Рекомбинантные тканезащитные цитокины и кодирующие их нуклеиновые кислоты для защиты, восстановления и усиления чувствительных клеток, тканей и органов

010200 В заявке на данное изобретение заявлен приоритет предварительной заявки на патент США с номером 60/392455, поданной 1 июля 2002 г., и предварительной заявки на патент США с номером 60/393423,поданной 3 июля 2002 г., содержание которых полностью включено в данное описание в качестве ссылки. 1. Введение Данное изобретение относится к мутантным рекомбинантным тканезащитным цитокинам, имеющим одну или несколько аминокислотных замен, фармацевтическим композициям, содержащим такие цитокины, для защиты, поддержания, усиления или восстановления функции или жизнеспособности чувствительных клеток млекопитающих и ассоциированных с ними клеток, тканей и органов. Это включает в себя защиту возбудимой ткани, такой как нервная ткань и ткань сердца, от нейротоксинов, гипоксии и других вредных стимулов и усиление функции возбудимой ткани, например, для содействия обучению и памяти. Данное изобретение относится дополнительно к композициям для транспортировки или облегчения транспортировки молекулы посредством трансцитоза через барьер эндотелиальных клеток с использованием мутантных рекомбинантных тканезащитных цитокинов. 2. Уровень техники В течение многих лет единственной ясной ролью эритропоэтина была его регуляция образования эритроцитов. Полученные в настоящее время в нескольких линиях доказательства дают основания предполагать, что эритропоэтин, член суперсемейства цитокинов, выполняет важные физиологические функции, которые могут быть опосредованы взаимодействием с рецептором эритропоэтина (эритропоэтин-R). Эти воздействия включают в себя мутогенез, модуляцию вхождения кальция в клетки гладких мышц и нервные клетки, вазоактивное действие, т.е. вазоконстрикцию/вазодилатацию, гиперактивацию тромбоцитов и воздействие на промежуточный обмен. Считается, что эритропоэтин обеспечивает компенсаторные реакции, которые служат для улучшения гипоксического микроокружения клеток, а также модулируют программированную смерть клеток, вызываемую метаболическим стрессом. Хотя путем исследований установили, что эритропоэтин, инъецированный интракраниально, защищает нейроны от гипоксического повреждения нейронов, интракраниальное введение является непрактичным и в общем и целом неприемлемым способом введения для терапевтического использования, в частности, для здоровых индивидов. Кроме того, более ранние исследования анемичных пациентов, получавших эритропоэтин, привели к выводу, что вводимый периферически эритропоэтин не транспортируется в головной мозг (MartiTransplant. 15:422-433). Были описаны различные модифицированные формы эритропоэтина с активностями, направленными на улучшение эритропоэтической активности этой молекулы, такие как формы, имеющие измененные аминокислоты на карбоксиконце, описанные в патенте США 5457089 и в патенте США 4835260; изоформы эритропоэтина с различными количествами остатков сиаловых кислот на молекулу, такие как изоформы, описанные в патенте США 5856298; полипептиды, описанные в патенте США 4703008; агонисты, описанные в патенте США 5767078; пептиды, которые связываются с рецептором эритропоэтина,как описано в патентах США 5773569 и 5830851; и миметики, имеющие малую молекулу, описанные в патенте США 5835392. Данное изобретение относится к применению рекомбинантного тканезащитного цитокина для защиты, поддержания, усиления или восстановления чувствительных клеток и ассоциированных с ними клеток, тканей и органов in situ, а также ex vivo, и для доставки рекомбинантного тканезащитного цитокина через барьер эндотелиальных клеток с целью защиты и усиления чувствительных клеток и ассоциированных с ними клеток, тканей и органов, дистальных относительно сосудистой сети, или для переноса ассоциированных молекул. 3. Сущность изобретения В одном аспекте данное изобретение относится к применению различных форм рекомбинантных тканезащитных цитокинов для приготовления фармацевтических композиций для защиты, поддержания,усиления или восстановления функции или жизнеспособности чувствительных клеток млекопитающих и ассоциированных с ними клеток, тканей и органов. В одном конкретном аспекте эти чувствительные клетки млекопитающих и их ассоциированные с ним клетки, ткани или органы являются дистальными относительно сосудистой сети по причине плотности барьера эндотелиальных клеток. В другом конкретном аспекте эти клетки, ткани, органы или другие части организма являются выделенными из организма млекопитающего, например, когда они предназначены для применения в качестве трансплантата. В качестве неограничивающих примеров чувствительная клетка или ткань может быть нервной клеткой,клеткой сетчатки, мышечной клеткой или тканью, клеткой или тканью сердца, легкого, печени, почки,тонкой кишки, вещества коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников, эндотелия капилляров, яичек, яичника, поджелудочной железы, кости, кожи или эндометрия. Кроме того, неограничивающие примеры чувствительных клеток включают в себя клетки фоторецептора (палочки и колбочки сетчатки), ганглия, биполярные, горизонтальные, амакриновые клетки, клетки Мюллера, клетки Пуркинье,клетки миокарда, пейсмекера, синусно-предсердного узла, синусного узла, клетки ткани контакта, предсердно-желудочкового пучка, пучка Гиса, гепатоциты, звездчатые клетки, Купферовские клетки, мезан-1 010200 гиальные, почечные эпителиальные, трубчатые интерстициальные, бокаловидные (эпителиальные) клетки, кишечные железистые (крипты), кишечные эндокринные клетки, клетки клубочковой зоны коры надпочечников, фасцикулятные клетки, ретикулярные клетки, хромаффинные клетки, перициты, интерстициальные клетки Лейдига, клетки Сертоли, сперматозоиды, граафовы пузырьки, примордиальные яичниковые фолликулы, островки Лангерганса, -клетки, -клетки, -клетки, F-клетки, предшественники остеоцитов, остеокласты, остеобласты, клетки стромы эндометрия, эндометриальные клетки, стволовые и эндотелиальные клетки. Эти примеры чувствительных клеток являются лишь иллюстративными. В одном аспекте чувствительная клетка или ассоциированные с ней клетки, ткани или органы являются не способными к проявлению возбуждения в ответ на адекватный стимул клетками, тканями или органами,и они предпочтительно не содержат возбудимых клеток или тканей. В конкретном варианте осуществления клетка, ткань или орган млекопитающего, для которых используют вышеуказанный рекомбинантный тканезащитный цитокин, являются клеткой, тканью или органом, которые продлевали или будут продлевать период времени по меньшей мере при одном состоянии, неблагоприятном для жизнеспособности этих клеток, ткани или органа. В конкретном варианте осуществления клетка, ткань или орган млекопитающего, для которых используют вышеуказанный рекомбинантный тканезащитный цитокин, экспрессируют ЕРО-рецептор. Такие состояния включают в себя травматическую гипоксию in situ или метаболическую дисфункцию, индуцированную хирургическим вмешательством гипоксию in situ или метаболическую дисфункцию или подвергание действию токсина in situ, причем последнее может быть связано с химиотерапией или лучевой терапией. В одном варианте осуществления эти неблагоприятные состояния являются результатом искусственного (экстракорпорального) кровообращения (аппарат сердцелегкое, АИК), используемого для определенных хирургических процедур. Рекомбинантные тканезащитные цитокины согласно изобретению применимы для терапевтического или профилактического лечения заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) или периферической нервной системы человека, которые могут сначала иметь первичные неврологические или психиатрические симптомы, а также глазных болезней, сердечно-сосудистых заболеваний, сердечно-легочных заболеваний, респираторных заболеваний, заболеваний почки, заболеваний мочевых путей и репродуктивных заболеваний, желудочно-кишечных заболеваний и эндокринных и метаболических патологий. Данное изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим конкретные вышеуказанные рекомбинантные тканезащитные цитокины, для введения млекопитающему животному,предпочтительно человеку. Такие фармацевтические композиции могут быть приготовлены для перорального, интраназального или парентерального введения или могут быть в виде раствора перфузата для поддержания жизнеспособности клеток, тканей или органов ex vivo. Рекомбинантные тканезащитные цитокины, применимые для вышеуказанных целей, могут быть мутеином или генетически модифицированным эритропоэтином, т.е. эритропоэтином, для которого существует по меньшей мере одна модификация аминокислотного скелета нативной молекулы. "Мутантный белок", "вариантный белок" или "мутеин" означает белок, содержащий мутантную аминокислотную последовательность, и включает в себя полипептиды, которые отличаются от аминокислотной последовательности нативного эритропоэтина вследствие делеций, замен аминокислот или и того, и другого."Нативная последовательность" означает аминокислотную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты, которая является идентичной форме дикого типа или нативной форме гена или белка. Кроме того, в одном варианте осуществления рекомбинантные тканезащитные цитокины согласно изобретению имеют клеточно-защитную активность, но также обладают одним или несколькими из эффектов эритропоэтина в отношении костного мозга, т.е. увеличенный гематокрит (эритропоэз), вазоактивное действие (вазоконстрикцию/вазодилатацию), гиперактивацию тромбоцитов, увеличенное продуцирование тромбоцитов и прокоагулянтные активности. В другом варианте осуществления рекомбинантные тканезащитные цитокины согласно изобретению имеют клеточно-защитную активность, но не имеют одного или нескольких из эффектов эритропоэтина на костном мозге, т.е. увеличенного гематокрита (эритропоэза), вазоактивного действия (вазоконстрикции/вазодилатации), гиперактивации тромбоцитов, увеличенной продукции тромбоцитов и прокоагулянтных активностей. Предпочтительно, клеточно-протективный рекомбинантный тканезащитный цитокин согласно изобретению лишен по меньшей мере одного из эффектов эритропоэтина в отношении костного мозга; более предпочтительно рекомбинантный тканезащитный цитокин должен быть лишен эритропоэтической активности; и наиболее предпочтительно рекомбинантный тканезащитный цитокин лишен всех эффектов эритропоэтина в отношении костного мозга. В качестве неограничивающих примеров могут быть произведены изменения в одной или нескольких аминокислотах или обеспечены делеции или добавления в молекуле нативного эритропоэтина. В предпочтительном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин имеет одну или несколько модификаций в одном или нескольких из следующих районов: VLQRY (аминокислоты 11-15 нативного человеческого эритропоэтина; SEQ ID NO:1), и/или TKVNFYAW (аминокислоты 44-51 нативного человеческого эритропоэтина; SEQ ID NO:2), и/или SGLRSLTTL (аминокислоты 100-108 нативного человеческого эритропоэтина; SEQ ID NO:3), и/или SNFLRG (аминокислоты 146-151 нативного человеческого эритропоэтина; SEQ ID NO:4). Другие мутации могут быть обеспечены при аминокислотах 7, 20,-2 010200 21, 29, 33, 38, 42, 59, 63, 67, 70, 83, 96, 126, 142, 143, 152, 153, 155, 156 и 161 SEQ ID NO:10. Эти другие мутации могут находиться отдельно или наряду по меньшей мере с одной мутацией по меньшей мере в одном из районов, указанных выше. В некоторых вариантах осуществления, изменения в одной или нескольких аминокислотах TKVNFYAW (аминокислотах 44-51 нативного человеческого эритропоэтина;SEQ ID NO:2) приводят к модифицированной молекуле эритропоэтина с частичной функцией, т.е. имеющей меньшую эритропоэтическую активность, чем rhu-EPO. В других вариантах осуществления изменения в одной или нескольких аминокислотах SGLRSLTTL (аминокислотах 100-108 нативного человеческого эритропоэтина; SEQ ID NO:3) приводят к рекомбинантному тканезащитному цитокину с частичной функцией, т.е. имеющему меньшую эритропоэтическую активность, чем rhu-EPO. Описанные выше рекомбинантные тканезащитные цитокины проявляют тканезащитную или клеточно-защитную активность. Что касается эритропоэтических активностей, описанные выше рекомбинантные тканезащитные цитокины лишены одной или нескольких эритропоэтических активностей или же они у них снижены. Примеры эритропоэтических активностей включают в себя увеличение гематокрита, вазоконстрикцию, гиперактивацию тромбоцитов, прокоагулянтные активности и увеличение продукции тромбоцитов. Эритропоэтические активности могут быть измерены стандартными способами. Например, гематокрит может быть измерен с использованием анализов на клетках UT-7, описанных в разделе 6.17, или с использованием способов, описанных в справочнике Physicians's Desk Reference (Medical EconomicsCompany, Inc. Montvale, NJ, 2000), включенном в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. В частности, на страницах 519-525 и 2125-2131 описаны способы, которые могут быть использованы в измерении уровней гематокрита, и описаны различные диапазоны гематокрита, которые могут быть использованы в качестве мишеней во избежание токсичности. Например, пациентам с хронической почечной недостаточностью в этом справочнике (PDR) рекомендуется доза эритропоэтина для достижения нетоксичных желаемых гематокритов в диапазоне 30-36% у пациента (например, см. PDR, с. 523, кол. 1,11. 17-96 и с. 2129, кол. 1, 11. 8-93, и прилагаемую таблицу в столбцах 2 и 3). В справочнике PDR отмечается, что токсичности в форме полицитемии (состояния, характеризующегося отклоняющимся от нормы увеличением количества циркулирующих в кровотоке эритроцитов) можно избежать тщательным мониторингом гематокрита и коррекцией доз ЕРО путем приостановления поставки эритропоэтина, если гематокрит приближается к верхней границе желаемого диапазона (36% для этой популяции пациентов),или увеличениями более чем на 4 балла, в любом 2-недельном периоде, пока гематокрит не возвратится к предлагаемому желаемому диапазону (30-36% для этой популяции пациентов; см. PDR, с. 523, кол. 1 и с. 2129, кол. 1, в разделе "Dose Adjustment"). В противоположность этому, для раковых пациентов, проходящих химиотерапию, PDR рекомендует корректировать дозу при отличающемся уровне гематокрита,т.е. если гематокрит превышает 40% (см. с. 2129, кол. 2, в разделе "Dose Adjustment"). В одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин имеет одну или несколько эритропоэтических активностей, но при уровнях, которые являются недостаточными для индукции неблагоприятных эффектов, т.е. эффектов, которые перевешивают терапевтическую пользу клеточно-защитной активности рекомбинантного тканезащитного цитокина. В одном варианте осуществления рекомбинантные тканезащитные цитокины, которые имеют одну или несколько эритропоэтических активностей, все еще могут быть использованы в способах согласно изобретению, при условии измерения уровней эритропоэтической активности. В вариантах осуществления, в которых рекомбинантные тканезащитные цитокины имеют одну или несколько эритропоэтических активностей, эти эритропоэтические активности могут быть измерены, и количественная дозировка и/или схема введения доз цитокина могут корректироваться для гарантии того, что рекомбинантный тканезащитный цитокин не будет токсичным. В вариантах, в которых рекомбинантный тканезащитный цитокин имеет одну или несколько эритропоэтических активностей, эти эритропоэтические активности могут быть измерены, и количественная дозировка и/или схема введения доз цитокина могут корректироваться для гарантии того, что рекомбинантный тканезащитный цитокин имеет низкую активность. В одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин проявляет уменьшение эритропоэтических активностей приблизительно на 1, 2, 4, 6, 8, 10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% в сравнении с рекомбинантным Epo. Данное изобретение обеспечивает рекомбинантный тканезащитный цитокин, не имеющий по меньшей мере одной активности, выбранной из группы, состоящей из увеличения гематокрита, вазоконстрикции, гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтных активностей и увеличения продукции тромбоцитов. Этот цитокин содержит по меньшей мере одну клеточно-защитную активность, выбранную из группы, состоящей из защиты, поддержания, усиления или восстановления функции или жизнеспособности чувствительных клеток, ткани или органа млекопитающего. В одном варианте осуществления данного изобретения рекомбинантный тканезащитный цитокин содержит один или несколько измененных аминокислотных остатков между положениями 11-15 SEQ IDNO:10 [SEQ ID NO:3] или положениями 146-151 SEQ ID NO:10 [SEQ ID NO:4]. В другом варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин содержит измененный аминокислотный остаток в одном или нескольких положениях SEQ ID NO:10: 7, 20, 21, 29, 33, 38, 42, 59,63, 67, 70, 83, 96, 126, 142, 143, 152, 153, 155, 156 или 161.