридизации, использованного для выделения генов эпоксигеназы Euphorbia lagascae. Пул +6 кДНК состоял преимущественно из последовательностей, подобных последовательностям запасных белков семян. Пул из 15 таких последовательностей биотинилировали, а затем вычленили из +6 кДНК. LH=длительная гибридизация - 20 ч; SH=короткая гибридизация - 3 ч. Фиг. 7 показывает фотографию дот-блотгибридизации РНК, демонстрирующей на примере последовательности 20 экспрессию гена эпоксигеназы в растениях, синтезирующих верноловую кислоту, по сравнению с растениями,не синтезирующими верноловую кислоту. 1 мкг тотальной РНК выделяли из указанной ткани и наносили на мембрану Hybond N+ (Amersham)(в соответствии с инструкциями изготовителя). Блот гибридизовали при 42 С в 50%-ном формамиде меченым 32P зондом, полученным из последовательности 20, в течение 16 ч. Блоты дважды промывали 2 хSSC (NaCl-натрийцитратный буфер) при комнатной температуре,0,5 хSSC при 55 С в течение 20 мин. Авторадиограммы экспонировали в течение ночи. Панель А показывает тотальную РНК из развивающихся семян Euphorbia lagascae (1), Euphorbia cyparissus (2), Vernonia galamensis (3) и льна (Linum usitatissimum) (4). Панель В показывает тотальную РНК из различных тканей Euphorbialagascae, включая развивающееся семя (1), корень (2) и лист (3). Фиг. 8 показывает схему бинарного плазмидного вектора, содержащего кассету экспрессии, содержащую укороченный напиновый семя-специфичный промотор (Napin) и терминатор нопалинсинтазы (NT), с находящимся между ними сайтом клонирования BamHI, а также ген устойчивости к канамицину NPTII, под контролем промотора нопалинсинтазы (NP) и терминатора нопалинсинтазы (NT). Кассета экспрессии фланкирована левой (LB) и правой(RB) последовательностями Т-ДНК. Фиг. 9 показывает схему бинарного плазмидного вектора, содержащего кассету экспрессии, которая включает последовательность 1 под контролем укороченного напинового семяспецифичного промотора (Napin) и перед терминатором нопалинсинтазы (NT), а также ген 9 устойчивости к канамицину NPTII, под контролем промотора нопалинсинтазы (NP) и терминатора нопалинсинтазы (NT). Кассета экспрессии фланкирована левой (LB) и правой (RB) последовательностями Т-ДНК. Чтобы получить эту конструкцию, последовательность 1 встраивали в сайт BamHI бинарного вектора, показанного на фиг. 8. Фиг. 10 показывает графическое изображение газово-хроматографического анализа остатков сложных эфиров жирных кислот и метила, полученных из маслосодержащих семян нетрансформированных растений Arabidopsis thaliana [панель (а)], или растений A. thaliana(трансгенной линии Cpa1-17), трансформированных последовательностью 1 с использованием генетической конструкции, показанной на фиг. 9 [панели (b) и (с)]. В панелях (а) и (b) сложные эфиры жирных кислот и метила разделяли с помощью разделения на упакованных колонках. В панели (с) сложные эфиры жирных кислот и метила разделяли с помощью разделения на капиллярных колонках. Указаны позиции элюирования верноловой кислоты. Фиг. 11 показывает определенное с помощью газовой хроматографии совместное распределение эпоксижирных кислот в полученных от самоопыления семенах растений T1 от Cpa12 трансформированных растений Arabidopsis thaliana. Были определены уровни как верноловой кислоты (ось х), так и 12,13-эпокси-9,15 октадекадиеновой кислоты (ось у), и указаны на графике друг относительно друга. Данные показывают наличие положительной корреляции между уровнями этих жирных кислот в трансгенных растениях. Фиг. 12 показывает включение метки 14 С в хлороформную фазу, полученную путем экстракции липидов из семядоль льна. Использованные символы:- [14 С] олеиновая кислота;- [14 С] верноловая кислота. Фиг. 13 показывает включение метки 14 С в фосфатидилхолин семядоль льна. Использованные символы:- [14 С] олеиновая кислота;- [14 С] верноловая кислота. Фиг. 14 показывает включение метки 14 С в триацилглицеролы семядоль льна. Использованные символы:- [14 С] олеиновая кислота;- [14 С] верноловая кислота. Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения Одним из объектов настоящего изобретения является выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид эпоксигеназы жирной кислоты, а более предпочтительно полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению происходит из источни 004568palaestina, Crepis vesicaria, Crepis xacintha,Euphorbia lagascae и Vernonia galamensis. He исключаются и дополнительные виды. В настоящем описании термин происходящий из используется для указания на то, что определенная составляющая или группа составляющих происходит из указанного биологического вида, но не обязательно была получена непосредственно из указанного источника. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растениеисточник представляет собой вид Crepis, который содержит высокие уровни верноловой кислоты, такой как Crepis palaestina, среди прочих,или, в качестве альтернативы, Vernonia galamensis или Euphorbia lagascae. Молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может представлять собой ДНК, такую как ген, молекулу кДНК,молекулу РНК или молекулу синтетического олигонуклеотида, имеющую либо одинарную,либо двойную цепь, и независимо от любых вторичных структурных характеристик, кроме особо оговоренных случаев. В настоящем описании термин ген используется в его наиболее широком контексте и включает 1) классический геномный ген, включающий транскрипционные и/или трансляционные регуляторные последовательности, и/или кодирующую область и/или нетранслируемые последовательности (т.е. интроны, 5'-и 3'нетранслируемые последовательности); или 2) мРНК или кДНК, соответствующие кодирующим областям (т.е. экзоны) и 5'- и 3'нетранслируемые последовательности гена. Термин ген также используется для описания синтетических или составных молекул,кодирующих весь функциональный продукт или его часть. Предпочтительными генами эпоксигеназ по настоящему изобретению могут быть гены, полученные из встречающегося в природе гена эпоксигеназы с помощью стандартных методов генной инженерии. Настоящее изобретение, безусловно, распространяется на выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению,когда она включена в геном клетки в качестве добавки к эндогенному клеточному набору эпоксигеназных генов. В качестве альтернативы, в случае, если клетка-хозяин в норме не кодирует ферменты, требующиеся для биосинтеза эпоксижирных кислот, настоящее изобретение распространяется на выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, когда она включена в геном указанной клетки в качестве добавки к эндогенному клеточному геному. 11 В контексте настоящего изобретения термин эпоксигеназа жирной кислоты означает фермент, который катализирует биосинтез эпоксигенизированной жирной кислоты, путем преобразования углеродной связи жирной кислоты в эпоксильную группу, и предпочтительно путем преобразования углеродной двойной связи ненасыщенной жирной кислоты в эпоксильную группу. Хотя настоящее изобретение этим не ограничивается, эпоксигеназа жирной кислоты может катализировать биосинтез эпоксижирной кислоты, выбранной из перечня,включающего 12,13-эпокси-9-октадеценовую кислоту (зерноловую кислоту), 12,13-эпокси 9,15-октадекадиеновую кислоту, 15,16-эпокси 9,12-октадекадиеновую кислоту, 9,10-эпокси 12-октадеценовую кислоту и 9,10-эпоксиоктадекановую кислоту, среди прочих. Термины эпокси, эпоксильная группа,эпоксильный остаток известны специалистам в данной области техники, как обозначающие трехчленное кольцо, включающее два атома углерода и атом кислорода, соединенные одинарными связями следующим образом: Соответственно, термин эпоксид относится к соединениям, которые включают, по меньшей мере, одну эпоксильную группу, определенную здесь выше. Специалистам в данной области техники известно, что номенклатура жирных кислот основана на длине углеводородной цепи и позиции ненасыщенных атомов углерода в пределах этой углеродной цепи. Исходя из этого, жирные кислоты обозначают с использованием краткого обозначения в котором двойные связи являются цис-связями,кроме особо оговоренных случаев. Например,пальмитиновая кислота (n-гексадекановая кислота) представляет собой насыщенную 16 углеродную жирную кислоту (т.е. 16:0), олеиновая кислота (октадеценовая кислота) представляет собой ненасыщенную 18-углеродную жирную кислоту с одной двойной связью между С-9 и С-10 (т.е. 18:19), и линолевая кислота (октадекадиеновая кислота) представляет собой ненасыщенную 18-углеродную жирную кислоту с двумя двойными связями между С-9 и С-10 и между С-12 и С-13 (т.е. 18:29,12). Однако в настоящем контексте фермент эпоксигеназа может катализирозать преобразование любой углеродной связи в эпоксильную группу или, в качестве альтернативы, преобразование любого дубля в субстрате, представляющем собой ненасыщенную жирную кислоту,в эпоксильную группу. Что касается этого, специалистам в данной области техники хорошо 12 известно, что большинство мононенасыщенных жирных кислот высших организмов представляют собой 18-углеродные ненасыщенные жирные кислоты (т.е. 18:19), в то время как большинство полиненасыщенных жирных кислот,происходящих из высших организмов, представляют собой 18-углеродные жирные кислоты, по меньшей мере, с одной из двойных связей, расположенных между С-9 и С-10. Кроме того, в бактериях также имеются С 16 мононенасыщенные жирные кислоты. Кроме того, эпоксигеназа по настоящему изобретению может действовать на более чем одну молекулу субстрата, представляющего собой жирную кислоту, и, вследствие этого, настоящее изобретение не ограничивается природой молекулы субстрата, на которую воздействует эпоксигеназный фермент по настоящему изобретению. Предпочтительно, чтобы молекула субстрата для эпоксигеназы по настоящему изобретению представляла собой ненасыщеную жирную кислоту, содержащую, по меньшей мере,одну двойную связь. Кроме того, эпоксигеназные ферменты могут действовать на любое количество атомов углерода в любой из молекул субстрата. Например, они могут быть охарактеризованы, среди прочих, как ферменты 6-эпоксигеназа, 9 эпоксигеназа, 12-эпоксигеназа или 15 эпоксигеназа. В соответствии с этим настоящее изобретение не ограничено позицией атома углерода в субстрате, на который может воздействовать эпоксигеназный фермент. Термин 6-эпоксигеназа в настоящем описании используется для обозначения эпоксигеназного фермента, который катализирует преобразование 6-углеродной связи субстрата,представляющего собой жирную кислоту, в 6 эпоксильную группу и предпочтительно катализирует преобразование 6-двойной связи, по меньшей мере, одной ненасыщенной жирной кислоты в 6-эпоксильную группу. Термин 9-эпоксигеназа в настоящем описании используется для обозначения эпоксигеназного фермента, который катализирует преобразование 9-углеродной связи субстрата,представляющего собой жирную кислоту, в 9 эпоксильную группу и предпочтительно катализирует преобразование 9-двойной связи, по меньшей мере, одной ненасыщенной жирной кислоты в 9-эпоксильную группу. Термин 12-эпоксигеназа в настоящем описании используется для обозначения эпоксигеназного фермента, который катализирует преобразование 12-углеродной связи субстрата, представляющего собой жирную кислоту, в 12-эпоксильную группу и предпочтительно катализирует преобразование 12-двойной связи, по меньшей мере, одной ненасыщенной жирной кислоты в 12-эпоксильную группу. 13 Термин 15-эпоксигеназа в настоящем описании используется для обозначения эпоксигеназного фермента, который катализирует преобразование 15-углеродной связи субстрата, представляющего собой жирную кислоту, в 15-эпоксильную группу и предпочтительно катализирует преобразование 15-двойной связи, по меньшей мере, одной ненасыщенной жирной кислоты в 15-эпоксильную группу. