Применение антагонистов взаимодействия vla-4 и альфа-4-бета-7 с соответствующими альфа-4-лигандами для лечения фиброза

006681 Родственные заявки В данной заявке испрашивается приоритет более ранней предварительной заявки США с серийным номером 60/130,847, поданной 22 апреля 1999 г., и предшествующей предварительной временной заявки США с серийным номером 60/137,214, поданной 1 июня 1999 г. Основа создания изобретения Фибронектин и коллаген являются белками, которые играют важную роль в поддержании целостности внеклеточного матрикса, обнаруживаемого в соединительных тканях. Продукция указанных белков является строго контролируемым процессом, и его нарушение может привести к развитию тканевого фиброза. Хотя образование фиброзной ткани является частью нормального доброкачественного процесса заживления ткани после повреждения, при некоторых обстоятельствах происходит аномальное накопление фиброзного материала, так что в конечном счете это может привести к недостаточности органа (Border et al. (1994) New Engl. J. Med. 331:1286-1292). Повреждение любого органа влечет за собой стереотипный ответ: гемостаз, вызываемый тромбоцитами, и последующий приток воспалительных клеток и активированных фибробластов. Под контролем происходящих из указанных типов клеток цитокинов происходит формирование нового внеклеточного матрикса и кровеносных сосудов (грануляционная ткань). Образование грануляционной ткани является строго контролируемым запрограммированным процессом, в котором экспрессия протеиназных ингибиторов и белков внеклеточного матрикса регулируется по типу отрицательной обратной связи, причем экспрессия протеиназ уменьшается, что приводит к накоплению внеклеточного матрикса. Главным событием, приводящим к развитию условий фиброза, будь то индуцированный или спонтанный фиброз, является стимуляция активности фибробластов. Приток воспалительных клеток и активированных фибробластов в поврежденный орган зависит от способности таких клеток к взаимодействию с промежуточным (интерстициальным) матриксом, в состав которого прежде всего входят фибронектин и коллаген. Такие взаимодействия клеток друг с другом и клеток с внеклеточным матриксом опосредованы несколькими семействами молекул межклеточной адгезии, из которых одно из таких семейств включает в себя интегрины. Интегрины представляют собой структурно и функционально связанные гликопротеины, состоящие из различных альфа-(альфа-1 альфа-2, в настоящее время вплоть до альфа-11) и бета- (бета-1 и бета-7) гетеродимерных трансмембранных рецепторных доменов, обнаруживаемых в различных комбинациях фактически на всех типах клеток млекопитающих (в качестве обзора см.: Е.С.Medicinal Chemistry, Vol. 31, J. A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, p.191). Были описаны два интегрина,содержащие альфа-4-субъединицы; они обозначаются как альфа-4-бета-1 (VLA-4) и альфа-4-бета-7. Интерстициальный легочный фиброз (IPF) является патологическим состоянием, к которому в конечном счете приводят многие заболевания промежуточной ткани легких, и в результате этого снижается степень эластичности легочной ткани и ослабляется жизненная функция газообмена легких. В зависимости от этиологии, IPF характеризуется воспалительными и фибропролиферативными изменениями легкого и избыточным накоплением коллагена в промежуточной ткани легкого. У больных с IPF в период активной фазы легочного фиброза обычно обнаруживается присутствие циркулирующих иммунных и воспалительных клеток, что указывает на то, что легочный фиброз является результатом аномального заживления после первичного воспалительного поражения. Циркулирующие воспалительные клетки,скорее всего, во многих случаях участвуют в первичном поражении. Кроме того, эти клетки могут играть комплексную роль в регуляции процесса заживления. В любом случае циркуляция иммунных и воспалительных клеток в легких может играть важную роль в реализации фиброзного ответа. Приток воспалительных клеток и активированных фибробластов в поврежденное легкое зависит от способности указанных типов клеток взаимодействовать с компонентами внеклеточного матрикса (ВКМ). Передвижение и состояние активации лейкоцитов модулируется различными интегринами. Предотвращение притока воспалительных клеток в легкие может оказаться критичным в отношении последующего фиброзного ответа. Многие из заболеваний, связанных с пролиферацией фиброзной ткани, являются как хроническими,так и зачастую изнуряющими, включая, например, такие заболевания как склеродермия. Некоторые заболевания, включая легочный фиброз, могут быть фатальными, отчасти в связи с тем, что традиционные формы лечения этого заболевания имеют существенные побочные эффекты и обычно являются неэффективными в отношении замедления или прекращения прогрессирования фиброза [Nagler et al. 1996, Am. J.Respir. Crit. Care Med., 154:1082-86]. Соответственно, существует постоянная потребность в новых антифиброзных агентах. Краткое содержание изобретения Настоящее изобретение обеспечивает способ лечения фиброза. Заявители изучали возможную роль в патогенезе фиброза путем введения антагонистов интегринов, содержащих альфа-1- и альфа-4 субъединицы, мышам с легочным фиброзом. Положительный эффект, оказываемый указанными антагонистами как на общее накопление коллагена, так и на степень (выраженности) легочных поражений при-1 006681 фиброзе, как показано в настоящем сообщении, предполагает, что интегрины, содержащие альфа-1 и/или альфа-4-субъединицу, могут представлять собой вполне резонные мишени антифиброзной терапии. Одним из аспектов данного изобретения является способ, включающий в себя введение субъекту с явлениями фиброза эффективного количества композиции, включающей в себя антагонист взаимодействия между интегрином, несущим альфа-4-субъединицу, и лигандом, несущим альфа-4-субъединицу. Антагонистом является агент, связывающий альфа-4-интегрин, или агент, связывающий лиганд альфа-4 интегрина. Предпочтительными альфа-4-связывающими агентами являются агенты, выбранные из группы, состоящей из а) гомолога антитела, который препяствует взаимодействию как VLA-4, так и альфа-4 бета-7 с их соответствующими альфа-4-лигандами; b) гомолога антитела, который препяствует взаимодействию VLA-4 с его альфа-4-лигандом; и с) гомолога антитела, который препяствует взаимодействию альфа-4- бета-7 с его альфа-4-лигандом. В других аспектах (связаных с настоящим изобретением) гомолог антитела выбран из группы, состоящей из антитела человека, химерного антитела, гуманизированного антитела и его фрагментов. Другим аспектом настоящего изобретения является способ снижения повышенного под действием фиброза количества лейкоцитов в пробе (жидкости) бронхоальвеолярного лаважа, включающий в себя стадии введения субъекту с фиброзом эффективного количества антагониста взаимодействия между интегрином, несущим альфа-4-субъединицу, и лигандом интегрина, несущего альфа-4-субъединицу. В определенных аспектах данного изобретения агент, связывающий альфа-4-интегрин, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в некоторых определенных жестких условиях с определенными последовательностями нуклеиновой кислоты,выбранными из группы последовательностей, приведенных в табл. 6 патента США 5,840,299, или последовательностей, комплементарных указанным последовательностям нуклеиновой кислоты. В других аспектах способа согласно изобретению агент, связывающий лиганд альфа-4-интегрина, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в некоторых определенных жестких условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из определенных полипептидов,обнаруживаемых в патенте США 5,932,214 или продуцируемых линией клеток АТСС CRL 11175. Вся цитируемая в предыдущем разделе литература, так же как и цитируемая литература и опубликованные патенты, фигурирующие в дальнейшем описании, включены сюда в виде ссылки. Подробное описание изобретенияI. Определения. Чтобы более ясно и точно охарактеризовать предмет заявленного изобретения, приводятся следующие определения специфических терминов, используемых в нижеследующем описании и прилагаемой формуле изобретения. Теперь данное изобретение будет описано в соответствии с последующим подробным изложением,в котором использованы следующие определения. Очень поздний антиген (VLA) суперсемейства интегринов состоит из структурно и функционально связанных гликопротеинов, состоящих из (альфа- и бета-)гетеродимерных молекул трансмембранного рецептора, обнаруживаемых в различных комбинациях почти на всех типах клеток млекопитающих (в качестве обзора см: Е.С. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox et al., "The Pharmacology of the Integrins."in Ann. Report in Medicinal Chemistry. Vol. 31, J. A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, p. 191). Интегрины семейства VLA включают в себя (в настоящее время) VLA-1, -2, -3, -4, -5, -6, -9 и -11, в которых каждая из молекул содержит 1-цепь, нековалентно связанную с альфа-цепью (l, 2, 3, 4, 5, 6 и так далее) соответственно. Интегрин альфа-4-бета-1 (41) является рецептором клеточной поверхности для VCAM-1, фибронектина и, возможно, других лигандов (указанные лиганды, взятые вместе или индивидуально, обозначаются здесь как "альфа-4-лиганд(ы)"). Термин 41-интегрин ("VLA-4", или "41", или "альфа-4-бета 1-интегрин", взаимозаменяемые в использовании) относится здесь к полипептидам, которые способны связываться с VCAM-1 и белками, входящими в состав внеклеточного матрикса, более конкретно - фибронектин или его гомологи или фрагменты, хотя специалистам и рядовым сотрудникам, работающим в данной области, вполне очевидно, что могут существовать и другие лиганды VLA-4, которые можно изучать с помощью обычных традиционных методов. Тем не менее, известно, что субъединица альфа-4 будет ассоциироваться и с остальными бета-субъединицами, кроме бета-1, так что можно определить термин "альфа-4-интегрин" или "интегрин, содержащий альфа-4-субъединицу" как такие интегрины, у которых альфа-4-субъединица ассоциирована с той или иной из бета-субъединиц. Другим примером "альфа-4"-интегрина, кроме VLA-4, является альфа-4-бета-7 (см. Lobb and Adams, выше). Сходным образом, "альфа-1-интегринами", или "интегринами, содержащими альфа-1-субъединицу", являются такие интегрины, у которых альфа-1-субъединица ассоциирована с той или иной из бета-субъединиц."Антагонист" интегрина включает в себя любое соединение, которое ингибирует связывание интегринов, содержащих альфа-1- и/или альфа-4-субъединицу, с интегриновым лигандом и/или рецептором.-2 006681 Используются также антиинтегриновое антитело или белки, содержащие гомолог антитела (обсуждаемые ниже), а также другие молекулы, такие как растворимые формы интегриновых белковых лигандов. Растворимые формы белковых лигандов для интегринов, содержащих альфа-4-субъединицу, включают в себя растворимый VCAM-1, белки, слитые с VCAM-1, или бифункциональные VCAM-1/Ig-слитые белки. Например, для связывания с интегрином может быть введена растворимая форма интегринового лиганда или его фрагмента, и предпочтительно - компетентная в отношении сайта связывания интегрина на клеточной поверхности, что приводит, таким образом, к эффектам, сходным с эффектами, вызываемыми введением антагонистов, таких как антиинтегриновые (например, VLA-1, VLA-4) антитела. В частности,в объем данного изобретения входят также растворимые интегриновые мутанты, которые связывают лиганд, но не вызывают интегринзависимого сигналирования. Такие интегриновые мутанты могут действовать в качестве конкурентных ингибиторов интегринового белка дикого типа и считаются "антагонистами". Другими антагонистами, используемыми в способах согласно изобретению, являются "малые молекулы", как описано ниже. В рамки данного изобретения входят также способы, в которых используются молекулы, которые являются антагонистами действия интегрина, содержащего более одной альфа-4-субъединицы, такие как малые молекулы или гомологи антител, которые являются антагонистами как VLA-4, так и альфа-4-бета 7 или других комбинаций интегринов, содержащих альфа-4-субъединицу. В рамки данного изобретения входят также способы, в которых используются молекулы, которые являются антагонистами действия интегрина, содержащего более одной альфа-1-субъединицы. В рамки данного изобретения входят также способы, в которых используется комбинация молекул, такая, что эта комбинация является антагонистом действия более чем одного интегрина, причем в указанных способах используется несколько малых молекул или гомологов антител, комбинация которых является антагонистической по отношению к действию как VLA-4, так и альфа-4-бета-7 или других комбинаций интегринов, содержащих альфа-4 субъединицу. Как уже упоминалось выше, определенные антагонисты интегрина могут быть слиты или иначе конъюгированы, например, с гомологом антитела, таким как иммуноглобулин или его фрагмент, и не ограничены конкретным типом или структурой интегрина или лиганда или другой молекулы. Таким образом, для целей данного изобретения любой агент, способный к образованию химерного белка (как определено ниже) и способный связываться с интегриновыми лигандами, который эффективно блокирует или покрывает интегрин, содержащий альфа-4- и/или альфа-1-субъединицу, считается эквивалентным антагонистам, используемым в приведенных здесь примерах."Гомолог антитела" включает в себя интактные антитела, состоящие из легких и тяжелых цепей иммуноглобулина, связанных дисульфидными мостиками. Под термином "гомолог антитела" подразумевается также белок, содержащий один или более полипептидов, выделенных из легких цепей иммуноглобулина, тяжелых цепей иммуноглобулина и их антигенсвязывающих фрагментов, который способен связываться с одним или более антигенами (т.е. интегрином или интегриновым лигандом). Полипептиды-компоненты гомолога антитела, состоящие более чем из одного полипептида, могут необязательно быть связанными дисульфидной связью или иначе - связанными поперечными ковалентными связями. Следовательно, "гомологи антитела", соответственно, включают в себя интактные иммуноглобулины классов IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (так же как и их субклассов), в которых легкие цепи иимуноглобулинов могут быть легкими цепями каппа- или лямбда-типов. "Гомологи антитела" также включают в себя части интактных антител, которые сохраняют специфичность связывания антигена, например, Fab-фрагменты,Fab'-фрагменты, F(ab')2-фрагменты, F(v)-фрагменты, мономеры или димеры тяжелой или легкой цепей или их смеси."Гомологом гуманизированного антитела" является гомолог антитела, продуцируемый с помощью технологии рекомбинантной ДНК, в котором некоторые или же все аминокислоты человека, которые не являются необходимыми для связывания антигена, заменены соответствующими аминокислотами из легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина млекопитающих, не являющихся человеком. "Гомологом антитела человека" является гомолог антитела, в котором все аминокислоты легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина (независимо от того, являются ли они необходимыми для связывания антигена) получены из материала человеческой природы. В данном тексте "гомологом антитела человека" является гомолог антитела, продуцируемый с помощью технологии рекомбинантной ДНК, в котором все аминокислоты легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина получены из материала человеческой природы."Агонист" интегрина включает в себя любое соединение, которое активирует лиганд интегрина."Аминокислота" является мономерной единицей пептида, полипептида или протеина. Существует двадцать аминокислот, обнаруживаемых в природных пептидах, полипептидах и протеинах, и все они являются L-изомерами. Этот термин включает в себя также аналоги аминокислот и D-изомеры белковых аминокислот и их аналоги."Ковалентно связанный" означает, что специальные (особые) фрагменты данного изобретения (например, PEG-илированный антагонист альфа-4- и/или альфа-1-интегрина, иммуноглобулиновый фрагмент/антагонист альфа-4- или альфа-1-интегрина) либо являются ковалентно связанными друг с другом-3 006681 непосредственно, либо ковалентно связаны друг с другом через встроенный фрагмент или фрагменты,такие как спейсерный фрагмент или фрагменты. Такой встроенный фрагмент или фрагменты называется"связывающей группой". Термин "конъюгированный" используется наряду с термином "ковалентно связанный", и эти термины являются взаимозаменяемыми. В этой связи "спейсер" относится к фрагменту,который может быть вставлен между аминокислотой или другим компонентом антагониста интегрина или фрагмента и остальной молекулой. Спейсер может обеспечивать разделение между аминокислотой или другим компонентом и остальной молекулой, таким образом, чтобы защитить модификацию от возможности нарушения белковой функции и/или облегчить связывание аминокислоты или другого компонента с другим фрагментом."Последовательность, контролирующая экспрессию" - это последовательность полинуклеотидов,которая контролирует и регулирует экспрессию генов, когда она оперативно связана с этими генами."Экспрессирующий вектор" или "вектор экспрессии" - это полинуклеотид, такой как ДНК плазмиды или фага (наряду с другими общими примерами), который обеспечивает экспрессию по меньшей мере одного гена при внесении указанного вектора экспрессии в хозяйскую клетку. При этом указанный вектор может или не может быть способен экспрессироваться в клетке."