-3 010200 Еще в одном варианте осуществления, рекомбинантный тканезащитный цитокин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10 с одним или несколькими из следующих изменений (каждой измененной последовательности был приписан отдельный идентификационный номер последовательности): аланин в положении остатка 6 SEQ ID NO:10 (SEQ ID NO:15); аланин в положении остатка 7SEQ ID NO:10 (SEQ ID NO:105). В одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный ци-4 010200 токин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10 с заменами одного или нескольких аминокислотных остатков SEQ ID NO:15-105 и 119. Еще в одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10 с делецией аминокислотных остатков 44-49 SEQ IDNO:10. В другом варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10 по меньшей мере с одним из следующих изменений (каждой измененной последовательности был приписан отдельный идентификационный номер последовательности):NO:118). В одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10 по меньшей мере с одной из следующих замен аминокислотных остатков SEQ ID NO:106-118. Один вариант осуществления данного изобретения относится к рекомбинантному тканезащитному цитокину, описанному в настоящем описании выше, дополнительно содержащему химическую модификацию одной или нескольких аминокислот. В другом варианте осуществления эта химическая модификация содержит изменение заряда рекомбинантного тканезащитного цитокина. Еще в одном варианте осуществления положительный или отрицательный заряд добавляют химическим способом к аминокислотному остатку в том случае, когда заряженный аминокислотный остаток модифицирован в незаряженный остаток. Кроме того, такие рекомбинантные тканезащитные цитокины могут быть дополнительно модифицированы химической модификацией одной или нескольких аминокислот, как описано в следующих одновременно находящихся на рассмотрении заявках: заявке РСТ с регистрационным номеромPCT/US01/49479, поданной 28 декабря 2001 г., заявке на патент США с регистрационным номером 09/753132, поданной 29 декабря 2000 г. и кратком изложении поверенного заявки на патент США с номером KW00-009C02-US, поданном 3 июля 2002 г., причем каждая из этих заявок включена в данное описание в качестве ссылки в полном объеме. Эти дополнительные химические модификации могут быть использованы для усиления тканезащитных активностей рекомбинантных тканезащитных цитокинов или подавления любых действий, которые рекомбинантные тканезащитные цитокины могут оказывать на костный мозг. В дополнительном варианте осуществления обеспечена дополнительная химическая модификация для восстановления растворимости этой молекулы, которая может быть уменьшена вследствие вышеуказанной генетической модификации, например, химическим добавлением положительного или отрицательного заряда к этой молекуле, если заряженный аминокислотный остаток изменен на незаряженный остаток. В качестве неограничивающих примеров рекомбинантные тканезащитные цитокины согласно изо-5 010200 бретению включают в себя мутеин S100E эритропоэтина человека (SEQ ID NO:5), мутеин K45D эритропоэтина человека (SEQ ID NO:6) и любые из неэритропоэтических, но клеточно-защитных рекомбинантных тканезащитных цитокинов или цитокинов, способных приносить пользу чувствительным клетке,ткани или органу, которые описаны у Elliot et al., 1997, Blood 89:493-502; Boissel et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 268, No. 21, pp. 15983-15993 (1993); Wen et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 269,No. 36, pp. 22839-22846 (1994) и Syed et al., Nature, vol. 395, pp. 511-516 (1998), которые включены в настоящее описание в качестве ссылки в их полном виде. Данное изобретение относится к способам применения любых из вышеуказанных рекомбинантных тканезащитных цитокинов для защиты, восстановления и усиления чувствительных клеток, тканей и органов. Другие рекомбинантные тканезащитные цитокины согласно изобретению включают в себя вышеуказанный эритропоэтин, содержащий по меньшей мере одну генетически измененную аминокислоту по меньшей мере с одной дополнительной модификацией, которая может быть другой модификацией по меньшей мере одной дополнительной аминокислоты молекулы эритропоэтина или модификацией по меньшей мере одного углевода молекулы эритропоэтина. Генетически измененная аминокислота (аминокислоты) может быть одной аминокислотой или находиться среди аминокислот, дополнительно модифицированных. Конечно, молекулы рекомбинантных тканезащитных цитокинов, применимые для указанных в настоящем описании целей, могут иметь множество модификаций в сравнении с молекулой нативного эритропоэтина, таких как множественные модификации аминокислотной части молекулы,множественные модификации углеводной части молекулы или по меньшей мере вторая модификация аминокислотной части молекулы и по меньшей мере одна модификация углеводной части молекулы. Молекула рекомбинантного тканезащитного цитокина сохраняет ее способность защищать, поддерживать, усиливать или восстанавливать функцию или жизнеспособность чувствительных клеток млекопитающих, но другие свойства рекомбинантного тканезащитного цитокина, не относящиеся к вышеуказанному, желаемому признаку, могут отсутствовать в сравнении с природной молекулой. В предпочтительном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин является неэритропоэтическим. В другом варианте осуществления рекомбинантные тканезащитные цитокины могут быть модифицированы фукозилированием для изменения картины гликозилирования на гликопротеине. Один вариант осуществления данного изобретения относится к рекомбинантному тканезащитному цитокину, описанному выше, и является мутеином эритропоэтина человека. В другом варианте осуществления данного изобретения рекомбинантный тканезащитный цитокин является мутеином фенилглиоксальэритропоэтина. В следующем варианте осуществления данного изобретения рекомбинантный тканезащитный цитокин является мутеином асиалоэритропоэтина человека. В одном варианте осуществления, описанном выше, рекомбинантный тканезащитный цитокин содержит по меньшей мере одну чувствительную клеточно-защитную активность, выбранную из группы,состоящей из защиты, поддержания, усиления или восстановления функции или жизнеспособности чувствительных клетки, ткани или органа. В таком варианте осуществления чувствительная клетка млекопитающего включает в себя нервную клетку, мышечную клетку, клетки сердца, легкого, печени, почки,тонкой кишки, кортикального вещества надпочечников, мозгового вещества надпочечников, эндотелия капилляров, яичек, яичника, клетки эндометрия и стволовые клетки. В других вариантах осуществления эти клетки включают в себя клетки фоторецептора, ганглия, биполярные, горизонтальные, амакриновые клетки, клетки Мюллера, клетки миокарда, пейсмекера, синусно-предсердного узла, синусного узла,предсердно-желудочкового пучка, пучка Гиса, гепатоциты, звездчатые клетки, Купферовские клетки,мезангиальные, бокаловидные (эпителиальные) клетки, кишечные железистые, кишечные эндокринные клетки, клетки клубочковой зоны коры надпочечников, фасцикулятные клетки, ретикулярные клетки,хромаффинные клетки, перициты, интерстициальные клетки Лейдига, клетки Сертоли, сперматозоиды,граафовы пузырьки, примордиальные яичниковые фолликулы, клетки стромы эндометрия или эндометриальные клетки. Согласно другому аспекту данного изобретения рекомбинантный тканезащитный цитокин, описанный в настоящем описании выше, способен преодолевать барьер эндотелиальных клеток. В соответствующем варианте осуществления барьер эндотелиальных клеток включает в себя гематоэнцефалический барьер, барьер между кровью и глазом, барьер между кровью и яичком, барьер между кровью и яичником, барьер между кровью и плацентой, барьер между кровью и сердцем, барьер между кровью и почкой и барьер между кровью и маткой. В другом варианте осуществления данного изобретения рекомбинантный тканезащитный цитокин,описанный в настоящем описании выше, является дополнительно модифицированным. В одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин выбран из группы, состоящей из:i) цитокина, не имеющего остатков сиаловой кислоты или имеющего их в уменьшенном количестве;ii) цитокина, не имеющего N-связанных или О-связанных углеводов или имеющего их в уменьшенном количестве;iii) цитокина, имеющего, по меньшей мере, уменьшенное содержание углеводов вследствие обработки природного цитокина по меньшей мере одной гликозидазой;iv) цитокина, имеющего по меньшей мере один или несколько окисленных углеводов;v) цитокина, имеющего по меньшей мере один или несколько окисленных углеводов и восстановленного химически;vi) цитокина, имеющего по меньшей мере один или несколько модифицированных остатков аргинина;vii) цитокина, имеющего по меньшей мере один или несколько модифицированных остатков лизина или модификацию N-концевой аминогруппы молекулы цитокина;ix) цитокина, имеющего, по меньшей мере, модифицированный остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты; х) цитокина, имеющего, по меньшей мере, модифицированный остаток триптофана;xi) цитокина, имеющего по меньшей мере один удаленный аминокислотный остаток;xii) цитокина, имеющего по меньшей мере один разрыв по меньшей мере одной из цистеновых связей в молекуле цитокина;xiv) цитокина, имеющего по меньшей мере одну присоединенную молекулу полиэтиленгликоля;xv) цитокина, имеющего по меньшей мере одну присоединенную жирную кислоту;xvi) цитокина, имеющего характер гликозилирования, не свойственный млекопитающим, вследствие экспрессии рекомбинантного цитокина не в клетках млекопитающего; иxvi) цитокина, имеющего по меньшей мере одну меченнную гистидином аминокислоту для облегчения очистки. В одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин согласно изобретению не имеет остатков сиаловой кислоты или содержит их в уменьшенном количестве. В предпочтительном варианте осуществления, рекомбинантный тканезащитный цитокин является асиалоформой эритропоэтина (т.е. не имеет остатков сиаловой кислоты) и наиболее предпочтительно является асиалоэритропоэтином человека. В другом варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин имеет 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остатков сиаловой кислоты. Количество доступных сайтов для сиалилирования может быть изменено присутствием одной или нескольких измененных или модифицированных аминокислот в рекомбинантном тканезащитном цитокине. Таким образом, данное изобретение включает в себя варианты осуществления, в которых рекомбинантный тканезащитный цитокин является гипосиалилированным или гиперсиалилированным. В предпочтительном аспекте мутеин эритропоэтина имеет более чем 14 остатков сиаловой кислоты, присутствующих в природном эритропоэтине. В одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин является эритропоэтином без N-связанных углеводов. В другом варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин является эритропоэтином с уменьшенным количеством N-связанных углеводов. В одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин является эритропоэтином без Освязанных углеводов. В другом варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин является эритропоэтином с уменьшенным количеством О-связанных углеводов. В другом варианте осуществления рекомбинантные тканезащитные цитокины могут быть модифицированы фукозилированием для изменения картин распределения гликозилирования на гликопротеине. Еще в одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин обрабатывают по меньшей мере одной гликозидазой. В другом варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин имеет, по меньшей мере, уменьшенное содержание углеводов вследствие обработки рекомбинантного тканезащитного цитокина по меньшей мере одной гликозидазой. В другом варианте осуществления углеводная часть рекомбинантного тканезащитного цитокина имеет, по меньшей мере, характер гликозилирования немлекопитающего вследствие экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в клетках немлекопитающего. В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантные тканезащитные цитокины экспрессируются в клетках насекомых, клетках растений,бактериальных клетках или клетках дрожжей. Еще в одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин дополнительно имеет по меньшей мере один или несколько углеводов, которые могут быть также химически восстановленными. В предпочтительном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин является окисленным периодатом эритропоэтином. В некоторых вариантах осуществления окисленный периодатом эритропоэтин химически восстанавливают цианоборгидридом натрия. В другом варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин для описанных выше применений имеет по меньшей мере один или несколько модифицированных остатков аргинина. В одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин содержит R-глиоксальную часть молекулы на одном или нескольких остатках аргинина, где R означает арильную или алкильную группу. Еще в одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин является фенилглиоксальэритропоэтином. Еще в одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин является эритропоэтином, в котором остаток аргинина модифицирован реакцией с вицинальным дикетоном, таким, например, как 2,3-бутандион и циклогександион, но ими не ограничиваясь. В другом вариан-7 010200 те осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин является эритропоэтином, в котором остаток аргинина взаимодействует с 3-дезоксиглюкозоном. Еще в одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин содержит по меньшей мере один или несколько модифицированных остатков лизина или модификацию N-концевой аминогруппы молекулы эритропоэтина, причем такие модификации являются модификациями, происходящими из реакции остатка лизина или N-концевой аминогруппы с модифицирующим аминогруппу агентом. Этот модифицированный остаток лизина может быть дополнительно химически восстановленным. В одном предпочтительном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин является биотинилированным или карбамилированным или ацилированным, например, ацетилированным посредством одной или нескольких групп лизина. В другом предпочтительном варианте осуществления лизин взаимодействует с альдегидом или редуцирующим сахаром, с образованием имина, который может быть стабилизирован восстановлением, например, цианоборгидридом натрия, с образованием Nалкилированного лизина, такого как глюцитолиллизин, или который в случае редуцирующих сахаров может быть стабилизирован перегруппировкой Амадори или Хайнса с образованием альфа-дезоксиальфа-аминосахара, такого как альфа-дезокси-альфа-фруктозиллизин. В другом предпочтительном варианте осуществления группу лизина карбамилируют (карбамоилируют), например, реакцией с цианатным ионом, алкилкарбамилируют, арилкарбамилируют или арилтиокарбамилируют алкилизоцианатом, арилизоцианатом или арилизотиоцианатом, соответственно, или она может быть ацилирована реакционноспособным производным алкилкарбоновой или арилкарбоновой кислоты, например, реакцией с уксусным ангидридом, янтарным ангидридом или фталевым ангидридом. По меньшей мере одна группа лизина может быть также тринитрофенилом, модифицированным реакцией с тринитробензолсульфоновой кислотой или предпочтительно ее солями. В другом варианте осуществления остатки лизина могут быть модифицированы реакцией с производным глиоксаля, например, реакцией с глиоксалем, метилглиоксалем или 3-дезоксиглюкозоном, с образованием соответствующих альфа-карбоксиалкильных производных. В родственном варианте осуществления карбамилированный цитокин состоит из альфа-Nкарбамоилэритропоэтина; N-эпсилон-карбамоилэритропоэтина; альфа-N-карбамоил,N-эпсилон-карбамоилэритропоэтина; альфа-N-карбамоиласиалоэритропоэтина; N-эпсилон-карбамоиласиалоэритропоэтина; альфа-N-карбамоил,N-эпсилон-карбамоиласиалоэритропоэтина; альфа-N-карбамоилгипосиалоэритропоэтина; N-эпсилон-карбамоилгипосиалоэритропоэтина и альфа-N-карбамоил,N-эпсилон-карбамоилгипосиалоэритропоэтина. Еще в одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин содержит по меньшей мере один ацилированный остаток лизина. Еще в одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин содержит по меньшей мере один ацилированный остаток лизина. В родственном варианте осуществления ацетилированный цитокин состоит из альфа-N-ацетилэритропоэтина; Nэпсилон-ацетилэритропоэтина; альфа-N-ацетил,N-эпсилон-ацетилэритропоэтина; альфа-N-ацетиласиалоэритропоэтина; N-эпсилон-ацетиласиалоэритропоэтина; альфа-N-ацетил,N-эпсилон-ацетиласиалоэритропоэтина; альфа-N-ацетилгипосиалоэритропоэтина; N-эпсилон-ацетилгипосиалоэритропоэтина; альфа-Nацетил,N-эпсилон-ацетилгипосиалоэритропоэтина,альфа-N-ацетилгиперсиалоэритропоэтина;Nэпсилон-ацетилгиперсиалоэритропоэтина; альфа-N-ацетил,N-эпсилон-ацетилгиперсиалоэритропоэтина. Еще в одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин имеет остаток лизина, который является сукцинилированным. В родственном варианте сукцинилированный цитокин состоит из альфа-N-сукцинилэритропоэтина; N-эпсилон-сукцинилэритропоэтина; альфа-N-сукцинил,Nэпсилон-сукцинилэритропоэтина; альфа-N-сукциниласиалоэритропоэтина; N-эпсилон-сукциниласиалоэритропоэтина; альфа-N-сукцинил,N-эпсилон-сукциниласиалоэритропоэтина; альфа-N-сукциниласиалоэритропоэтина; N-эпсилон-сукцинилгипосиалоэритропоэтина; альфа-N-сукцинил,N-эпсилон-сукцинилгипосиалоэритропоэтина; альфа-N-сукцинилгиперсиалоэритропоэтина; N-эпсилон-сукцинилгиперсиалоэритропоэтина и N-эпсилон-сукцинилгиперсиалоэритропоэтина. В одном варианте осуществления по меньшей мере один остаток тирозина рекомбинантного тканезащитного цитокина может быть модифицирован в положении остатка ароматического кольца электрофильным реагентом, например, нитрованием или иодинированием. В родственном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин, описанный в настоящем описании выше, содержит по меньшей мере один остаток лизина, модифицированный 2,4,6-тринитробензолсульфонатом натрия или другой его солью. В другом варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин содержит по меньшей мере один нитрованный или иодинированный остаток тирозина. В другом варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин содержит остаток аспарагиновой или глутаминовой кислоты, который взаимодействует с карбодиимидом с последующей реакцией с амином. В родственном варианте осуществления этим амином является глицинамид. В одном варианте осуществления по меньшей мере один остаток триптофана рекомбинантного тканезащитного цитокина является модифицированным, например, реакцией с н-бромсукцинамидом или нхлорсукцинамидом. В другом варианте осуществления обеспечен рекомбинантный тканезащитный цитокин, имеющий-8 010200 по меньшей мере одну аминогруппу эритропоэтина, удаленную, например, реакцией с нингидрином с последующим восстановлением полученной карбонильной группы реакцией с боргидридом. Еще в одном варианте осуществления обеспечен рекомбинантный тканезащитный цитокин, имеющий по меньшей мере один разрыв по меньшей мере одной из цистиновых связей в молекуле реакцией с восстанавливающим агентом, таким как дитиотреитол, с последующей реакцией последующих сульфгидрилов с иодацетамидом, иодуксусной кислотой или другим электрофилом для предотвращения повторного образования дисульфидных связей. Еще в одном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин подвергают ограниченному химическому протеолизу, который нацелен на специфические остатки, например, на расщепление после остатков триптофана. Такие образующиеся фрагменты рекомбинантного тканезащитного цитокина также включены в данное изобретение. Как отмечалось выше, рекомбинантный тканезащитный цитокин, применимый для описанных в настоящем описании целей, необязательно может иметь по меньшей мере одну из вышеуказанных химических модификаций, наряду с генетически измененной аминокислотой (аминокислотами), но может иметь и более чем одну из вышеуказанных модификаций. В качестве примера рекомбинантного тканезащитного цитокина с одной модификацией в углеводной части молекулы и одной модификации в аминокислотной части, рекомбинантный тканезащитный цитокин является асиалоэритропоэтином, остатки лизина которого являются биотинилированными, ацилированными (например, ацетилированными) или карбамилированными. Рекомбинантные тканезащитные цитокины могут быть также модифицированы путем добавления цепей жирных кислот. В другом варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин модифицирован пэгилированием для создания пэгилированных тканезащитных цитокинов путем добавления полиэтиленгликоля (ПЭГ). В соответствии с одним аспектом данного изобретения обеспечена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий рекомбинантный тканезащитный цитокин, описанный в настоящем описании выше. В одном варианте осуществления эта выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность нуклеотидных остатков 5461-6041 векторной конструкции SEQ ID NO:208, нуклеотидных остатков 5461-6041 SEQ ID NO:209, нуклеотидных остатков 5461-6041 SEQ ID NO:210, нуклеотидных остатков 5461-6041 SEQ ID NO:211 или нуклеотидных остатков 5461-6041 SEQ ID NO:212. В одном варианте осуществления данного изобретения обеспечена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность (т.