Аналоги глюкагонподобного пептида-2 (glp-2)

Описаны аналоги GLP-2, включающие один или более заместитель по сравнению c [hGly2]GLP2, обладающие улучшенной биологичесой активностью in vivo и/или улучшенной химической стабильностью, оцененной in vitro анализом на стабильность. В частности, описанные здесь предпочтительные аналоги GLP-2 включают заместители в одной или более позиции 8, 16, 24 и/или 28 последовательности дикого типа GLP-2, необязательно в комбинации с дополнительными заместителями в позиции 2 (как указано во введении) и в одной или более позиции 3, 5, 7,10 и 11 и/или удаление одной или более аминокислоты 31-33 и/или присоединение к N-концу или С-концу стабилизирующей пептидной последовательности. Аналоги особенно полезны для профилактики или лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта и для снижения побочных эффектов химиотерапии. 014184 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к аналогам глюкагонподобного пептида-2 (GLP-2) и их медицинскому применению, например, в профилактике или лечении желудочно-кишечных заболеваний и для снижения побочных эффектов химиотерапии и лучевой терапии. Уровень техники, предшествующий изобретениюGLP-2 представляет собой пептид, состоящий из 33 аминокислот, выделяющийся в посттрансляционном процессинге проглюкагона в кишечных L энтероэндокринных клетках и определенных областях ствола головного мозга. Он секретируется совместно с глюкагонподобным пептидом-l (GLP-1), оксинтомодулином и глицентином в ответ на прием нутриента.GLP-2 индуцирует значительный рост эпителиальной ткани слизистой оболочки тонкого кишечника посредством стимуляции пролиферации стволовых клеток в криптах и ингибирования апоптоза на ворсинках (Drucker et al. Proc Natl Acad Sel Acad Sci USA. 1996, 93:7911-6). GLP-2 также ингибирует эвакуацию из желудка и секрецию кислоты желудочного сока (Wojdemann et al. J Clin Endocrinol Metab. 1999, 84:2513-7), усиливает функцию интестинального барьера (Benjamin et al. Gut. 2000, 47:112-9), стимулирует транспорт гексозы в кишечнике путем повышения регуляции переносчиков глюкозы (Cheeseman, Am J Physiol. 1997, R1965-71) и увеличивает ток крови в кишечнике (Guan et al. Gastroenterology. 2003, 125, 136-47).GLP-2 связывается с G-белок сопряженным рецептором, принадлежащим к классу II семейства глюкагона-секретина (1). Рецептор GLP-2 локализован только в тонком кишечнике, толстой кишке и желудке, участках, известных как ответственные за GLP-2 (Yusta et al. Gastroenterology. 2000,119:744-55). Однако остается неясным механизм стимуляции клетки-мишени рецептора GLP-2 в желудочнокишечном тракте и плохо понятны внутриклеточные медиаторы прямого направления, сопряженные с рецептором GLP-2. Демонстрация специфических и благоприятных эффектов GLP-2 в тонком кишечнике вызвала сильный интерес к использованию GLP-2 для лечения кишечных заболеваний или поражений. Кроме того, было выявлено на целом ряде преклинических моделей повреждений кишечника, включая мукозиты, индуцированные химиотерапией, повреждения, вызванные ишемией-реперфузией, колиты, вызванные сульфатом декстрана, и генетические модели воспалительных заболеваний кишечника, что GLP-2 предотвращает или снижает повреждения эпителиальных тканей слизистой (Sinclair and Drucker, Physiology 2005:357-65). GLP-2 секретируется как пептид из 33 аминокислот с следующей последовательностью: H-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-IleAsn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH. Инактивация человеческого GLP-2 (3-33) ферментом DPPIV происходит за счет быстрого отщепления у аланина в положении 2 NH2 группы. Эта быстрая ферментативная деградация GLP-2 (1-33) в дополнение к почечному клиренсу ведет к тому, что период полужизни для пептида составляет около 7 мин (Tavares et al., Am. J. Physyol. Endocrinol. Metab. 278:E134E139, 2000). В патенте США 5994500 (Drucker et al.) описываются антагонисты GLP-2 и их воздействие на рост тканей желудочно-кишечного тракта. Предполагалось, что антагонисты входят в состав фармацевтических препаратов, используемых для лечения гиперплазии или индуцирования гипоплазии. В патенте США 5994500 структура GLP-2 млекопитающих была изменена мутациями, такими как замещения и делеции. В патентах США 6184208, 5789379 и 6184201 описываются аналоги GLP-2 и их медицинское применение. Все аналоги получены замещениями и/или делециями в человеческом GLP-2.DaCambra et al. (Biochemistry 2000, 39, 8888-8894) описывает структурные детерминанты активности GLP-2. Примерами таких детерминант являются Phe6 и Thr5, которые отвечают за связывание и активацию рецептора GLP-2. В WO 97/39031 описан аналог GLP-2 [Gly2]GLP-2, где аланин в позиции 2 был замещен глицином с получением пептида, устойчивого к расщеплению DPPIV. Замещение аланина приводит к росту стабильности и активности пептида. Патентная заявка описывает использование аналога GLP-2 при лечении заболеваний, связанных с воспалением и разрушением эпителия слизистой оболочки кишечника. Последние включают все виды резекции тонкого кишечника, воспалительные заболевания кишечника, мукозиты, вызванные химиотерапией, и повреждения, вызванные ишемией. В WO 02/066511 описаны аналоги GLP-2, имеющие продленный период полужизни in vivo, и их применение в качестве медикаментов при лечении желудочно-кишечных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника.WO 01/41779 описывает использование h[Gly2] GLP-2 для профилактики ингибирования апоптоза,индуцированного химиотерапией, и стимуляции способности клеток к выживанию. Все цитированные здесь ссылки введены в полном объеме. Многие ученые предлагали применение GLP-2 или аналогов GLP-2 для лечения различных заболеваний. Однако все еще существует потребность в улучшенных и стабильных аналогах GLP-2. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к аналогам GLP-2, которые включают один или более заместите-1 014184 лей по сравнению с диким типом GLP-2 и которые обладают улучшенной биологической активностью invivo и/или улучшенной химической стабильностью, например, определяемой пробой на стабильность invitro. В частности, предпочтительные аналоги GLP-2 включают заместители в одной или более позициях 8, 16, 24 и/или 28 последовательности GLP-2 дикого типа необязательно в комбинации с дополнительными замещениями позиции 2 (как упомянуто во введении) и одной или более позиций 3, 5, 7, 10 и 11,и/или одной или более делецией аминокислот в позициях 31-33 последовательности GLP-2 дикого типа,и/или дополнением N-конца или С-конца, стабилизирующим пептидную последовательность. Также и к аналогам, имеющим улучшенную химическую стабильность и/или биологическую активность, настоящее изобретение также относится к соединениям, обладающим способностью увеличивать рост тканей в тонком кишечнике по сравнению с толстым кишечником и наоборот, в частности, включая модификацию одной или более позиций Asp3, и/или Ser8, и/или Asn16, и/или Asn24, и/или Gln28 последовательности GLP-2 дикого типа. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к аналогу GLP-2, представленному общей формулой IX10 представляет собой Met, Leu, Nle или стабильно окисленную Met-замещенную аминокислоту.Z1 и Z2 независимо отсутствуют или представляют пептидную последовательность из 3-20 аминокислотных единиц, выбранных из группы, состоящей из Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys,Arg, His, Met и Orn; где аналог GLP-2 включает один или более заместитель, выбранный из Х 8, представляющий собойSer, и/или X16, представляющий собой Ala, и/или Х 24, представляющий собой Ala, и/или Х 28 представляющий собой Ala; или его фармацевтически приемлемая соль, или производное. В другом аспекте настоящее изобретение относится к аналогу GLP-2, представленному общей формулой IIX10 представляет собой Met, Leu, Nle или стабильно окисленную Met-замещенную аминокислоту.Z1 и Z2 независимо отсутствуют или представляют пептидную последовательность из 3-20 аминокислотных единиц, выбранных из группы, состоящей из Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys,Arg, His, Met и Orn; где аналог GLP-2 включает один или более заместитель, выбранный из Х 8, представляющий собойSer, и/или X16, представляющий собой Ala, и/или Х 24, представляющий собой Ala, и/или Х 28, представляющий собой Ala; или его фармацевтически приемлемая соль, или производное. В другом аспекте настоящее изобретение относится к аналогу GLP-2, представленному общей формулой IIIX10 представляет собой Met, Leu, Nle или стабильно окисленную Met-замещенную аминокислоту.Z1 и Z2 независимо отсутствуют или представляют пептидную последовательность из 3-20 аминокислотных единиц, выбранных из группы, состоящей из Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys,Arg, His, Met и Orn; где аналог GLP-2 включает один или более заместитель, выбранный из Х 8, представляющий собойSer, и/или X16, представляющий собой Ala, и/или Х 24, представляющий собой Ala, и/или Х 28, представляющий собой Ala; или его фармацевтически приемлемая соль, или производное,где X16 не является Ala, а представляет собой Asn. В определенных вариантах воплощения настоящего изобретения Z1 представляет собой R1 и может быть Н, a Z2 представляет собой R2 и может быть ОН. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения аналог GLP-2 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную последовательности GLP-2 дикого типа (133), приведенной во введении заявки, более предпочтительно по меньшей мере на 63% идентичную последовательности, более предпочтительно по меньшей мере на 66% идентичную последовательности, и еще более предпочтительно, по меньшей мере на 69% идентичную последовательности. Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности в отношении полипептидных последовательностейGLP-2 определяется как процентное соотношение аминокислотных остатков в испытуемой последовательности, идентичных аминокислотным остаткам последовательности GLP-2 дикого типа после выравнивания последовательностей и введения пробела, при необходимости, с достижением максимального процента идентичности последовательности, при этом какие-либо консервативные заместители не учитываются как часть идентичности последовательности. Выравнивание последовательности может быть-3 014184 осуществлено специалистом в данной области техники с использованием технологий, хорошо известных из предшествующего уровня техники, например с использованием общедоступного программного обеспечениия, такого как BLAST, BLAST2 или Align, см. BLAST, BLAST2 или Align software, см. Altschul etal. (Genomics, 46, 24, 36, 1997) и http://molbiol.soton.ac.uk/compute/align.html для Align program. Процент идентичности последовательности, использованный здесь и в соответствии с настоящим изобретением, определен с использованием этих программ и их стандартных настроек. В более общем смысле, специалист в данной области техники может легко определить подходящие параметры для определения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания полной длины сравниваемых последовательностей. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения настоящего изобретения аналоги пептидаGLP-2, представленные формулой I, II или III, включают заместители в более чем одной позиции Х 8,X16, Х 24 и/или Х 28 и/или комбинацию этих заместителей с другими заместителями, предпочтительно в позициях Х 3, Х 5, Х 7, X10 и/или X11. Примеры комбинаций Х 8, X16, Х 24 и/или Х 28, которые приведены в формулах I-III, включают Примеры заместителей в позициях Х 3, Х 5, Х 7, X10 и/или X11, приведенных в формулах I-III, могут быть скомбинированы с заместителями в одной или более позициях Х 8, X16, Х 24 и/или Х 28 включают или удалена одна или более из позиций Х 31-Х 33 в комбинации с выше приведенными изменениями в позициях 8, 16, 24 и/или 28. Отдельные примеры соединений GLP-2 по настоящему изобретению приведены ниже в детальном описании настоящего изобретения. Настоящее изобретение относится как к аналогам GLP-2, обладающим улучшенной химической стабильностью и биологической активностью, так и к соединениям, которые обладают способностью преимущественно усиливать рост ткани тонкого кишечника по сравнению с тканями толстого кишечника и наоборот. В частности, описанные здесь эксперименты показывают, что замещения в позицияхAsp3, и/или Ser8, и/или Asn16, и/или Gln28 последовательности GLP-2 дикого типа обеспечивают при введении тестируемым животным преимущественно увеличение массы тонкого кишечника по сравнению с массой толстого кишечника. Эти полученные результаты свидетельствуют о том, что эти соединения, приведенные в качестве примера, могут быть использованы для лечения состояний, когда преимуществом является эффект усиления роста тканей тонкого кишечника, в то время как рост тканей толстого кишечника меньше и наоборот. Таким образом, соединения, являющиеся предпочтительными для роста тканей тонкого кишечника,включают один или более заместителей в позициях 3, 8, 16 и/или 28 GLP-2 дикого типа. Такие соединения могут являться причиной избирательного роста тканей тонкого кишечника по сравнению с тканями толстого кишечника. Они могут быть использованы в состояниях, вызванных неблагоприятным воздействием, или в состояниях, относящихся к проблемам тонкого кишечника. Предпочтительно такие соединения, оказывающие избирательное воздействие на рост ткани тонкого кишечника, включают заместители более чем одной позиции Х 3, Х 7, X16, Х 24, Х 28, Х 31, Х 32 и/или Х 33. Таким образом, соединения, оказывающие избирательное воздействие на рост ткани тонкого кишечника, могут включать более чем один заместитель Х 3, представляющий собой Glu, X7, представляющий собой Ser, X16, представляющий собой Ala, X24, представляющий собой Ala, X28, представляющий собой Ala, X31, представляющий собой Ile, Х 32, представляющий собой Thr, и Х 33, представляющий собой Asp. Аминокислотные остатки в позициях Х 31, Х 32 и Х 33 необязательно могут быть удалены. Соединения, приведенные в качестве примеров, стимулирующие преимущественно эпителиальный рост в тонком кишечнике, включают 1809, 1818, 1819, 1820, 1826, 1827, 1844, 1845, 1846, 1848, 1849,1850, 1851, 1852, 1853, 1855, 1857, 1858, 1859. С другой стороны, соединения по настоящему изобретению, не имеющие этих модификаций, на-5 014184 пример, которые включают один или более заместитель в позициях 10, 11 и/или 24, могут быть предпочтительными для индуцирования преимущественного роста тканей толстого кишечника по сравнению с тканями тонкого кишечника. Они могут быть использованы в состояниях, вызванных неблагоприятным воздействием или в состояниях, относящихся к проблемам толстого кишечника. Такие соединения, оказывающие избирательное воздействие на рост ткани толстого кишечника,включают заместители в позициях Х 3, Х 8 и/или Х 24. Например, они могут включать более чем один заместитель, выбранный из Х 3, представляющий собой Asp, X8, представляющий собой Asp, и Х 24, представляющий собой Ala. Аминокислотные остатки в позициях Х 31, Х 32 и Х 33 необязательно могут быть удалены. Соединения, приведенные в качестве примеров, стимулирующие преимущественно эпителиальный рост в толстом кишечнике, включают 1830, 1831, 1835, 1836, 1839, 1840,1841 и 1843. Соединения, приведенные в качестве примеров, не оказывающие преимущественной стимуляции на рост тканей тонкого кишечника или рост тканей толстого кишечника: [Gly2]GLP-2 (то есть молекулы,приведенные в качестве ссылки), 1559, 1821, 1822, 1823, 1825, 1828, 1829, 1832, 1833, 1834, 1842, 1854. Соединения по настоящему изобретению также обладают повышенной химической стабильностью,например, к кислотному гидролизу, окислению и дезамидированию. Считается, что заместители в позициях Х 3 и/или Х 33 могут улучшать стабильность к кислотному гидролизу. Заместитель в позиции X10 может улучшать стабильность к окислению. Заместитель в одной или более позициях X11, X16 и/или Х 24 может повышать стабильность к дезамидированию. Кроме того, аналог GLP-2 по настоящему изобретению демонстрирует усиление стабильности к деградации в кислотном растворе, к дезамидированию и/или к окислительной деградации по сравнению с Gly2-GLP-2. Предпочтительно аналог GLP-2 сохраняет уровень чистоты, полученный при эксперименте, по меньшей мере на 70% по сравнению с начальным уровнем чистоты по меньшей мере в одном тесте на деградацию, описанном ниже в примере 7. Кроме того, или в качестве альтернативы, он сохраняет уровень чистоты, полученный при эксперименте, по меньшей мере на 60% по сравнению с начальной чистотой в растворе HCl 0,1 М после 12 дней. Кроме того, или в качестве альтернативы, он сохраняет уровень чистоты, полученный при эксперименте, по меньшей мере на 70% по сравнению с начальной чистотой в растворе NH4HCO3 0,1 М после 6 дней. В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей аналог GLP-2, как описано выше, или его соль, или производное в смеси с носителем. В предпочтительных вариантах воплощения настоящего изобретения композиция является фармацевтически приемлемой композицией, и носитель является фармацевтически приемлемым носителем. Аналог пептида GLP-2 может представлять собой фармацевтически приемлемую аддитивную соль кислоты аналога GLP-2. В другом аспекте настоящее изобретение относится к аналогу GLP-2, как описано выше, или его соли для применения в лечении. В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению аналога GLP-2, или его соли,или производного для получения лекарственного средстваа для лечения и/или профилактики желудочнокишечных заболеваний, таких как лечение у новорожденных нарушений кишечной функции, остеопороза, состояний, связанных с DPP-IV (дипептидилпептидазой-IV). Например, желудочно-кишечные заболевания включают язвенные заболевания, гастриты, расстройства пищеварения, синдром недостаточности всасывания, синдром укороченного кишечника, синдром прямокишечно-маточного углубления, воспалительные заболевания кишечника, брюшные спру (например, возникающие из-за глютеновой энтеропатии или глютенового заболевания), тропическую спру, гипогаммаглобулемическую спру, энтериты, региональный энтерит (болезнь Крона), язвенные колиты, синдром раздраженного кишечника, связанный с диареей, повреждения тонкого кишечника и синдром укороченной тонкой кишки. Другие состояния, которые могут лечить аналогами GLP-2 по настоящему изобретению, или для которых могут быть применены аналоги GLP- 2 для профилактики или лечения, включают лучевые энтериты, инфекционные или постинфекционные энтериты, повреждения тонкого кишечника из-за воздействия токсических или других химических агентов. Это может потребовать введение аналога GLP-2 перед, одновременно с или после курса химиотерапии или лучевой терапии для снижения побочных эффектов химиотерапии, таких как диарея, абдоминальные спазмы и рвота и уменьшения структурных и функциональных повреждений кишечного эпителия в результате химиотерапии или лучевой терапии. Кроме того, настоящее изобретение также относится к терапевтическому набору, включающему химиотерапевтические препараты для лечения рака и аналог GLP-2 по настоящему изобретению, каждый необязательно в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Два терапевтических агента могут быть упакованы раздельно (например, в отдельных емкостях) для раздельного введения или могут входить в состав одной композиции. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей химиотерапевтические препараты для лечения рака и аналог GLP-2 по настоящему изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Для пациентов с неоплазией слизистой желудочно-кишечного тракта или с повышенным риском возникновения неоплазии слизистой желудочно-кишечного тракта желательно выбирать соединение,которое снижает или упраздняет риск возникновения побочных эффектов, таких как стимуляция или-6 014184 обострение неоплазии слизистой желудочно-кишечного тракта. Например, при выборе соединения для лечения пациента с неоплазией толстой кишки (как доброкачественной, так и злокачественной) или при риске развития неоплазии толстой кишки, может быть более приемлемым выбор соединения, селективного для тонкого кишечника по сравнению с толстой кишкой, чем неселективного соединения, или соединения, которое является селективным для толстой кишки по сравнению с тонкой. В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению аналогов GLP-2 для получения лекарственных средств для лечения и/или профилактики недостаточности или нарушения питания, например, состояний, таких как сидром атрофии, такой как катехия или анорексия. В другом аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аналог GLP-2, описанный выше. В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему вышеуказанную последовательность нуклеиновой кислоты, необязательно в комбинации с последовательностями, направляющими экспрессию, и клеткам-хозяевам, трансформированным векторами экспрессии. Предпочтительно клетки-хозяева способны экспрессировать и секретировать аналог GLP-2. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения аналога GLP-2, способ включает культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессирования аналога GLP-2, и очистку полученного таким образом аналога GLP-2. В другом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте по настоящему изобретению, вектору экспрессии по настоящему изобретению или клетке-хозяину, способной экспрессировать и секретировать аналог GLP-2 по настоящему изобретению для применения в терапии. Следует понимать, что нуклеиновая кислота, вектор экспрессии и клетки-хозяева могут использоваться для лечения любого из описанных здесь заболеваний, которое может лечиться аналогами GLP-2. Ссылки на терапевтические композиции, содержащие аналог GLP-2 по настоящему изобретению, или введение аналогаGLP-2 по настоящему изобретению должны включать в свой объем введение нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетки-хозяина по настоящему изобретению, за исключением тех случаев, когда в контексте предусмотрено иное. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения желудочно-кишечных заболеваний у пациента, нуждающегося в нем, введением эффективного количества аналога GLP-2, описанного выше, или его соли, или производного, или нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетки хозяина по настоящему изобретению. Примеры желудочно-кишечных заболеваний приведены выше. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии у пациентов, нуждающихся в этом, способ включает введение эффективного количества аналога GLP-2, описанного выше, или его соли, или производного, или нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетки хозяина по настоящему изобретению. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики недостаточности или нарушения питания, например состояний, таких как сидром атрофии, такой как катехия или анорексия, способ включает введение эффективного количества аналога GLP-2, описанного выше,или его соли, или производного, или нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетки хозяина по настоящему изобретению. Варианты воплощения настоящего изобретения будут описаны более детально путем приведения примеров и не ограничиваются ссылкой на прилагаемые фигуры. Описание чертежей Фиг. 1. Примеры данных по эффектам полной дозы четырех селективных соединений для тонкого кишечника (соединения 1846, 1855, 1848 и 1858 в расчете на массу тонкого кишечника (SI) C57BL мышей). Соединения вводились путем подкожных инъекций дважды в день в течение трех дней в следующих дозах: 0 (носитель), 5, 15, 45, 135, 405 нмоль/кг (n=6/дозу группы). Результаты каждого уровня доз сравнивали с результатами, полученными при таких же дозах на мышах, парно обработанных неселективным эталонным соединением [Gly2]GLP-2. Для корректировки в зависимости от изменений массы тела (BW) масса тонкого кишечника (SI) была выражена по отношению к BW (SI-BW соотношение), и результат изменений роста при каждом уровне дозы нормализовали по результату, полученному при использовании неселективного эталонного соединения [Gly2]GLP-2. Результаты показали, что при дозах в пределах 5-405 нмоль/кг отношения эффекта дозы селективных соединений для тонкого кишечника 1846, 1855, 1848 и 1858, значительно отличались от отношений эффекта дозы неселективного эталонного соединения [Gly2]GLP-2, (p0,05 двухфакторный ANOVA), при этом все четыре соединения стимулировали рост ткани тонкого кишечника с максимальными ответами, которые были значительно выше, чем у[Gly2]GLP-2. Приведенные значения указаны СКО. : Р 0,05 по сравнению с эквимолярной дозой[Gly2]GLP-2. Фиг. 2. Примеры данных по эффектам полной дозы четырех селективных соединений для тонкого кишечника (соединение 1846, 1855, 1848 и 1858) приведены через индекс чувствительности мышей,представляющий отношение массы тонкого кишечника (SI) к массе толстой кишки (Si-Colon) по отношению к неселективному эталонному соединению [Gly2]GLP-2. Соединения вводились мышам C57BL подкожно дважды в день в течение трех дней следующими дозами: 0 (носитель), 5, 15, 45, 135, 405-7 014184 нмоль/кг (n=6/ дозу группы). Ответы на каждый уровень доз были сравнены с ответами, полученными при тех же самых дозах на мышах, парно обработанных неселективным эталонным соединением[Gly2]GLP-2. Индекс чувствительности (Si-Colon) рассчитывается как отношение массы тонкого кишечника (SI) к массе толстой кишки (Colon) и индекс чувствительности при каждом уровне дозы нормализовали по результату, полученному при использовании неселективного эталонного соединения [Gly2]GLP2. Результаты показали, что при дозах в пределах 5-405 нмоль/кг отношения эффекта дозы селективных соединений для тонкого кишечника 1846, 1855, 1848 и 1858 значительно отличались от отношений эффекта дозы неселективного эталонного соединения [Gly2]GLP-2, (p0,05 двухфакторный ANOVA), и соединения 1846, 1855 и 1848 продемонстрировали максимальное возрастание чувствительности