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эпоксигеназа жирной кислоты по настоящему изобретению представляет собой 12-эпоксигеназу, 15-эпоксигеназу или 9-эпоксигеназу, как они определены выше в настоящем описании. Более предпочтительно, чтобы эпоксигеназа жирной кислоты по настоящему изобретению представляла собой 12-эпоксигеназу, как она определена выше в настоящем описании. В особо предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует линолеат-12-эпоксигеназу, фермент, который, по меньшей мере,преобразовывает 12-двойную связь линолевой кислоты в 12-эпоксильную группу, тем самым продуцируя 12,13-эпокси-9-октадеценовую кислоту (верноловую кислоту). Хотя это не ограничивает настоящего изобретения, предпочтительным источником 12 эпоксигеназы по настоящему изобретению является растение, в частности Crepis palaestina, и другие виды Crepis, которые отличаются от С.palaestina, но содержат высокие уровни верноловой кислоты, а также Vernonia galamensis илиEuphorbia lagascae. В соответствии с этим вариантом осуществления изобретения 12-эпоксигеназа может катализировать преобразование пальмитолеиновой кислоты в 9,10-эпоксипальмитиновую кислоту, и/или преобразование олеиновой кислоты в 9,10-эпоксистеариновую кислоту, и/или преобразование линолевой кислоты в любую одну или более одной из 9,10-эпокси-12-октадеценовой кислоты, или 12,13-эпокси-9-октадеценовой кислоты, или 9,10,12,13-диэпоксистеариновой кислоты, и/или преобразование линоленовой кислоты в любую одну или более одной из 9,10 эпокси-12,15-октадекадиеновой кислоты, или 12,13-эпокси-9,15-октадекадиеновой кислоты,или 15,16-эпоксиоктадекадиеновой кислоты, или 9,10,12,13-диэпокси-15-октадеценовой кислоты,или 9,10,15,16-диэпокси-12-октадеценовой кислоты, или 12,13,15,16-диэпокси-9-октадеценовой кислоты, или 9,10,12,13,15,16-триэпоксистеариновой кислоты, и/или преобразование арахидоновой кислоты в любую одну или более одной из 5,6-эпокси-8,11,14-тетракозатриеновой кислоты, или 8,9-эпокси-5,11,14-тетракозатриеновой кислоты, или 11,12-эпокси-5,8,14 тетракозатриеновой кислоты, или 14,15-эпокси 004568 14 5,8,11-тетракозатриеновой кислоты, или 5,6,8,9 диэпокси-11,14-тетракозадиеновой кислоты, или 5,6,11,12-диэпокси-8,14-тетракозадиеновой кислоты, или 5,6,14,15-диэпокси-8,11-тетракозадиеновой кислоты, или 8,9,11,12-диэпокси-5,14 тетракозадиеновой кислоты, или 8,9,14,15-диэпокси-5,11-тетракозадиеновой кислоты, или 11,12,14,15-диэпокси-5,8-тетракозадиеновой кислоты, или 5,6,8,9,11,12-триэпокси-14-тетракозеновой кислоты, или 5,6,8,9,14,15-триэпокси 11-тетракозеновой кислоты, или 5,6,11,12,14,15 триэпокси-8-тетракозеновой кислоты, или 8,9,11,12,14,15-триэпокси-5-тетракозеновой кислоты, среди прочих. Специалистам в данной области может быть известно, что не все перечисленные выше субстраты могут происходить из природных источников, но, несмотря на это, их можно получить с помощью химического синтеза. Преобразование как встречающихся в природе, так и химически синтезированных ненасыщенных жирных кислот в эпоксижирные кислоты находится в пределах объема настоящего изобретения, причем единственное требование состоит в том, чтобы описанная здесь молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодировала фермент или его функциональную часть, способные катализировать указанное преобразование. В соответствии с вышеобсуждавшимся специалистам в данной области техники известно, что эпоксигеназа жирной кислоты может представлять собой фермент цитохром-Р-450 зависимую монооксигеназу или монооксигеназный фермент со смешанными функциями, или,в качестве альтернативы, фермент пероксидзависимую пероксигеназу, или подобный фермент, среди прочих. Однако настоящее изобретение особо направлено на те эпоксигеназные ферменты, которые представляют собой монооксигеназные ферменты со смешанными функциями, а также на кодирующее их молекулы нуклеиновой кислоты и на их использование. В соответствии с этим особо предпочтительно,чтобы молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодировала полипептид монооксигеназного фермента со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты. В контексте настоящего изобретения термин монооксигеназный фермент со смешанными функциями обозначает любой фермент,который катализирует эпоксигенизирование углеродной связи или углеродной двойной связи в молекуле жирной кислоты, причем указанный фермент включает также последовательность аминокислот, которая содержит три обогащенные гистидином области, как указанные ниже: 1) His-(Xaa)3-4-His; 2) His-(Xaa)2-3-His-His; и 15 3) His-(Хаа)2-3-His-His,где His обозначает гистидин, Хаа обозначает остаток встречающейся в природе аминокислоты, такой как показан в таблице настоящего списания, составляющая (Хаа)3-4 обозначает последовательность аминокислот, включающую три или четыре повтора Хаа, а составляющая(Хаа)2-3 обозначает последовательность аминокислот, включающую два или три повтора Хаа. Термин фермент, подобный монооксигеназе со смешанными функциями означает любой фермент, который включает три богатые гистидином области, перечисленные выше. Таблица 1 Трехбуквенная Однобуквенаббревиатура ный символ Аланин АlаX из указанных выше Аминокислота В описанном здесь примере осуществления данного изобретения его авторы продемонстрировали, что описываемая здесь аминокислотная последовательность Crepis palaestina включает фермент 12-эпоксигеназу, который включает характерные мотивы аминокислотной последовательности монооксигеназного фермента со смешанными функциями, определенного выше в настоящем описании. Близкая идентичность аминокислотных последовательностей между ферментом 12-эпоксиге-назой С.palaestina (последов.2) и аминокислотными последовательностями полипептидов, происходящих из неидентифицированного вида Crepis и из Vernonia galamensis, приведенных в настоящем описании (последов.4 и 6), по сравнению с аминокислотными последовательностями других монооксигеназ со смешанными функциями, таких как десатуразы и гидроксилазы,позволяет предположить, что указанные аминокислотные последовательности Crepis sp. и V.galamensis также представляют собой эпоксигеназные ферменты жирных кислот и могут представлять собой 12-эпоксигеназные ферменты. 16 В этом отношении, аминокислотная последовательность Vernonia galamensis, приведенная в настоящем описании, представляет собой часть последовательности, которая включает только одну полную обогащенную гистидином область(т.е. His-Arg-Asn-His-His) и часть последовательности первой обогащенной гистидином области (т.е. два последних остатка гистидина области His-Glu-Cys-Gly-His-His), потому что кодирующая ее соответствующая нуклеотидная последовательность была амплифицирована посредством полимеразной цепной реакции в качестве частичной последовательности кДНК,с помощью первого праймера для этой первой обогащенной гистидином области и второго амплификационного праймера, предназначенного для области, расположенной выше третьей обогащенной гистидином области (т.е. His-ValMet-His-His). Кроме того, тот факт, что последовательность V. galamensis была амплифицирована с помощью праймера, специфичного для первой обогащенной гистидином области, указывает на то, что соответствующая полноразмерная последовательность также включает эту область. В соответствии с этим в особо предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодирует монооксигеназный фермент эпоксигеназу со смешанными функциями или подобный ему фермент, происходящий из видов Crepis, включая Crepis palaestina, или, в качестве альтернативы, происходящий из Vernonia galamensis. В соответствии с этим вариантом осуществления изобретения даже более предпочтительно, чтобы эпоксигеназа по данному изобретению включала, по меньшей мере,аминокислотную последовательность, которая содержит три или более обогащенные гистидином области, указанные ниже: 1) His-Glu-Cys-Gly-His-His (последов.15); 2) His-Arg-Asn-His-His (последов.16); и 3) His-Val-Met-His-His (последов.17),в которых His обозначает гистидин, Glu обозначает глютамат, Сys обозначает цистеин, Gly обозначает глицин, Arg обозначает аргинин,Asn обозначает аспарагин, Val обозначает валин, Met обозначает метионин. В соответствии с вышесказанным один из аспектов настоящего изобретения касается выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназыCrepis palaestina со смешанными функциями,способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты,где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность,выбранную из группы, состоящей из(а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имею 17 щий аминокислотную последовательность SEQID No: 1 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и(в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б). Аминокислотная последовательность,представленная в последов.2, обладает 12 эпоксигеназной активностью. Другой аспект настоящего изобретения касается выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы Crepis sp., за исключением Crepis palaestina, со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из(а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имеющий аминокислотную последовательность SEQID No: 3 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и(в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б). Нуклеотидная последовательность, представленная в последов.3, соответствует кДНК, происходящей из вида Crepis, иного, чемCrepis palaestina, который содержит высокие уровни верноловой кислоты. Еще один аспект настоящего изобретения касается выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы Vernonia galamensis со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из(а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имеющий аминокислотную последовательность SEQID No: 5 или ее вариантов, полученных на основе вырожденности генетического кода; и(в) нуклеотидной последовательности, которая комплементарна последовательности, указанной в (а) или (б). Нуклеотидная последовательность, представленная в последов.5, соответствует амплифицированной ДНК, полученной из Vernonia galamensis с помощью амплификационных праймеров, выведенных на основе консенсусной(общей) последовательности монооксигеназ со смешанными функциями, включая последова 004568 18 тельность гена эпоксигеназы Crepis spp. по настоящему изобретению. Амплифицированная ДНК включает частичную последовательность гена эпоксигеназы, включающую нуклеотидные последовательности, способные кодировать обогащенную гистидином область His-Arg-AsnHis-His, которая характерна для монооксигеназных ферментов со смешанными функциями. Авторы настоящего изобретения также выделили посредством амплификации нуклеотидные последовательности, представленные в последов.19 и 20, которые происходят изEuphorbia lagascae и кодируют предполагаемую последовательность цитохром-Р-450-зависимой монооксигеназы, либо последовательность, подобную последовательности цитохром-Р-450 зависимой монооксигеназы. С этой целью использовали нуклеотидную последовательность,представленную в последов.18, которая соответствует вырожденному амплификационному праймеру. В связи с этим, нуклеотидные остатки, показанные в последов.18, обозначены в соответствии с рекомендациями Комиссии по Биохимической Номенклатуре IUPAC-IUB, а именно, А представляет собой аденин, С представляет собой цитозин, G представляет собой гуанин, Т представляет собой тимин, Y представляет собой остаток пиримидина, R представляет собой остаток пурина, М представляет собой аденин или цитозин, К представляет собой гуанин или тимин, S представляет собой гуанин или цитозин, W представляет собой аденин или тимин, Н представляет собой нуклеотид, не являющийся гуанином, В представляет собой нуклеотид, не являющийся аденином, V представляет собой нуклеотид, не являющийся тимином, D представляет собой нуклеотид, не являющийся цитозином, и N представляет собой остаток любого нуклеотида. Описываемые здесь выделенные молекулы нуклеиновой кислоты можно использовать для выделения или идентификации их гомологов,аналогов или производных, происходящих из других клеток, тканей или другого типа органов, либо из клеток, тканей или органов других биологических видов, с помощью любого из множества способов, известных специалистам в данной области техники. Например, геномную ДНК, или мРНК, или кДНК можно привести в контакт, по меньшей мере, в мягких условиях гибридизации или в эквивалентных условиях, с эффективным для гибридизации количеством выделенных молекул нуклеиновой кислоты, включающих нуклеотидную последовательность, представленную в любой из последов.1, 3, 5, 19 или 20,либо комплементарную по отношению к ним последовательность, либо ее функциональную часть, и факт гибридизации устанавливают с помощью средств ее обнаружения. Средства обнаружения могут представлять собой репортерную молекулу, способную пода 19 вать идентифицируемый сигнал (например, радиоизотоп, такой как 32 Р или 35S, или обработанная биотином молекула), ковалентно связанную с выделенной молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. В качестве альтернативного способа средства обнаружения представляют собой любой известный формат полимеразной цепной реакции (ПЦР). В соответствии с этим способом конструируют вырожденные пулы праймерных молекул нуклеиновой кислоты длиной около 15-50 нуклеотидов, на основе нуклеотидных последовательностей, описанных в последов.1, 3, 5, 19 или 20 или комплементарных по отношению к ним последовательностей. Гомологи, аналоги и производные (т.