е. кДНК, нуклеотидную последовательность, прерываемую интронами или не прерываемую интронами), которая кодирует полипептид,содержащий рекомбинантный тканезащитный цитокин, описанный в настоящем описании выше, или состоящий из рекомбинантного тканезащитного цитокина, описанного в настоящем описании выше, при условии, что эта молекула нуклеиновой кислоты не кодирует рекомбинантный тканезащитный цитокин,который содержит одну или несколько из следующих аминокислотных замен: I6A, С 7 А, K20 А, Р 42 А,D43A, K45D, K45 А, F48A, Y49A, K52 А, K49 А, S100E, R103A, K116 А, Т 132 А, I133A, K140 А, N147K,N147A, R150A, R150E, G151A, K152 А, K154 А, G158A, С 161 А или R162A. В родственном варианте осуществления обеспечена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий рекомбинантный тканезащитный цитокин,описанный в настоящем описании выше, при условии, что эта молекула нуклеиновой кислоты не кодирует рекомбинантный тканезащитный цитокин, который содержит любую из следующих комбинаций замен: N24K/N38K/N83K или A30N/H32T. В одном варианте осуществления нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный тканезащитный цитокин, синтезируют с использованием предпочтительных кодонов, которые способствуют оптимальной экспрессии в конкретной клеткехозяине. Такие предпочтительные кодоны могут быть оптимальными для экспрессии в клетках растений,бактерий, дрожжей, млекопитающих, грибов или насекомых. Данное изобретение обеспечивает также вектор, содержащий эту молекулу нуклеиновой кислоты. Данное изобретение обеспечивает также экспрессирующий вектор, содержащий эту молекулу нуклеиновой кислоты и по меньшей мере один регуляторный район, функционально связанный с этой молекулой нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления этим вектором является вектор pCiNeo. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает клетку, содержащую этот экспрессирующий вектор. Еще в одном варианте осуществления обеспечена генетически сконструированная клетка,которая содержит эту молекулу нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления данное изобретение включает в себя также композиции, в том числе фармацевтические композиции, содержащие один или несколько описанных выше рекомбинантных тканезащитных цитокинов. В соответствии с другим аспектом данного изобретения обеспечена фармацевтическая композиция,содержащая рекомбинантный тканезащитный цитокин, описанный в настоящем описании выше, лишенный по меньшей мере одной эритропоэтической активности, выбранной из группы, состоящей из увеличения гематокрита, вазоконстрикции, гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтных активностей и увеличения продукции тромбоцитов. В соответствии с другим аспектом данного изобретения обеспечена-9 010200 фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный тканезащитный цитокин, описанный в настоящем описании выше, но эти цитокины не лишены по меньшей мере одной эритропоэтической активности, выбранной из группы, состоящей из увеличения гематокрита, вазоконстрикции, гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтных активностей и увеличения продукции тромбоцитов. Цитокин содержит по меньшей мере одну клеточно-защитную активность в отношении чувствительных клеток, выбранную из группы, состоящей из защиты, поддержания, усиления или восстановления функции или жизнеспособности чувствительных клетки, ткани или органа млекопитающего. Рекомбинантный тканезащитный цитокин такой фармацевтической композиции может содержать аминокислотную последовательностьSEQ ID NO:10 по меньшей мере с одним из следующих изменений, т.е. замен (каждому изменению или комбинации перечисленных изменений был приписан отдельный идентификационный номер последовательности):NO:118). В соответствии с другим аспектом данного изобретения обеспечена фармацевтическая композиция для защиты, поддержания, усиления или восстановления функции или жизнеспособности чувствительных клеток млекопитающих и ассоциированных с ними клеток, тканей и органов, содержащая терапевтически эффективное количество рекомбинантного тканезащитного цитокина, содержащего по меньшей мере одну из следующих замен аминокислотных остатков (каждому изменению или комбинации перечисленных изменений был приписан отдельный идентификационный номер последовательности): триптофан в положении остатка 152 SEQ ID NO:10 (SEQ ID NO:98); аланин в положении остатка 14 и аланин в положении остатка 15 SEQ ID NO:10 (SEQ ID NO:119); аланин в положении остатка 6 SEQ ID NO:10NO:10 (SEQ ID NO:102); аланин в положении остатка 161 SEQ ID NO:10 (SEQ ID NO:104) или аланин в положении остатка 162 SEQ ID NO:10 (SEQ ID NO:105). В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция, описанная в настоящем описании выше, приготовлена для перорального, интраназального или парентерального введения. В другом варианте осуществления эта фармацевтическая композиция приготовлена в виде перфузатного раствора. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции данного изобретения для защиты, поддержания, усиления или восстановления функции или жизнеспособности чувствительных- 10010200 клеток млекопитающих и ассоциированных с ними клеток, тканей и органов содержат терапевтически эффективное количество рекомбинантного тканезащитного цитокина, содержащего по меньшей мере одну замену аминокислотных остатков аминокислотной последовательности природного эритропоэтина человека. В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция данного изобретения для защиты, поддержания, усиления или восстановления функции или жизнеспособности чувствительных клеток млекопитающих и ассоциированных с ними клеток, тканей и органов содержит терапевтически эффективное количество рекомбинантного тканезащитного цитокина, содержащего клеточно-защитную активность, может быть лишенной одной или нескольких эритропоэтических активностей или эффектов, таких как увеличение гематокрита, вазоактивное действие (вазоконстрикция/вазодилатация), гиперактивация тромбоцитов, прокоагулянтные активности и увеличение продукции тромбоцитов. В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция данного изобретения для защиты, поддержания, усиления или восстановления функции или жизнеспособности чувствительных клеток млекопитающих и ассоциированных с ними клеток, тканей и органов содержит терапевтически эффективное количество рекомбинантного тканезащитного цитокина, содержащего клеточно-защитную активность, имеет также одну или несколько эритропоэтических активностей или эффектов, таких как увеличение гематокрита, вазоактивное действие (вазоконстрикция/вазодилатация), гиперактивация тромбоцитов, прокоагулянтные активности и увеличение продукции тромбоцитов. В соответствии с одним аспектом данного изобретения обеспечен способ защиты, поддержания или усиления жизнеспособности клетки, ткани или органа, выделенных из организма млекопитающего, предусматривающий воздействие на указанную клетку, ткань или орган фармацевтической композиции,содержащей рекомбинантный тканезащитный цитокин, состоящий из эритропоэтина, который лишен по меньшей мере одной эритропоэтической активности, выбранной из группы, состоящей из увеличения гематокрита, вазоактивного действия (вазоконстрикции/вазодилатации), гиперактивации тромбоцитов,прокоагулянтной активности и увеличения продукции тромбоцитов. В некоторых вариантах осуществления эта защита не влияет на костный мозг. Данное изобретение обеспечивает также способ защиты, поддержания или усиления жизнеспособности клетки, ткани или органа, выделенных из организма млекопитающего, предусматривающий подвергание указанной клетки, ткани или органа действию фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный тканезащитный цитокин, описанный в настоящем описании выше, который лишен по меньшей мере одной эритропоэтической активности, выбранной из группы, состоящей из увеличения гематокрита, вазоактивного действия (вазоконстрикции/вазодилатации), гиперактивации тромбоцитов,прокоагулянтной активности и увеличения продукции тромбоцитов. Далее, данное изобретение обеспечивает применение рекомбинантного тканезащитного цитокина,описанного в настоящем описании выше, который лишен по меньшей мере одной эритропоэтической активности, выбранной из группы, состоящей из увеличения гематокрита, вазоактивного действия (вазоконстрикции/вазодилатации), гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтной активности и увеличения продукции тромбоцитов, для приготовления фармацевтической композиции для защиты против и предупреждения повреждения ткани, а также восстановления и омоложения ткани и функции ткани у млекопитающего. В одном варианте осуществления это повреждение вызвано эпилептическим припадком,рассеянным склерозом, инсультом, гипотензией, остановкой сердца, ишемией, инфарктом миокарда,воспалением, связанной с возрастом потерей когнитивной функции, лучевым повреждением, церебральным параличом, нейродегенеративным заболеванием, болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона,подострой некротизирующей энцефалопатией (болезнью Leigh), деменцией при СПИДе, потерей памяти,боковым амиотрофическим склерозом, алкоголизмом, нарушением настроения, нарушением, связанным с тревожностью, нарушением с дефицитом внимания, гиперактивностью, болезнью КрейтцфельдаЯкоба, травмой или ишемией головного или спинного мозга, искусственным кровообращением, хронической сердечной недостаточностью, дегенерацией желтого пятна, диабетической невропатией, диабетической ретинопатией, глаукомой, ретинальной ишемией или ретинальной травмой. В соответствии с другим аспектом данного изобретения обеспечен способ облегчения трансцитоза молекулы через барьер эндотелиальных клеток у млекопитающего, предусматривающий введение указанному млекопитающему композиции, содержащей указанную молекулу в ассоциации с рекомбинантным тканезащитным цитокином, описанным в настоящем описании выше, лишенным по меньшей мере одной активности, выбранной из группы, состоящей из увеличения гематокрита, увеличения кровяного давления, гиперактивации тромбоцитов и увеличения продукции тромбоцитов. В одном варианте осуществления эта ассоциация является лабильной ковалентной связью, стабильной ковалентной связью или нековалентной ассоциацией с сайтом связывания для указанной молекулы. В соответствии с другим аспектом данного изобретения обеспечен способ облегчения трансцитоза молекулы через барьер эндотелиальных клеток у млекопитающего, предусматривающий введение указанному млекопитающему композиции, содержащей указанную молекулу в ассоциации с рекомбинантным тканезащитным цитокином,описанным в настоящем описании выше и имеющим активность, выбранную из группы, состоящей из увеличения гематокрита, увеличения кровяного давления, гиперактивации тромбоцитов и увеличения- 11010200 продукции тромбоцитов. В одном варианте осуществления эта ассоциация является лабильной ковалентной связью, стабильной ковалентной связью или нековалентной ассоциацией с сайтом связывания для указанной молекулы. В другом варианте осуществления барьер эндотелиальных клеток выбран из группы, состоящей из гематоэнцефалического барьера, барьера между кровью и глазом, барьера между кровью и яичком, барьера между кровью и яичником, барьера между кровью и почкой и барьера между кровью и плацентой. Еще в одном варианте осуществления, эта молекула является гормоном-агонистом или гормоном-антагонистом рецептора, нейротрофическим фактором, антимикробным агентом, антивирусным агентом, радиоактивным фармацевтическим агентом, антисмысловым олигонуклеотидом, антителом, иммуносупрессором, красителем, маркером или противораковым лекарственным средством. В соответствии с другим аспектом данного изобретения обеспечена композиция для транспортировки молекулы посредством трансцитоза через барьер эндотелиальных клеток, содержащая указанную молекулу в ассоциации с рекомбинантным тканезащитным цитокином, описанным в настоящем описании выше, лишенным по меньшей мере одной эритропоэтической активности, выбранной из группы,состоящей из увеличения гематокрита, вазоактивного действия (вазоконстрикции/вазодилатации), гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтной активности и увеличения продукции тромбоцитов. В соответствии с другим аспектом данного изобретения обеспечена композиция для транспортировки молекулы посредством трансцитоза через барьер эндотелиальных клеток, содержащая указанную молекулу в ассоциации с рекомбинантным тканезащитным цитокином, описанным в настоящем описании выше и имеющим по меньшей мере одну эритропоэтическую активность, выбранную из группы, состоящей из увеличения гематокрита, вазоактивного действия (вазоконстрикции/вазодилатации), гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтной активности и увеличения продукции тромбоцитов. В одном варианте осуществления эта ассоциация является лабильной ковалентной связью, стабильной ковалентной связью или нековалентной ассоциацией с сайтом связывания для указанной молекулы. В другом варианте осуществления эта молекула является гормоном-агонистом или гормоном-антагонистом рецептора, нейротрофическим фактором, антимикробным агентом, радиоактивным фармацевтическим агентом, антисмысловым олигонуклеотидом, антителом, иммуносупрессором, красителем, маркером или противораковым лекарственным средством. Данное изобретение обеспечивает также применение молекулы в ассоциации с рекомбинантным тканезащитным цитокином, описанным в настоящем описании выше, лишенным по меньшей мере одной эритропоэтической активности, выбранной из группы, состоящей из увеличения гематокрита, вазоактивного действия (вазоконстрикции/вазодилатации), гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтных активностей и увеличения продукции тромбоцитов для получения фармацевтической композиции для транспортировки молекулы посредством трансцитоза барьер эндотелиальных клеток. В одном варианте осуществления эта ассоциация является лабильной ковалентной связью, стабильной ковалентной связью или нековалентной ассоциацией с сайтом связывания для указанной молекулы. В другом варианте осуществления эта молекула является гормоном-агонистом или гормоном-антагонистом рецептора, нейротрофическим фактором, антимикробным агентом, радиоактивным фармацевтическим агентом, антисмысловым олигонуклеотидом, антителом, иммуносупрессором, красителем, маркером или противораковым лекарственным средством. Таким образом, данное изобретение относится к клеточно-протективному применению любого рекомбинантного тканезащитного цитокина с изменением по меньшей мере одной аминокислоты природной копии эритропоэтина, где этот рекомбинантный тканезащитный цитокин имеет клеточнопротективную активность, описанную в настоящем описании. Такая клеточно-протективная активность включает в себя, не ограничиваясь ею, нейропротективную активность. Далее, данное изобретение относится к применению любого из вышеуказанных рекомбинантных тканезащитных цитокинов в лечении чувствительных клетки, ткани или органа, в частности, для лечения состояния или заболевания, включающего в себя такие чувствительные клетку, ткань или орган. В одном таком варианте осуществления рекомбинантные тканезащитные цитокины имеют по меньшей мере одну эритропоэтическую активность, выбранную из группы, состоящей из увеличения гематокрита, вазоактивного действия (вазоконстрикции/вазодилатации), гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтных активностей и увеличения продукции тромбоцитов. Рекомбинантный тканезащитный цитокин данного изобретения предпочтительно поддерживает трехмерную конформацию природного эритропоэтина. Рекомбинантный тканезащитный цитокин может иметь или может не иметь эритропоэтическую активность. В одном варианте осуществления данного изобретения рекомбинантный тканезащитный цитокин создают в виде рекомбинантного белка с N-концевым слиянием His-метки (6 His-остатков). В некоторых вариантах осуществления могут быть добавлены дополнительные аминокислотные последовательности в качестве спейсера. В особом варианте осуществления меченные гистидином мутеины рекомбинантного тканезащитного цитокина данного изобретения включают в себя, но не ограничиваются ими, K45D6xHis и S100E-6xHis. В другом аспекте данного изобретения любой из предыдущих рекомбинантных тканезащитных цитокинов может быть использован в приготовлении фармацевтической композиции для обработки ex vivo клеток, тканей и органов с целью защиты, поддержания, усиления или восстановления функции или- 12010200 жизнеспособности чувствительных клеток млекопитающих и их ассоциированных клеток, тканей и органов. Такая обработка ex vivo применима, например, для консервирования клеток, тканей или органов