Эффективное количество" агента согласно изобретению - это такое количество, которое оказывается результативным или оказывает влияние на конкретное состояние, которое подвергается лечению."Функциональным эквивалентом" аминокислотного остатка является (i) аминокислотный остаток,имеющий реактивные свойства, сходные со свойствами аминокислотного остатка, который был заменен функциональным эквивалентом; (ii) аминокислотный остаток антагониста согласно изобретению, причем указанный аминокислотный остаток имеет реактивные свойства, сходные со свойствами аминокислотного остатка, который был заменен функциональным эквивалентом; (iii) неаминокислотная молекула,имеющая свойства, сходные со свойствами аминокислотного остатка, который был заменен функциональным эквивалентом. Первый полинуклеотид, кодирующий протеинизированный антагонист согласно изобретению, является "функциональным эквивалентом", сравнимым со вторым полинуклеотидом, кодирующим протеин-антагонист, если выполняется по меньшей мере одно из следующих условий:(a) "функциональный эквивалент" является первым полинуклеотидом, который гибридизуется со вторым полинуклеотидом в стандартных условиях гибридизации и/или является вырожденным по отношению к последовательности первого полинуклеотида. В наиболее предпочтительном случае он кодирует мутантный протеин, имеющий активность протеина антагониста интегрина;(b) "функциональный эквивалент" является первым полинуклеотидом, который кодирует экспрессию аминокислотной последовательности, кодируемой вторым полинуклеотидом. Антагонисты интегрина, используемые в настоящем изобретении, включают в себя, не ограничиваясь ими, перечисленные здесь агенты, а также их функциональные эквиваленты. В рамках данного описания термин "функциональный эквивалент" относится, таким образом, к антагонисту интегрина или к полинуклеотиду, кодирующему антагонист интегрина, который оказывает на реципиента такое же или же улучшенное благоприятное воздействие, что и антагонист интегрина, функциональным эквивалентом которого он является. Рядовому специалисту в данной области очевидно, что функционально эквивалентный протеин может быть получен с помощью рекомбинантной технологии, например, путем экспрессии "функционально эквивалентной ДНК". Соответственно, настоящее изобретение охватывает интегриновые протеины, кодируемые природными ДНК, также как и неприродными ДНК, которые кодируют тот же протеин, который кодируется природной ДНК. В силу вырожденности полинуклеотидных кодирующих последовательностей для кодирования интегринового протеина могут быть использованы и другие полинуклеотиды. Последние включаются в себя - целиком или частично - перечисленные выше последовательности, которые изменены путем замены различных кодонов, которые кодируют один и тот же аминокислотный остаток внутри последовательности, продуцируя, таким образом, "молчащую" (или"нулевую") замену. Такие измененные последовательности рассматриваются как эквивалентные исходным последовательностям. Например, Phe (F) кодируется двумя колонами, ТТС или ТТТ, Tyr (Y) кодируется кодонами ТАС или TAT, a His (Н) кодируется кодонами САС или CAT. С другой стороны, Trp(W) кодируется единственным кодоном TGG. Соответственно, предпочтительно, чтобы для данной последовательности ДНК, кодирующей конкретный интегрин, существовало много вырожденных последовательностей, кодирующих указанный интегрин. Вырожденные последовательности ДНК, о которых идет речь, считаются входящими в рамки данного изобретения. Термин "химерный", когда он относится к антагонисту согласно изобретению, означает, что указанный антагонист состоит из связанных (химическими поперечными или ковалентными связями или же иными связями) двух или более протеинов, имеющих несопоставимые структуры и/или имеющих различную несопоставимую природу или источники, из которых они получены. Таким образом, химерный антагонист альфа-4-интегрина может включать в себя один фрагмент, который является антагонистом альфа-4-интегрина или его фрагмента, и другой фрагмент, который не является антагонистом альфа-4 интегрина. Химерный антагонист альфа-1-интегрина может включать в себя один фрагмент, который-4 006681 является антагонистом альфа-1-интегрина или его фрагмента, и другой фрагмент, который не является антагонистом альфа-1-интегрина. Разновидностью "химерного" белка (протеина) является "слитый белок", который относится к колинеарным, состоящим их двух или более, белкам или их фрагментам, ковалентно связанным через их индивидуальный пептидный каркас, наиболее предпочтительно путем генетической экспрессии полинуклеотидной молекулы, кодирующей указанные белки. Таким образом, предпочтительными слитыми белками являются химерные белки, которые включают в себя антагонист альфа-4- (или альфа-1-) интегрина или фрагмент, ковалентно связанный со вторым фрагментом, который не является антагонистом альфа-4- (или альфа-1-)интегрина. Предпочтительные слитые белки согласно изобретению могут включать в себя части интактных антител, которые сохранили специфические антигенсвязывающие свойства, например, Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab')2-фрагменты, F(v)-фрагменты, мономеры или димеры тяжелой цепи, мономеры или димеры легкой цепи, димеры, состоящие из одной тяжелой и одной легкой цепи, и тому подобное. Наиболее предпочтительными слитыми белками являются химерные белки, и они включают в себя фрагмент антагониста интегрина, слитый или связанный иным способом с легкой цепью иммуноглобулина, содержащей полностью или частично шарнирную и константную области легкой цепи, с тяжелой цепью иммуноглобулина, содержащей полностью или частично шарнирную и константную области тяжелой цепи, либо с ними обеими. Таким образом, данное изобретение связано с молекулой, которая включает в себя (1) фрагмент антагониста интегрина, (2) второй пептид, например, такой, который повышает растворимость или увеличивает время жизни in vivo фрагмента антагониста интегрина, или же, к примеру, член суперсемейства иммуноглобулинов, или его фрагмент, или часть его, или, к примеру,часть или фрагмент IgG, например константная область тяжелой цепи IgGl человека, например, СН 2,СН 3 и шарнирная области. В частности, "слияние антагониста интегрина с Ig" дает белок, содержащий биологически активную молекулу антагониста интегрина согласно изобретению (например, растворимый лиганд VLA-4 или VLA-1 или его биологически активный фрагмент, связанный с N-концом иммуноглобулина, причем часть N-конца иммуноглобулина заменена антагонистом интегрина. Разновидностью слитого белка антагонист интегрина/Ig является слитый белок "интегрин/Fc", который представляет собой белок, содержащий антагонист интегрина согласно изобретению, связанный по меньшей мере с частью константного домена иммуноглобулина. Предпочтительное Fc-слияние включает в себя антагонист интегрина согласно изобретению, связанный с фрагментом антитела, содержащим С-концевой домен тяжелых цепей иммуноглобулина. Термин "слитый белок" означает также антагонист интегрина, химически связанный посредством моно- или гетерофункциональной молекулы со вторым фрагментом, который не является антагонистом интегрина (с образованием "химерной" молекулы), и созданный de novo из очищенного белка, как описано ниже. Таким образом, один из примеров химически связанной, в отличие от рекомбинантно связанной, химерной молекулы, которая является слитым белком, может включать в себя (1) фрагмент, таргетирующий субъединицу альфа-4-интегрина, например, фрагмент VCAM-1, способный связываться сVLA-4 на поверхности клеток, несущих VLA-4; (2) вторую молекулу, которая повышает растворимость или увеличивает время жизни in vivo таргетирующего фрагмента, например, полимер полиалкиленгликоля, такой как полиэтиленгликоль (PEG). Фрагмент, таргетирующий альфа-4, может представлять собой любой альфа-4-лиганд или его фрагмент, например пептид VCAM-1 или сходная с ним последовательность, содержащая консервативные замены. Под "гетерологичным промотором" здесь подразумевается промотор, который в природе не является ассоциированным с геном или с очищенной нуклеиновой кислотой. Под "гомологией" здесь подразумевается синоним термина "идентичность" и относится указанный термин к сходству между двумя последовательностями полипептидов, молекул или между двумя нуклеиновыми кислотами. Когда какое-нибудь положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занято одной и той же мономерной субъединицей основания или аминокислоты (например, если какое-то положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином или какое-то положение в каждом из двух полипептидов занято лизином), в таком случае соответствующие молекулы являются гомологичными по данному положению. Процент гомологии между двумя последовательностями является функцией от числа совпадений или гомологичных положений, имеющихся в указанных двух сравниваемых последовательностях, деленного на число сравниваемых положений, х 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают или являются гомологичными, тогда указанные последовательности являются на 60% гомологичными. В порядке примера, последовательности ДНК CTGACT и CAGGTT имеют 50% гомологию (3 из 6 положений совпадают). Обычно сравнение проводят в тех случаях, когда две последовательности при сравнительном анализе первичной структуры имеют максимальную гомологию. Такой сравнительный анализ первичной структуры может быть обеспечен, например, методом Karlin и Altschul, более подробно описываемым ниже. Гомологичные последовательности имеют идентичные или сходные аминокислотные остатки, причем сходные остатки представляют собой консервативные замены на соответствующие аминокислотные остатки в последовательности, с которой проведен сравнительный анализ первичной структуры, или"разрешенные точковые мутации" указанной последовательности, с которой проведен сравнительный анализ первичной структуры. В этой связи "консервативной заменой" остатка в упомянутой последовательности являются такие замены, которые физически или функционально сходны с соответствующими указанными остатками, например, такими, которые имеют сходный размер, форму, электрический заряд,химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи, или тому подобное. В частности, предпочтительными консервативными заменами являются такие, которые удовлетворяют критериям, определяемым для "приемлемой точковой мутации" у Dayhoff et al., 5: Atlas of"Гомология" и "идентичность" являются здесь взаимозаменяемыми, и каждый из терминов относится к сходству последовательностей двух полипептидов. Гомология и идентичность могут быть определены путем сравнения положения в каждой из последовательностей, которые, с учетом результатов сравнительного анализа первичной структуры, пригодны для сравнения. Когда какое-нибудь положение в сравниваемых последовательностях занято одним и тем же аминокислотным остатком, в таком случае сравниваемые полипептиды считаются гомологичными по данному положению; когда эквивалентный сайт занят одной и той же аминокислотой (например, идентичной) или сходной аминокислотой (например, сходной по стерической или электронной природе), в таком случае соответствующие молекулы являются гомологичными по данному положению. Процент гомологии или идентичности между последовательностями является функцией от числа совпадений или гомологичных положений, имеющихся в сравниваемых последовательностях. "Неродственная" или "негомологичная" последовательность имеет менее 40% идентичности, хотя и предпочтительно, чтобы имела менее 25% идентичности, с последовательностью согласно изобретению."Процент гомологии" двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот определяется с помощью алгоритма сравнительного анализа первичной структурыNat. Acad. Sci., USA 90: 5873 (1993). Такой алгоритм включен в программы NBLAST или XBLASTNBLAST, схема (подсчета) = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей,гомологичных нуклеотидным последовательностям согласно изобретению. BLAST-анализы белков предприняты с использованием программы XBLAST, схема (подсчета) = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных упомянутому полипептиду. Для получения сравнительного gapped-анализа первичных структур использовали программу gapped-BLAST, как описано у Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389 (1997). При выполнении анализов BLAST и GappedBLAST использовали параметры соответствующих программ (XBLAST и NBLAST). См.http://www/ncbi.nlm.nih.gov. Термин "выделенный" (используется взаимозаменяемо с термином "существенно чистый"), когда он применяется в отношении нуклеиновой кислоты, т.е. полинуклеотидных последовательностей, которые кодируют антагонисты интегрина, означает полинуклеотид РНК или ДНК, часть геномного полинуклеотида, кДНК или синтетический полинуклеотид, который по своей природе или в результате манипуляций (i) является неассоциированным со всеми из полинуклеотидов, с которыми он ассоциирован в природе (например, присутствует в хозяйской клетке в виде экспрессирующего вектора или его части); или (ii) связан с нуклеиновой кислотой или с другим химическим фрагментом, отличным от того, с которым он связан в природе; или (iii) не встречается в природе. Далее под "выделенной" подразумевается полинуклеотидная последовательность, которая (i) амплифицирована in vitro путем, например, полимеразной цепьевой реакции (PCR); (ii) химически синтезирована; (iii)получена рекомбинантным путем с помощью клонирования или (iv) очищена, например, путем расщепления и разделения в геле. Таким образом, "существенно чистой нуклеиновой кислотой" является нуклеиновая кислота, которая непосредственно не прилегает (соприкасается) к одной или более из кодирующих последовательностей, к которым она прилегает (соприкасается) в природном геноме в организме, из которого данная нуклеиновая кислота получена. Существенно чистая ДНК включает в себя также и рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительные последовательности интегрина. Термин "выделенный" (используется взаимозаменяемо с термином "существенно чистый"), когда он применяется в отношении полипептидов, означает полипептид или часть его, который по своей природе или в результате манипуляций (i) присутствует в хозяйской клетке в виде продукта экспрессии или части экспресирующего вектора; или (ii) связан с белком или с другим химическим фрагментом, отличным от того, с которым он связан в природе; или (iii) не встречается в природе, например, белок, который химически модифицирован путем добавления к нему хотя бы одного гидрофобного фрагмента, так,что белок приобретает форму белка, не встречающегося в природе. Далее под "выделенным" подразумевается белок, который (i) синтезирован химическим путем; или (ii) экспресирован в хозяйской клетке и очищен от ассоциированных с ним и сопутствующих ему белков. Указанный термин обычно означает полипептид, который отделен от остальных белков и нуклеиновых кислот, с которыми он обычно ассо-6 006681 циирован в природе. Предпочтительно, чтобы полипептид был отделен также и от таких веществ как антитела и гелевый матрикс (полиакриламид), которые используются для его очистки."Мультивалентный белковый комплекс" относится ко множеству антагонистов интегрина (т.е. к одному или более). Гомолог антиинтегринового антитела или его фрагмент может быть поперечно связанным или связанным с другим гомологом антитела или его фрагментом. Каждый из белков может быть одним и тем же или различным, и каждый из гомологов антитела или его фрагментов может быть одним и тем же или различным.(т.е. делеция, замена, добавка или отклонение) в полинуклеотидной последовательности дикого типа или любое изменение в белке дикого типа. Термин "мутеин" и термин "мутант" используются как взаимозаменяемые."Оперативно связанный" - полинуклеотидная последовательность (ДНК, РНК) является оперативно связанной с последовательностью, контролирующей экспрессию, когда контролирующая экспрессию последовательность контролирует и регулирует транскрипцию и трансляцию указанной полинуклеотидной последовательности. Термин "оперативно связанный" включает в себя наличие соответствующего стартового сигнала (например, ATG) перед полинуклеотидной последовательностью, которая подлежит экспрессии, и сохранение правильной рамки считывания, чтобы экспрессия полинуклеотидной последовательности происходила под контролем экспрессии контрольной последовательности, и продукция требуемого полипептида кодировалась полипептидной последовательностью."Фармакологический агент" определяется как одно или более соединений, или молекул, или других химических веществ, вводимых субъекту (вдобавок к антагонистам согласно изобретению), которые усиливают действие антагониста. Используемый здесь термин "фармакологический агент" относится к такому агенту(ам), который вводят в процессе "комбинированной терапии", когда антагонист согласно изобретению вводится либо до, либо после, либо одновременно с введением одного или более фармакологических агентов."