е. матричные молекулы) гибридизируют с двумя из указанных праймерных молекул так, чтобы первый праймер гибридизировался с областью на одной цепи матричной молекулы, а второй праймер гибридизировался с комплементарной по отношению к ней последовательностью, причем первый и второй праймеры не должны гибридизироваться в пределах одной и той же области или перекрывающих друг друга областей матричной молекулы, и при этом каждый праймер должен иметь ориентацию от 5' до 3', по отношению к позиции, в которой другой праймер гибридизируется на противоположной цепи. Конкретные молекулы нуклеиновой кислоты,представляющие собой копии матричной молекулы, амплифицируются с помощью ферментов в процессе полимеразной цепной реакции, методика которой хорошо известна специалистам в данной области техники. Праймерные молекулы могут включать любые встречающиеся в природе нуклеотидные остатки (т.е. аденин, цитидин, гуанин, тимидин) и/или могут включать инозин либо его функциональные аналоги или производные, способные включаться в молекулу полинуклеотида. Праймерные молекулы нуклеиновой кислоты могут также содержаться в водной смеси других праймерных молекул нуклеиновой кислоты,либо они могут находиться по существу в чистом виде. Обнаруженная последовательность может находиться в рекомбинантной форме, в вирусной частице, в частице бактериофага, в клетке дрожжей, в клетке животного или в клетке растения. Предпочтительно, чтобы родственные генетические последовательности происходили из другого вида растений. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению полезна для создания включающих ее генетических конструкций, которые предназначены для экспрессии в клетке, которая в норме не экспрессирует указанную молекулу нуклеиновой кислоты, либо для сверхэкспрессии указанной молекулы нуклеиновой кислоты в клетке, которая нормально экспрессирует указанную молекулу нуклеино 004568 20 вой кислоты, чтобы получить рекомбинантный полипептид монооксигеназы, т.е. для создания генетических конструкций, включающих смысловую молекулу. В соответствии с этим следующий аспект настоящего изобретения касается генетической конструкции, которая включает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующую полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, или ее часть, которая кодирует ферментативно активную часть указанного полипептида, функционально связанную с последовательностью промотора, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть может быть транскрибирована в смысловой ориентации по отношению к направлению транскрипции in vivo существующего в природе гена монооксигеназы. В настоящем описании термин ферментативно активный используется для обозначения способности молекулы полипептида катализировать ферментативную реакцию, в частности ферментативную реакцию, включающую эпоксигенизирование углеродной связи в молекуле субстрата, представляющего собой жирную кислоту. Более конкретно, однако, не ограничивая этим данное изобретение, термин ферментативно активный также может обозначать способность молекулы полипептида катализировать эпоксигенизирование -9 или -12 в молекуле субстрата, представляющего собой жирную кислоту, такую как линолевая кислота или верноловая кислота. Специалистам в данной области техники известно, что генетическую конструкцию можно использовать для того, чтобы трансфецировать клетку, и в этом случае она вводится в указанную клетку без интеграции ее в клеточный геном. В качестве альтернативы, генетическая конструкция может использоваться для того, чтобы трансформировать клетку, и в этом случае она стабильно включается в геном указанной клетки. Смысловая молекула, которая соответствует последовательности гена монооксигеназы по настоящему изобретению или его части,может быть введена в клетку с помощью любого известного способа трансфекции или трансформации указанной клетки. В случае, если клетку трансформируют с помощью генетической конструкции по настоящему изобретению,то из одной трансформированной клетки можно регенерировать целый организм с помощью способов, известных специалистам в данной области техники. Таким образом, описанные здесь гены монооксиненаз со смешанными функциями могут использоваться для получения отдельных клеток или целых организмов, синтезирующих эпоксижирные кислоты, которые в норме не продуцируются дикими или существующими в природе организмами, принадлежащим к тем же 21 самым родам и видам, что и те роды или виды,из которых получены трансфецированные или трансформированные клетки, или для увеличения уровня содержания таких жирных кислот по сравнению с уровнями, нормально присутствующими в таких диких или существующих в природе организмах. Следующий аспект настоящего изобретения касается генетической конструкции, которая включает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующую полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, или ее часть, которая способна модифицировать экспрессию указанного полипептида, функционально связанную с последовательностью промотора, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть может быть транскрибирована в антисмысловой ориентации по отношению к направлению транскрипции in vivo существующего в природе гена монооксигеназы. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению или ее часть способна уменьшить экспрессию монооксигеназы по настоящему изобретению, если она экспрессируется под контролем последовательности соответствующего промотора в антисмысловой ориентации или в виде рибозимной молекулы. В контексте настоящего изобретения антисмысловая молекула представляет собой молекулу РНК, которая транскрибирована из комплементарной цепи ядерного гена в такой,который в норме транскрибируется для продуцирования смысловой молекулы мРНК, способной быть транслированной в полипептид. Поэтому антисмысловая молекула является комплементарной по отношению к смысловой мРНК или к ее части. Хотя это и не ограничивает режим действия настоящего изобретения никаким специфическим механизмом, молекула антисмысловой РНК обладает способностью образовывать мРНК с двойной цепью путем спаривания оснований со смысловой мРНК, что может предотвратить трансляцию смысловой мРНК и последующий синтез продукта гена полипептида. Рибозимы представляют собой синтетические молекулы РНК, которые включают область гибридизации, комплементарную по отношению к двум областям, каждая из которых содержит, по меньшей мере, по 5 сцепленных оснований нуклеотидов в являющейся мишенью смысловой мРНК. Кроме того, рибозимы обладают высокоспецифичной эндорибонуклеазной активностью, которая автокаталитически расщепляет являющуюся мишенью смысловую мРНК. Полное описание функций рибозимов представлено в работе Haseloff and GerlachWО 89/05852. Настоящее изобретение распространяется на рибозимы, мишенью которых яв 004568 22 ляется смысловая РНК, кодирующая описанный здесь полипептид монооксигеназы, тем самым гибридизируя указанную смысловую РНК и расщепляя ее, в результате чего она теряет способность быть транслированной и синтезировать продукт функционального полипептида. В соответствии с этим вариантом его осуществления настоящее изобретение касается рибозимной или антисмысловой молекулы,включающей последовательность сцепленных оснований нуклеотидов, которые способны образовать связанный водородом комплекс со смысловой мРНК, кодирующей описываемую здесь монооксигеназу, тем самым уменьшая трансляцию указанной мРНК. Хотя предпочтительные антисмысловые и/или рибозимные молекулы гибридизируются по меньшей мере до от около 10 до 20 нуклеотидов молекулымишени, настоящее изобретение распространяется на молекулы, способные к гибридизации,по меньшей мере, до длины около 50-100 оснований нуклеотидов, или на молекулу, способную к гибридизации с мРНК монооксигеназы,имеющей полную длину или по существу полную длину. Для ингибирования экспрессии гена монооксигеназы, описанного в настоящем описании изобретения, настоящее изобретение распространяется на использование соподавления. Соподавление представляет собой уменьшение экспрессии эндогенного гена, которое происходит в случае, когда одна или более копий указанного гена, или одна или более копий существенно подобного гена введены в клетку. Для целей настоящего изобретения выбор промотора может варьироваться в зависимости от требуемого уровня экспрессии смысловой молекулы, и/или от биологического вида, из которого происходит клетка-хозяин, и/или от специфики экспрессии требующейся смысловой молекулы, связанной с видом ткани или со стадией развития. Термин промотор в настоящем описании используется в его наиболее широком смысле и включает транскрипционные регуляторные последовательности классического эукариотного геномного гена, включая блок ТАТА, который требуется для точной инициации транскрипции,с блоком последовательности ССААТ или без него, а также дополнительные регуляторные элементы (т.е. вышерасположенные активирующие последовательности, энхансеры и сайленсеры), которые изменяют экспрессию гена в ответ на стимулы, связанные со стадией развития, и/или внешние стимулы, или тканевоспецифическим образом. В контексте настоящего изобретения термин промотор также включает транскрипционные регуляторные последовательности классического прокариотного гена,и в этом случае он может включать последовательность блока -35 и/или транскрипционные регуляторные последовательности блока -10. 23 В настоящем контексте термин промотор также используется для описания синтетической или составной молекулы или их производного, которые определяют, активируют или усиливают экспрессию указанной смысловой молекулы в клетке. Предпочтительные промоторы могут содержать дополнительные копии одного или более особых регуляторных элементов для еще большего усиления экспрессии смысловой молекулы и/или для изменения экспрессии указанной смысловой молекулы в пространстве и/или во времени. Например, чувствительные к меди регуляторные элементы можно разместить рядом с последовательностью гетерологичного промотора, управляющего экспрессией смысловой молекулы, чтобы придать ей свойство индуцируемой медью экспрессии. Помещение смысловой, антисмысловой,рибозимной или соподавляющей молекулы под регуляторный контроль последовательности промотора означает, что указанную молекулу располагают таким образом, чтобы экспрессия контролировалась последовательностью промотора. Промотор обычно, но не обязательно, расположен выше или в положении 5' по отношению к молекуле нуклеиновой кислоты, которую он регулирует. Кроме того, регуляторные элементы, включающие промотор, обычно расположены в пределах 2 т.