трансплантата, независимо от того, является ли он аутотрансплантатом или ксенотрансплантатом. Клетки, ткань или орган могут омываться в растворе, содержащем мутеины эритропоэтина или рекомбинантные тканезащитные цитокины, или перфузат вводят инстилляцией в орган через сосудистую сеть или другими способами для поддержания функционирования клеток во время периода, в течение которого эти клетки, ткань или орган не являются интегрированными с сосудистой сетью донора или реципиента. Может осуществляться введение перфузата донору перед взятием органа, а также во взятый орган и реципиенту. Кроме того, вышеуказанное применение любого рекомбинантного тканезащитного цитокина применимо всякий раз, когда клетка, ткань или орган изолированы от сосудистой сети индивидуума и,следовательно, по существу, существует ех vivo в течение некоторого периода времени, причем термин"изолирован" означает ограничение или пережимание сосудистой сети от клетки, ткани, органа или части организма, или к ним, как это может выполняться во время хирургического вмешательства, в том числе, в частности, хирургического вмешательства для шунтирования; шунтирования сосудистой сети клетки, ткани, органа или части организма; удаления клетки, ткани, органа или части организма из организма млекопитающего, как это может выполняться перед ксенотрансплантацией или до, или во время аутотрансплантации; или травматической ампутации клетки, ткани, органа или части организма. Таким образом, этот аспект данного изобретения относится к перфузии мутеином эритропоэтина как in situ, так и exvivo. Ex vivo рекомбинантный тканезащитный цитокин может быть обеспечен в растворе для консервирования клетки, ткани или органа. В любом аспекте воздействию рекомбинантного тканезащитного цитокина может осуществляться посредством непрерывной перфузии, пульсирующей перфузии, инфузии,выдерживания в растворе бани, инъекции или катетеризации. Еще в одном аспекте данное изобретение относится к способу защиты, поддержания, усиления или восстановления функции или жизнеспособности чувствительных клетки, ткани, органа или части организма млекопитающего, которая содержит чувствительную клетку или ткань, где эта клетка, ткань, орган или часть организма являются изолированными из организма млекопитающего. Этот способ предусматривает, по меньшей мере, воздействие на выделенные клетки, ткани, органы или части организма млекопитающего количества мутеина эритропоэтина или рекомбинантного тканезащитного цитокина в течение периода времени, которое является эффективным для защиты, поддержания, усиления или восстановления вышеуказанной жизнеспособности. В неограничивающих примерах термин "изолирован" означает ограничение или пережимание сосудистой сети от клетки, ткани, органа или части организма, или к ним, как это может выполняться во время хирургического вмешательства, в том числе, в частности, хирургического вмешательства для шунтирования; шунтирования сосудистой сети клетки, ткани, органа или части организма; удаления клетки, ткани, органа или части организма из организма млекопитающего, как это может выполняться перед ксенотрансплантацией или до, или во время аутотрансплантации; или травматической ампутации клетки, ткани, органа или части организма. Таким образом, этот аспект данного изобретения относится к перфузии мутеином эритропоэтина или рекомбинантным тканезащитным цитокином как in situ, так и ex vivo. Ex vivo рекомбинантный тканезащитный цитокин может быть обеспечен в растворе для консервирования клетки, ткани или органа. Для любого аспекта воздействие рекомбинантного тканезащитного цитокина может осуществляться посредством непрерывной перфузии,пульсирующей перфузии, инфузии, выдерживания в растворе, инъекции или катетеризации. В качестве неограничивающих примеров, вышеуказанные ex vivo чувствительные клетка или ткань могут представлять или содержать нервные, ретинальные, мышечные клетки или ткань, клетки или ткань сердца, легкого, печени, почки, тонкой кишки, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников,эндотелия капилляров, яичка, яичника, поджелудочной железы, кости, костного мозга, кожи, пуповинной крови или эндометрия. Эти примеры чувствительных клеток являются лишь иллюстративными. Все предыдущие способы и применения предпочтительно применимы для человека, но также применимы и для любого млекопитающего, такого, например, как домашние животные, прирученные животные, домашний скот и животные зоопарков. Способы введения вышеуказанных фармацевтических композиций включают в себя пероральное, внутривенное, интраназальное, местное, внутрипросветное введение, введение путем ингаляции или парентеральное введение, причем последнее включает в себя внутривенное, внутриартериальное, подкожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, подслизистое или интрадермальное введение. Для применения ex vivo предпочтительным является перфузат или раствор для бани. Это относится и к перфузии изолированной части сосудистой сети in situ. Еще в одном аспекте данного изобретения любые из вышеуказанных рекомбинантных тканезащитных цитокинов применимы в приготовлении фармацевтической композиции для восстановления клетки,ткани или органа с нарушенной функцией при введении после возникновения болезни или состояния,ответственного за эту дисфункцию. В качестве неограничивающего примера, введение фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный тканезащитный цитокин, восстанавливает когнитивную функцию в животных, имеющих ранее травму головного мозга, даже в тех случаях, когда введение проводится после продолжительного периода времени (например, спустя один день, три дня, пять дней, неделю, месяц или более) после первоначальной травмы. Данное изобретение включает в себя фармацев- 13010200 тические композиции для лечения (т.е. ослабления или обращения симптомов или эффектов) и предупреждения (т.е. задержки возникновения, ингибирования или остановки) последующего повреждения клеток и тканей, которое происходит в виде каскада из первоначальной травмы. Рекомбинантные тканезащитные цитокины, полезные для таких применений, включают в себя любые из конкретных вышеуказанных рекомбинантных тканезащитных цитокинов. Любая форма рекомбинантного тканезащитного цитокина, способная приносить пользу чувствительным клеткам, включена в этот аспект данного изобретения. Еще в одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способы применения вышеупомянутого рекомбинантного тканезащитного цитокина для восстановления клетки, ткани или органа с нарушенной функцией при введении после возникновения болезни или состояния, ответственного за эту дисфункцию. В качестве неограничивающего примера, способы введения фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный тканезащитный цитокин, восстанавливают когнитивную функцию в животных, имеющих ранее травму головного мозга, даже в тех случаях, когда введение проводится спустя продолжительнее время времени (например, спустя один день, три дня, пять дней, неделю, месяц или более) после затихания травмы. Рекомбинантные тканезащитные цитокины и их дополнительные модификации являются такими, какие описаны в настоящем описании выше. Любая форма рекомбинантного тканезащитного цитокина, способная приносить пользу чувствительным клеткам, включена в этот аспект данного изобретения. В дополнительном аспекте данного изобретения обеспечены способы облегчения трансцитоза молекулы через барьер эндотелиальных клеток в организме млекопитающего, посредством введения композиции молекулы в ассоциации с мутеином эритропоэтина или рекомбинантным тканезащитным цитокином, описанным в настоящем описании ранее. Эта ассоциация между подлежащей транспортировке молекулой и рекомбинантным тканезащитным цитокином может быть, например, лабильной ковалентной связью, стабильной ковалентной связью или нековалентной ассоциацией с сайтом связывания с этой молекулой. Рекомбинантный тканезащитный цитокин и подлежащий транспортировке белок может быть экспрессирован в виде слитого полипептида. Барьерами эндотелиальных клеток могут быть гематоэнцефалический барьер, барьер между кровью и сердцем, барьер между кровью и почкой, барьер между кровью и глазом, барьер между кровью и яичком, барьер между кровью и яичником и барьер между кровью и плацентой. Подходящие молекулы для транспортировки способом согласно изобретению включают в себя гормоны, такие как гормон роста,антибиотики и противораковые агенты. В дополнительном аспекте данного изобретения обеспечена композиция для облегчения трансцитоза молекулы через барьер эндотелиальных клеток в организме млекопитающего, причем указанная композиция содержит молекулу в ассоциации с рекомбинантным тканезащитным цитокином, таким как описанный выше. Еще в одном аспекте данного изобретения, любые из вышеуказанных рекомбинантных тканезащитных цитокинов применимы в приготовлении фармацевтической композиции для облегчения трансцитоза молекулы через барьер эндотелиальных клеток в организме млекопитающего, причем указанная композиция содержит молекулу в ассоциации с рекомбинантным тканезащитным цитокином, описанным в настоящем описании выше. Эта ассоциация может быть, например, лабильной ковалентной связью, стабильной ковалентной связью или нековалентной ассоциацией с сайтом связывания с этой молекулой. Барьерами эндотелиальных клеток могут быть гематоэнцефалический барьер, барьер между кровью и глазом, барьер между кровью и яичком, барьер между кровью и яичником и барьер между кровью и плацентой. Подходящие молекулы для транспортировки способом согласно изобретению включают в себя, например, гормоны,такие как гормон роста, нейротрофические факторы, антибиотики, антивирусные агенты или противогрибковые агенты, такие как агенты, в норме исключенные из головного мозга и других имеющих барьер органов, пептидные радиоактивные фармацевтические агенты, антисмысловые лекарственные средства,антитела против биологически активных агентов, фармацевтические средства, красители, маркеры и противораковые агенты. Эти и другие аспекты данного изобретения будут более понятны со ссылкой на следующие фигуры и подробное описание. 4. Краткое описание фигур На фиг. 1 показано распределение рецептора эритропоэтина в тонких срезах нормального головного мозга человека, окрашенных антителом против эритропоэтина. Фиг. 2 является увеличением с более высокой разрешающей способностью изображения на фиг. 1. На фиг. 3 показано, с использованием меченных золотом вторичных антител, ультрамикроскопическое распределение рецепторов эритропоэтина. На фиг. 4, полученной подобно фиг. 3, показаны рецепторы эритропоэтина высокой плотности вблизи люминальных и противолюминальных поверхностей капилляров головного мозга человека. На фиг. 5 изображена транслокация парентерально введенного эритропоэтина в цереброспинальную жидкость.- 14010200 На фиг. 6 А и 6 В показаны результаты анализа нейрозащиты клеток нейробластомы SK-N-SH (против ротенона) для эритропоэтина, а также рекомбинантных тканезащитных цитокинов с рекомбинантными тканезащитными цитокинами K45D и S100E. На оси y на этом графике отложены показатели оптической плотности, и эти результаты являются среднимидиапазон двух определений. График на фиг. 6 А ясно свидетельствует о том, что жизнеспособность этих клеток в пробах K45D и S100E сохранялась, что демонстрирует их клеточно-защитное действие. На фиг. 6 В показана карта плазмиды hEPO-6xHisTagPCiNeo. На фиг. 7 показана сравнительная эффективность действия in vitro эритропоэтина и асиалоэритропоэтина на жизнеспособность испытывающих недостаток сыворотки клеток Р 19. На фиг. 8 показан другой эксперимент, в котором сравнивается эффективность действия in vitro эритропоэтина и асиалоэритропоэтина на жизнеспособность испытывающих недостаток сыворотки клеток Р 19. На фиг. 9 показана защита эритропоэтином и асиалоэритропоэтином на модели очаговой церебральной ишемии крыс. На фиг. 10 показана зависимость доза-ответ при сравнении эффективности эритропоэтина человека и асиалоэритропоэтина человека в окклюзии средней мозговой артерии на модели ишемического мозгового удара. На фиг. 11 показана активность иодинированного эритропоэтина в анализе Р 19. На фиг. 12 показано действие биотинилированного эритропоэтина и асиалоэритропоэтина в анализе Р 19. На фиг. 13 сравнивается эффективность действия in vitro эритропоэтина с эффективностью действия модифицированного фенилглиоксалем эритропоэтина на жизнеспособность испытывающих недостаток сыворотки клеток Р 19. На фиг. 14 показано действие тканезащитных цитокинов в анализе водной интоксикации. На фиг. 15 показано поддержание эритропоэтином функции сердца, препарированного для трансплантации. На фиг. 16 показана защита эритропоэтином миокарда от ишемического повреждения после временной васкулярной окклюзии. На фиг. 17 А, 17 В, 17 С и 17D изображены эффекты лечения эритропоэтином на модели глаукомы крыс. На фиг. 18 изображена степень сохранения ретинальной функции эритропоэтином на модели глаукомы крыс. На фиг. 19 изображено восстановление когнитивной функции после травмы головного мозга путем введения эритропоэтина, начинающегося спустя пять дней после травмы. На фиг. 20 изображено восстановление когнитивной функции после травмы головного мозга путем введения эритропоэтина, начинающегося спустя 30 дней после травмы. На фиг. 21 изображена эффективность асиалоэритропоэтина человека на каинатной модели церебральной токсичности. На фиг. 22 изображена эффективность тканезащитных цитокинов в модели повреждения спинного мозга крыс. На фиг. 23 показана эффективность тканезащитных цитокинов на модели повреждения спинного мозга кроликов. На фиг. 24 А, 24 В и 24 С показан венечный срез кортикального слоя головного мозга, окрашенный гематоксилином и эозином. На фиг. 25 А, 25 В и 25 С показаны венечные срезы лобной доли полушария головного мозга, смежной с районом инфаркта, окрашенные GFAP-антителом. На фиг. 26 А и 26 В показаны венечные срезы кортикального слоя головного мозга, окрашенные ОХ 42-антителом. На фиг. 27 А и 27 В показаны венечные срезы кортикального слоя головного мозга, смежного с районом инфаркта, окрашенные ОХ-42-антителом. На фиг. 28 показана эффективность эритропоэтина против воспаления в модели ЕАЕ. На фиг. 29 показано сравнительное действие дексаметазона и эритропоэтина на воспаление на модели ЕАЕ. На фиг. 30 А и 30 В показано, что эритропоэтин подавляет воспаление, связанное с гибелью нейронов. На фиг. 31 показано, что эритропоэтин человека и рекомбинантные тканезащитные цитокиныR130E и R150E эффективно уменьшают смертность клеток, индуцированную NMDA, при добавлении к первичным культурам нервных клеток гиппокампа перед обработкой NMDA. В клетках, обработанныхR103E (5 нМ), обнаруживали значимо меньшую смертность, в сравнении с контрольными клетками, обработанными носителем (р=0,01). У клеток, обработанных R103E (5 нМ), обнаруживали приблизительно 20% снижение смертности в сравнении с контрольными клетками, обработанными растворителем- 15010200 На фиг. 32 показана защита нейронов от депривации сыворотки в клетках Р 19. Процент апоптотических клеток уменьшался для клеток, предобработанных Epo, EpoWT и рекомбинантным тканезащитным цитокином S100E. У клеток, обработанные Epo, обнаруживали приблизительно 20% уменьшение смерти апоптотических клеток в сравнении с необработанными контрольными клетками. У клеток, обработанные как EpoWT, так и S100E, обнаруживали приблизительно 10% уменьшение смерти апоптотических клеток в сравнении с необработанными контрольными клетками. На фиг. 33A и 33 В показано действие предынкубации с S100E в дифференцированных клетках РС 12, подвергнутых удалению NGF, в двух независимых экспериментах. Дифференцированные клетки РС 12 предобрабатывали S100E в указанных концентрациях в течение 24 ч, фиг. 33A (3 пМ), фиг. 33 В(+NGF) (n=8 в обоих экспериментах). Имеется статистически значимое увеличение жизнеспособности обработанных S100E клеток в сравнении с клетками отрицательного контроля (-BGF), как показано однофакторным ANOVA и post hoc критерием Бонферрони. р 0,001, р 0,05. Эффекты, наблюдаемые сS100E, были сходными с эффектами Epo в этой тест-системе в отношении силы действия и эффективности. На фиг. 34 А, 34 В и 34 С показано действие предынкубации с Epo в дифференцированных клетках РС 12, подвергнутых удалению NGF. Дифференцированные клетки РС 12 предобрабатывали Epo, S100E или карбамилированным Epo (30 пМ-30 нМ) в течение 24 ч. Химически модифицированная молекулаEpo, АА 24496, имеет в 10000 раз более низкую активность, чем ЕРО, в анализе клеток UT-7. Жизнеспособность измеряли в МТТ-анализе. NGF (100 нг/мл) использовали в качестве положительного контроля,а не содержащую NGF среду (-NGF) - в качестве отрицательного контроля. На фиг. 35 показаны кривые концентрация-ответ Epo, K45D и S100E в клетках UT-7. Различные концентрации Epo, EpoWT, K45D и S100E добавляли к клеткам UT-7. Жизнеспособность измеряли спустя 48 ч в анализе WST-1. Данные представляют собой среднееSD по трем различным экспериментам,каждый из которых выполняли в двух повторностях. Эта кривая построена в виде кривой нелинейной регрессии. На фиг. 36 показаны кривые доза-ответ Epo, R103E и R150E в клетках UT-7. Различные концентрации Epo, EpoWT, R103E и R150E добавляли к клеткам UT-7. Жизнеспособность измеряли спустя 48 ч в анализе WST-1. Данные представляют собой среднееSD по трем различным экспериментам, каждый из которых выполняли в двух повторностях. Эта кривая построена в виде кривой нелинейной регрессии. Фиг. 37 является графиком, демонстрирующим опорно-двигательные оценки крыс, восстанавливающихся от травмы спинного мозга на протяжении периода сорока двух дней. Как можно видеть из этого графика, крысы, которые получали S100E, восстанавливались после этого повреждения более легко и показали лучшее общее восстановление из этого повреждения, чем контрольные крысы и крысы,которым вводили метилпреднизолон. На фиг. 38 показано отношение времени скрытого восстановления функции поврежденного глаза ко времени скрытого восстановления функции нормального глаза для различных схем обработки. Каждый из четырех рекомбинантных тканезащитных цитокинов приводил ко времени скрытого восстановления функции, равному или лучшему, чем ЕРО, причем R103E, R150E и S100E показали статистически значимое улучшение в сравнении с ЕРО. 5. Подробное описание изобретения Данное изобретение относится к мутантным рекомбинантным тканезащитным цитокинам. В частности, данное изобретение обеспечивает композиции, содержащие выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие рекомбинантные тканезащитные цитокины, а также выделенные и/или рекомбинантные клетки и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновых кислот. Далее, данное изобретение включает в себя выделенные полипептиды мутантного рекомбинантного тканезащитного цитокина, лишенного по меньшей мере одной эритропоэтической активности, выбранной из группы, состоящей из увеличения гематокрита, вазоактивного действия (вазоконстрикции/вазодилатации), гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтных активностей и увеличения продукции тромбоцитов, причем цитокин имеет по меньшей мере одну клеточно-защитную активность в отношении чувствительных клеток, выбранную из группы, состоящей из защиты, поддержания, усиления или восстановления функции или жизнеспособности чувствительных клетки, ткани или органа. Данное изобретение включает в себя также способы защиты, поддержания или усиления жизнеспособности клетки, ткани или органа, выделенных из организма млекопитающего, с использованием мутеинов рекомбинантных тканезащитных цитокинов данного изобретения и применение таких мутеинов в лечении и предупреждении заболеваний и состояний."