Протеин" или "белок" - это любой полимер, который главным образом состоит из любых из 20 аминокислот. Хотя термин "полипептид" часто используется при указании на относительно большие полипептиды, а термин "пептид" часто используется в отношении малых полипептидов, использование указанных терминов в данной области перекрывается и является вариабельным. Термин "протеин" используется здесь, если не указано иначе, в отношении пептидов, белков и полипептидов. Термины "пептид(ы)", "белок(ки)" и "полипептид(ы)" используются здесь как взаимозаменяемые. Термины "полинуклеотидная последовательность" и "нуклеотидная последовательность" также используются здесь как взаимозаменяемые. Используемый здесь термин "рекомбинантный" означает, что белок получен из рекомбинантных экспрессирующих систем млекопитающих. Поскольку интегрин не является ни гликозилированным, ни содержащим дисульфидные связи, он может быть экспрессирован в большинстве прокариотических и эукариотических экспрессирующих систем."Малая молекула" имеет то же определение, какое приведено в разделе А 2. Выражение "поверхностная" означает любую аминокислоту, которая экспонирована в растворителе, когда упаковка белка соответствует его нативной форме."Условия гибридизации" обычно подразумевают солевые и температурные условия, эквивалентные 0,5 X SSC примерно до 5 X SSC и 65 С как для гибридизации, так и для промывки. Таким образом, используемый здесь термин "стандартные условия гибридизации" является оперативным определением и охватывает интервал условий гибридизации. Тем не менее термин "жесткие" условия включает в себя гибридизацию с использованием буфера "plaque screen" (0,2% поливинилпирролидона, 0,2% Фиколл-400; 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 50 mM Tris-HCl (рН 7,5); 1 М NaCl; 0,1% пирофосфата натрия; 1% SDS); 10% декстрансульфата и 100 мкг/мл денатурированной, обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося при 65 С в течение 12-20 ч и промывание 75 мМ NaCl/7,5 мМ цитратом натрия (0,5 ХSSC)/1% SDS при 65 С. "Гибридизация в условиях пониженной жесткости" включает в себя гибридизацию с использованием буфера "plaque screen", 10% декстрансульфата и 110 мкг/мл денатурированной,обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося при 55 С в течение 12-20 ч и промывание 300 мМNaCl/30 мМ цитратом натрия (2,0 X SSC)/1% SDS при 55 С. См. также Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, Inc. New York, Sections 6.3.1-6.3.6, (1989). Используемый здесь термин "терапевтическая композиция" включает в себя антагонисты согласно изобретению и другие биологически совместимые ингредиенты. Терапевтическая композиция может содержать такие эксципиенты как вода, минералы, и такие носители как белок. Термин "субъект с состоянием фиброза"относится, не ограничиваясь этим, к субъектам, страдающим от фиброза внутреннего органа, к субъектам, страдающим от фиброзного заболевания кожи, и к субъектам, страдающим от фиброзных состояний глаза. Фиброз внутренних органов (например, печени,легкого, почки, сердца, кровеносных сосудов, желудочно-кишечного тракта) возникает при таких патологических состояниях как легочный фиброз, миелофиброз, цирроз печени, мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, серповидный гломерулонефрит, диабетическая нефропатия, почечный интер-7 006681 стициальный фиброз, почечный фиброз у больных, принимающих циклоспорин, и нефропатия, ассоциированная с HTV. Фиброзные заболевания кожи включают в себя, не ограничиваясь ими, склеродермию,кольцевидную склеродермию, келоиды, гипертрофированные рубцы, семейная подкожная коллагенома и коллагенозный невус соединительной ткани. Фиброзные состояния глаза включают в себя такие состояния как диабетическая ретинопатия, постхирургическое образование рубца (например, после опериции по удалению глаукомы и после поперечно-глазной хирургии), и пролиферативную витреоретинопатию. Дополнительные фиброзные состояния, которые можно лечить способами соглано настоящему изобретению, включают в себя ревматоидный артрит, болезни, связанные с продолжительной болью в суставах и деградацией суставов; прогрессивный системный склероз, полимиозиты, дерматомиозиты, эозинофильный фасцит, кольцевидную склеродермию, синдром Рейно и назальный полипоз. Кроме того, фиброзные состояния, которые можно лечить, используя способы согласно настоящему изобретению, также включают в себя ингибирование усиленной продукции рубцовой ткани у больных, для которых свойственно образование келоидов или гипертрофированных рубцов, ингибирование или предотвращение процесса образования рубцов или усиленной продукции рубцовой ткани в процессе заживления различных типов ран, включая и хирургические разрезы, хирургические абдоминальные раны и травматические раны, предотвращение или ингибирование процесса образования рубцов и повторного закрытия артерии в результате коронарной ангиопластики, предотвращение или ингибирование процесса образования избыточной рубцовой или фиброзной ткани, ассоциированного с фиброзом ткани сердца после инфаркта, и при гиперчувствительной васкулопатии. Термин "эффективное количество" подразумевает такое количество, которого достаточно для оказания благоприятного воздействия или получения требуемых результатов. Эффективное количество может быть введено в виде однократного или многократного введения. В терминологии лечебной практики"эффективное количество" антагониста для применения в настоящем изобретении означает количество,достаточное для паллиативного воздействия, для улучшения, стабилизации, обратного развития, замедления или отложенного прогрессирования фиброзного состояния, в соответствии с общепринятыми стандартами, разработанными для лечения заболеваний. Определение и измерение индикаторов эффективности могут быть произведены с помощью целого ряда доступных диагностических подходов, включая, например, физические анализы, такие как анализы крови, проверку функции легких и рентген грудной клетки; компьютерную томографию; бронхоскопию; бронхоальвеолярный лаваж; биопсию легких и компьютерную томографию. Практически в настоящем изобретении будут использованы, если не оговорено особо, традиционные методы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии,рекомбинантной ДНК, белковой химии, фармакологии и иммунологии, которые находятся в пределах компетенции специалистов в данной области. Все эти методы описаны в литературе. Если не оговорено особо, все ссылки, приводимые в разделе "Подробное описание изобретения", включены в настоящее описание в виде ссылок.II. Описание предпочтительных аспектов. Настоящее описание связано с открытием возможности использования антагонистов интегринов,содержащих альфа-1- и/или альфа-4-субъединицу, и их фрагментов для лечения легочных фиброзов. А. Антагонисты интегрина. Для целей настоящего изобретения антагонистом интегрина может быть антагонист, препятствующий любому взаимодействию между интегрином и узнающим его лигандом или рецептором так, что нормальная функция, индуцируемая взаимодействиями лиганд-рецептор, становится измененной (т.е. она предотвращается, замедляется или становится каким-либо иным образом модифицированной). В одном из предпочтительных аспектов антагонист интегрина является антагонистом взаимодействий альфа 4-интегринов с их лигандами, таких как взаимодействие VCAM-1/VLA-4. Это - агент, например полипептид или другая молекула, который может ингибировать или блокировать связывание, опосредованноеVCAM-1 и/или VLA-4, или который иным способом модулирует функцию VCAM-1 и/или VLA-4, например путем ингибирования или блокирования опосредованной VLA-4-лигандом передачи сигналаVLA-4 или опосредованной VCAM-1-лигандом передачи сигнала VCAM-1, и который является эффективным при лечении острого повреждения мозга, предпочтительно таким же образом, что и анти-VLА-4 антитела. Антагонистом взаимодействия VCAM-1/VLA-4 является агент, который обладает одним или более из следующих свойств: (1) он покрыт или связан с VLA-4 на поверхности VLA-4-несущей клетки (например, лимфоцита), обладает достаточной специфичностью в отношении ингибирования взаимодействия VLА-4-лиганд/VLА-4, например, взаимодействия VCAM-1/VLA-4; (2) он покрыт или связан с VLA-4 на поверхности VLA-4-несущей клетки (например, эндотелиальной клетки), обладает достаточной специфичностью в отношении модифицирования, и предпочтительно ингибирования передачи VLA-4 опосредованного сигнала, например VLA-4/VCAM-1-опосредованного сигналирования; (3) он покрыт или связан с VLA-4-лигандом (например, VCAM-1) на эндотелиальных клетках, обладает достаточной специфичностью в отношении ингибирования взаимодействия VLA-4/VCAM-1; (4) он покрыт или связан с VLA-4-лигандом (например, VCAM-1), обладает достаточной специфичностью в отношении модифи-8 006681 цирования, и предпочтительно ингибирования передачи опосредованного VLA-4-лигандом VLA-4 сигналирования, например VCAM-1-опосредованного VLA-4-сигналирования. В предпочтительных аспектах антагонист обладает одним или более из свойств 1 и 2. В других предпочтительных аспектах антагонист обладает одним или более из свойств 3 и 4. Более того, можно использовать более одного антагониста, например агент, который связывается с VLA-4, можно комбинировать с агентом, который связывается с VCAM-1. В другом аспекте антагонист интегрина является антагонистом взаимодействий альфа-1-интегринов с их лигандами, таких как взаимодействие коллаген/VLA-l. Это - агент, например полипептид или другая молекула, который может ингибировать или блокировать связывание, опосредованное коллагеном и/илиVLA-1, или который иным способом может модулировать функцию коллагена и/или VLA-1, например путем ингибирования или блокирования опосредованной VLA-1-лигандом передачи сигнала VLA-1 или опосредованной коллагеном передачи сигнала. Антагонист взаимодействия коллаген/VLA-1 является агентом, который обладает одним или более из следующих свойств: (1) он покрыт или связан с VLA-1 на поверхности VLA-4-несущей клетки (например, коллаген), обладает достаточной специфичностью в отношении ингибирования взаимодействия VLA-1-лиганд/VLA-1, например взаимодействия коллаген/VLA-1; (2) он покрыт или связан с VLA-1 на поверхности VLA-1-несущей клетки, обладает достаточной специфичностью в отношении модифицирования и предпочтительно ингибирования передачи VLA-1 опосредованного сигнала, например VLA-1/коллагенопосредованного сигналирования; (3) он покрыт или связан с VLA-1-лигандом, (например, коллагеном), обладает достаточной специфичностью в отношении ингибирования взаимодействия VLA-1/коллаген; (4) он покрыт или связан с VLA-1-лигандом,обладает достаточной специфичностью в отношении модифицирования и предпочтительно ингибирования передачи опосредованного VLA-1-лигандом VLA-1-сигналирования, например, опосредованного коллагеном VLA-1-сигналирования. В предпочтительных аспектах альфа-1-антагонист обладает одним или более из свойств 1 и 2. В других предпочтительных аспектах антагонист обладает одним или более из свойств 3 и 4. Более того, больному можно вводить более одного антагониста, например, агент который связывается с VLA-1, можно комбинировать с агентом, который связывается с коллагеном. Как уже обсуждалось, антагонисты, используемые в способах согласно изобретению, не ограничены особым типом или структурой молекулы, так что для целей настоящего изобретения и только в порядке примера, любой агент, способный связываться с альфа-4-интегринами (например, VLA-4) на поверхности клеток или с альфа-4-лигандом, таким как VCAM-1, на поверхности альфа-4-лиганд-несущих клеток) и который эффективно блокирует или покрывает альфа-4-интегрин (например, VLA-4) или альфа-4-лиганд (например, VCAM-1), называемый "агент, связывающий альфа-4-интегрин" и "агент, связывающий лиганд альфа-4-интегрина" соответственно), считается эквивалентом антагонистов, используемых здесь в примерах. Например, применимыми являются антитела или гомологи антител (обсуждаемые ниже), также как и растворимые формы белков, природно связывающихся с VLA-4 и VCAM-1. Растворимые формы белков, природно связывающихся с VLA-4, включают в себя растворимые пептиды VCAM-1, VCAM-1 слитые белки, бифункциональные слитые белки VCAM-1/Ig (например, "химерные" молекулы, обсуждаемые выше), фибронектин, фибронектин, который содержит полученный в результате альтернативного сплайсинга не-тип-III соединяющий сегмент, и пептиды фибронектина, содержащие аминокислотную последовательность EILDV или сходную консервативно замененную аминокислотную последовательность. Растворимые формы белков, природно связывающихся с VCAM-1, включают в себя растворимые пептиды VLA-4, VLA-4-слитые белки, бифункциональные слитые белки VLA-4/Ig и тому подобное. Здесь под "растворимым VLA-4-пептидом" или "растворимым VCAM-1-пептидом" подразумевается полипептид VLA-4 или VCAM-1, не способный самостоятельно заякориваться на мембране. Такие растворимые полипептиды включают в себя, например, полипептиды VLA-4 и VCAM, которые лишены части мембрано-связывающего домена, необходимой для заякоривания этих полипептидов, или же они модифицированы таким образом, что их мембрано-связывающий домен становится нефункциональным. Указанные связывающие агенты могут конкурировать с белками клеточной поверхности за связывание VLA4 или же иным способом видоизменять функцию VLA-4. Например, растворимая форма VCAM-1 (см.,например, Osborn et al. 1989, Cell, 59: 1203-1211) или ее фрагмент могут быть введены для связыванияVLA-4, и предпочтительно - конкурентного в отношении сайта связывания VLA-4 на VCAM-1-несущих клетках, приводя, таким образом, к эффектам, напоминающим таковые при введении антагонистов, таких как малые молекулы или анти-VLA-4-антитела. 1. Гомологи антиинтегринового антитела. В иных предпочтительных аспектах антагонисты, используемые в способах согласно изобретению для связывания, включая блокировку или покрытие, с альфа-1- и/или альфа-4-интегрином клеточной поверхности (таким как VLA-1, VLA-4 или альфа-4-бета-7) и/или с лигандом альфа-1- и/или альфа-4 интегрина клеточной поверхности (такими как коллаген или VCAM-1 соответственно), представляют собой, как было определено выше, моноклональное антитело или гомолог моноклонального антитела против VLA-1 или против VLA-4 и/или против коллагена и/или против VCAM-1. Предпочтительные для лечения антитела и гомологи, в частности для лечения человека, включают в себя гомологи антителаF(v)-фрагментов антитела, и мономеры или димеры тяжелых или легких цепей антитела или их смеси. Моноклональные антитела против VLA-4 являются предпочтительным связывающим агентом в способе согласно изобретению. 2. Малые молекулы-антагонисты интегрина. Термин "малая молекула" - антагонист интегрина относится к химическим агентам (т.е. органическим молекулам), способным нарушить взаимодействие интегрин/лиганд интегрина путем, например,блокирования взаимодействий VLA-4/VCAM в результате связывания VLA-4 на поверхности клеток или связывания VCAM-1 на поверхности клеток. Такие малые молекулы могут также связывать, соответственно, рецепторы VLA-4 и VCAM-1. Малыми молекулами-ингибиторами VLA-4 и VCAM-1 могут быть сами пептиды как таковые, полупептидные соединения или непептидные соединения, такие как малые органические молекулы, которые являются антагонистами взаимодействия VCAM-1 /VLA-4. Здесь термин "малая молекула" не призван охватить антитело или гомолог антитела. Молекулярный вес малых молекул обычно ниже 1000. Например, могут быть использованы малые молекулы, такие как олигосахариды, которые имитируют связывающий домен лиганда VLA-4 и занимают рецепторный домен VLA-4. (См. J.J. Devlin et al.,1990, Science 249: 400-406 (1990), J.K. Scott and G.P. Smith, 1990, Science 249: 386-390, and U.S. Patent 4,833,092 (Geysen), все из которых включены в данное описание в виде ссылок) . И наоборот, могут быть использованы также малые молекулы, которые имитируют связывающий домен лиганда VCAM-1 и занимают рецепторный домен VCAM-1. Примеры других малых молекул, применимых в данном изобретении, можно найти в публикацииthe Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine-Aspartic AcidValine", J. Biol. Chem., 266 (23), pp. 15075-79 (1991. В указанной публикации идентифицирована минимальная аминокислотная последовательность, необходимая для связывания VLA-4 и синтезированы различные перекрывающиеся пептиды на основе аминокислотной последовательности CS-1-области (VLA4-связывающий домен) особых разновидностей фибронектина. Авторами идентифицирован пептид, содержащий 8 аминокислот, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr, a также два более коротких перекрывающихся пентапептида, Glu-Ile-Leu-Asp-Val и Leu-Asp-Val-Pro-Ser, которые обладали ингибиторной активностью против фибронектинзависимой клеточной адгезии. Впоследствии было показано, что определенные более длинные пептиды, содержащие последовательность LDV, обладают активностью in vivo (Т.A.Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment", J. Clin. Invest., 94, pp. 655-62 (1994. Был описан также циклический пентапептид, Arg-Cys-Asp-TPro-Cys (в котором TPro означает 4 тиопролин), который может ингибировать адгезию к фибронектину как VLA-4, так и VLA-5. (См., например, D.M. Nowlin et al. "A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits Alpha4Betal Integrin-mediated Cell Adhesion", J. Biol. Chem., 268(27), pp. 20352-59 (1993); и публикацию PCT PCT/US 91/04862). Указанный пентапептид был основан на последовательности трипептида Arg-Gly-Asp из фибронектина, эта последовательность была известна как общий мотив в сайте узнавания для нескольких белков внеклеточного матрикса. Были опубликованы примеры других ингибиторов VLA-4, например, у Adams et al. "Cell AdhesionInhibitors", PCT US 97/13013, описывающих линейные петидиловые соединения, содержащие бетааминокислоты, которые обладают активностью, ингибирующей клеточную адгезию. В международных патентных заявках WO 94/15958 и WO 92/00995 описан циклический пептид и пептидомиметические соединения, обладающие активностью, ингибирующей клеточную адгезию. В международных патентных заявках WO 93/08823 и WO 92/08464 описаны содержащие гуанидинил, мочевину и тиомочевину соединения, ингибирующие клеточную адгезию. В патенте США 5,260,277 описаны содержащие гуанидинил соединения, модулирующие клеточную адгезию. В публикациях D.Y. Jackson et al., "Potent 41peptide antagonists as potential anti-inflammatory agents", J. Med. Chem., 40.3359 (1997); H. Shroff et al.,"Small peptide inhibitors of 47 mediated MadCAM-1 adhesion to lymphocytes", Bio. Med, Chem. Lett., 1 2495 (1996); U.S Patent 5,510,332, публикациях PCT WO 98/53814, WО 97/03094, WО 97/02289, WО 96/40781, WО 96/22966, WО 96/20216, WО 96/01644, WО 96106108, и WО 95/15973 и других были описаны также и другие пептидиловые антагонисты VLA-4. Указанные малые молекулы-агенты могут быть получены путем синтеза множества пептидов (например, длиной от 5 до 20 аминокислот), полупептидных или непептидных соединений, органических соединений, а затем скрининга этих соединений с целью выяснения их способности ингибировать соответствующее взаимодействие VLA-1/коллаген или VLA-4/VCAM-1. См. в целом патент США 4,833,092, Scott and Smith, "Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library", Science, 249, pp. 386-90(1990), и Devlin et al., "Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules", Science,249, pp. 40407 (1990). В. Способы изготовления гомологов антиинтегриновых антител.- 10006681 Технология получения моноклональных антител, включая, например, антиинтегриновые антитела,хорошо известны. См., например, Mendrick et al. 1995, Lab. Invest. 72:367-375 (моноклональные антитела (mAbs) против мышиных анти-41 и анти-21); Sonnenberg et al. 1987 J. Biol. Chem.262:10316-10383 (mAbs против мышиных анти-61); Yao et al. 1996, J Cell. Sci 1996 109:3139-50 (mAbs против мышиных анти 71); Hemler et al. 1984, J. Immunol 132:3011-8 (mAbs против 11 человека); Pischel et al. 1987 J Immunol 138:226-33 (mAbs против 21 человека); Wayner et al. 1988, J Cell Biol 107:1881-91 (mAbs против 31 человека); Hemler et al. 1987 J Biol Chem 262:11478-85 (mAbs против 41 человека); Wayner et al. 1988 J Cell Biol 107:1881-91 (mAbs против 51 человека); Sonnenberg et al. 1987, J. Biol. Chem. 262:10376-10383 (mAbs против 61 человека); A. Wang et al. 1996 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:664672 (mAbs против 9l человека); Davies et al. 1989 J Cell Biol 109:1817-26 (mAbs против v1 человека);V6 человека); Cerf-Bensussan et al. 1992 Eur J Immunol 22:273-7 (mAbs против Е 7 человека); Nishimura et al. 1994 J Biol Chem 269:28708-15 (mAbs против V8 человека); Bossy et al. 1991 EMBO J 10:2375-85 (поликлональная антисыворотка против 81 человека); Camper et al. 1998 J. Biol Chem. 273:20383-20389 (поликлональная антисыворотка против 10l человека). Представленные здесь предпочтительные антагонисты интегрина могут быть экспрессированы из интактной или усеченной в результате процессинга геномной или кДНК или же из синтетичесих кДНК в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах. Димерные протеины могут быть выделены из культуральной среды и/или могут заново приобрести пространственную упаковку и пройти процесс димеризации in vitro с образованием биологически активных композиций. Гетеродимеры могут быть сформированы in vitro путем комбинирования отдельных, различных полипептидных цепей. Альтернативно гетеродимеры могут быть образованы в отдельной клетке путем коэкспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих отдельные, различные полипептидные цепи. См., например, WO 93/09229 или патент США 5,411,941, где представлены методики получения ряда примеров рекомбинантных гетеродимерных белков. Обычно предпочитаемые клетки-хозяева включают в себя, не ограничиваясь ими, прокариоты,включая Е. coli, или эукариоты, включая дрожжи, Saccharomyces, клетки насекомых или клетки млекопитающих, такие как СНО, COS или BSC-клетки. Любому рядовому специалисту в данной области очевидно, что в зависимости от задачи можно использовать и другие клетки-хозяева. Например, анти-VLA-4-антитела могут быть идентифицированы путем иммунопреципитации 125Iмеченных клеточных лизатов, полученных из клеток, экспрессирующих VLA-4. (См. Sanchez-Madrid etal. 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349 and Hemler et al. 1987, J. Biol. Chem., 262, 11478-11485), АнтиVLА-4-антитела могут быть также идентифицированы путем проточной цитометрии, например, путем измерения флуоресцентного окрашивания клеток Ramos, инкубированных с антителом, способным распознавать VLA-4 (см. Elices et al., 1990 Cell, 60: 577-584). Лимфоциты, используемые для получения клеток гибридомы, обычно выделяют из иммунизированных млекопитающих, сыворотка которых позитивна, как предварительно выясняется методами скрининга, в отношении наличия анти-VLА-4-антител. Обычно из тех же видов млекопитающих, из которых получены лимфоциты, получают также и иммортализованную линию клеток (например, миеломную линию клеток). Предпочтительными иммортализованными линиями клеток являются мышиные миеломные линии клеток, которые чувствительны к культуральной среде, содержащей гипоксантин, арниноптерин и тимидин ("среда HAT"). Обычно НАТчувствительные клетки миеломы мыши сливают со спленоцитами мыши, используя полиэтиленгликоль с молекулярным весом 1500 ("PEG 1500"). Затем гибридомные клетки, получаемые в результате слияния,подвергают селекции с использованием среды HAT, которая убивает неслитые и непродуктивно слитые миеломные клетки (неслитые спленоциты погибают через несколько дней, поскольку они не трансформированы). Гибридомы, продуцирующие требуемое антитело, определяются путем скрининга супернатантов гибридомных культур. Например, гибридомы, полученные для продукции анти-VLA-4-антител,могут быть подвержены скринингу путем тестирования супернатантов гибридомных культур на наличие секретируемых антител, обладающих способностью связываться с линией рекомбинантных клеток, экспрессирующих альфа-4-субъединицу (см. Elices et al., выше). Для продукции гомологов анти-VLA-4-антител, которые являются интактными иммуноглобулинами, клетки гибридомы, которые в результате указанных скрининговых анализов были определены как позитивные, культивировали в питательной среде в соответствующих условиях и в течение времени,достаточного для того, чтобы дать возможность клеткам гибридомы секретировать моноклональные антитела в культуральную среду. Методы культуры тканей и культуральные среды, подходящие для куль- 11006681 тивирования клеток гибридомы, хорошо известны. Далее супернатанты культивируемых клеток гибридомы, и полученные анти-VLA4-антитела могут быть, но не обязательно, подвержены дальнейшей очистке с использованием хорошо известных методов. Альтернативно, требуемое антитело может быть получено путем инъекции клеток гибридомы в брюшную полость иммунизированной мыши. В брюшной полости клетки гибридомы пролиферируют,секретируя антитело, которое накапливается в виде асцитной жидкости. Образованное антитело может быть изъято из брюшной полости мыши с помощью шприца. Несколько мышиных моноклональных антител против VLA-4 было описано ранее. См., например,Sanchez-Madrid et al., 1986, выше; Hemler et al., 1987, выше; Pulido et al., 1991, J. Biol. Chem., 266 (16),10241-10245); Issekutz and Wykretowicz, 1991, J. Immunol., 147: 109 (ТА-2 mab). Эти моноклональные антитела против VLA-4 и другие моноклональные антитела против VLA-4 (например, патент США 5,888,507- Biogen, Inc., а также ссылки, приводимые в описании этого патента), способные узнавать альфа- и/или бета-цепь VLA-4, будут использованы в способах лечения согласно настоящему изобретению. Анти-VLA-4-антитела, которые будут узнавать эпитопы альфа-4-цепи VLA-4, участвуют в связывании лигандов VCAM-1 и фибронектина (т.е. антитела, которые могут связываться с сайтом VLA-4, вовлеченном в узнавание лиганда, и блокировать связывание VCAM-1 и фибронектина), являются предпочтительными. Такие антитела определяются как В-эпитоп-специфические антитела (В 1 или В 2) (Pulido et al.,1991, выше) и являются также анти-VLA-4-антителами согласно данному изобретению. В способах согласно изобретению другим предпочтительным связывающим агентом, который может блокировать или покрывать лиганды VLA-4, являются гомологи полного моноклонального антитела против VLA-4. Они могут быть получены в интактной форме с помощью примированных in vitro спленоцитов человека, как описано Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147, 86-95. Альтернативно они могут быть получены путем клонирования, как описано Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 24322436 или Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236. В патенте США 5,798,230 (Aug. 25,1998, "Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use") описан способ получения моноклональных антител человека из В-клеток человека. Соответственно этому способу, антителопродуцирующие В-клетки человека, становятся иммортализованными в результате инфицирования их вирусом Эпштейна-Барр, или их производные, которые экспрессируют ядерный антиген 2 вируса ЭпштейнаБарр (EBNA2). Впоследствии функция EBNA2, которая необходима для иммортализации, выключается,что приводит к увеличению продукции антител. Еще в одном способе получения полных антител человека, патент США 5,789,650 (Aug. 4, 1998,"Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies"), описаны не являющиеся человеком трансгенные животные, способные продуцировать гетерологичные антитела, и не являющиеся человеком трансгенные животные, имеющие инактивированные эндогенные иммуноглобулиновые гены. Эндогенные иммуноглобулиновые гены подавлены антисмысловыми полинуклеотидами и/или антисывороткой против эндогенных иммуноглобулинов. Гетерологичные антитела кодируются иммуноглобулиновыми генами, обычно не обнаруживаемыми в геноме видов, не являющихся человеком. Один или более трансгенов, содержащих последовательности нереаранжированных гетерологичных тяжелых цепей иммуноглобулина человека, вводятся в не являющееся человеком животное, чтобы получить трансгенное животное, способное к функциональной реаранжировке трансгенных иммуноглобулиновых последовательностей и продуцированию репертуара антител различных изотипов, кодируемых иммуноглобулиновыми генами человека. Такие гетерологичные антитела человека получены в В-клетках человека, которые затем иммортализуют, например, путем слияния с иммортализованной линией клеток, такой как миеломная, или с помощью других манипуляций с В-клетками, которые способствуют иммортализации линии клеток, способных продуцировать гомолог моноклонального гетерологичного полноразмерного антитела человека. Для выделения высоко аффинных антител, которые можно использовать в терапии человека с применением стандартной фаговой технологии, можно использовать также обширные библиотеки распределения фагов у неиммунизированного человека (Vaughan et al, 1996). Еще одним предпочтительным связывающим агентом, который может блокировать или покрывать лиганды интегрина в способе согласно изобретению, является гомолог гуманизированного рекомбинантного антитела, имеющего антиинтегриновую специфичность. Вслед за ранними способами получения истинно "химерных антител" (где полная константная и полная вариабельная области получены из различных источников), был изобретен новый подход, описанный в ЕР 0239400 (Winter et al.), где антитела изменены путем замены (внутри данной вариабельной области) областей, определяющих их комплементарность (CDR), у одного вида таковыми из другого вида. Этот способ может быть использован,например, для замены CDR из доменов вариабельной области тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина человека на альтернативные CDR из доменов вариабельной области мыши. Эти измененные вариабельные области иммуноглобулина могут впоследствии быть скомбинированы с константными областями иммуноглобулина человека, чтобы получить антитела, которые по составу являются полностью человеческими, за исключением замены CDR на мышиные. Предполагалось, что такие антитела с CDRзамещением будут со значительно меньшей вероятностью вызывать иммунный ответ у человека по срав- 12006681 нению с истинно химерными антителами, поскольку такие антитела с CDR-замещением содержат значительно меньше компонентов нечеловеческой природы. Процесс гуманизирования моноклональных антител путем "прививки" CDR был назван "решейпингом". (Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536). Обычно области, определяющие комплементарность мышиного антитела, (CDR), трансплантировали в соответствующие области антитела человека, поскольку именно CDR (три - в тяжелых цепях антитела, три - в легких цепях) являются областями мышиного антитела, которые связываются со специфическим антигеном. Трансплантация CDR выполняется с помощью методов генной инженерии, причемCDR-последовательности ДНК определяются путем клонирования сегментов генов вариабельной (V) области мышиных тяжелых и легких цепей, а затем переносятся в соответствующие V-области человека сайт-направленным мутагенезом. На конечном этапе этого процесса добавляются сегменты генов константной области человека требуемого изотипа (обычно гамма I в случае СН и каппа в случае CL), и гуманизированные гены тяжелой и легкой цепи совместно экспрессируют в клетках млекопитающих для получения растворимого гуманизированного антитела. Перенос этих CDR в антитело человека придает этому антителу антиген-связывающие свойства первичного мышиного антитела. Шесть CDR в мышином антителе оказываются структурно встроенными в область "рамки считывания" V-области. Причина успешной транслантации CDR связана с тем, что области рамки считывания антител мыши и человека имеют очень большое сходство пространственных структур с очень похожими сайтами прикрепления CDR, так что CDR могут быть взаимозаменяемыми. Такие гуманизированные гомологи антитела могут быть получены, как описано у Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann, 1988, Nature 332, 323-327; Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86,10029; and Orlandi et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 3833. Тем не менее предполагается, что определенные аминокислоты внутри областей рамки считывания взаимодействуют с CDR и в целом влияют на аффинность связывания антитела. Прямой перенос CDR из мышиного антитела для получения рекомбинантного гуманизированного антитела без каких-либо модификаций рамок считывания V-области человека часто приводит к частичной или полной потере аффинности связывания. В ряде случаев изменение остатков в областях рамки считывания антитела-акцептора оказывается критичным в отношении активности связывания. В публикациях Queen et al., 1989 (выше) и WO 90/07861 (Protein Design Labs) описано получение гуманизированного антитела, которое содержит модифицированные остатки в областях рамки считывания антитела-акцептора путем комбинации CDR мышиного МАb (анти-Тас) с рамкой считывания иммуноглобулина человека и константными областями. Этими исследователями было продемонстрировано одно из решений проблемы утраты связывающей активности, которая часто возникает при прямом переносе CDR без каких-либо модификаций остатков рамки считывания V-области человека; их решение данной проблемы включает в себя два ключевых момента. Во-первых, рамки считывания V-области человека выбираются путем компьютерного анализа оптимальной белковой последовательности, гомологичной рамке считывания V-области первичного мышиного антитела, в данном случае анти-Tac-MAb. Вторым моментом является то, что третичная структура мышиной V-области моделируется с помощью компьютера, с тем, чтобы визуализировать аминокислотные остатки рамки считывания, которые с наибольшей вероятностью будут взаимодействовать с мышиными CDR, и затем эти мышиные аминокислотные остатки накладываются на гомологичную рамку считывания человека. См. также патенты США 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; and 5,530,101 (Protein Design Labs). Можно использовать другой подход (Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266-271), применяя в качестве стандарта рамки считывания V-области, полученные, соответственно, для тяжелой и легкой цепейNEWM и REI при трансплантации CDR без радикального введения мышиных остатков. Преимуществом использования подхода Tempest et al. для конструирования гуманизированных антител на основе NEWM и REI является то, что пространственные структуры вариабельных областей NEWM и REI известны из рентгеновской кристаллографии, и таким образом, специфические взаимодействия между CDR и остатками рамки считывания V-области могут моделироваться. Несмотря на выбранный подход, примеры гомологов исходно гуманизированного антитела, полученных на сегодняшний день, показали, что это не простой процесс. Однако даже зная, что такие изменения рамки считывания могут быть необходимы, невозможно предсказать на основании знаний предшествующего уровня техники, которые именно из остатков рамки считывания (если такие есть вообще) нужно будет заменить, чтобы получить функциональные гуманизированные рекомбинантные антитела нужной специфичности. Таким образом, результаты показывают, что изменения, необходимые для сохранения специфичности и/или аффинности, являются в большей степени уникальными для данного антитела и не могут быть предсказаны на основе опыта гуманизирования различных антител. Определенные антагонисты интегрина, содержащего альфа-4-субъединицу, используемые в данном изобретении, включают в себя гомологи химерного и гуманизированного рекомбинантного антитела (т.