Выделенные полипептиды baff-r, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды baff-r, антитела анти baff-r и способы применения таких полипептидов, нуклеиновых кислот и антител

Формула / Реферат | Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Код ссылки

Номер патента: 12833

Опубликовано: 30.12.2009

Авторы: Томпсон Джеффри С., Амброуз Кристин М.

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Выделенный полипептид, который связывается с BAFF (BAFF-R), содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO:5;

(b) фрагмента SEQ ID NO:5, который связывается с BAFF;

(c) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:5 или фрагменту SEQ ID NO:5, который связывается с BAFF;

(d) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO:5 или фрагменту SEQ ID NO:5, который связывается с BAFF;

(e) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:5 или фрагменту SEQ ID NO:5, который связывается с BAFF;

(f) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:5 или фрагменту SEQ ID NO:5, который связывается с BAFF; и

(g) SEQ ID NO:5 или фрагмента SEQ ID NO:5, модифицированных заменой, добавлением или делецией одной или нескольких аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с BAFF.

2. Выделенный полипептид BAFF-R, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO:10;

(b) фрагмента SEQ ID NO:10, который связывается с BAFF;

(c) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:10 или фрагменту SEQ ID NO:10, который связывается с BAFF;

(d) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO:10 или фрагменту SEQ ID NO:10, который связывается с BAFF;

(e) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:10 или фрагменту SEQ ID NO:10, который связывается с BAFF;

(f) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:10 или фрагменту SEQ ID NO:10, который связывается с BAFF; и

(g) SEQ ID NO:10 или фрагмента SEQ ID NO:10, модифицированных заменой, добавлением или делецией одной или нескольких аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с BAFF.

3. Выделенный полипептид BAFF-R по п.1 или 2, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) аминокислот 19-35 последовательности SEQ ID NO:5;

(b) аминокислот 19-35 последовательности SEQ ID NO:5, которые модифицированы заменой одной или нескольких консервативных аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с BAFF;

(d) SEQ ID NO:13, модифицированной заменой, добавлением или делецией одной или нескольких аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с BAFF.

4. Выделенный полипептид BAFF-R, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO:15;

(b) SEQ ID NO:16;

(d) SEQ ID NO:18;

(e) SEQ ID NO:19;

(f) SEQ ID NO:20;

(g) SEQ ID NO:21;

(h) SEQ ID NO:22;

(i) SEQ ID NO:23;

(j) SEQ ID NO:24;

(k) SEQ ID NO:25;

(l) SEQ ID NO:26;

(m) SEQ ID NO:27;

(n) SEQ ID NO:28;

(о) SEQ ID NO:29;

(p) SEQ ID NO:30;

(q) SEQ ID NO:31;

(r) SEQ ID NO:32;

(s) фрагмента любой аминокислотной последовательности из (а)-(r), который связывается с BAFF; и

(t) аминокислотной последовательности по любому из (a)-(s), модифицированной добавлением, делецией или заменой одной или нескольких аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с BAFF.

5. Выделенный полипептид BAFF-R по п.4, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO:19;

(b) SEQ ID NO:22;

(d) SEQ ID NO:25;

(e) SEQ ID NO:26;

(f) SEQ ID NO:27 и

(g) фрагмента любой аминокислотной последовательности из (a)-(f), который связывается с BAFF.

6. Выделенный полипептид BAFF-R по любому из пп.1-3, где полипептид связывается с BAFF, обладает пониженной способностью к агрегации по сравнению с полипептидом, содержащим соответствующую природную последовательность BAFF-R, и содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:10 или аминокислот 2-71 последовательности SEQ ID NO:10 (SEQ ID NO:13), где одна или несколько неконсервативных аминокислот природного полипептида BAFF-R заменены соответствующими аминокислотами полипептида BAFF-R другого животного; или

(b) фрагмента аминокислотной последовательности (а), который связывается с BAFF.

7. Выделенный полипептид BAFF-R по п.6, где замены введены в одно или несколько положений, выбранных из группы, состоящей из:

(a) V20, Р21, А22 и L27 последовательности SEQ ID NO:10;

(b) V20, Р21, А22 и L27 фрагмента последовательности SEQ ID NO:10, содержащего аминокислоты 2-71; и

8. Выделенный полипептид BAFF-R по п.7, содержащий аминокислоты 2-71 последовательности SEQ ID NO:10, где измененные аминокислоты выбраны из группы, состоящей из:

(a) V20N, P21Q, А22Т и L27P;

(b) V20N и L27P;

(d) L27P;

(e) V20N и L27A и

(f) V20N и L27S.

9. Выделенный полипептид BAFF-R по любому из пп.1-8, где полипептид дополнительно содержит последовательность белка, отличного от BAFF-R.

10. Выделенный полипептид BAFF-R по п.9, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO:12;

(b) фрагмента SEQ ID NO:12, который связывается с BAFF;

(c) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO:12 или фрагменту SEQ ID NO:12; и

(d) SEQ ID NO:12 или фрагмента SEQ ID NO:12, модифицированных заменами, добавлениями или делециями одной или нескольких аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с BAFF.

11. Выделенный полипептид BAFF-R по п.9, содержащий аминокислоты 2-71 последовательности SEQ ID NO:10 и Fc-фрагмент IgG1 человека.

12. Выделенный полипептид BAFF-R по п.9, содержащий последовательность белка, выбранную из группы, состоящей из:

(a) константного домена иммуноглобулина;

(b) гетерологичной сигнальной последовательности и

(с) глутатион S-трансферазы.

13. Выделенный полипептид BAFF-R по п.12, содержащий константный домен иммуноглобулина и аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) любой последовательности SEQ ID NO:13, аминокислот 2-66 последовательностей SEQ ID NO:9 (SEQ ID NO:14); SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:31 и SEQ ID NO:32; и

(b) фрагмента аминокислотной последовательности из (а), который связывается с BAFF.

14. Выделенный полипептид BAFF-R, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO:9;

(b) фрагмента SEQ ID NO:9, который связывается с BAFF;

(c) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:9 или фрагменту SEQ ID NO:9, который связывается с BAFF;

(d) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO:9 или фрагменту SEQ ID NO:9, который связывается с BAFF;

(e) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:9 или фрагменту SEQ ID NO:9, который связывается с BAFF; и

(f) SEQ ID NO:9 или фрагмента SEQ ID NO:9, модифицированных заменой, добавлением или делецией одной или нескольких аминокислот, уфх модифицированная последовательность связывается с BAFF.

15. Выделенный полипептид BAFF-R, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO:14;

(b) фрагмента SEQ ID NO:14, который связывается с BAFF;

(c) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:14 или фрагменту SEQ ID NO:14, который связывается с BAFF;

(d) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO:14 или фрагменту SEQ ID NO:14, который связывается с BAFF;

(e) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:14 или фрагменту SEQ ID NO:14, который связывается с BAFF; и

(f) SEQ ID NO:14 или фрагмента SEQ ID NO:14, модифицированных заменой, добавлением или делецией одной или нескольких аминокислот, где модифицированная последовательность связывается с BAFF.

16. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид BAFF-R по п.15.

17. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид BAFF-R по любому из пп.1-13.

18. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который связывается с BAFF (BAFF-R), где указанная последовательность выбрана из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO:3;

(b) SEQ ID NO:4;

(d) SEQ ID NO:11;

(e) нуклеотидов 67-276 последовательности SEQ ID NO:11;

(f) нуклеотидов 67-276 и 280-960 последовательности SEQ ID NO:11;

(g) фрагмента из по меньшей мере 100 последовательных нуклеотидов любой последовательности (а)-(е);

(h) фрагмента любой последовательности (a)-(f), кодирующего полипептид, который связывается с BAFF;

(i) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который связывается с BAFF, и по меньшей мере на 70% идентична любой последовательности (a)-(h);

(j) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который связывается с BAFF, и по меньшей мере на 80% идентична любой последовательности (a)-(h); и

(k) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который связывается с BAFF, и по меньшей мере на 90% идентична любой последовательности (а)-(h).

19. Молекула нуклеиновой кислоты по п.17, где молекула кодирует полипептид BAFF-R, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO:5 или фрагмента SEQ ID NO:5, который связывается с BAFF;

(b) SEQ ID NO:10 или фрагмента SEQ ID NO:10, который связывается с BAFF;

(d) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 70% идентична любой последовательности (а)-(с);

(e) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 80% идентична любой последовательности (а)-(с);

(f) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 90% идентична любой последовательности (а)-(с).

20. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.17-19, где нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, который меньше полноразмерного BAFF-R и который связывается с BAFF.

21. Молекула нуклеиновой кислоты по п.17, где кодируемый полипептид выбран из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO:19;

(b) SEQ ID NO:22;

(d) SEQ ID NO:25;

(e) SEQ ID NO:26;

(f) SEQ ID NO:27 и

(g) фрагмента любой последовательности (a)-(f), который связывается с BAFF.

22. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, связывающийся с BAFF (BAFF-R), где указанная последовательность выбрана из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO:8;

(b) фрагмента SEQ ID NO:8, содержащего по меньшей мере 100 последовательных нуклеотидов;

(d) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который по меньшей мере на 70% идентичен SEQ ID NO:14 и который связывается с BAFF;

(e) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который по меньшей мере на 90% идентичен SEQ ID NO:14 и который связывается с BAFF; и

(f) последовательности нуклеиновой кислоты, которая комплементарна любой из (а)-(е).

23. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.17-21.

24. Клетка, содержащая вектор по п.23.

25. Клетка по п.24, где клетка представляет собой клетку яичника китайского хомяка.

26. Клетка по п.24, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.19.

27. Антитело или полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен антитела, которые специфически связываются с полипептидом BAFF-R по любому из пп.1-13.

28. Антитело или полипептид по п.27, которые специфически связываются с полипептидом BAFF-R, аминокислотная последовательность которого выбрана из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO:5;

(b) SEQ ID NO:10;

(d) фрагмента любой последовательности (а)-(с), который связывается с BAFF.

29. Антитело или полипептид по п.27 или 28, где антитело выбрано из группы, состоящей из:

(a) моноклонального антитела;

(b) поликлонального антитела;

(d) гуманизированного антитела;

(e) одноцепочечного антитела;

(f) фрагмента Fab и

(g) фрагмента F(ab)'2.

30. Антитело или полипептид по п.29, которые специфично связываются с полипептидом по п.2 или 3.

31. Антитело по п.27 или 28, продуцируемое:

(a) гибридомным клоном #2.1, АТСС No. PTA-3689 или

(b) гибридомным клоном #9.1, АТСС No. PTA-3688.

32. Антитело или полипептид по любому из пп.27-30, которые блокируют связывание BAFF с BAFF-R.

33. Антитело или полипептид по п.32, где антитело или антигенсвязывающая часть полипептида гуманизирована.

34. Антитело или полипептид по п.28, где антитело или антигенсвязывающая часть полипептида гуманизирована.

35. Фармацевтическая композиция, содержащая один или более из следующих компонентов:

(a) полипептид по любому из пп.1-13 и

(b) антитело или полипептид по пп.27-34.

36. Фармацевтическая композиция по п.35, содержащая антитело или полипептид по п.34.

37. Применение полипептида по любому из пп.1-13 для получения лекарственного средства для лечения, профилактики или задержки развития заболевания, опосредованного В-клетками, заболевания плазмацитов, аутоиммунного заболевания или опухолевого заболевания.

38. Применение антитела или полипептида, содержащего антигенсвязывающую часть антитела по любому пп.27-34, для получения лекарственного средства для лечения, профилактики или задержки развития заболевания, опосредованного В-клетками, заболевания плазмацитов, аутоиммунного заболевания или опухолевого заболевания.

39. Применение по п.37 или 38, где заболеванием плазмоцитов является множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей, первичный амилоидоз или амилоидоз, связанный с иммуноцитами, или моноклональная гаммопатия неопределенного значения (MGUS).

40. Применение по п.37 или 38, где аутоиммунным заболеванием является ревматоидный артрит, системная красная волчанка, миастения гравис, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, антифосфолипидный синдром, болезнь Чагаса, болезнь Грейва, грануломатоз Вегенера, полиартрит нодозный или гломерулонефрит.

41. Применение по п.37 или 38, где опухолевым заболеванием является В-клеточная карцинома, лейкемия или лимфома.

42. Применение по п.37 или 38, где лекарственное средство предназначено для лечения, профилактики или задержки развития системной красной волчанки.

43. Применение по п.37 или 38, где лекарственэюх средство предназначено для лечения, профилактики или задержки развития ревматоидного артрита.

44. Применение по п.37 или 38, где лекарственное средство содержит полипептид по п.3 или 5 и предназначено для лечения, профилактики или задержки развития системной красной волчанки.

45. Применение по п.37 или 38, где лекарственное средство содержит антитело или полипептид по п.34 и предназначено для лечения, профилактики или задержки развития системной красной волчанки.

46. Применение по п.37 или 38, где лекарственное средство содержит полипептид по п.3 или 5 и предназначено для лечения, профилактики или задержки развития ревматоидного артрита.

47. Применение по п.37 или 38, где лекарственное средство содержит антитело или полипептид по п.34 и предназначено для лечения, профилактики или задержки развития ревматоидного артрита.

48. Выделенный зонд нуклеиновой кислоты для детекции молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид BAFF-R по любому из пп.1-15, где зонд состоит по меньшей мере из 10 и максимально из 50 последовательных нуклеотидов, выбранных из:

(a) последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6;

(b) SEQ ID NO:8;

(c) последовательности, комплементарной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6; и

(d) вырожденных последовательностей (а) или (b), которые кодируют ту же аминокислотную последовательность.

49. Способ получения полипептида BAFF-R, включающий стадии:

(a) получения клетки по любому из пп.24-26;

(b) культивирования клетки в условиях, подходящих для экспрессии полипептида BAFF-R; и

50. Способ идентификации функционально активного мутантного полипептида BAFF-R по любому из пп.1-15, включающий оценку мутанта BAFF-R на одну или несколько следующих активностей:

(a) на способность связываться с BAFF;

(b) на способность связываться с внутриклеточным белком-мишенью или с его биологически активной частью;

(d) на способность ингибировать BAFF-индуцированную В-клеточную пролиферацию,

где наличие одной или нескольких этих активностей указывает на то, что такой мутант BAFF-R является функционально активным.

51. Способ идентификации соединения, которое модулирует активность полипептида BAFF-R, включающий стадии:

(a) контактирования полипептида BAFF-R по любому из пп.1-15 с соединением и

(b) определение того, была ли изменена активность полипептида BAFF-R.

52. Способ получения полипептида BAFF-R с пониженной способностью к агрегации, включающий стадии:

(a) трансформации клетки-хозяина нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид BAFF-R по любому из пп.1-15, где одна или несколько неконсервативных аминокислот в области от С19 до L27 заменены соответствующими аминокислотами полипептида BAFF-R с последовательностью SEQ ID NO:9;

(b) культивирования клетки в условиях, подходящих для экспрессии полипептида BAFF-R; и

53. Способ по п.52, где неконсервативная аминокислота является неполярной аминокислотой.

54. Способ по п.53, где неполярная аминокислота заменена аминокислотой, выбранной из группы, включающей пролин, серин или аланин.

55. Трансгенное животное, не являющееся человеком, в геном которого введены эндогенные последовательности, кодирующие полипептид BAFF-R по любому из пп.1-15.

56. Набор, содержащий по меньшей мере одно антитело по любому из пп.27-34, и контроль.

57. Способ идентификации клеток или тканей с нарушенной экспрессией BAFF-R, включающий:

(a) контактирование олигонуклеотидного зонда, содержащего по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидов последовательности, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, и последовательностей, которые комплементарны любой последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6, с биологическим образцом индивидуума; и

(b) измерение уровня нуклеиновой кислоты, кодирующей BAFF-R, в биологическом образце для определения уровней мРНК BAFF-R; или альтернативно

(c) определение того, была ли мутирована или делетирована нуклеиновая кислота, кодирующая BAFF-R, в биологическом образце;

где различие уровней нуклеиновой кислоты, кодирующей BAFF-R, и контрольного образца, или мутации или делеции в нуклеиновой кислоте, кодирующей BAFF-R, указывает, что в клетке или ткани нарушена экспрессия BAFF-R.

58. Диагностический набор для идентификации клеток или тканей с нарушенной экспрессией BAFF-R, содержащий олигонуклеотидный зонд, содержащий по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидов последовательности из группы, состоящей из последовательностей: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, и последовательностей, которые комплементарны любой последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6.

59. Набор для определения BAFF-R в биологическом образце, содержащий меченное соединение или агент, способный обнаруживать полипептид BAFF-R по любому из пп.1-15 или мРНК, кодирующую полипептид BAFF-R по любому из пп.1-15, в биологическом образце; средство для определения количества полипептида BAFF-R или мРНК в образце; и средство для сравнения количества полипептида BAFF-R или мРНК в образце со стандартом.

60. Способ диагностики заболевания, опосредованного В-клетками, у индивидуума, включающий стадии:

(a) взятия биологического образца у индивидуума;

(b) измерение количества полипептида BAFF-R по любому из пп.1-15 или нуклеиновой кислоты BAFF-R, кодирующей полипептид BAFF-R по любому из пп.1-15, в образце, взятом у индивидуума; и

(c) сравнение количества полипептида BAFF-R или нуклеиновой кислоты BAFF-R в образце, взятом у индивидуума, с количеством полипептида BAFF-R или нуклеиновой кислоты BAFF-R контрольного образца,

где различие количества полипептида BAFF-R или нуклеиновой кислоты BAFF-R в образце, взятом у субъекта, и количества полипептида BAFF-R или нуклеиновой кислоты BAFF-R контрольного образца указывает на заболевание, опосредованное В-клетками, у субъекта.

61. Применение полипептида по любому из пп.1-13 для получения диагностического средства для диагностики состояния, опосредованного В-клетками.

62. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.17-21 для получения диагностического средства для диагностики состояния, опосредованного В-клетками.

63. Применение антитела по любому из пп.27-34 для получения диагностического средства для диагностики состояния, опосредованного В-клетками.

64. Применение зонда по п.48 для получения диагностического средства для диагностики состояния, опосредованного В-клетками.

65. Гибридома, продуцирующая антитело по любому из пп.27-31.

66. Гибридома по п.65, выбранная из группы, состоящей из гибридомного клона #2.1, АТСС No. PTA-3689 или гибридомного клона #9.1, АТСС No. PTA-3688.

67. Полипептид BAFF-R, полученный способом, включающим:

(a) культивирование клетки-хозяина, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по любому из пп.1-15 в условиях, достаточных для экспрессии полипептида BAFF-R; и

(b) выделение экспрессируемого полипептида.

68. Химерный полипептид, полученный способом, включающим:

(a) культивирование клетки-хозяина, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую:

(i) полипептид BAFF-R, содержащий SEQ ID NO:10 или фрагмент SEQ ID NO:10, который связывается с BAFF; и

(ii) полипептид, отличный от BAFF-R, в условиях, достаточных для экспрессии слитого белка; и

(b) выделение экспрессируемого химерного полипептида BAFF-R.

69. Полипептид BAFF-R по п.67 или химерный полипептид по п.68, где полипептид BAFF-R содержит аминокислоты 2-71 последовательности SEQ ID NO:10 или ее фрагмент, который связывается с BAFF.

70. Полипептид BAFF-R по п.67 или химерный полипептид пю я.68, где полипептид BAFF-R содержит аминокислоты 2-71 SEQ ID NO:10.

71. Химерный полипептид по любому из пп.68-70, где полипептид, отличный от BAFF-R, содержит Fc-фрагмент IgG человека.

72. Полипептид BAFF-R по п.67 или химерный полипептид по любому из пп.68-70, где клетка-хозяин является клеткой млекопитающего.

73. Полипептид по п.72, где клетка млекопитающего представляет собой клетку яичника китайского хомячка.

74. Полипептид по п.72, где клетка млекопитающего представляет собой клетку 293 EBNA.

75. Способ детекции BAFF-R в биологическом образце у индивидуума, включающий:

(a) взятие биологического образца у индивидума;

(b) детекцию полипептида BAFF-R по любому из пп.1-15 в образце индивидуума с использованием антитела или полипептида, содержащего антигенсвязывающий домен антитела по любому из пп.28-35.