Чувствительная клетка" означает клетку млекопитающего, функция или жизнеспособность которой может поддерживаться, стимулироваться, усиливаться, регенерироваться или получать пользу любым другим образом посредством подвергания действию эритропоэтина. Неограничивающие примеры- 16010200 таких клеток включают в себя нервные, ретинальные, мышечные клетки, клетки сердца, легкого, печени,почки, тонкой кишки, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников, эндотелия капилляров,яичек, яичника, поджелудочной железы, кости, кожи или эндометрия. В частности, чувствительные клетки включают в себя, без ограничения, нервные клетки; клетки Пуркинье; ретинальные клетки: клетки фоторецептора (палочки и колбочки сетчатки), ганглия, биполярные, горизонтальные, амакриновые клетки и клетки Мюллера; мышечные клетки; клетки сердца: клетки миокарда, пейсмекера, синуснопредсердного узла, синусного узла и клетки ткани контакта (предсердно-желудочкового узла и пучка Гиса); клетки легких; клетки печени: гепатоциты, звездчатые клетки и Купферовские клетки; клетки почек: мезангиальные, почечные эпителиальные и трубчатые интерстициальные клетки; клетки тонкой кишки: бокаловидные (эпителиальные) клетки, кишечные железистые (крипты) и кишечные эндокринные клетки; клетки коры надпочечников: клетки клубочковой зоны коры надпочечников, фасцикулятные клетки и ретикулярные клетки; клетки мозгового вещества надпочечников: хромаффинные клетки; клетки капилляров: перициты; клетки яичек: интерстициальные клетки Лейдига, клетки Сертоли и сперматозоиды и их предшественники; клетки яичников: клетки Граафова пузырька и примордиальные яичниковые фолликулы; клетки поджелудочной железы: островки Лангерганса, -клетки, -клетки, -клетки, Fклетки; костные клетки: предшественники остеоцитов, остеокласты и остеобласты; клетки кожи; эндометриальные клетки: клетки стромы эндометрия и эндометриальные клетки; а также стволовые и эндотелиальные клетки, присутствующие в перечисленных выше органах. Кроме того, диапазон таких чувствительные клеток и преимуществ, обеспечиваемых в отношении этих клеток рекомбинантным тканезащитным цитокином, может быть расширен для обеспечения защиты или усиления косвенным путем другим клеткам, которые не являются непосредственно чувствительными, или тканям или органам, которые содержат такие нечувствительные клетки. Эти другие клетки, ткани или органы, которые получают пользу косвенным образом вследствие усиления чувствительных клеток, присутствуют в виде части клеток, ткани или органа в качестве ассоциированных клеток, тканей и органов. Таким образом, преимущества рекомбинантного тканезащитного цитокина, описанного в настоящем описании, могут быть обеспечены в результате присутствия небольшого количества или небольшой доли чувствительных клеток в ткани или органе, например, возбудимой или нервной ткани, присутствующей в такой ткани, или клеток Лейдига в яичке, которые продуцируют тестостерон. В одном аспекте чувствительная клетка или ее ассоциированные клетки, ткани или органы не являются возбудимыми клетками, тканями или органами или предпочтительно не содержат возбудимых клеток или тканей. Способы согласно изобретению обеспечивают локальную или системную защиту или усиление клеток, тканей и органов в организме млекопитающего при большом разнообразии нормальных и неблагоприятных состояний, или защиту клеток, тканей и органов, которые предназначены для перемещения в организм другого млекопитающего. Кроме того, обеспечены также восстановление или регенерация дисфункции. Как упоминалось выше, способность мутеина эритропоэтина или рекомбинантного тканезащитного цитокина пересекать плотный барьер эндотелиальных клеток и проявлять его положительные действия на чувствительных клетках (а также других типах клеток), дистальных относительно сосудистой сети, предоставляет потенциал для предупреждения, а также лечения большого разнообразия состояний и заболеваний, которые в противном случае вызывают значительное повреждение клеток и ткани у животного, в том числе человека, и, кроме того, делает возможным успех до сих пор непригодных хирургических процедур, для которых риск традиционно перевешивал пользу. Продолжительность и степень преднамеренных вредных условий, индуцируемых для конечной пользы, таких как химиотерапия с использованием высоких доз, лучевая терапия, пролонгированное выживание трансплантата exvivo и пролонгированные периоды хирургически индуцированной ишемии, могут проводиться с использованием преимуществ заявленного в настоящем списании изобретения. Однако данное изобретение не ограничивается этим, но включает в себя в качестве одного из аспектов способы или композиции, где чувствительные клетки-мишени являются дистальными относительно сосудистой сети из-за барьера из эндотелиальных клеток или эндотелиальных межклеточных контактов. Вообще данное изобретение относится к любой чувствительной клетке и ассоциированным клеткам, тканям и органам, на которые может положительно воздействовать рекомбинантный тканезащитный цитокин. Кроме того, клеточная,тканевая функция или функция органа может быть восстановлена или регенерирована после острого вредного воздействия (такого как травма) под действием рекомбинантного тканезащитного цитокина. Таким образом, данное изобретение относится в общем к применению рекомбинантных тканезащитных цитокинов для приготовления фармацевтических композиций для вышеуказанных целей, где клеточная функция поддерживается, стимулируется, усиливается, регенерируется или улучшается любым другим образом. Данное изобретение относится также к способам поддержания, усиления, стимуляции или регенерации клеточной функции путем введения млекопитающему эффективного количества рекомбинантного тканезащитного цитокина, описанного в настоящем описании. Далее, данное изобретение относится к способам поддержания, стимуляции, усиления или регенерации клеточной функции exvivo путем воздействия на клетки, ткани или орган рекомбинантного тканезащитного цитокина. Данное изобретение относится также к композиции перфузата, содержащей рекомбинантный тканезащитный цитокин, для применения в консервировании органов или тканей.- 17010200 В различных способах согласно изобретению используется фармацевтическая композиция, которая,по меньшей мере, включает в себя рекомбинантный тканезащитный цитокин в эффективном количестве для конкретного способа введения и продолжительности действия для проявления положительных эффектов или преимуществ в отношении чувствительных клеток в организме млекопитающего или вне его при выделении из организма млекопитающего. В случаях, когда при терапии клетки-мишени, ткани- или органа-мишени требуется преодоление барьера эндотелиальных клеток рекомбинантным тканезащитным цитокином, эта фармацевтическая композиция включает в себя рекомбинантный тканезащитный цитокин в концентрации, которая способна, после пересечения барьера эндотелиальных клеток, проявлять желаемые действия в отношении чувствительных клеток. Молекулы, способные взаимодействовать с рецептором эритропоэтина и модулировать клеточно-защитную активность в клетке, применимы в контексте данного изобретения. 5.1. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению. Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, кодирующая рекомбинантный тканезащитный цитокин, включает в себя нуклеиновые кислоты, кодирующие рекомбинантные тканезащитные цитокины, содержащие мутеин эритропоэтина, лишенный или проявляющий уменьшение по меньшей мере одной эритропоэтической активности, выбранной из группы, состоящей из увеличения гематокрита, вазоактивного действия (вазоконстрикции/вазодилатации), гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтных активностей и увеличения продукции тромбоцитов, причем этот цитокин имеет по меньшей мере одну клеточно-защитную активность в отношении чувствительных клеток, выбранную из группы, состоящей из защиты, поддержания, усиления или восстановления функции или жизнеспособности чувствительных клетки, ткани или органа млекопитающего. Молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения, кодирующая рекомбинантный тканезащитный цитокин, включает в себя нуклеиновые кислоты, кодирующие мутеин эритропоэтина, с активностью, описанной выше, содержащие один или несколько измененных аминокислотных остатков между положениями 11-15 SEQ ID NO:10 [SEQ ID NO:1], положениями 44-51SEQ ID NO:10 [SEQ ID NO:2], положениями 100-108 SEQ ID NO:10 [SEQ ID NO:3] или положениями 146-151 SEQ ID NO:10 [SEQ ID NO:4]. Молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения, кодирующая рекомбинантный тканезащитный цитокин, включает в себя нуклеиновые кислоты, кодирующие мутеин эритропоэтина, с активностью, описанной выше, содержащий измененный аминокислотный остаток в одном или нескольких положениях SEQ ID NO:10: 7, 20, 21, 29, 33, 38, 42, 59, 63, 67, 70, 83, 96, 126,142, 143, 152, 153, 155, 156 или 161. Молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения, кодирующая тканезащитный цитокин, включает в себя нуклеиновые кислоты, кодирующие мутеин эритропоэтина, с активностью, описанной выше, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10 с одним или несколькими из следующих изменений: аланин в положении остатка 6 SEQ ID NO:10, аланин в положении остатка 7 SEQ ID NO:10, серин в положении остатка 7 SEQ ID NO:10, изолейцин в положении остатка 10 SEQ ID NO:10, серин в положении остатка 11 SEQ ID NO:10, аланин в положении остатка 12 SEQ ID NO:10, аланин в положении остатка 13 SEQ ID NO:10, аланин в положении остатка 14 SEQ IDNO:10, аланин в положении остатка 147 SEQ ID NO:10, тирозин в положении остатка 148 SEQ ID NO:10,аланин в положении остатка 148 SEQ ID NO:10, аланин в положении остатка 149 SEQ ID NO:10, аланин в положении остатка 150 SEQ ID NO:10, глутаминовая кислота в положении остатка 150 SEQ ID NO:10,аланин в положении остатка 151 SEQ ID NO:10, аланин в положении остатка 152 SEQ ID NO:10, триптофан в положении остатка 152 SEQ ID NO:10, аланин в положении остатка 153 SEQ ID NO:10, аланин в положении остатка 154 SEQ ID NO:10, аланин в положении остатка 155 SEQ ID NO:10, аланин в положении остатка 158 SEQ ID NO:10, серин в положении остатка 160 SEQ ID NO:10, аланин в положении остатка 161 SEQ ID NO:10 или аланин в положении остатка 162 SEQ ID NO:10. Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению дополнительно включают в себя нуклеотидные последовательности, которые кодируют рекомбинантные мутеины эритропоэтина, имеющие по меньшей мере 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98% или более высокую идентичность аминокислотной последовательности с одним из описанных выше мутеинов эритропоэтина. Для определения процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот, кодирующих мутеины эритропоэтина, эти последовательности сопоставляют для целей оптимального сравнения (например, могут быть введены гэпы в последовательность первой аминокислотной последовательности или первой последовательности нуклеиновой кислоты для оптимального сопоставления со второй аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или нуклеотидов. Когда положение в первой последовательности занято тем же самым аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и во второй последовательности, тогда эти молекулы являются идентичными по этому положению. Степень идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для двух последовательностей (т.е. % идентичности=количество идентичных перекрывающихся положений/общее количество перекрывающихся положений 100%). В одном из вариантов эти две последовательности представляют собой последовательности одной и той же длины. Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению включают в себя также нуклеотидные последовательности, которые кодируют рекомбинантные мутеины эритропоэтина, в которых кодирующая эритропоэтин последовательность нуклеиновой кислоты, которая изменена одной или несколькими заменами, делециями или модификациями, описанными выше, имеет по меньшей мере 30, 35, 40, 45, 50,55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98% или более высокую степень идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO:7. Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению включают в себя также нуклеотидные последовательности, которые кодируют рекомбинантные мутеины эритропоэтина, в которых кодирующая эритропоэтин последовательность нуклеиновой кислоты, которая изменена путем одной или нескольких замен, делеций или модификаций, описанных выше, является нуклеиновой кислотой, кодирующей эритропоэтин не человека. Определение степени идентичности между двумя последовательностями может быть также выполнено с использованием математического алгоритма. Предпочтительным, неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритмAltschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Такой алгоритм включен в программы NBLAST иXBLAST Altschul, et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. Поиски нуклеотидов BLAST могут выполняться в программе NBLAST, балл = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидной последовательности,гомологичной молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Поиск белков BLAST может выполняться с программой XBLAST, балл = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекуле белка данного изобретения. Для получения имеющих гэпы сопоставлений для целей сравнения может быть использована программа Gapped BLAST, описанная в Altschulet al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Альтернативно, может быть использована программа PSIBlast для проведения повторяемого поиска, который детектирует отдаленное родство между двумя молекулами (Altschul et al., 1997, supra). При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST иNBLAST) (см. http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Другим предпочтительным, неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритмMyers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17. Такой алгоритм включен в программу ALIGN (version 2.0), которая является частью пакета программного обеспечения GCG sequence alignment. При использовании программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей могут быть использованы таблица РАМ 120 weight residue, штраф (пенальти) длины гэпа 12 и штраф (пенальти) открывания гэпа 4.- 19010200 Процентная идентичность между двумя последовательностями может быть определена с использованием способов, сходных с описанными выше, с разрешением или без разрешения гэпов. При расчете процентной идентичности считают обычно только точные совпадения. Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению дополнительно включают в себя (а) любую нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с кодирующей рекомбинантный тканезащитный цитокин молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению, описанной выше, при строгих условиях, например, при гибридизации со связанной с фильтром ДНК в 6 хлорид натрия/цитрат натрия(SSC) приблизительно 45 С с последующими одной или несколькими промывками в 0,2 SSC/0,1% ДСН приблизительно при 50-65 С, или (b) в очень жестких условиях, например, при гибридизации со связанной с фильтром ДНК в 6 хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при приблизительно при 45 С, с последующими одной или несколькими промывками в 0,2 SSC/0,1% ДСН приблизительно при 68 С, или при других условиях гибридизации, которые являются очевидными для специалистов с квалификацией в данной области (см., например, Ausubel F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology,Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., и John WileySons, Inc., New York, на с. 6.3.1-6.3.6 и 2.10.3). Предпочтительно, чтобы кодирующая мутеин эритропоэтина молекула нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях, описанных в (а), (b) выше, являлась нуклеиновой кислотой, которая содержит комплемент молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутеин эритропоэтина. В предпочтительном варианте осуществления молекулы нуклеиновых кислот, которые гибридизуются в условиях (а) и (b) выше, кодируют белковые продукты, например, белковые продукты, функционально эквивалентные, т.е. имеющие одну или несколько активностей эритропоэтина, описанных выше, мутеину эритропоэтина. Предпочтительно, если нуклеиновые кислоты согласно изобретению являются нуклеиновыми кислотами человека. Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению включают в себя также описанные выше нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются с нуклеотидными последовательностями,кодирующими мутеин эритропоэтина или рекомбинантный тканезащитный цитокин, описанный выше,и, кроме того, лишенный - или проявляющий уменьшение - по меньшей мере одной эритропоэтической активности, выбранной из группы, состоящей из увеличения гематокрита, вазоактивного действия (вазоконстрикции/вазодилатации), гиперактивации тромбоцитов, прокоагулянтных активностей и увеличения продукции тромбоцитов, цитокин или мутеин, содержащий по меньшей мере одну клеточно-защитную активность в отношении чувствительных клеток, выбранную из группы, состоящей из защиты, поддержания, усиления или восстановления функции или жизнеспособности чувствительных клетки, ткани или органа млекопитающего. Это уменьшение может быть слабым уменьшением или почти отсутствием одной из эритропоэтических активностей. Такие уменьшения могут быть измерены стандартными способами, известными в данной области (Gruber et al., 2002, J. Biol. Chem. 277(81): 27581-27584; Page et al.,1996, Cytokine 8(1): 66-69; Park et al., 1997, Mol. Cells 7(6): 699-704; Wolf et al., 1997, Thromb. Haemost 78: 1505-1509 и Dale et al., 2002, Nature 415:175-179). Анализы на клетках UT-7, описанные в разделе 6.17,являются одним неограничивающим примером способа для измерения уменьшенной или пониженной эритропоэтической активности. Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению содержат также комплементы описанных выше нуклеиновых кислот. Фрагментами нуклеиновых кислот мутеинов эритропоэтина называют последовательности нуклеиновых кислот мутеинов эритропоэтина, описанных выше, которые могут иметь длину по меньшей мере 10, 12, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1050 или более смежных нуклеотидов. Альтернативно, эти фрагменты могут содержать последовательности, которые кодируют по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или более смежных аминокислотных остатков мутеина эритропоэтина. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты мутеина эритропоэтина кодирует генный продукт, обнаруживающий по меньшей мере одну биологическую активность соответствующего мутеина эритропоэтина. Фрагментами молекул нуклеиновых кислот мутеина эритропоэтина могут также называться части кодирующих районов мутеина эритропоэтина, которые кодируют домены мутеина эритропоэтина или зрелый мутеин эритропоэтина. Эритропоэтин, полученный из других организмов, может быть использован для создания мутеинов эритропоэтина согласно изобретению. Что касается клонирования вариантов нуклеиновых кислот мутеина эритропоэтина или рекомбинантного тканезащитного цитокина и гомологов и ортологов из других видов, выделенные молекулы нуклеиновых кислот эритропоэтина, описанные в настоящем описании,могут быть помечены и использованы для скрининга библиотеки кДНК, сконструированной из мРНК,полученной из подходящих клеток или тканей, полученных из представляющего интерес организма. Используемые условия гибридизации должны быть обычно условиями более низкой жесткости, когда эта библиотека кДНК получена из организма, отличающегося от типа организма, из которого была произведена меченная последовательность, и могут быть определены рутинным образом на основе, например,относительного родства организма-мишени и ссылочного организма. Альтернативно, меченный фрагмент может быть использован для скрининга геномной библиотеки,- 20010200 происходящей из представляющего интерес организма, опять с использованием подходящих условий жесткости. Подходящие условия жесткости хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области, как обсуждалось выше, и будут варьироваться в зависимости от конкретных организмов, из которых произведены эта библиотека и меченные последовательности. В отношении руководства, касающегося таких условий, см., например, Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; и Ausubel, et al., 1989-1999, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., которые в настоящее описание в качестве ссылки в их полном виде. В предпочтительном варианте осуществления для получения рекомбинантного тканезащитного цитокина ДНК может быть амплифицирована из геномной или кДНК (т.е. SEQ ID NO:7) путем амплификации при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, сконструированных из известной последовательности родственного или гомологичного рекомбинантного тканезащитного цитокина. ПЦР используют для амплификации желаемой последовательности в ДНК-клоне или геномной библиотеке или библиотеке кДНК, перед отбором. ПЦР может проводиться, например, с использованием термоциклера и полимеразы Taq (Gene Amp). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) используют обычно для получения представляющих интерес генов или фрагментов генов. Например, нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантный тканезащитный цитокин, любой желаемой длины может быть генерирована с использованием ПЦР-праймеров, которые фланкируют нуклеотидную последовательность, кодирующую открытую рамку считывания. Альтернативно, последовательность гена рекомбинантного тканезащитного цитокина может быть расщеплена в подходящих сайтах рестрикционной эндонуклеазой (рестрикционными эндонуклеазами), если такие сайты являются доступными, с высвобождением фрагмента ДНК, кодирующего ген рекомбинантного тканезащитного цитокина. Если удобные сайты рестрикции не являются доступными, они могут быть созданы в подходящих положениях сайт-направленным мутагенезом и/или способами амплификации ДНК, известными в данной области(см., например, Shankarappa et al., 1992, PCR Method Appl. 1: 277-278). Затем ДНК-фрагмент, который кодирует рекомбинантный тканезащитный цитокин, выделяют и лигируют в подходящий экспрессирующий вектор, обращая внимание на то, чтобы была сохранена правильная рамка считывания трансляции. Любой способ мутагенеза, известный в данной области, может быть использован для модификации индивидуальных нуклеотидов в ДНК-последовательности с целью получения аминокислотной замены(аминокислотных замен) в экспрессируемой пептидной последовательности или для создания/делеции сайтов рестрикции для облегчения дополнительных манипуляций. Такие способы включают в себя, но не ограничиваются ими, химический мутагенез, сайт-направленный мутагенез in vitro (Hutchinson et al.,1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), олигонуклеотид-направленный мутагенез (Smith, 1985, Ann. Rev. Genet. 19: 423-463; Hill et al., 1987, Methods Enzymol. 155: 558-568) и, как описано в разделе 6.3, перекрывающееся удлинение на основе ПЦР (Но et al., 1989, Gene 77: 51-59), мегапраймерный мутагенез на основе ПЦР (Sarkar et al., 1990, Biotechniques 8: 404-407) и т.д. Модификации могут быть подтверждены, например, секвенированием двухцепочечной ДНК с использованием дидезоксинуклеотидного способа. Данное изобретение включает в себя также молекулы нуклеиновых кислот, предпочтительно молекулы ДНК, которые являются комплементарными нуклеотидным последовательностям предшествующих абзацев. В некоторых вариантах осуществления, молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению присутствуют в виде части молекул нуклеиновых кислот, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, которые содержат или кодируют гетерологичные (например, вектор, экспрессирующий вектор или слитый белок) последовательности. 5.2. Рекомбинантные тканезащитные цитокины согласно изобретению. Рекомбинантные тканезащитные цитокины согласно изобретению включают в себя мутеины эритропоэтина, которые сохраняют частичную или полную эритропоэтическую активность. Эритропоэтин является гликопротеиновым гормоном, который у человека имеет молекулярную массу приблизительно 34 кДа. Зрелый белок содержит 165 аминокислот (SEQ ID NO:10), а гликозильные остатки составляют приблизительно 40% массы этой молекулы. Формы рекомбинантного тканезащитного цитокина, используемые в применении на практике данного изобретения, включают в себя по меньшей мере одно изменение аминокислоты в природно-встречающихся, синтетических и рекомбинантных формах следующих родственных эритропоэтину человека и других млекопитающих молекул: эритропоэтине, асиалоэритропоэтине, дегликозилированном эритропоэтине, аналогах эритропоэтина, миметиках эритропоэтина,фрагментах эритропоэтина, гибридных молекулах эритропоэтина, связывающих рецептор эритропоэтина молекулах, агонистах эритропоэтина, почечном эритропоэтине, эритропоэтине головного мозга, его олигомерах и мультимерах и представителях того же рода. Такие эквивалентные рекомбинантные тканезащитные цитокины включают в себя мутантные эритропоэтины, которые могут содержать замены, делеции, в том числе внутренние делеции, добавления, в том числе добавления, дающие слитые (гибридные) белки, или консервативные замены аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности и/или смежно с этой аминокислотной последовательностью, но которые приводят к "молчащему" изме- 21010200 нению, заключающемуся в том, что это изменение дает функционально эквивалентный мутеин эритропоэтина или рекомбинантный тканезащитный цитокин. В предпочтительном варианте осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин является неэритропоэтическим, т.е. лишенным эритропоэтической активности или проявляющим уменьшенную эритропоэтическую активность. Консервативные замены аминокислот могут быть произведены на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатического характера участвующих остатков. Например, неполярные (гидрофобные) остатки включают в себя аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; полярные нейтральные аминокислоты включают в себя глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; положительно заряженные (основные) аминокислоты включают в себя аргинин, лизин и гистидин и отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Альтернативно, неконсервативные изменения аминокислот и более крупные инсерции и делеции могут быть использованы для создания функционально измененных рекомбинантных тканезащитных цитокинов. Такие мутанты могут быть использованы для изменения свойств эритропоэтина желаемым образом. Например, в одном варианте осуществления, эритропоэтин, используемый для практики данного изобретения, может быть рекомбинантным тканезащитным цитокином, измененным по одной или нескольким аминокислотам в четырех функциональных доменах эритропоэтина, которые влияют на связывание рецептора: VLQRY (SEQ ID NO:1),и/или TKVNFYAW (SEQ ID NO:2), и/или SGLRSLTTL (SEQ ID NO:3), и/или SNFLRG (SEQ ID NO:4). В другом варианте осуществления могут быть использованы эритропоэтины, содержащие мутации в окружающих участках этой молекулы, которые влияют на кинетику или рецептор связывающие свойства этой молекулы. Определение того, какие изменения или какие положения в этих доменах будут влиять на связывание, могут быть выполнены с использованием стандартных способов. Например, эти домены могут быть изменены парными мутациями аланина (аланин-сканирующий мутагенез), с последующим измерением кинетики связывания мутантов для испытания действия на связывание с рецептором (Bernatet al., 2003, PNAS 100:952-957; Wells et al., 1989, Science 244: 1081-1085). Термин рекомбинантный тканезащитный цитокин, а также некоторый рекомбинантный тканезащитный цитокин может быть использован взаимозаменяемо или связанным образом, для охвата рекомбинантных тканезащитных цитокинов согласно изобретению и их дополнительных модификаций,таких как дегликозилированная, асиалилированная формы рекомбинантного тканезащитного цитокина,или химических модификаций аминокислот. Неограничивающие примеры таких вариантов описаны в публикации Tsuda et al., 1990, Eur. J. Biochem. 188:405-411, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Цитокины являются высокогибкими молекулами, и, в случае гормона роста человека, известно,что гибкость необходима для активации (Wells et al., 1989, Science 244:1081-1085). Таким образом, мутации, которые стабилизируют трехмерную структуру цитокина, предотвращая нормальную активацию рецептора эритропоэтина, включены в данное изобретение. Кроме того, различные системы-хозяева могут быть использованы для экспрессии и продукции рекомбинантных тканезащитных цитокинов, в том числе, но не ограничиваясь ими, системы клеток бактерий, дрожжей, насекомых, растений и млекопитающих, в том числе человека. Например, рекомбинантный эритропоэтин, продуцируемый в бактериях,которые не гликозилируют, асиалилируют или частично гликозилируют этот продукт, мог бы использоваться для получения негликозилированных форм рекомбинантного тканезащитного цитокина, или он может быть дополнительно гликозилирован с использованием известных в данной области способов,таких как, но не только, способы, описанные в заявках на патент США с номерами US 2003/0040037 A1 иUS 2003/0003529, для применения фукозилирования для коррекции гликозилирования белков. Альтернативно, рекомбинантный тканезащитный цитокин может быть получен в других системах, способных гликозилировать экспрессируемые белки, например, в растениях, а также в клетках человека. Как отмечалось выше, данное изобретение включает в себя любые и все модуляторные молекулы активности рецептора эритропоэтина, способные проявлять положительную активность на чувствительных клетках, независимо от любого структурного родства этой молекулы с эритропоэтином. Кроме того, рекомбинантный тканезащитный цитокин может быть модифицирован для подгонки его активностей для конкретной ткани или конкретных тканей. Несколько неограничивающих стратегий,которые могут проводиться для получения этой желаемой тканеспецифичности, включают в себя модификации, которые укорачивают полупериод жизни в кровотоке, и, следовательно, уменьшают время, в течение которого рекомбинантный тканезащитный цитокин может взаимодействовать с эритроидными предшественниками, или модификацию первичной структуры молекулы мутеина эритропоэтина или рекомбинантного тканезащитного цитокина. Одним подходом к уменьшению полупериода жизни в кровотоке является удаление или модификация групп гликозилирования, из которых эритропоэтин имеет триN-связанные и одну О-связанную. Такие варианты гликозилированного рекомбинантного тканезащитного цитокина могут быть получены рядом способов. Например, имеется несметное количество способов модификации первичной структуры эритропоэтина для получения тканезащитных цитокинов данного изобретения, и они включают в себя замену одной или нескольких конкретных аминокислот, т.е. мутацию аминокислот в сайтах N-связанного или О-связанного гликозилирования и/или химическую модификацию одной или нескольких аминокислот или добавление других структур, которые препятствуют- 22010200 взаимодействию эритропоэтина с любым из его рецепторов. Применение таких форм рекомбинантных тканезащитных цитокинов полностью включено в данное изобретение. Сиаловые кислоты, которые находятся на конце сахарных цепей, могут быть удалены специфическими сиалидазами в зависимости от химической связи, соединяющей конкретную сиаловую кислоту с этой сахарной цепью. Альтернативно,гликозилированная структура может быть демонтирована различными путями с использованием других ферментов, которые расщепляют при специфических связях. В предпочтительном варианте осуществления, полупериод существования в кровотоке неэритропоэтического рекомбинантного тканезащитного цитокина данного изобретения уменьшают на приблизительно 90% в сравнении с полупериодом существования в кровотоке природного эритропоэтина. Некоторые из этих молекул рекомбинантных тканезащитных цитокинов будут тем не менее имитировать действия самого эритропоэтина в других тканях или органах. Например, 17-мер, содержащий аминокислотную последовательность 31-47 природного эритропоэтина, является неактивным в отношении эритропоэза, но полностью активным в отношении нервных клеток in vitro (CampanaO'Brien,1998: Int. J. Mol. Med. 1:235-41). Кроме того, молекулы производного рекомбинантного тканезащитного цитокина, желательные для описанных в настоящем описании применений, могут быть генерированы гуанидинированием, амидинированием, карбамилированием (карбамоилированием), тринитрофенилированием, ацилированием, таким как ацетилирование, или сукцинилированием, нитрованием или модификацией остатков аргинина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, лизина, тирозина, триптофана или цистеина или карбоксильных групп, среди других процедур, таких как ограниченный протеолиз, удаление аминогрупп и/или мутационная замена остатков аргинина, лизина, тирозина, триптофана или цистеина молекулярнобиологическими способами, с получением мутеинов эритропоэтина или рекомбинантных тканезащитных цитокинов, которые сохраняют достаточный уровень активностей в отношении специфических органов и тканей, но не в отношении других, таких как эритроциты (например, публикация Satake et al., 1990, Biochim. Biophys. Acta 1038:125-9, включенная в настоящее описание в качестве ссылки в ее полном объеме). Одним неограничивающим примером, описанным ниже, является модификация остатков аргинина эритропоэтина глиоксалем, например, фенилглиоксалем (в соответствии с протоколом Takahashi, 1977, J.Biochem. 