п.н. сайта запуска транскрипции смысловой, антисмысловой, рибозимной или соподавляющей молекулы. В конструкции комбинаций гетерологичного промотора/структурного гена, как правило, предпочтительно располагать промотор на расстоянии от сайта запуска транскрипции гена, которое примерно равно расстоянию между промотором и контролируемым им геном в его естественном хромосомном наборе, т.е. в гене, из которого происходит данный промотор. Как известно в данной области техники, допустимы некоторые вариации в величине этого расстояния, без потери функции промотора. Подобным образом,предпочтительное расположение элемента регуляторной последовательности по отношению к гетерологичному гену, который помещают под его контроль, определяется расположением этого элемента в его естественном хромосомном наборе, т.е. в генах, из которых получен этот элемент. Опять-таки, в данной области техники известно, что также могут иметь место некоторые вариации по длине этого расстояния. Примеры промоторов, пригодных для использования в генетических конструкциях по настоящему изобретению, включают промоторы, полученные из генов вирусов, дрожжей,плесневых грибов, бактерий, насекомых, птиц,млекопитающих и растений, способных к функционированию в изолированных клетках или в регенерировавших из них целых организмах. Промотор может регулировать экспрессию смысловой, антисмысловой, рибозимной или соподавляющей молекулы конститутивно или 24 дифференциально, в зависимости от ткани, в которой имеет место экспрессия, в зависимости от стадии развития, в которой происходит экспрессия, или в зависимости от внешних воздействий, таких как физиологические стрессы, патогены или ионы металлов, среди прочего. Примеры промоторов включают промоторthaliana, напиновый семя-специфичный промотор, промотор Р 32, ВК 5-Т imm-промотор, lacпромотор, tac-промотор, промоторы фага лямбда L или g, промотор CMV (патент США 5168062), промотор Т 7, промотор lacUV5, ранний промотор SV40 (патент США 5118627),поздний промотор SV40 (патент США 5118627), промотор аденовируса, промотор бакуловируса Р 10 или полиэдриновый промотор(патенты США 5243041, 5242687, 5266317,4745051 и 5169784) и им подобные. Кроме специфических указанных здесь промоторов, пригодны также клеточные промоторы для так называемых конститутивных генов. Предпочтительными промоторами в соответствии с этим вариантом осуществления изобретения являются промоторы, способные к функционированию в клетках дрожжей, плесневых грибов или растений. Более предпочтительно, чтобы промоторы, пригодные для использования в соответствии с этим вариантом осуществления изобретения, были способными к функционированию в клетках, происходящих из жиросодержащих дрожжей, жиросодержащих плесневых грибов или культурных растений с масличными семенами, таких как лен, в том числе лен обыкновенный, лен, поступающий в продажу под торговой маркой Linola (далее здесь именуемый лен Linola), a также подсолнечник, сафлор, соя, кунжут, семена хлопчатника, арахис, маслина или масличная пальма,среди прочего.Linoia является зарегистрированной торговой маркой Организации научных и промышленных исследований Содружества (CSIRO),Австралия. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения прoмотор может происходить из геномных генов, кодирующих полипептид монооксигеназы по настоящему изобретению. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения промотор может происходить из высокоэкспрессируемого в семенах гена, такого как напиновый ген, среди прочих. Генетическая конструкция по настоящему изобретению может также включать последовательность терминатора и может быть встроена в подходящую клетку-хозяин, в которой она способна экспрессироваться, вырабатывая продукт гена рекомбинантного полипептида, или, в качестве альтернативы, в рибозимную или в антисмысловую молекулу. 25 Термин терминатор обозначает последовательность ДНК в конце единицы транскрипции, которая сигнализирует об окончании транскрипции. Терминаторы представляют собой 3'-нетранслируемые последовательности ДНК, содержащие сигнал полиаденилирования,который стимулирует добавление полиаденилированных последовательностей к 3'-концу первичного транскрипта. Терминаторы, активные в клетках, происходящих из вирусов, дрожжей,плесневых грибов, бактерий, насекомых, птиц,млекопитающих и растений, известны и описаны в литературе. Их можно выделить из бактерий, грибов, вирусов, животных и/или растений. Примеры терминаторов, особенно пригодных для использования в генетических конструкциях по настоящему изобретению, включают терминатор гена нопалинсинтазы (NOS) Agrobacterium tumefaciens, терминатор гена вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S, терминатор гена zein из кукурузы Zea mays, последовательности терминатора гена малой субъединицы (SSU) Рубиско, терминаторы последовательности гена вируса карликовости подземного клевера (SCSV), любой rho-независимый терминатор Е. coli, среди прочих. Специалистам в данной области техники известны и другие промоторные и терминаторные последовательности, которые могут быть пригодными для осуществления данного изобретения. Такие последовательности вполне можно использовать без проведения каких-либо дополнительных экспериментов. Генетические конструкции по настоящему изобретению могут также включать область начала репликации, которая требуется для репликации определенного типа клеток, например бактериальной клетки, в случае, когда требуется, чтобы указанная генетическая конструкция поддерживалась в эписомном генетическом элементе (например, в плазмиде или в молекуле космиды) в указанной клетке. Предпочтительные области начала репликации включают, не ограничиваясь ими, области начала репликации -fl-ori и colEl. Генетическая конструкция может также включать ген или гены селектируемого маркера,которые являются функциональными в клетке, в которую вводится указанная генетическая конструкция. Термин ген селектируемого маркера, как он используется в настоящем описании, включает любой ген, определяющий фенотип клетки,в которой он экспрессируется, и который используют, чтобы облегчить идентификацию и/или отбор клеток, трансфецированных или трансформированных с помощью генетической конструкции по настоящему изобретению. Подходящие гены селектируемых маркеров, рассматриваемые в настоящем описании,включают ген устойчивости к ампициллину(CAT) и ген люциферазы, среди прочих. Предпочтительно, чтобы выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержалась внутри описанной здесь генетической конструкции. Генетическая конструкция по настоящему изобретению может быть введена в клетку с помощью различных методов, известных специалистам в данной области техники. Используемые методы могут быть различными, в зависимости от того, какие методы известны и успешно применяются для данного конкретного организма. Способы введения рекомбинантной ДНК в бактериальные клетки, клетки дрожжей, или растений, грибов (включая плесневые грибы), в ткани или клетки птиц или млекопитающих включают, не ограничиваясь этим, трансформацию с использованием CaCl2 и ее вариации, в частности способ, описанный Hananan (1983),прямое введение ДНК в протопласты (Krens etal., 1982; Paszkowski et al., 1984), опосредованное ПЭГ введение в протопласты (Armstrong etal., 1990), бомбардировку микрочастицами,электропорацию (Fromm et al., 1985), микроинъекцию ДНК (Crossway et al., 1986), бомбардировку микрочастицами тканевых эксплантатов или клеток (Christou et al., 1988; Sanford, 1988),вакуум-инфильтрацию тканей нуклеиновой кислотой, или, в случае растений, опосредованный Т-ДНК перенос из Agrobacterium в ткань растения, как подробно описано An et al. (1985), Herrera-Estrella et al. (1983a, 1983b, 1985). При бомбардировке клеток микрочастицами, микрочастицы внедряются в клетку, в результате чего получают трансформированную клетку. При осуществлении настоящего изобретения можно использовать любую подходящую методологию баллистической трансформации клеток и любое подходящее для этого устройство. Примеры таких устройств и методов описали Stomp et al. (патент США 5122466), а также Sanford and Wolf (патент США 4945050). При использовании методов баллистической трансформации генетическую конструкцию можно внедрить в плазмиду, способную к репликации в клетке, подлежащей трансформации. Примеры микрочастиц, пригодных для использования в таких системах, включают золотые шарики размером от 1 до 5 мкм. Конструкция ДНК может быть нанесена на микрочастицы с помощью любого подходящего способа,такого как осаждение. В особо предпочтительном варианте осуществления изобретения, в котором генетическая конструкция включает смысловую молекулу, особо предпочтительно, чтобы полипептид рекомбинантной монооксигеназы, продуцированный из нее, был ферментативно активным. 27 В качестве альтернативы, в случае, если клетка происходит из многоклеточного организма, а также, когда существует подходящая технология, из трансформированной клетки может быть регенерирован целый организм в соответствии с методами, известными в данной области техники. Специалистам в данной области техники известны также методы трансформации, регенерации и размножения других типов клеток, таких как клетки грибов. В случае растений, растительные ткани,способные к последующему клональному размножению, с помощью органогенеза или эмбриогенеза, можно трансформировать с помощью генетической конструкции по настоящему изобретению и регенерировать из них целое растение. Выбор конкретной ткани зависит от систем размножения, имеющихся и наиболее подходящих для конкретных биологических видов, подвергаемых трансформации. Примеры таких тканей включают листовые диски, пыльцу, зародыши, семядоли, гипокотили, мегагаметофиты, каллусные ткани, существующие меристематические ткани (например, верхушечную меристему, пазушные почки и корневую меристему), а также индуцированную меристематическую ткань (например, меристему, полученную из семядоль или гипокотиля). Термин органогенез, как он используется здесь, означает процесс, с помощью которого из меристематических центров последовательно развиваются побеги и корни. Термин эмбриогенез, как он используется здесь, означает процесс, с помощью которого побеги и корни развиваются вместе, одновременно (а не последовательно), из соматических тканей или из гамет. Регенерированные трансформированные растения можно размножить с помощью различных способов, таких как клональное размножение или классические селекционные способы. Например, первое поколение трансформированных растений (Т 1) можно подвергнуть самоопылению, чтобы получить гомозиготное второе поколение трансформантов (Т 2), а далее растения Т 2 размножить с помощью классических селекционных способов. Рассматриваемые в настоящем описании регенерировавшие трансформированные организмы могут представлять собой ряд различных форм. Например, это могут быть химеры, состоящие из трансформированных клеток и нетрансформированных клеток; клональные трансформанты (т.е. все клетки которых трансформированы таким образом, что они содержат кассеты экспрессии); прививки трансформированных и нетрансформированных тканей (например, для растений на трансформированный корневой подвой привит нетрансформированный привой). 