е. интактные иммуноглобулины и их части) со специфичностью В-эпитопа, которая былла получена и описана в патенте США 5,932,214 (mab HP1/2). Стартовым материалом для получения гомологов химерного(с вариабельной мышиной и константной человеческой частями) и гуманизированного антиинтегриново- 13006681 го антитела может служить, как описывалось ранее, мышиное антиинтегриновое моноклональное антитело, имеющееся в продаже антиинтегриновое моноклональное антитело (например, НР 2/1, Amae International, Inc., Westbrook, Maine) или антиинтегриновое моноклональное антитело, полученное в соответствии с описанной здесь методикой. Другие предпочтительные гомологи гуманизированного антиVLА 4-антитела описаны в публикациях Athena Neurosciences, Inc. in PCT/US 95/01219 (27 июля 1995 г.) и патенте США 5,840,299 (который включен в данное описание в виде ссылки). Эти гуманизированные анти-VLА 4-антитела содержат гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь. Гуманизированная легкая цепь содержит три области, определяющие ее комплементарность (CDR1, CDR2 и CDR3), содержащие аминокислотные последовательности из соответствующих определяющих комплементарность областей легкой цепи иммуноглобулина мыши 21-6 и рамки считывания вариабельной области из последовательности рамки считывания вариабельной области легкой каппа-цепи человека, за исключением по крайней мере одного положения аминокислоты, занятого той же самой аминокислотой, которая находится в эквивалентном положении рамки считывания вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина мыши 21-6. Гуманизированная тяжелая цепь содержит три области, определяющие ее комплементарность (CDRI, CDR2 и CDR3), содержащие аминокислотные последовательности из соответствующих определяющих комплементарность областей тяжелой цепи иммуноглобулина мыши 21-6 и рамки считывания вариабельной области из последовательности рамки считывания вариабельной области тяжелой цепи человека, за исключением по крайней мере одного положения аминокислоты, занятого той же самой аминокислотой, которая находится в эквивалентном положении рамки считывания вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши 21-6. В способах данного изобретения могут быть использованы антагонисты, кодируемые последовательностями нуклеиновой кислоты, которая в жестких условиях гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими антитела против интегринов, содержащих альфа-4-субъединицу. Например, антагонист согласно изобретению может представлять собой белок, нуклеиновая кислота которого в жестких условиях гибридизуется с одной или более последовательностями нуклеиновых кислот,представленных в табл. 6 патента США 5,840,299, или с комплементарными им одной или более последовательностями. В качестве антагонистов может служить также белок, нуклеиновая кислота которого в жестких условиях гибридизуется с нуклеиновой кислотой, кодирующей SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO:4,опубликованных в патенте США 5,932,214. Далее в качестве антагонистов может служить также белок,нуклеиновая кислота которого в жестких условиях гибридизуется с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный домен антитела, продуцируемого линией клеток АТСС CRL 11175. Альтернативно, антагонистом согласно изобретению может быть белок, нуклеиновая кислота которого в условиях пониженной жесткости гибридизуется с одной или более из последовательностей нуклеиновых кислот, представленных в табл. 6 патента США 5,840,299, или с комплементарными им одной или более последовательностями. В качестве антагонистов может служить также белок, нуклеиновая кислота которого в условиях пониженной жесткости гибридизуется с нуклеиновой кислотой, кодирующей SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NО:4, опубликованных в патенте США 5,932,214. Далее в качестве антагонистов может служить также белок, нуклеиновая кислота которого в условиях пониженной жесткости гибридизуется с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный домен антитела, продуцируемого линией клеток АТСС CRL 11175. С. Продуцирование фрагментов и аналогов. Фрагменты антагонистов выделенного альфа-4-интегрина (например, описанные здесь фрагменты гомологов антител) могут быть также успешно получены с использованием рекомбинантных методов,путем протеолитического переваривания или путем химического синтеза с использованием методов, известных специалистам в данной области. Рекомбинантными методами внутренние или концевые фрагменты могут быть получены путем удаления одного или более нуклеотидов с одного конца (в случае концевого фрагмента) или с обоих концов (в случае внутреннего фрагмента) последовательности ДНК,которая кодирует выделенный полипептид hedgehog. Экспрессия подвергнутой мутагенезу ДНК продуцирует полипептидные фрагменты. Переваривание под действием нуклеаз "end nibbling" также может приводить к образованию ДНК, которая кодирует ряд фрагментов. ДНК, которые кодируют фрагменты белка, могут быть получены также путем случайной фрагментации, переваривания рестриктазами или же комбинацией того и другого. Белковые фрагменты могут вырабатываться непосредственно из интактных белков. Пептиды могут специфически расщепляться протеолитическими ферментами, включая, но не ограничиваясь ими, плазмин, тромбин, трипсин, химотрипсин или пепсин. Каждый из этих ферментов специфичен в отношении определенного типа пептидной связи, которую он атакует. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, в которых карбонильная группа принадлежит основной аминокислоте,обычно аргинину или лизину. Пепсин и химотрипсин катализируют гидролиз пептидных связей ароматических аминокислот, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин. Альтернативные группы расщепленных белковых фрагментов вырабатываются путем превентивного расщепления в сайте, который подвержен действию протеолитического фермента. Например, реакция Е-аминогруппы лизина с этилтрифтортиоацетатом в слабом щелочном растворе приводит к блокированию аминокислотных остатков,при котором прилегающая к ним соседняя пептидная связь не подвержена более гидролизу под действи- 14006681 ем трипсина. Протеины могут быть модифицированы таким образом, что в результате образуются связи,которые подвержены протеолитическому воздействию. Например, алкилирование цистеиновых остатков-галогенэтиламинами приводит к образованию пептидных связей, которые подвержены гидролизу под действием трипсина (Lindley, (1956) Nature 178, 647). Кроме того, могут быть использованы химические реагенты, которые расщепляют пептидные цепи вблизи специфических остатков. Например, цианогенбромид расщепляет пептиды по метиониновым остаткам (Gross and Witkip, (1961) J. Am. Chem. Soc. 83,1510). Таким образом, путем обработки белков различными комбинациями модификаторов, протеолитических ферментов и/или химических реагентов эти белки можно разделить на перекрывающиеся фрагменты требуемой длины или разделить на неперекрывающиеся фрагменты требуемой длины. Фрагменты могут быть также синтезированы химически с использованием методов, известных в данной области, таких как твердофазная F-moc- или t-Boc-химия Меррифилда. Merrifield, Recent Progressin Hormone Research 23: 451 1967). Примеры способов, которые позволяют получать и тестировать фрагменты и аналоги, обсуждаются ниже. Эти же или аналогичные способы могут быть использованы для получения и скрининга фрагментов и аналогов антагониста выделенного альфа-4-интегрина, биологическая активность которых может быть продемонстрирована. Пример такого способа проверки того, обладают ли фрагменты или аналоги антагонистов интегрина, содержащего альфа-4-субъединицу, биологической активностью, можно обнаружить в разделе IV и в примерах.D. Получение измененных ДНК и пептидных последовательностей: рандомизированные (неспецифические) методы. Варианты аминокислотной последовательности белка могут быть получены путем рандомизированного мутагенеза ДНК, которая кодирует этот белок или часть этого белка. Используемые методы включают в себя PCR-мутагенез и насыщающий мутагенез. Может быть получена также библиотека вариантов случайных аминокислотных последовательностей путем синтеза ряда вырожденных олигонуклеотидных последовательностей. Способы выработки вариантов аминокислотных последовательностей данного белка с помощью измененных ДНК и пептидов хорошо известны в данной области. Следующие ниже примеры таких способов призваны не ограничить объем данного изобретения, а скорее послужить наглядной иллюстрацией представленных методов. Любому рядовому специалисту в данной области будет совершенно очевидно, что для целей настоящего изобретения могут быть использованы и другие методы.PCR-мутагенез. См., например, Leung et al., (1989) Technique 1, 11-15. Насыщающий мутагенез. В общих чертах метод описан Mayers et al., (1989) Science 229,242. Мутагенез вырожденных олигонуклеотидов. См., например, Harang, S.A., (1983) Tetrahedron 39, 3;E. Получение измененных ДНК и пептидных последовательностей: прямые методы. Ненеспецифический или прямой мутагенез обеспечивает специфические последовательности или мутации в специфических частях полинуклеотидной последовательности, которая кодирует выделенный полипептид, чтобы обеспечить варианты, которые включают в себя делеции, вставки или замены остатков известной аминокислотной последовательности выделенного полипептида. Сайты мутации могут быть модифицированы индивидуально или серийно, например, путем (1) замены сначала консервативными аминокислотами, а затем более радикальным отбором, в зависимости от получаемых результатов;(2) делеции остатков-мишеней или (3) вставки остатков того же самого или другого класса по соседству с локализованным сайтом или комбинации возможностей 1-3. Точнее, такие сайт-направленные методы являются одной из возможностей, при которых Nконцевой цистеин (или функциональный эквивалент) могут быть введены в данную полипептидную последовательность для обеспечения сайта прикрепления гидрофобного фрагмента. Алании сканирующий мутагенез. См. Cunningham and Wells, (1989) Science 244, 1081-1085). Направленный мутагенез посредством олигонуклеотидов. См., например, Adelman et al., (1983)F. Другие варианты антагонистов интегрина. Варианты могут отличаться от остальных описанных здесь антагонистов интегрина аминокислотной последовательностью или иным образом, не включающим в себя последовательность, либо и тем, и иным образом. Наиболее предпочтительные полипептиды согласно изобретению имеют модификации,предпочтительно не связанные с их последовательностью, которые включают в себя химическую дериватизацию in vivo или in vitro (например, по их N-концу), а также возможные изменения в ацетилировании, метилировании, фосфорилировании, амидировании, карбоксилировании или гликозилировании.- 15006681 Другие аналоги включают в себя белок или его биологически активные фрагменты, последовательности которых отличаются от таковых, отраженных в патентах США 5,840,299 или 5,888,507; 5,932,214(все они включены в настоящее описание в виде ссылок) или РСТ US/94/00266, одной или более консервативных аминокислотных замен или одной или более неконсервативных аминокислотных замен, либо делециями или вставками, которые не лишают выделенный белок биологической активности. Консервативные замены обычно включают в себя замену аминокислоты другой аминокислотой со сходными свойствами, такую как замены в пределах следующих групп: валин, аланин и глицин; лейцин и изолейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин и глутамин; серии и треонин; лизин и аргинин; и фенилаланин и тирозин. Неполярные гидрофобные аминокислоты включают в себя аланин,лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают в себя глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают в себя аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Другие консервативные замены могут быть легко узнаваемы рядовыми специалистами в данной области. Например, для консервативной замены аминокислоты аланина может быть взята любая одна из Dаланина, глицина, бета-аланина, L-цистеина и D-цистеина. Для лизина заменой может служить любая одна из группы D-лизина, аргинина, D-аргинина, гомоаргинина, метионина, D-метионина, орнитина илиD-орнитина. Другими аналогами, используемыми в рамках данного изобретения, являются аналоги с модификациями, которые повышают стабильность пептида. Такие аналоги могут содержать, например, одну или более непептидных связей (которые заменяют пептидные связи) в пептидной последовательности. Сюда включаются также аналоги, которые включают в себя остатки, отличные от природных L-аминокислот,такие как D-аминокислоты или неприродные или искусственные аминокислоты, такие как бета- или гамма-аминокислоты, и циклические аналоги. Включение D-аминокислот вместо L-аминокислот в выделенный полипептид hedgehog может повышать его резистентность к протеиназам. См. выше патент США 5,219,990. Предпочтительные гомологи антитела включают в себя аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60, 80, 90, 95, 98 или 99% гомологичную аминокислотной последовательности антителаPS/2 (См. пример), или включают в себя аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60,80, 90, 95, 98 или 99% гомологичную аминокислотным последовательностям, описанным в патенте США 5,840,299 (SEQ ID NO: 15 вариабельной области легкой цепи или SEQ ID NO: 17 вариабельной области тяжелой цепи) или патенте США 5,932,214 (SEQ ID NOS: 2 или 4); или в опубликованной патентной заявке WО 94/16094 (эти последовательности обнаружены в последовательности анти-VLA4-антитела депонированной линии клеток АТСС CRL 11175).G. Виды конъюгатов полимеров. В рамках обширного объема настоящего изобретения для конъюгации с антагонистом альфа-1 или альфа-4-интегрина может быть использована только одна полимерная молекула, несмотря на предположение, что может быть прикреплено также и более одного полимера. Композиции конъюгированного антагониста альфа-1 или альфа-4-интегрина согласно изобретению могут найти применение как in vivo,так и не in vivo. Кроме того, как выясняется, при конъюгации конъюгирующего полимера могут быть использованы, в соответствии с конечным результатом его применения, любые другие группы, фрагменты или иные виды конъюгации. В порядке примера, в ряде применений может быть полезным ковалентное привязывание к полимеру функционального фрагмента, придающего полимеру резистентность к деградации под действием ультрафиолета, или придающего ему антиоксидантные или иные свойства или характеристики. В качестве другого примера, в некоторых случаях может оказаться полезным функционализировать полимер, чтобы восстановить его реактивность и создать возможность его поперечного связывания с молекулой лекарственного средства, чтобы усилить различные свойства или характеристики всего конъюгированного продукта в целом. Соответственно, полимер может содержать некоторую функциональную группу, повторяющиеся группы, связи или другие структуры, которые не препятствуют эффективности применения композиции конъюгированного антагониста альфа-4-интегрина для намеченной цели. Другие цели и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из дальнейшего описания и прилагаемой формулы изобретения. Иллюстративные полимеры, которые могут быть успешно использованы для достижения указанных необходимых свойств, описаны ниже в образцовых реакционных схемах. В конъюгатах ковалентно связанного с полимером антагониста полимер может быть функционализирован, а затем связан со свободной аминокислотой (аминокислотами) антагониста с образованием лабильных связей. Наиболее предпочтительно, чтобы антагонисты интегринов, содержащих альфа-4- или альфа-1 субъединицу, были конъюгированы через концевую реактивную группу на полимере, хотя конъюгаты могут ответвляться и от неконцевых реактивных групп. Полимер с реактивной группой(группами) обозначается здесь как "активированный полимер". Реактивная группа селективно реагирует со свободными аминогруппами или другими реактивными группами на молекуле антагониста. Реактивность активированного полимера(ов) предусматривает, что прикрепление может происходить к любой доступной ами- 16006681 ногруппе антагониста альфа-4-интегрина, такой как альфа-аминогруппы или эпсилон-аминогруппы лизинов. Свободные карбоксильные группы, соответствующим образом активированные карбонильные группы, гидроксильные, гуанидиловые, окисленные углеводные фрагменты и меркаптогруппы антагониста альфа-4-интегрина (если они доступны) также могут быть использованы в качестве сайтов прикрепления. Несмотря на то, что полимер может быть прикреплен к любому сайту на молекуле антагониста интегрина, предпочтительным сайтом связывания полимера с антагонистами интегрина (в особенности с такими, которые являются белками) является