81:395-402). Как будет видно ниже, такая молекула рекомбинантного тканезащитного цитокина полностью сохраняет нейротрофическое действие эритропоэтина. Такие молекулы рекомбинантных тканезащитных цитокинов полностью включены для различных применений и композиций, описанных в настоящем описании. Кроме того, эти химические модификации могут быть дополнительно использованы для усиления защитных действий рекомбинантных тканезащитных цитокинов или нейтрализации любых изменений в заряде молекулы, происходящих из мутации аминокислоты природного эритропоэтина. Такие модификации описаны в ожидающих одновременного рассмотрения заявках с регистрационным номером PCT/US01/49479, поданной 28 декабря 2001 г.; с регистрационным номером 09/753132,поданной 29 декабря 2000 г. и кратком изложении поверенногоKW00-009C02-US, поданном 3 июля 2002 г., все из которых включены в данное описание в полном объеме. Синтетические и рекомбинантные молекулы, такие как эритропоэтин головного мозга и эритропоэтин почки, рекомбинантные формы эритропоэтина млекопитающих, а также его природновстречающиеся, происходящие из опухолей и рекомбинантные изоформы, такие как рекомбинантно экспрессируемые молекулы и молекулы, полученные гомологичной рекомбинацией, обеспечены в настоящем описании. Кроме того, данное изобретение включает в себя молекулы, в том числе пептиды, которые связывают рецептор эритропоэтина, а также рекомбинантные конструкции или другие молекулы,которые имеют часть или все структурные и/или биологические свойства эритропоэтина, в том числе фрагменты и мультимеры эритропоэтина или его фрагментов. Мутеины эритропоэтина или другие рекомбинантные тканезащитные цитокины, которые имеют дополнительные или уменьшенные сайты гликозилирования, включены в данное изобретение. Как отмечалось выше, термины "эритропоэтин" и "миметики", а также другие термины используются в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения защищающих и усиливающих чувствительные клетки молекул, родственных эритропоэтину, а также молекул, которые способны преодолевать барьеры эндотелиальных клеток. Кроме того, в данное изобретение включены молекулы, продуцируемые трансгенными животными. Следует отметить, что молекулы эритропоэтина, включенные в данное изобретение, необязательно подобны эритропоэтину структурно или любым другим образом, за исключением способности взаимодействовать с рецептором эритропоэтина или модулировать активность рецептора эритропоэтина или активировать активируемые эритропоэтином каскады передачи сигнала, как описано в настоящем описании. В качестве неограничивающих примеров, формы рекомбинантных тканезащитных цитокинов, применимые для применения на практике данного изобретения, включают в себя рекомбинантные тканезащитные цитокины, например, с измененными аминокислотами на карбоксиконце, описанные в патенте США 5457089 и в патенте США 4835260; изоформы асиалоэритропоэтина и эритропоэтина с различными количествами остатков сиаловых кислот на молекулу, такие как описанные в патенте США 5856298; полипептиды, описанные в патенте США 47030088; агонисты, описанные в патенте США 5767078; пептиды, которые связываются с рецептором эритропоэтина, описанные в патентах США 5773569 и- 23010200 5830851; миметики с небольшой молекулой, которые активируют рецептор эритропоэтина, описанные в патенте США 5835382; и аналоги эритропоэтина, описанные в WO 9505465, WO 9718318 и WO 9818926. Все из вышеуказанных ссылок включены в настоящее описание в той степени, что такие описания относятся к различным альтернативным формам или способам получения таких форм рекомбинантных тканезащитных цитокинов данного изобретения. Эритропоэтин может быть получен коммерческим путем, например, под товарными названиямиOaks, CA. Активность (в единицах) эритропоэтина (ЕРО) и эритропоэтин-подобных молекул определяют традиционно на основе его эффективности в стимуляции образования эритроцитов в моделях грызунов (и при получении с использованием международных стандартов эритропоэтина). Одна единица (Е) обычного эритропоэтина (MW (молекулярная масса) 30000-43000) равна 8 нг белка (1 мг белка равен приблизительно 125000 Е). Однако поскольку действие на эритропоэз является несущественным для желаемых в настоящем описании активностей и может, наверно, необязательно быть детектируемым свойством рекомбинантных тканезащитных цитокинов данного изобретения, определение активности на основе эритропоэза является неподходящим. Таким образом, в применении в настоящем описании, единица активности эритропоэтина или эритропоэтин-родственных молекул определяется как количество белка,требующееся для вызывания такой же активности в системах нервных клеток или других чувствительных клеток, какая вызывается эритропоэтином, соответствующим Международному стандарту Всемирной организации здравоохранения (WHO), в той же самой системе. Специалист с квалификацией в данной области легко определит единицы неэритропоэтического рекомбинантного тканезащитного цитокина или родственной молекулы, используя приведенные в настоящем описании рекомендации. Мутеины рекомбинантных тканезащитных цитокинов включают в себя, но не ограничиваются ими,белки и полипептиды, кодируемые нуклеиновыми последовательностями эритропоэтина, описанными в разделе 6.3. Данное изобретение включает в себя мутеины, которые являются функционально эквивалентными продукту гена эритропоэтина, описанному в разделе 6.3. Такие продукты гена эритропоэтина могут содержать одну или несколько делеций, добавлений или замен аминокислотных остатков эритропоэтина в аминокислотной последовательности, кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты эритропоэтина, которые, однако, приводят к молчащему изменению, давая, следовательно, функционально эквивалентный продукт гена эритропоэтина. Аминокислотные замены могут быть произведены на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатического характера участвующих остатков. Мутеины рекомбинантных тканезащитных цитокинов согласно изобретению могут быть получены путем мутагенеза, например, путем дискретной точковой мутации или укорочения. Мутеин рекомбинантного тканезащитного цитокина согласно изобретению сохраняет клеточно-защитные биологические активности природно-встречающейся формы, но может быть лишен одной или нескольких активностей природно-встречающейся формы этого белка. Таким образом, биологические действия могут быть индуцированы добавлением мутеина с ограниченной функцией. Модификация структуры рекомбинантных тканезащитных цитокинов может быть произведена для таких целей, как усиление эффективности, стабильности или посттрансляционных модификаций (например, для изменения картины фосфорилирования этих мутеинов). Такие модифицированные мутеины рекомбинантных тканезащитных цитокинов, при конструировании для сохранения по меньшей мере одной клеточно-защитной активности природно-встречающейся формы этого белка или для получения его специфических антагонистов, считаются функциональными эквивалентами мутеинов рекомбинантных тканезащитных цитокинов. Такие модифицированные мутеины рекомбинантных тканезащитных цитокинов могут быть получены, например, заменой, делецией или добавлением аминокислот. Например, резонно ожидать, что отдельная замена лейцина изолейцином или валином, аспартата глутаматом, треонина серином или подобная замена аминокислоты структурно родственной аминокислотой (т.е. изостерические и/или изоэлектрические мутации) не будут оказывать большого влияния на биологическую активность полученной молекулы. Приводит ли изменение аминокислотной последовательности мутеина рекомбинантного тканезащитного цитокина к функциональному гомологу или нефункциональному гомологу (т.е. лишенному одной или нескольких активностей немутированного цитокина), может быть легко определено путем оценки способности этого вариантного мутеина вызывать реакцию в клетках таким же образом, как это осуществляется цитокином дикого типа, или конкурентно ингибировать такую реакцию. Мутеины согласно изобретению, проявляющие измененную функцию, могут быть идентифицированы путем скрининга комбинаторных библиотек мутантов, например, мутантов укорочения, рекомбинантного тканезащитного цитокина согласно изобретению на желаемую активность или ее отсутствие. В одном варианте осуществления смешанная библиотека вариантов создается при помощи комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновых кислот и кодируется библиотекой смешанных генов. Смешанная библиотека вариантов может быть получена, например, ферментативным лигированием смеси синтетических олигонуклеотидов в последовательности нуклеиновых кислот, так что вырожденный набор по- 24010200 тенциальных белковых последовательностей может экспрессироваться в виде индивидуальных полипептидов, или альтернативно, в виде набора более крупных слитых белков (например, для фагового дисплея). Имеются различные способы, которые могут быть использованы для получения библиотек потенциальных вариантов рекомбинантных тканезащитных цитокинов согласно изобретению из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Способы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в данной области (см., например, Narang, 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura et al., 1984, Annu, Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., 1984, Science 198:1056; Ike et al., 1983, Nucleic Acid Res. 11:477). Кроме того, библиотеки фрагментов кодирующей последовательности рекомбинантных тканезащитных цитокинов согласно изобретению могут быть использованы для генерирования смешанной популяции рекомбинантных тканезащитных цитокинов для скрининга и последующего отбора мутеинов. Например, библиотека фрагментов кодирующей последовательности может быть генерирована путем обработки двухцепочечного ПЦР-фрагмента представляющей интерес кодирующей последовательности нуклеазой в условиях, в которых разрывание происходит только приблизительно один раз на молекулу,денатурацией двухцепочечной ДНК, ренатурацией этой ДНК для образования двухцепочечной ДНК,которая может включать в себя смысловые/антисмысловые пары из различных разорванных продуктов,удалением одноцепочечных участков из повторно образованных дуплексов обработкой нуклеазой S1 и лигированием полученной библиотеки фрагментов в экспрессирующий вектор. Этим способом может быть получена экспрессионная библиотека, которая кодирует N-концевые и внутренние фрагменты различных размеров представляющих интерес рекомбинантных тканезащитных цитокинов. В данной области известны несколько способов скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, полученных точковыми мутациями или укорочением, и скрининга кДНК-библиотек на генные продукты, имеющие выбранное свойство. Наиболее широко применимые способы, которые пригодны для высокопроизводительного анализа, для скрининга больших библиотек генов обычно включают в себя клонирование данной библиотеки генов в реплицируемые экспрессионные векторы, трансформацию подходящих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессию этих комбинаторных генов в условиях, в которых детектирование желаемой активности способствует выделению вектора, кодирующего ген, продукт которого был детектирован. Мутагенез с повторяющейся сборкой (REM), способ, который ускоряет частоту возникновения функциональных мутантов в этих библиотеках, может быть использован в комбинации с анализами-скринингами для идентификации мутеинов рекомбинантного тканезащитного цитокина данного изобретения (Arkin and Yourvan, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:78117815; Delgrave et al., 1993, Protein Engineering 6(3):327-331). Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутеин, может быть создана введением одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений или делеций в нуклеотидную последовательность эритропоэтина, так что одна или несколько замен, добавлений или делеций вводятся в кодируемый рекомбинантный тканезащитный цитокин. Мутации могут вводиться стандартными способами, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Вкратце, конструируют ПЦРпраймеры, которые делетируют трехнуклеотидный кодон подлежащей изменению аминокислоты и заменяют его трехнуклеотидным кодоном подлежащей включению аминокислоты. Этот праймер используют в ПЦР-амплификации ДНК, кодирующей представляющий интерес рекомбинантный тканезащитный цитокин. Затем этот фрагмент выделяют и встраивают в полноразмерную кДНК, кодирующую представляющий интерес рекомбинантный тканезащитный цитокин и экспрессируют рекомбинантно. Теперь этот рекомбинантный тканезащитный цитокин включает в себя эту замену аминокислоты. Консервативные или неконсервативные замены аминокислот могут быть произведены по одному или нескольким аминокислотным остаткам. Могут быть произведены как консервативные, так и неконсервативные замены. Консервативными являются замены, которые имеют место в семействе аминокислот, которые являются близкими по их боковым цепям. Генетически кодируемые аминокислоты могут быть разделены на четыре семейства: (1) кислые = аспартат, глутамат; (2) основные = лизин, аргинин,гистидин; (3) неполярные = аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные = глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Подобным образом, спектр аминокислот может быть сгруппирован как (1) кислые = аспартат, глутамат;(2) основные = лизин, аргинин, гистидин; (3) алифатические = глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин,серин, треонин, причем серин и треонин необязательно могут находиться в отдельной группе как алифатические-гидроксилсодержащие; (4) ароматические = фенилаланин, тирозин, триптофан; (5) амиды = аспарагин, глутамин; и (6) серосодержащие = цистеин и метионин. (См., например, Biochemistry, 4th ed.,Ed. by L. Stryer, WH Freeman and Co.; 1995). Альтернативно, мутации могут быть введены случайным образом вдоль всей или части кодирующей последовательности рекомбинантного тканезащитного цитокина, например, насыщающим мутагенезом, и полученные мутанты могут быть подвергнуты скринингу на биологическую активность для идентификации мутантов, которые сохраняют активность. После мутагенеза кодируемый белок может быть экспрессирован рекомбинантно и может быть определена активность рекомбинантного тканезащитного цитокина. Дополнительно к вышеупомянутым модификациям эритропоэтина, применимым в настоящем опи- 25010200 сании, следующее обсуждение распространяется на различные рекомбинантные тканезащитные цитокины согласно изобретению. Как описано в Elliott et al., Boissel et al., и Wen et al., упоминаемых выше, следующие мутеины эритропоэтина применимы для описанных в настоящем описании целей и могут быть обеспечены в фармацевтической композиции для описанных в настоящем описании способов. В используемой здесь номенклатуре мутеинов, измененная аминокислота изображается однобуквенным кодом природных аминокислот первой, затем указывается ее положение в молекуле эритропоэтина и затем следует однобуквенный код аминокислоты-замены. Например, эритропоэтин S100E человека или рекомбинантный тканезащитный цитокин S100E означает молекулу эритропоэтина человека, в которой в положении аминокислоты 100 зрелого эритропоэтина серин изменен на глутаминовую кислоту. Такие мутанты, применимые для использования на практике данного изобретения, включают в себя не ограничиваясь ими, эритропоэтин человека по меньшей мере с одним из следующих изменений аминокислот: В предпочтительных вариантах осуществления мутеин эритропоэтина или рекомбинантный тканезащитный цитокин данного изобретения содержит одну или несколько из приведенных выше замен. В других вариантах осуществления мутеин эритропоэтина или рекомбинантный тканезащитный цитокин данного изобретения содержит одну или несколько из приведенных выше замен или их комбинацию. В альтернативном варианте осуществления рекомбинантные тканезащитные цитокины, фармацевтические композиции, применение и способы лечения данного изобретения включают в себя одну или несколько приведенных выше замен, при условии, что они не содержат одну или несколько из следующих замен: I6A, С 7 А, K20 А, Р 42 А, D43A, K45D, K45 А, F48A, Y49A, K52 А, K49 А, S100E, R103A,K116 А, Т 132 А, I133A, K140 А, N147K, N147A, R150A, R150E, G151A, K152 А, K154 А, G158A, С 161 А илиR162A. В родственном варианте осуществления данного изобретения рекомбинантные тканезащитные цитокины, фармацевтические композиции, применение и способы лечения согласно изобретению вклю- 26010200 чают в себя одну или несколько приведенных выше замен, при условии, что они не содержат любую из следующих комбинаций замен: N24K/N38K/N83K или A30N/H32T. В некоторых вариантах осуществления, более чем одно изменение аминокислоты, может комбинироваться для образования мутеина. Примеры таких комбинаций включают в себя, не ограничиваясь ими,K45D/S100E,A30N/H32T,K45D/R150E,R103E/L108S,K140 А/K52 А,K140 А/K52 А/K45 А,K97 А/K152 А,K97 А/K152 А/K45 А,K97A/K152A/K45A/R52A,K97 А/K152 А/K45 А/K52 А/K140 А,K97 А/K152 А/K45 А/K52 А/K140 А/K154 А, N24K/N38K/N83K и N24K/Y15A. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин данного изобретения не содержит одной или нескольких из вышеуказанных множественных замен. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции данного изобретения, содержащие рекомбинантный тканезащитный цитокин данного изобретения, не содержат одной или нескольких из вышеуказанных множественных замен. В некоторых вариантах применение и способы лечения данного изобретения, которые используют мутеин рекомбинантного тканезащитного цитокина данного изобретения, не содержат одной или нескольких из вышеуказанных множественных замен. Некоторые модификации или комбинации модификаций могут придавать гибкость мутеинам эритропоэтина, действуя на связывание с рецептором, таким как рецептор эритропоэтина или вторичный рецептор, с которым связывается эритропоэтин или мутеин эритропоэтина. Примеры таких модификаций или их комбинаций, применимых в композициях и способах данного изобретения, включают в себя,но не ограничиваются ими, K152W, R14A/Y15A, I6A, С 7 А, D43A, Р 42 А, F48A, Y49A, Т 132 А, I133A,Т 134 А, N147A, F148A, R150A, G151A, G158A, С 161 А и R162A. Известно, что соответствующие мутации являются вредными в гормоне роста человека (Wells etal.). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин данного изобретения не содержит одной или нескольких из вышеуказанных замен. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции согласно изобретению, содержащие рекомбинантный тканезащитный цитокин согласно изобретению, не содержат одной или более из вышеуказанных замен. В некоторых вариантах осуществления применение и способы лечения согласно изобретению, в которых используют мутеин рекомбинантного тканезащитного цитокина согласно изобретению, не содержат одной или более из вышеуказанных замен. Кроме одной из предыдущих модификаций аминокислот, рекомбинантный тканезащитный цитокин согласно изобретению может также не иметь остатков сиаловых кислот и называется в этом случае мутеином асиалоэритропоэтина. Предпочтительно, мутеин асиалоэритропоэтина согласно изобретению является асиалоэритропоэтином человека. В альтернативных вариантах осуществления рекомбинантный тканезащитный цитокин согласно изобретению может иметь по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12 или 13 остатков сиаловых кислот. Он может быть получен путем десиалилирования рекомбинантного тканезащитного цитокина с использованием сиалидазы, как описано в упаковке изготовителя для Сиалидазы А из ProZyme Inc., San Leandro, California. Обычно используют PROZYME GLYCOPROsequencinggrade SIALYDASE A (N-ацетилнейраминатгликогидролазу, EC 3.2.1.18) для отщепления всех невосстанавливающих концевых остатков сиаловых кислот из комплексных углеводов и гликопротеинов, таких как эритропоэтин. Она будет также отщеплять разветвленные сиаловые кислоты (связанные с внутренним остатком). Сиалидаза А выделена из клона Arthrobacter ureafaciens. Неограничивающий пример сиалилирования гликопептида обнаружен в заявке на патент СШАUS 2003/0040037, которая описывает способы сиалилирования с использованием сиалилтрансфераз млекопитающих и бактерий. Другой неограничивающий пример способов сиалилирования и изменения картин сиалилирования на гликопротеинах обнаружен в заявке на патент СШАUS 2002/0160460 А 1 и в US 6399336 В 1. В них описаны способы in vitro сиалилирования рекомбинантных гликопротеинов, где донорную часть сиаловой кислоты соединяют с гликопротеином, имеющим галактозную или Nацетилгалактозаминовую акцепторную часть. В таких способах сиалилтрансфераза, объединенная с акцептором и донором, присоединяла сиаловую кислоту к сахариду. Рекомбинантный тканезащитный цитокин данного изобретения может иметь, по меньшей мере,уменьшенное количество N-связанных углеводов. Для удаления N-связанных углеводов рекомбинантный тканезащитный цитокин может быть обработан гидразином, например, в соответствии со способами, описанными Hermentin et al., 1996, Glycobiology 6(2):217-30. Как отмечалось выше, эритропоэтин имеет три N-связанных углеводных остатка; данное изобретение включает в себя эритропоэтины с двумя, одним N-связанными углеводами и без N-связанного углевода. Рекомбинантный тканезащитный цитокин данного изобретения может иметь, по меньшей мере,уменьшенное содержание углеводов вследствие обработки рекомбинантного тканезащитного цитокина по меньшей мере одной гликозидазой. Например, может быть использована процедура Chen and Evangelista, 1998, Electrophoresis 19(15):2639-44. Кроме того, удаление О-связанного углевода может быть достигнуто следующими способами, описанными в Hokke et al., 1995, Eur. J. Biochem. 228(3):981-1008. Углеводная часть молекулы рекомбинантного тканезащитного цитокина может иметь, по меньшей мере, картину гликозилирования не млекопитающего вследствие экспрессии рекомбинантного тканеза- 27010200 щитного цитокина в клетках не млекопитающих. Предпочтительно, рекомбинантные тканезащитные цитокины данного изобретения экспрессируются в клетках насекомых или растений. В качестве неограничивающего примера, экспрессия рекомбинантного тканезащитного цитокина в клетках насекомого с использованием бакуловирусной системы экспрессии может проводиться в соответствии с Quelle et al., 1989, Blood 74 (2):652-657. Другой способ описан в патенте США 5637477. Экспрессия в растительной системе может проводиться с использованием способа Matsumoto et al., 1993, Biosci. Biotech. Biochem. 57(8):1249-1252. Альтернативно, экспрессия в бактериях будет приводить к негликозилированным формам рекомбинантного тканезащитного цитокина. Это лишь примеры способов, применимых для получения рекомбинантного тканезащитного цитокина данного изобретения, и они никоим образом не являются ограничивающими. Неограничивающим примером модификации картины гликозилирования является фукозилирование, описанное в заявке на патент СШАUS 2003/0040037 A1 и в заявке на патент СШАUS 2003/0003529 A1. В них описаны способы модификации картины гликозилирования гликопептидом контактированием гликопептида, имеющего акцепторную часть для фукотрансферазы, с реакционной смесью, имеющей фукозную донорную часть, для модификации картины гликозилирования с использованием рекомбинантного гликопептида. Рекомбинантный тканезащитный цитокин согласно изобретению может иметь по меньшей мере один или несколько углеводов, которые могут быть также химически восстановленными. Например, рекомбинантный тканезащитный цитокин может быть окисленным периодатом мутеином эритропоэтина; этот окисленный периодатом мутеин эритропоэтина может быть также химически восстановлен боргидридной солью в виде боргидрида натрия или цианоборгидрида натрия. Периодатное окисление мутеина эритропоэтина может проводиться, например, способами, описанными Linsley et al., 1994, Anal. Biochem. 219 (2):207-17. Химическое восстановление после окисления периодатом может проводиться способамиTonelli and Meints, 1978, J. Supramol. Struct. 8(1):67-78. Следует отметить, что некоторые вышеупомянутые и следующие модификации аминокислот относительно природного эритропоэтина могут быть невозможными, так как конкретная аминокислотамишень для химической модификации в природной молекуле была изменена с образованием рекомбинантного тканезащитного цитокина согласно изобретению. Конечно, эта измененная аминокислота может быть предметом химической модификации сама по себе, и данное изобретение включает в себя все такие молекулы. Специалист с квалификацией в данной области легко определит доступные аминокислотные остатки рекомбинантного тканезащитного цитокина данного изобретения и доступную (доступные) в отношении этих остатков модификацию (модификации). Рекомбинантный тканезащитный цитокин для вышеуказанных применений может иметь по меньшей мере один или несколько модифицированных остатков аргинина. Например, рекомбинантный тканезащитный цитокин может содержать R-глиоксальную часть на одном или нескольких остатках аргинина, где R может быть арилом, гетероарилом, низшим алкилом, низшим алкокси или циклоалкильной группой или альфа-дезоксиглицитолильной группой. В применении в настоящем описании термин низший алкил обозначает имеющую прямую или разветвленную цепь насыщенную алифатическую углеводородную группу, предпочтительно содержащую 1-6 атомов углерода. Представителем таких групп являются метил, этил, изопропил, изобутил, бутил, пентил, гексил и т.п. Термин алкокси обозначает низшую алкильную группу, определенную выше, присоединенную к остатку молекулы кислорода. Примеры алкокси включают в себя метокси, этокси, пропокси, изопропокси и т.п. Термин циклоалкил обозначает циклические алкильные группы с 3-8 атомами углерода, в том числе, например, циклопропил,циклобутил, циклогексил и т.п. Термин арил обозначает фенильную и нафтильную группы. Термин гетероарил обозначает гетероциклические группы, содержащие 4-10 членов кольца и 1-3 гетероатома, выбранных из группы, состоящей из кислорода, азота и серы. Примеры включают в себя, но не ограничиваются ими, изоксазолил, фенилизоксазолил, фурил, пиримидинил, хинолил, тетрагидрохинолил, пиридил, имидазолил, пирролидинил, 1,2,4-триазолил, тиазолил, тиенил и т.п. Группа R может быть замещенной, например, 2,3,4-тригидроксибутильной группой 3-дезоксиглюкозона. Типичные примеры Rглиоксальных соединений являются глиоксаль, метилглиоксаль, 3-дезоксиглюкозон и фенилглиоксаль. Предпочтительными R-глиоксальными соединениями являются метилглиоксаль или фенилглиоксаль. Пример способа для такой модификации может быть найден в Werber et al., 1975, Isr. J. Med. Sci. 11(11): 1169-70, в котором используют фенилглиоксаль. В следующем примере осуществления по меньшей мере один остаток аргинина может быть модифицирован реакцией с вицинальным дикетоном, таким как 2,3-бутандион или циклогександион, предпочтительно в приблизительно 50 миллимолярном боратном буфере при pH 8-9. Процедура для последней модификации с 2,3-бутандионом может выполняться в соответствии с Riordan, 1973, Biochemistry 12(20): 3915-3923; а процедура с циклогексаноном в соответствии с Patthy et al., 1975, J. Biol. Chem. 250(2):565-9. Рекомбинантный тканезащитный цитокин данного изобретения может содержать по меньшей мере один или несколько модифицированных остатков лизина или модификацию N-концевой аминогруппы- 28010200 молекулы эритропоэтина, причем такие модификации происходят из реакции остатка лизина с модифицирующим аминогруппу агентом. В другом варианте осуществления остатки лизина могут быть модифицированы реакцией с производными глиоксаля, например, реакцией с глиоксалем, метилглиоксалем и 3-дезоксиглюкозоном с образованием альфа-карбоксиалкильных производных. Примерами являются реакция с глиоксалем с образованием карбоксиметиллизина, как описано в Glomb and Monnier, 1995, J.Biol. Chem. 270(17):10017-26, или с метилглиоксалем с образованием (1-карбоксиэтил)лизина, как описано в Degenhardt et al., 1998, Cell. Mol. Biol. (Nousy-le-grand) 44 (7): 1139-45. Модифицированный остаток лизина может быть дополнительно химически восстановлен. Например, рекомбинантный тканезащитный цитокин может быть биотинилирован через группы лизина, когда N-гидроксисукцинимидный эфир D-биотиноиламинокапроновой кислоты взаимодействует с эритропоэтином с последующим удалением непрореагировавшего биотина гель-фильтрацией на колонке Centricon 10, как описано Wojchowski and Caslake, 1989, Blood 74(3):952-8. В этой статье авторы используют три различных способа биотинилирования эритропоэтина, любой из которых может быть использован для получения эритропоэтинов для применений в настоящем описании. Биотин может присоединяться (1) к остатку сиаловой кислоты, (2) карбоксилатным группам или (3) аминогруппам. В другом предпочтительном варианте осуществления лизин может реагировать с альдегидом или редуцирующим сахаром, с образованием имина, который может быть стабилизирован восстановлением,например, цианоборгидридом натрия с образованием N-алкилированного лизина, такого как глюцитолиллизин, или который в случае редуцирующих сахаров может быть стабилизирован перегруппировкой Амадори или Хайнса с образованием альфа-дезокси-альфа-аминосахара, такого как альфа-дезокси-альфафруктозиллизин. В качестве примера, получение модифицированного фруктозиллизином белка путем инкубирования с 0,5 М глюкозой в натрий-фосфатном буфере при pH 7,4 в течение 60 дней описано Makita et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:5133-5138. В другом примере группа лизина может быть карбамилирована, например, вследствие реакции с цианатным ионом или алкил- или арилкарбамилирована или тиокарбамилирована алкил- или арилизоцианатом или изотиоцианатом, или она может быть ацилирована реакционноспособным производным алкил- или арилкарбоновой кислоты, например, реакцией с уксусным ангидридом или янтарным ангидридом или фталевым ангидридом. Примерами являются модификация групп лизина 4-сульфофенилизотиоцианатом или уксусным ангидридом, в обоих случаях описанная в Gao et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(25):12027-30. Группы лизина могут быть также модифицированы тринитрофенилом реакцией с тринитрофенилбензолсульфоновой кислотой или предпочтительно ее солями. По меньшей мере один остаток тирозина рекомбинантного тканезащитного цитокина может быть модифицирован в положении остатка ароматического кольца электрофильным реагентом, например,нитрованием или иодинированием. В качестве неограничивающего примера, эритропоэтин может взаимодействовать с тетранитрометаном (Nestler et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(12):7316-21); или быть иодинирован, как описано в примере 4. По меньшей мере один остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты рекомбинантного тканезащитного цитокина может быть модифицирован, например, в результате реакции с карбодиимидом, с последующей реакцией с амином, таким как глицинамид, но не только с ним. В другом примере остаток триптофана рекомбинантного тканезащитного цитокина может быть модифицирован, например, в результате реакции с н-бромсукцинимидом или н-хлорсукцинимидом в соответствии со способами, описанными в Josse et al., Chem Biol Interact 1999 May 14; 119-120. Еще в одном примере рекомбинантный тканезащитный цитокин может быть получен путем удаления по меньшей мере одной аминогруппы, что может быть достигнуто в результате реакции с нингидрином, с последующим восстановлением последующей карбонильной группы в результате реакции с боргидридом. Еще в одном примере обеспечен рекомбинантный тканезащитный цитокин, который имеет по меньшей мере один разрыв по меньшей мере одной из цистеиновых связей в молекуле эритропоэтина в результате реакции с восстанавливающим агентом, таким как дитиотреитол, с последующей реакцией последующих сульфгидрилов с иодацетамидом, иодуксусной кислотой или другим электрофилом для предотвращения повторного образования дисульфидных связей. Как отмечалось выше, альтернативно или в комбинации, дисульфидные связи могут быть элиминированы изменением молекулы цистеина,которая участвует в этой фактической мостиковой связи, или по меньшей мере одной другой аминокислоты, что приводит к неспособности мутеина эритропоэтина к образованию по меньшей мере одной дисульфидной связи, присутствующей в природной молекуле. Рекомбинантный тканезащитный цитокин может быть получен подверганием эритропоэтина ограниченному химическому протеолизу, который нацелен на специфические остатки, например, для расщепления после остатков триптофана. Такие полученные фрагменты рекомбинантного тканезащитного цитокина включены в данное изобретение. Как отмечалось выше, рекомбинантный тканезащитный цитокин, применимый для целей данного изобретения, может иметь по меньшей мере одну из вышеупомянутых модификаций. В качестве примера рекомбинантного тканезащитного цитокина с одной модификацией относительно углеводной части этой- 29010200 молекулы и одной модификацией относительно аминокислотной части, рекомбинантный тканезащитный цитокин может быть асиалоэритропоэтином и иметь его остаток лизина в положении остатка 45, замененный аспарагиновой кислотой. Таким образом, в данное изобретение включены различные молекулы рекомбинантных тканезащитных цитокинов и фармацевтические композиции, содержащие их, для описанных в настоящем описании применений. Как упоминалось выше, такие молекулы эритропоэтина включают в себя, но не ограничиваются ими, мутеины, которые являются дополнительно асиалоэритропоэтином, N-дегликозилированным эритропоэтином, O-дегликозилированным эритропоэтином, эритропоэтином с уменьшенным содержанием углеводов и измененными картинами гликозилирования, эритропоэтином с углеводами,окисленными и затем восстановленными, модифицированным арилглиоксалем эритропоэтином, модифицированным алкилглиоксалем эритропоэтином, модифицированным 2,3-бутандионом эритропоэтином, модифицированным циклогександионом эритропоэтином, биотинилированным эритропоэтином, Nалкилированным лизил-эритропоэтином, глюцитолиллизин-эритропоэтином, альфа-дезокси-альфафруктозиллизин-эритропоэтином, карбамилированным эритропоэтином, ацетилированным эритропоэтином, сукцинилированным эритропоэтином, альфа-карбоксиалкилэритропоэтином, нитрованным эритропоэтином, иодинированным эритропоэтином, в качестве некоторых репрезентативных неограничивающих примеров, на основе приведенных в настоящем описании описаний. Предпочтительными являются вышеупомянутые модифицированные формы на основе эритропоэтина человека. Кроме того, данное изобретение включает в себя вышеупомянутые рекомбинантные тканезащитные цитокины и фармацевтические композиции, содержащие такие соединения. В качестве неограничивающего примера, такие рекомбинантные тканезащитные цитокины включают в себя окисленный периодатом мутеин эритропоэтина, мутеин глюцитолиллизин-эритропоэтина, мутеин фруктозиллизинэритропоэтина, мутеин 3-дезоксиглюкозон-эритропоэтина и мутеин карбамилированного асиалоэритропоэтина. 5.3. Системы экспрессии. Различные системы хозяин - экспрессирующий вектор могут быть использованы для получения рекомбинантных тканезащитных цитокинов, в том числе молекул мутеинов эритропоэтина данного изобретения. Такие системы хозяин-система экспрессии представляют векторы, при помощи которых представляющие интерес рекомбинантные тканезащитные цитокины могут быть получены и затем очищены,но также представляют клетки, которые при трансформации или трансфекции подходящими нуклеотидными кодирующими последовательностями обнаруживают модифицированный продукт гена эритропоэтина in situ. Они включают в себя, но не ограничиваются ими, системы-хозяева бактерий, насекомых,растений, млекопитающих, в том числе человека, такие как, но не только, системы клеток насекомых,инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом), содержащими последовательности, кодирующие продукт в виде рекомбинантного тканезащитного цитокина; системы клеток растений, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаичной болезни цветной капусты, CaMV; вирусом мозаичной болезни табака, TMV) или трансформированных рекомбинантными плазмидными экспрессирующими векторами(например, Ti-плазмидой), содержащими кодирующие последовательности рекомбинантных тканезащитных цитокинов; или системы клеток млекопитающих, в том числе системы клеток человека (например, НТ 1080, COS, CHO, BHK, 293, 3T3), несущих рекомбинантные экспрессионные конструкции, содержащие промоторы, происходящие из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор 7,5K вируса коровьей оспы). Экспрессионная конструкция, в данном контексте, обозначает нуклеотидную последовательность,кодирующую рекомбинантный тканезащитный цитокин, функционально связанную с одним или несколькими регуляторными районами, которые делают возможной экспрессию рекомбинантного тканезащитного цитокина в подходящей клетке-хозяине. Функционально связанные обозначает связь, в которой регуляторные районы и нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид рекомбинантного тканезащитного цитокина, соединены и расположены таким образом, чтобы сделать возможной транскрипцию и, в конечном счете, трансляцию последовательности рекомбинантного тканезащитного цитокина. Различные экспрессирующие векторы могут быть использованы для экспрессии рекомбинантного тканезащитного цитокина, в том числе, но не только, плазмиды, космиды, фаг, фагмиды или модифицированные вирусы. Примеры включают в себя бактериофаги, такие как производные фага лямбда,или плазмиды, такие как производные плазмид pBR322 или pUC или вектор BlueScript (Stratagene). Обычно такие экспрессирующие векторы содержат функциональный сайт инициации репликации для размножения вектора в подходящей клетке-хозяине, один или несколько сайтов рестрикционных эндонуклеаз для встраивания последовательности гена рекомбинантного тканезащитного цитокина и один или несколько маркеров отбора. В предпочтительных вариантах осуществления вектор pCI-neo используют для отжига олигонуклеотидов с исходным кДНК-клоном ЕРО человека для введения мутаций, описанных выше. Вектор pCI-neo содержит ген неомицинфосфотрансферазы, селектируемый маркер для клеток млекопитающих. Вектор