тонкого кишечника по отношению к [Gly2]GLP-2. Значения выражены СКО. : Р 0,05 по сравнению с эквимолярной дозой [Gly2]GLP-2. Фиг. 3. Примеры данных по эффектам полной дозы трех соединений, селективных для тонкого кишечника (соединение 1857, 1849 и 1820) приведены на массе тонкого кишечника (SI) C57BL мышей. Соединения вводились подкожно дважды в день в течение трех дней следующими дозами: 0 (носитель), 5,15, 45, 135, 405 нмоль/кг (n=6/дозу группы). Ответы на каждый уровень доз были сравнены с ответами,полученными при тех же самых дозах на мышах, парно обработанных неселективным эталонным соединением [Gly2]GLP-2. Для корректировки изменений в массе тела (BW) масса тонкого кишечника (SI) была выражена относительно BW (SI-BW соотношение), и ростовая ответная реакция при каждом уровне дозы была приведена к ответу, полученному при использовании неселективного эталонного соединения [Gly2]GLP-2. Результаты показали, что при дозах в пределах 5-405 нмоль/кг отношения эффекта дозы селективных соединений для тонкого кишечника 1857, 1849 и 1820, значительно отличались от отношений эффекта дозы неселективного эталонного соединения [Gly2]GLP-2, (p0,05 двухфакторныйANOVA), и все соединения стимулировали рост ткани тонкого кишечника с максимальными ответами,которые были значительно выше, чем у [Gly2]GLP-2. Значения выражены СКО. : Р 0,05 по сравнению с эквимолярной дозой [Gly2]GLP-2. Фиг. 4. Примеры данных по эффектам полной дозы трех соединений, селективных для тонкого кишечника (соединение 1857, 1820 и 1849), приведены через индекс чувствительности мышей, представляющий отношение массы тонкого кишечника (SI) к массе толстой кишки (Si-Colon) по отношению к неселективному эталонному соединению [Gly2]GLP-2. Соединения вводились мышам C57BL подкожно дважды в день в течение трех дней следующими дозами: 0 (носитель), 5, 15, 45, 135, 405 нмоль/кг (n=6/ дозу группы). Ответы на каждый уровень доз были сравнены с ответами, полученными при тех же самых дозах на мышах, парно обработанных неселективным эталонным соединением [Gly2]GLP-2. Индекс чувствительности (Si-Colon) рассчитывается как отношение массы тонкого кишечника (SI) к массе толстой кишки (Colon), и индекс чувствительности при каждом уровне дозы был приведен к ответу, полученному при использовании неселективного эталонного соединения [Gly2]GLP-2. Результаты показали, что при дозах в пределах 5-405 нмоль/кг отношения эффекта дозы селективных соединений для тонкого кишечника 1857, 1849 и 1820 значительно отличались от отношений эффекта дозы неселективного эталонного соединения [Gly2]GLP-2 (p0,05 двухфакторный ANOVA), и все три соединения 1857, 1820 и 1849 продемонстрировали максимальное возрастание чувствительности тонкого кишечника по отношению к[Gly2]GLP-2. Значения выражены СКО. : Р 0,05 по сравнению с эквимолярной дозой [Gly2]GLP-2. Фиг. 5. Примеры данных по эффектам полной дозы неселективного соединения ([Gly2]GLP-2) и соединения, селективного для тонкого кишечника (соединение 1848), приведены на массе тонкого кишечника, массе толстой кишки и массе желудка. Соединения вводились мышам C57BL подкожно дважды в день в течение трех дней следующими дозами: 0 (носитель), 5, 15, 45, 135, 405 нмоль/кг (n=6/ дозу группы.) Результаты показали, что при дозах в пределах 5-405 нмоль/кг [Gly2]GLP-2 получена доза зависимая стимуляция роста тонкого кишечника, толстой кишки и желудка. При этом соединение 1848 вызывало дозазависимую стимуляцию только роста тонкого кишечника. Значения выражены СКО. : Р 0,05 по сравнению с носителем. Фиг. 6. Примеры показали воздействие соединения 1846 (5, 15, 45, 135, 405 и 810 нмоль/кг подкожно дважды в день; n=6/дозу группы) на А) массовое соотношение тонкого кишечника к массе тела (SIBW) и В) длину тонкого кишечника (SI длина) у мышей, обработанных цитостатическим препаратом 5 фторурацил (5-FU). Соединение 1846 вводили в течение трех дней перед и 4 дней совместно с 5-FU, 50 мг/кг интраперитонеально ежедневно. Для сравнения одна группа животных получала [Gly2]GLP-2 (405 нмоль/кг). Также показаны результаты для контрольной группы животных, обработанных носителем(PBS) или одним 5-FU. Соединение 1846 предотвращает 5-FU индуцированную атрофию тонкого кишечника (снижение массы органа и укорачивание) у C57BL мышей. Значения выражены СКО. Р 0,05 по сравнению с 5-FU. Фиг. 7. Пример показал воздействие соединения 1848 (5, 15, 45, 135, 405 и 810 нмоль/кг подкожно дважды в день; n=6/дозу группы) на А) массовое соотношение тонкого кишечника к массе тела (SI-BW) и В) длину тонкого кишечника (SI длина) у мышей, обработанных цитостатическим препаратом 5 фторурацил (5-FU). Соединение 1848 вводили в течение трех дней перед и 4 дней совместно с 5-FU, 50-8 014184 мг/кг интраперитонеально ежедневно. Для сравнения одна группа животных получала [Gly2]GLP-2 (405 нмоль/кг). Также показаны результаты для контрольной группы животных, обработанных носителем(PBS) или одним 5-FU. Соединение 1848 предотвращает 5-FU индуцированную атрофию тонкого кишечника (снижение массы органа и укорачивание) у C57BL мышей и высокие дозы соединения 1848 обладали большей эффективностью, чем [Gly2]GLP-2. Значения выражены СКО. : Р 0,05 по сравнению с 5-FU. Р 0,05 по сравнению с [Gly2]GLP-2. Фиг. 8. Пример показал воздействие соединения 1855 (5, 15, 45, 135 и 405 нмоль/кг подкожно дважды в день; n=6/дозу группы) на А) массовое соотношение тонкого кишечника к массе тела (SI-BW) и В) длину тонкого кишечника (SI длина) у мышей, обработанных цитостатическим препаратом 5 фторурацил (5-FU). Соединение 1855 вводили в течение 3 дней перед и 4 дней совместно с 5-FU, 50 мг/кг интраперитонеально ежедневно. Для сравнения одна группа животных получала [Gly2]GLP-2 (405 нмоль/кг). Также показаны результаты для контрольной группы животных, обработанных носителем(PBS) или одним 5-FU. Соединение 1855 предотвращает 5-FU индуцированную атрофию тонкого кишечника (снижение массы органа и укорачивание) у C57BL мышей, и высокие дозы соединения 1855 обладали большей эффективностью, чем эквимолярная доза [Gly2]GLP-2. Значения выражены СКО.Р 0,05 по сравнению с 5-FU.Р 0,05 по сравнению с [Gly2]GLP-2. Фиг. 9. Пример показал, что воздействие соединения 1857 (5, 15, 45, 135 и 405 нмоль/кг подкожно дважды в день; n=6/групп доз) на А) массовое соотношение тонкого кишечника к телу (SI-BW) и В) длину тонкого кишечника (SI длина) у мышей, обработанных цитостатическим препаратом 5-фторурацил (5FU). Соединение 1857 вводили в течение 3 дней перед и 4 дней совместно с 5-FU, 50 мг/кг интраперитонеально ежедневно. Для сравнения одна группа животных получала [Gly2]GLP-2 (405 нмоль/кг). Также показаны результаты для контрольной группы животных, обработанных носителем (PBS) или одним 5FU. Соединение 1857 предотвращает 5-FU индуцированную атрофию тонкого кишечника (снижение массы органа и укорачивание) у C57BL мышей и высокие дозы соединения 1857 обладали большей эффективностью, чем высокая доза [Gly2]GLP-2. Значения выражены СКО.Р 0,05 относится к 5-FU.P0,05 относится к [Gly2]GLP-2. Фиг. 10. Пример показал воздействие соединения 1846 (16, 80 и 400 нмоль/кг/день подкожно;n=6/дозу группы) на самцов крыс Spague-Dawley, обработанных цитостатическим препаратом 5 фторурацил (5-FU). Соединение 1846 вводили в течение 3 дней перед и 4 дней совместно с 5-FU, (75 мг/кг интраперитонеально ежедневно). Результаты сравнивали с ответами контрольных животных, обработанных носителем (солевой раствор) или одним 5-FU. Также показаны контроли с солевым раствором и 5-FU. Соединение 1846 предотвращает 5-FU индуцированную атрофию тонкого кишечника (снижение массы органа и укорачивание) у крыс. Значения выражены СКО. Р 0,05 по сравнению с 5-FU. Фиг. 11. Пример иллюстрирует терапевтическое воздействие соединения 1846 при диарее, индуцированной обработкой цитостатическим препаратом 5-фторурацил (5-FU). Крысы были обработаны 5-FU в течение 4 дней 75 мг/кг один раз в день (дни 1-4); (n=40 крыс). Половина животных получала дополнительную обработку соединением 1846 (400 нмоль/кг подкожно один раз в день) в течение 3 последних дней перед обработкой (дни с -3 по -1) и в течение 4 дней обработки 5-FU (дни 0-3). Крыс наблюдали дважды в день (утром и вечером) для определения наличия диареи у животного и тяжесть диареи оценивалась по шкале: (0) нет диареи; (1) слабая диарея - фекалии остаются вокруг ануса; (2) умеренная диарея фекалии остаются на задних конечностях и хвосте; и (3) - сильная диарея - фекалии остаются на передних конечностях и брюшке. На 5 день у около 70% крыс Spague-Dawley, получавших только 5-FU, развилась диарея (фиг. 11 А), при этом только у 30% крыс, которых обрабатывали 5-FU совместно с соединением 1846, развилась диарея (фиг. 11 В). Эти результаты показывают, что соединение 1846 эффективно предотвращает повреждение тонкого кишечника и, таким образом, развитие диареи при цитостатической обработке (5-FU). Фиг. 12. Этот пример иллюстрирует воздействие соединения 1846 на высоту комплекса криптаворсинка (фиг. 12 А) и толщину мышечного слоя (фиг. 12 В) тонкой кишки (т.е. средняя секция тонкого кишечника). Крысы Sprague Dawley получали внутривенно соединение 1846 (0,62; 3,41 или 6,2 мг/кг ежедневно) в течение 5 дней (n=6/дозу группы). Затем животных умертвляли и взяли биопсию (1 см) из тонкого кишечника, брали в 25 см от дистального конца пилорического сфинктера. Образцы биопсии фиксировали, погружали в парафин, разделяли на части и окрашивали гематоксилином и эозином. Окрашенные части исследовали под микроскопом и измеряли глубину крипт, высоту ворсинок, длину комплекса крипта-ворсинка и толщину мышечного слоя. Как показано, соединение 1846 вызывало дозазависимое увеличение длины комплекса крипта-ворсинка на эпителии тонкой кишки, но не наблюдалось воздействие на толщину мышечного слоя тонкой кишки. Эти результаты показывают, что соединение 1846 прежде всего влияет на пролифиративную активность тонкого кишечника через стимуляцию роста эпителия тонкого кишечника. Значения выражены СКО. Р 0,05 по сравнению с контролем с носителем (0 мг/кг/день). Фиг. 13. Этот пример иллюстрирует воздействие соединения 1848 на язвы тонкого кишечника, индуцированные индометацином. Самцы крыс Spague-Dawley были обработаны носителем (солевой рас-9 014184 твор; группа 1) или индометацином (7 мг/кг подкожно, ежедневно в течение 2 дней; группы 2-7). Давали только индометацин (группа 2) или в комбинации с преднизолоном (10 мг/кг подкожно, группа 3) или с 8, 40 или 200 нмоль/кг соединения 1848 подкожно раз в день (группы 4-6). Наконец, одна группа крыс получала комбинированное лечение преднизолоном (10 мг/кг подкожно) и соединением 1848 200 нмоль/кг подкожно 1 раз в день (группа 7). Лечение соединением 1848 было начато за 4 дня до обработки индометацином и продолжалось в течение 2 дней при обработке индометацином. На третий день крысы были умертвлены и после вскрытия тонкий кишечник промывали аккуратно 10% формалином и погружали в формалин на 5 мин, после чего кишку рассекали вдоль антибрыжеечного края и помещали в полипропиленовую планшету. Оставшееся содержимое кишечника удаляли с помощью пинцета. После фиксации в течение 24 ч при комнатной температуре ткань промывали деионизированной водой и поверхность окрашивали в течение 20 мин алциановым зеленым Alcian Green 3BX (Chroma), полученным в виде 0,5% раствора в 1% уксусной кислоте (Bie Berntsen). После удаления избытка окрашивающего раствора деионизированной водой препарат ткани перемещали в 70% спирт и исследовали с помощью стереомикроскопа при низком увеличении (х 7). Тонкий кишечник был сканирован начиная с пилоруса, и были измерены форма (круглые; линейные) и размер язв (для круглых язв - диаметр, для линейных язв длинаширина) с использованием стандартной линейки (с точность 0,5 мм). Язва была определена как площадь, на которой отсутствует эпителий. В заживающих язвах в качестве язвы рассматривалась площадь, на которой еще отсутствовал эпителий, даже если ворсинки отсутствовали на большей площади. Все исследования проводили слепым методом. Как показано на фиг. 13, индометацин явился причиной сильного язвенного поражения тонкого кишечника (общее изъязвление тонкого кишечника=33321 мм 2). Обработка преднизалоном послужила причиной значительного снижения площади изъязвления примерно на 29%. Обработка соединением 1848 предотвратила изъязвление, вызванное индометацином, в зависимости от дозы, и максимальная доза снизила общее изъязвление почти на 50% (17817 мм 2). Этот максимальный ответ на соединение 1848 был сильнее воздействия преднизалона и, кроме того, преднизолон в комбиниции с высокой дозой соединения 1848 не производил никакого дополнительного эффекта. Эти результаты показывают, что соединение 1848 эффективно предотвращает изъязвление тонкого кишечника, вызванное индометацином. Значения выражены СКО.Р 0,05 по сравнению с индометацином(группа 2).