28 В соответствии с вышесказанным настоящее изобретение распространяется на растение,трансформированное молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, а также на семя и потомство такого растения, которые содержат указанную молекулу нуклеиновой кислоты. Следующий аспект настоящего изобретения касается способа уменьшения экспрессии гена, кодирующего полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, в клетке или в микроорганизме, включающего введение генетической конструкции настоящего изобретения в клетку или в микроорганизм и инкубацию указанной клетки или микроорганизма в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для осуществления экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид монооксигеназы, в данной генетической конструкции. В предпочтительном варианте осуществления стадия введения генетической конструкции включает стабильную трансформацию клетки или микроорганизма генетической конструкцией. В соответствии с этим вариантом осуществления изобретения клетка может происходить из дрожжей, грибов (включая плесневые грибы),насекомого, растения, птицы или млекопитающего. Также в соответствии с данным способом клетка может являться частью ткани, органа или целого растения. Поскольку рекомбинантный полипептид монооксигеназы может экспрессироваться в регенерировавшем трансформанте, а также и ехvivo, то один из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения касается способа получения рекомбинантного ферментативно активного полипептида монооксигеназы со смешанными функциями в клетке,причем указанный способ включает культивирование клетки, содержащей генетическую конструкцию настоящего изобретения, в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид монооксигеназы, в указанной генетической конструкции. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный способ включает стадию введения генетической конструкции в клетку перед культивированием клетки. Особо предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения касается способа получения рекомбинатного ферментативно активного полипептида монооксигеназы со смешанными функциями в трансгенном растении, включающий следующие стадии:(а) введение генетической конструкции по настоящему изобретению в клетку или ткань растения;(б) регенерацию трансформированного растения из указанной клетки или ткани; и(в) отбор трансформированного растения с высоким уровнем экспрессии в семенах ферментативно активного полипептида монооксигеназы, кодируемого указанной генетической конструкцией. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения растение представляет собой вид растения с масличными семенами с высоким уровнем продуцирования линолевой кислоты, например лен, в том числе лен Linola,лен обыкновенный, масличный рапс, подсолнечник, сафлор, соя, кунжут, семена хлопчатника, арахис, маслина европейская или масличная пальма, среди прочих. В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения растение представляет собой вид с масличными семенами с высоким уровнем продуцирования линолевой кислоты, например лен Linola, подсолнечник или сафлор, среди прочих. Следующий аспект настоящего изобретения касается рекомбинантного полипептида монооксигеназы Crepis palaestina со смешанными функциями, способного катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранного из группы, состоящей из(а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2; и(б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID No: 1 или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода. Другой аспект настоящего изобретения касается рекомбинантного полипептида монооксигеназы Crepis sp., за исключением Crepis palaestina, со смешанными функциями, способного катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранного из группы, состоящей из(а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No: 4; и(б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID No: 3 или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода. Следующий аспект настоящего изобретения касается рекомбинантного полипептида монооксигеназы Vernonia galamensis со смешанными функциями, способного катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, выбранного из группы,состоящей из(а) полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID No: 6; и(б) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID No: 5 30 или ее вариантами, полученными на основе вырожденности генетического кода. Описываемые здесь рекомбинатные ферментативно активные полипептида монооксигеназ со смешанными функциями особенно полезны для изменения внутриклеточного содержания эпоксигенизированной жирной кислоты. В соответствии с этим следующим аспектом настоящего изобретения является способ изменения внутриклеточного содержания эпоксигенизированной жирной кислоты, включающий культивирование клетки, содержащей генетическую конструкцию по настоящему изобретению, в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид монооксигеназы со смешанными функциями, в указанной генетической конструкции, и последующее инкубирование указанной клетки с жирнокислотным субстратом в течение такого времени и в таких условиях, которые достаточны для того, чтобы по меньшей мере одна углеродная связь указанного субстрата была преобразована в эпоксигруппу. В соответствии с этим способом клетка происходит из бактерий, дрожжей, грибов(включая плесневые грибы), насекомого, растения, птицы или млекопитающего. Более предпочтительно, чтобы клетка происходила из дрожжей, растения или гриба, а еще более предпочтительно - из жиросодержащих дрожжей или растения или гриба, или из растения с масличными семенами, которое в норме не экспрессирует полипептид монооксигеназы по настоящему изобретению на высоком уровне. В соответствии с настоящим способом клетка может являться составной частью ткани, органа или целого организма. Среди основных хозяйственно-ценных растений с масличными семенами, рассматриваемых в настоящем описании, предпочтительными являются генотипы льна с высоким содержанием линолевой кислоты, подсолнечник,кукуруза и сафлор. В качестве альтернативы также могут использоваться соя и выращиваемый на семена рапс, однако, они менее подходят с точки зрения максимального синтеза эпоксижирных кислот из-за того, что они содержит более низкие уровни субстрата, представляющего собой линолевую кислоту, а также из-за присутствия активной 15-десатуразы, которая конкурирует с эпоксигеназой за используемую в качестве субстрата линолевую кислоту. Альтернативный вариант осуществления изобретения представляет собой трансформацию льна Linola (=лен с низким содержанием линоленовой кислоты) с помощью монооксигеназы по настоящему изобретению. Лен Linola обычно содержит около 70% линолевой кислоты, причем лишь очень малая ее доля (2%) 31 превращается впоследствии в линоленовую кислоту с помощью 15-десатуразы (Green, 1986). В предпочтительном варианте способа жирнокислотный субстрат представляет собой ненасыщенную жирную кислоту, а углеродная связь указанного субстрата, которая преобразуется в эпоксигруппу, представляет собой углеродную двойную связь. Рассматриваемые здесь предпочтительные ненасыщенные жирные кислоты, используемые в качестве субстратов, включают, не ограничиваясь нижеперечисленным, пальмитолеиновую кислоту, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, 9,15-октадекадиеновую кислоту и арахидоновую кислоту, среди прочих. В видах растений, естественно содержащих высокие уровни верноловой кислоты, содержащаяся в них 12-эпоксигеназа может быть очень эффективной для эпоксидизирования линолевой кислоты. Вследствие этого, настоящее изобретение, в частности, касается экспрессии рекомбинантной 12-эпоксигеназы, происходящей из Vernonia spp. и Crepis spp., с высокими уровнями в трансгенных масличных семенах во время синтеза масел, в результате чего в них продуцируются высокие уровни верноловой кислоты. В соответствии с этим линолевая кислота является особо предпочтительным субстратом для этого варианта осуществления изобретения. Дополнительные виды субстратов не исключаются. Продукты молекул субстратов, перечисленных выше, легко могут определить специалисты в данной области техники без проведения дополнительных экспериментов. Особо предпочтительные эпоксижирные кислоты, продуцируемые в соответствии с настоящим изобретением, включают 12,13-эпокси-9-октадеценовую кислоту (верноловую кислоту) и 12,13 эпокси-9,15-октадекадиеновую кислоту, среди прочих. Условия для инкубации клеток, экспрессирующих рекомбинантную монооксигеназу, в присутствии молекулы субстрата варьируют в зависимости, по меньшей мере, от поглощения субстрата клеткой и от сродства монооксигеназы по отношению к молекуле субстрата в конкретных выбранных условиях окружающей среды. Оптимальные условия могут легко определить специалисты в соответствующей области техники. Авторы настоящего изобретения также показали, что монооксигеназы со смешанными функциями (ММО), которые осуществляют каталитические функции, такие как десатурирование, ацетиленирование, гидроксилирование и/или эпоксигенирование, образуют семейство генов, имеющих в значительной степени сходные нуклеотидные и аминокислотные последо 004568 32 вательности. Например, ферменты десатураза,ацетиленаза, гидроксилаза и/или эпоксигеназа,которые действуют на молекулы субстрата,имеющие схожие характеристики длины цепи и положения любой углеродной двойной связи(или связей) (если таковые присутствуют), более близко родственны друг с другом, чем с ферментами, действующими на другие субстраты, и их можно рассматривать как семейство. Не будучи связанным какой-либо теорией или режимом действия, сходство последовательностей между членами любого семейства генов имеет в своей основе идентичность используемого субстрата и биохимическое сходство реакционных событий, происходящих в являющейся их мишенью углеродной связи во время реакции модификации, что делает возможным предположение, что дивергентные последовательности в пределах семейства могут включать каталитические детерминанты или, по меньшей мере, их функциональную часть, которая вносит вклад в специфические каталитические свойства членов семейства. Одним из примеров семейства являются ферменты десатураза, ацетиленаза, гидроксилаза и/или эпоксигеназа, которые катализируют соответственно десатурирование, ацетиленирование, гидроксилирование и/или эпоксигенирование позиции 12 линолевой кислоты (далее здесь называемое семейство С 18 12-ММО). Авторы настоящего изобретения произвели сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей членов семейства С 18 12-ММО, чтобы определить их дивергентные области, которые потенциально включают детерминанты альтернативных каталитических функций в позиции 12 (предполагаемые каталитические детерминанты). Кроме того, наличие таких семейств ММО,модифицирующих жирные кислоты, рассматривается в отношении жирных кислот с другой длиной цепи и другими позициями двойных связей. Например, С 18 15-десатураза рассматривается как принадлежащая к семейству родственных ферментов, способных к десатурированию, ацетиленированию, гидроксилированию и/или эпоксигенированию позиции 15 жирнокислотных субстратов, а именно к семейству С 18 15-MМO. Настоящее изобретение ниже описывается со ссылками на примеры, которыми оно не ограничивается. Пример 1. Характеристика эпоксижирных кислот в Euphorbia lagascae и Crepis spp. Семена, полученные от дикого видаEuphorbia lagascae и от различных видов Crepis,подвергли скринингу с помощью газожидкостной хроматографии на присутствие эпоксижирных кислот. Как показано в табл. 3, масло, полученное из семян Euphorbia lagascae, содержит очень 33 высокие уровни относящейся к эпоксижирным кислотам верноловой кислоты. Показано также,что семена Crepis palaestina содержат 61,4% по массе верноловой кислоты и 0,17% по массе относящейся к ацетиленовым жирным кислотам крепениновой (crepenynic) кислоты, от общей массы жирных кислот (табл. 3). Таблица 3 Жирно-кислотный состав липидов, происходящих из семян Crepis alpina, Crepis palaestina и Рассчитано на основе % площади от общих интегрированных площадей пика при определении методом газожидкостной хроматографии метиловоэфирных производных липидов семян. Пример 2. Биохимическая характеристика линолеат-12-эпоксигеназ в Euphorbia lagascae и Crepis palaestina. Фермент линолеат-12-эпоксигеназа синтезирует верноловую кислоту из линолевой кислоты. Линолеат-12-эпоксигеназы, происходящие из Euphorbia lagascae и Crepis