N-конец антагониста интегрина. Вторым предпочтительным сайтом(ами) является сайт на или вблизи С-конца и через фрагмент сахара (если таковой имеется). Таким образом, в данном изобретении рассматриваются (i) связанные с N-концом полимера конъюгаты альфа-1- или альфа-4-интегрина; (ii) связанные с С-концом полимера конъюгаты альфа-1- или альфа-4 интегрина; (iii) сахарсвязанные конъюгаты; (iv) а также N-, С- и сахарсвязанные конъюгаты полимера с антагонистами альфа-1- и альфа-4-интегрина. Обычно используют, в зависимости от концентрации антагониста, примерно от 1,0 до 10 моль активированного полимера на моль антагониста. Конечное количество сбалансировано таким образом, чтобы, с одной стороны, по возможности максимализировать выраженность реакции, при этом минимизируя неспецифические модификации продукта, и с другой стороны, определить химизм, который поможет сохранить оптимальную активность, в то же время оптимизируя, если это возможно, время полужизни антагониста. Предпочтительно, чтобы сохранилось по меньшей мере 50% биологической активности антагониста и более предпочтительно, если сохранится 100%. Реакции могут проводиться каким-нибудь искусственно распознаваемым способом, используемым при реагировании биологически активных материалов с инертными полимерами. Обычно такой способ включает в себя получение активированного полимера (который может иметь по меньшей мере одну концевую гидроксильную группу), а затем реакцию антагониста с активированным полимером с получением растворимого белка, пригодного для композиции. Указанная выше реакция модификации может быть предпринята несколькими методами, которые могут включать в себя одну или несколько стадий. Как указывалось выше, в определенных аспектах данного изобретения используют для связывания с полимером N-конец антагониста интегрина. Имеются соответствующие общеизвестные методы селективного получения модифицированного по N-концу антагониста альфа-1- или альфа-4-интегрина. Примером может служить метод редуктивного алкилирования, в котором используется различная реактивность первичных аминогрупп разного типа (эпсилон-аминогруппы лизина против аминогрупп на Nконце метионина), доступных для дериватизации, на соответствующем антагонисте интегрина. При определенных селективных условиях может быть достигнута существенно селективная дериватизация подходящего антагониста интегрина на его N-конце полимером, содержащим карбонильную группу. Реакцию проводили при значениях рН, которые позволяют использовать преимущество различий значений рКа между эпсилон-аминогруппами лизиновых остатков и альфа-аминогруппой N-концевого остатка антагониста интегрина. Такого типа химия хорошо известна любому рядовому специалисту. Стратегия таргетирования полиалкиленгликолевого полимера, такого как PEG, на С-конец антагониста альфа-1- или альфа-4-интегрина (такого, например, как протеин), должна быть направлена на то,чтобы химически или с помощью техники генной инженерии прикрепить сайт, который может быть использован для таргетирования полимерного фрагмента. Например, включение Cys в сайт, который находится на С-конце протеина или вблизи него, позволило бы произвести специфическую модификацию с использованием известной техники малеимид-, винилсульфон- или галогенацетатактивированных производных полиалкиленгликоля (например, PEG). В особенности эти производные могут быть использованы для модификации генноинженерных цистеинов благодаря высокой селективности этих реагентов в отношении Cys. Другие стратегии, такие как включение гистидина tag, который может быть таргетирован (Fancy et al., (1996) Chem.Biol. 3: 551), или дополнительный сайт гликозилирования на протеине представляют собой другие альтернативы для модификации С-конца антагониста интегрина согласно изобретению. Методы таргетирования сахаров как сайтов химической модификации также хорошо известны, а следовательно, вполне вероятно, что полимер полиалкиленгликоля может быть добавлен непосредственно и в особенности к сахарам (если таковые есть) на антагонисте интегрина, который активирован путем окисления. В качестве примера, можно получить полиэтиленгликольгидразид, который образует относительно стабильные гидразоновые связи, путем конденсации с альдегидами и кетонами. Это свойство использовано для модификации через окисленные олигосахаридные связи. См. Andresz, H. et al., (1978),Makromol. Chem. 179: 301. В частности, обработка PEG-карбоксиметилгидразина нитритом продуцируетPEG-карбоксиметилазид, который является электрофильной активной группой, реактивной в отношении аминогрупп. Эта реакция также может быть использована для получения полиалкиленгликольмодифицированных белков. См. патенты США 4,101,380 и 4,179,337. Для получения мультивалентных композиций антагониста альфа-1- или альфа-4-интегрина можно воспользоваться также опосредованной тиоловым линкером химией, чтобы еще более облегчить поперечное связывание. В частности, можно получить реактивные альдегиды на углеводных фрагментах с- 17006681 перйодатом натрия, с образованием цистаминовых конъюгатов через альдегиды и с индуцированием поперечного связывания на цистамине через тиоловые группы. См. Pepinsky, В. et al., (1991), J. Biol. Chem.,266: 18244-18249 and Chen, L.L. et al., (1991) J. Biol. Chem., 266: 18237-18243. Следовательно, такой тип химии также должен быть приемлем для модификации полиалкиленгликолевыми полимерами, в которых линкер встроен в сахар, и полиалкиленгликолевый полимер присоединен к линкеру. Поскольку аминотиоловые или гидразинсодержащие линкеры допускают добавление одиночной полимерной группы,структуру линкера можно варьировать таким образом, чтобы можно было добавлять множество полимеров, и/или таким образом, чтобы изменялась пространственная ориентация полимера по отношению к антагонисту интегрина. Практически в данном изобретении полиалкиленгликолевые остатки С 1-С 4-алкилполиалкиленгликолей, предпочтительно полиэтиленгликоля (PEG), или поли(окси)алкиленгликолевые остатки таких гликолей успешно встраиваются в нужные полимерные системы. Таким образом, полимер,к которому прикреплен протеин, может быть гомополимером или полиэтиленгликолем (PEG) или является полиоксиэтилированным полиолом, при том условии, что во всех случаях полимер является растворимым в воде при комнатной температуре. Неограничивающие примеры таких полимеров включают в себя гомополимеры полиалкиленоксида, такие как PEG или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные гликоли, их сополимеры и их блок-сополимеры, при условии, что растворимость в воде блоксополимеров сохранена. Примеры полиоксиэтиленированных полиолов включают в себя, например, полиоксиэтилированный глицерин, полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированную глюкозу или им подобное. Глицериновый остов полиоксиэтилированного глицерина является тем же самым остовом,который природно образуется, например, у животных и человека в моно-, ди- и триглицеридах. Следовательно, нет необходимости рассматривать такую разветвленность как чужеродный агент в организме. В качестве альтернативы полиалкиленоксидам могут быть использованы декстран, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, полимеры на основе углеводов и тому подобное. Как будет очевидно любому рядовому специалисту, нижеследующий список носит исключительно иллюстративный характер, и подразумеваются все полимерные материалы, имеющие описанные здесь свойства. Не обязательно, чтобы полимер имел конкретный молекулярный вес, но предпочтительно, чтобы его молекулярный вес был заключен примерно от 300 до 100,000, более предпочтительно от 10,000 до 40,000. В частности, размеры от 20,000 или выше являются наиболее удачными с точки зрения предотвращения потери продукта в результате фильтрации в почках. Практически в настоящем изобретении дериватизация полиалкиленгликоля имеет ряд преимущественных свойств при образовании конъюгатов полимера с антагонистом интегрина в связи со следующими свойствами производных полиалкиленгликоля: улучшение растворимости в воде, при этом отсутствие порождения антигенной или иммуногенной реактивности; высокая степень биосовместимости; отсутствие биодеградации производных полиалкиленгликоля in vivo; и легкость экскреции живыми организмами. Более того, в другом аспекте согласно изобретению можно использовать антагонист альфа-1- или альфа-4-интегрина, ковалентно связанный с полимерным компонентом, в котором природа конъюгирования включает в себя расщепление ковалентных химических связей. Это позволяет осуществлять контроль все то время, в течение которого полимер может быть отщеплен от антагониста интегрина. Эта ковалентная связь между антагонистом интегрина и полимером может быть расщеплена в результате химической или ферментативной реакции. Получаемый продукт конъюгации полимера с антагонистом интегрина сохраняет приемлемый уровень активности. Кроме того, при конъюгировании полимера присутствует доля полиэтиленгликоля для придания конъюгату полимера с антагонистом интегрина высокую растворимость в воде и пролонгированную способность циркулировать в крови. В результате таких улучшенных характеристик в данном изобретении подразумевается парентеральная, назальная и пероральная доставка активных видов конъюгатов полимера с антагонистом альфа-4-интегрина и последующее гидролитическое расщепление, биодоступность антагониста интегрина как такового при применении in vivo. Понятно, что описанные здесь схемы реакций приведены только для иллюстрации и не являются ограничивающими по отношению ко всем возможным реакциям и структурам, которые могут быть использованы в модификации антагониста альфа-1- или альфа-4-интегрина, например, для придания растворимости, стабильности и аффинности в отношении клеточной мембраны для парентерального и перорального введения. Активность и стабильность этих конъюгатов интегриновых антагонистов можно варьировать несколькими способами, используя полимер различного молекулярного размера. Растворимость конъюгатов можно варьировать путем изменения соотношения и размера фрагмента полиэтиленгликоля, встраиваемого в полимерную композицию.III. Применимость. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалами носителя для получения одноразовой дозировки, будет варьировать, в зависимости от конкретного субъекта, который подвергается лечению, и конкретного способа введения. При этом подразумевается, однако, что специ- 18006681 альная доза и схема лечения любого конкретного субъекта будут зависеть от различных факторов, включая активность используемых специфических соединений, возраст, вес тела, общее состояние здоровья,пол, диету, время введения, скорость выведения, комбинацию лекарственных средств и мнение лечащего врача, а также степень тяжести конкретного заболевания, которое лечат. Количество активного ингредиента может зависеть также от терапевтического или профилактического средства (при наличии таковых),совместно с которыми данный ингредиент вводится. Способ лечения согласно данному изобретению включает в себя введение субъекту эффективного количества антагонистов согласно данному изобретению. Дозы, используемые в способе согласно изобретению, диктуются наличием эффективности и отсутствием токсичности. Специалисты в данной области, проводящие традиционные клинические анализы, могут определить оптимальные дозы для случая каждого кокретного заболевания, которое лечат. Фармацевтические композиции В способах данного изобретения антагонисты согласно изобретению могут быть введены парентерально. Под термином "парентеральный", используемым здесь, подразумевается подкожное, внутривенное, внутримышечное, внутрисуставное, внутрисиновиальное, внутригрудинное, внутритрахеальное,внутрипеченочное, внутриочаговое или внутричерепное введение в виде инъекции или инфузии. Необходимая доза вводится субъекту один или более раз в день внутривенно, перорально, ректально, парентерально, интраназально, местно или путем ингаляции. Необходимая доза может также вводиться путем непрерывной внутривенной инфузии. Гомологи антитела предпочтительно вводятся в виде стерильной фармацевтической композиции,содержащей фармацевтически приемлемый носитель, который может быть любым из ряда хорошо известных носителей, таких как вода, солевой раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор,декстроза, глицерин, этанол и им подобные или их комбинации. Соединения данного изобретения могут быть использованы в виде фармацевтически приемлемых солей, полученных из неорганических или органических кислот и оснований. Среди них могут быть соли кислот, включая следующие: ацетат, адипат,альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат,циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат и ундеканоат. Соли оснований включают в себя соли аммония, соли щелочных металлов, такие как соли натрия и калия, соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция и магния, соли органических оснований, такие как дициклогексиламиновые соли, N-метил-D-глутамин, трис(гидроксиметил)метиламин и соли аминокислот, такие как аргинин, лизин и так далее. Также группы, содержащие основный азот, могут быть кватернизованы такими агентами как галогениды низшего алкила, такие как метил, этил, пропил и бутилхлорид, бромиды и йодиды; диалкилсульфатами, такими как диметил, диэтил, дибутил и диамилсульфаты, галогениды с длинными цепями, такие как децил, лаурил, миристил и стеарилхлориды, бромиды и йодиды, аралкиловые галогениды, такие как бензил и фенетилбромиды и другие. Таким путем получают продукты, растворимые или диспергируемые в воде или в масле. Фармацевтические композиции согласно изобретению содержат любое из соединений согласно изобретению или их фармацевтически приемлемых солей, а также фармацевтически приемлемый носитель. Термин "носитель", используемый здесь, включает в себя приемлемые адъюванты и наполнители. Фармацевтически приемлемые носители, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях согласно изобретению, включает в себя, не ограничиваясь ими, ионообменники, глинозем (оксид алюминия), стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, частичные глицеридные смеси насыщенных растительных жирных кислот, вода, соли или электролиты, протаминсульфат, гидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный кремнезем, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, поликрилаты, воски, блок-полимеры полиэтиленполиоксипропилен, полиэтиленгликоль и ланолин. Согласно изобретению фармацевтические композиции могут быть в виде стерильных препаратов для инъекций, например стерильных водных растворов или масляных суспензий для инъекций. Эти суспензии могут быть составлены в соответствии с технологиями, известными в данной области, с помощью соответствующих диспергирующих или увлажняющих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный инъецируемый препарат может представлять собой также стерильный инъецируемый раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворе, например, таком как раствор в 1,3-бутандиоле. К приемлемым носителям и растворам, которые можно использовать, относятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлористого натрия. Кроме того, к обычно используемым в качестве растворителя или суспендирующей среды относятся стерильные связующие масла. Для этой цели может быть использовано любое мягкое связующее масло, включая искусственные моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как масляная кислота и ее глицеридные производные, могут быть- 19006681 использованы при приготовлении инъецируемых препаратов, такие как фармацевтически приемлемые масла, как, например, оливковое масло или касторовое масло, особенно в их полиоксиэтилированной форме. Фармацевтические композиции согласно данному изобретению могут быть в форме для перорального введения. При пероральном назначении они могут вводиться в любой перорально приемлемой дозированной форме, включая, но не ограничиваясь этим, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для перорального применения обычно используемые носители включают в себя лактозу и кукурузный крахмал. Обыно добавляются также и смазывающие агенты, такие как стеарат магния. Для перорального введения в форме капсулы используются разбавители, включая лактозу и сухой кукурузный крахмал. В тех случаях, когда для перорального применения требуются водные суспензии, активный ингредиент комбинируют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. В случае необходимости могут быть добавлены определенные подслащивающие, вкусовые агенты или красители. В частности, композициями для применения в способе согласно данному изобретению являются такие, в которых антагонист заключен в везикулы, такие как композиции, содержащие липосомы. Липосомы являются везикулами, образованными амфифатическими молекулами, такими как полярные липиды,например, фосфатидилхолины, этаноламины и серины, сфингомиелины, кардиолипины, плазма-логены,фосфатидные кислоты и церебиозиды. Липосомы образуются, когда соответствующие амфифатические молекулы имеют возможность сгруппироваться в воде или водных растворах с образованием жидких кристаллов, обычно многослойной структуры, состоящей из многих бислоев, отделенных друг от друга водным материалом (их называют также грубыми липосомами). Другим типом липосом, известных как состоящие из единственного бислоя, инкапсулирующего водный материал, являются