76. Способ по п.75, где антитело выбрано из группы, состоящей из:

(a) моноклонального антитела;

(b) поликлонального антитела;

(d) гуманизированного антитела;

(e) одноцепочечного антитела;

(f) фрагмента Fab и

(g) фрагмента F(ab)'2.

77. Способ определения того, была ли мутирована или делетирована геномная последовательность BAFF-R, включающий:

(a) взятие биологического образца у индивидуума;

(b) определение того, была ли мутирована или делетирована молекула нуклеиновой кислоты BAFF-R с использованием молекулы нуклеиновой кислоты, способной гибридизоваться в жестких условиях с геномными последовательностями BAFF-R человека (SEQ ID NO:10) или BAFF-R мыши (SEQ ID NO:9),

причем жесткими условиями являются 6_SSC, 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 1 мМ EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA и 500 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося при 65шС, а затем одна или несколько промывок в 0,2_SSC, 0,1% BSA при 50шС.

Текст

Смотреть все

012833 Область изобретения Данное изобретение обеспечивает новый рецепторный белок. Данное изобретение относится, в общем, к нуклеиновым кислотам и полипептидам. Более конкретно, данное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды, относящиеся к рецептору BAFF, фактора активации Вклеток, принадлежащего к семейству факторов некроза опухолей (TNF), который связан с экспрессией В-клеток и иммуноглобулинов. Этот рецептор может быть использован для лечения раков, лимфом, аутоиммунных заболеваний или наследственных генетических нарушений, в которых участвуют В-клетки. Предпосылки изобретения Данное изобретение относится к новому рецептору в семействе TNF. Новый рецептор идентифицирован как BAFF-рецептор (BAFF-R). Семейство TNF состоит из пар лигандов и их специфических рецепторов, называемых лигандами семейства TNF и рецепторами семейства TNF (Bazzoni and Beutler (1996) N. Engl. J. Med. 334(26):17171725). Это семейство участвует в регуляции иммунной системы и, возможно, других неиммунологических систем. Эта регуляция часто находится на уровне основного переключения, так что передача сигнала семейства TNF может приводить к большому числу последующих событий, лучше всего определенных для TNF. TNF может инициировать общую защитную воспалительную реакцию организма на чужеродную инвазию, которая включает в себя измененное представление молекул адгезии, участвующих в перемещении клеток, продуцирование хемокинов для перемещения специфических клеток в специфические компартменты и примирование (сенсибилизацию) различных эффекторных клеток. В качестве таковой регуляция этих путей имеет клинический потенциал. Считается, что индукция различных клеточных реакций, опосредованная такими цитокинами семейства TNF, инициируется их связыванием со специфическими клеточными рецепторами. Были идентифицированы по меньшей мере два различающихся TNF-рецептора приблизительно 55 кДа (TNFR1) и 75 кДа (TNFR2) (Hohman et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:14927-14934; and Brockhaus et al. (1990) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 87:3127-3131). Широкие полиморфизмы были ассоциированы с генами обоих TNFрецепторов. Оба TNFR имеют общую типичную структуру рецепторов клеточной поверхности, включающую внеклеточный, трансмембранный и внутриклеточный домены. Внеклеточная часть TNFR типа 1 и типа 2 содержит повторяющуюся картину аминокислотной последовательности из четырех богатых цистеинами доменов (CDR). Сходная повторяющаяся картина CDR существует в нескольких других белках клеточной поверхности, в том числе рецепторе фактора роста нервов р 75, антигене CD40 В-клеток,наряду с другими. Эти рецепторы являются мощными инструментами для выяснения биологических путей вследствие легкости и превращения в слитые с иммуноглобулинами белки. Эти димерные формы растворимого рецептора являются хорошими ингибиторами событий, опосредуемых либо секретируемыми, либо связанными с поверхностью лигандами. Посредством связывания с такими лигандами они препятствуют взаимодействию этого лиганда со связанными с клетками рецепторами, которые могут передавать сигнал. Эти слитые белки рецептор-Fc не только применимы в экспериментальном смысле, но они были успешно использованы клинически в виде TNF-R-Fc для лечения воспаления кишечника, ревматоидного артрита и острого клинического синдрома, сопутствующего введению OKT3 (антигенного маркера популяции зрелых периферических Т-лимфоцитов у человека) (Eason et al. (1996) Transplantation 61 (2):224-228;Feldmann et al. (1996) Int. Arch. Allergy Immunol. 111(4):362-365; и van Dullemen et al. (1995) Gastroenterol 109(1):129-135). Можно предвидеть, что манипулирование многими событиями, опосредованными передачей сигналов через семейство TNF-рецепторов, будет иметь широкое применение для лечения заболеваний, в основе которых лежит нарушение иммунной системы, а также большого диапазона заболеваний человека, которые имеют патологические осложнения вследствие участия иммунной системы. Растворимая форма недавно описанного рецептора, остеопротегерина, может блокировать потерю костной массы(остеопороза), и, следовательно, события, регулируемые передачей сигнала рецептором TNF-семейства,необязательно ограничиваются только регуляцией иммунной системы (Simonet et al. (1997) Cell 89(2):309-319). Антитела к этому рецептору могут блокировать связывание лиганда и, следовательно, могут также иметь клиническое применение. Такие антитела часто являются очень долго живущими и могут иметь преимущества над слитыми белками растворимый рецептор-Fc, которые имеют более короткие полупериоды существования в крови. Хотя ингибирование опосредованного рецептором пути представляет наиболее используемое терапевтическое применение этих рецепторов, первоначально используемым применением была активацияTNF-рецепторов, которая обнаружила клиническую перспективу (Aggarwal and Natarajan (1996) Eur Cytokine Netw. 7 (2):93-124). Активация TNF-рецепторов может инициировать гибель клеток в клеткахмишенях, и, следовательно, применение к опухолям было и все еще остается привлекательным (Eggermont et al. (1996) Ann. Surg. 224 (6):756-765). Этот рецептор может активироваться либо введением лиганда, т.е. природным путем, либо некоторыми антителами, которые могут сшивать рецептор и являются также сильными агонистами. Антитела могли бы иметь преимущество в онкологии, так как они могут сохраняться в крови в течение продолжительных периодов, тогда как лиганды обычно имеют короткие продолжительности жизни в крови. Поскольку многие из этих рецепторов могут экспрессироваться бо-1 012833 лее селективно в опухолях или они могут только передавать сигнал гибели клеток или дифференцировки в опухолях, агонистические антитела могли бы быть хорошим оружием для лечения рака. Подобным образом, многочисленные положительные иммунологические события опосредуются через рецепторыTNF-семейства, например, воспалительные реакции хозяина, продуцирование антител и т.д., и, следовательно, агонистические антитела могли бы иметь полезные эффекты в других, неонкологических применениях. Парадоксально, ингибирование пути может иметь клиническую пользу при лечении опухолей. Например, некоторыми опухолями экспрессируется Fas-лиганд, и эта экспрессия может приводить к гибелиFas-положительных лимфоцитов, облегчая тем самым способность опухоли уклоняться от действия иммунной системы. В этом случае ингибирование Fas-системы могло бы затем позволить иммунной системе реагировать с опухолью другими путями теперь, когда доступ является возможным (Green and Ware(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (12):5986-90). Лиганд BAFF TNF-семейства, также известный как TALL-1, THANK, BLyS и zTNF4 (Sclneider et al.(2000) Nature 404 (6781): 995-999) усиливает выживание В-клеток in vitro (Batten et al. (2000) J. Exp. Med. 192 (10):1453-1466) и становится ключевым регулятором популяций периферических В-клеток in vivo. Мыши, сверхэкспрессирующие BAFF, обнаруживают гиперплазию зрелых В-клеток и симптомы системной красной волчанки (SLE) (Mackay et al. (1999) J. Exp. Med. 190 (11): 1697-1710). Некоторые пациенты со SLE имеют также значимо увеличенные уровни BAFF в их сыворотке (Zhang et al. (2001) J. Immunol. 166 (1):6-10). Таким образом, было сделано предположение, что аномально высокие уровни этого лиганда могут способствовать патогенезу аутоиммунных заболеваний посредством усиления выживания аутореактивных В-клеток (Batten et al. (2000) J. Exp. Med. 192(10):1453-1466).BAFF, мембранный белок типа 2, продуцируется клетками миелоидного происхождения (Schneideret al. (1999) J. Exp. Med. 189(11):1747-1756; Moore et al. (1999) Science 285 (5425):260-263) и экспрессируется либо на клеточной поверхности, либо находится в растворимой форме (Schneider et al. (1999) J. Exp.Med. 189(11):1747-1756). Ранее было показано, что два члена семейства TNF-рецепторов, ВСМА и TACI,взаимодействуют с BAFF (Gross et al. (2000) Nature 404:995-999; Thompson et al. (2000) J. Exp. Med. 192(1):129-135; Xia et al. (2000) J. Exp. Med. 192:137-143; Marsters et al. (2000) Curr. Biol. 10(13):785-788;Shu et al. (2000) J. Leukoc. Biol. 65(5):680-683; Wu et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:35478-35485). Сущность изобретения Данное изобретение основано, частично, на обнаружении BAFF-R, рецепторного белка BAFF, полинуклеотидных последовательностей BAFF-R и полипептидов BAFF-R, кодируемых этими последовательностями нуклеиновых кислот. В одном аспекте данное изобретение обеспечивает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты,которая кодирует BAFF-R-полипептид, или ее фрагмент или производное. Эта нуклеиновая кислота может включать в себя, например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по меньшей мере на 50% идентичный или по меньшей мере на 90% идентичный полипептиду, включающему аминокислотную последовательность фиг. 2D (SEQ ID NO:5). Данное изобретение обеспечивает также, по существу, чистую молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, которая гибридизуется при жестких условиях с гибридизационным зондом, причем последовательность нуклеиновой кислоты этого зонда состоит из кодирующей последовательности фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4) или комплемента указанной кодирующей последовательности. В некоторых вариантах последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, имеющий последовательность фиг. 2D (SEQ ID NO:5) по меньшей мере с одной консервативной заменой аминокислоты. В некоторых вариантах последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который связывает BAFF. Нуклеиновая кислота может включать в себя, например, нуклеиновую кислоту, включающую в себя нуклеотидную последовательность, показанную на фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1 В (SEQ ID NO:2), фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6). Нуклеиновая кислота может быть, например, фрагментом геномной ДНК, или она может быть молекулой кДНК. В данное изобретение включены также вектор, содержащий одну или несколько из описанных здесь нуклеиновых кислот, и клетка, содержащая описанные здесь векторы или нуклеиновые кислоты. В другом аспекте данное изобретение обеспечивает, по существу, чистую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый белок, включающий по меньшей мере два сегмента, где один из этих сегментов включает полипептид или его фрагмент, описанные в аминокислотных последовательностях,приведенных в указанных выше вариантах данного изобретения. Данное изобретение обеспечивает также слитый белок, включающий по меньшей мере два или три сегмента, где первый сегмент включает гетерологичный сигнальный полипептид, второй включает полипептид или его фрагмент, описанные в-2 012833 аминокислотных последовательностях BAFF-R, указанных в приведенных выше вариантах данного изобретения, и третий сегмент включает полипептид иммуноглобулина. Альтернативно, первый сегмент включает фрагмент полипептида иммуноглобулина, содержащий сигнальную последовательность, а второй сегмент включает фрагмент полипептида BAFF-R. В других аспектах данное изобретение обеспечивает, по существу, чистый связывающий агент, который специфически связывается с полипептидом вышеуказанных вариантов данного изобретения. Данное изобретение относится также к клеткам-хозяевам, трансформированным рекомбинантным экспрессирующим вектором, содержащим любую из вышеописанных молекул нуклеиновых кислот. В другом аспекте данное изобретение включает в себя фармацевтическую композицию, которая включает в себя нуклеиновую кислоту BAFF-R и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В следующем аспекте данное изобретение включает в себя по существу очищенный полипептидBAFF-R, например, любой из полипептидов, кодируемых нуклеиновой кислотой BAFF-R. Данное изобретение включает в себя также фармацевтическую композицию, которая включает в себя полипептид BAFF-R и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Еще в одном варианте данное изобретение обеспечивает антитело, которое связывается специфически с полипептидом BAFF-R. Это антитело может быть, например, моноклональным или поликлональным антителом. Данное изобретение включает в себя также фармацевтическую композицию, включающую в себя BAFF-R-антитело и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Данное изобретение относится также к выделенным антителам, которые связываются с эпитопом на полипептиде,кодируемом любой из молекул нуклеиновых кислот, описанных выше. Далее данное изобретение относится к наборам, содержащим антитела, которые связываются с полипептидом, кодируемым любой из молекул нуклеиновых кислот, описанных выше, и антитело отрицательного контроля. Данное изобретение обеспечивает, далее, способ для получения полипептида BAFF-R. Этот способ предусматривает обеспечение клетки, содержащей нуклеиновую кислоту BAFF-R, например вектора,который включает в себя нуклеиновую кислоту BAFF-R, и культивирование этой клетки в условиях, достаточных для экспрессии полипептида BAFF-R, кодируемого этой нуклеиновой кислотой. Затем экспрессированный полипептид BAFF-R извлекают из данной клетки. Предпочтительно клетка продуцирует мало эндогенного полипептида BAFF-R или вообще не продуцирует эндогенный полипептид BAFF-R. Эта клетка может быть, например, прокариотической клеткой или эукариотической клеткой. Данное изобретение обеспечивает способ индукции иммунного ответа у млекопитающего против полипептида, кодируемого любой из описанных выше молекул нуклеиновых кислот, введением этому млекопитающему количества полипептида, достаточного для индукции иммунного ответа. Данное изобретение относится также к способам идентификации соединения, которое связывается с полипептидом BAFF-R, посредством контактирования полипептида BAFF-R с соединением и определения, связывается ли это соединение с полипептидом BAFF-R. Данное изобретение относится также к способам идентификации соединения, которое связывается с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид BAFF-R, посредством контактирования нуклеиновой кислоты BAFF-R с соединением и определения, связывается ли это соединение с этой молекулой нуклеиновой кислоты. Данное изобретение обеспечивает также способы идентификации соединения, которое модулирует активность полипептида BAFF-R, посредством контактирования полипептида BAFF-R с соединением и определения, модифицирована ли активность этого полипептида BAFF-R. Данное изобретение относится также к соединениям, которые модулируют активность полипептидаBAFF-R, идентифицированным посредством контактирования полипептида BAFF-R с соединением и определения, модифицирует ли это соединение активность полипептида BAFF-R, связывается с полипептидом BAFF-R или связывается с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид BAFF-R. В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способ диагностики опосредованного Вклетками состояния, например аутоиммунного нарушения или рака, у субъекта. Этот способ предусматривает обеспечения пробы белка из субъекта и измерение количества полипептида BAFF-R в этой пробе субъекта. Затем количество BAFF-R в пробе субъекта сравнивают с количеством полипептида BAFF-R в контрольной пробе белка. Изменение в количестве полипептида BAFF-R в пробе белка субъекта относительно количества полипептида BAFF-R в контрольной пробе белка указывает на то, что субъект имеет опосредованное В-клетками состояние. Контрольную пробу предпочтительно берут из соответствующего индивидуума, т.е. индивидуума сходного возраста, того же пола или другого общего состояния, но в котором не предполагается наличие этого состояния. Альтернативно, контрольная проба может быть взята из субъекта в то время, когда в этом субъекте не предполагали наличия данного нарушения. В некоторых вариантах полипептид BAFF-R детектируют с использованием BAFF-R-антитела. В следующем аспекте данное изобретение включает в себя способ диагностики опосредованного Вклетками состояния, например, аутоиммунного нарушения у субъекта. Этот способ предусматривает-3 012833 обеспечение пробы нуклеиновой кислоты, например РНК, или ДНК, или обеих, из субъекта и измерение количества этой нуклеиновой кислоты BAFF-R в пробе нуклеиновой кислоты субъекта. Затем это количество нуклеиновой кислоты BAFF-R в пробе нуклеиновой кислоты субъекта сравнивают с количеством нуклеиновой кислоты BAFF-R в контрольной пробе. Изменение в количестве нуклеиновой кислоты BAFF-R в данной пробе относительно количества нуклеиновой кислоты BAFF-R в контрольной пробе указывает на то, что данный субъект имеет аутоиммунное состояние. В следующем аспекте данное изобретение включает в себя способ диагностики онкогенного или аутоиммунного состояния у субъекта. Этот способ предусматривает обеспечение пробы нуклеиновой кислоты из субъекта и идентификацию по меньшей мере части нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты BAFF-R в пробе нуклеиновой кислоты субъекта. Затем это количество нуклеотидной последовательности BAFF-R в пробе субъекта сравнивают с нуклеотидной последовательностью BAFFR контрольной пробы. Изменение в нуклеотидной последовательности BAFF-R в пробе относительно нуклеотидной последовательности BAFF-R в указанной контрольной пробе указывает, что субъект имеет такое состояние. В еще одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ лечения или предупреждения или замедления опосредованного В-клетками состояния. Этот способ включает в себя введение субъекту, для которого желательно такое лечение, или предупреждение, или замедление, нуклеиновой кислоты BAFFR, полипептида BAFF-R или анти-BAFF-антитела в количестве, достаточном для лечения, предупреждения или замедления онкогенного или иммунорегуляторного состояния у субъекта. Состояния, диагностируемые, подвергаемые лечению, предупреждаемые или замедляемые с использованием молекул нуклеиновых кислот BAFF-R, полипептидов BAFF-R или BAFF-R-антител, могут быть раком или иммунорегуляторным заболеванием. Эти заболевания включают в себя заболевания, которые являются аутоиммунными по природе, такие как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, тяжелая псевдопаралитическая миастения, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, антифосфолипидный синдром, болезнь Шагаса, болезнь Грейвса, гранулематоз Вегенера, нодозный полиартериит и быстро прогрессирующий гломерулонефрит. Этот терапевтический агент имеет также применение в нарушениях плазматических клеток, таких как множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь с поражением тяжелых цепей иммуноглобулина,первичный или иммуноцитассоциированный амилоидоз и моноклональная гаммапатия неустановленной этиологии (MGUS). Онкологические мишени включают в себя В-клеточные карциномы, лейкозы и лимфомы. Композиции и способы лечения с использованием нуклеиновых кислот, полипептидов и антител данного изобретения могут применяться при любом состоянии, связанном с нежелательной пролиферацией клеток. В частности, данное изобретение может быть использовано для лечения опухолевых клеток,которые экспрессируют BAFF и/или BAFF-R. Композиции данного изобретения, содержащие агонисты BAFF-R (такие как антитела, которые связываются с BAFF-R и имитируют BAFF), также могут быть использованы для лечения иммунных недостаточностей, например, связанных с низкими количествами В-клеток. Такие нарушения могут быть обусловлены, например, облучением и/или химиотерапией. В другом аспекте данного изобретения обеспечен способ уменьшения агрегации рекомбинантно экспрессируемого белка. Этот способ предусматривает сравнение гомологов белка или его слитого белка для определения консервативных доменов и неидентичных аминокислот в консервативных доменах. Обычно по меньшей мере одну неполярную аминокислоту заменяют на незаряженную полярную аминокислоту или на пролин, аланин или серин. Если нет других указаний, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же самое значение, какое понимается специалистами с квалификацией в области, к которой относится это изобретение. Хотя способы и материалы, сходные с описанными здесь или эквивалентные описанным здесь, могут быть использованы на практике или при тестировании данного изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упоминаемые здесь, включены в качестве ссылки в их полном виде. В случае противоречия, контролем будет данное описание, в том числе и в отношении определений. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения данного изобретения. Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидными из следующего подробного описания и формулы изобретения. Краткое описание чертежей Фиг. 1 А показывает ДНК-последовательность кДНК BJAB (SEQ ID NO:1), клонированную в(SEQ ID NO:2). Фиг. 2 А показывает нуклеотидную последовательность JST576 с удаленным интроном, предсказанную программой GENESCAN (SEQ ID NO:3). Фиг. 2 В показывает 1% агарозный гель ПЦР-продуктов, полученных для BAFF-R с использованием-4 012833 либо кДНК первой цепи, генерированной из РНК BJAB или IM-9, или на кДНК JST576. Дорожка 1. Продукт HindIII-расщепления лямбда-ДНК. Дорожка 2. Олиго-dT-праймированный продукт BAF-225/BAF191 BJAB. Дорожка 3. Олиго-dT-праймированный продукт BAF-226/BAF-191 BJAB. Дорожка 4. Случайно праймированный продукт BAF-225/BAF-191 BJAB. Дорожка 5. Случайно праймированный продуктBAF-226/BAF-191 BJAB. Дорожка 6. Олиго-dT-праймированный продукт BAF-225/BAF-191 IM-9. Дорожка 7. Олиго-dT-праймированный продукт BAF-226/BAF-191 IM-9. Дорожка 8. Случайно праймированный продукт BAF-225/BAF-191 IM-9. Дорожка 9. Случайно праймированный продукт BAF-226/BAF191 IM-9. Дорожка 10. BAF-225/BAF-191 кДНК JST576. Дорожка 11. BAF-226/BAF-191 кДНК JST576. Дорожка 12. BAF-225/BAF-191 без матрицы. Дорожка 13. BAF-226/BAF-191 без матрицы. Фиг. 2 С показывает последовательность зрелого JST576 (BAFF-R) (SEQ ID NO:4) (также номер доступа GenBank AF373846), определенную секвенированием массы ПЦР-продукта, фланкирующую предсказанный интрон из кДНК первой цепи BJAB. Фиг. 2D показывает аминокислотную последовательность BAFF-R (JST576) (SEQ ID NO:5). Остаток A (Ala) (жирный шрифт) указывает последовательность, образующуюся вследствие использования альтернативного акцепторного сайта сплайсинга. Предсказанный трансмембранный домен заключен в блок, а предполагаемый сигнал остановки транспорта является подчеркнутым. Фиг. 3 показывает сплайсированную версию JST576 (SEQ ID NO:6), содержащую 5'-UTRпоследовательность, полученную ОТ-ПЦР из кДНК первой цепи селезенки человека, и выведенную аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:7). Эта последовательность содержит стоп-кодон слева в рамке считывания с ATG. Фиг. 4 А показывает последовательность кДНК мышиного BAFF-R (SEQ ID NO:8) (также номер доступа GenBank AF373847). Фиг. 4 В показывает аминокислотную последовательность мышиного BAFF-R (SEQ ID NO:9). Остатки Cys напечатаны жирным шрифтом и подчеркнуты, а предсказанный трансмембранный район заключен в блок. Фиг. 4 С показывает гомологию между последовательностями белков BAFF-R человека (SEQ IDNO:10) и мыши (SEQ ID NO:9). Фиг. 5 изображает связывание BAFF человека с трансфицированными JST576 клетками. Клетки 293EBNA котрансфицировали pJST576 или СА 336 (huTACI) и репортерной конструкцией GFP. Клетки анализировали на связывание BAFF с 1 мкг/мл биотинилированного myc-huBAFF с последующим добавлением SAV-PE. Фиг. 6 показывает связывание BAFF человека и мыши с JST576-трансфицированными клетками. Клетки 293EBNA котрансфицировали pJST576 и репортерной конструкцией GFP. Клетки анализировали спустя 24 ч на связывание BAFF с 5 мкг/мл flag-huBAFF или flag-muBAFF с последующим добавлением моноклонального антитела М 2 против flag и обезьяньего антимышиного IgG-PE. Фиг. 7 показывает, что APRIL не связывается с JST576-трансфицированными клетками. Клетки 293EBNA котрансфицировали pJST576 или СА 336 (huTACI) и репортерной конструкцией GFP. Клетки анализировали на связывание APRIL с 1 мкг/мл myc-muAPRIL с последующим добавлением антиmuAPRIL крысиного IgGb, биотинилированного антикрысиного FcG2b и SAV-PE. Фиг. 8 показывает, что BAFF осаждает белок из JST576-трансфицированных клеток. Клетки 293EBNA котрансфицировали либо BAFF-R (pJST576), только вектором (СН 269), либо huTACI (CA336) и кратковременно метили 35S-цистеином и метионином. Экстракты иммунопреципитировали с использованием flag-huBAFF и подвергали электрофорезу в восстанавливающих условиях на ДСН-ПААГ. Маркеры молекулярных масс указаны слева. Фиг. 9 изображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:11) и выведенную из нее аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:12) гена, кодирующего слитый белок huBAFF-R:Fc: нуклеотиды 1-63 кодируют сигнальную последовательность мьшиного IgG-каппа; нуклеотиды 64-66 использовали для введения сайта рестриктазы, нуклеотиды 67-276 кодируют часть внеклеточного доменаBAFF-R, нуклеотиды 277-279 использовали для введения сайта рестриктазы и нуклеотиды 280-960 кодируют Fc-район IgGl человека. Фиг. 10 изображает результаты Нозерн-блот-анализа с использованием EcoNI-фрагмента JST576 в качестве зонда. Все экспозиции составляли 4 дня. 10 А: Clontech human Immune II blot; 10B: Clontech human 12 lane multi-tissue blot; 10C: Clontech human multi-tissue II blot. Фиг. 11 показывает результат Нозерн-блот-анализа 20 мкг тотальной РНК, выделенной из различных клеточных линий. Этот блот зондировали фрагментом рестрикции EcoNI JST576 и экспонировали в течение 4 дней. Способность этих клеточных линий связывать BAFF, определенная FACS-анализом, указана ниже дорожки. Фиг. 12 показывает результаты иммунопреципитации с использованием BAFF-R:Fc. BAFF человека иммунопреципитируется с помощью BAFF-R:Fc или ВСМА:Ес, но не Fn14-Fc. Контрольный белокBAFF показан в дорожке 1. Фиг. 13 показывает, что слитый белок BAFF-R человека:Fc блокирует связывание BAFF человека с клетками BJAB. Результаты FACS-анализа показаны на фиг. 13 А. Кривая Е представляет связывание-5 012833 биотинилированного BAFF с клетками BJAB в отсутствие BAFF-R:Fc. Кривые B-D представляют способность BAFF связываться с клетками BJAB в присутствии 5 мкг/мл, 1 мкг/мл или 0,2 мкг/мл соответственно. Кривая А является единственной кривой второй стадии. Фиг. 13 В иллюстрирует способность различных концентраций BAFF-R:Fc (квадраты) по сравнению с TACI:Fc (треугольники) или неспецифического слитого белка LTR:Fc (кружки) блокировать связывание BAFF с экспрессирующими рецептор клетками BJAB. Фиг. 14 показывает способность BAFF-R:Fc блокировать BAFF-индуцированную костимуляцию Вклеток селезенки. Показан график включения [3 Н]-тимидина (имп/мин) в зависимости от увеличивающихся количеств hBAFF (нг/мл). Фиг. 15 показывает, что обработка BAFF-R:Fc1 приводит к потере периферических В-клеток у здоровой мыши. Фиг. 16 показывает, что обработка мышей слитым белком BAFF-R:Fc человека и мыши снижает число В 220+ В-клеток селезенки. Фиг. 17 показывает, что введение BAFF-R:Fc мышам снижает процент В 220+ В-клеток лимфатических узлов. Фиг. 18 показывает, что введение BAFF-R:Fc мышам снижает процент В 220+ В-клеток периферической крови. Фиг. 19 А показывает данные FACS для супернатантов четырех клонов, которые продуцируют антитела, связывающие BAFF-R. Показан также контрольный супернатант, который не содержит антител,связывающих BAFF-R. Фиг. 19 В показывает гистограмму, показывающую, что два клона блокируют связывание BAFF сBAFF-R. (а) показывает контроль без BAFF; (b) показывает блокирующую активность антитела из клона 2; (с) показывает блокирующую способность антитела из клона 9; (d) показывает кривую для контрольного антитела, которое не связывает BAFF-R. Фиг. 20 показывает сопоставление аминокислотных последовательностей внеклеточных доменовBAFF-R:Fc человека (hBAFF-R) и BAFF-R:Fc мыши (mBAFF-R) и процент агрегации, наблюдаемой при экспрессии слитых с Fc белков, содержащих указанные последовательности. Пронумерованные клоныJST представляют аминокислотные последовательности, обнаруживающие мутации (подчеркнутые) в исходных последовательностях и полученную агрегацию экспрессированного белка. Показаны частичные последовательности для BAFF-R человека (аминокислоты 2-71 последовательности SEQ ID NO:10;SEQ ID NO:13) и мыши (аминокислоты 2-66 последовательности SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:14); и соответствующие части следующих клонов: JST659 (SEQ ID NO:15), JST660 (SEQ ID NO:16), JST661 (SEQNO:29), JST665 (SEQ ID NO:30), JST666 (SEQ ID NO:31) и JST667 (SEQ ID NO:32). Фиг. 21 показывает радиоавтограф белков, иммунопреципитированных с использованием лизатов,приготовленных из клеток, трансфицированных BAFF-R-i.с.d. (внутриклеточный домен BAFF-R) (дорожка 1), или трансфицированных контрольным вектором клеток (дорожка 2). Приблизительно 6106 клеток 293 Е трансфицировали конструкцией, кодирующей BAFF-R-i.с.d. или псевдо-(пустой) плазмидой. Спустя 48 ч клетки метаболически метили 35S в течение 24 ч, лизировали буфером для лизиса, предварительно осветляли и иммунопреципитировали антителом anti-myc mAB, 9E10. Иммунопреципитаты разделяли электрофорезом на 10-20% ПААГ-ДСН при восстанавливающих условиях. Подробное описание изобретения Ссылочные работы, патенты, патентные заявки и научная литература, в том числе номера доступа для последовательностей базы данных GenBank, на которые даются ссылки здесь, доказывают знание их специалистами с квалификацией в данной области и включены здесь в качестве ссылки в их полном объеме в той же самой степени, как если бы каждая из них была конкретно и индивидуально указана как включенная в качестве ссылки. Любое противоречие между любой цитированной здесь ссылкой и конкретными описаниями данной заявки должны решаться в пользу последней. Подобно этому, любое противоречие между признаваемым в данной области определением слова или фразы и определением слова или фразы, конкретно даваемыми в данном описании, должно решаться в пользу последнего. Стандартные ссылочные работы, излагающие общие принципы технологии рекомбинантных ДНК,известные специалистам с квалификацией в данной области, включают в себя Ausubel et al. CURRENTMUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press, Oxford (1991). Данное изобретение описывает нуклеиновые кислоты BAFF-R, изолированные нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептид BAFF-R или его часть, полипептиды BAFF-R, векторы, содержащие эти нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, трансформированные этими нуклеиновыми кислотами BAFF-6 012833R, антитела против BAFF-R и фармацевтические композиции. Описаны также способы получения полипептидов BAFF-R, а также способы скрининга, диагностики, лечения состояний с использованием этих соединений и способы скрининга соединений, которые модулируют активность полипептида BAFF-R. Нуклеиновые кислоты и полипептиды BAFF-R, а также BAFF-R-антитела, а также фармацевтические композиции, обсуждаемые здесь, применимы, inter alia, для лечения рака и/или иммунорегуляторных состояний. Эти нарушения включают в себя, например, опосредованные В-клетками заболевания,которые являются аутоиммунными по природе, такие как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, тяжелая псевдопаралитическая миастения, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, антифосфолипидный синдром, болезнь Шагаса, болезнь Грейвса,гранулематоз Вегенера, нодозный полиартериит и быстро прогрессирующий гломерулонефрит. Этот терапевтический агент имеет также применение при нарушениях плазматических клеток, таких как множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь с поражением тяжелых цепей иммуноглобулина, первичный или иммуноцитассоциированный амилоидоз и моноклональная гаммапатия неустановленной этиологии (MGUS). Онкологические мишени включают в себя В-клеточные карциномы, лейкозы и лимфомы. Нуклеиновые кислоты BAFF-R. Один аспект данного изобретения относится к изолированным молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют белки BAFF-R или их биологически активные части. Включены также фрагменты нуклеиновых кислот, достаточные для их использования в качестве гибридизационных зондов для идентификации BAFF-R-кодирующих нуклеиновых кислот (например, мРНК BAFF-R), или фрагменты для использования в качестве праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации или мутации молекул нуклеиновых кислот BAFF-R. В применении здесь термин молекула нуклеиновой кислоты включает в себя молекулы ДНК (например, кДНК или геномную ДНК), молекулы РНК (например,мРНК), аналоги ДНК или РНК, генерируемые с использованием аналогов нуклеотидов, и их производные, фрагменты и гомологи. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Термин зонды относится к последовательностям нуклеиновых кислот вариабельной длины, предпочтительно между по меньшей мере 10 нуклеотидами (нт) или приблизительно, например, 6000 нт, в зависимости от применения. Зонды используют для детектирования идентичных, сходных или комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот. Зонды большей длины обычно получают из природного или рекомбинантного источника, они являются высокоспецифическими и гибридизуются гораздо медленнее, чем олигомеры. Зонды могут быть одно- или двухцепочечными и конструируются таким образом, чтобы они имели специфичность в ПЦР, способах гибридизации на основе мембраны илиELISA-подобных способах. Изолированной молекулой нуклеиновой кислоты называют молекулу, которая отделена от других молекул нуклеиновых кислот, которые присутствуют в природном источнике данной нуклеиновой кислоты. Примеры изолированных молекул нуклеиновых кислот включают в себя, но не ограничиваются ими, рекомбинантные молекулы ДНК, содержащиеся в векторе, рекомбинантные молекулы ДНК, поддерживаемые в гетерологичной клетке-хозяине, частично или по существу очищенные молекулы нуклеиновых кислот и синтетические ДНК- или РНК-молекулы. Предпочтительно изолированная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательностей, которые природно фланкируют эту нуклеиновую кислоту (т.е. последовательностей, локализованных на 5'- и 3'-концах этой нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена данная нуклеиновая кислота. Например, в различных вариантах изолированная молекула нуклеиновой кислоты BAFF-R может содержать менее чем приблизительно 50 т.п.н., 25 т.п.н., 5 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 2 т.п.н., 1 т.п.н., 0,5 т.п.н. или 0,1 т.п.н. нуклеотидных последовательностей, которые природно фланкируют данную молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой получена эта нуклеиновая кислота. Кроме того, изолированная молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, может, по существу, не содержать другого клеточного материала или культуральной среды при получении рекомбинантными способами или при получении из химических предшественников при химическом синтезе. Молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения, например молекула нуклеиновой кислоты,имеющая нуклеотидную последовательность фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B (SEQ ID NO:2), фиг. 2 А(SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6) или комплемент любой из этих нуклеотидных последовательностей, может быть изолирована с использованием стандартных способов молекулярной биологии и обеспеченной здесь информации о последовательностях. С использованием полных последовательностей или части последовательностей нуклеиновых кислот фиг. 1 А, В, 2 А, С и 3 в качестве гибридизационного зонда, последовательности нуклеиновых кислот BAFF-R могут быть изолированы с использованием стандартной гибридизации и стандартных способов клонирования (например, как описано в Sambrook et al., Eds., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2ND ED., Cold SpringMOLECULAR BIOLOGY, John WileySons, New York, NY, 1993). Нуклеиновая кислота данного изобретения может быть амплифицирована с использованием кДНК,-7 012833 мРНК или, альтернативно, геномной ДНК в качестве матрицы и подходящих олигонуклеотидных праймеров в соответствии со стандартными способами ПЦР-амплификации. Амплифицированная таким образом нуклеиновая кислота может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована анализом секвенирования ДНК. Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие нуклеотидным последовательностям BAFF-R, могут быть получены стандартными синтетическими способами, например, с использованием автоматического ДНК-синтезатора. В применении здесь термин олигонуклеотид относится к ряду связанных нуклеотидных остатков,причем олигонуклеотид имеет достаточное число нуклеотидных оснований для использования в ПЦРреакции. Короткая олигонуклеотидная последовательность может быть основана на геномной или кДНКпоследовательности или сконструирована из геномной или кДНК-последовательности и использована для амплификации, подтверждения или выявления присутствия идентичной, сходной или комплементарной ДНК или РНК в конкретной клетке или ткани. Олигонуклеотиды включают части последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие, по меньшей мере, приблизительно 10 нуклеотидов и так много,как 50 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 15-30 нуклеотидов. Они могут быть синтезированы химически и могут быть использованы в качестве зондов. В другом варианте изолированная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементом нуклеотидной последовательности,показанной на фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1 В (SEQ ID NO:2), фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ IDNO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6). В другом варианте изолированная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементом нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1 В (SEQ ID NO:2), фиг. 2 А (SEQ IDNO:3), фиг. 2C (SEQ ID NO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6), или частью этой нуклеотидной последовательности. Молекула нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B (SEQ ID NO:2), фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2C (SEQ IDNO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6), является последовательностью, которая является достаточно комплементарной нуклеотидной последовательности, показанной на фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B (SEQ IDNO:2), фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6), чтобы она могла связываться водородными связями с малым количеством ошибочных спариваний или вообще без ошибочных спариваний с нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B (SEQID NO:2), фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6), с образованием посредством этого стабильного дуплекса. В применении здесь термин комплементарное относится к спариванию оснований по УотсонуКрику или Хугстину между нуклеотидными звеньями молекулы нуклеиновой кислоты, и термин связывание означает физическое или химическое взаимодействие между двумя полипептидами или соединениями или связанными полипептидами или соединениями или их комбинациями. Связывание включает в себя ионные, неионные, ван-дер-ваальсовы, гидрофобные взаимодействия и т.д. Физическое взаимодействие может быть либо прямым, либо опосредованным. Непрямые взаимодействия могут происходить посредством или вследствие действий другого полипептида или соединения. Прямым связыванием называют взаимодействия, которые не происходят через посредство или не опосредованы действием другого полипептида или соединения, а осуществляются без других существенных химических промежуточных продуктов. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения может включать только часть последовательности нуклеиновой кислоты фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B (SEQ ID NO:2), фиг. 2 А (SEQ IDNO:3), фиг. 2C (SEQ ID NO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6), например, фрагмент, который может быть использован в качестве зонда или праймера, или фрагмент, кодирующий биологически активную часть BAFF-R. Обеспеченные здесь фрагменты определяются как последовательности с длиной по меньшей мере из 6 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов или по меньшей мере 4 непрерывно следующих друг за другом аминокислот, достаточной для возможности специфической гибридизации в случае нуклеиновых кислот или для специфического узнавания эпитопа в случае аминокислот, соответственно, и они являются в лучшем случае меньшими, чем полноразмерная последовательность. Фрагменты могут быть получены из любой непрерывной части предпочтительной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности. Производными являются последовательности нуклеиновых кислот или аминокислотные последовательности, образованные из природных соединений либо непосредственно, либо модификацией, либо частичной заменой. Аналогами являются последовательности нуклеиновых кислот или аминокислотные последовательности, которые имеют структуру, сходную, но не идентичную относительно природного соединения, но отличаются от нее в отношении определенных компонентов или боковых цепей. Аналоги могут быть синтетическими или иметь отличающееся эволюционное происхождение и могут иметь сходную или противоположную метаболическую активность по сравнению с активностью дикого типа. Производные и аналоги могут быть полноразмерными или иметь другую длину, если производное или аналог содержит модифицированный нуклеотид или аналог модифицированной аминокислоты, как описано ниже. Производные и аналоги нуклеиновых кислот или белков данного изобретения включают в-8 012833 себя, но не ограничиваются ими, молекулы, включающие районы, которые являются, по существу, гомологичными относительно нуклеиновых кислот или белков данного изобретения, с идентичностью в различных вариантах, равной по меньшей мере приблизительно 45, 50, 70, 80, 95, 98 или даже 99% (с предпочтительной идентичностью 80-99%) относительно последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности идентичного размера или при сравнении с сопоставленной последовательностью, когда сопоставление производят с использованием компьютерной программы гомологии,известной в данной области, или кодирующая нуклеиновая кислота которых способна гибридизоваться с комплементом последовательности, кодирующей вышеупомянутые белки, при жестких, умеренно жестких условиях или при условиях низкой жесткости. См., например, Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John WileySons, New York, NY, 1993 и приведенные ниже ссылки. Примером такой программы является Gap (Гэп)-программа (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI) с использованием установок по умолчанию, которые используют алгоритм Смита и Уотермана (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489, которая включена здесь ссылкой в ее полном виде. Гомологичная последовательность нуклеиновой кислоты, или гомологичная аминокислотная последовательность, или их вариации обозначают последовательности, характеризующиеся гомологией на нуклеотидном уровне или на уровне аминокислот, как обсуждалось выше. Гомологичные нуклеотидные последовательности кодируют последовательности изоформ полипептида BAFF-R. Изоформы могут экспрессироваться в различных тканях одного организма в результате, например, альтернативного сплайсинга РНК. Альтернативно, изоформы могут кодироваться различными генами. В данном изобретении гомологичные нуклеотидные последовательности включают в себя нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид BAFF-R других видов, чем человек, в том числе, но не только, млекопитающих, и,следовательно, эти виды могут включать в себя, например, мышь, крысу, кролика, собаку, кошку, корову, лошадь и другие организмы. Гомологичные нуклеотидные последовательности включают в себя также, но не ограничиваются ими, природно встречающиеся аллельные вариации и мутации представленных здесь нуклеотидных последовательностей. Однако гомологичная нуклеотидная последовательность не включает в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую белок BAFF-R человека. Гомологичные последовательности нуклеиновых кислот включают в себя те нуклеотидные последовательности,которые кодируют консервативные аминокислотные замены (см. ниже) на фиг. 2D (SEQ ID NO:5), а также полипептид, имеющий BAFF-R-активность. Гомологичная аминокислотная последовательность не кодирует аминокислотную последовательность полипептида BAFF-R человека. Нуклеотидная последовательность, определенная из клонирования гена BAFF-R человека, позволяет генерировать зонды и праймеры, сконструированные для применения в идентификации и/или клонировании гомологов BAFF-R в других клеточных типах, например из других тканей, а также гомологовBAFF-R из других млекопитающих. Зонд/праймер обычно содержит, по существу, очищенный олигонуклеотид. Этот олигонуклеотид обычно включает район нуклеотидной последовательности, который гибридизуется при жестких условиях, по меньшей мере, с состоящей из приблизительно 12, 25, 50, 