Р 0,05 относится к преднизалону (группа 3). Фиг. 14. Этот пример иллюстрирует воздействие соединения 1848 на содержание TNF- в тонком кишечнике крыс с воспалением, индуцированным индометацином. Самцы крыс Spague-Dawley были обработаны носителем (солевой раствор; группа 1) или индометацином (7 мг/кг подкожно, ежедневно в течение 2 дней; группы 2-7). Давали только индометацин (группа 2) или в комбинации с преднизолоном(10 мг/кг подкожно, группа 3) или с 8, 40 или 200 нмоль/кг соединения 1848 подкожно раз в день (группы 4-6). Наконец, одна группа крыс получала комбинированное лечение преднизолоном (10 мг/кг подкожно) и соединением 1848 200 нмоль/кг подкожно 1 раз в день (группа 7). Лечение соединением 1848 было начато за 4 дня до обработки индометацином и продолжалось в течение 2 дней при обработке индометацином. На третий день крысы были умертвлены и вскрыты, при вскрытии тонкий кишечник был разделен на три части, равной длины соответственно 1) двенадцатиперстная кишка и проксимальная часть тощей кишки, 2) средняя и дистальная часть тощей кишки и 3) подвздошная кишка. Образцы немедленно были подвергнуты быстрой заморозке в жидком N2 и хранились при температуре -80 С до момента проведения исследования. Гомогенизацию и экстракцию клеточного белка из сегментов тонкого кишечника проводили согласно следующей процедуре: ткани сегментов взвешивали и вводили 1,5 мл ледяной воды (4 С) на грамм тканей, экстракционный буфер (10 мМ Tris-HCl (Sigma) и 1 мМ EDTA (J.T.(PMSF, Fluka) и 1 г/мл каждого из ингибиторов протеазы апротинина, леупептина и пепстатина A(Roche Diagnostics. Ткани нарезали с помощью ножниц на мелкие кусочки и гомогенизировали 3 раза по 20 с (IKA UltraTurrax T25 homogenizer, JankeKunkel) при 9500 об./мин и быстро замораживали на льду в течение 30 с. Гомогенат центрифугировали при 20000g в течение 30 мин при температуре 4 С,супернатант собирали и хранили при температуре -20 С до момента проведения исследования TNF-. Экстракты белка тонкого кишечника анализировали на TNF- с использованием коммерчески доступного набора ELISA (сверхчувствительный набор ELISA для фактора- некроза опухоли крыс, BiosourceInternational Inc.). Предел обнаружения в пробе составляет 0,7 пг/мл. Экстракты белков анализировали на содержание общего белка с использованием коммерчески доступного анализа (DC protein assay, Bio-RadLaboratories LTD.). Уровни содержания TNF- в тканях тонкого кишечника были выражены относительно общего белка. Соединение 1848 значительно снизило уровни содержания провоспалительного цитакина TNF-, и этот эффект был наиболее заметен на проксимальном сигменте (первая треть тонкого кишечника). Соединение 1848 было более эффективно, чем преднизолон в проксимальной и средней частях(вторая треть тонкого кишечника). Примечательно, что соединение 1848 подавило воспаление в тонком кишечнике более эффективно, чем преднизолон, и совместное использование преднизолона и соединения 1848 не дало дополнительного эффекта. Эти результаты предполагают, что соединение 1848 обладает заметным противовоспалительным потенциалом при воспалительных заболеваниях тонкого кишечни- 10014184 ка. Значения выражены СКО.Р 0,05 по сравнению с индометацином (группа 2). Детальное описание изобретения Определения. Если не указанно иное, то следующие определения относятся к специальным терминам, использованным в приведенном ниже описании. В описании и формуле изобретения использованы традиционный однобуквенный и трехбуквенный коды как для обозначения природных аминокислот, так и для других-аминокислот, таких как саркозин (Sar), норлейцин (Me) и -аминоизомасляная кислота (Aib). Все аминокислотные остатки в пептидах по настоящему изобретению являются предпочтительно L формами. Однако также могут присутствовать D формы аминокислот. Предпочтительные соединения по настоящему изобретению обладают по меньшей мере однойGLP-2 биологической активностью, а именно вызывают рост тканей кишечника. Это может быть оценено in vivo опытами, например, как описано в примерах, в которых масса кишечника или его части определена после теста на животных, получавших или подвергшихся воздействию аналога GLP-2. Аналоги GLP-2 по настоящему изобретению имеют один или более аминокислотный заместитель,делецию, инверсию или дополнение по сравнению с нативным GLP-2 и как описано выше. Это определение также включает синонимы-миметики GLP-2 и/или агонисты GLP-2. Кроме того, аналоги по настоящему изобретению дополнительно могут иметь химическую модификацию по одной или более боковой группе аминокислот, -углеродных атомов, по концевой аминогруппе или концевой группе карбоновой кислоты. Химические модификации включают без ограничения введение химических молекул,создание новых связей и удаление химических молекул. Модификации по боковым группам аминокислот включают без ограничения ацилирование -аминогрупп лизина, N-алкилирование аргинина, гистидина или лизина, алкилирование карбоксильных групп глутаминовой кислоты или аспарогиновой кислоты и деамидирование глутамина или аспарагина. Модификации по амино-концу включают без ограничения дезаминирование, алкилирование низшим алкилом по N-концу, алкилирование низшим диалкилом по N-концу и N-ацильные модификации. Модификации концевой карбоксильной группы включают без ограничения амид, образование низшего алкиламида, диалкиламида и модификации с получением эфира низших алкилов. Предпочтительно здесь низшим алкилом является С 1-С 4 алкил. Кроме того, одна или более боковая группа или концевая группа могут быть защищены протективными группами, известными специалисту в области химии пептидов. -Углерод аминокислоты может быть моно- или диметилированным. Представленная здесь стабильная к окислению Met-замена аминокислоты означает замену, выбранную из группы, состоящей из Met(O) (метионинсульфоксида), Met(O)2 (метионинсульфона), Val, Ile, Asn,Glx (Glu или Gln), Tyr, Phe, Trp и предпочтительно Leu, Nle, Ala, Ser и Gly. Следует понимать, что пептиды по настоящему изобретению также могут быть в форме соли или другого производного. Соли включают фармацевтически приемлемые соли, такие как аддитивные соли кислоты и основные соли. Примеры аддитивных солей кислоты включают хлористо-водородные соли,соли лимонной кислоты и соли уксусной кислоты. Примеры основных солей включают соли, в которых катион выбран из щелочных металлов, таких как натрий и калий, щелочно-земельных металлов, таких как кальций, и ионов аммония N(R3)3(R4), где R3 и R4 независимо обозначают необязательно замещенный C1-6 алкил, необязательно замещенный С 2-6 алкенил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил. Другие примеры фармацевтически приемлемых солей описаны в Remingtons Pharmaceutical Sciences 17 edition. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton,PA, U.S.A., 1985 и более поздних изданиях и в the Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology. Другие производные аналогов GLP-2 по настоящему изобретению включают координационный комплекс с ионами металла, такого как Mn2+ и Zn2+, эфирами, такими как in vivo гидролизуемые эфиры,свободными кислотами или основаниями, гидратами, пролекарствами или липидами. Эфиры могут быть образованы между гидроксильными или карбоксильными группами, присутствующими в соединении и подходящей карбоновой кислотой или спиртом, участвующим в реакции, с использованием технологий,хорошо известных из предшествующего уровня техники. Производные соединений, такие как пролекарства, представляют собой одно из исходных соединений, поддающееся превращению in vivo или in vitro. Как правило, по меньшей мере одна из биологических активностей соединения будет снижена в пролекарственной форме соединения и может быть активирована конверсией из пролекарства с выделением из него соединения или метаболита. Примеры пролекарств включают использование защитных групп, которые могут быть удалены in situ, с выделением активного соединения или служат для игибирования клиренса лекарственного препарата in vivo. Присутствующие Z1 и Z2, каждая независимо, представляет собой пептидную последовательность из 3-20 или 4-20 аминокислотных остатков, например в пределах 4-15, более предпочтительно в пределах 4-10, в частности в пределах 4-7 аминокислотных остатков, например 4, 5, 6 или 7 аминокислотных остатков, таких как 6 аминокислотных остатков. Каждый из аминокислотных остатков в пептидных последовательностях Z может быть независимо выбран из Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg,His, Met, Orn. Предпочтительно аминокислотный остаток выбран из Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys,- 11014184Arg, His, Orn и Met, также как и аминокислотные остатки, входящие в формулу I, как описано в WO 01/04156, например Dbu (2,4-диаминомасляная кислота) или Dpr (2,3-диаминопропионовая кислота), более предпочтительно Glu, Lys и Met, особенно Lys. Вышеприведенные аминокислоты могут быть как вD-, так и в L-форме, но предпочтительно выше приведенные аминокислоты имеют L-форму. Особенно предпочтительны последовательности Z, представляющие собой последовательности из четырех, пяти или шести последовательных остатков лизина и особенно из шести последовательных остатков лизина. Примеры последовательностей Z приведены в WO 01/04156. В определенных вариантах воплощения настоящего изобретения Z1 отсутствует. В таких случаях Z2 может как присутствовать, так и отсутствовать. Настоящее изобретение включает следующие пептиды дополнительно к описанным ниже в экспериментальной части. Особенно предпочтительные соединения по настоящему включают соединения 1834, 1846, 1847,1848, 1849, 1855, 1857 и 1858.- 15014184 Исследование стабильности. Специалист в данной области техники способен разработать подходящие методы (например, количественные методы) для обнаружения продуктов деградации аналогов GLP-2, например, на основе методов, описанных здесь ниже. Деградация может представлять собой окисление, гидролиз и дезамидирование, в зависимости от идентичности и положения аминокислот в любом из приведенных аналогов GLP-2 и условий, таких как уровень рН раствора и температура. Соединения могут быть классифицированы по химической стабильности, когда соединения выдерживают в жестких условиях (например, в условиях,подобных вызывающим деградацию) и затем исследованы на содержание остаточных пептидов. Кроме того, знания, приобретенные в отношении основных продуктов деградации, образующихся в жестких условиях, будут важны для последующей разработки аналитического метода. Количественный анализ определения аналогов GLP. Специалист в данной области техники также способен разработать методы (например, количественные методы) для определения аналогов GLP в сложных средах или растворах (например, плазма, моча, тканевый гомогенат, клеточный гомогенат, слюна или им подобные) для исследования абсорбции,распределения, метаболизма и выделения аналогов GLP после введения млекопитающим или как части функциональных исследований клеточных систем in vitro. В одном варианте воплощения настоящего изобретения количественный анализ может основываться на антителах, полученных против аналогов GLP или их фрагментов. Антитела, полученные от иммунизированных животных, могут быть использованы для количественных анализов. В одном из примеров прямой сэндвич ELISA может быть проведен с использованием первого антитела, имеющего сродство к одной части молекулы, иммобилизованного в многолуночном планшете. Затем образец вносят в лунки, и аналог GLP связывается первым антителом. Связанный аналог GLP затем узнается вторым антителом, имеющим сродство к другой части GLP. Второе антитело может быть мечено ферментом (пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой или -галактозидазой) или радиоизотопом. Количество связанного аналога GLP затем может быть определено введением колориметрического субстрата или прямым подсчетом источников радиоизлучения или сцинтилляцией. В качестве альтернативы, количество связанного аналога GLP может быть определено косвенно с помощью добавления меченого антитела, имеющего сродство ко второму антителу. Концентрация в образце может быть оценена по отклику, полученному из кривой внешнего стандарта, включающей известные количества аналога GLP. В качестве альтернативы, антитела могут быть использованы для проведения прямого конкурентного иммунноанализа, где антитело, специфичное к аналогу GLP, иммобилизовано на многолуночном планшете, после чего образец выдерживают в лунках с определенной концентрацией меченого аналога GLP. Метка может представлять собой фермент, флуорофор, радиоизотоп или биотин и детектироваться с использованием, например, субстратов (например, колориметрически, флурометрически или хемилюменисцентно), специфичных для ферментов, сцинтилляции или авидина, связанного с ферментом, с последующим определением, как описано выше. Количество связанного меченого аналога GLP может быть определено подходящим способом и концентрацию аналога GLP, присутствующего в образце, устанавливают по отклику, полученному из кривой внешнего стандарта, как описано выше. В другом варианте воплощения настоящего изобретения количественный анализ может быть основан на методе жидкостной хроматомасспектрометрии. По такой схеме отклик от исследуемого фрагмента, специфичного для аналога GLP, получают при фрагментации исходного соединения, индуцированной столкновением с инертным газом (He или Ar). Перед фрагментацией компоненты образца могут быть разделены с использованием обращено-фазовой хроматографии или образец может быть инжектирован непосредственно в масс-спектрометр. При необходимости, образец может быть подвергнут предварительной обработке (т.