palaestina,локализованы в микросомах. Ферменты из этих видов растений способны по меньшей мере оставаться активными в мембранных (микросомных) фракциях, полученных из развивающихся семян. Препараты мембран из Euphorbia Iagascae получали и анализы их эпоксигеназной активности проводили, как описано в публикацииBafor et al. (1993), причем инкубацию осуществляли с NADPH (никотинамид-аденин-динуклеотидфосфат, восстановленный), кроме особо оговоренных случаев, указанных в табл. 4. Экстракцию липидов, разделение и метилирование,а также разделение с помощью газожидкостной хроматографии и радио-газожидкостной хроматографии осуществляли по существу так, как описано в публикациях Kohn et al. (1994) и Bafor et al. (1993). Препараты мембран Crepis alpina и Crepispalaestina получали следующим образом. Растения Crepis alpina и Crepis palaestina выращивали в теплицах, семена собирали в средней стадии их развития (через 17-20 дней после цветения). Семядоли выдавливали из семенных оболочек,растирали до гомогенного состояния с помощью ступки и пестика, в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,2, содержащем 0,33 М сахарозы, 4 мМ(никотинамид-аденин-динуклеотидфосфата), 2 мМ CoASH, 1 мг/мл альбумина из бычьей сыворотки и 4000 единиц каталазы на 34 мл. Гомогенат центрифугировали в течение 10 мин при 18000 х g, а полученную надосадочную жидкость центрифугировали 60 мин при 150000 хg, чтобы получить микросомный осадок. Стандартные анализы на десатуразу, ацетиленазу и эпоксигеназу с микросомными мембранами из видов Crepis осуществляли при 25 С с микросомными препаратами, эквивалентными 0,2 мг микросомного белка, ресуспендированными в свежем буфере для гомогенизации и в 10 ммоль либо [1-14 С]18:1-СоА, либо [1-14C] 18:2-СоА (удельная активность 85000 распадов в минуту/ммоль), в общем объеме 360 мкл. Если в качестве совосстановителя использовалиNADPH, мембраны ресуспендировали в буфере для гомогенизации, в котором NADH был заменен на NADPH. Были получены биохимические характеристики микросомной линолеат-12-эпоксиназы,происходящей из Euphorbia lagascae и Crepispalaestina, и полученные данные сравнили с биохимическими характеристиками ферментов олеат-12-десатуразы и линолеат-12-ацетиленазы, полученных из микросомных препаратовCrepis alpina (табл. 4). Как показано в табл. 4, линолеат-12 эпоксигеназа из Crepis palaestina проявляет биохимические свойства, подобные свойствам линолеат-12-ацетиленазы и олеат-12-десатуразы из Crepis alpina, и поскольку все эти три фермента требуют О 2, то они работают одинаково хорошо как с NADH, так и с NADPH, используемыми в качестве совосстановителей, и ингибируются цианидом, а не моноокисью углерода. Кроме того, ни один из этих ферментов не ингибируется моноклональными антителами, эффективными против цитохром-Р-450-редуктазы. Данные табл. 4 позволяют сделать вывод,что линолеат-12-эпоксигеназа Crepis palaestina принадлежит к тому же самому классу ферментов, что и микросомальная олеат-12-десатуразаCrepis alpina и линолеат-12-ацетиленаза. В противоположность этому, линолеат 12-эпоксигеназа Euphorbia lagascae требует в качестве совосстановителя NADPH, не ингибируется цианидом, но ингибируется моноокисью углерода (табл. 4). Кроме того, авторы настоящего изобретения установили, что линолеат 12-эпоксигеназа Euphorbia lagascae ингибируется моноклональными антителами, эффективными против фермента цитохром-Р-450 редуктазы. Эти данные позволяют сделать вывод, что линолеат-12-эпоксигеназа Euphorbialagascae принадлежит к классу белков цитохром Р 450, и поэтому не является биохимически родственной линолеат-12-эпоксигеназе Crepis palaestina. Таблица 4 Сравнение биохимических характеристик эпоксигеназ, ацетиленаз и десатураз,происходящих из Crepis spp. и Euphorbia lagascae Вариант Моноокись углерода Антитела против Р 450 редуктазы (C5A5) Активность ферментов (% от контроля) С. alpina С. alpina С. palaestina E. lagascae олеат- линолеат- линолеат- линолеат 12-де- 12-аце- 12-эпок- 12-эпоксатураза тиленаза сигеназа сигеназа 85 Пример 3. Стратегия клонирования эпоксигеназных генов Crepis palaestina. Клонирование эпоксигеназных геновCrepis palaestina основано на характеристиках ферментов С. Palaestina и Crepis alpina, описанных в предыдущих примерах. В частности, поли (А)+ РНК выделили из развивающихся семян Crepis palaestina с помощью набора для очистки мРНК QuickPrep Micro(Pharmacia Biotechnology) и использовали для синтеза двухцепочечной кДНК с использованием в качестве затравки олиго d(T). Двухцепочечную кДНК лигировали с адапторамиEcoRI/NotI (Pharmacia Biotechnology) и сконструировали библиотеку кДНК с помощью набора для клонирования кДНК ZAP-cDNA Gigapack(Stratagene). Одноцепочечную кДНК получили на основе РНК, выделенной из развивающихся семянCrepis alpina с помощью стандартных методов. ПЦР-фрагмент, обозначенный как D12V (последов.7), получили путем амплификации одноцепочечной кДНК с помощью праймеров, выведенных из аминокислотных последовательностей растительных монооксигеназ со смешанными функциями. Затем фрагмент D12V был рандомизированно помечен и использован для скрининга библиотеки кДНК Crepis palaestina, описанной выше, на мембранных фильтрах Hybond N+(Amersham) в соответствии с инструкциями изготовителя, c использованием стандартных условий гибридизации. Этот подход привел к выделению рекомбинантного бактериофага, обозначенного Cpal2. Определили нуклеотидную последовательность кДНК Cpal2 и представили ее в последов.1. Клон кДНК Cpal2 оказался полноразмерным. Схема вектора экспрессии, содержащего кДНК Cpal2, показана на фиг. 1. Представленная на ней генетическая конструкция была получена для введения в растительный материал с 36 целью получения трансгенного растения, экспрессирующего эпоксигеназу по настоящему изобретению. Специалисты в данной области техники согласятся с тем, что подобные векторы экспрессии можно сконструировать без проведения дополнительных экспериментов и использовать их для получения трансгенных растений, экспрессирующих любые генетические последовательности по настоящему изобретению, заменив кДНК Cpal2 последовательностью другого структурного гена. Как показано на фиг. 2, нуклеотидная последовательность кДНК Сrер 1 кодирует полипептид, близко родственный на аминокислотном уровне, по меньшей мере по отношению к ацетиленазному ферменту С. alpina (Bafor et al. 1997; заявка на международный патентPCT/SE 97/00247). Вставку в 1,4 т.п.н. из рCpal2 секвенировали (последов.1) и показали, что она содержит открытую рамку считывания, которая кодирует полипептид длиной в 374 аминокислоты. Выведенная аминокислотная последовательность Cpal2 обладает 81% идентичностью и 92% сходством с 12-ацетиленазой из Crepis alpina и примерно 60% идентичностью и 80% сходством с белками растительной микросомальной 12 десатуразы (фиг. 2). Однако аминокислотная последовательность полипептида, кодируемогоCpal2, значительно отличается от аминокислотных последовательностей неэпоксигеназных ферментов. В частности, Cpal2 имеет делецию шести прилегающих друг к другу аминокислот в 5'-концевой области по сравнению со всеми микросомальными 12-десатуразами, а также делецию двух соседних аминокислот в 3'концевой области по сравнению с 12 ацетиленазой Сrерl (фиг. 2). Хотя связанные с мембранами гены десатураз жирных кислот обладают низкой гомологией последовательностей, все они содержат три обогащенные гистидином области, приведенные ниже:(iii) His-(Xaa)2-3-His-His,где His обозначает гистидин, Xaa обозначает остаток любой встречающейся в природе аминокислоты, приведенный в табл. 1 настоящего описания, составляющая (Хаа)3-4 обозначает последовательность аминокислот, содержащую три или четыре повтора Xaa, а составляющая(Хаа)2-3 обозначает последовательность аминокислот, содержащую два или три повтора Xaa. Предполагают, что эти обогащенные гистидином области являются частью активного центра фермента (Shanklin et al., 1994). Аминокислотная последовательность, кодируемая кДНК Cpal2, содержит три обогащенные гистидином области, схожие, но не идентичные с обогащенными гистидином областями 37 12-десатуразных ферментов. Эти данные позволяют сделать вывод, что кДНК Cpal2 кодирует фермент, принадлежащий к классу ферментов, представляющих собой монооксигеназы со смешанными функциями. Анализ жирных кислот, представленный выше, в примере 1, показывает, что верноловая кислота присутствовала по меньшей мере в семенах Crepis palaestina. Это фермент фактически может присутствовать исключительно в семенах С. palaestina. Экспрессию гена Cpal2 изучали с использованием в качестве гибридизационного зонда 3'-нетранслируемой области клона кДНКCpal2, на нозерн-блотах мРНК, выделенной из развивающихся семян и листьев С. palaestina. Как показано на фиг. 3, высокие уровни экспрессии гена Cpal2 были обнаружены в развивающихся семенах, однако, в листьях экспрессия этого гена вообще не была обнаружена. Эти данные согласуются с профилем ферментативной активности линолеат-12-эпоксигеназы С.palaestina в этих тканях. Пример 4. Стратегия клонирования эпоксигеназных генов Euphorbia lagascae. Клонирование эпоксигеназных геновEuphorbia lagascae было основано на характеристиках ферментов Е. lagascae, описанных в предшествующих примерах. В одном из подходов, предпринятых для клонирования эпоксигеназных генов Euphorbialagascae, РНК выделяли из незрелых зародышейEuphorbia lagascae, взятых в стадии активного синтеза верноловой кислоты, и использовали ее для конструирования библиотеки кДНК. Библиотеку кДНК конструировали в вектореLambda ZAP II (Stratagene), как описано в предыдущем примере, за исключением того, что вставки кДНК клонировали направленным образом в сайты EcoRI-XhoI плазмидного вектора,встроенного в вектор лямбда. Синтезировали вырожденный ПЦРпраймер, представленный на фиг. 4 (последов.18), и использовали его для амплифицирования нуклеотидных последовательностей, кодирующих последовательности фермента Р 450 из библиотеки кДНК Euphorbia lagascae. Для реакций ПЦР амплификации аликвоту в 100 мкл из библиотеки кДНК экстрагировали с помощью смеси фенол:хлороформ (1:1, по объему), осаждали ДНК путем добавления 2 объемов этанола и ресуспендировали в 100 мкл воды. Аликвоту(1 мкл) ресуспендированной ДНК использовали в качестве матрицы в реакции амплификации ПЦР. Реакции ПЦР проводили в 10 мкл полимеразного буфера TaqI, содержащего по 200 мкМ каждого dNTP (дезоксинуклеозидтрифосфата),10 пмоль вырожденного праймера, 1 пмоль праймера полимеразного промотора Т 7 и 0,4 единицы полимеразы TaqI. Условия амплификации были следующими: 2 мин при 94 С и 5 циклов, каждый из кото 004568 38 рых включал 1 мин при 48 С, затем 2 мин при 72 С, затем 30 с при 93 С, после чего следовали 28 циклов, каждый из которых включал 30 с при 55 С, затем 90 с при 72 С, затем 30 с при 93 С,и, наконец, 1 цикл, включающий 30 с при 55 С,затем 10 мин при 72 С и затем 1 мин при 25 С. Продукты ПЦР очищали и расщепляли с помощью EcoRI и Xhol, а затем субклонировали в вектор Bluescript для характеризации последовательностей. Было обнаружено, что один из ПЦР-клонов кодирует последовательность Р 450,который и был использован в качестве зонда для выделения полноразмерного клона кДНК. Эта нуклеотидная последовательность представлена в последов.19. последов.19 имела сходство с другими членами семейства 2 С генов Р 450. В частности, с использованием программы BLAST было показано, что последов.19 в среднем имеет 40%-ную идентичность с последовательностями арахидоновых эпоксигеназ человека и крысы. Кроме того, было показано, что транскрипт последов.19 экспрессировался в семенах Euphorbia lagascae, но не экспрессировался в корнях и в листьях (фиг. 5 В). Транскрипт последов.19 был обнаружен в развивающихся семенах Vernonia galamensis, но не был обнаружен в семенах Е. cyparissis или льна - двух видов, которые не продуцируют эпоксижирные кислоты (фиг. 5 А и 5 В). В альтернативном подходе, применявшемся