так называемые униламеллярные везикулы. Если водорастворимые вещества включены в водную фазу во время образования липидами указанных структур, они оказываются в водном слое, заключенном между бислоями липидов. Особо распространенным методом приготовления заключенных в липосомы форм настоящих антагонистов является метод, описанный в публикации ЕР-А-253,619, включенной в данное описание в виде ссылки. В этом методе липосомы, состоящие из единственного бислоя, содержащие инкапсулированные активные ингредиенты, получают путем растворения липидного компонента в органической среде,впрыскивая под давлением органический раствор липидного компонента в водный компонент при одновременном перемешивании органического и водного компонентов высокоскоростным гомогенизатором или смешивающим устройством, под действием которого липосомы образуются спонтанно. Липосомы,состоящие из единственного бислоя, содержащие инкапсулированный активный ингредиент, могут быть использованы как таковые, или же их можно использовать в подходящем фармацевтически приемлемом носителе для местного применения. Вязкость липосом может быть увеличена путем добавления одного или более подходящих загустителей, таких, например, как ксантановая смола, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза и их смеси. Водные компоненты могут состоять только из воды или же они могут содержать электролиты, забуферивающие системы и другие ингредиенты, такие, например,как консерванты. Подходящие электролиты, которые могут быть использованы, включают в себя соли металлов, таких как щелочные металлы, и соли щелочно-земельных металлов. Предпочтительными солями металлов являются хлорид кальция, хлорид натрия и хлорид калия. Концентрация электролита может варьировать от нуля до 260 мМ, предпочтительно от 5 до 160 мМ. Водный компонент помещают в подходящий сосуд, который может быть адаптирован для гомогенизации под действием высокой турбулентности в процессе инъецирования органического компонента. Гомогенизация двух компонентов может быть произведена внутри сосуда или, альтернативно, водный и органический компоненты могут быть инъецированы отдельно в смешивающее устройство, которое находится вне сосуда. В последнем случае липосомы образуются в смешивающем устройстве, а затем переносятся в другой сосуд для хранения. Органический компонент состоит из подходящего нетоксичного фармацевтически приемлемого растворителя, такого, например, как этанол, глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль, и подходящего фосфолипида, который растворим в растворителе. Подходящие фосфолипиды, которые могут быть использованы, включают в себя, например, лецитин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит, лизофосфатидилхолин и фосфатидилглицерин. Другие липофильные добавки могут быть использованы для селективной модификации свойств липосом. Примеры таких других липофильных добавок включают в себя стеариламин, фосфатидную кислоту, токоферол,холестерин и экстракты ланолина. Кроме того, к органическому компоненту могут быть добавлены и другие ингредиенты, которые могут предотвращать окисление фосфолипидов. Примеры таких других ингредиентов включают в себя токоферол, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, аскорбилпальмитат и аскорбилолеат. Консерванты, такие как бензойная кислота, метилпарабен и пропилпарабен, могут быть использованы также. Помимо описанных выше композиций, могут оказаться полезными покрытия, например, пластыри,повязки, перевязочные материалы, марлевые тампоны и тому подобное, содержащие соответствующее- 20006681 количество терапевтического анти-VLA-антитела. В некоторых случаях могут применяться пластыри,повязки, перевязочные материалы, марлевые тампоны и тому подобное, что должно быть пропитано композицией для местного нанесения, содержащей терапевтический состав. Фармацевтические композиции согласно данному изобретению могут вводиться также в виде назальных аэрозолей или ингаляций с использованием распылителя, ингалятора сухого порошка или ингалятора метрированной дозы. Такие композиции изготавливаются в соответствии с хорошо известными в фармацевтической области способами и могут быть получены в виде растворов в физиологическом растворе, с использованием бензилового спирта или других подходящих консервантов, промоторов абсорбции для повышения биосовместимости, флуорокарбонов и/или других подходящих растворяющих или диспергирующих агентов. В соответствии с другим аспектом, композиции, содержащие соединение данного изобретения, могут включать в себя также и дополнительный агент, выбранный из группы, состоящей из кортикостероидов, противовоспалительных агентов, иммуносупрессоров, антиметаболитов и иммуномодуляторов. Специфические соединения внутри каждого из этих классов могут быть выбраны из любого из перечисленных в соответствующей группе заголовков в "Comprehensive Medicinal Chemistry", PergamonPress, Oxford, England, pp. 970-986 (1990), описание которых приведено в данном описании в виде ссылки. Все входящие в эту группу соединения являются такими соединениями как теофиллин, сульфазалазин и аминосалицилаты (противовоспалительные); циклоспорин, FK-506 и рапамицин (иммуносупрессанты); циклофосфамид и метотрексат (антиметаболиты); стероиды (ингалируемые, пероральные или местные) и интерфероны (иммуномодуляторы). Дозировка и степень дозирования соединений согласно изобретению, эффективные для достижения требуемых эффектов, будут зависеть от разнообразия факторов, таких как природа антагониста, вес индивидуума, цель лечения, природа патологии, в связи с которой проводится лечение, используемой специфической фармацевтической композиции и решения, принимаемого лечащим врачом. Используются уровни дозировки примерно между 0,001 и 100 мг/кг массы тела в день, предпочтительно примерно между 0,1 и 50 мг/кг массы тела в день активного соединения-ингредиента. Наиболее предпочтительно, чтобы VLA-4-связывающий агент, будь то антитело или производное антитела, был назначен в дозе примерно между 0,1 и 20 мг/кг массы тела в день, предпочтительно примерно между 0,1 и 10 мг/кг массы тела в день и интервалами 1-14 дней. В случае неантител или же агентов, связывающих малые молекулы, предпочтительно, чтобы границы дозы варьировали между их молярно эквивалентными количествами и молярно эквивалентными количествами антитела. Предпочтительно, чтобы антительная композиция назначалась в количестве, обеспечивающем уровень антитела в плазме по меньшей мере 1 мг/мл. Оптимизация дозировок может быть установлена путем введения связывающих агентов и последующей оценкой покрытия интегринположительных клеток агентом спустя время после введения определенной дозы in vivo. Присутствие введенного агента может быть зарегистрировано in vitro (или ex vivo) по неспособности или пониженной способности клеток индивидуума связывать этот же самый агент, который был меченным (например, флуорохромом). Предпочтительная дозировка должна продуцировать регистрируемое покрытие обширного большинства интегрин-положительных клеток. Предпочтительно, чтобы в случае гомолога антитела покрытие поддерживалось в течение 1-14-дневного периода. Рядовые специалисты в данной области смогут с легкостью проверить, вызывает ли антагонист согласно изобретению предполагаемый эффект. Для определения эффективности специалистами будут использованы стандартные клинические тесты (например, лаваж и FACS-сканирование для связывания антитела; улучшение жизненной функции легких). Например, клетки, содержавшиеся в образце легочной ткани индивидуума, тестируются на наличие агента in vitro (или ex vivo) с помощью второго агента для регистрации введенного агента. Это может быть, например, меченное флуорохромом антитело, специфичное в отношении введенного агента, которое затем измеряют с помощью FACS-анализа (флуоресцентно активируемый клеточный сортер). Альтернативно, присутствие введенного агента регистрируется in vitro (или ex vivo) по неспособности или пониженной способности клеток индивидуума связывать этот же самый агент, который был меченным (например, флуорохромом). Предпочтительная дозировка должна продуцировать регистрируемое покрытие обширного большинства интегринположительных клеток. Предпочтительно, чтобы покрытие поддерживалось в течение 1-14-дневного периода. Следующие далее примеры призваны проиллюстрировать данное изобретение и не должны быть истолкованы как ограничительные. Пример 1. Животные модели легочного фиброза. Много доказательств участия воспалительных клеток и медиаторов в легочном фиброзе получено на имеющих широкое применение блеомициновых (BL) моделях грызунов. Эта модель привлекательна в связи с тем, что в ней воспроизводится характерная картина фиброза со многими признаками этого заболевания у человека, а также потому, что BL-индуцированный легочный фиброз является распространенным побочным явлением, возникающим на фоне химиотерапии у человека. Внутритрахеальное (IT) введение BL грызунам широко используется для изучения механизмов фиброгенеза и для скрининга потенциально необходимых противофиброзных соединений. Хотя первопричину BL-индуцированной легоч- 21006681 ной токсичности связывают с выработкой видов реактивного кислорода (ROS), который связывается с железом и ДНК, процесс, приводящий к конечным проявлениям легочного фиброза, включает в себя высвобождение различных медиаторов воспаления (Giri and Wang., Comments Toxicol., 3: 145-176 (1989. Патогенез BL-индуцированного повреждения легких связывали с отеком, геморрагией и клеточными инфильтратами, преимущественно нейтрофильными и макрофагальными. Избыточное накопление воспалительных лейкоцитов в сосудах, интерстиции и в альвеолярном пространстве легких могло приводить к повреждению сосудов и паренхимы в результате выработки ROS и протеолитических ферментов. Нейтрофилы содержат значительное количество миелопероксидазы (МРО), которая может окислять Сl с образованием гипохлорной кислоты (НОСl) в реакции с Н 2 О 2, и вырабатываемая нейтрофилами НOСl, как известно, является причиной клеточной токсичности. Вырабатываемые макрофагами и нейтрофиламиROS могут стимулировать продукцию провоспалительных и фиброгенных цитокинов, которыми опосредован усиленный фибропролиферативный ответ (Phan and Kunkel., Exp. Lung Res., 18: 29-43 (1992. Помимо обширного воспалительного клеточного инфильтрата, фиброзный процесс характеризуется еще и гиперпролиферативным ответом активированных фибробластов. Фибробластоподобные клетки, в первую очередь, ответственны за увеличение абсолютного содержания коллагена в легких, а также за аномальные проявления на уровне ультраструктуры и пространственного рапределения разных типов коллагенов. Пример 2. Ингибирование фиброза антагонистом интегрина, содержащего альфа-4-субъединицу. Материалы и методы Были использованы неспецифическое контрольное антитело (1 Е 6) и антитело против интегринов,содержащих альфа-4-субъединицу (PS2). 1 Е 6 представляет собой мышиное моноклональное антитело(1992) J. Exp. Med. 178: 211-222. PS/2 был получен методом, описанным Miyake et al., J. Exp. Med., 173: 599-607 (1991). Мыши C57BL/6 весом 25-30 г, не пораженные хроническим респираторным заболеванием, были получены в Charles River Laboratory. Блеомицинсульфат (торговая марка Blenoxane) был получен в подарок от Bristol Laboratories, (Syracuse, NY). L-[3,4-3 Н]пролин для мечения проколлагенового субстрата пролилгидроксилазы был приобретен в NEN Life Science Products (Boston, MA). Z-fix, водный забуференный цинк-формалин, был приобретен в Anatech, LTD (Battle Creek, MI). Все остальные использованные химические реагенты были реагентами высокой степени чистоты и были приобретены из стандартных коммерческих источников. Обработка животных Мыши были рассажены по 4 животных в каждой клетке, и уход за ними был обеспечен в соответствии с предписаниями Национального Института Здоровья по уходу за животными. Перед началом эксперимента мышей содержали в течение одной недели для их полной акклиматизации и привыкания к изменившейся обстановке. Им устанавливали чередующийся двенадцатичасовой цикл (12 ч/12 ч) света и темноты и обеспечивали свободный доступ к воде и пище (корм Rodent Laboratory Chow). Животных наугадBL + PS2. Мышам делали внутритрахеальную (IT) инъекцию однократной дозы физиологического раствора или BL в концентрации 0,08 ед./100 мкл/мышь под ксиламиновой и кетаминовой анестезией. После внутритрахеальной инъекции мышам три раза в неделю делали внутрибрюшинную инъекцию IE6, SA или PS2 (100 мкг в 0,2 мл/мышь). Через двадцать один день после введения BL мышей умерщвляли под действием анестезии пентобарбиталом для получения бронхоальвеолярного лаважа (BALF), биохимических и гистопатологических анализов. Получение BALF и легочной ткани После анестезии вскрывали брюшную полость и делали кровопускание путем рассечения нисходящей брюшной аорты. Легкие подготавливали к лаважу путем канюлирования трахеи толстой иглой, присоединенной к шприцу. Лаваж легких производили 3 мл охлажденного изотонического раствора, вводимого в виде аликвот по 1 мл. Аликвоту BALF отбирали для счета общего количества клеток. Остальное количество BALF центрифугировали при 1500 хg в течение 20 мин при 4 С, полученный в результате супернатант разделяли на аликвоты, и затем замораживали и хранили при температуре -70 С. После процедуры получения BALF легочные доли быстро отсекали от непаренхиматозной ткани, немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -70 С. Позже замороженные легкие подвергали оттаиванию и гомогенизации в 0,1 М KCl, 0,02 М Tris (pH 7,6) с использованием гомогенизатора Polytron (Brinkmann Instruments Inc., Westbury, NY). Гомогенат тщательно перемешивали путем многократных переливаний из сосуда в сосуд, и окончательный объем полученного в результате гомогената (4-5 мл) регистрировали. Гомогенат разделяли на несколько аликвот и хранили при -70 С для биохимических анализов. Определение эквивалента малонового диальдегида и содержания гидроксипролина в легких Эквивалент малонового диальдегида легких устанавливали на основании общего количества продуктов в нефракционированном гомогенате, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, с помощью ме- 22006681 тодики Ohkawa et al., Anal. Biochem., 95: 351 (1979). Для определения содержания гидроксипролина в легких 1 мл гомогената осаждали добавлением 0,25 мл охлажденной до температуры льда 50% (мас./об.) трихлоруксусной кислоты, центрифугировали и осадок гидролизовали в 2 мл 6 н. НСl в течение 18 ч при 110 С. Содержание гидроксипролина измеряли методом, описанным Woessner, J.F., Arch. Biochem. Biophys., 93: 440 (1961). Определение активности пролилгидролазы (ЕС 1.14.11.2) Способ получения субстрата для пролилгидролазы (проколла-гена) и метод анализа пролилгидролазы описаны в публикации Giri, S.N. et al., Exp. Mol. Pathol. 