е. введению ингибиторов протеазы, осаждению белков, твердофазной экстракции,иммуноаффинной экстракции и т.п.). Концентрация аналога GLP, присутствующего в образце, устанавливается по отклику кривой внешнего стандарта, как описано выше, потенциально после уточнения отклика с использованием внешнего стандарта, идентичного исследуемому аналогу GLP. Получение специфических антител. Специфические антитела против аналогов GLP или их фрагменты могут быть получены в млекопитающих и выделены из сыворотки. Аналоги GLP или их фрагменты могут быть использованы для иммунизации кроликов, мышей или других млекопитающих как непосредственно с адьювантом, так и аналогиGLP или их фрагменты могут быть химически связаны с молекулой-носителем (т.е. гемоцианином лимфы улитки, овальбумином, альбумином и т.п.) и инъецированы с адьювантом. Инъекции могут быть повторены с интервалом 2-4 недели, увеличенным для улучшения сродства и селективности антител. Поликлональные антитела могут быть выделены непосредственно из сыворотки. Для получения моноклональных антител В клетки, выделенные из иммунизированных животных, предпочтительно мышей,должны быть слиты с опухолевыми клетками с получением антителопродуцирующих гибридом. Скрининг и селекция подходящих клонов и антител могут быть осуществлены с использованием как иммунизированных аналогов GLP, так и их пептидов с последующим определением меченых антител. В качестве альтернативы, скрининг и селекция могут основываться на иммобилизированных антителах с последующей детекцией меченных с помощью аналогов GLP или их фрагментов. В любых случаях метка мо- 16014184 жет представлять собой радиоизотоп, фермент, флуорофор или биотин и детектироваться (например,колориметрически, флурометрически или хемилюменисцентно) с помощью, например, субстратов, специфических для ферментов, сцинтилляции или авидина, связанного с ферментом, с последующим определением, как описано выше. Синтез аналогов GLP-2. Аналоги по настоящему изобретению предпочтительно синтезируют посредством твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза. В этом контексте приводится ссылка на WO 98/11125 и в том числе Fields, GB et al., 2002. Таким образом, аналоги GLP-2 могут быть синтезированы многочисленными путями, включая, например, способ, который включает:(a) синтез пептида посредством твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза и выделение полученного таким образом синтетического пептида; или(b) если пептид сконструирован из природных аминокислот, кодирующая конструкция нуклеиновой кислоты экспрессирует пептид в клетке-хозяине, который выделяют из культуры клетки-хозяина,или(с) если пептид сконструирован из природных аминокислот, проводят in vitro бесклеточную экспрессию конструкцией нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, и выделяют продукты экспрессии или комбинация способов (а), (b) и (с) с получением фрагментов пептида с последующим связыванием фрагментов с получением пептида и выделением пептида. Таким образом, для некоторых аналогов по настоящему изобретению предпочтительно использование генноинженерных технологий. Это возможно в тех случаях, когда пептид достаточно большой (или получен как слитая конструкция) и когда пептид состоит только из природных аминокислот, которые могут быть транслированы из РНК в живых организмах. Фрагменты нуклеиновой кислоты, кодирующие пептиды по настоящему изобретению, представляют собой важные химические продукты для рекомбинантной генной технологии. Следовательно, дополнительный аспект настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей аналог GLP-2 по настоящему изобретению, где пептид предпочтительно включает природные аминокислоты. Фрагменты нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению представляют собой как фрагменты ДНК, так и фрагменты РНК. Фрагменты нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению обычно встраивают в подходящие векторы, чтобы получить клонирующие или экспрессионные векторы, несущие фрагменты нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению; такие новые векторы также являются частью изобретения. Детали, касающиеся конструкции указанных векторов настоящего изобретения, будут описаны ниже в рамках трансформированных клеток и микроорганизмов. Векторы, в зависимости от цели и способа применения, могут находиться в форме плазмид, фагов, космид, минихромосом или вируса, а также важньм вектором является депротеинизированная ДНК, которая экспрессируется в определенных клетках исключительно транзиентно. Предпочтительные клонирующие и экспрессионные векторы (плазмидные векторы) настоящего изобретения способны к автономной репликации, обеспечивая, таким образом,высокое число копий в целях высокого уровня экспрессии или высокого уровня репликации для последующего клонирования. Общая схема вектора настоящего изобретения включает следующие функционально связанные элементы в 5'3' направлении: промотор, регулирующий экспрессию фрагмента нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей лидерный пептид, обеспечивающий секрецию указанного фрагмента (во внеклеточное пространство или, по возможности, в периплазму), или лидерный пептид для разнообразных целей, например для комбинированной секреции, в качестве тэга для аффинной очистки, для ферментативного процессинга с целью коррекции пептида, а также для интеграции в мембрану полипептидного фрагмента; фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий пептид настоящего изобретения; и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая терминатор. При работе с векторами экспрессии в штаммах-продуцентах или клеточных линиях, в целях генетической стабильности трансформированной клетки, предпочтительно,чтобы вектор, вводимый в клетку-хозяина, интегрировался в геном клетки-хозяина. Векторы настоящего изобретения используются для трансформации клеток-хозяев в целях продукции модифицированного пептида настоящего изобретения. Такие преобразованные клетки, которые также являются частью изобретения, могут быть культивируемыми клетками или линиями клеток, используемыми для получения фрагментов нуклеиновой кислоты и векторов по настоящему изобретению, или использоваться для получения пептидов по настоящему изобретению с помощью рекомбинантных технологий. Предпочтительные трансформированные клетки по настоящему изобретению представляют собой микроорганизмы, такие как бактерии (такого вида как Escherichia (напр., Е. coli), Bacillus (напр., Bacillussubtilis), Salmonella или Mycobacterium (предпочтительно непатогенных видов, напр., М. bovis БЦЖ),дрожжи (такого вида, как Saccharomyces cerevisiae) и простейшие. В качестве альтернативы трансформи- 17014184 рованные клетки могут происходить из многоклеточного организма, то есть указанными клетками могут являться клетки гриба, клетки насекомого, клетки растения или клетки млекопитающих. Также интерес представляют клетки, полученные от человека, сравните описание клеточных линий и векторов ниже. В целях клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка являлась способной к репликации фрагмента нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения используются клетки, экспрессирующие нуклеиновый фрагмент; причем указанные клетки могут использоваться как для мелкомасштабного, так и для крупномасштабного производства пептидов по настоящему изобретениию. При получении пептида по настоящему изобретениию посредством трансформированных клеток,желательно, хотя и необязательно, чтобы продукт экспрессии либо экспортировался в культуральную среду, либо презентировался на поверхности трансформированной клетки. При выделении эффективной клетки-продуцента предпочтительно на ее основе получать устойчивую линию клеток, которая несет вектор по настоящему изобретениию и которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий пептид. Предпочтительно указанная устойчивая линия клеток секретирует или несет пептид по настоящему изобретениию, облегчая, таким образом, его очистку. В основном плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, которые происходят из совместимых с клеткой-хозяином видов, используются в совокупности с хозяевами. Вектор обычно несет участок репликации, а также маркерные последовательности, которые обеспечивают фенотипический отбор трансформированных клеток. Например, Е. coli обычно трансформируют, используя pBR322 (хотя существует ряд других полезных плазмид) плазмиду, полученную из Е. coli spp.(см., например, Bolivar et al., 1977). Плазмида pBR322 несет гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, что обеспечивает, таким образом, простой способ идентификации трансформированных клеток. Плазмида pBR или другая микробная плазмида или фаг должна также содержать или должна быть модифицирована таким образом, чтобы содержать промоторы, которые могут использоваться прокариотическим микроорганизмом для экспрессии. Промоторы, обычно используемые в конструировании прокариотической рекомбинантной ДНК,включают Р-лактамазную (пенициллиназные), систему на основе лактозного промотора (Chang et al.,1978; ltakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979), a также систему на основе триптофанового (trp) промотора(Goeddel et al., 1979; ЕР 0036776 А). Хотя указанные промоторы используются наиболее часто, были открыты и использовались другие микробные промоторы, причем была опубликована подробная информация относительно их нуклеотидных последовательностей, что позволяет специалисту в данной области техники функционально объединить их с плазмидными векторами (Siebwenlist et al., 1980). В дополнение к прокариотическим, эукариотическим микробам, также могут использоваться культуры дрожжей и промотор, который должен обеспечивать регулируемую экспрессию. Saccharomycescerevisiae или обычные хлебопекарные дрожжи являются наиболее распространенными среди эукариотических микроорганизмов, хотя доступны и множество других штаммов. Для экспрессии в Saccharomyces, например, обычно используют плазмиду YRp7 (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979;Tschemper et al., 1980). Указанная плазмида уже содержит ген trpl, который является селективным маркером для мутантного штамма дрожжей, неспособного расти на среде без триптофана, например АТСС 44076 или РЕР 4-1 (Jones, 1977). Присутствие trpl мутации, как особенности генома дрожжевой клеткихозяина, обеспечивает эффективную возможность для обнаружения трансформированных клеток по росту в отсутствии триптофана. Подходящие последовательности промотора в дрожжевых векторах включают промоторы для 3 фосфоглицерат киназы (Hitzman et al., 1980) или других гликолитических ферментов (Hess et al., 1968; Голландия, 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, гексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкоза-6-фосфат изомераза, 3-фосфоглицерат мутаза, пируваткиназа, триозафосфат изомераза, фосфоглюкоизомераза и глюкокиназа. При конструировании подходящих экспрессионных плазмид, в экспрессионный вектор также включены терминальные последовательности,связанные с 3'-концом экспрессируемых генов, в целях обеспечения полиаденилирования мРНК и терминации. Другими промоторами, имеющими дополнительное преимущество транскрипции, контролируемой условиями роста, являются промоторные области алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов деградации, связанных с метаболизмом азота, а также вышеуказанной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящим является любой плазмидный вектор, включающий функционирующие в дрожжах последовательности промотора, начала репликации и терминатора. В дополнение к микроорганизмам в качестве организмов-хозяев могут также использоваться культуры клеток, полученные из многоклеточных организмов. В принципе, может быть получена любая клеточная культура в независимости от того, является ли она культурой клеток позвоночных или беспозвоночных. Тем не менее, больший интерес вызывают клетки позвоночных и размножение позвоночного организма в культуре (культуре ткани) в последние годы ставшей стандартной методикой (Tissue Culture,1973). Примерами таких полезных линий клеток-хозяев являются клетки VERO и HeLa, линии яйцекле- 18014184 ток китайских хомячков (СНО), а также клетки W138, BHK, COS-7 293, Spodoptera frugiperda (SF) (коммерчески доступные как полные системы экспрессии, например, от Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, США и от Invitrogen), линия S2 клеток D. melanogaster, доступная от Invitrogen,PO Box 2312, 9704 СН Groningen, The Netherlands, и линии клеток MDCK. Экспрессионные векторы для таких клеток обычно включают (в случае необходимости) начало репликации, промотор, располагающийся перед экспрессируемым геном, наряду с любыми необходимыми участками связывания рибосомы, участками сплайсинга РНК, участками полиаденилирования и последовательностями терминатора транскрипции. Функции регулирования в векторах экспрессии для использования в клетках млекопитающих часто обеспечиваются вирусным материалом. Например, обычно используются промоторы, полученые из вируса полиомы, аденовируса 2, и наиболее часто из вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (SV40). Ранние и поздние промоторы вируса SV40 особенно полезны, так как оба легко могут быть получены из вируса в виде фрагмента, который также содержит начало репликации вируса SV40 (Fiers et al., 1978). Также могут использоваться меньшие или большие фрагменты SV40, если в них включена последовательность размером около 250 п.