при клонировании эпоксигеназных генов Euphorbialagascae, использовали стратегию вычленяющей (substractive) гибридизации, чтобы выделить гены, экспрессия которых характерна для организма, продуцирующего высокие уровни эпоксижирных кислот. В частности, способ вычленяющей гибридизации, представленный на фиг. 6, применяли для выделения эпоксигеназных генов, экспрессия которых характерна для Euphorbia lagascae,продуцирующего высокие уровни эпоксижирной кислоты, а именно верноловой кислоты(пример 1), и которые не экспрессируются в близкородственном виде Euphorbia cyparissus,не вырабатывающем верноловой кислоты. В соответствии с этим мРНК выделяли из развивающихся зародышей Euphorbia lagascae в стадии, когда они активно синтезировали верноловую кислоту, и использовали для получения так называемой тестерной кДНК. Кроме того, мРНК выделяли из развивающихся зародышей Е. cyparissus (в такой же стадии развития, что и для Е. lagascae) и использовали для получения так называемой драйверной кДНК. В результате вычленяющей гибридизации получили библиотеку, которая была обогащена последовательностями, экспрессируемыми исключительно в Euphorbia lagascae. Клоны из этой библиотеки секвенировали, и по меньшей мере две последовательности идентифицировали как кодирующие белки Р 450 на основе сход 39 ства с другими последовательностями Р 450 из базы данных. Эти два клона Р 450 ПЦР использовали в качестве зондов для выделения полноразмерных клонов кДНК из библиотеки кДНК,о которой говорилось ранее. Было обнаружено, что одна из выделенных Р 450 кДНК, содержащая последовательность нуклеотидов, представленную в последов.20,экспрессируется в тканях Euphorbia lagascae(фиг. 7 В), и при этом ни одного гомологичного транскрипта не было обнаружено в ткани из семян Е. cyparissus или льна - двух видов, не продуцирующих эпоксижирные кислоты. Выведенная аминокислотная последовательность последов 20 указывает на то, что клон кДНК имеет полную длину и кодирует фермент Р 450. Эти данные подтверждают, что кДНК, представленная в качестве примера в последов.20, может кодировать эпоксигеназу, например линолеат-12-эпоксигеназу, которая преобразовывает линолевую кислоту в верноловую кислоту. Пример 5. Демонстрация эпоксигеназной активности. Подтверждение того, что клоны кДНК, иллюстрирующие в качестве примеров настоящее изобретение, кодируют эпоксигеназную активность, было получено посредством трансформации Arabidopsis thaliana, который не продуцирует эпоксижирные кислоты, в частности верноловую кислоту, с помощью каждого отдельного изучаемого клона, и исследования трансформированных тканей на присутствие эпоксигенизированных жирных кислот, которые они в норме не продуцируют, или на присутствие гидроксижирных кислот, которые могли образоваться в процессе метаболизма из эпоксигенизированных жирных кислот под воздействием эндогенных эпоксидгидролаз (Blee and Schuber, 1990). Эпоксигеназную кДНК, включающую последовательность 1, клонировали в конструкцию бинарного вектора, показанную на фиг. 8. Вкратце, последовательность кДНК субклонировали из плазмиды рCpal2 (фиг. 1) в бинарную плазмиду, посредством расщепления рCpa12EcoRI и достраивания концов рестрикционного фрагмента с помощью фермента Т 4 ДНКполимеразы. Бинарный вектор (фиг. 8) расщепляли ВаmНI, и также достраивали липкие концы с помощью Т 4 ДНК-полимеразы. Для реакций достраивания концов 1 мкг вставки кДНК или ДНК линейного бинарного вектора ресуспендировали в 50 мкл буфера Т 4-ДНК-полимеразы, 33 мМ Трис-ацетата с рН 7,9, 66 мМ ацетата калия,10 мМ ацетата магния и 5 мМ ДДТ, с добавкой по 100 мМ каждого dNTP и 0,1 мг/л BSA, а также 3 единиц Т 4 ДНК-полимеразы, и инкубировали в течение 6 мин при 37 С. Реакцию останавливали путем нагревания при 75 С в течение 10 мин ДНК с тупыми концами, и ДНК бинарного вектора лигировали с помощью Т 4 ДНКлигазы, в стандартных условиях для лигирова 004568 40 ния, рекомендуемых фирмой Promega. Отобрали клоны, в которых последовательность 1 была проклонирована после напинового промотора, в смысловой ориентации, что позволяло экспрессировать полипептид эпоксигеназы. Бинарная плазмида, содержащая последовательность 1 в смысловой ориентации, расположенную под контролем укороченного напинового промотора, представлена на фиг. 9. Бинарной плазмидой, представленной на фиг. 9, трансформировали с помощью электропорации штамм Agrobacterium AGLI и использовали для трансформации Arabidopsis thaliana. Трансгенные растения A. thaliana получили в соответствии со способом, описанным Valvekens et al. (1988) и Dolferus et al. (1994). Трансгенные и нетрансформированные(т.е. контрольные) растения выращивали до созревания. Зрелые семена с каждого растения анализировали на жирно-кислотный состав с помощью стандартных методов. Установили растения, являющиеся первичными трансформантами (Т 0), и с каждого растения собрали семена Т 1 и анализировали их на жирнокислотный состав с помощью газовой хроматографии. Было показано, что двенадцать растений Т 0 содержали верноловую кислоту в липидах своих семян Т 1, в концентрациях от 0,9 до 15,8% от общего количества жирных кислот, в то время как нетрансформированные контрольные растения не содержали верноловой кислоты(табл. 5). Наиболее высокоэкспрессирующей линией была линия Cpal-17, для которой на фиг. 10 представлены профили элюирования, полученные при газожидкостной хроматографии (из анализов для упакованной и капиллярной колонок). На фиг. 10 также показан профиль элюирования, полученный при газожидкостной хроматографии (из анализов для упакованной колонки) для нетрансформированных контрольных растений. Таблица 5 Уровни верноловой кислоты в трансгенных линиях A. thaliana, экспрессирующих последовательность 1 Верноловая кислотарастения Т 0(мас.% от общего содержания жирных кислот в семенах) Сраl-4 1,4 Сраl-5 1,1 Сраl-8 2,7 Сраl-9 0,9 41 В качестве альтернативы или в дополнение, каждую из описанных здесь предполагаемых последовательностей эпоксигеназы жирных кислот, находящуюся под контролем напинового семя-специфического промотора, трансформировали в Linum usitatissimum (лен) и вArabidopsis thaliana. Трансгенные растения льна и Arabidopsis thaliana исследовали на присутствие эпоксижирных кислот в маслах развивающихся семян. Предыдущие исследования показали, что если эпоксижирные кислоты присутствуют при развитии семян, то они включаются в триглицериды (пример 10). В качестве альтернативы, дрожжи также трансформировали клонами эпоксигеназы по настоящему изобретению и анализировали на продуцирование эпоксижирных кислот. Пример 6. Подтверждение с помощью масс-спектрометрии наличия эпоксижирных кислот в семенах Arabidopsis T1, образовавшихся на первичных трансгенных растениях Т 0. Газовая хроматография метиловых сложных эфиров, полученных из липидов семян T1 растений Arabidopsis thaliana, трансформированных с помощью Cpal-12 (пример 5), показала присутствие двух дополнительных жирных кислот по сравнению с семенами нетрансформированных контрольных растений. Первое из этих соединений имело время удерживания,эквивалентное этому показателю стандарта верноловой кислоты. Второе соединение имело более длительное время удерживания и было предположительно идентифицировано как 12,13-эпокси-9,15-октадекадиеновая кислота,ожидаемое производное верноловой кислоты,получающееся в результате десатурирования в позиции 15 с помощью эндогенной 15 десатуразы Arabidopsis thaliana. Подтверждение точной идентичности двух пиков получили с помощью массспектрометрии диодов, полученных из фракции эпоксижирных кислот, происходящих от Сраl2 трансформированных растений. Далее диолы преобразовали в триметилсилиловые эфиры и проанализировали с помощью метода массспектрометрии GC-MS DB23 на капиллярной колонке из кварцевого стекла (Hewlett-Packard 5890 II GC, соединенной с Hewlett-Packard 5989 А MS, работающих в электронном ударе при 70 eV15). Общая ионная хроматограмма показала наличие двух пиков, указанных ниже:(i) Первый пик элюирования имел отчетливо выраженные ионы массой 73, 172, 275 и 299, что указывает на то, что эпоксильная группа была расположена на позиции С-12 С 18 жирной кислоты и что имелась двойная связь между эпоксильной группой и карбоксильным концом. Эти масс-спектры были идентичными со спектрами триметилсилилэфирных производных диолов, полученных из чистой верноловой кислоты (12,13-эпокси-9-октадеценовой кислоты); и(ii) Второй пик элюирования имел отчетливо выраженные ионы массой 73, 171, 273 и 299, что указывает на присутствие двойных связей, а также на то, что эпоксильная группа расположена в позиции С 12 С 18-жирной кислоты,что согласуется с масс-спектром для 12,13 эпокси-9,15-октадекадиеновой кислоты. Пример 7. Анализ жирных кислот Сраl2 трансгенных растений Arabidopsis. Семена T1, полученные от трансформированных растений Arabidopsis thaliana, экспрессирующих клон кДНК Сраl2 под контролем напинового промотора, проращивали и получали растения Т 1 от пяти линий Т 0 ( 4, 8, 13, 17 и 21, показанных в табл. 5). С каждого растения Т 1 собирали семена Т 2 и анализировали их на жирно-кислотный состав. Как и ожидалось, потомство трансформантов 4, 8, 13 и 21 (табл. 5) расщеплялось по наличию верноловой кислоты, причем в растениях, содержащих верноловую кислоту, ее содержание достигало 3,1%(табл. 6). Все растения Т 1, содержащие верноловую кислоту (т.е. эпокси 18:1 в табл. 6), также содержали 12,13-эпокси-9,15-октадекадиеновую кислоту (т.е. эпокси 18:2 в табл. 6; см. также фиг. 11), что указывает на то, что некоторое количество верноловой кислоты, синтезированное Сраl2-эпоксигеназой, было впоследствии десатурировано эндогенной 15-десатуразой. Таблица 6 Жирно-кислотный состав самоопыленных семян,полученных от растений T1, происходящих от пяти первичных Сраl2-трансформантов Arabidopsis thaliana 44 дящих от АР 20 и АР 21 и содержащих верноловую кислоту, содержали также 12,13-эпокси 9,15-октадекадиеновую кислоту. Таблица 7 Жирно-кислотный состав десяти индивидуальных семян Т 1, полученных от первичных Сраl2-трансформантов АР 20 льна Linola Таблица 8 Жирно-кислотный состав десяти индивидуальных семян Т 1, полученных от первичных Сраl2-трансформантов АР 21 льна Linola Пример 8. Анализ жирных кислот Сраl2 трансгенных растений льна Linola. Вышеописанную конструкцию бинарной плазмиды, содержащей клон кДНК Сраl2 (фиг. 9), трансформировали в Agrobacterium tumefaciens, штамм AGLI, с помощью электропорации. Трансформированный A. tumefaciens использовали для инфецирования эксплантатов льна Linum usitatissimum сорта Эйр, как описано в публикации Lawrence et al. (1989), за исключением того, что в качестве основной среды для индукции корнеобразования из регенерировавших побегов использовали среду MS. Для двух первичных трансформантов льнаLinola (растений Т 0), обозначенных АР 20 и АР 21, была подтверждена их трансгенная природа с помощью ПЦР, с использованием праймеров, направленных против гена Сраl2, а также путем демонстрации устойчивости этих растений к канамицину. По десять семян Т 1 с каждого растения индивидуально анализировали на жирно-кислотный состав с помощью стандартных методов . Как показано в табл. 7, семена, полученные от АР 20, расщеплялись на 3 класса, при этом три семени не содержали верноловой кислоты, в двух семенах содержание верноловой кислоты было выше 0,7%, а пять семян содержали промежуточные уровни (0,13-0,47%) верноловой кислоты. Подобным же образом, семена, полученные от АР 21, расщеплялись на 3 класса, при этом пять семян не содержали верноловой кислоты, в двух семенах содержание верноловой кислоты было выше 0,25%, а три семени содержали промежуточные уровни (0,09-0,14%) верноловой кислоты (табл. 8). Таким образом, всего было получено двенадцать семян, содержащих верноловую кислоту. Восемь из этих двенадцати семян, происхо Из устойчивых к канамицину проростков растения АР 20 получили четыре растения Т 1. Впоследствии было показано, что