100,150, 200, 250, 300, 350 или 400 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательностью смысловой цепи любой из последовательностей фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B (SEQID NO:2), фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2C (SEQ ID NO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6), или нуклеотидной последовательностью антисмысловой цепи любой из последовательностей фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B(SEQ ID NO:2), фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6) или природно встречающимся мутантом любой из последовательностей фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B (SEQ IDNO:2), фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6). Зонды на основе нуклеотидной последовательности BAFF-R человека могут быть использованы для детектирования транскриптов или геномных последовательностей, кодирующих тот же самый или гомологичные белки. В различных вариантах этот зонд дополнительно включает присоединенную к нему группу метки, например, эта группа метки может быть радиоизотопом, флуоресцентным соединением,ферментом или кофактором фермента. Такие зонды могут быть использованы в качестве части набора для диагностического теста для идентификации клеток или ткани, которые неправильно экспрессируют белок BAFF-R, например, посредством измерения уровня кодирующей BAFF-R нуклеиновой кислоты в пробе клеток из субъекта, например, детектированием уровня мРНК BAFF-R или определением, был ли геномный ген BAFF-R мутирован или делетирован. Термин полипептид, имеющий биологически активную часть BAFF-R, обозначает полипептиды,проявляющие активность, сходную, но необязательно идентичную, с активностью полипептида данного изобретения, в том числе зрелых форм, при измерении в конкретном биологическом анализе, с зависимостью от дозы или без зависимости от дозы. Фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий биологически активную часть BAFF-R, может быть получен изолированием части любой последовательности из фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B (SEQ ID NO:2), фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4) и фиг. 3 (SEQID NO:6), которая кодирует полипептид, имеющий биологическую активность BAFF-R (биологические активности белков BAFF-R описаны ниже), экспрессией этой кодируемой части белка BAFF-R (напри-9 012833 мер, рекомбинантной экспрессией in vitro) и оценкой активности кодируемой части BAFF-R. Например,фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий биологически активную часть BAFF-R, может необязательно включать в себя домен связывания BAFF. В другом варианте фрагмент нуклеиновой кислоты,кодирующий биологически активную часть BAFF-R, включает в себя один или несколько районов. Варианты BAFF-R. Далее данное изобретение включает в себя молекулы нуклеиновых кислот, которые отличаются от нуклеотидных последовательностей, показанных на фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B (SEQ ID NO:2), фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6), вследствие вырожденности генетического кода. Таким образом, эти нуклеиновые кислоты кодируют тот же самый белок BAFF-R, который кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной на фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B (SEQ IDNO:2), фиг. 2A (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6). В другом варианте изолированная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения имеет нуклеотидную последовательность,кодирующую белок, имеющий аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2D (SEQ IDNO:5). Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что, кроме нуклеотидной последовательности BAFF-R человека, показанной в любой из последовательностей фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B (SEQ ID NO:2), фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6), полиморфизмы последовательности ДНК, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностяхBAFF-R, могут существовать в популяции (например, популяции человека). Такой генетический полиморфизм в гене BAFF-R может существовать среди индивидуумов в популяции вследствие природной аллельной вариации. В применении здесь термины ген и рекомбинантный ген обозначают молекулы нуклеиновой кислоты, включающие открытую рамку считывания, кодирующую белок BAFF-R, предпочтительно белок BAFF-R млекопитающего. Такие природные аллельные вариации могут обычно приводить к 1-5% отклонению в нуклеотидной последовательности гена BAFF-R. Предполагается, что любые и все подобные нуклеотидные вариации и возникающие в результате полиморфизмы аминокислот вBAFF-R, которые являются результатом природной аллельной вариации и которые не изменяют функциональную активность BAFF-R, входят в объем данного изобретения. Кроме того, предполагается, что молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие белки BAFF-R из других видов и, следовательно, имеющие нуклеотидную последовательность, которая отличается от последовательностей человека фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B (SEQ ID NO:2), фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6), находятся в объеме данного изобретения. Молекулы нуклеиновых кислот, соответствующие природным аллельным вариантам и гомологам кДНК BAFF-R данного изобретения, могут быть изолированы на основе их гомологии с нуклеиновыми кислотами BAFF-R человека, описанными здесь, с использованием кДНК у человека или ее части, в виде гибридизационного зонда в соответствии со стандартными способами гибридизации при жестких условиях гибридизации. Например, кДНК растворимого BAFF-R человека может быть изолирована на основе его гомологии с мембраносвязанным BAFF-R человека. Подобным образом, кДНК мембраносвязанного BAFF-R человека может быть изолирована на основе его гомологии с растворимым BAFF-R человека. Таким образом, в другом варианте изолированная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения имеет длину по меньшей мере 6 нуклеотидов и гибридизуется при жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность любой из последовательностей фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B (SEQ ID NO:2), фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4) и фиг. 3(SEQ ID NO:6). В другом варианте эта нуклеиновая кислота имеет длину по меньшей мере 10, 25, 50,100, 250 или 500 нуклеотидов. В другом варианте изолированная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения гибридизуется с кодирующим районом. В применении здесь термин гибридизуется при жестких условиях предназначен для описания условий гибридизации и промывки, при которых нуклеотидные последовательности по меньшей мере на 60% гомологичные друг другу, обычно остаются гибридизованными друг с другом. Гомологи (т.е. нуклеиновые кислоты, кодирующие белки BAFF-R, происходящие из видов, иных,чем человек) или другие родственные последовательности (например, паралоги) могут быть получены с использованием условий гибридизации низкой, умеренной или высокой жесткости с полной конкретной последовательностью человека или с частью этой последовательности в качестве зонда с использованием способов, хорошо известных в данной области для гибридизации и клонирования нуклеиновых кислот. В применении здесь фраза жесткие условия гибридизации обозначает условия, при которых зонд,праймер или олигонуклеотид будет гибридизоваться с его последовательностью-мишенью, но не с другими последовательностями. Жесткие условия являются последовательность-зависимыми и будут различными в различных обстоятельствах. Более длинные последовательности гибридизуются специфически при более высоких температурах, чем более короткие последовательности. Обычно жесткие условия выбирают таким образом, чтобы температура была приблизительно на 5 С ниже, чем точка плавления(Tm) для этой конкретной последовательности при определенных ионной силе и рН. Tm является температурой (при определенных ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных последовательности-мишени, гибридизуются с последовательностью- 10012833 мишенью при равновесии. Поскольку последовательности-мишени обычно присутствуют в избытке, приTm, 50% этих зондов занимают мишень при равновесии. Обычно жесткими условиями будут условия, в которых концентрация соли равна менее чем приблизительно 1,0 М ион натрия, обычно приблизительно 0,01-1,0 М ион натрия (или других солей) при рН 7,0-8,3, а температура равна по меньшей мере приблизительно 30 С для коротких зондов, праймеров или олигонуклеотидов (например, 10 нуклеотидов-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60 С для более длинных зондов, праймеров и олигонуклеотидов. Жесткие условия могут быть также достигнуты с добавлением дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Жесткие условия известны специалистам в данной области и могут быть найдены в CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John WileySons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Предпочтительно эти условия являются такими, что последовательности по меньшей мере на приблизительно 65, 70, 75,85, 90, 95, 98 или 99% гомологичные друг с другом, обычно остаются гибридизованными друг с другом. Неограничивающим примером жестких условий гибридизации является гибридизация в высокосолевом буфере, содержащем 6SSC, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 1 мМ ЭДТА, 0,02% ПВП, 0,02 Фиколл, 0,02% БСА и 500 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося при 65 С. За этой гибридизацией следуют одна или несколько промывок в 0,2SSC, 0,01% БСА при 50 С. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения, которая гибридизуется при жестких условиях с последовательностями SEQ IDNO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, соответствует природно встречающейся молекуле нуклеиновой кислоты. В применении здесь природно встречающаяся молекула нуклеиновой кислоты обозначает молекулу РНК или ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность, которая встречается в природе (например, кодирует природный белок). Во втором варианте обеспечена последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность любой из последовательностей фиг. 1 А (SEQ ID NO:1), фиг. 1B (SEQ ID NO:2), фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ IDNO:4) и фиг. 3 (SEQ ID NO:6) или ее фрагментами, аналогами или производными, в условиях умеренной жесткости. Неограничивающим примером условий гибридизации умеренной жесткости является гибридизация в 6SSC, 5 растворе Денхардта, 0,5% ДСН и 100 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося при 55 С, с последующими одной или несколькими промывками в 1SSC, 0,1% ДСН при 37 С. Другие условия умеренной жесткости, которые могут быть использованы, хорошо известны в данной области. См., например, Ausubel et al., Eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John WileySons, NY, 1993; and Kriegler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY, 1990. В третьем варианте обеспечена нуклеиновая кислота, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность любой из последовательностей фиг. 1 АNO:6), или ее фрагментами, аналогами или производными в условиях низкой жесткости. Неограничивающим примером условий гибридизации низкой жесткости является гибридизация в 35% формамиде,5SSC, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 5 мМ ЭДТА, 0,02% ПВП, 0,02% Фиколле, 0,2% БСА, 100 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, 10% (мас./об.) декстрансульфате при 40 С, с последующими одной или несколькими промывками в 2SSC, 25 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 5 мМ ЭДТА и 0,1% ДСН при 50 С. Другие условия низкой жесткости, которые могут быть использованы, хорошо известны в данной области (например, используемые для межвидовых гибридизаций). См., например, Ausubel et al., Eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John WileySons, NY, 1993; and Kriegler, GENEWeinberg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792. Консервативные мутации. Специалисту с квалификацией в данной области будет также понятно, что, кроме природно встречающихся аллельных вариантов последовательности BAFF-R, которые могут существовать в популяции,изменения могут быть введены мутацией в нуклеотидную последовательность фиг. 2 А (SEQ ID NO:3),фиг. 2 С (SEQ ID NO:4), фиг. 3 (SEQ ID NO:6), что приводит к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемого белка BAFF-R, без изменения функциональной активности этого белка BAFF-R. Например, нуклеотидные замены, приводящие к аминокислотным заменам в ненезаменимых аминокислотных остатках, могут быть произведены в последовательности любой из фиг. 2 А (SEQ ID NO:3),фиг. 2 С (SEQ ID NO:4), фиг. 3 (SEQ ID NO:6). Ненезаменимым аминокислотным остатком является остаток, который может быть изменен, из последовательности дикого типа BAFF-R без изменения биологической активности, тогда как незаменимый аминокислотный остаток является необходимым для биологической активности. Например, предсказывается, что аминокислотные остатки, которые являются консервативными среди белков BAFF-R данного изобретения, являются особенно неподдающимися изменению. Кроме того, предсказывается также, что аминокислотные остатки, которые являются консервативными среди членов семейства белков BAFF-R данного изобретения, являются также особенно не под- 11012833 дающимися изменению. Например, белки BAFF-R данного изобретения могут содержать по меньшей мере один домен, который обычно является консервативным районом в членах семейства TNF. Как таковые, эти консервативные домены, по-видимому, не поддаются мутации. Однако другие аминокислотные остатки (например, остатки, которые не являются консервативными или являются только полуконсервативными среди членов белков BAFF-R), могут не быть незаменимыми для активности и, следовательно,могут быть, по-видимому, поддающимися изменению. Другой аспект данного изобретения относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим белки BAFF-R, которые содержат изменения аминокислотных остатков, которые не являются незаменимыми для активности. Такие белки BAFF-R отличаются по аминокислотной последовательности от аминокислотной последовательности из фиг. 2D (SEQ ID NO:5), но все еще сохраняют биологическую активность. В одном варианте изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, причем этот белок включает аминокислотную последовательность по меньшей мере на приблизительно 45% гомологичную аминокислотной последовательности фиг. 2D(SEQ ID NO:5). Предпочтительно белок, кодируемый этой молекулой нуклеиновой кислоты, является по меньшей мере на приблизительно 60% гомологичным последовательности, по меньшей мере на приблизительно 70, 80, 90, 95, 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 99% гомологичным последовательности фиг. 2D (SEQ ID NO:5). Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок BAFF-R, гомологичный белку фиг. 2D, может быть создана введением одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений или делеций в нуклеотидную последовательность фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4), фиг. 3 (SEQID NO:6), так что одна или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций вводятся в кодируемый белок. Мутации могут быть введены в фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2C (SEQ ID NO:4) или фиг. 3 (SEQ IDNO:6), например, стандартными способами, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦРопосредованный мутагенез. Предпочтительно, производят консервативные замены аминокислот в одном или нескольких предсказанных ненезаменимых аминокислотных остатках. Консервативной аминокислотной заменой является замена, при которой аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, предсказанный ненезаменимый аминокислотный остаток в BAFF-R заменяют другим аминокислотным остатком из того же самого семейства боковых цепей. Альтернативно, в другом варианте мутации могут вводиться случайным образом вдоль всей или части кодирующей цепи для BAFF-R, например насыщающим мутагенезом, и полученные мутанты могут быть подвергнуты скринингу на биологическую активность BAFF-R для идентификации мутантов, которые сохраняют активность. После мутагенеза любой из последовательностей фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4), фиг. 3 (SEQ ID NO:6) кодируемый белок может быть экспрессирован любым рекомбинантным способом, известным в данной области, и может быть определена активность этого белка. В одном варианте мутантный белок BAFF-R может быть испытан на(1) способность формировать взаимодействия по типу белок-белок с другими белками BAFF-R,другими белками клеточной поверхности или их биологически активными частями;(2) образование комплекса между мутантным белком BAFF-R и лигандом BAFF-R;(3) способность мутантного белка BAFF-R связываться с внутриклеточным белком-мишенью или его биологически активной частью (например, белками авидина);(5) способность специфически связывать антитело против белка BAFF-R. Данное изобретение обеспечивает специфические мутанты, кодирующие полипептид BAFF-R:Fc,сконструированные для ослабления агрегации экспрессируемого белка при сохранении активности связывания BAFF. Такие мутанты включают в себя, например, клоны, кодирующие аминокислотные последовательности JST661 (SEQ ID NO:17), JST662 (SEQ ID NO:18), JST663 (SEQ ID NO:19), JST673 (SEQ IDNO:24), JST671 (SEQ ID NO:25), JST677 (SEQ ID NO:26) и JST678 (SEQ ID NO:27). Другие варианты включают в себя мутанты, кодирующие полипептид BAFF-R или BAFF-R:Fc, который имеет характеристики агрегации, сходные с природным полипептидом BAFF-R человека или BAFF-R:Fc, но также связывают BAFF, в том числе, например, последовательности, включающие аминокислотные последовательности JST659 (SEQ ID NO:15), JST660 (SEQ ID NO:16), JST664 (SEQ ID NO:28), JST668 (SEQ ID- 12012833 включают в себя мутанты, кодирующие полипептид BAFF-R или BAFF-R:Fc, где консервативные аминокислоты между BAFF-R человека и мыши заменены на другие консервативные аминокислоты и где сохраняется связывающая активность полипептида BAFF-R или BAFF-R:Fc в отношении BAFF. В других вариантах мутанты кодируют полипептид BAFF-R или BAFF-R:Fc, имеющий аминокислоты, которые не являются консервативными между BAFF-R человека и мыши, которые были заменены на другие аминокислоты. Предпочтительно по меньшей мере одна неполярная аминокислота заменена на остаток пролина или на незаряженную полярную аминокислоту. Антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот. Другой аспект данного изобретения относится к изолированным антисмысловым молекулам нуклеиновых кислот, которые могут гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность фиг. 2 А, С, 3, или ее фрагментами, аналогами или производными, или являются комплементарными этой молекуле нуклеиновой кислоты, или ее фрагментам, аналогам или производным. Антисмысловая нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна смысловой нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, например комплементарна кодирующей цепи двухцепочечной кДНК-молекулы или комплементарна мРНК-последовательности. В специфических аспектах обеспечены антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот, которые включают последовательность, комплементарную по меньшей мере приблизительно 10, 25, 50, 100, 250 или 500 нуклеотидам или всей кодирующей цепи BAFF-R или только ее части. Дополнительно обеспечены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие фрагменты, гомологи, производные и аналоги белка BAFFR любого из фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2C (SEQ ID NO:4), фиг. 3 (SEQ ID NO:6), или антисмысловые нуклеиновые кислоты, комплементарные последовательности нуклеиновой кислоты BAFF-R любой из фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4), фиг. 3 (SEQ ID NO:6). В одном варианте антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты является антисмысловой относительно кодирующего района кодирующей цепи нуклеотидной последовательности, кодирующейBAFF-R. Термин кодирующий район обозначает район нуклеотидной последовательности, включающий кодоны, которые транслируются в аминокислотные остатки (например, кодирующий белок район,BAFF-R человека соответствует нуклеотидам 13-568 фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), или нуклеотидам 13-565 фиг. 2 С (SEQ ID NO:4), или нуклеотидам 298-849 фиг. 3 (SEQ ID NO:6. В другом варианте антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты является антисмысловой относительно некодирующего района кодирующей цепи нуклеотидной последовательности, кодирующей BAFF-R. Термин некодирующий район обозначает 5'- и 3'-последовательности, которые фланкируют кодирующий район, которые не транслируются в аминокислоты (т.е. называемые также 5'- и 3'-нетранслируемыми районами). При условии, что последовательности кодирующей цепи, кодирующей BAFF-R, описаны здесь, антисмысловые нуклеиновые кислоты данного изобретения могут быть сконструированы в соответствии с правилами спаривания оснований Уотсона и Крика или Хугстина. Антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты может быть комплементарной всему кодирующему району мРНК BAFF-R, но более предпочтительно является олигонуклеотидом, который является антисмысловым относительно только части кодирующего или некодирующего района мРНК BAFF-R. Например, антисмысловой олигонуклеотид может быть комплементарным району, окружающему сайт начала трансляции мРНК BAFF-R. Антисмысловой олигонуклеотид может иметь длину, например, приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов. Антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения может быть сконструирована с использованием химического синтеза или реакций ферментативного лигирования с использованием процедур, известных в данной области. Например, антисмысловая нуклеиновая кислота(например, антисмысловой олигонуклеотид) может быть химически синтезирована с использованием природно встречающихся нуклеотидов или различным образом модифицированных нуклеотидов, предназначенных для увеличения биологической стабильности этих молекул или для увеличения физической стабильности дуплекса, образуемого между антисмысловой и смысловой нуклеиновыми кислотами, например, могут использоваться фосфоротиоатные производные и замещенные акридином нуклеотиды. Примеры модифицированных нуклеотидов, которые могут быть использованы для генерирования антисмысловой нуклеиновой кислоты, включают в себя 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5 иодурацил, гипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, бета-D-галактозилквеозин, инозин, N6-изопентениладенин, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2 метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-аденин, 7-метилгуанин, 5 метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеозин, 5'-метоксикарбоксиметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6-изопентениладенин, урацил-5-оксиуксусную кислоту (v), вибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4 тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, 5-метил-2-тиоурацил, 3-(3 амино-3-N-2-карбоксипропил)урацил, (acp3)w и 2,6-диаминопурин. Альтернативно, антисмысловая нуклеиновая кислота может быть получена биологически с использованием экспрессирующего вектора, в который была субклонирована нуклеиновая кислота в антисмысловой ориентации (т.