н., идущая от сайта HindIII до сайта BgII, расположенных в начале репликации вируса. Далее также возможно и чаще предпочтительно использовать промоторные или регуляторные последовательности, обычно связанные с последовательностью желаемого гена, если такие регуляторные последовательности совместимы с системами клеток-хозяев. Начало репликации может обеспечиваться либо конструкцией вектора, чтобы включать экзогенное начало репликации, которое может быть получено из SV40 или другого вируса (напр., вируса полиомы,аденовируса, вируса везикулярного стоматита, коровьего вируса папиломы), либо может обеспечиваться механизмом хромосомной репликации клетки-хозяина. Если вектор интегрирован в хромосому клеткихозяина, то последнее обычно является достаточным. Чтобы получить приемлемые уровни продукции в процессе рекомбинантного производства, может быть выгодным приготовить аналоги в виде слитых белков, или путем сшивания пептида с последовательностью, которая может служить аффинным тэгом (для простоты очистки), и/или имеющих в составе многократные повторы пептида. Указанные методы требуют присутствия подходящего сайта расщепления для пептидазы, тем не менее, специалист в данной области техники будет знать, как создать основные генетические конструкции. После получения с помощью рекомбинантных технологий, пептиды настоящего изобретения могут быть очищены методами, известными в уровне техники, включая многостадийную хроматографию (ионообменые, гельфильтрационные и аффинные хроматографические методы). В качестве альтернативы, в бесклеточных системах in vitro могут быть получены пептиды, состоящие из природных аминокислот. Это особенно целесообразно в тех случаях, когда пептиды могут быть токсичны для предполагаемых клеток-хозяев. Таким образом, настоящее изобретение также рассматривает использование бесклеточной трансляции/экспрессии in vitro для получения пептидов по настоящему изобретению. В связи с этим приведена ссылка на коммерчески доступные наборы in vitro трансляции,материалы и техническую документацию, например, от Ambion Inc, 2130 Woodward, Остин, ТХ 787441832, США. Наконец, доступные методы могут быть, конечно, скомбинированы с целью получения, например,полусинтетических аналогов. В связи с этим, пептидные фрагменты получают, используя по крайней мере 2 отдельных стадии или метода, сопровождаемых лигированием указанных фрагментов для получения конечного пептидного продукта. Фармацевтические композиции и введение. Аналоги GLP-2 по настоящему изобретению или их соли или производные могут входить в состав фармацевтических композиций, подготовленных к хранению или введению, которые при этом включают терапевтически эффективную дозу пептида GLP-2 по настоящему изобретению или его соль или производное в фармацевтически приемлемом носителе. Терапевтически эффективная доза соединения по настоящему изобретению будет зависеть от пути введения, вида обрабатываемого млекопитающего и физических особенностей определенного исследуемого млекопитающего. Указанные факторы и их отношение к определению указанной дозы известны квалифицированным специалистам, обладающим медицинскими навыками. Указанная доза и способ введения могут быть разработаны таким образом, чтобы достичь оптимальной эффективности и обеспечить доставку пептида в толстый кишечник, но будут зависеть при этом от таких факторов как вес, питание, параллельное лечение, а также от других факторов, известных квалифицированным специалистам,обладающим медицинскими навыками. Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, в которой аналог GLP-2, или его соль присутствует в дозировке, эффективной для терапии или профилактики желудочных и кишечных расстройств. Фармацевтически приемлемые соли соединений по настоящему изобретению, имеющих кислотную группу, могут быть образованы с использованием органических и неорганических оснований. Подходящие соли, образованные с основаниями, включают такие соли металлов, как соли щелочных или щлоч- 19014184 но-земельных металлов, например соли натрия, калия или магния; соли аммония и соли таких органических аминов, как морфолин, тиоморфолин, пиперидин, пирролидин, моно-, ди- или тринизший алкиламин (например, этил-трет-бутил-, диэтил-, диизопропил-, триэтил-, трибутил- или диметилпропиламин) или моно-, ди- или тригидроксинизший алкиламин (например, моно-, ди- или триэтаноламин). Также могут быть образованы внутренние соли. Аналогичным образом, когда соединение по настоящему изобретению включает основную группу, соответствующие соли могут быть образованы с использованием органических и неорганических кислот. Например, могут быть образованы соли со следующими кислотами: уксусной, пропионовой, молочной, лимонной, винной, янтарной, фумаровой, малеиновой, малоновой, миндальной, яблочной, фталевой, хлороводородной, бромоводородной, фосфорной, азотной, серной,метансульфоновой, нафталинсульфоновой, бензолсульфоновой, толуолсульфоновой и камфорсульфоновой, а также с другими известными фармацевтически приемлемыми кислотами. Также могут быть образованы соли присоединения аминокислот с такими аминокислотами, как лизин, глицин или фенилаланин. Квалифицированному специалисту, обладающему медицинскими навыками, будет очевидно, что"терапевтически эффективная доза" пептидов или фармацевтических композиций по настоящему изобретению изменится в зависимости от возраста, веса и от вида млекопитающего, подвергнутого терапии,от конкретных использованных соединений, специфического способа введения, а также желаемых эффектов и терапевтических показаний. Поскольку перечисленные факторы и их связь с определением указанной дозы известны в медицине, то определение терапевтически эффективных уровней дозировки и собственно дозы, необходимой для достижения желаемого результата профилактики и/или лечения желудочно-кишечных заболеваний, описанных здесь, а также другие медицинские показания, раскрытые здесь, будут находиться в компетенции специалиста в данной области техники. В настоящем изобретении "терапевтически эффективное количество" является таким количеством,которое уменьшает симптомы данного состояния или патологии и которое предпочтительно нормализует физиологические ответы у индивидуума с указанным состоянием или патологией. Уменьшение симптомов или нормализация физиологических ответов могут быть определены с использованием стандартных методов из уровня техники и могут меняться у индивидуума с указанным состоянием или патологией. В одном аспекте терапевтически эффективное количество одного или более аналогов GLP-2 или фармацевтической композиции, включающей один или более указанных аналогов GLP-2, является тем количеством, которое восстанавливает измеряемый физиологический параметр, в основном, до значения параметра у индивидуума без указанного состояния или патологии (предпочтительно до +30%, более предпочтительно до +20% и еще более предпочтительно до 10% значения параметра). В одном варианте осуществления настоящего изобретения введение соединений или фармацевтической композиции по настоящему изобретению начинают при более низких уровнях дозировки с увеличением уровней дозировки до достижения желаемого эффекта профилактики/лечения, соответствующего медицинским показаниям, таким как желудочно-кишечные заболевания. Это определило бы их терапевтически эффективное количество. Для пептидов по настоящему изобретению одного или как части фармацевтической композиции такие дозы могут находиться в пределах от около 0,01 до 100 мг/на кг массы тела, в пределах от около 0,01 до 10 мг/на кг массы тела, например, 10-100 мг/нa кг массы тела. Для терапевтического применения выбранный аналог GLP-2 объединяют с носителем, фармацевтически приемлемым для введения пептида выбранным способом. В соответствии с целями настоящего изобретения периферийные парентеральные способы введения включают внутривенные, внутримышечные, подкожные и внутрибрюшинные способы введения. Определенные соединения, используемые в настоящем изобретении, также могут быть пригодными для введения орально, ректально, назально или через нижние дыхательные пути. Указанные способы введения являются так называемыми непарентеральными способами введения. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает аналог GLP-2 по настоящему изобретению или его соль или производное и фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие фармацевтически приемлемые носители представляют собой носители, используемые традиционно с лекарствами на основе пептидов, такие как разбавители, наполнители и т.п. Фармацевтически приемлемые носители для терапевтического использования хорошо известны из предшествующего уровня техники и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, MackPublishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). Например, могут использоваться стерильный солевой и фосфатно-солевой буферы при слегка кислом или физиологическом рН. Буферными агентами могут быть фосфат, цитрат, ацетат, трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS), N-трис(гидрокисметил)метил-3-аминопропансульфоновая кислота (TAPS), бикарбонат аммония, диэтаноламин, гистидин, являющийся предпочтительным буфером, аргинин, лизин или ацетат или их смеси. Предпочтительные значения рН буферов находятся в диапазонах рН 4-8, рН 6,5-8, более предпочтительно рН 7-7,5. В состав фармацевтической композиции могут быть включены такие консерванты, как пара-, мета- и ортокрезол, метил- и пропилпарабен, фенол, бензиловый спирт, бензоат натрия, бензойная кислота, бензилбензоат, сорбиновая кислота,пропановая кислота, эфиры n-гидроксибензойной кислоты. В состав фармацевтической композиции могут быть включены стабилизаторы, которые предотвращают окисление, дезамидирование, изомеризацию, рацемизацию, циклизацию, гидролиз пептидов, такие как, например, аскорбиновая кислота, метио- 20014184 нин, триптофан, EDTA, аспарагин, лизин, аргинин, глутамин и глицин. В состав фармацевтической композиции могут быть включены стабилизаторы, предотвращающие агрегацию, образование волокон и преципитацию, такие как додецилсульфат натрия, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлоза, циклодекстрин. В состав фармацевтической композиции также могут быть включены органические модификаторы для солюбилизации или предотвращения агрегации, такие как этанол, уксусная кислота или ацетаты. В состав фармацевтической композиции могут быть включены изотонические агенты, такие как соли,например хлорид натрия, или наиболее предпочтительные из углеводов, например декстроза, маннитол,лактоза, трегалоза, сахароза или их смеси. В фармацевтическую композицию могут входить детергенты, такие как Tween 20, Tween 80, SDS,полоксамеры, например плюроник F-68, плюроник F-127. В фармацевтическую композицию могут входить красители и даже ароматизаторы. В другом варианте воплощения настоящего изобретения в фармацевтическую композицию может входить фармацевтически приемлемая аддитивная соль кислоты аналога пептида GLP-2. Могут быть использованы суспендирующие агенты. В фармацевтическую композицию для лиофилизации лиофилизируемого продукта могут входить органические модификаторы, такие как этанол, третичный бутиловый спирт, 2-пропанол, глицерин, полиэтиленгликоль. В фармацевтическую композицию для лиофилизации могут входить агенты-наполнители и изотонические агенты, такие как соль, например хлорид натрия, углеводы, например декстроза, маннитол, лактоза, трегалоза, сахароза или их смеси, аминокислоты, например глицин, глютамат, или инертные носители, такие как цистеин,лецитин или сывороточный альбумин человека или их смеси. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть получены и применены в виде таблеток, капсул или эликсиров для орального введения; суппозиториев для ректального введения; предпочтительно стерильных растворов или стерильного порошка или суспензии для введения инъекцией и т.