все эти четыре растения содержали верноловую кислоту в своих семенах Т 2 (табл. 9). Уровни содержания эпоксижирных кислот 18:2 в этих семенах Т 2 не анализировали. Таблица 9 Жирно-кислотный состав семян Т 2, полученных от потомства Сраl2-трансформантов T1 AP20 льна Linola Пример 9. Продуцирование эпоксижирных кислот в трансгенных организмах. Продуцирование богатого верноловой кислотой масла было достигнуто посредством трансформации описанным здесь геном эпоксигеназы, в частности последов.1, Arabidopsisthaliana, экспрессирующие последов.1, продуцируют в своих семенах высокие уровни верноловой кислоты по отношению к другим жирным кислотам. В частности, в одной трансгенной линии, (Cpal-17), количество продуцируе 45 мой верноловой кислоты достигало 15,2% (по массе) от общего содержания жирных кислот в семенах. Продуцирование богатого верноловой кислотой масла было также достигнуто путем трансформации описанным здесь геном эпоксигеназы, представленным в любой из последов.1, 3, 5, 19 или 20 и предпочтительно в любой из последов.1, 3 или 5, любого накапливающего масло организма, который в норме имеет очень высокие уровни линолевой кислоты и минимальную активность других конкурирующих ферментов, способных использовать линолевую кислоту в качестве субстрата. Генетические последовательности по настоящему изобретению расположены под контролем промотора, который обеспечивает высокий уровень экспрессии в масличных семенах, например напинового семя-специфичного промотора. В одном из альтернативных подходов к трансформации А. thaliana высоколинолевые генотипы льна, подсолнечника, кукурузы или сафлора трансформируют геном эпоксигеназы по настоящему изобретению. Трансгенные растения продуцируют высокие уровни верноловой кислоты во время синтеза масла в семенах, в случае, если ген эпоксигеназы экспрессируется на высоких уровнях. При альтернативном подходе, лен Linola(=лен с низким содержанием линоленовой кислоты) трансформируют геном эпоксигеназы по настоящему изобретению. Трансгенные растения льна Linola продуцируют высокие уровни верноловой кислоты во время синтеза масла в семенах, в случае высоких уровней экспрессии гена эпоксигеназы. Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что меченая верноловая кислота,подаваемая к развивающимся семенам льна, не разлагалась, а включалась в запасные липиды во всех трех позициях молекулы триглицерида (см. пример 10). В соответствии с этими данными высокие уровни верноловой кислоты, синтезированные с помощью интродуцированной эпоксигеназы, легко откладываются в триглицеридах масла семян этого вида растений. Пример 10. Включение олеиновой кислоты и верноловой кислоты в липиды семядоль развивающихся семян льна. Отделенные от развивающихся семян льна семядоли (по шесть пар на каждую инкубацию,по две инкубации), взятые в средней стадии развития семян (20 суток после цветения), инкубировали с 10 нмоль аммониевых солей, либо[1-14C]верноловой кислоты (удельная активность 3000 распадов в минуту/нмоль), либо [114 С]олеиновой кислоты (удельная активность 5000 распадов в минуту/нмоль), в 0,2 мл фосфатного буфера с рН 7,2, в течение 30 мин при 30 С. Затем семядоли трижды промывали 1 мл дистиллированной воды и либо немедленно подвергали экстрагированию с помощью UltraTurrax согласно Bligh and Dyer (1959), либо дополнительно инкубировали перед экстрагированием в 0,5 м. 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,2 еще от 90 до 270 мин. Аликвоту липидов в хлороформной фазе метилировали и разделяли на силикагелевых пластинах для тонкослойной хроматографии в смеси n-гексана, диэтилэфира и уксусной кислоты (85:15:1). Остальные липиды в хлороформной фазе каждого образца наносили на две отдельные силикагелевые пластины для тонкослойной хроматографии, и липиды разделяли в смеси хлороформа, метанола, уксусной кислоты и воды (85:15:10:3,5 по объему) для разделения полярных липидов, и в смеси nгексана, диэтилэфира и уксусной кислоты(60:40:1,5), для разделения нейтральных липидов. Области, соответствующие миграции аутентичных липидам стандартов, удаляли, и для каждого липида количественно определяли радиоактивность путем жидкостной сцинтилляции. Выход метки 14 С в хлороформной фазе изображен на фиг. 12. Несколько более половины добавочной радиоактивности как из кислоты,так и из[14 С]верноловой кислоты было поглощено семядолями, а затем было извлечено в виде липофильных веществ после 30 мин импульсного введения метки. Это количество оставалось фактически неизменным в течение дальнейших 270 мин инкубации для обоих субстратов. Разделение радиоактивных метиловых сложных эфиров показало, что большая часть радиоактивности (92%) в экспериментах с введением[14 С]верноловой кислоты присутствовала в соединениях с такой же самой миграцией, как у метилвернолеата, что указывает на то, что эпоксильная группа оставалась интактной в семядолях семян льна в течение 270 мин инкубации. После 30 мин инкубации около 28% активности, полученной в результате введения[14 С]верноловой кислоты, которая присутствовала в хлороформной фазе, приходилось на фосфалидинхолин, и радиоактивность уменьшилась всего лишь на 5% после 300 мин инкубации (фиг. 13). После 30 мин инкубации около 22% активности, полученной в результате введения[14 С]олеиновой кислоты, которая присутствовала в хлороформной фазе, приходилось на фосфалидинхолин, и радиоактивность уменьшилась на 11% после 300 мин инкубации (фиг. 13). После 30 мин инкубации около 32% активности, полученной в результате введения[14 С]верноловой кислоты, которая присутствовала в хлороформной фазе, приходилось на триацилглицеролы, и радиоактивность увеличилась до свыше 60% после 300 мин инкубации(фиг. 14). Диацилглицеролы содержали около 24% активности в экспериментах с введением[14 С]верноловой кислоты, и это количество оставалось достаточно постоянным в течение периода инкубации. 47 После 30 мин инкубации около 5% активности, полученной в результате введения[14 С]олеиновой кислоты, которая присутствовала в хлороформной фазе, приходилось на триацилглицеролы, и радиоактивность увеличилась до 18% после 300 мин инкубации (фиг. 14). Диацилглицеролы содержали около 19% активности через 30 мин в экспериментах с введением [14 С]олеиновой кислоты, и это количество оставалось достаточно постоянным в течение периода инкубации. Вышеописанный эксперимент показывает,что семядоли льна не метаболизируют эпоксильную группу верноловой кислоты в скольконибудь значительной степени. Кроме того, эксперимент показал, что семядоли льна обладают механизмами, которые эффективно удаляют верноловую кислоту из липидов мембран и включают ее в триацилглицеролы. Пример 11. Клонирование генов 12 эпоксигеназы из других биологических видов,содержащих эпоксикислоты. Гомологи гена Сраl2 12-эпоксигеназы получили из других биологических видов, богатых эпоксижирными кислотами, путем клонирования членов семейства генов монооксигеназ 12 со смешанными функциями, которые на высоком уровне экспрессируются в развивающихся семенах, сопоставляли их аминокислотные последовательности с последовательностями, известными для 12-десатуразы и 12 эпоксигеназы. Такие гены клонировали либо посредством скрининга библиотек кДНК развивающихся семян с помощью генетических зондов, основанных на гене Сраl2 (последов.1) или на фрагменте D12V (последов.7), либо посредством амплификации ПЦР-фрагментов с помощью праймеров, сконструированных для консервативных последовательностей 12 монооксигеназ растений со смешанными функциями, как описано в настоящем описании. 12 Предполагаемые последовательности эпоксигеназ демонстрируют более высокую общую идентичность последовательностей по отношению к описанным здесь последовательностям 12-эпоксигеназ, чем по отношению к известным последовательностям 12-десатураз. В одном из примеров такого подхода из неидентифицированного вида Crepis, не являющегося Crepis palaestina и содержащего в масле своих семян высокие уровни верноловой кислоты, получили полноразмерную последовательность, подобную последовательности 12 эпоксигеназы. Из развивающихся семян этого вида Crepis выделяли поли(А)+ РНК с помощью набора для выделения мРНК QuickPrep Micro(Pharmacia Biotechnology) и использовали ее для синтеза двухцепочечной кДНК, с использованием в качестве затравки олигосахарида d(T). Полученную таким образом двухцепочечную ДНК затем лигировали с адаптерами EcoRI/NotI(Pharmacia Biotechnology) и получали библиотеку кДНК с помощью набора для клонирования кДНК ZAP-cDNA Gigapack (Stratagene). Эту библиотеку кДНК на мембранных фильтрахHybond N+ (Amersham) подвергали скринингу с помощью рандомизированно меченого фрагмента D12V (последов.7) из Crepis alpina в соответствии с инструкциями изготовителя,используя стандартные условия гибридизации. Это привело к выделению рекомбинатного бактериофага, обозначенного СrерХ. Определили нуклеотидную последовательность кДНК СrерХ, и представили ее в последов.3. Выведенная для СrерХ аминокислотная последовательность (последов.4) представляет собой белок, состоящий из 374 аминокислот, имеющий 97%-ную идентичность с последовательностью гена Сраl2 12 эпоксигеназы, но только 57%-ную идентичность с последовательностью L26296 12-десатуразыArabidopsis thaliana. Это явно указывает на присутствие гена в другом виде Crepis, имеющего высокое содержание верноловой кислоты, причем этот ген высоко гомологичен по отношению к гену Сраl2 12-эпоксигеназы и безусловно не является геном десатуразы. Во втором примере этого подхода удалось выделить частичную последовательность, подобную последовательности 12-эпоксигеназы,из содержащего верноловую кислоту вида Vernonia galamensis. Матрицы первой цепи кДНК получили из тотальной РНК, выделенной из развивающихся семян V. galamensis, с помощью стандартных методов. ПЦР-фрагмент (длиной в 550 нуклеотидов),обозначенный как VgalI, получали путем амплификации одноцепочечной кДНК с помощью праймеров, разработанных на основе выведенной аминокислотной последовательности монооксигеназ растений со смешанными функциями. Нуклеотидную последовательность амплифицированной ДНК определяли с помощью стандартных методов, и она представлена в ПОСЛЕДОВ.5. Сопоставление установленной аминокислотной последовательности ПЦР-фрагментаVgalI (последов.6) с полной последовательностью гена Сраl2 12-эпоксигеназы и с последовательностью L26296 12-десатуразы Arabidopsis thaliana (фиг. 2) показывает, что последовательность амплифицированного VgalI кодирует аминокислотную последовательность, соответствующую области, включающей аминокислотные остатки 103-285 полипептида Сраl2. В пределах этой области последовательностьVgalI проявила более высокую идентичность аминокислот с последовательностью Сраl2 12 эпоксигеназы (67%), чем с последовательностью 12-десатуразы A. thaliana (60%), что позволяет сделать вывод, что амплифицированная ДНК скорее соответствует последовательности 49 эпоксигеназы, чем последовательности десатуразы. Специалистам в данной области техники понятно, что для настоящего изобретения возможны также вариации и модификации, иные,чем конкретно описанные здесь. Следует понимать, что данное изобретение включает все такие вариации и модификации. Настоящее изобретение также включает все те стадии, свойства, композиции и соединения, на которые ссылаются или которые указаны в настоящем описании, по отдельности или совместно, в любой и во всех комбинациях любых двух или более указанных стадий или свойств. Перечень публикаций, на которые имеются ссылки в настоящем описании 1. An et al. (1985) EMBO J. 4:277-284. 2. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E.,Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl,K. (1987). In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience (ISBN 047150338). 3. Badami, R.C. and Patil, K.B. (1981) Progress in Lipid Research, 19, 119-53. 4. Bafor, M., Smith, M.A., Jonsson, L., Stobart, K. and Stymne, S. (1993) Arch. Biochem.