е. РНК, транскрибированная из инсертированной нуклеиновой кислоты, будет иметь антисмысловую ориентацию относи- 13012833 тельно представляющей интерес нуклеиновой кислоты, описанной дополнительно в следующем подразделе). Антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения обычно вводят субъекту или генерируют in situ таким образом, что они гибридизуются или связываются с клеточной мРНК и/или геномной ДНК, кодирующей белок BAFF-R, ингибируя тем самым экспрессию этого белка, например, ингибированием транскрипции и/или трансляции. Эта гибридизация может происходить посредством обычной комплементарности нуклеотидов с образованием стабильного дуплекса или, например, в случае антисмысловой молекулы нуклеиновой кислоты, которая связывается с ДНК-дуплексами, посредством специфических взаимодействий в основной бороздке двойной спирали. Пример способа введения антисмысловых молекул нуклеиновых кислот данного изобретения включает в себя прямую инъекцию в участок ткани. Альтернативно, антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот могут быть модифицированы для выбранных клеток-мишеней и затем введены системно. Например, для системного введения антисмысловые молекулы могут быть модифицированы таким образом, что они специфически связываются с рецепторами или антигенами, экспрессируемыми на выбранной клеточной поверхности, например, посредством связывания антисмысловых молекул нуклеиновых кислот с пептидами или антителами, которые связываются с рецепторами или антигенами клеточной поверхности. Антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот могут также доставляться в клетки с использованием описанных здесь векторов. Для достижения достаточных внутриклеточных концентраций антисмысловых молекул предпочтительными являются векторные конструкции, в которых антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты помещена под контроль сильного промотора pol II или pol III. Еще в одном варианте антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения является -аномерной молекулой нуклеиновой кислоты, -аномерная молекула нуклеиновой кислоты образует специфические двухцепочечные гибриды с комплементарной РНК, в которых, в противоположность обычным -звеньям, цепи идут параллельно друг другу (Gaultier et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15:66256641). Антисмысловая молекула нуклеиновой кислоты может также содержать 2'-О-метилрибонуклеотидFEBS Lett. 215:327-330). Рибозимы и ПНК-радикалы. Еще в одном варианте антисмысловой нуклеиновой кислотой данного изобретения является рибозим. Рибозимы являются каталитическими РНК-молекулами с рибонуклеазной активностью, которые способны расщеплять одноцепочечную нуклеиновую кислоту, такую как мРНК, относительно которой они имеют комплементарный район. Таким образом, рибозимы (например, молотоголовые рибозимы,описанные в Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591) могут быть использованы для каталитического расщепления мРНК-транскриптов BAFF-R для ингибирования посредством этого трансляции мРНК BAFF-R. Рибозим, имеющий специфичность в отношении BAFF-R-кодирующей нуклеиновой кислоты, может быть сконструирован на основе описанной здесь нуклеотидной последовательности ДНКBAFF-R (т.е. SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6). Например, может быть сконструировано производное РНК Tetrahymena L-19 IVS, в котором нуклеотидная последовательность активного сайта является комплементарной нуклеотидной последовательности, которая должна быть расщеплена, в BAFF-Rкодирующей мРНК. См., например, Cech et al. U.S. Pat. No. 4987071; и Cech et al. патент США 5116742. Альтернативно, мРНК BAFF-R может быть использована для отбора каталитической РНК,имеющей специфическую рибонуклеазную активность, из пула РНК-молекул. См., например, Bartel et al.,(1993) Science 261:1411-1418. Альтернативно, экспрессия гена BAFF-R может быть ингибирована нацеливанием нуклеотидных последовательностей, комплементарных регуляторному району BAFF-R (например, промотору BAFF-R и/или энхансерам BAFF-R) с образованием тройных спиральных структур, которые предотвращают транскрипцию гена BAFF-R в клетках-мишенях. См. в общем Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6:56984; Helene et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; и Maher (1992) Bioassays 14:807-15. В различных вариантах нуклеиновые кислоты BAFF-R могут быть модифицированы в части основания, сахарной части или фосфатном скелете молекулы для улучшения, например, стабильности, гибридизации или растворимости этой молекулы. Например, дезоксирибозофосфатный скелет нуклеиновых кислот может быть модифицирован для генерирования пептиднуклеиновых кислот (см. Hyrap et al.(1996) Bioorg. Med. Chem. 4:5-23). В применении здесь термины пептиднуклеиновые кислоты или ПНК обозначают миметики нуклеиновых кислот, например, ДНК-миметики, в которых дезоксирибозофосфатный скелет заменен псевдопептидным скелетом и сохранены только четыре природных нуклеооснования. Было показано, что нейтральный скелет ПНК делает возможной специфическую гибридизацию с ДНК и РНК в условиях низкой ионной силы. Синтез ПНК-олигонуклеотидов можно выполнять с использованием протоколов стандартного твердофазного пептидного синтеза, описанных в Hyrap et al.(1996) Bioorg. Med. Chem. 4:5-23; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675. ПНК BAFF-R могут быть использованы для терапевтических и диагностических применений. Например, ПНК могут быть использованы в качестве антисмысловых или антигенных агентов для последо- 14012833 вательность-специфической модуляции экспрессии генов, например, индукцией остановки транскрипции или трансляции или ингибированием репликации. ПНК BAFF-R могут быть также использованы, например, в анализе мутаций единственной пары оснований в гене посредством, например, ПНКнаправляемого образования ПЦР-клэмпа; в качестве искусственных рестриктаз при применении в комбинации с другими ферментами, например, S1-нуклеазами (Hyrup В. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4:523), или в качестве зондов или праймеров для ДНК-последовательности и гибридизации (Hyrup et al.,(1996), Bioorg. Med. Chem. 4:5-23; Perry-O'Keefe (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675). В другом варианте ПНК BAFF-R могут быть модифицированы, например, для усиления их стабильности или клеточного поглощения, присоединением липофильных или других вспомогательных групп к ПНК с образованием ПНК-ДНК-химер или с использованием липосом или других способов доставки лекарственных средств, известных в данной области. Например, могут быть получены ПНК-ДНКхимеры BAFF-R, которые могут объединять полезные свойства ПНК и ДНК. Такие химеры позволяют узнающим ДНК ферментам, например РНКазе и ДНК-полимеразам, взаимодействовать с ДНК-частью,тогда как ПНК-часть обеспечивает высокую аффинность связывания и специфичность. ПНК-ДНКхимеры могут быть связаны с использованием линкеров подходящей длины, выбранных в зависимости от стекинга оснований, числа связей между нуклеооснованиями и ориентации (Hyrup (1996) Bioorg. Med.Chem. 4:5-23; and Finn et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24:3357-63. Например, цепь ДНК может быть синтезирована на твердом носителе с использованием стандартного способа фосфорамидитного связывания, и модифицированные нуклеозидные аналоги,например,5'-(4-метокситритил)амино-5'дезокситимидинфосфорамидит, могут быть использованы между ПНК и 5'-концом ДНК (Mag et al.(1989) Nucl. Acids Res. 17:5973-88). Затем ПНК-мономеры связывают ступенчатым образом с получением химерной молекулы с 5'-ПНК-сегментом и 3'-ДНК-сегментом (Finn et al. (1996) выше). Альтернативно, химерные молекулы могут быть синтезированы с 5'-ДНК-сегментом и 3'-ПНК-сегментом. См., например, Petersen et al. (1975) Bioorg. Med. Chem. Lett. 5:1119-11124. В других вариантах олигонуклеотид может включать в себя другие присоединенные группы, такие как пептиды (например, для нацеливания на рецепторы клетки-хозяина in vivo), или агенты, способствующие транспорту через мембрану клетки (см., например, Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT публикациюWO 88/09810) или гематоэнцефалический барьер (см., например, публикацию РСТWO 89/10134). Кроме того, олигонуклеотиды могут быть модифицированы запускаемыми гибридизацией агентами расщепления (см., например, Krol et al., (1988) BioTechniques 6:958-976) или интеркалирующими агентами (см.,например, Zon, (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Для этой цели олигонуклеотид может быть конъюгирован с другой молекулой, например, пептидом, запускаемым гибридизацией сшивающим агентом, агентом транспорта, запускаемым гибридизацией агентом расщепления и т.д. Полипептиды BAFF-R. Один из аспектов данного изобретения относится к выделенным белкам BAFF-R и их биологически активным частям или их производным, фрагментам, аналогам или гомологам. Обеспечены также полипептидные фрагменты, пригодные для применения в качестве иммуногенов для индукции BAFF-Rантител. В одном варианте природные белки BAFF-R могут быть выделены из клеток или тканейисточников при помощи подходящей схемы очистки с использованием стандартных способов очистки белков. В другом варианте белки BAFF-R получают способами рекомбинантных ДНК. Альтернативно рекомбинантной экспрессии, белок или полипептиды BAFF-R могут быть синтезированы химически с использованием стандартных способов синтеза пептидов. Выделенные или очищенные белок или его биологически активная часть, по существу, не содержат клеточного материала или других загрязняющих (примесных) белков из данной клетки или ткани-источника, из которых получен данный белок BAFF-R, или, по существу, не содержат химических предшественников или других химикалиев при химическом синтезе. Выражение по существу не содержащие клеточного материала включает в себя препараты белка BAFF-R, в которых этот белок отделен от клеточных компонентов клеток, из которых он выделен, или получен рекомбинантным путем. В одном варианте выражение по существу не содержащие клеточного материала включает в себя препараты белка BAFF-R, имеющие менее чем приблизительно 30% (по сухому весу) He-BAFF-R-белка (также называемого здесь загрязняющим (примесным) белком), более предпочтительно менее чем приблизительно 20% не-BAFF-R-белка, еще более предпочтительно менее чем приблизительно 10% нe-BAFF-Rбелка и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 5% нe-BAFF-R-белка. При получении белка BAFF-R или его биологически активной части рекомбинантным путем, он также является, по существу, свободным от культуральной среды, т.е. культуральная среда представляет менее чем приблизительно 20%, более предпочтительно менее чем приблизительно 10% и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 5% объема препарата белка. Выражение по существу не содержащие химических предшественников или других химикалиев включает в себя препараты белка BAFF-R, в которых этот белок отделен от химических предшественников или других химикалиев, которые участвуют в синтезе этого белка. В одном варианте выражение по- 15012833 существу не содержащие химических предшественников или других химикалиев включает в себя препараты белка BAFF-R, имеющие менее чем приблизительно 30% (по сухому весу) химических предшественников или нe-BAFF-R-химикалиев, более предпочтительно менее чем приблизительно 20% химических предшественников или нe-BAFF-R-химикалиев, еще более предпочтительно менее чем приблизительно 10% химических предшественников или не-BAFF-R-химикалиев и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 5% химических предшественников или нe-BAFF-R-химикалиев. Биологически активные части белка BAFF-R включают в себя пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, достаточно гомологичные или полученные из аминокислотной последовательности белка BAFF-R, например аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:5, которые включают в себя меньше аминокислот, чем полноразмерные белки BAFF-R и проявляют по меньшей мере одну активность белка BAFF-R. Обычно биологически активные части включают домен или мотив по меньшей мере с одной активностью белка BAFF-R. Биологически активная часть белка BAFF-R может быть полипептидом, который имеет длину, например по меньшей мере 10, 25, 50, 100 или более аминокислот. Биологически активная часть белка BAFF-R данного изобретения может содержать по меньшей мере один из вышеуказанных доменов, консервативных между белками BAFF-R. Альтернативная биологически активная часть белка BAFF-R может содержать по меньшей мере два из вышеуказанных доменов. Другая биологически активная часть белка BAFF-R может содержать по меньшей мере три из вышеуказанных доменов. Еще одна биологически активная часть белка BAPF-R данного изобретения может содержать по меньшей мере четыре из вышеуказанных доменов. Кроме того, другие биологически активные части, в которых делетированы другие районы данного белка, могут быть получены рекомбинантными способами и оценены на одну или несколько функциональных активностей нативного белка BAFF-R. В одном варианте белок BAFF-R имеет аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2D (SEQ ID NO:5). В других вариантах белок BAFF-R является, по существу, гомологичным фиг. 2D(SEQ ID NO:5) и сохраняет функциональную активность белка фиг. 2D (SEQ ID NO:5), но отличается по аминокислотной последовательности вследствие природной аллельной вариации или мутагенеза, как описано подробно ниже. Таким образом, в другом варианте белок BAFF-R является белком, который включает аминокислотную последовательность, гомологичную по меньшей мере на приблизительно 45% аминокислотной последовательности фиг. 2D (SEQ ID NO:5), и сохраняет функциональную активность белков BAFF-R фиг. 2D (SEQ ID NO:5). В некоторых вариантах данное изобретение включает в себя специфические мутанты полипептидаBAFF-R:Fc, сконструированного для ослабления агрегации экспрессируемого белка при сохраненииBAFF-связывающей активности. Такие мутанты включают в себя, например, клоны, кодирующие аминокислотные последовательности JST661 (SEQ ID NO:17), JST662 (SEQ ID NO:18), JST663 (SEQ IDNO:27). Другие варианты включают в себя мутанты, кодирующие полипептид BAFF-R или BAFF-R:Fc,которые имеют характеристики агрегации, сходные с нативным полипептидом BAFF-R человека илиBAFF-R:Fc, но также связывают BAFF, в том числе, например, последовательности, включающие аминокислотные последовательности JST659 (SEQ ID NO:15), JST660 (SEQ ID NO:16), JST664 (SEQ IDNO:32). Другие варианты включают в себя мутанты, кодирующие полипептид BAFF-R или BAFF-R:Fc,где консервативные аминокислоты между BAFF-R человека и мыши заменены другими консервативными аминокислотами и где сохранена связывающая активность полипептида BAFF-R или BAFF-R:Fc относительно BAFF. В других вариантах мутанты кодируют полипептид BAFF-R или BAFF-R:Fc, имеющий аминокислоты, которые не являются консервативными между BAFF-R человека и мыши, которые были заменены на другие аминокислоты. Предпочтительно неполярные аминокислоты мутированы заменой их на пролин или незаряженные полярные аминокислоты. Определение гомологии между двумя или несколькими последовательностями. Для определения процентной гомологии двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот эти последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например,могут вводиться гэпы в первой аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания со второй аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Когда положение в первой последовательности занято тем же самым аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то эти молекулы являются гомологичными в этом положении (т.е. в применении здесь гомология аминокислоты или нуклеотида эквивалентна идентичности аминокислоты или нуклеотида). Гомология последовательности нуклеиновой кислоты может быть определена как степень идентичности между двумя последовательностями. Гомология может быть определена с использованием компь- 16012833 ютерных программ, известных в данной области, таких как программа GAP (ГЭП), обеспеченная в пакете программ GCG. См. Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453. С использованием программы GAP GCG со следующими установками для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот: штраф (пенальти) за создание гэпа 5,0 и штраф (пенальти) за удлинение гэпа 0,3, кодирующий район аналогичных последовательностей нуклеиновых кислот, указанных выше, проявляет степень идентичности предпочтительно по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99%, причем CDS (кодирующая) часть последовательности ДНК показана на фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4), фиг. 3(SEQ ID NO:6). Термин идентичность последовательностей обозначает степень, в которой две полинуклеотидные или полипептидные последовательности являются идентичными на основе остаток-за-остатком на протяжении конкретного района сравнения. Процентную идентичность последовательности рассчитывают сравнением двух оптимально выравненных последовательностей на протяжении района сравнения, определением числа положений, в которых идентичные основания нуклеиновых кислот (например, А, Т, С,G, U или I, в случае нуклеиновых кислот) встречаются в обеих последовательностях, с получением совпадающих положений, делением числа совпадающих положений на общее число положений в районе сравнения (т.е. на размер окна) и умножением результата на 100 с получением процента идентичности последовательности. Термин существенная идентичность в применении здесь обозначает характеристику полинуклеотидной последовательности, где данный полинуклеотид включает последовательность,которая имеет по меньшей мере 80%-ную идентичность последовательности, предпочтительно по меньшей мере 85%-ную идентичность и часто 90-95%-ную идентичность последовательности, более обычно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности по сравнению со ссылочной последовательностью на протяжении района сравнения. Химерные и слитые белки. Данное изобретение обеспечивает также химерные или слитые белки BAFF-R. В применении здесь химерный белок или слитый белок BAFF-R включает BAFF-R-полипептид, функционально слитый с нe-BAFF-R-полипептидом. BAFF-R-полипептид обозначает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую BAFF-R, тогда как нe-BAFF-R-полипептид обозначает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую белку, который не является,по существу, гомологичным белку BAFF-R, например белку, который отличается от белка BAFF-R и который получен из того же самого или отличающегося организма. В слитом белке BAFF-R BAFF-Rполипептид может соответствовать всему белку или части белка BAFF-R. В одном варианте слитый белок BAFF-R включает по меньшей мере одну биологически активную часть белка BAFF-R. В другом варианте слитый белок BAFF-R включает по меньшей мере две биологически активные части белкаBAFF-R. Еще в одном варианте слитый белок BAFF-R включает по меньшей мере три биологически активные части белка BAFF-R. В слитом белке термин функционально связанные указывает на то, чтоBAFF-R-полипептид и нe-BAFF-R-полипептид слиты в рамке считывания друг с другом. Не-BAFF-Rполипептид может быть слит с N-концом или С-концом BAFF-R-полипептида. He-BAFF-R-полипептид может быть, например, Fc-частью антитела. Она может быть функционально присоединена либо к Nконцу, либо к С-концу BAFF-R-полипептида. Слитые с Fc-частью белки описаны в Lo et al. (1998) ProteinEnginering 11:495-500 и патент США 5541087 и 5726044, описания которых включены здесь в качестве ссылки. Например, в одном варианте слитый белок BAFF-R включает домен BAFF-R, функционально связанный с внеклеточным доменом второго белка. Такие слитые белки могут быть дополнительно использованы в скрининг-анализах на соединения, которые модулируют активность BAFF-R (такие анализы описаны подробно ниже). Еще в одном варианте слитый белок является слитым белком GST-BAFF-R, в котором последовательности BAFF-R слиты с С-концом последовательности GST (т.е. глутатион-S-трансферазы). Такие слитые белки могут облегчать очистку рекомбинантного BAFF-R. В другом варианте слитый белок является белком BAFF-R, содержащим гетерологичную сигнальную последовательность на его N-конце. Например, поскольку BAFF-R не содержит собственной сигнальной последовательности, гетерологичная сигнальная последовательность должна быть слита с 5'концом кодирующей последовательности BAFF-R для эффективной секреции слитого белка BAFF-R. Экспрессия и/или секреция BAFF-R может быть увеличена посредством использования различных гетерологичных сигнальных последовательностей. Еще в одном варианте слитый белок является слитым белком BAFF-R-иммуноглобулин, в котором последовательности BAFF-R, включающие один или несколько доменов, слиты с последовательностями,полученными из члена семейства белков иммуноглобулинов. Слитые белки BAFF-R-иммуноглобулин данного изобретения могут включаться в фармацевтические композиции и вводиться субъекту для ингибирования взаимодействия между лигандом BAFF-R и белком BAFF-R на поверхности клетки для супрессии посредством этого BAFF-R-опосредованной трансдукции сигнала in vivo. Слитые белки BAFFR-иммуноглобулин могут быть использованы для действия на биодоступность родственного BAFF-R лиганда. Ингибирование взаимодействия лиганд BAFF-R/BAFF-R может быть полезным терапевтически- 17012833 как для лечения пролиферативных и связанных с дифференцировкой нарушений, так и для модуляции(например, стимуляции или ингибирования) выживания клеток. Кроме того, слитые белки BAFF-Rиммуноглобулин данного изобретения могут быть использованы в качестве иммуногенов для получения анти-BAFF-R-антител у субъекта, для очистки лигандов BAFF-R и в скрининг-анализах для идентификации молекул, которые ингибируют взаимодействие BAFF-R с лигандом BAFF-R. Химерный или слитый BAFF-R-белок данного изобретения может быть получен стандартными способами рекомбинантых ДНК. Например, ДНК-фрагменты, кодирующие различные полипептидные последовательности, лигируют вместе в рамке считывания в соответствии с общепринятыми способами,например, с использованием затупленных или ступенчатых концов для лигирования, расщепления рестрикционными ферментами для обеспечения подходящих концов, заполнения липких концов, если нужно, обработки щелочной фосфатазой во избежание нежелательного соединения и ферментативного лигирования. В другом варианте слитый ген может быть синтезирован общепринятыми способами, в том числе автоматическими ДНК-синтезаторами. Альтернативно, может проводиться ПЦР-амплификация фрагментов гена с использованием якорных праймеров, которые приводят к образованию комплементарных выступов между двумя последовательными фрагментами гена, которые могут быть затем отожжены и повторно амплифицированы с получением химерной генной последовательности (см., например, Ausubel et al. Eds. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John WileySons, 1992). Кроме того, многие экспрессирующие векторы являются коммерчески доступными, причем эти векторы уже кодируют сливаемую часть молекулы (например, GST-полипептид). Кодирующая BAFF-R нуклеиновая кислота может быть клонирована в такой экспрессирующий вектор, так что сливаемая часть связывается в рамке считывания с белком BAFF-R. В предпочтительном варианте слитый белок BAFF-R обеспечен последовательностью нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:11) и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:12) фиг. 9. Агонисты и антагонисты BAFF-R. Данное изобретение относится также к вариантам белков BAFF-R, которые функционируют либо как агонисты BAFF-R (миметики), либо как антагонисты BAFF-R. Варианты белка BAFF-R могут быть получены мутагенезом, например, дискретной точковой мутацией или укорочением белка BAFF-R. Агонист белка BAFF-R может сохранять, по существу, те же самые биологические активности или подчиненный набор биологических активностей природно встречающейся формы белка BAFF-R. Антагонист белка BAFF-R может ингибировать одну или несколько активностей природно встречающейся формы белка BAFF-R, например, конкурентным связыванием с членом каскада передачи сигнала, находящимся по ходу или против хода каскада, который включает в себя белок BAFF-R. Таким образом, специфические биологические, эффекты могут быть индуцированы обработкой вариантом ограниченной функции. В одном варианте обработка субъекта вариантом, имеющим подчиненный набор биологических активностей природно встречающейся формы белка, имеет меньшие побочные действия у субъекта, по сравнению с обработкой природно встречающейся формой белков BAFF-R. Варианты белка BAFF-R, которые функционируют либо как агонисты BAFF-R (миметики), либо как антагонисты BAFF-R, могут быть идентифицированы скринингом комбинаторных библиотек мутантов, например, укороченных мутантов, белка BAFF-R на агонистическую или антагонистическую активность белка BAFF-R. В одном варианте мозаичную библиотеку разнообразных вариантов BAFF-R получают комбинаторным мутагенезом на уровне нуклеиновых кислот, причем указанная библиотека кодируется посредством мозаичной библиотеки генов. Мозаичная библиотека вариантов BAFF-R может быть получена, например, ферментативным лигированием смеси синтетических олигонуклеотидов в последовательности генов, так что вырожденный набор потенциальных последовательностей BAFF-R экспрессируется в виде индивидуальных полипептидов, или альтернативно, в виде набора более крупных слитых белков (например, фаговое представление), содержащих в них набор последовательностей BAFF-R. Существует множество способов, которые могут быть использованы для получения библиотек потенциальных вариантов BAFF-R из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Химический синтез вырожденной генной последовательности может выполняться в автоматическом ДНК-синтезаторе, и затем синтетический ген может быть лигирован в подходящий экспрессирующий вектор. Применение вырожденного набора генов позволяет обеспечить в одной смеси все последовательности, кодирующие желаемый набор потенциальных последовательностей BAFF-R. Способы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в данной области (см., например, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al.Res. 11:477-488). Библиотеки полипептидов. Кроме того, библиотеки фрагментов кодирующей последовательности белка BAFF-R могут быть использованы для получения мозаичной популяции фрагментов BAFF-R для скрининга и последующего отбора вариантов белка BAFF-R. В одном варианте библиотека фрагментов кодирующей последовательности может быть получена обработкой двухцепочечного ПЦР-фрагмента кодирующей последовательности BAFF-R нуклеазой в условиях, в которых разрыв одной цепи происходит только приблизительно один раз на молекулу, денатурацией двухцепочечной ДНК, ренатурацией этой ДНК с образованием- 18012833 двухцепочечной ДНК, которая может включать в себя смысловые/антисмысловые пары из продуктов с различными разрывами одной цепи, удалением одноцепочечных частей из повторно образованных дуплексов обработкой S1-нуклеазой и лигированием полученной библиотеки фрагментов в экспрессирующий вектор. Посредством этого способа может быть получена экспрессирующая библиотека, которая кодирует N-концевые и внутренние фрагменты различных размеров белка BAFF-R. В данной области известны несколько способов для скрининга генных продуктов комбинаторных библиотек, полученных точковыми мутациями или укорочением, и для скрининга кДНК-библиотек на генные продукты, имеющие выбранное свойство. Такие способы могут быть адаптированы для быстрого скрининга библиотек генов, генерируемых комбинаторным мутагенезом белка BAFF-R. Наиболее широко используемые способы, которые пригодны для высокопроизводительного анализа, для скрининга больших библиотек генов, обычно включают в себя клонирование библиотеки генов в реплицируемые экспрессирующие векторы, трансформацию подходящих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессию этих комбинаторных генов в условиях, в которых детектирование желаемой активности облегчает выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого был детектирован. REM (recrusive ensemble mutagenesis), новый способ, который усиливает частоту появления функциональных мутантов в библиотеках, может быть использован в комбинации со скрининг-анализами для идентификации вариантов BAFF-R (Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6:327-331). Антитела против BAFF-R. Выделенный белок BAFF-R, или его часть, или фрагмент могут быть использованы в качестве иммуногена для генерирования антител, которые связывают BAFF-R, с использованием стандартных способов для получения моноклональных и поликлональных антител. Может быть использован полноразмерный белок BAFF-R, или, альтернативно, данное изобретение обеспечивает антигенные пептидные фрагменты BAFF-R для применения в качестве иммуногенов. Антигенный пептид BAFF-R включает по меньшей мере 8 аминокислотных остатков аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 2D(SEQ ID NO:5), и включает в себя эпитоп BAFF-R, так что антитело, индуцированное против этого пептида, образует специфический иммунный комплекс с BAFF-R. Предпочтительно этот антигенный пептид включает по меньшей мере 10 аминокислотных остатков,более предпочтительно по меньшей мере 15 аминокислотных остатков, еще более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 аминокислотных остатков. Предпочтительными эпитопами, охватываемыми термином антигенный пептид, являются районы BAFF-R, которые локализованы на поверхности этого белка, например гидрофильные районы. Как описано здесь, последовательность белка BAFF-R фиг. 2D (SEQ ID NO:5) или ее производные,фрагменты, аналоги или гомологи могут быть использованы в качестве иммуногенов в генерировании антител, которые иммуноспецифически связывают эти белковые компоненты. Термин антитело в применении здесь обозначает молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулина, т.е. молекулы, которые содержат сайт связывания антигена, который специфически связывает (иммунореагирует с ним) антиген, такой как BAFF-R. Такие антитела включают в себя, но не ограничиваются ими, поликлональные, моноклональные, химерные антитела, одноцепочечные, Fab иF(ab')2-фрагменты и экспрессирующую Fab библиотеку. В конкретном варианте описаны антитела к белкам BAFF-R человека. Различные процедуры, известные в данной области, могут быть использованы для получения поликлональных или моноклональных антител к последовательности белка BAFF-R фиг. 2D(SEQ ID NO:5) или его производного, фрагмента, аналога или гомолога. Некоторые из этих белков обсуждаются ниже. Для получения поликлональных антител различные подходящие животные-хозяева (например, кролик, коза, мышь или другое млекопитающее) могут быть иммунизированы инъекцией природным белком или его синтетическим вариантом или их производным. Подходящий иммуногенный препарат может содержать, например, рекомбинантно экспрессированный белок BAFF-R или химически синтезированный полипептид BAFF-R. Этот препарат может дополнительно включать в себя адъювант. Различные адъюванты, используемые для увеличения иммунологического ответа, включают в себя, но не ограничиваются ими, адъювант Фрейнда (полный или неполный), минеральные гели (например, гидроксид алюминия), поверхностно-активные вещества (например, лизолецитин, плурониковые полиолы, полианионы,пептиды, масляные эмульсии, динитрофенол и т.д.), адъюванты для человека, такие как Bacille CalmetteGuerin (BCG) и Corynebacterium pervum, или подобные иммуностимуляторные агенты. Если желательно,молекулы антител, направленные против BAFF-R, могут быть выделены из млекопитающего (например,из крови) и дополнительно очищены хорошо известными способами, такими как протеин Ахроматография, для получения IgG-фракции. Термин моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела в применении здесь относится к популяции молекул антител, которые содержат только один вид антигенсвязывающего сайта, способный иммунореагировать с конкретным эпитопом BAFF-R. Таким образом, композиция моноклонального антитела обычно проявляет единственную связывающую аффинность в отношении кон- 19012833 кретного белка BAFF-R, с которым она иммунореагирует. Для получения моноклональных антител, направленных против конкретного белка BAFF-R или его производных, фрагментов, аналогов или гомологов, может быть использован любой способ, который обеспечивает продуцирование молекул антител непрерывным культивированием клеточной линии. Такие способы включают в себя, но не ограничиваются ими, гибридомный способ (см. KohlerMilstein, (1975) Nature 256:495-497); триомный способ; гибридомный способ с использованием В-клеток человека (см. Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4:72) иEBV-гибридомный способ для получения моноклональных антител человека (см. Cole, et al. IN MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., 1985, pp. 77-96). Моноклональные антитела человека могут быть использованы в практике данного изобретения и могут быть получены с использованием гибридом человека (Cole et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) или трансформацией В-клеток человека вирусом Эпштейна-Барра in vitro (см. Cole et al. IN MONOCLONALANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., 1985, pp. 77-96). Согласно данному изобретению способы могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител, специфических для белка BAFF-R (см., например, патент США 4946778). Кроме того, способы могут быть адаптированы для конструирования экспрессирующих Fab библиотек (см. Huse et al.(1989) Science 246:1275-1281) для возможности быстрой и эффективной идентификации моноклональных Fab-фрагментов с желаемой специфичностью в отношении белка BAFF-R или его производных,фрагментов, аналогов или гомологов. Heчеловеческие антитела могут быть гуманизированы способами, хорошо известными в данной области. См., например, патент США с номером 5225539. Фрагменты антител, которые содержат идиотипы к белку BAFF-R, могут быть получены способами, известными в данной области, в том числе, но не только: (i) F(ab')2-фрагмент, получаемый расщеплением пепсином молекулы антитела; (ii) Fab-фрагмент, получаемый восстановлением дисульфидных мостиков F(ab')2 фрагмента; (iii) Fab-фрагмент, получаемый обработкой молекулы антитела папаином и восстанавливающим агентом, и (iv) Fv-фрагменты. Кроме того, рекомбинантные анти-BAFF-R-антитела, такие как химерные и гуманизированные моноклональные антитела, содержащие части как человека, так и нечеловека, которые могут быть получены с использованием стандартных способов рекомбинантных ДНК, находятся в объеме данного изобретения. Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела могут быть получены способами рекомбинантных ДНК, известными в данной области, например, с использованием способов, описанных в Международной публикации РСТ с номером PCT/US 86/02269; Европейской патентной заявке с номером 184187; Европейской патентной заявке с номером 171496; Европейской патентной заявке с номером 173494; Международной публикации РСТ с номером WO 86/01533; патенте США с номером 4816567; Европейской патентной заявке с номером 125023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al.(1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; U.S. Pat. No. 5225539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; и Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060. В одном варианте способы для скрининга антител, которые обладают желаемой специфичностью,включают в себя, но не ограничиваются ими, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и другие иммунологически-опосредованные способы, известные в данной области. В конкретном варианте отбор антител, которые являются специфическими в отношении конкретного домена белка BAFF-R, облегчается генерированием гибридом, которые связываются с фрагментом белка BAFF-R, обладающим таким доменом. Антитела, которые являются специфическими в отношении одного или нескольких доменов в белке BAFF-R, например доменов, охватывающих вышеописанные консервативные районы белков семейства BAFF-R, или их производных, фрагментов, аналогов или гомологов, также обеспечены в данном изобретении. Анти-BAFF-R-антитела могут быть использованы в способах, известных в данной области, относящихся к локализации и/или количественному определению белка BAFF-R (например, для применения в измерении уровней белка BAFF-R в подходящих физиологических пробах, для применения в диагностических способах, для применения в визуализации этого белка и т.п.). В конкретном варианте антитела для белков BAFF-R или их производных, фрагментов, аналогов или гомологов, которые содержат происходящий из этих антител домен связывания, используют в качестве фармакологически активных соединений (далее называемых терапевтическими веществами). Анти-BAFF-R-антитело (например, моноклональное антитело) может быть использовано для выделения BAFF-R стандартными способами, такими как аффинная хроматография или иммунопреципитация. Анти-BAFF-R-антитело может облегчать очистку природного BAFF-R из клеток и рекомбинантно продуцируемого BAFF-R, экспрессируемого в клетках-хозяевах. Кроме того, анти-BAFF-R-антитело может быть использовано для детектирования белка BAFF-R (например, в клеточном лизате или клеточном супернатанте) для оценки представленности и распределения экспрессии белка BAFF-R. Анти-BAFF-Rантитела могут быть использованы диагностически для мониторинга уровней белка в тканях как части процедуры клинического испытания, например, для определения эффективности конкретной схемы ле- 20012833 чения. Детектирование может облегчаться связыванием (т.е. физическим связыванием) антитела с детектируемым веществом. Примеры детектируемых веществ включают в себя различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают в себя пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, -галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают в себя стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают в себя умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат,родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает в себя люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают в себя люциферазу, люциферин и аэкворин, и примеры подходящего радиоактивного материала включают в себя 125 131 35I, I, S или 3 Н. Рекомбинантные экспрессирующие BAFF-R векторы и клетки-хозяева. Другой аспект данного изобретения относится к векторам, предпочтительно экспрессирующим векторам, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую белок BAFF-R или его производные, фрагменты, аналоги или гомологи. В применении здесь термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой он был связан. Один тип вектора является плазмидой, которая является кольцевой двухцепочечной петлей ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные ДНК-сегменты. Другим типом вектора является вирусный вектор,где дополнительные ДНК-сегменты могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации (ориджин), и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и посредством этого реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны к управлению экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называют здесь экспрессирующими векторами. Обычно экспрессирующие векторы, используемые в способах рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. В данной заявке термины плазмида и вектор могут использоваться взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако данное изобретение имеет в виду также и другие формы экспрессирующих векторов, такие как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции. Рекомбинантные экспрессирующие векторы данного изобретения включают нуклеиновую кислоту данного изобретения в форме, пригодной для экспрессии этой нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине,что означает, что эти рекомбинантные экспрессирующие векторы включают в себя одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных на основе используемых для экспрессии клеток-хозяев,которая (которые) функционально связаны с подлежащей экспрессии нуклеиновой кислотой. В рекомбинантном экспрессирующем векторе термин функционально связана означает, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью (регуляторными последовательностями) таким образом, что создается возможность экспрессии этой нуклеотидной последовательности (например, в системе транскрипции/трансляции in vitro или в клетке-хозяине при введении этого вектора в клетку-хозяина). Термин регуляторная последовательность включает в себя промоторы, энхансеры и другие элементы регуляции экспрессии (например, сигналы полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel Gene Expression TechnologyMETHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990. Регуляторные последовательности включают в себя последовательности, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и последовательности, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (например,тканеспецифические регуляторные последовательности). Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что конструкция экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор клетки хозяина, которая должна быть трансформирована, желаемого уровня экспрессии белка и т.д. Экспрессирующие векторы данного изобретения могут быть введены в клетки-хозяева для продуцирования посредством этого белков или пептидов, в том числе слитых белков или пептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, описанными здесь (например, белков BAFF-R, мутантных форм BAFF-R, слитых белков и т.д.). Рекомбинантные экспрессирующие векторы данного изобретения могут быть сконструированы для экспрессии BAFF-R в прокариотических или эукариотических клетках. Например, BAFF-R может экспрессироваться в бактериальных клетках, таких как Escherichia coli, клетках насекомых (с использованием бакуловирусных экспрессирующих векторов), дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева обсуждаются дополнительно в Goeddel, Gene Expression Technology METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990. Альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор может транскрибироваться и транслироваться in vitro, например, с использованием регуляторных последовательностей промотора Т 7 и полимеразы Т 7.- 21012833 Экспрессию белков в прокариотах наиболее часто проводят в Е. coli с векторами, содержащими конститутивные или индуцируемые промоторы, управляющие экспрессией либо слитых, либо неслитых белков. Векторы слитых белков добавляют ряд аминокислот к кодируемому ими белку, обычно к аминоконцу рекомбинантного белка. Такие векторы слитых белков обычно служат для достижения трех целей:(1) для увеличения экспрессии рекомбинантного белка; (2) для увеличения растворимости рекомбинантного белка и (3) для содействия очистке рекомбинантного белка посредством действия в качестве лиганда при аффинной очистке. Часто в экспрессирующие слитые белки векторы вводят сайт протеолитического расщепления в месте соединения слитой части и рекомбинантого белка для обеспечения отделения рекомбинантного белка от этой слитой части после очистки слитого белка. Такие ферменты и их родственные последовательности узнавания включают в себя фактор Ха, тромбин и энтерокиназу. Типичные экспрессирующие слитые белки векторы включают в себя pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) и pRIT5 (Pharmacia, Piscataway,N.J.), которые сливают глутатион-S-трансферазу (GST), мальтозу Е-связывающий белок, или белок А,соответственно, с рекомбинантным белком-мишенью. Примеры подходящих индуцируемых экспрессирующих неслитые белки векторов Е. coli включают в себя pTrc ( (Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315) и pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990, pp. 60-89). Одной стратегией максимизации экспрессии рекомбинантного белка в Е. coli является экспрессия этого белка в бактерии-хозяине с нарушенной способностью протеолитического расщепления рекомбинантного белка. См. Gottesman, Gene Expression Technology METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990, pp. 119-128. Другой стратегией является изменение последовательности нуклеиновой кислоты, которая должна быть встроена в экспрессирующий вектор, таким образом, что индивидуальные кодоны для каждой аминокислоты являются кодонами, преимущественно используемыми в Е. coli (Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Такое изменение последовательностей нуклеиновых кислот данного изобретения может быть выполнено стандартными способами синтеза ДНК. В другом варианте экспрессирующий BAFF-R вектор является дрожжевым экспрессирующим вектором. Примеры векторов для экспрессии в дрожжах (например, Saccharomyces cerevisiae) включают в себя pYepSecl (Baldari, et al., (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) и для Р. pastoris включают в себя семейство векторов pPIC (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.). Альтернативно, BAFF-R может быть экспрессирован в клетках насекомых с использованием бакуловирусных экспрессирующих векторов. Бакуловирусные векторы, доступные для экспрессии белков в культивируемых клетках насекомых (например, клетках SF9), включают в себя серию рАс (Smith et al.