п. Доза и способ введения могут быть подобраны для достижения оптимального эффекта, но зависят от таких факторов, как вес, диета, сопутствующее лечение и другие факторы, которые известны специалисту в области медицины. При парентеральном введении, таком как, например, внутривенное и подкожное, ежедневно инъецируемые фармацевтические композиции могут быть получены в традиционных формах, таких как водные растворы или суспензии; лиофилизованные формы, твердые формы или суспензии или эмульсии,подходящие для восстановления жидкостью непосредственно перед инъекцией. Разбавители для восстановления лиофилизованного продукта могут представлять собой подходящие буферы из выше приведенного списка, воду, физиологический раствор, декстрозу, маннитол, лактозу, трегалозу, сахарозу, лецитин, альбумин, глютамат натрия, цистеина гидрохлорид или воду для инъекций с введением детергентов, таких как Tween 20, Tween 80, полоксамеры, например плюроник F-68 или плюроник F-127, полиэтиленгликоль и/или с введением консервантов, таких как пара-, мета- и ортокрезол, метил- и пропилпарабен, фенол, бензиловый спирт, бензоат натрия, бензойная кислота, бензилбензоат, сорбиновая кислота, пропионовая кислота, эфиры п-гидроксибензойной кислоты, и/или с введением органического модификатора, такого как этанол, уксусная кислота, лимонная кислота, молочная кислота и их соли. Кроме того, если требуется, инъецируемые фармацевтические композиции могут включать незначительное количество нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие агенты или рН забуферивающие агенты. Могут быть использованы вещества, усиливающие абсорбцию (например, липосомы, детергенты и органические кислоты). В одном варианте воплощения настоящего изобретения получают соединения для введения инфузией, например, в качестве жидких питательных добавок для пациентов, получающих общую парентеральную нутритивную терапию (например, новорожденные или пациенты, страдающие кахексией или анорексией) или инъекцией, например, подкожно, интраперитонеально или внутривенно и, таким образом, примененные в виде водных растворов в стерильной и апирогенной форме и необязательно забуференных до физиологически допускаемого рН, например слабо кислый или физиологический рН. Состав для внутримышечного введения может быть основан на растворах или суспензиях в растительном масле,например масле канолы, кукурузном масле или соевом масле. Эти масла в основе составов могут быть стабилизированы антиоксидантами, например ВНА (бутилированный гидроксианизол) и ВНТ (бутилированный гидрокситолуол). Таким образом, пептидные соединения по настоящему изобретению могут быть введены с носителями, такими как дистиллированная вода или физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, 5% растворы декстрозы или масел. Растворимость аналога GLP-2 может быть повышена, если требуется, введением усилителя растворимости, такого как детергенты и эмульгаторы. Водный носитель или носитель может быть добавлен для применения в инъекциях с желатином,который служит для пролонгированного действия аналога GLP-2 в месте инъекции или рядом с ним для его медленного выделения при желаемом местном воздействии. В качестве альтернативы могут быть использованы такие желирующие агенты, как гиалуроновая кислота, которые также могут быть использованы в качестве агентов, замедляющих всасывание. В одном варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:A. L-гистидин, растворенный в воде с получением конечных концентраций от 0,5 до 300 мМ, предпочтительно от 3 до 200 мМ, наиболее предпочтительно от 20 до 100 мМ;B. Маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ;C. Уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ и более предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе. Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл. рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный. В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:A. L-гистидин, растворенный в воде с получением конечных концентраций от 0,5 до 300 мМ, предпочтительно от 3 до 200 мМ, наиболее предпочтительно от 20 до 100 мМ L-гистидина;B. L-аргинин с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ;C. Маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ;D. Уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе. Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл. рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный. В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:A. L-гистидин, растворенный в воде с получением конечных концентраций вплоть до 200 мМ,предпочтительно от 3 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ L-гистидина;B. L-аргинин с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 мМ до 50 мМ;C. Маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 мМ до 230 мМ;D. Уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе. Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл. рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный. В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:A. L-гистидин, растворенный в воде с получением конечных концентраций от 0,5 до 300 мМ, предпочтительно от 3 до 200 мМ, наиболее предпочтительно от 20 до 100 мМ L-гистидина;B. L-аргинин с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ;C. Маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ;D. Уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе. Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл. рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный. В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:A. L-гистидин, растворенный в воде с получением конечных концентраций вплоть до 200 мМ,предпочтительно от 3 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ L-гистидина;B. L-аргинин с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ;C. Маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ;D. Уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе. Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл. рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный. В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:A. N-ацетат, растворенный в воде с получением конечных концентраций вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ;B. Маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ. Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл. рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный. Аналоги GLP-2 по настоящему изобретению также могут входить в состав композиции для медленного высвобождения из имплантируемого устройства для пролонгированного и замедленного выделения пептида аналога GLP-2. Такие составы замедленного выделения могут быть в форме пластыря, расположенного на внешней поверхности тела. Примеры составов замедленного выделения включают композиции биологически совместимых полимеров, таких как полимолочная кислота, сополимер молочной и гликолевой кислот, метилцеллюлоза, гиалуроновая кислота, сиаловая кислота, силикат, коллаген, липосомы и т.п. Составы замедленного выделения могут быть особенно полезны, когда требуется обеспечить высокую местную концентрацию аналога GLP-2 по настоящему изобретению. Аналог GLP-2, прошедший стерильную фильтрацию, может быть помещен в ампулу или емкость в количестве, оказывающем трофическое воздействие на кишечник. Емкость или ампула может содержать аналог GLP-2 в качестве состава, готового для введения, и необходимый носитель. В качестве альтернативы, емкость или ампула может содержать пептид GLP-2 в таких формах, как лиофилизованная форма,подходящая для восстановления в подходящем носителе, таком как стерильная вода или физиологический раствор, забуференный фосфатом. В качестве альтернативы инъектируемым составам аналог GLP-2 может входить в композицию,вводимую другим способом. В соответствии со стандартной фармацевтической практикой могут быть получены композиции лекарственных форм для орального введения, такие как таблетки, капсулы и т.п. Согласно настоящему изобретению аналог GLP-2 вводят для лечения индивидуумам для оказания положительного влияния на рост тканей тонкого кишечника. Лекарственные формы для назального введения могут иметь в своем составе усилители, такие как хитозан или детергенты, такие как Tween 20, Tween 80, полоксамеры, например плюроник F-68 или плюроник F-127; Brij 35, Brij 72, кремофор EL. Пептидные соединения по настоящему изобретению могут применяться как по отдельности, так и в комбинации с соединениями, обладающими противовоспалительным воздействием. Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения предположили, что комбинированное лечение может усилить положительные эффекты лечения аналогом пептида по настоящему изобретению. Терапевтическая дозировка и режим, наиболее подходящие для лечения пациента, конечно, варьируют в зависимости от лечимого заболевания или состояния и зависят от веса и других параметров пациента. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы считают, что дозы в показателях мг/кг и длительность или частота повторяемости лечения позволяют получить терапевтически эффективные результаты, такие как статистически значимое повышение, в частности, массы тонкого кишечника. В некоторых примерах терапевтический режим может включать введение поддерживающей дозы, подходящей для предотвращения тканевой регрессии, что случается после прекращения проводимого лечения. Дозировка и режим, наиболее подходящие для применения человеком, могут быть определены по результатам, полученным в настоящем изобретении, и могут быть подтверждены проведением собственно кли- 23014184 нических испытаний. Эффективная дозировка и протоколы лечения могут быть определены традиционными способами,начиная с низкой дозы на лабораторных животных и повышая дозировку с проведением мониторинга воздействия и систематически варьируя схему приема. При определении оптимальной дозы для конкретного субъекта должны быть приняты во внимание различные факторы. Такие факторы известны специалисту в данной области. Дозировка пептида GLP-2 для человека по настоящему изобретению в одном варианте воплощения настоящего изобретения может составлять от около 10 до около 10 мг/кг/день, предпочтительно от около 50 до около 5 мг/кг /день и наиболее предпочтительно от около 100 до около 1 мг/кг /день. Медицинские показания. Пептиды по настоящему изобретению применяют в качестве фармацевтических агентов для профилактики или лечения индивидуума, страдающего заболеваниями желудочно-кишечного тракта, включая пищевод верхнего отдела желудочно-кишечного тракта, введением эффективного количества аналогаGLP-2 или его соли, как описано здесь. Заболевания желудочно-кишечного тракта включают язвы любой этиологии (например, пептидные язвы, язвы, обусловленные действием лекарственных препаратов, язвы,обусловленные инфекциями или другими патогенами), нарушения пищеварения, синдром недостаточности всасывания, синдром укороченной тонкой кишки, синдром прямокишечно-маточного углубления,воспалительные заболевания кишечника, брюшные спру (например, возникающие из-за глютеновой энтеропатии или целиакии), тропическую спру, гипогаммаглобулемическую спру, энтериты, язвенные колиты, поражения тонкого кишечника и диарею/воспаления слизистой оболочки, обусловленные химиотерапией (CID). Как было указанно выше, как правило, кандидатами для лечения настоящими аналогами GLP-2 являются индивидуумы, которые будут ощущать положительное воздействие от увеличения массы тонкого кишечника и последствий и/или поддержания нормальной структуры слизистой тонкого кишечника и ее функции. Конкретные состояния, которые могут быть вылечены аналогом GLP-2, включают различные формы спру, включая глютеновое спру, которое является результатом токсической реакции на альфаглиадин из-за нагревания и может быть результатом глютеновой энтеропатии или целиакии, и отмечается значительная потеря ворсинок тонкого кишечника; тропические спру являются результатом инфекции и отмечается частичное уплощение ворсинок; гипогаммаглобулемические спру, наблюдаемые, как правило, у пациентов с общим неклассифицируемым иммунодефицитом или гипогаммаглобулемией, и отмечается значительное понижение высоты ворсинок. Терапевтическая эффективность лечения аналогомGLP-2 может быть проконтролирована кишечной биопсией для исследования морфологии ворсинок,оценкой поглощения питательных веществ, прибавкой в весе пациента или улучшением симптомов, связанных с этими состояниями. Другие состояния, которые могут лечиться аналогами GLP-2 по настоящему изобретению или для которых аналоги GLP-2 могут быть использованы в качестве профилактического средства, включают в дополнение к выше приведенным лучевые энтериты, инфекционные или постинфекционные энтериты,повреждения тонкого кишечника из-за воздействия токсических или других химических агентов. Аналоги GLP-2 также могут быть применены для лечения нарушений питания, например кахексии и анорексии. Конкретный вариант воплощения настоящего изобретения