39: 317 (1983). Вкратце, свежеудаленную большеберцовую кость десятидневных куриных эмбрионов метили [3 Н]-пролином в культуральной среде, не содержащей пролин, при 37 С в течение 6 ч. После удаления несвязавшейся метки путем промывания ткань гомогенизировали и центрифугировали при 3000 хg в течение 20 мин при 4 С. Полученный в результате супернатант экстенсивно промывали для освобождения от несвязавшейся метки. Меченый проколлагеновый субстрат разделяли на аликвоты и хранили при -70 С. Инкубационную смесь для ферментативного анализа общим объемом 2 мл, состоящую из сульфата железистого аммония (0,1 ммоль/л),альфа-кетоглутаровой кислоты (0,1 ммоль/л), [3 Н]-пролинпроколлагена (200,000 dpm), гомогената легких (0,2 мл), аскорбиновой кислоты (0,5 ммоль/л) и буфера TRIS-HCl (0,1 моль/л, рН 7,8). После 30 минутной инкубации в метаболическом шейкере Dubnoff при 37 С к реакционной смеси добавляли 0,2 мл 50% трихлоруксусной кислоты. В процессе реакции меченная тритием вода выделялась в стехиометрическом отношении к гидроксилированию пролила, и это использовали в качестве меры при определении ферментативной активности. Меченную по тритию воду реакционной системы отделяли путем вакуумной дистилляции реакционной смеси в полном объеме, и в ней производили счет радиоактивности. Ферментативную активность выражали в dpm меченой воды, высвобождаемой в расчете на целое легкое,за 30 мин. Определение количества клеток в BALF Общее количество клеток в BALF определяли, как описано у Wang, Q. et al., Lab. Invest., 67: 234242 (1992). Общее количество лимфоцитов в BALF определяли с помощью культурального счетчика(Model F, Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL), в соответствии с инструкцией для пользователей. Анализ белка в BALF Содержание белка в супернатанте BALF определяли с помощью белкового анализа Bio-Rad (BioRad Laboratories, Richmond, CA), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Гистопатологический и иммуногистохимический анализы Трех или четырех животных из каждой группы рандомизированно выбирали для гистопатологической и иммуногистохимической оценки в конце эксперимента. Брюшную полость животного вскрывали,и делали кровопускание путем рассечения нисходящей брюшной аорты. Сразу же после этого ткань легкого препарировали для гистологического анализа, как описано в публикации Wang et al. выше. После канюлирования трахеи толстой иглой вскрывали полость грудины и из нее извлекали сердце и легкие как одно целое (не разделяя их). Легкие фиксировали Z-fix-раствором через трахею под давлением в 30 см водного столба. Позже блокировали правую краниальную и каудальную и левую доли, погружали в парафин, делали 7-микронные срезы и окрашивали гематоксилинэозином. Для иммуногистохимического окрашивания альфа-SMA срезы легочной ткани депарафинизировали и блокировали эндогенную пероксидазу. Затем срезы, подлежащие окрашиванию, в течение 16 ч обрабатывали блокирующей козьей сывороткой, содержащей первичное моноклональное антитело против альфа-SMA (Sigma Chemical Co.,St Louis, MO). Статистический анализ данных Данные, полученные на животных, выражали в расчете на целое легкое в виде среднегостандартная ошибка (SE). Данные сравнивали внутри четырех групп с помощью двупараметрического вариационного анализа (SIGMASTAT) и метода Student-Newman-Keuls. Величина Р 0,05 считалась значимой. Результаты Перекисное окисление липидов в легких мышей. В различных группах мышей проводили определение содержания эквивалента малонового диальдегида как показателя перекисного окисления липидов. Введение BL значительно повышало содержание эквивалента малонового диальдегида в легких мышей в группах BL+IE6 и BL+SA по сравнению с группами SA+SA и BL+PS2 (данные не представлены). Обработка PS2 эффективно блокировала BLиндуцированное перекисное окисление липидов в легких, так как уровень эквивалента малонового диальдегида в легких в группе BL+PS2 не отличался от такового в группе SA+SA. Содержание гидроксипролина в легких мышей. Гидроксипролин легких, ключевой показатель уровня коллагена в легких, определяли в четырех группах мышей. Внутритрахеальное ведение BL значительно повышало уровень гидроксипролина в легких мышей в группах BL+IE6 и BL+SA, до 185 и 205% соответственно, по сравнению с контрольной группой SA+SA. BL-индуцированное увеличение уровня гидроксипролина в легких мышей в группеBL+PS2 значительно, на 35%, снижалось при обработке PS2, по сравнению с группой BL+SA. Уровень- 23006681 гидроксипролина в легких мышей в группе BL+TR был незначительно выше такового в контрольной группе SA+SA, в которой животным внутритрахеально вводили физиологический раствор. Активность пролилгидроксилазы в легких мышей. Измерение активности пролилгидроксилазы в легких различных групп мышей показало, что BL как таковой значительно повышает активность пролилгидроксилазы легкого в группе BL+SA до 207% по сравнению с контрольной группой SA+SA. PS2 значительно снижал активность пролилгидроксилазы,повышенную под действием обработки BL, в группе BL+SA. Общий счет клеток BALF в легких мышей. Счет общего количества клеток в BALE в различных группах животных на 21 день после внутритрахеального введения физиологического раствора или BL показал, что обработка BL повышала общее количество клеток в BALF в группах BL+IE6 и BL+SA по сравнению с контрольной группой (SA+SA),которой вводили физиологический раствор, хотя только в группе BL+IE6 это количество значительно превышало таковое в контрольной группе SA+SA. Количество BALF клеток в группе BL+PS2 не отличалось от такового в группе SA+SA. Содержание белка в BALF. Определение содержания белка в супернатанте BALF в 4 экспериментальных группах выявило, что внутритрахеальное введение BL значительно повышает содержание белка в BALF во всех группах животных, обработанных BL, по сравнению с контрольной группой SA+SA. Однако обработка PS2 в группеBL+PS2 способствовала снижению BL-индуцированного увеличения содержания белка в супернатантеBALF, хотя эти изменения были статистически недостоверными. Гистопатология легких мышей. Гистологическое исследование легких мышей обнаружило, что животные в контрольной группеSA+SA имели нормальную ткань паренхимы легких. Однако легкие животных из групп BL+IE6 иBL+SA обнаруживали локальные проявления альвеолита и мультифокального интерстициального фиброза с накоплениями внеклеточных волокон. Легкие мышей в этих группах имели утолщенную межальвеолярную перегородку и скопления воспалительных клеток в окружающем пространстве. По сравнению с группами BL+IE6 и BL+SA, легкие животных из группы BL+PS2 имели значительно меньше фиброзных повреждений, хотя в некоторых долях все еще выявлялся в слабой степени интерстициальный фиброз. Иммуногистохимическое окрашивание на альфа-SMA легких мышей. Чтобы выявить накопление фибробластов и фибробластоподобных клеток у мышей после введенияBL, изучали экспрессию альфа-SMA в ткани легких с использованием моноклональных антител против альфа-SMA. В контрольных легких иммунопозитивными оказались слои гладкой мускулатуры сосудов и бронхов. В группах BL и контрольной группе обработанных антителом или физиологическим раствором животных ткань легких оказались обширно и интенсивно иммуноокрашенной внутри фиброзных областей, как в интерстициальной, так и в плевральной областях. Однако в легких, обработанных BL и PS2,обнаруживалось существенно редуцированное иммуноокрашивание на альфа-SMA по сравнению с группами BL+IE6 и BL+SA. Обсуждение IPF представляет собой калечащее заболевание, которое слабо поддается традиционному лечению. В настоящем исследовании показано, что интегрин, содержащий альфа-4-субъединицу,является еще одной возможной мишенью в лечении IPF. Обычно полагают, что лейкоциты легкого участвуют в развитии легочного фиброза в результате секреции ROS, фиброгенных цитокинов и факторов роста. Транспорт и состояние активации лейкоцитов модулируются различными белками клеточной поверхности, такими как интегрины. Очевидно, что межклеточные взаимодействия, также как и взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом, являются критическими в патогенезе легочного фиброза. Неизменным проявлением у больных с активной формой легочного фиброза и у модельных животных с фиброзными заболеваниями легких является накопление избыточных количеств иммунных и воспалительных клеток на участках с фиброзными проявлениями.VLA-4 экспрессируется на всех циркулирующих лейкоцитах, а на поверхности сосудистых клеток связывается с молекулой клеточной адгезии (VCAM-1), членом суперсемейства иммуноглобулиновых генов, который экспрессируется на поверхности активированных цитокином эндотелиальных клеток, и с белком матрикса фибронектином. Альфа-4-бета-7 экспрессируется на субпопуляциях Т- и В-клеток, естественных киллерах и эозинофилах. Он связывается с молекулой клеточной адгезии слизистой сосудов(MAdCAM-1), членом иммуноглобулинового и муциноподобного семейств адгезивных молекул, а также с VCAM-1 и фибронектином. Исследованиях in vitro показали, что взаимодействие VLA-4 с VCAM-1 участвует в прикреплении мононуклеарных лейкоцитов и эозинофилов к эндотелию и в трансэндотелиальной миграции, а кроме того, полагают, что альфа-4-бета-7 прежде всего участвует в рекрутменте лейкоцитов ассоциированной с кишечником лимфоидной ткани. В настоящем изобретении обработка PS2 способствовала снижению BL-индуцированного повышения общего числа лейкоцитов в BALF. Снижение количества лейкоцитов в легких мышей группыBL+PS2 может быть причиной меньших повреждений при воспалении и фиброзе в легких мышей, обработанных BL. BL-индуцированное повреждение легких значительно уменьшалось под действием PS2,- 24006681 как показали путем измерения перекисного окисления липидов в легких. Как таковое повышенное содержание коллагена было ассоциировано с увеличением числа фибробластов в интерстициальном и альвеолярном пространстве. Многие из этих фибробластоподобных клеток являются миофибробластами,которые имеют отличимый фенотип, включая экспрессию альфа-SMA, сократительного белка, обычно обнаруживаемого в клетках гладкой мускулатуры и играющего, как полагают, важную роль в фиброгенезе и процессе заживления ран. Важным открытием в настоящем исследовании явилось то, что обработкаPS2 ослабляла индуцированную BL пролиферацию миофибробластов. Вне связи с какой-либо конкретной теорией, утверждается, что введение антитела против альфа-интегрина может способствовать уменьшению в легких уровня факторов роста, высвобождаемых инфильтрирующими лейкоцитами, или непосредственно воздействовать на поведение миофибробластов. В любом случае сниженная пролиферация миофибробластов может приводить к снижению накопления коллагена в легких у BLобработанных животных в группе BL+PS2. Пример 3. Ингибирование фиброза антагонистом интегрина, содержащего альфа-1-субъединицу. Обработка животных. Самцов мышей C57/BL6 весом 28-30 г размещали в пластиковых клетках по группам из 4 животных, и уход за ними был обеспечен в соответствии с установленным американской Ассоциацией по аккредитации лабораторных животных. Перед началом эксперимента мышей содержали в течение одной недели для их полной акклиматизации и привыкания к лабораторным условиям. Им устанавливали чередующийся двенадцатичасовой цикл (12 ч/12 ч) света и темноты и обеспечивали свободный доступ к воде и пище (корм Rodent Laboratory Chow 5001 (Purina Mills, Inc., St. Louis, МО) и содержали в помещении с фильтрующимся воздухом. Мышей разделяли на 4 следующие группы: Блеомицинсульфат растворяли в апирогенном стерильном изотоническом растворе непосредственно перед внутритрахеальной (IT) инъекцией. Под метоксифлурановой анестезией мыши соответствующих групп внутритрахеально получали либо 100 мкл стерильного изотонического раствора, либо 0,08 единиц раствора блеомицина в 100 мкл. Антитела (4 мг/кг) вводили мышам соответствующих групп три раза в неделю путем внутрибрюшинной инъекции в течение 21 дня после введения блеомицина. Затем мышей каждой группы умерщвляли путем введения больших доз пентобарбитала натрия (100-125 мг/кг внутрибрюшинно) и их легкие подвергали бронхоальвеолярному лаважу, биохимическим и гистопатологическим исследованиям. Определение общего числа клеток и уровней белка в бронхоальвеолярном лаваже. После канюлирования трахеи легкие промывали 5 мл физиологического раствора, разделенного на 5 частей по 1 мл в каждой. Физиологический раствор вводили шприцем через канюлю, слегка массируя при этом грудную клетку, и жидкость собирали. Отобранную жидкость центрифугировали при 1500xg в течение 20 мин при 4 С, и ресуспендировали в изотоническом солевом растворе. Содержание белка в супернатанте образцов бронхоальвеолярного лаважа определяли методом Lowry et al., J Biol. Chem. 1193: 265-275 (1951), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Общее количество лейкоцитов в суспензии определяли с помощью культурального счетчика клеток (Coulter Electronics,Hialeah, FL). Определение гидроксипролина. Легкие животных, используемые для биохимических исследований, перфузировали in situ через правый желудочек ледяным изотоническим солевым раствором для удаления крови из кровеносных сосудов легких путем открытия левого предсердия. Легочные доли быстро отсекали от непаренхиматозной ткани, немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 С. Позже замороженные легкие подвергали оттаиванию и гомогенизации в 0,1 М KСl, 0,02 М Tris (pH 7,6) с использованием гомогенизатораPolytron. В легочном гомогенате определяли содержание гидроксипролина как меру количественного содержания коллагена согласно методике Woessner, Arch. Biochem. Biophys. 93: 440-447 (1961). Гистопатологическое исследование. После легочного лаважа вскрывали полость грудины, и из нее извлекали сердце и легкие как одно целое (не разделяя их). В легкие вводили 1% фиксатор глутаральдегид-параформальдегид в 0,12 М какодилатном буфере при 400 mOsm под давлением в 30 см водного столба. Легкие фиксировали под таким давлением в течение 2 ч, а затем хранили в фиксаторе, с закупоренной трахеей. Перед заливкой легкое отделяли от сердца, и всю нелегочную ткань удаляли. Блоки ткани отрезали по меньшей мере от двух сагиттальных пластинок (толщиной 2-3 мм) от правой краниальной, правой каудальной и левой долей каждого из легких. Каждый блок ткани нарезался на кусочки площадью примерно в 1 см 2. Блоки дегидратировали в градуированной серии метанольной обработки и погружали в парафин. Секции (толщиной- 25006681 5 мкм) отрезали от парафиновых блоков и окрашивали гематоксилин-эозином для гистологической оценки. Анализ данных и их интепретация. Данные анализировали по их средним значениям с учетом стандартных отклонений и стандартных ошибок. Для установления значимости различий между контрольной группой и опытными группами применяли t-тест Стьюдента, хи-квадратные распределения, коэффициент корреляции, анализ вариансы(ANOVA) и множество сравнительных тестов, пользуясь компьютерной базой статистических программ(SAS/STAT Guide, 6th Ed. Cary, N.C. pp. 183-260 (1985. Результаты В данном исследовании проверяли гипотезу, что нейтрализующее 11-интегрин антитело (анти 11) уменьшает индуцированный блеомицином (BL) легочный фиброз in vivo. Самцов мышей C57/BL6 внутритрахеально (IT) инъецировали солевым раствором (SA) или BL, 0,08 ед. в 0,1 мл, после чего внутрибрюшинно (IP) инъецировали антителом (100 мкг в 0,2 мл) три раза в неделю. Через 21 день после ITвведения блеомицина мышей забивали, производили бронхоальвеолярный лаваж (BAL) и проводили биохимические и гистопатологические анализы. Гистопатологическое исследование легких. В результате оказывается, что у мышей, обработанных солевым раствором и контрольным IgG, не обнаруживается заметных повреждений, и межальвеолярная перегородка у этих животных имеет нормальную толщину. И наоборот, мыши, обработанные блеомицином и контрольным IgG, имеют повреждения, варьирующие от мультифокальной локализации в проксимальных ацинусах до диффузного распределения, которое случайным образом включено в плевру. Утверждается, что легкие мышей, обработанных блеомицином и антиальфа-1-интегриновыми антителами, скорее напоминают таковые в группе В(выше). У животных группы D проявляется лишь незначительное количество фиброзных повреждений с образованием слабых мультифокальных утолщений перегородок и малых ареггатов мононуклеарных клеток. Несмотря на то, что представленное выше изобретение описано в некоторых деталях с целью его иллюстрации, а примеры приведены для большей ясности и лучшего понимания, специалистам очевидно, что определенные изменения и модификации неизбежны. Следовательно, описание и примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем данного изобретения, которое определяется прилагаемой формулой изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение композиции, содержащей антитело или гомолог антитела, являющийся антагонистом взаимодействия VLA-4 и альфа-4-бета-7 с их соответствующими альфа-4-лигандами, или антитело или гомолог антитела, который является антагонистом взаимодействия VLA-4 с его лигандом, или антитело или гомолог антитела, который является антагонистом взаимодействия альфа-4-бета-7 с его лигандами, для получения фармацевтической композиции для лечения субъекта с явлениями фиброза. 2. Применение по п.1, где антитело или гомолог антитела выбран из группы, состоящей из антитела человека, химерного антитела, гуманизированного антитела и их фрагментов. 3. Применение по п.1, при котором дозировка указанной композиции в составе фармацевтической композиции соответствует таковой, обеспечивающей примерно от 0,1 до 20 мг/кг массы тела. 4. Применение антитела или гомолога антитела, являющегося антагонистом взаимодействия между интегрином, несущим альфа-4-субъединицу, и лигандом интегрина, несущего альфа-4-субъединицу, для получения фармацевтической композиции для снижения вызванного состоянием фиброза возрастания числа лейкоцитов в образце жидкость бронхоальвеолярного лаважа. 5. Применение по п.4, где антитело или гомолог антитела является одновременно антагонистом взаимодействия VLA-4 и альфа-4-бета-7 с их соответствующими лигандами, или является антагонистом взаимодействия VLA-4 с его лигандом, или является антагонистом взаимодействия альфа-4-бета-7 с его лигандом. 6. Применение по п.4, где антитело или гомолог антитела выбран из группы, состоящей из антитела человека, химерного антитела, гуманизированного антитела и их фрагментов. 7. Применение по п.4, при котором дозировка гомолога антитела в составе фармацевтической композиции соответствует таковой, обеспечивающей примерно от 0,1 до 20 мг/кг массы тела. 8. Применение по п.7, при котором дозировка антитела или гомолога антитела приблизительно составляет от 0,1 до 30 мг/кг массы тела. 9. Применение по п.1, при котором композиция содержит гуманизированное антитело против VLA4. 10. Применение по п.1, при котором состояние фиброза у субъекта связано с фиброзом внутреннего органа. 11. Применение по п.10, при котором внутренним органом является печень, легкое, почка, кровеносные сосуды сердца или желудочно-кишечный тракт.- 26006681 12. Применение по п.1, при котором состоянием фиброза является легочный фиброз, миелофиброз,цирроз печени, мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, серповидный гломерулонефрит,диабетическая нефропатия почечный интерстициальный фиброз или ВИЧ-ассоциированная нефропатия. 13. Применение по п.1, при котором состоянием фиброза является кожный фиброз. 14. Применение по п.13, при котором субъект страдает склеродермией, кольцевидной склеродермией, келоидами, гипертрофированными рубцами, семейной кожной коллагеномой или коллагенозным невусом соединительной ткани. 15. Применение по п.1, при котором состоянием фиброза является фиброз глаза. 16. Применение по п.15, при котором субъект страдает диабетической ретинопатией, постхирургическим образованием рубца или пролиферативной витреоретинопатией.