(1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165) и серию pVL (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39). Еще в одном варианте нуклеиновую кислоту данного изобретения экспрессируют в клетках млекопитающих с использованием экспрессирующего вектора млекопитающих. Примеры экспрессирующих векторов млекопитающих включают в себя pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840-842) и рМТ 2 РС (Kaufmanet al. (1987) EMBO J. 6:187-195). При использовании в клетках млекопитающих функции регуляции этого экспрессирующего вектора часто обеспечиваются вирусными регуляторными элементами. Например,обычно используемые промоторы получают из полиомы, аденовируса 2, цитомегаловируса и вируса обезьян 40. В отношении других подходящих систем экспрессии как для прокариотических, так и для эукариотических клеток см., например, части 16 и 17 Sambrook et al., Molecular Cloning: A LaboratoryHarbor N.Y., (1989). В другом варианте рекомбинантный экспрессирующий вектор млекопитающих способен управлять экспрессией нуклеиновой кислоты преимущественно (преферентивно) в конкретном типе клеток (например, тканеспецифические регуляторные элементы используются для экспрессии этой нуклеиновой кислоты). Тканеспецифические регуляторные элементы известны в данной области. Неограничивающие примеры подходящих тканеспецифических промоторов включают в себя промотор альбумина (печень-специфический; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), лимфоидспецифические промоторы (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), в частности, промоторы рецепторов Т-клеток (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) и иммуноглобулинов (Banerji et al.(например, промотор нейрофиламента; Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477),специфические для поджелудочной железы промоторы (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916) и промоторы, специфические для молочной железы (например, промотор молочной сыворотки; патент США 4873316 и публикация Европейской заявки 264166). В данное изобретение включены также регулируемые стадией развития промоторы, например промоторы hox мышей (Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379) и промотор -фетопротеина (эмбрионального белка) (Campes and Tilghman (1989) GenesDev. 3:537-546). Далее данное изобретение обеспечивает рекомбинантный экспрессирующий вектор, включающий- 22012833 молекулу ДНК данного изобретения, клонированную в этот экспрессирующий вектор в антисмысловой ориентации. То есть эта молекула ДНК функционально связана с регуляторной последовательностью таким образом, что создается возможность экспрессии (транскрипцией этой молекулы ДНК) РНКмолекулы, которая является антисмысловой относительно мРНК BAFF-R. Регуляторные последовательности, функционально связанные с нуклеиновой кислотой, клонированной в антисмысловой ориентации,могут быть выбраны таким образом, что они управляют непрерывной экспрессией молекулы антисмысловой РНК в различных типах клеток, например, вирусные промоторы и/или энхансеры, или регуляторные последовательности могут быть выбраны таким образом, что они управляют конститутивной, тканеспецифической или клеткоспецифической экспрессией антисмысловой РНК. Этот антисмысловой экспрессирующий вектор может быть в форме рекомбинантной плазмиды, фагмиды или аттенуированного вируса, в котором антисмысловые нуклеиновые кислоты продуцируются под контролем высокоэффективного регуляторного района, активность которого может быть определена типом клеток, в которые вводится этот вектор. В отношении дискуссии о регуляции экспрессии генов с использованием антисмысловых генов см. Weintraub et al. (1986) Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis ReviewsTrends in Genetics, 1(1). Другой аспект данного изобретения относится к клеткам-хозяевам, в которые был введен рекомбинантный экспрессирующий вектор данного изобретения. Термины клетка-хозяин и рекомбинантная клетка-хозяин используются здесь взаимозаменяемо. Понятно, что такие термины относятся не только к конкретной рассматриваемой клетке, но и к потомству или потенциальному потомству такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут происходить в последующих генерациях вследствие либо мутации, либо влияний окружающей среды, такое потомство может быть, на самом деле, неидентичным родительской клетке, но оно все-таки включено в используемый здесь термин. Клеткой-хозяином может быть любая прокариотическая или эукариотическая клетка. Например,белок BAFF-R может экспрессироваться в бактериальных клетках, таких как Е. coli, клетках насекомых,дрожжевых клетках или клетках млекопитающих (таких как клетки яичника Китайского хомячка (СНО) или COS-клетках). Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам с квалификацией в данной области. Векторная ДНК может быть введена в прокариотические или эукариотические клетки общепринятыми способами трансформации или трансфекции. В применении здесь термины трансформация и трансфекция обозначают разнообразные признанные в данной области способы введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, в том числе кальций-фосфатную или кальцийхлоридную копреципитацию, опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию, липофекцию или электропорацию. Подходящие способы трансформации или трансфекции клеток-хозяев можно найти в Sambrook etHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y., (1989) и других лабораторных руководствах. Для стабильной трансфекции клеток млекопитающих известно, что в зависимости от используемых экспрессирующего вектора и способа трансфекции только небольшая фракция клеток может интегрировать чужеродную ДНК в их геном. Для идентификации и отбора этих интегрантов ген, кодирующий селектируемый маркер (например, устойчивость к антибиотикам), обычно вводят в клетки-хозяева вместе с представляющим интерес геном. Различные селектируемые маркеры включают в себя маркеры, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин и метотрексат. Нуклеиновая кислота, кодирующая селектируемый маркер, может быть введена в клетку-хозяина на том же самом векторе, который кодирует BAFF-R, или может быть введена на отдельном векторе. Клетки, стабильно трансфицированные введенной нуклеиновой кислотой, могут быть идентифицированы отбором с лекарственным средством (например, клетки, которые включили ген селектируемого маркера, будут выживать, тогда как остальные клетки погибают). Клетка-хозяин данного изобретения, например прокариотическая или эукариотическая клеткахозяин в культуре, может быть использована для продуцирования (т.е. экспрессии) белка BAFF-R. Таким образом, данное изобретение обеспечивает дополнительно способы получения белка BAFF-R с использованием клеток-хозяев данного изобретения. В одном варианте этот способ включает в себя культивирование клетки-хозяина данного изобретения (в которую был введен рекомбинантный экспрессирующий вектор, кодирующий BAFF-R) в подходящей среде, так что продуцируется белок BAFF-R. В другом варианте этот способ дополнительно предусматривает выделение BAFF-R из среды или клетки-хозяина. Трансгенные животные. Клетки-хозяева данного изобретения могут быть также использованы для получения трансгенных животных, кроме человека. Например, в одном варианте клеткой-хозяином данного изобретения является оплодотворенный ооцит или эмбриональная стволовая клетка, в которую были введены кодирующиеBAFF-R последовательности. Такие клетки-хозяева могут быть затем использованы для создания трансгенных животных, кроме человека, в которых экзогенные последовательности BAFF-R были введены в их геном, или гомологичных рекомбинантных животных, в которых эндогенные последовательностиBAFF-R были изменены. Такие животные применимы для исследования функции и/или активностиBAFF-R и для идентификации и/или оценки модуляторов активности BAFF-R. В применении здесь трансгенное животное является животным, кроме человека, предпочтительно млекопитающим, более предпочтительно грызуном, таким как крыса или мышь, причем одна или более клеток этого животного включают в себя трансген. Другие примеры трансгенных животных включают приматов (кроме человека), овец, собак, коров, коз, кур, земноводных и т.д. Трансгеном является экзогенная ДНК, которая интегрируется в геном клетки, из которой развивается трансгенное животное и которая остается в геноме зрелого животного, управляя экспрессией кодируемого геном продукта в одном или нескольких типах клеток или тканей трансгенного животного. В применении здесь гомологичное рекомбинантное животное является животным (кроме человека), предпочтительно млекопитающим, более предпочтительно мышью, в котором эндогенный ген BAFF-R был изменен гомологичной рекомбинацией между эндогенным геном и экзогенной ДНК-молекулой, введенной в клетку этого животного, например эмбриональную клетку этого животного, до развития этого животного. Трансгенное животное данного изобретения может быть создано введением кодирующей BAFF-R нуклеиновой кислоты в мужские пронуклеусы оплодотворенного ооцита, например, микроинъекцией,ретровирусной инфекцией, и предоставлением этому ооциту возможности развиваться в псевдобеременном вынашивающем животном-самке. ДНК-последовательность BAFF-R человека фиг. 2 А (SEQ IDNO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4), фиг. 3 (SEQ ID NO:6) может быть введена в качестве трансгена в геном животного (кроме человека). Альтернативно, нечеловеческий гомолог гена BAFF-R человека, такой как ген BAFF-R мыши (фиг. 4 А) (SEQ ID NO:8), может быть выделен на основе гибридизации с кДНКBAFF-R человека (описанной более подробно выше) и использован в качестве трансгена. Интронные последовательности и сигналы полиаденилирования могут быть также включены в этот трансген для увеличения эффективности экспрессии трансгена. Тканеспецифические регуляторные последовательности могут быть функционально связаны с трансгеном BAFF-R для управления экспрессией белка BAFF-R в конкретных клетках. Способы получения трансгенных животных посредством манипуляции и микроинъекции эмбриона, в частности, таких животных, как мыши, стали общепринятыми в данной области и описаны, например, в патенте США 4736866; 4870009 и 4873191; и Hogan in MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986. Подобные способы используют для получения других трансгенных животных. Трансгенное животное-основатель может быть идентифицировано на основании присутствия трансгена BAFF-R в его геноме и/или экспрессии мРНК BAFF-R в тканях или клетках этих животных. Затем трансгенное животное-основатель может быть использовано для разведения дополнительных животных, несущих этот трансген. Кроме того, трансгенные животные, несущие трансген, кодирующий BAFF-R, могут быть размножены далее с получением других трансгенных животных, несущих другие трансгены. Для создания гомологичного рекомбинантного животного готовят вектор, который содержит по меньшей мере часть гена BAFF-R, в который была введена делеция, добавление или замена для изменения посредством этого, например, функционального разрушения, гена BAFF-R. Геном BAFF-R может быть ген человека (например, фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4), фиг. 3 (SEQ ID NO:6, но более предпочтительно этот ген является нечеловеческим гомологом гена BAFF-R человека. Например,мышиный гомолог (фиг. 4 А) гена BAFF-R человека фиг. 2 А (SEQ ID NO:3), фиг. 2 С (SEQ ID NO:4), фиг. 3 (SEQ ID NO:6) может быть использован для конструирования вектора для гомологичной рекомбинации, пригодного для изменения эндогенного гена BAFF-R в мышином геноме. В одном варианте этот вектор сконструирован таким образом, что при гомологичной рекомбинации эндогенный ген BAFF-R является функционально разрушенным (т.е. он уже не кодирует функциональный белок; этот вектор называют также вектором нокаута). Альтернативно, вектор может быть сконструирован таким образом, что при гомологичной рекомбинации эндогенный ген BAFF-R является мутированным или иным образом измененным, но все еще кодирует функциональный белок (например, левый регуляторный район может быть изменен для изменения посредством этого экспрессии эндогенного белка BAFF-R). В векторе для гомологичной рекомбинации измененная часть гена BAFF-R фланкирована на его 5'- и 3'-концах дополнительной нуклеиновой кислотой гена BAFF-R для обеспечения возможности гомологичной рекомбинации между экзогенным геном BAFF-R, несомым этим вектором, и эндогенным геном BAFF-R в эмбриональной стволовой клетке. Эта дополнительная фланкирующая нуклеиновая кислота BAFF-R имеет достаточную длину для успешной гомологичной рекомбинации с эндогенным геном. Обычно в вектор включают несколько т.п.н. фланкирующей ДНК (как на 5'-, так и на 3'-концах). См., например, Thomas et al. (1987) Cell 51:503 в отношении описания векторов для гомологичной рекомбинации. Этот вектор вводят в линию эмбриональных стволовых клеток (например, электропорацией), и клетки, в которых введенный ген BAFF-R гомологично рекомбинировался с эндогенным геном BAFF-R, отбирают (см., например, Li et al. (1992)Cell 69:915). Затем отобранные клетки инъецируют в бластоцисту животного (например, мыши) для образования агрегированных химер. См., например, Bradley, in TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEMCELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, Ed. IRL, Oxford, 1987, pp. 113-152. Затем химерный эм- 24012833 брион может быть имплантирован в подходящую псевдобеременную самку-вынашивающее животное, и эмбрион растет до конца беременности. Потомство, несущее гомологично рекомбинированную ДНК в их половых зародышевых клетках, может быть использовано для выведения животных, в которых все клетки животного содержат гомологично рекомбинированную ДНК в результате передачи зародышевой линией этого трансгена. Способы конструирования векторов для гомологичной рекомбинации и гомологичные рекомбинантные животные описаны дополнительно в Bradley (1991) Curr. Opin. Biotechnol. 2:823-829; PCT International Publication Nos.: WO 90/11354; WO 91/01140; WO 92/0968 и WO 93/04169. В другом варианте могут быть получены трансгенные животные (кроме человека), которые содержат выбранные системы, которые обеспечивают регулируемую экспрессию данного трансгена. Одним из примеров такой системы является система cre/loxP-рекомбиназы бактериофага Р 1. В отношении описания системы cre/loxP-рекомбиназы см., например, Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:62326236. Другим примером системы рекомбиназы является система рекомбиназы FLP S. cerevisiae(О'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355). Если систему cre/loxP-рекомбиназы используют для регуляции экспрессии трансгена, необходимы животные, содержащие трансгены, кодирующие как рекомбиназу Cre, так и выбранный белок. Такие животные могут быть обеспечены конструированием двойных трансгенных животных, например, спариванием двух трансгенных животных, одно из которых содержит трансген, кодирующий выбранный белок, а другое содержит трансген, кодирующий рекомбиназу. Клоны трансгенных животных (не человека), описанные здесь, могут быть также получены в соответствии со способами, описанными в Wilmut et al. (1997) Nature 385:810-813. Вкратце, клетка, например,соматическая клетка, из трансгенного животного может быть выделена и индуцирована для выхода из цикла роста и вступления в фазу G0. Затем находящуюся в покое клетку сливают, например, с использованием электрических импульсов, с энуклеированным ооцитом из животного того же вида, из которого выделена находящаяся в покое клетка. Затем реконструированный ооцит культивируют таким образом,что он развивается до морулы или бластулы, и затем переносят его в псевдобеременную самкувынашивающее животное. Потомство, родившееся у такой самки-вынашивающего животного, будет клоном животного, из которого выделена эта клетка, например, соматическая клетка. Фармацевтические композиции. Молекулы нуклеиновых кислот BAFF-R, белки BAFF-R и анти-BAFF-R-антитела (также называемые здесь активными соединениями) данного изобретения и их производные, фрагменты, аналоги и гомологи, могут быть включены в фармацевтические композиции, пригодные для введения. Такие композиции обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, белок или антитело и фармацевтически приемлемый носитель. В применении здесь фармацевтически приемлемый носитель включает в себя любые и все растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие поглощение агенты и т.п., совместимые с фармацевтическим введением. Подходящие носители описаны в наиболее недавнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences, стандартном справочнике в данной области, который включен здесь в качестве ссылки. Предпочтительные примеры таких носителей или разбавителей включают в себя, но не ограничиваются ими, воду, солевой раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и 5% человеческий сывороточный альбумин. Могут быть также использованы липосомы и неводные носители, такие как нелетучие масла. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области. За исключением общепринятых сред или агентов, которые несовместимы с активным соединением, предполагается применение этих сред и агентов в этих композициях. Дополнительные активные соединения также могут включаться в эти композиции. Фармацевтическую композицию данного изобретения готовят таким образом, чтобы она была совместимой с предполагаемым путем ее введения. Примеры способов введения включают в себя парентеральное, например, внутривенное, интрадермальное, подкожное, пероральное (например, ингаляцией),чрескожное (локальное), трансмукозное и ректальное введение. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, интрадермального или подкожного введения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразователи, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для коррекции тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. рН может корректироваться кислотами или основаниями, например, хлористоводородной кислотой или гидроксидом натрия. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы,одноразовые шприцы или флаконы с множественными дозами, изготовленные из стекла или пластика. Фармацевтические композиции, пригодные для инъекций, включают стерильные водные растворы(если они являются водорастворимыми) или дисперсии и стерильные порошки для незапланированного приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсий. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Кремофор EL(BASF, Parsippany, N.J.) или забуференный фосфатом солевой раствор (ФСБ). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть текучей до степени легкого введения шприцом. Она должна- 25012833 быть стабильной в условиях приготовления и хранения и должна быть предохранена против загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), и их подходящие смеси. Подходящая текучесть может поддерживаться, например, использованием покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и использованием поверхностно-активных веществ. Предупреждение действия микроорганизмов может достигаться с использованием различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты,тимерозала и т.п. Во многих случаях будет предпочтительно включение изотонических агентов, например, Сахаров, полиспиртов, таких как маннит, сорбит, хлорид натрия, в композицию. Пролонгированное всасывание инъектируемых композиций может достигаться включением в композицию агента, который пролонгирует всасывание, например, моностеарата алюминия и желатины. Стерильные инъектируемые растворы могут быть приготовлены включением активного соединения(например, белка BAFF-R или анти-BAFF-R-антитела) в требуемом количестве в подходящем растворителе с одним или с комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием через микропористую мембрану. Обычно дисперсии готовят включением активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную диспергирующую среду и требуемые остальные ингредиенты из ингредиентов, перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов способы приготовления включают в себя вакуумную сушку и лиофилизацию, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его предварительно стерилизованного фильтрацией через микропористую мембрану раствора. Пероральные композиции обычно включают в себя инертный разбавитель или съедобный носитель. Они могут быть заключены в желатиновые касулы или спрессованы в таблетки. Для целей перорального терапевтического введения активное соединение может быть включено с наполнителями и использовано в форме таблеток, пастилок или капсул. Пероральные композиции могут быть приготовлены с использованием жидкого носителя для применения в качестве жидкости для полоскания рта, где соединение в жидком носителе применяют перорально и прополаскивают рот и выплевывают или проглатывают. Фармацевтически совместимые связывающие агенты и/или адъюванты могут быть включены в качестве части этой композиции. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений сходной природы: связывающее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатина; наполнитель, такой как крахмал или лактоза,дезинтегрирующий агент, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или стеротес; скользящее вещество, такое как коллоидальный диоксид кремния; подслащивающий агент, такой как сахароза или сахарин; или ароматизирующий агент, такой как мята перечная, метилсалицилат или апельсиновая отдушка. Для введения ингаляцией соединения доставляются в форме аэрозольного спрея из находящегося под давлением контейнера или дозатора, который содержит подходящий пропеллент, например газ, такой как диоксид углерода, или распылителя. Системное введение может осуществляться также трансмукозным или трансдермальным путем (через слизистую оболочку или через кожу). Для трансмукозного или трансдермального введения в композиции используют усилители проникновения (пенетранты), пригодные для барьера, который должен быть пересечен. Такие усиливающие проникновение агенты обычно известны в данной области и включают в себя, например, для трансмукозного введения, детергенты, желчные кислоты и производные фусидовой кислоты. Трансмукозное введение может выполняться с использованием спреев для носа или суппозиториев. Для трансдермального введения активные соединения готовят в виде мазей, пастообразных масс, гелей или кремов, обычно известных в данной области. Соединения данного изобретения могут быть также приготовлены в форме суппозиториев (например, с подходящими основами для суппозиториев, такими как масло какао и другие глицериды), или удерживающих клизм для ректальной доставки. В одном варианте активные соединения готовят с носителем, который будет защищать эти соединения против быстрого выведения из тела, например, в виде композиции пролонгированного высвобождения, в том числе имплантатов и микроинкапсулированных систем доставки. Могут использоваться биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы приготовления таких композиций будут очевидными для специалистов с квалификацией в данной области. Эти материалы могут быть также получены коммерчески из Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. В качестве фармацевтически приемлемых носителей могут быть также использованы липосомные суспензии (в том числе липосомы, нацеленные на инфицированные клетки моноклональными антителами к вирусным антигенам). Они могут быть приготовлены в соответствии со способами, известными специалистам с квалификацией в данной области, например, как описано в патенте США 4522811. Особенно выгодно готовить пероральные или парентеральные композиции в форме унифицирован- 26012833 ных (стандартных) доз для легкости введения и однородности доз. Формой стандартной дозы в применении здесь называют физически дискретные стандартные единицы в виде единичных доз для проходящего лечение субъекта; причем каждая стандартная единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное таким образом, что она производит желаемое терапевтическое действие, вместе с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для форм стандартных доз данного изобретения диктуется уникальными характеристиками конкретного активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который желательно получить, и зависит непосредственно от этих характеристик и эффекта. Молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть инсертированы в векторы и использованы в качестве векторов генотерапии. Векторы генотерапии могут доставляться субъекту любым путем введения, например, как описано в патенте США 5703055. Таким образом, доставка может включать, например, внутривенную инъекцию, локальное введение (см. патент США 5328470) или стереотаксическую инъекцию (см., например, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3054-3057). Фармацевтический препарат вектора генотерапии может включать вектор генотерапии в приемлемом разбавителе или может содержать матрикс для замедленного высвобождения, в который внедрен вектор доставки гена. Альтернативно, если полный вектор доставки гена не может быть получен интактным из рекомбинантных клеток, например, ретровирусные векторы, фармацевтический препарат может включать в себя одну или несколько клеток, которые продуцируют систему доставки гена. Фармацевтические композиции могут быть упакованы в контейнер, упаковку или распределительное устройство вместе с инструкциями для введения. Применения и способы изобретения. Молекулы нуклеиновых кислот, белки, гомологи белков и антитела, описанные здесь, могут быть использованы в одном или нескольких из следующих способов: (а) скрининг-анализах; (b) анализах детектирования (например, хромосомном картировании, гистотипировании, судебной биологии), (с) прогностической медицине (например, диагностических анализах, прогностических анализах, мониторинге клинических испытаний и фармакогеномике); и (d) способах лечения (например, терапевтического или профилактического). Как описано здесь, в одном варианте белок BAFF-R данного изобретения способен связывать BAFF. Изолированные молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть использованы для экспрессии белка BAFF-R (например, через рекомбинантный экспрессирующий вектор в клетке-хозяине при применениях в генотерапии), для детектирования мРНК BAFF-R (например, в биологической пробе) или генетического повреждения в гене BAFF-R, и для модуляции активности BAFF или BAFF-R, как описано дополнительно ниже. Кроме того, белки BAFF-R могут быть использованы для скрининга лекарственных средств или соединений, которые модулируют активность или экспрессию BAFF-R, а также для лечения нарушений, характеризующихся недостаточным или избыточным продуцированием BAFF и/или белка BAFF-R, или продуцированием форм белка BAFF-R, которые имеют уменьшенную или отклоняющуюся от нормы активность по сравнению с белком BAFF-R дикого типа. Кроме того, антиBAFF-R-антитела данного изобретения могут быть использованы для детектирования и выделения белков BAFF-R и модуляции активности BAFF и/или BAFF-R. Данное изобретение относится также к новым агентам, идентифицированным вышеописанными скрининг-анализами, и их применениям для способов лечения, описанных здесь. Скрининг-анализы. Данное изобретение обеспечивает способ (также называемый здесь скрининг-анализом) для идентификации модуляторов, т.е. кандидатов или тест-соединений или агентов (например, пептидов,пептидомиметиков, небольших молекул или других лекарственных средств), которые связываются с белками BAFF-R или оказывают стимуляторное или ингибиторное действие, например, на экспрессиюBAFF-R или активность BAFF-R. В одном варианте данное изобретение обеспечивает анализы для скрининга кандидатов или тестсоединений, которые связываются с белком или полипептидом BAFF-R или его биологически активной частью или модулируют активность белка или полипептида BAFF-R или его биологически активной части. Тест-соединения данного изобретения могут быть получены любым из многочисленных подходов в способах с использованием комбинаторных библиотек, известных в данной области, в том числе: биологических библиотек; пространственно разделяемых параллельных твердофазных или жидкофазных библиотек; способов синтетических библиотек, требующих обращения свертки при анализе цифрового изображения; способа библиотек типа одна-гранула одно-соединение и способов синтетических библиотек, использующих отбор с использованием аффинной хроматографии. Подход биологических библиотек ограничен пептидными библиотеками, тогда как четыре других подхода применимы к библиотекам соединений пептидов, непептидных олигомеров или небольших молекул (Lam (1997) AnticancerDrug Des. 12:145-167). Примеры способов для синтеза, молекулярных библиотек могут быть найдены в данной области,например, в: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6013; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad.Engl. 33:2061; и Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233-1251. Библиотеки соединений могут быть представлены в растворе (например, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421) или на гранулах (Lam (1991) Nature 354:82-84), на чипах (Fodor (1993) Nature 364:555556), бактериях (Ladner, патент США 5223409), спорах (Ladner, патент США 5223409), плазмидах(Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) или на фаге (Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:63786382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, патент США 5223409). В одном варианте анализом является анализ на основе клеток, в котором клетку, которая экспрессирует мембраносвязанную форму белка BAFF-R или его биологически активную часть на поверхности клетки, контактируют с тест-соединением и определяют способность этого тест-соединения связываться с белком BAFF-R. Клетка может происходить, например, из млекопитающего или из дрожжей. Определение способности тест-соединения связываться с белком BAFF-R может выполняться, например, связыванием тест-соединения с радиоизотопной или ферментативной меткой, так что связывание тестсоединения с белком BAFF-R или его биологически активной частью может быть определено детектированием меченого соединения в комплексе. Например, тест-соединения могут быть помечены 125I, 35S, 14C или 3 Н, прямо или опосредованно, и радиоизотоп может быть детектирован прямым счетом радиоизлучения или сцинтилляционным счетом. Альтернативно, тест-соединения могут быть ферментативно мечеными, например, пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой или люциферазой, и ферментативная метка может быть детектирована определением превращения соответствующего субстрата в продукт. В одном варианте этот анализ предусматривает контактирование клетки, которая экспрессирует мембраносвязанную форму белка BAFF-R или его биологически активную часть на клеточной поверхности, с известным соединением, которое связывает BAFF-R, для образования тест-смеси, контактирование этой тест-смеси с тест-соединением и определение способности тест-соединения взаимодействовать с белкомBAFF-R, где определение способности тест-соединения взаимодействовать с белком BAFF-R предусматривает определение способности этого тест-соединения преимущественно связываться с BAFF-R или его биологически активной частью по сравнению с известным соединением. В другом варианте анализом является анализ на основе клеток, предусматривающий контактирование клетки, которая экспрессирует мембраносвязанную форму белка BAFF-R или его биологически активную часть на поверхности клетки, с тест-соединением и определение способности этого тестсоединения модулировать (например, стимулировать или ингибировать) активность белка BAFF-R или его биологически активной части. Определение способности тест-соединения модулировать активностьBAFF-R или его биологически активной части может выполняться, например, определением способности белка BAFF-R связываться или взаимодействовать с молекулой-мишенью BAFF-R. В применении здесь молекула-мишень является молекулой, с которой белок BAFF-R связывается или взаимодействует в природе, например, молекулой на поверхности клетки, которая экспрессирует белок BAFF-R, молекулой на поверхности второй клетки, молекулой во внеклеточной окружении, молекулой, связанной с внутренней поверхностью клеточной мембраны, или цитоплазматической молекулой. Молекула-мишень BAFFR может не быть BAFF-R-молекулой или белком или полипептидом BAFF-R данного изобретения. В одном варианте молекула-мишень BAFF-R является компонентом пути трансдукции сигнала, который облегчает трансдукцию внеклеточного сигнала (например, сигнала, генерируемого связыванием соединения с мебраносвязанной молекулой BAFF-R) через эту клеточную мембрану и в клетку. Эта мишень может быть, например, вторым межклеточным белком, который имеет каталитическую активность, или белком, который облегчает связывание находящихся ниже по ходу трансдукции сигнала передающих сигнал молекул с BAFF-R. Определение способности белка BAFF-R связываться или взаимодействовать с молекулоймишенью BAFF-R может выполняться одним из способов, описанных выше для определения прямого связывания. В одном варианте определение способности белка BAFF-R связываться или взаимодействовать с молекулой-мишенью BAFF-R может выполняться определением активности молекулы-мишени. Например, активность молекулы-мишени может быть определена детектированием индукции клеточного вторичного мессенджера мишени (т.е. внутриклеточного Са 2+, диацилглицерина, IP3 и т.д.), детектированием каталитической/ферментативной активности мишени на подходящем субстрате, детектированием индукции репортерного гена (содержащего отвечающий на BAFF-R регуляторный элемент, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей детектируемый маркер, например, люциферазу) или детектированием клеточной реакции, например, выживания клетки, клеточной дифференцировки или пролиферации клеток. Еще в одном варианте анализом данного изобретения является бесклеточный анализ, предусматривающий контактирование белка BAFF-R или его биологически активной части с тест-соединением и определение способности этого тест-соединения связываться с белком BAFF-R или его биологически активной частью. Связывание тест-соединения с белком BAFF-R может быть определено либо прямо, либо опосредованно, как описано выше. В одном варианте этот анализ предусматривает контактирование белка BAFF-R или его биологически активной части с известным соединением, которое связывает BAFF-R,- 28012833 с образованием тест-смеси, контактирование этой тест-смеси с тест-соединением и определение способности тест-соединения взаимодействовать с белком BAFF-R, где определение способности тестсоединения взаимодействовать с белком BAFF-R предусматривает определение способности этого тестсоединения преимущественно связываться с BAFF-R или его биологически активной частью по сравнению с известным соединением. В другом варианте этим анализом является бесклеточный анализ, предусматривающий контактирование белка BAFF-R или его биологически активной части с тест-соединением и определение способности этого тест-соединения модулировать (например, стимулировать или ингибировать) активность белкаBAFF-R или его биологически активной части. Определение способности тест-соединения модулировать активность BAFF-R может выполняться, например, определением способности белка BAFF-R связываться с молекулой-мишенью BAFF-R одним из описанных выше способов для определения прямого связывания. В альтернативном варианте определение способности тест-соединения модулировать активностьBAFF-R может выполняться определением способности белка BAFF-R дополнительно модулировать молекулу-мишень BAFF-R. Например, может быть определена каталитическая/ферментативная активность молекулы-мишени на подходящем субстрате, как описано ранее. Еще в одном варианте этот бесклеточный анализ предусматривает контактирование белка BAFF-R или его биологически активной части с известным соединением, которое связывает BAFF-R, с образованием тест-смеси, контактирование этой тест-смеси с тест-соединением и определение способности тестсоединения взаимодействовать с белком BAFF-R, где определение способности тест-соединения взаимодействовать с белком BAFF-R предусматривает определение способности белка BAFF-R преимущественно связываться с молекулой-мишенью BAFF-R или модулировать активность молекулы-мишениBAFF-R. Бесклеточные анализы данного изобретения пригодны для применения как растворимой формы, так и мембраносвязанной формы BAFF-R. В случае бесклеточных анализов, содержащих мембраносвязанную форму BAFF-R, может быть желательным использовать солюбилизирующий агент, чтобы мембраносвязанная форма BAFF-R поддерживалась в растворе. Примеры таких солюбилизирующих агентов включают неионные детергенты, такие как н-октилглюкозид, н-додецилглюкозид, н-додецилмальтозид,октаноил-M-метилглюкамид, деканоил-N-метилглюкамид, Тритон Х-100, Тритон Х-114, Тезит,изотридециполи(простой эфир этиленгликоля)n, 3-(3-холамидопропил)диметиламминиол-1-пропансульфонат (CHAPS), 3-(3-холамидопропил)диметиламминиол-2-гидрокси-1-пропансульфонат (CHAPSO) или N-додецил-N,N-диметил-3-аммонио-1-пропансульфонат. В более чем одном варианте вышеописанных способов данного изобретения может быть желательным иммобилизация либо BAFF-R, либо его молекулы-мишени для облегчения отделения образовавших комплексы форм от не образовавших комплексы форм одного или обоих белков, а также для обеспечения автоматизации этого анализа. Связывание тест-соединения с BAFF-R или взаимодействие BAFF-R с молекулой-мишенью в присутствии или в отсутствие соединения-кандидата может выполняться в любом сосуде, пригодном для помещения реагирующих веществ. Примеры таких сосудов включают в себя микротитрационные планшеты, тест-пробирки и микроцентрифужные пробирки. В одном варианте может быть обеспечен слитый белок, который добавляет домен, который позволяет одному или обоим белкам связываться с матриксом. Например, слитые белки GST-BAFF-R или слитые белки GST-мишень могут быть адсорбированы на гранулах глутатион-сефарозы (Sigma Chemical, St. Louis, МО) или дериватизованных глутатионом микротитрационных планшетах, которые затем объединяют с тест-соединением или тест-соединением и либо неадсорбированным белком-мишенью, либо белком BAFF-R, и смесь инкубируют в условиях, способствующих образованию комплекса (например, физиологических условиях в отношении соли и рН). После инкубирования гранулы или лунки микротитрационного планшета промывают для удаления всех несвязавшихся компонентов, матрикс иммобилизуют в случае гранул, комплекс определяют либо прямо, либо опосредованно, например, как описано выше. Альтернативно, эти комплексы могут быть диссоциированы из матрикса, и уровень связывания или активности BAFF-R определяют с использованием стандартных способов. Другие способы иммобилизации белков на матриксах могут быть также использованы в скрининганализах данного изобретения. Например, либо BAFF-R, либо его молекула-мишень могут быть иммобилизованы с использованием конъюгации биотина и стрептавидина. Биотинилированные молекулыBAFF-R или его молекулы-мишени могут быть получены из биотин-NHS (N-гидроксисукцинимид) с использованием способов, хорошо известных в данной области (например, набор для биотинилирования,Pierce Chemicals, Rockford, III), и иммобилизованы в лунках покрытых стрептавидином 96-луночных планшетов (Pierce Chemical). Альтернативно, антитела, реактивные с BAFF-R или молекуламимишенями, но не мешающие связыванию белка BAFF-R с его молекулой-мишенью, могут быть дериватизованы с лунками планшета и несвязанная мишень или BAFF-R улавливаются в этих лунках конъюгацией с антителами. Способы детектирования таких комплексов, наряду с описанными выше для GSTиммобилизованных комплексов, включают в себя иммунодетектирование комплексов с использованием антител, реактивных с BAFF-R или молекулой-мишенью, а также связанных с ферментом анализов, которые основаны на детектировании ферментативной активности, связанной с BAFF-R или молекулой- 29012833 мишенью. В другом варианте модуляторы экспрессии BAFF-R идентифицируют в способе, в котором клетку контактируют с соединением-кандидатом и определяют экспрессию мРНК или белка BAFF-R в этой клетке. Уровень экспрессии мРНК или белка BAFF-R в присутствии соединения-кандидата сравнивают с уровнем экспрессии мРНК или белка BAFF-R в отсутствие соединения-кандидата. Затем соединениекандидат может быть идентифицировано как модулятор экспрессии BAFF-R на основе этого сравнения. Например, когда экспрессия мРНК или белка BAFF-R является более высокой (статистически значимо более высокой) в присутствии соединения-кандидата, чем в его отсутствие, соединение-кандидат идентифицируют как стимулятор экспрессии мРНК или белка BAFF-R. Альтернативно, когда экспрессия мРНК или белка BAFF-R является более низкой (статистически значимо более низкой) в присутствии соединения-кандидата, чем в его отсутствие, соединение-кандидат идентифицируют как ингибитор экспрессии мРНК или белка BAFF-R. Уровень экспрессии мРНК и белка BAFF-R в клетки может быть определен способами, описанными здесь, для детекции мРНК и белка BAFF-R. Еще в одном варианте данного изобретения белки BAFF-R могут быть использованы в качестве белков-приманок в двухгибридном анализе или трехгибридном анализе (см., например, патент США 5283317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartelet al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; и Brent WO 94/10300),для идентификации других белков, которые связываются или взаимодействуют с BAFF-R (BAFF-Rсвязывающих белков или BAFF-R-bp) и модулируют активность BAFF-R. Такие BAFF-Rсвязывающие белки, по-видимому, также участвуют в размножении сигналов белками BAFF-R в качестве, например, элементов, расположенных выше или ниже по ходу передачи сигнала в пути BAFF-R. Двухгибридная система основана на модуляторной природе большинства факторов транскрипции,которые состоят из разделяемых ДНК-связывающего и активирующего доменов. Вкратце, этот анализ использует две различные ДНК-конструкции. В одной конструкции ген, который кодирует BAFF-R, слит с геном, кодирующим ДНК-связывающий домен известного фактора транскрипции (например, GAL-4). В другой конструкции ДНК-последовательность из библиотеки ДНК-последовательностей, которая кодирует неидентифицированный белок (жертву или пробу) сливают с геном, который кодирует активирующий домен этого известного фактора транскрипции. Если белок-приманка и белок-жертва способны взаимодействовать in vivo с образованием BAFF-R-зависимого комплекса, ДНК-связывающий и активирующий домены этого фактора транскрипции приводятся в тесную близость. Эта близость обеспечивает возможность транскрипции репортерного гена (например, LacZ), который функционально связан с регуляторным сайтом транскрипции, отвечающим на этот фактор транскрипции. Экспрессия репортерного гена может быть детектирована, и колонии клеток, содержащие этот функциональный фактор транскрипции, могут быть выделены и использованы для получения клонированного гена, который кодирует белок, взаимодействующий с BAFF-R. Кроме того, данное изобретение относится к новым агентам, идентифицированным вышеописанными скрининг-анализами, и их применениям для лечения, как описано здесь. Анализы детектирования. Части или фрагменты кДНК-последовательностей, идентифицированных здесь (и соответствующих полных генных последовательностей), могут быть использованы для многочисленных целей в качестве полинуклеотидных реагентов. Например, эти последовательности могут быть использованы для: (i) картирования их соответствующих генов на хромосоме; и, следовательно, локализации районов генов, связанных с генетическим заболеванием; (ii) идентификации индивидуума при использовании очень небольшой биологической пробы (тканевого типирования); и (iii) содействия в судебной идентификации биологической пробы. Эти применения описаны в подразделах ниже. Хромосомное картирование. После выделения последовательности (или части этой последовательности) гена эта последовательность может быть использована для локализации этого гена на хромосоме. Этот процесс называют хромосомным картированием. Таким образом, части или фрагменты BAFF-R, последовательности, описанные выше, могут быть использованы для картирования местоположения (позиционирования) геновBAFF-R, соответственно, на хромосоме. Картирование последовательностей BAFF-R относительно хромосомы является важной первой ступенью в корреляции этих последовательностей с генами, ассоциированными с заболеванием. Вкратце, гены BAFF-R могут быть картированы относительно хромосом получением ПЦРпраймеров (предпочтительно длиной 15-25 п.н.) из последовательностей BAFF-R. Компьютерный анализ последовательностей BAFF-R может быть использован для быстрого отбора праймеров, которые не простираются более чем на один экзон, в геномной ДНК, осложняя, таким образом, процесс амплификации. Затем эти праймеры могут быть использованы для ПЦР-скрининга соматических клеточных гибридов,содержащих индивидуальные хромосомы данного вида. Только гибриды, содержащие видоспецифический ген, соответствующий последовательностям BAFF-R, будут давать амплифицированный фрагмент. ПЦР-картирование соматических клеточных гибридов является быстрой процедурой для отнесения конкретной последовательности к конкретной хромосоме. Три или более последовательности могут быть

МПК / Метки

МПК: C12N 15/62, A61K 48/00, G01N 33/53, C07K 14/715, G01N 33/68, C12Q 1/68, C12N 15/10, A61K 38/17, C12N 15/12, C07K 16/28, C07H 21/04

Метки: антител, выделенные, полипептиды, таких, baff-r, анти, способы, кислоты, антитела, кодирующие, полипептидов, кислот, применения, нуклеиновых, нуклеиновые

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/30-12833-vydelennye-polipeptidy-baff-r-nukleinovye-kisloty-kodiruyushhie-polipeptidy-baff-r-antitela-anti-baff-r-i-sposoby-primeneniya-takih-polipeptidov-nukleinovyh-kislot-i-antitel.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Выделенные полипептиды baff-r, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды baff-r, антитела анти baff-r и способы применения таких полипептидов, нуклеиновых кислот и антител</a>