относится к применению пептидов по настоящему изобретению для профилактики и/или лечения повреждений кишечника и его дисфункции. Такие повреждения и дисфункция хорошо известны как побочный эффект лечения рака химиотерапией. Применение химиотерапии часто связано с неожиданными побочными эффектами, оказываемыми на пищеварительную систему, такими как мукозиты, диарея, бактериальная транслокация, синдром пониженного всасывания, абдоминальные спазмы, желудочно-кишечные кровотечения и рвота. Эти побочные эффекты являются клиническими последствиями повреждения структуры и функции кишечного эпителия и часто требуют снижения доз и частоты применения химиотерапии. Введение агонистов пептидаGLP-2 по настоящему изобретению может усилить воздействие на кишечные крипты и быстро обеспечить рост новых клеток для замещения поврежденного кишечного эпителия, вызванного химеотерапией. Конечная цель, достигаемая введением пептидов по настоящему изобретению, снижение заболеваемости, связанной с повреждениями желудочно-кишечного тракта у пациентов, получающих химиотерапию,при этом создается оптимальный режим проведения химиотерапии для лечения рака. Сопутствующая профилактика или терапевтическое лечение могут быть проведены в соответствии с настоящим изобретением у пациентов, получающих лучевую терапию, или тех, кто будет ее получать. Стволовые клетки слизистой тонкого кишечника, по существу, потенциально страдают от цитотоксических воздействий химиотерапии из-за большой скорости пролиферации (Keefe at al., Gut 2000; 47: 632-7). Повреждения слизистой тонкого кишечника, вызванные химиотерапией, клинически часто относят к мукозитам желудочно-кишечного тракта, и они характеризуются ослаблением абсорбции и защитного барьера тонкого кишечника. Например, было выявлено, что широко применяемые химиотерапевтические агенты 5-Fu, иринотекан и метотрексат повышают апоптоз, ведущий к атрофии ворсинок и гипоплазии крипт тонкого кишечника грызунов (Keefe at al., Gut 47: 632-7,2000; Gibson et al., J GAstroenterolHepatol. Sep; 18(9):1095-l 100, 2003; Tamaki et al., J Int Med Res. 31(1):6-16, 2003). Было выявлено, что химиотерапевтические агенты повышают апоптоз кишечных крипт через 24 ч после введения и, как следствие, снижают площадь ворсинок, глубину крипт, количество митозов в крипте и рост энтероцитов через три дня после химиотерапии у людей (Keefe at al., Gut 2000;47: 632-7). Таким образом, структурные изменения тонкого кишечника напрямую ведут к дисфункции кишечника и в некоторых случаях к диарее. Желудочно-кишечные мукозиты после химиотерапии рака представляют собой большую проблему,которая, по существу, не решается моментально, но может быть снята поэтапно. Исследования, проведенные с использованием противоопухолевых цитостатических препаратов 5-FU и иринотекана показали, что химиотерапевтический эффект этих лекарственных препаратов, главным образом, оказывает неблагоприятное воздействие на структурную целостность и функцию тонкого кишечника, при этом толстая кишка менее чувствительна и отвечает, главным образом, повышенным образованием слизи (Gibsonet al., J. Gastroenterol Hepatol Sep; 18(9): 1095-110, 2003; Tamaki et al., J. Int Med Res. 31(1):6-16,2003). Новые аналоги GLP-2 по настоящему изобретению могут быть использованы для профилактики и/или лечения повреждения желудочно-кишечного тракта и побочных эффектов химиотерапевтических агентов. Это потенциально важное терапевтическое применение может быть проведено на сегодняшний день с использованием химиотерапевтических агентов, таких как, но без ограничений, 5-FU, альтретамин, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин,крисантаспас, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, флударабин, флюороурацил, гемцитабин, гидроксикарбамид, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, липосомальный доксорубицин, лейковорин, ломустин, мельфалан, меркаптопурин, месна, метотрексат, митомицин, митоксантрон, оксалиплатин, паклитаксель, пеметрексет,пентостатин, прокарбазин, ралтитрексед, стрептозоцин, тегафур-урацил, темозоломид, тиотепа, тиогуанин, топотекал, треосульфан, винбластин, винкристин, виндесин, и винорелбин. Предполагается, что пептиды по настоящему изобретению могут быть применены в способе лечения новорожденных введением эффективного количества аналога GLP-2 или его соли. Осложнения при вскармливании новорожденных, связанные с недоразвитостью желудочно-кишечного тракта, могут быть преодолены применением агонистов пептида по настоящему изобретению. В другом варианте воплощения настоящего изобретения описан способ лечения состояний, обусловленных DPP-IV (дипептидилпептидаза-IV), введением пациенту при необходимости эффективного количества аналога GLP-2 или его соли. Такие заболевания включают состояния, при которых ферментDPP-IV вырабатывается в повышенном количестве. В одном варианте воплощения настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть получена для замедленного выделения указанного аналога GLP-2, или его соли, или производного, как описано выше. Примеры Следующие примеры предназначены для пояснения предпочтительных аспектов настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом. Общий пептидный синтез Приборы и стратегия синтеза. Пептиды синтезировали ступенчато в полиэтиленовой емкости, оборудованной полипропиленовым фильтром для фильтрации, с использованием 9-флуоренилметилоксикарбонильной группы (Fmoc) в качестве N-ot-аминозащитной группы, как стандартно используемой группы для защиты боковых цепей. Растворители. ДМФА (N,N-диметилформамид, Riedel de-Hen, Germany) очищали с помощью колонки, загруженной высокоэффективной катионобменной смолой (Lewatit S 100 МВ/Н strong acid, Bayer AG Leverkusen,Germany) и исследовали перед использованием на наличие свободных аминов путем добавления 3,4 дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазин (Dhbt-OH), при наличии свободных аминов происходит окрашивание в желтый цвет (Dhbt-O-анион). Растворитель DCM (дихлорметан, чда, Riedel de-Haen, Germany) использовали непосредственно без предварительной очистки. Ацетонитрил (HPLC-grade, LabScan, Dublin Ireland) использовали непосредственно без предварительной очистки. Аминокислоты.Fmoc-защищенные аминокислоты были получены от Advanced ChemTech (ACT). Сшивающие агенты. Сшивающий агент диизопропилкарбодиимид (DIC) был получен от Riedel de-Hen, Germany. Твердые подложки. Пептиды синтезировали на смолах TentaGel S 0,22-0,31 ммоль/г. TentaGel S-Ram, TentaGel S RAMLys(Boc)Fmoc (Rapp полимер, Germany) использовали в случаях, когда был предпочтительным амидированный по С-концу пептид, в то время как TentaGel S РНВ, TentaGel S PHB Lys(Boc)Fmoc использовали,когда была предпочтительной свободная С-концевая карбоксильная группа. Катализаторы и другие реагенты. Диизопропилэтиламин(DIEA) были получены от Aldrich, Germany, пиперидин и пиридин от Riedel- 25014184de Haen, Frankfurt, Germany. Этандитиол был получен от Riedel-de Haen, Frankfurt, Germany. 3,4-дигидро 3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазин(Dhbt-ОН), 1-гидроксибензотриазол (HOBt) (HOAt) были получены от Fluka, Switzerland. Уксусный ангидрид был получен от Fluka. Процедуры сшивания. Аминокислоты сшивали посредством получения in situ HObt или HOAt эфиров из соответствующейNзащищенной аминокислоты и HOBt или HOAt с DIC в DMF. Степень ацилирования проверяли с использованием нингидринового теста, выполненного при 80 С, в целях предотвращения Fmocдепротекции (Larsen, B.D. и Holm, A., Int. J. Peptide Protein Res. 43, 1994, 1-9). Депротекция Nзащитной группы(Fmoc). Снятие Fmoc-группы выполняли обработкой 20% пиперидином в DMF (15 и 110 мин), с последующей отмывкой с использованием DMF (515 мл, по 5 мин каждая), пока после добавления Dhbt-OH к слитому DMF не переставал обнаруживаться желтый цвет. Сшивание HOBt-эфиров. 3 экв. Nзащищенных аминокислот растворяли в DMF с 3 экв. HOBt и 3 экв. DIC, после чего полученный раствор добавляли к смоле. Снятие пептида кислотой со смолы. Пептиды снимали со смолы путем обработки 95%-м (по объему) водным раствором трифторуксусной кислоты (TFA, Riedel-de Hen, Frankfurt, Germany) или 95%-м (по объему) раствором TFA с 5% этандитиола при комнатной температуре в течение 2 ч. Профильтрованные смолы промывали 95%-м водным раствором TFA, после чего фильтраты и промывки выпаривали при пониженном давлении. Остаток промывали эфиром и лиофильно высушивали от водной уксусной кислоты. Неочищенный лиофильно высушенный продукт анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и идентифицировали масс-спектрометрией (MS). Ступенчатый пептидный синтез на смоле TentaGel (PEG-PS). Смола TentaGel (1 г, 0,23-0,24 ммоль/г) была помещена в полиэтиленовую емкость, оборудованную полипропиленовым фильтром для фильтрации. После набухания в DMF (15 мл), смолу обработали 20% раствором пиперидина в DMF для удаления начальной Fmoc группы либо на линкере TentaGel S RAM,либо на первой аминокислоте на смоле TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc. Смола была высушена и промытаDMF, пока после добавления Dhbt-OH к слитому DMF не переставал обнаруживаться желтый цвет. Аминокислоты в соответствии с последовательностью были присоединены в виде Fmoc-защищенных HOBt эфиров (3 экв.), как описано выше. Сшивание проводилсь в течение 2 ч, если не указано другое. Смола была высушена и промыта DMF (515 мл, 5 минут каждый), чтобы удалить избыток реагента. Степень ацилирования была проверена с помощью нингидринового теста, как описано выше. После завершения синтеза смола с пептидом была промыта DMF (315 мл, по 5 мин), DCM (315 мл, по 1 мин) и, наконец,диэтиловым эфиром (315 мл, по 1 мин), после чего высушена в вакууме. Пептид был снят со смолы, как описано ранее, после чего неочищенный пептид был проанализирован и очищен, как описано ниже. Параметры ВЭЖХ. Градиент ВЭЖХ-анализ проводили с использованием ВЭЖХ-системы Hewlett Packard HP 1100, состоящей из насоса для четырехкомпонентных смесей HP 1100, автосэмплера HP1100, колоночного термостата HP 1100 и HP 1100 многоволнового детектора. Для управления прибором и снятия данных использовали Hewlett Packard Chemstation с программным обеспечением для ЖХ (rev. A.06.01). Использовались следующие колонки и система ВЭЖХ буферов. Колонка: VYDAC 238TP5415, С-18, 5 мм, 3001504,6 мм. Буферы: А: 0,1% TFA в MQV; В: 0,085% TFA, 10% MQV, 90% MeCN. Градиент: 0-1,5 мин 0% В 1,5-25 мин 50% В 25-30 мин 100% В 30-35 мин 100% В 35-40 мин 0% В Поток 1 мл/мин, температура 40 С, УФ детекция: I = 215 нм. ВЭЖХ очистка пептида. Неочищенные пептидные продукты очищали с помощью PerSeptive Biosystems VISION Workstation. Для управления прибором и получения данных использовали программу VISION 3.0. Использовали следующую колонку и систему ВЭЖХ буферов. Колонка: Kromasil KR 100, 10 мм С-8, 25050,8 мм. Буферная система: Буферы: А: 0,1% TFA в MQV; В: 0,085% TFA, 10% MQV, 90% MeCN. Градиент: 0-37 мин 0-40% В Поток 35 мл/мин, УФ детекция: I = 215 нм и 280 нм. Масс-спектрометрия. Пептиды растворяли в суперградиенте метанола (Labscan, Dublin, Ireland), деионизированной воды(Millipore, Bedford, MA) и муравьиной кислоты (Merck, Damstadt, Germany) (50:50:0,1 по об.) до концен- 26014184 траций в диапазоне 1-10 мг/мл. Растворы пептидов (20 мл) анализировали в режиме положительной поляризации ESI-TOF-MS с использованием масс-спектрометра LCT (Micromass, Manchester, UK) с точностью +/-0,1 m/z. Общая стратегия синтеза. Во всех синтезах сухую смолу TentaGel-S-Ram (1 г, 0,22-0,31 ммоль/г) помещали в полиэтиленовую емкость, снабженную полипропиленовым фильтром для фильтрации. После набухания в DMF (15 мл),смолу обрабатывали 20% пиперидином в DMF, чтобы обеспечить присутствие непротонированных аминогрупп на смоле. Смолу высушивали и отмывали DMF, пока после добавления Dhbt-OH к слитому DMF не переставал обнаруживаться желтый цвет. Аминокислоты в соответствии с последовательностью пептида присоединяли в виде Fmoc-защищенных HOBt эфиров (3 экв.), как описано выше. Если иное не определено, то сшивку продолжали в течение 2 ч. Смолу высушивали и промывали в DMF (515 мл, по 5 мин каждый цикл) для того, чтобы удалить лишний реактив. Степень ацилирования проверяли нингидриновым тестом, выполненным при 80 С. После окончания синтеза пептида смолу промывали DMF(315 мл, по 5 мин каждый цикл), DCM (315 мл, по 1 мин каждый цикл) и, наконец, диэтиловым эфиром (315 мл, по 1 мин каждый цикл) и высушивали в вакууме. После чего пептид снимали со смолы,как описано выше, лиофильно высушивали. После очистки, используя препаративную ВЭЖХ, как описано выше, пептид собирали, и идентичность пептида подтверждали с помощью ES-MS. Эта процедура использовалась для синтеза всех пептидов, приведенных в качестве примеров далее ниже. Синтезируемые соединения. Используя вышеупомянутые методы, соединения с 1809 по 1861 и эталонное соединение 1559 (H[Gly2]hGLP-2-OH) синтезировали, как описано выше (табл. 1). Таблица 1